WO2004048562A1

WO2004048562A1 - ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法

Info

Publication number: WO2004048562A1
Application number: PCT/JP2003/014691
Authority: WO
Inventors: Enoch Y. Park; Tatsuya Kato
Original assignee: Hamamatsu Foundation For Science And Technology Promotion
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-19
Publication date: 2004-06-10
Also published as: AU2003284560A8; JP4376866B2; WO2004048562A8; AU2003284560A1; JPWO2004048562A1

Description

明糸田書ヒト由来 )31, 3—N—ァセチルダルコサミニル

トランスフェラーゼ 2の製造方法技術分野

本発明は、ヒト由来 ]31， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 2 (β 3GnT2) の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、活性を有する組換えヒト 03 GnT 2の製造方法に関する。背景技術

2001年に ESTシーケンスと PC R法により 4種類のヒト由来 j31, 3—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ (]33 GnT) 2〜 5がクロ一ニングされた（シライシ（Shiraishi) ら、 200 1年、 J Biol Chem 第 2 7 6卷、 p . 3 4 9 8 — 3 5 7 0 ; トガヤチ (Togayachi) ら、 2001年、 J Biol Chem第 276巻、 p. 2203 2— 22040参照）。 /33 GnT 2はボリラクトサミン受容体に対し高い活性を示し、ポリラクトサミン鎖の伸長に関与していると推測されている。 β 3 GnT 3および j83GnT4もポリラクトサミン鎖の伸長に関与する酵素であるが、その酵素活性は、 3GnT2の 1/10〜1/20 である。 i33 GnT 5は糖脂質上の糖鎖であるラクト、ネオラクト系の糖鎖合成に重要な働きをするラクトァオシルセラミド合成酵素と考えられている。しかしながら、 ]33GnT2〜5については、解析するために十分な量を天然資源から得ることができないため、その詳細な性質は知られていない。

バキュロウィルス遺伝子発現系（BES) は、昆虫細胞中で組換えタンパク質に対する糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行なわれるため、活性を有するヒ卜由来の組換え夕ンパク質の大量生産に適している（ァラム（Alam) ら、 2002年、 Protein Expression Purif 第 24巻、 p.

33 - 42 ；ジエイムス (James) ら、 1 995年、バイオ/テクノロジ一（Bio/Technology) 第 1 3巻、 p. 592— 596 ;ヘリコート

(Hericourt) 、第 2000年、 Biochem J.、第 349巻、 p. 417—

425参照）。しかしながら、ヒト由来) 33GnT2について BESが適用された場合、組換え i83GnT2の発現量が少なく、タンパク質の大量生産には適さなかった（シライシら、 2001年、 J Biol Chem第 276 巻、 p. 3498-3570参照）。発明の開示

本発明は、活性を有するヒト由来 /33 GnT 2を大量に得るための方法を提供することを目的とする。

本発明は、ヒト由来 j31， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ 2の製造方法であって、（a) 昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来の j31， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 2からなる融合タンパク質をコードする DN Aを含有するバキュロウィルスベクターで、昆虫細胞に形質導入する工程、（b) 形質導入された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（c) 培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法を提供する。

また、本発明は、ヒト由来 jS l， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ 2の製造方法であって、（a) 昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来 )31， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 2からなる融合夕ンパク質をコードする D N A配列を含有し、ウィルス由来のプロテア一ゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現ベクターで、昆虫細胞を形質転換する工程、（b) 形質転換された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および (c) 培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法を提供する。

前記各方法において、昆虫由来の分泌シグナル配列はミツバチのメリチン由来シグナル配列であることが好ましい。

前記各方法において、融合タンパク質は、さらに精製用タグ、レポ一夕一遺伝子および Zまたはェンテロキナーゼの認識部位を含有することが好ましい。

さらに、本発明は、前記各方法により得られるヒト由来 ι81, 3— N— ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ 2を用いることを特徴とする、ラクトー N—ネオテトラオースの製造方法に関する。図面の簡単な説明

図 1 (a) および 1 (b) は、それぞれ実施例 1および 2で得られた酵素の 33 GnT活性を測定した結果を示す。図 1 (a) および 1 (b) において、口は細胞内 |83GnT活性を表わし、画は細胞外) 33GnT活性を表わす。

図 2 (a) および 2 (b) は、それぞれ実施例 1および 2で得られた酵素液中のプロテアーゼ活性を測定した結果を示す。図 2 (a) および 2 (b) において、〇は細胞内プロテアーゼ活性を表わし、 ·は細胞外プロテア一ゼ活性を表わす。

図 3 (a) および 3 (b) は、それぞれ実施例 1および 2で得られた昆虫細胞において発現した融合タンパク質の G F P蛍光強度を測定した結果を示す。図 3 (a) および 3 (b) において、 ◊は細胞内の蛍光強度を表わし、 ♦は細胞外の蛍光強度を表わす。

図 4 (a) および 4 (b) は、形質導入体の培養時にプロテアーゼ阻害剤を添加した場合の )33 GnT活性を測定した結果を示す。図 4 (a) は、細胞外に分泌された酵素の /33 GnT活性を測定した結果である。図 4 (b) は、細胞破砕液中の酵素の )33 GnT活性を測定した結果である。図 5 (a) および 5 (b) は、形質導入体の培養時にプロテア一ゼ阻害剤を添加した場合のプロテア一ゼ活性を測定した結果を示す。図 5 (a) は、細胞外の酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した結果である。図 5 (b) は、細胞破砕液に含有される昆虫細胞由来のプロテア一ゼ活性を測定した結果である。

図 6 (a) および 6 (b) は、それぞれ実施例 4および 5で得られた酵素の /33 GnT活性を測定した結果を示す。図 6 (a) および 6 (b) において、口は細胞内 ;83 GnT活性を表わし、國は細胞外) 33GnT活性を表わす。発明を実施するための最良の形態

本発明のヒト由来) 31， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ 2 (j83 GnT2) の製造方法は、少なくとも昆虫由来の分泌シグナル配列および活性部位を含むヒト由来 i33GnT2からなる融合タンパク質を昆虫細胞で発現させることに特徴を有する。

