CN117442780A - 一种重组角蛋白可注射凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及医疗用品领域，具体提供了一种重组角蛋白可注射凝胶及其制备方法，该可注射凝胶在保持角蛋白和半胱氨酸的质量比α为5:1≤α＜15:1，同时调节至碱性pH值，即可在不添加交联剂的情况下，形成质量可靠的重组角蛋白凝胶，该可注射凝胶在医疗产品中的应用包括软组织填充、药物递送以及美容整形领域的应用，同时该可注射凝胶还可用于促进成纤维细胞增殖和迁移，以及促进成纤维细胞表达分泌胶原蛋白的用途。

Description

一种重组角蛋白可注射凝胶及其制备方法

技术领域

本申请涉及医疗用品领域，具体涉及一种重组角蛋白可注射凝胶及其制备方法。

背景技术

软组织填充这一概念可以追溯到19世纪，最早是使用自体脂肪进行组织修补。但当时的脂肪成活率很难把控，所以永久性人工合成填充物开始应用于美容界，目前医疗和美容行业制备注射凝胶所使用的天然聚合物材料主要为动物胶原和透明质酸钠等。常用的胶原蛋白来自猪皮、牛皮和牛腱等动物组织，动物胶原蛋白可能具有病毒残留并引起免疫排斥。因此，对于部分使用者仍然存在着使用部位红肿、过敏和慢性炎症等排异问题。重组胶原蛋白虽然解决了病毒源性的问题，但种类众多，消费者难以区分清楚，由于胶原蛋白凝胶不能长时间在人体中保持形态，会被降解成为小分子氨基酸、多肽等物质。所以消费者会多次注射，使用时效较为低下。未经修饰的透明质酸水凝胶不支持整合素介导的细胞结合，需要将细胞粘附性RGD肽化学偶联到透明质酸基质上，整过流程显得繁琐，不利于大规模生产。而角蛋白由于其本身独特的性质，含有大量的二硫键，锁水效果好并且稳定，利用本身自交联的性质就可以得到凝胶，流程简单并且稳定在体内不易降解。是一种理想的填充材料。

角蛋白注射填充物已有应用，但是是提取角蛋白，目前常用的角蛋白是从人体毛发、动物羽毛、动物的鳞甲中通过化学方法提取而得的，分子量并不明确，是一种角蛋白混合物，存在免疫原性、病毒隐患等问题。因此限制了其在生物医疗领域的发展。

发明内容

本申请发明人在前期研究克服了这一缺陷，利用基因工程技术生产的重组角蛋白取代了动物源提取角蛋白。重组角蛋白是基于重组质粒诱导其表达，通过发酵、破菌、纯化等工艺步骤，得到高纯度的重组角蛋白。

本项技术由专利技术重组角蛋白为主要原料，通过特定的工艺步骤使其自交联进而形成稳定的立体保湿凝胶，不需要添加戊二醛等交联剂，避免有毒交联试剂的残留的毒性。该技术采用的重组角蛋白来源于人毛发基因，进行一定的设计改造，规避了免疫性问题，注入体内后安全性高，可作为填充物用于软组织填充，适用于医美填充领域。

1.一种可注射凝胶，其中，包括：

角蛋白和半胱氨酸；所述可注射凝的pH为中性。

2.根据项1所述的可注射凝胶，其中，

所述角蛋白和半胱氨酸的质量比α为5:1≤α＜15:1。

3.根据项1所述的可注射凝胶，其中，

所述角蛋白为经由经机械法、酸碱处理法、还原法、氧化法、电化学还原法、铜氨溶液法、金属盐法、生物法或基因工程制备的角蛋白。

4.一种项1-3任一项所述的凝胶在制备医疗软组织修复或美容用填充剂中的应用。

5.一种可注射凝胶的制备方法，其中，

向上述重组角蛋白原液中加入半胱氨酸，调其pH至碱性，静置一段时间使其形成凝胶；

将凝胶切块，用大量的纯化水或PBS缓冲液清洗至透明状；

将凝胶用均质机破碎，离心后收取沉淀，用生理盐水重悬，形成稳定的重组角蛋白凝胶颗粒混悬液。

6.根据项5所述的方法，其中，加入的所述角蛋白原液与半胱氨酸的质量比大于等于5：1且小于15：1。

7.根据项5所述的方法，其中，调节加入半胱氨酸后的角蛋白溶液的所述酸溶液为盐酸或柠檬酸。

8.根据项5所述的凝胶，其中，所述pH调节至弱碱性是指调节加入半胱氨酸后的角蛋白溶液至pH为8.5～9.5。

9.根据项5所述的方法，其中，所述静置时间为3小时以上。

10.根据项5所述的方法，其中，控制所述角蛋白溶液交联的温度保持在4-27℃。

11.一种填充剂，其包项1～3中任一项所述的凝胶或项5～10中任一项所述的方法制备的凝胶。

12.根据项11所述的填充剂，其为医疗软组织修复或美容用填充剂。

13.项1～3中任一项所述的凝胶或项5～10中任一项所述的方法制备的凝胶用于促进成纤维细胞增殖和迁移并且能够促进成纤维细胞表达分泌胶原蛋白的用途本申请具有以下有益技术效果。