ヒト由来 /33 G n T 2は、配列番号 1に示すァミノ酸配列（塩基配列は、たとえば Ge nB an k登録番号 AF 092051) からなる膜貫通糖タンパク質であって、ラクトースを使用するポリラクトサミン鎖の伸長反応を触媒する酵素である。本明細書においてヒト由来 i33 GnT 2は、 β 3 GnT2としての酵素活性を失わない限り、たとえば、アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数個が生物学的に同等のアミノ酸配列に置換されていてもよく、数個のアミノ酸残基が付加、欠失されていてもよい。また、本発明の製造方法においては、昆虫細胞内で )33 GnT 2を発現させて細胞外に分泌させるため、ヒト由来 iS 3 GnT 2は膜貫通領域および細胞質領域を欠くもの、たとえばヒト |83 GnT 2の第 26番〜第 397番アミノ酸残基からなるものが好ましい。

本明細書において、分泌シグナル配列は、前駆体タンパク質またはポリペプチドの粗面小胞体膜までの選択的な輸送と膜通過のために働くシグナル配列を意味し、前駆体夕ンパク質またはポリぺプチドの N末端に含有されたかたちで合成される。分泌シグナル配列を ]33 GnT 2に融合することによって翻訳後修飾が行なわれ、活性を有する j33GnT2を得ることができる。分泌シグナル配列としては、たとえば、公知のメリチン (raelittin) (G e n B a n k登録番号 X 02007 ) 、 g p 64 (Ge nB an k登録番号 N C 001623の塩基配列 108179 bp〜： 10 971717 b p) およびセクロピン（cecropin) (Ge nBank登録番号 M34924) などを挙げることができ、この中でもメリチンがとくに好ましい。しかしながら、これらに限定されるものではなく、使用する昆虫または昆虫細胞の種類によって、分泌シグナル配列を適宜選択することができる。なお、分泌シグナルは、細胞外に分泌されたのちに切断されてもよい。

前記融合タンパク質は、前記 3 GnT 2および前記分泌シグナル配列とは異なるタンパク質またはペプチドをさらに含有してもよい。さらに含有されるタンパク質またはペプチドとしては、たとえば、精製を容易に行なうための精製用タグペプチドおよび検出を容易に行なうためのレポ一タータンパク質が挙げられる。さらにたとえば、本発明において製造されるヒト由来) 33 GnT 2は、ェンテロキナーゼの認識部位を含有してもよい。ヒト由来33 GnT 2がェンテロキナーゼの認識部位を含有する場合、ェンテロキナーゼを作用させることによって、ヒト由来) 33 GnT2の精製に利用した精製用夕グなどを除去することができる。

精製用タグとしては、たとえば、ヒスチジンタグ、 S 'タグ、 Tr x ' タグ、 CBD，タグ、 HSV ·タグなどが挙げられ、回収率が高いことからヒスチジンタグが好ましい。レポータータンパク質としては、たとえば、緑色蛍光タンパク質（GFP) 、 GFPの変異体（GFPuv (GenB a n kの登録番号 AF 007834) など）、 β一ガラクトシダーゼおよびルシフェラ一ゼなどが挙げられる。ェンテロキナーゼの切断部位としては、 As ρ— As p— As p— As p— Ly s (配列番号 2) からなるぺプチド配列を用いることができる。

前記分泌シグナル配列およびヒト由来 ]33GnT2をコードする DNA 配列、また、前記精製用タグ、レポ一タ一タンパク質およびェンテロキナ一ゼの認識部位などをコードする DNA配列は、従来の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。たとえば、それぞれ公知の DN A配列に基づき設計したプライマ一を用いることによって、所望の DNA領域を PC Rで増幅することができる。ついで各 P C R産物を連結することにより融合タンパク質をコードする DNA配列（融合タンパク質遺伝子）を得ることができる。あるいは、適当な制限酵素を用いて切断することにより各 D N A領域を得、ついで DNAリガ一ゼによって各 DNA領域を連結することにより、融合タンパク質遺伝子を得ることができる。なお、分泌シグナル配列は、融合タンパク質のァミノ末端側に融合される。

また、 j33GnT2については、たとえば、点変異やランダム変異などの従来の遺伝子工学的手法を用いて、数個のアミノ酸残基が置換、付加および Zまたは欠失された変異体をコードする DN A配列を得ることができる。

本発明において使用する昆虫細胞は、当業者により適宜選択され得るが、たとえば、スポドプテラフルギベルダ（Spodoptera frugiperda) 、スポドプテラリトラリス（Spodoptera littoralis) 、スポドプテラエキシグァ (Spodoptera exigua 、卜リコフレシァ '二 (Trichoplusia ni) を举げることができ、スポドプテラフルギベルダおよびトリコプルシア ·二が好ましい。

本発明における形質導入において使用される組換えウィルスベクタ一は、通常の方法でバキュロウィルスベクター DNAに前記融合夕ンパク質遺伝子を導入することによって得ることができる。ついで、得られた組換えゥィルスべクタ一を昆虫細胞に感染させることによって、形質導入を実施する。

前記組換えウィルスベクタ一による昆虫細胞の形質導入は、従来の方法により当業者が適宜実施することができる。たとえば、昆虫細胞を培養液から分離し、約 5%の血清を含有する適当量の培地において適当な感染多重度（MO I) の組換えウィルスと昆虫細胞を混合し、 27 で1〜2時間温和な条件で撹拌培養を行なうことによって、実施することができる。前記 MO Iは、たとえば 1〜100であり、感染効率が良いという理由から、 M〇 I 10〜50が好ましい。

本発明はまた、ウィルス由来のプロテア一ゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現ベクター（以下、ノンウィルス系発現べクタ一と略称する）を用いて該融合夕ンパク質を発現させることができる。

本発明において使用するノンウィルス系発現べクタ一とは、昆虫細胞内で働くプロモーターをもつプラスミドであり、そのプラスミドの下流に目的遺伝子を挿入することによつて昆虫細胞に目的遺伝子を組み込み、目的遺伝子を発現することができるベクターであって、かつウィルス由来のプ口テアーゼ遺伝子を含有しない発現ベクターを意味する。このようなノンウィルス系発現ベクターとしては、たとえば、 pX INSECT— DES T38、 p I B/H i s、 p I Z/V 5- H i s、 pMI BZV5- H i s、 p I B/V5-H i s一 TOPOなどがある。

前記融合タンパク質のノンウィルス系発現ベクターによる昆虫細胞の形質転換は、従来の方法により当業者が適宜実施することができる。たとえば、目的遺伝子を発現プラスミドに挿入して発現べクタ一を得る。この発現ベクターに組み込まれた目的遺伝子により昆虫細胞を形質転換するためには一般的にリポフエクシヨン法を用いることが多い。リポフエクシヨン法は、発現べクタ一、昆虫細胞の染色体に遺伝子を挿入することのできるヘルパープラスミドおよびカチオン性脂質からなる混合物を昆虫細胞の培養液に滴下し、一定条件下でィンキュベ一シヨンすることにより実施することができる。リポフエクシヨン後、抗生物質入りの約 5%の血清を含有する培地または無血清培地を適当量用いて形質転換された昆虫細胞を単離する。単離のための培養は一般的に 26〜28 で2〜4週間行ぅ。

本発明のヒト由来) 33 GnT 2の製造方法においては、目的の融合タンパク質の正しい高次構造形成を助ける目的で、本発明の融合タンパク質と共に分子シャペロンを染色体に組み込み共発現することが好ましい。このような分子シャペロンとしては、たとえば HSP 60、 HSP70などのファミリ一が知られている。具体的には、カルネキシン (calnexin) 、力ルレティキュリン (calreticulin) などがあげられる。シャペロン遺伝子を染色体に組み込む方法としては、前記融合タンパク質のノンウィルス系発現ベクターによる昆虫細胞の形質転換と同様に行なうことができる。目的の融合タンパク質遺伝子とシャペロン遺伝子による昆虫細胞の形質転換は、同一の発現ベクターにより行なってもよく、また、別々の発現べクタ —により、順次行なってもよい。

本発明のヒト由来 jQ 3 GnT 2の製造方法においては、培地中に融合タンパク質を分泌させるために、前記形質導入によって得られた形質導入体または前記形質転換によって得られた形質転換体を培養する。培養は通常の方法にしたがって適宜実施し得る。培養の際にはプロテアーゼの阻害剤を添加してもよく、プロテア一ゼの阻害剤を培地に添加する場合は、たとえば、 1〜7日間、好ましくは 2〜4日間、 2 7 で旋回培養することによつて実施することができる。プ口テアーゼの阻害剤を培地に添加しない場合は、たとえば 1〜5日間、好ましくは 1〜2日間、 2 7 で旋回培養することができる。

前記プロテアーゼの阻害剤としては、ウィルス由来のプロテアーゼ阻害剤およびカルボキシルプロテアーゼの阻害剤を用いることが好ましい。ゥィルス由来のプロテア一ゼ阻害剤としては、たとえば、ロイぺプチンおよび E 6 4を使用することができる。カルボキシルプロテア一ゼ阻害剤としては、たとえば、ぺプス夕チン Aを使用することができる。

前記形質導入体または形質転換体の培養によつて分泌された融合タンパク質は、従来の方法にしたがって、培養物から採取することができる。たとえば、培養物から細胞を除去し、得られた培養液をァフイエティーカラムによって精製することにより採取することができる。あるいは、培養液に硫酸アンモニゥムを添加することにより培養液中のタンパク質を沈殿させ、タンパク質を可溶化したのちに、 D E A Eなどのタンパク質吸着カラムによつて精製することにより採取することができる。

本発明のヒト由来 ]3 3 G n T 2の製造方法に従って得られるヒト由来 )3 3 G n T 2を用いて、ラクトー N—ネオテトラオースを製造することができる。ラクトー N—ネオテトラオースの製造は、たとえば、ラクトースを基質（出発物質）として前記ヒト由来 i3 3 G n T 2存在下でゥリジン 5 ' 一二リン酸一 N—ァセチルダルコサミンと反応させ、ラクト— N—トリオース I Iまで変換し、得られたラクト一N—トリオ一ス I Iとガラクトース 1 , 4—デキストロ一スに jSガラクトシダーゼ（安価な酵素）を作用させることにより実施できる。この際、ラクト一N—ネオテトラオースの製造には、ヒト由来) 33GnT2と同様に前記融合タンパク質を用いることもできる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

製造例 1

(融合夕ンパク質遺伝子の取得）

活性部位を含む) 33 GnT2の DNA領域は、 Quick_Clone^TMヒト胎児脳 cDNA (BDバイオサイエンス ·クロンテック製）を用い、 PCR法により増幅させた。すなわち、 Quick_Clone^TMヒト胎児脳 c DNA 1 n g、 DNAポリメラーゼ（BDバイオサイエンス ·クロンテック製) 1. 25 U、 2. 5mMのdNTP s (東洋紡績（株）製）、下記フォワードブライマ一 1およびリバースプライマ一 1を各 20 pmo 1ならびに蒸留水を混合し、全量 50 1の PC R用反応液を調製した。ついで、 PCR用反応溶液を、 95°Cで 5分間インキュベーションしたのち、 95 で1分間、 60°Cで 1分間および 72°Cで 2. 5分間を 1サイクルとしてこれを 30 サイクル行ない、ついで 72°Cで 3分間インキュベーションすることにより PCRを実施した。使用したプライマーを以下に示す。

フォヮ一ドプライマ一 1 ： 5 ' — CGGGATCCGGAAGTCTCC AAAAGCAGTAGCCAAG— 3 ' (配列番号 3)

リバースプライマ一 1 ： 5' — CGGAATTCTGAAGGGTTTA GAGGCCCTCAAATGGG - 3 ' (配列番号 4)

増幅させた DN A断片は 1, 264bpであり、 β 3 GnT 2のァミノ酸 26〜397残基までをコードする領域およびその 3' 非翻訳領域を含む。ついで、 6 Xヒスチジンタグ、 GFP、ェンテロキナーゼの認識部位および CATを順にコ一ドするプラスミド pB l ueBa cH i s 2—G F Pu v/C AT (チヤ一（Cha) ら、 1 9 9 9年、 J Biotechnol 69, P9-17) から制限酵素 H i ndlllを用いて CAT遺伝子を取り除くことによって構築されたプラスミド pB l u eB a cH i s 2—GFPuvの B amH I/Ec oR I部位に、 B amH Iおよび Ec oR Iで処理した前記 DNA断片を揷入し、プラスミド pB l u eB a cH i s 2/GFPu v— β 3GnT2を構築した。

ついで、ヒスチジンタグをコードする DNA配列の 5 ' 側にミツバチのメリチン由来の分泌シグナル配列をコ一ドする DNA領域を挿入するために、 pB l ueB a cH i s 2ZGFPuv— /33GnT2を铸型とする PCRを行なった。すなわち、 0. l gの pB l ueB a cH i s 2/ GFPuv-/33GnT2, DNAポリメラ一ゼ（東洋紡績（株）製） 1. 25U、 2. 5mMの dNTP s (東洋紡績（株）製）、フォワードブライマ一 2および前記リバースプライマ一 1を各 20 pmo 1ならびに蒸留水を混合し、全量 50 1の PCR用反応液を調製した。ついで、 PCR 用反応溶液を、 95°Cで 5分間インキュベーションしたのち、 95 で 3 0秒間、 60 °Cで 30秒間および 72 で 2. 5分間を 1サイクルとしてこれを 30サイクル行ない、ついで 72 °Cで 3分間インキュベーションすることにより PCRを実施した。なお、フォワードプライマー 2の DNA 配列は、ミツバチのメリチン由来分泌シグナル配列をコ一ドする遺伝子を含有する。使用したフォワードプライマ一 2を以下に示す。

フォワードプライマ一 2 ： 5 ' -CACCATGAAATTCTTAGT

TCATC- 3 ' (配列番号 5)

P CRの結果、分泌シグナル配列をコ一ドする DN A領域をさらに含む 0 ？11 — ^ 3 11丁2融合遺伝子（配列番号 6) が増幅された。得られた GFPuv— ]33 GnT 2融合遺伝子を、エントリ一ベクタ一 pENTRZD— TOPO (インビトロジェン（Invitrogen) 製）に挿入し、 pENTR/Dノ GFPu V— 33 GnT2とした。

製造例 2

(組換えウィルスベクタ一の製造）

製造例 1で得られた pENTRZDZGFPu v_)33 GnT 2、ならびにポリへドリンプロモーターを含有するドナーベクター pDE ST 8 (インビトロジェン製）および GATEWAY CLONING TECHNOLOGY (インビトロジェン製）を用いて、双方のベクタ一の組換えによってプラスミド pDE ST8/GFPU v-i33 GnT 2を構築した。さらに pDEST8,G FPu V— 33 GnT 2を用いる Bac- to- Bac バキュロウィルス発現システム (Baculovirus Expression Systems) (インビトロジェン製) により、 GFPuv— j33 GnT 2融合遺伝子をもつ組換えオートグラファ ·カルフォルニ力多角体ウィルス（ Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) (A c MN P V- GF P u v - |83 GnT 2) を作製した。 PCR法で得られたすべての DNA断片の塩基配列は、 DNA シーケンサ一により確認した。

製造例 3

(融合タンパク質の発現べクタ一の製造）

GATEWAY CLONING TECHNOLOGY (インビトロジェン製）を用いることにより、製造例 1で得られた pENTR/D/GFPu V— j33 GnT 2の融合タンパク質遺伝子を、ノンウィルス系発現べクタ一プラスミド PXINSECT-DEST38にサブク口一エングした。

製造例 4

(シャベロン分子遺伝子を組み込んだ発現べクタ一の製造）

ヒト胎盤の cDNAライブラリー（BDバイオサイエンス 'クロンテツク製）から PCRによりカルネキシン遺伝子（シャペロン遺伝子）を増幅した。すなわち、铸型としてヒト胎盤の cDNAライブラリー 1 ng、 K ODポリメラーゼ（東洋紡績（株）製） 1. 25U、 0. 2mMの dNT P s (東洋紡績（株）製）、および下記フォワードプライマ一 3およびリバースプライマー 3を各 20 pmo 1、ならびに ImMの MgC 1₂、 1 XPCRバッファ一（東洋紡績（株）製）を混合し、全量 50 ^ 1の PC R用反応液を調製した。ついで、 PCR用反応溶液を、 95 °Cで 3分間ィンキュベ一ションしたのち、 95°Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間および 72 °Cで 2分間を 1サイクルとしてこれを 30サイクル行ない、ついで 7 2でで 5分間インキュべ一ションすることにより PCRを実施した。使用したプライマーを以下に示す。

フォワードプライマ一 3 ： 5 ' -CACCGTCGACATGGAAGG GAAGTGGTTGCTGTGTATG— 3 ' (配列番号 7) リバ一スプライマー 3 ： 5 ' -GCTCTAGATCACTCTCTTC GTGGCTTTCTGTTTCTTGG - 3 ' (配列番号 8) 増幅させた DNA断片（カルネキシン遺伝子）を、ノンウィルス系発現ベクタ一 p I B/V 5-H i s -TOPO (インビトロジェン製）と混合し、 22°Cで 30分間反応させることにより、該 DNA断片を該ベクタ一に挿入し、シャペロン分子発現べクタ一プラスミド p I B/CNXを構築した。

実施例 1

(形質導入体の獲得）

対数増殖期（2〜3個 Zml) の S f — 9'細胞（インビトロジェン製）を用い、 M. O. I . 10で製造例 2において製造した AcMNPV— G FPu v-j33GnT2を感染させた。

(融合タンパク質の発現）前記形質導入体の培養は、 1 %の antibiotics- antimycotic (インピトロジェン製）を含有する S f— 90011培地（インビトロジェン製） 20 m 1を入れた 100m 1容三角フラスコを用いる旋回培養（27°C、回転数 100 r pm) で行なった。感染から 1、 2、 3または 4日後に培養液を回収し、遠心分離（8, 000 r pm、 5分間）によって、融合タンパク質（配列番号 9) を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群 4本用いた。

(融合タンパク質の精製）

前記フラスコ 4本分の培養上清液（80ml) に対し、 N i^{2 +} NTA ァガロース樹脂（キアゲン製）を 0. 5mlの割合で加え、氷中で 1時間穏やかに攪拌した。融合タンパク質には N i ^{2 +}に特異的に結合するヒスチジンタグが付加されているため、 N i ^{2 +} NTAァガロース樹脂により該融合タンパク質が特異的に吸着される。ついで樹脂をカラムに充填し、樹脂の 3倍量（1. 5ml) の 150 mM塩化ナトリウムと 40 mMィミダゾ一ルを含む 50 mMトリス緩衝液（p H 7. 5) で洗浄した。その後樹脂の 3倍量（1. 5m 1 ) の 15 OmM塩化ナトリウム、 20 OmMィミダゾールを含む 50 mMトリス緩衝液（ p H 7. 5) で融合夕ンパク質を溶出させることにより、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。

(GFPu V— /33 GnT 2融合タンパク質の性質）

酵素液 1 5 1に、ェンテロキナーゼ 1Uを添加し、 21°Cで 16時間保温した。その後 SDS— PAGEを用い、融合タンパク質の切断を確認した。また別途、酵素液 2. 5 1に変性条件下で lmUのグリコべプチダーゼ F (PNGase F) (夕カラバイオメディカル製）を加え、 37 で 16時間反応させた後、分子量の変化を SDS— PAGEによって確認した。タンパク質濃度は P ro t e i n As s ay Ki t I I ィォ—ラッド製）を用いて測定した（ブラッドフォード（Bradford) ， 1976) 。

その結果、 β 3GnT2とその他のヒスチジンタグと GFPu Vの 2個に切断されることが確認された。

また、糖鎖付加を確認するために融合タンパク質を PNGase処理したところ、分子量が 7〜 8 kD a減少した。これは、 j33GnT2は糖付加部位をもっていることを示唆している。

実施例 2

(形質導入体の獲得）

対数増殖期（ 2〜 3個 Zm 1) の Tn— 5 B 1— 4細胞（インビトロジェン製）を用い、 Μ. Ο. I. 10で製造例 2において製造した Ac Μ NPV-GFPu v- 33 GnT2を感染させた。

(融合タンパク質の発現）

前記形質導入体の培養は、 1 %の antibiotics- antimycotic (インビトロジェン製）を含有する Express Five培地（インビトロジェン製） 20m

1を入れた 100ml容三角フラスコを用いる旋回培養（27°C、回転数 l O O r pm) で行なった。感染から 1、 2、 3または 4日後に培養液を回収し、遠心分離（8, 000 r pm、 5分間）によって、融合タンパク質を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群 4本用いた。

(融合タンパク質の精製）

前記培養液上清を用いたほかはすべて実施例 1と同様の方法により、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。

試験例 1

(/33GnT活性測定試験） ' 実施例 1および 2において組換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液および培養液上清を試料として ]33Gn T活性を測定した。なお、細胞破砕液は、 l%Tr i t onX— 100を含む 5 OmMのトリス緩衝液（pH7. 5) で細胞を処理することによつて調製した。

j33 GnT反応は、 5 OmMトリス緩衝液（pH 7. 5) 、 15mM塩化マンガン、 19mMの UDP—N—ァセチルダルコサミン、 22mMの Ga l )31_4G l cNAc )3— pNP、試料 5 ^ 1を含有する全量 25 1液を調製したのち、 37°Cで 24時間インキュベーションすることによって行なった。

/33 GnT反応終了後、 5 1の反応液を分取し、 195 1の蒸留水を添加した。さらに 5分間煮沸し、 0. 45 mニトロセルロースフィルタ一でろ過し、生成物を HPLCによって検出した。 HPLCは、カラムとして M i gh t y s i l RP—18 (H) GP 150— 4. 6 (関東化学（株）製）を用い、流速 1. OmlZmi n、カラム温度 40 °Cで行なった。生成物は、 10%メタノールを用い、吸光度 300 nmで検出した。 1ュニットは 1分間に 1 imo 1の G 1 cNAcを転移させる酵素量と定義した。

各 j33 GnT活性を図 1 (a) および 1 (b) に示す。図 1 (a) は、実施例 1で得られた酵素の )33 GnT活性を測定した結果である。図 1

(b) は、実施例 2で得られた酵素の /33 GnT活性を測定した結果である。

β 3 GnT活性は S f — 9と Tn— 5B 1— 4の両細胞において細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かった。 Tn— 5B 1— 4細胞においては感染後 3日で劇的に ;33 GnT活性が減少した。それとは反対に S f — 9細胞では細胞外の /33 G n T活性は感染後 4日間で上昇した。最大の i33 GnT活性は S f — 9細胞では 0. δ θπιυΖπιし Tn— 5 81—4細胞では0. 68mUZmlであった。

試験例 2

(プロテアーゼ活性測定試験）

実施例 1および 2において組換えパキュロウィルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液および培養液上清を試料として、試料に含有される昆虫細胞由来のプロテア一ゼ活性を測定した。なお、細胞破砕液は、 1 %T r i t onX- 100を含む 5 OmMのトリス緩衝液（pH 7. 5) で細胞を処理することによって調製した。

反応は次のようにして実施した。試料と 430 1の AUE バッファ一 (0. 2%ァゾカゼイン、 3M尿素、 5 mMシスティン、 5m M EDTA、 5 OmMクェン酸、 pH5. 4) を混合することによりプ口テア一ゼ反応液を調製し、 37°Cで 1時間インキュベーションした。ついで、 500 1の 20%トリクロ口酢酸を反応停止液として反応液に添加し、プロテア一ゼ反応を停止させた。反応停止液を遠心分離（15, 0 00 r pm、 5分間）し、反応液の吸光度を 405 nmで測定した。 1ュニットは 1時間で 405 nmの吸光度値を 1上昇させる酵素量と定義した。各プロテアーゼ活性を図 2 (a) および 2 (b) に示す。図 2 (a) は、実施例 1で得られた酵素液中のプロテアーゼ活性を測定した結果である。図 2 (b) は、実施例 2で得られた酵素プロテアーゼ活性を測定した結果である。

感染 3日後の細胞外プロテア一ゼ活性について Tn— 5 Β 1—4細胞の方が S f — 9細胞に比べて 5倍高く、これが T n-5B 1-4細胞の急激な活性の低下の原因であると考えられる。

試験例 3

(プロテアーゼの影響の確認試験）

実施例 1および 2で得られた酵素液について、プロテア一ゼの影響を確認するために、細胞外 GFPuv_ 3 GnT 2融合タンパク質を SDS 一 PAGE上でその緑色蛍光により観察した。 S f — 9細胞では低分子量のバンド（プロテアーゼで切断されている融合タンパク質）が感染 3日後から現われはじめるが、まだ高分子量の融合タンパク質も存在した。一方 Tn~5B 1— 4細胞では、低分子量のバンドは感染後 2日目から現われはじめ、 3日目ではすべてが低分子量のバンドに分解され、ほとんどがプ口テア—ゼによって切断された。プロテアーゼで切断されていない融合夕ンパク質のバンドの減少は 133 GnT活性の減少と一致していた。

試験例 4

(ポリアクリルアミド電気泳動（SDS— PAGE) による組換えタンパク質の分子量の確認および蛍光イメージの分析）

実施例 1および 2において組換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液、培養液上清および精製酵素を試料として 10 %または 12%のポリアクリルアミドゲルの SDS— PAGEを行なうことにより、 GFPuv— ) 33 GnT 2融合遺伝子の発現とその GF Pu v- j33 GnT 2融合タンパク質の精製具合を確認した（リームリ

(Lae讓 li) ， 1970) 。なお、細胞破砕液は、 l%Tr i t onX— 10 0を含む 5 OmMのトリス緩衝液（pH7. 5) で細胞を処理することによって調製した。ゲル上の GFP由来緑色蛍光バンドは、 Mo 1 e cu 1 a r Imag e r FX (バイオ一ラッド（Bio-Rad)製）を用いて検出した。非特異的なバンドは、クーマシ一ブリリアントブル一（CBB) R - 250 (I CNバイオメディカル製）でゲルを染色してから検出した。特異的な緑色蛍光パンドを検出する場合、サンプルはサンプルバッファーを混合後、煮沸なしにそのまま電気泳動を行なった。

その結果、精製された融合夕ンパク質は S D S— P A G Eゲル上で約 7 7 kDaと推定された。 S f — 9細胞（実施例 1) と Τη_5Β 1— 4細胞（実施例 2) との培養液から精製された融合タンパク質の分子量の差は認められなかった。

また、各酵素液の蛍光強度の経時変化を図 3 (a) および 3 (b) に示す。図 3 (a) は、実施例 1で得られた昆虫細胞の蛍光強度を測定した結果である。図 3 (b) は、実施例 2で得られた昆虫細胞の蛍光強度を測定した結果である。

S f — 9と Tn— 5B 1— 4の両細胞において最大細胞内蛍光強度は最大細胞外蛍光強度の 2〜 4倍高かった。

実施例 3

(形質導入体の獲得）

対数増殖期（2〜3個 ml) の Tn— 5細胞（インビトロジェン製）を用い、 M. O. I. 10で製造例2にぉぃて製造したAcMNPV— G F P u V - /33 GnT2を感染させた。

(融合タンパク質の発現）

前記形質導入体の培養は、 1 %の antibiotics- antimycotic (インビトロジェン製）を含有する Express Five培地（インビ卜ロジェン製） 20m 1を入れた 100ml容三角フラスコを用いる旋回培養（27 、回転数 100 r pm) で行なった。感染から 1日後、培地 1 m 1当たり 0、 0. 25、 1. 0または 2. 5 gのロイぺプチン塩酸塩（Wak598- 06471、和光純薬製）を添加して、培養を継続した。感染から 1 (ロイぺプチン添加直前）、 2、 3または 4日後に培養液を回収し、遠心分離（8, 000 r pm、 5分間）によって、融合タンパク質を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群 4本用いた。

(融合タンパク質の精製）

試験例 5

(プロテア一ゼ阻害剤の )33 GnT活性への影響）

実施例 3で得られた酵素液を用いたほかはすべて試験例 1と同様にして、酵素液の )33 G n T活性を測定した。

結果を図 4 (a) および 4 (b) に示す。図 4 (a) は、細胞外に分泌された酵素の) 33 GnT活性を測定した結果である。図 4 (b) は、細胞破砕液中の酵素の) 33 GnT活性を測定した結果である。

図 4 (a) および 4 (b) に示されるように、プロテア一ゼ阻害剤を 0. 25 ノ ml以上添加することによって、 β 3 GnT活性は 3倍程度上昇した。

(プロテア一ゼ阻害剤のプロテアーゼ活性への影響）

実施例 3で得られた酵素液を用いたほかはすべて試験例 2と同様にして、酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した。

結果を図 5 (a) および 5 (b) に示す。図 5 (a) は、細胞外の酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテア一ゼ活性を測定した結果である。図 5 (b) は、細胞破碎液中に含有される昆虫細胞由来のプロテア一ゼ活性を測定した結果である。

図 5 (a) および 5 (b) に示されるように、プロテア一ゼ阻害剤を 0. 25 Xm 1以上添加することによって、細胞外プロテアーゼ濃度は 1 Z10程度減少した。一方、細胞内のプロテアーゼ活性には、ほとんど影響がなかった。

実施例 4

(形質転換体の獲得）

製造例 3で製造した融合タンパク質の発現べクタ一プラスミド 980 n gおよびネオマイシン耐性遺伝子含有プラスミド pBmA： ne o (インビトロジェン製） 20 ngを用い、対数増殖期（2〜3 10⁵個/111 1) の Tn_5細胞（インビトロジェン製）を 24ゥエルプレートに移し、 4/ lのセルフエクチン（インピトロジェン製）を用いてリポフエクション法により形質転換を行った。形質転換した細胞を Express Five培地（ィンビトロジェン製） 1mlに入れ、 72時間 27 °Cで培養した。その後抗生物質ジエネティシン (ィンビトロジェン製) 700 M g/m 1を含む Express Five培地（インビトロジェン製）に交換した。抗生物質耐性細胞を得るために以後 3〜4日毎に培地（抗生物質ジエネティシン（インビトロジェン製） 700 gZm 1を含む Express Five培地）を交換し、 14 日間 27°Cで培養した。ここで得られた細胞を抗生物質ジエネティシン

(インビトロジェン製） 700 n g/m 1を含む Express Five培地に入れ、 lmlスケールから 5m 1スケールにまで 30日間 27 °Cで培養した。

(融合タンパク質の発現）

前記形質転換体の培養は、 Express Five培地（インビトロジェン製） 2 0 m 1を入れた 100mlフラスコに初期細胞濃度 5 X 10⁵個/ m 1となるよう形質転換体を播種し、ついで旋回培養（27°C、回転数 100 r pm) することにより実施した。培養から 1、 2、 3、 4、 5、 6または 7日後に培養液を回収し、遠心分離（8， 000 r pm、 5分間）によつて、融合タンパク質（配列番号 9) を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群 4本用いた。

(融合タンパク質の精製）

(GFPu ν-|63 GnT 2融合タンパク質の性質）

前記酵素液を用いたほかはすべて実施例 1の「GFPuv— ^ 3GnT 2融合タンパク質の性質」と同様の方法により、酵素の分子量を測定した。その結果、 β 3 GnT2とその他のヒスチジンタグと GFPu Vの 2個に切断されることが確認された。

また、糖鎖付加を確認するために融合タンパク質を PNGase処理したところ、分子量が？〜 8 kD a減少した。これは、 i83 GnT2は糖付加部位をもっていることを示唆している。

実施例 5

対数増殖期の実施例 4で得られた融合タンパク質発現細胞 (5 X 1 0⁵ 個 Zml) を 24ゥエルプレートに移し、 1 0 ^ 1のセルフエクチン (ィンビトロジェン製）を用いてリポフエクシヨン法により、製造例 4で製造したシャペロン分子発現べクタ一プラスミド p I B/CNX 500 n g を用いて形質転換を行った。形質転換した細胞を Express Five培地（インビトロジェン製） 50 0 1に入れ、 7 2時間 27 °Cで培養した。その後抗生物質ブラストサイジン (インビトロジェン製) 5 0 g/m 1を含む Express Five培地（インピトロジェン製）に交換した。ブラストサイジン耐性細胞を得るために以後 3日毎に培地（ブラストサイジン（インビトロジェン製） 5 0 g/m 1を含む Express Five培地）を交換し、 72時間 2 7 で培養した。ここで得られた細胞をブラストサイジン（インビトロジェン製） 5 0 /m 1を含む Express Five培地に入れ、 1m lスケ一ルから 5 m 1スケールにまで 3 0日間 2 7 °Cで培養した。

(融合タンパク質の発現）

前記形質転換体の培養は、ブラストサイジン (インビトロジェン製) 5 0 w gZm 1を含む Express Five培地（インビトロジェン製） 2 Om lを入れた 1 0 0m lフラスコに初期細胞濃度 5 X 1 0⁵個 Zmlとなるよう形質転換体を播種し、ついで旋回培養（2 7°C、回転数 1 00 r pm) することにより実施した。培養から 7日後に培養液を回収し、遠心分離（8， 000 r pm、 5分間）によって、融合タンパク質（配列番号）を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群 4本用いた。

(融合タンパク質の精製）

試験例 6

(33GnT活性測定試験）

実施例 4または 5で得られた形質転換体について、該細胞の破砕液および培養液上清を試料として用いたほかはすべて試験例 1と同様にして、 β 3GnT活性を測定した。

酵素の) 33 GnT活性を測定した結果を図 6 (a) および 6 (b) に示す。図 6 (a) は、実施例 4で得られた酵素の) 33 GnT活性を測定した結果である。図 6 (b) は、実施例 5で得られた酵素の /33 GnT活性を測定した結果である。

実施例 4において、 3 GnT活性は細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かった。 ^ 3GnT活性は、細胞内で最大 1. 19mU /ml、細胞外で最大 3. 74mU/mlであった。実施例 5において、 jS 3Gn T活性は細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かつた。 /33GnT活性は、細胞内で最大 8. 33mU/ml、細胞外で最大 22. 4mU/mlであった。

比較例 1

(シグナル配列非含融合遺伝子の発現）

製造例 1と同様の方法で、分泌シグナル配列を含有しない p B 1 u e B a cH i s 2/GFPu v-j33GnT2を構築した。

p B 1 u e B a c H i s 2/GF P uv- β 3GnT2と Bac - N - Blue Transfection Kit (インビトロジェン製）を用いて、シグナル配列を含有しない GFPu V— jS 3 GnT 2遺伝子を持つ組換えウィルス（AcMN PV-GFPu v-)83GnT2 (-sig)) を作製した。

前記 AcMNPV— GFPu v— j33 GnT2 (-sig)を用いたほかはすベて実施例 1と同様にして、融合タンパク質を含有する溶出液を得た。 (i33 GnT活性の測定試験）

組換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液、培養液上清および酵素液を試料として、試験例 1と同様の方法で ]33 GnT活性を測定した。しかしながら、各試料については、 /33Gn T活性が認められなかつた。実施例 1において感染後 2日で培養液を採取して得た酵素液に関し、試験の結果をまとめて表 1に示す。表 1

酵素の活性と比活性は活性測定に用いる基質や測定条件が異なるため一概には比較できないが、本発明の方法により得られたヒト由来 |33 GnT 2の活性は、以前の報告（免疫グロブリン由来のシグナルを使用した前掲のシライシらの文献）の 10〜15倍の活性を示し、マウス由来の ]33 G n Tとほぼ同程度の活性を示した（ィガン（Egan) ら、 2000年、 Glycoconj J 17:867-875) 。また、精製酵素の比活性は、隋膜炎菌 (Neisseria meningtidis) 由来の組換え N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ（ブリクト（Blixt) ら、 1999年、 Glycobiology 9:1061-1071) よりも約 17倍高かった。

さらに GFPと融合させることにより、ウエスタンブロットゃ EL I S Aなどの煩雑な作業を省くことができる。

また、 ]33GnT2を GFPu Vと融合させることにより、蛍光顕微鏡を用いて GFPu Vの緑色蛍光を観察することによって j33 GnT2の発現を簡単に確認することができた。たとえば、組換えウィルス AcMNP V— GFPuv— j33GnT2を S f — 9細胞に感染させたときは 18〜 20時間、 T n— 5 B 1— 4細胞では 16〜： 18時間で細胞内に緑色蛍光が観察され始めた。細胞内では細胞膜の内側に沿って、強い緑色蛍光が観察された。感染後 2〜4日後、細胞内全体に緑色蛍光が観察されると同時に細胞外にも観察された。細胞外の蛍光強度は Tn— 5 Β 1一 4細胞の方が S f — 9細胞よりも高かったが、 β 3 GnT活性はその逆であった。

Tn-5B 1 - 4細胞では細胞外のプロテアーゼ活性が感染後 3日で最大となるが、それが )33 GnT活性の減少に関連し、また Tn— 5 B 1一 4の細胞外プロテアーゼ活性は S f — 9に比べて 3倍高かった。高いプロテアーゼ活性が、 Tn— 5 B 1— 4細胞における β 3 Gn Τ活性の低さの原因と推測される。 BE S内に存在するプロテアーゼが 3種類発見されている。 S f — 9細胞内ではウィルス感染に関わらず存在する 40 kD aのプロテアーゼが発見されている。

GFPu v-j33 GnT 2融合タンパク質を PNGaseで処理したとき、分子量が 7〜 8 kD a減少した。このことから融合タンパク質は 3〜4個 N型糖鎖が結合していると推測される。 7〜8 kD aという差は以前に報告された 1. 5 kD aおよび 4 kD aよりも大きい（前掲のシライシらの文献、 2001年）。また、発現させた融合タンパク質の ]83 GnT領域の分子量は SDS— PAGEから 45 kD aと推定されたが、実際は 43, 065. 49D aであり、その差は約 2 kD aであった。

ノンウィルス発現系において細胞外 3 G n T活性がバキュロウィルスを用いる発現系に比べ、 5. 5倍高い結果が得られた。また、ノンウィルス発現系では細胞外 3 GnT活性はプロテアーゼ阻害剤を添加した結果よりさらに 1. 9倍上昇した。 SDS— PAGE法による生化学的な解析の結果、ノンウィルス発現系の場合、プロテアーゼによって切断されたと考えられる低分子タンパク質は殆ど確認できなかった。このことから、細胞外に GFP— 33 GnT 2融合タンパク質を分泌生産するためにノンゥィルス発現系は非常に有効であると考えられる。さらに、ノンウィルス発現系においてシャペロン遺伝子を共発現させた場合は、シャペロン遺伝子を共発現させていない場合と比較して細胞外 /33 GnT活性は、約 6倍上昇した。産業上の利用可能性

本発明により、活性を有するヒト由来] 33 GnT 2を効率的に大量生産する方法が提供された。 /33 G n T 2は母乳などの主な成分であるラクト一 N—ネオテトラオース（LnNT) の産生に非常に重要な役割を有しており、本発明で得られた /33 G n T 2を用いれば、母乳の代わりに乳幼児に与えるミルクの主成分を工業的に得ることができるようになる。したがって、本発明のヒト由来 /33 GnT 2の製造方法は極めて優れた効果を有する。さらに、本発明の方法により製造されたヒ卜由来 )83011丁2が ? を含有する場合には、蛍光顕微鏡を用いてその発現を迅速に確認できるうえ、タンパク質の精製や回収に極めて効果的である。さらに、蛍光顕微鏡による G F Pの観察はバキュ口ウイルス感染後のタンパク質分泌経路の解析にも応用することができる。配列表フリーテキスト

配列番号 2 ：ェンテロキナーゼの切断部位のアミノ酸配列

配列番号 3 ：活性部位を含む )33GnT2をコ一ドする DN A配列を得るためのフォヮ一ドプライマ一

配列番号 4 ：活性部位を含む33GnT2をコードする DN A配列を得るためのリバースプライマー

配列番号 5 ：ミツバチのメリチン由来分泌シグナル配列との融合タンパク質をコードする DN A配列を得るためのフォワードプライマ一

配列番号 6 ： GFPuv-i83GnT2融合遺伝子をコードするDNA配列

配列番号 7 ：カルネキシン遺伝子をコードする DN A配列を得るためのフォワードプライマー

配列番号 8 ：カルネキシン遺伝子をコードする DNA配列を得るためのリバースプライマー

配列番号 9 ： GFPUV-/33 GnT 2融合タンパク質のアミノ酸配列

Claims

言青求の範囲

1. ヒト由来 3 1 , 3— N—ァセチルダルコサミニル卜ランスフェラーゼ 2の製造方法であって、（a ) 昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来 ι8 1， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ 2からなる融合タンパク質をコードする D N Aを含有するバキュロウィルスべクタ一で、昆虫細胞に形質導入する工程、（b ) 形質導入された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（c ) 培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法。

2. ヒト由来 )3 1， 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 2の製造方法であって、（a ) 昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来 /3 1 , 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 2からなる融合夕ンパク質をコードする D N A配列を含有し、ウィルス由来のプロテアーゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現べクターで、昆虫細胞を形質転換する工程、（b) 形質転換された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および

( c ) 培養物から該融合夕ンパク質を採取する工程からなる方法。

3. 前記昆虫由来の分泌シグナル配列が、ミツバチのメリチン由来シグナル配列である請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

4. 前記融合タンパク質が、さらに精製用タグ、レポ一夕一遺伝子および Zまたはェンテロキナーゼの認識部位を含有する請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

5. 請求の範囲第 1項および第 2項記載の方法により得られるヒト由来 /3 1 , 3— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ 2を用いることを特徴とするラクトー N—ネオテトラオースの製造方法。