本申请提供了上述可注射凝胶在诸如美容注射填充剂的医疗产品以及美容整形领域中的应用，包括软组织填充、药物递送。

本申请所使用的重组角蛋白，相较于普通角蛋白具有高活性、高纯度、高安全性以及无免疫原性等优势，在凝胶生产过程中无需添加各类交联剂，使用更加安全。

重组角蛋白和半胱氨酸的共价交联，吸收大量水分，同时，立体结构使得凝胶有着非常好的锁水能力；最后重组角蛋白可以在体内完全降解成氨基酸，同时，基于角蛋白的特殊性质，其降解速度也低于传统填充物，可作为新型人体填充物使用，维持时间更长。

重组角蛋白和半胱氨酸的协同使用，具有更好的抗氧化和刺激胶原蛋白再生的作用。

本申请交联重组角蛋白方法不需要交联剂参与，且在室温即可完成交联形成凝胶，工艺相对简单，凝胶粒径分布可控，能够满足工艺转化和大批量生产。

附图说明

图1为实验例4中结果柱状图；

图2A、图2B为实施例1与对比例6形成的凝胶对比图；

图3A为重组角蛋白凝胶注射于大鼠皮下24小时后照片；

图3B为重组胶原蛋白注射于大鼠皮下24小时后照片；

图3C仅注射生理盐水注射于大鼠皮下24小时后照片；

图4为实施例1重组角蛋白凝胶注射一周后大鼠皮肤组织H&E染色结果；

图5A为生理盐水对照组大鼠皮肤组织切片Masson染色图；

图5B为重组胶原蛋白组大鼠皮肤组织切片Masson染色图；

图5C为重组角蛋白凝胶组大鼠皮肤组织切片Masson染色图。

具体实施方式

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请提供一种可注射凝胶，包括角蛋白和半胱氨酸。

在本申请说明书中，“角蛋白”是一种纤维状天然蛋白质，为羊毛、人发、哺乳动物的蹄、角、甲，及禽类羽毛的主要组成成分。一般的，按照二级结构分类，角蛋白可分为α-角蛋白(分子量为40-60kDa)和β-角蛋白(分子量为10-25kDa)。本申请不限定角蛋白的种类和来源，本领域技术人员完全可以理解该角蛋白可以是任何天然来源的，也可以是通过分子生物学合成的。

目前已经公开的角蛋白制备方法多是机械方法、酸碱处理法、还原法、氧化法、电化学还原法、铜氨溶液法、金属盐法以及生物法制备的角蛋白。

在本申请说明书中，机械方法提取角蛋白，一般采用加压、加热，使毛发中角蛋白分子间二硫键断裂，但是机械提取法通常只能得到分子量较低的蛋白，甚至是多肽混合物。

在本申请说明书中，氧化法提取角蛋白，是用氧化剂把角蛋白中的二硫键打断氧化成磺酸基，制得角蛋白。所用氧化剂一般为过甲酸、过乙酸、过氧化氢等过氧化物。但是容易出现肽键氧化断裂现象，所获得角蛋白平均分子量不高。

在本申请说明书中，还原法提取角蛋白，是利用还原剂将角蛋白中二硫键还原成巯基，得到角蛋白。所用还原剂一般为巯基化合物，如巯基乙酸钠、巯基乙酸等。但是整个工艺复杂，角蛋白不稳定，制得的溶液会重新氧化还原成不溶物。

在本申请说明书中，酸碱处理法提取角蛋白，是利用强酸、强碱试剂溶胀毛发，然后在一定温度下水解，制得可溶性角蛋白，通常和还原剂配合使用。但是酸碱处理过程中不可避免的会出现蛋白质大分子肽键水解及二硫键的分解。提取过程会产生碱性废水和废酸的蒸汽，污染环境。

在本申请说明书中，生物法主要是利用微生物产生的角蛋白酶，对角蛋白进行诱导分解，是将角蛋白的高级结构酶解成氨基酸和多肽等次级结构。但是这种方法一般耗时较长，且产物多为分子量较低的多肽。

在本申请说明书中，基因工程制备角蛋白的过程中，采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白生产强度。重组角蛋白一般经过性能改造，胞外蛋白活性单一，简化了发酵下游的纯化工作。通过基因工程技术寻求新型的角蛋白。

在本申请说明书中，半胱氨酸在形成蛋白凝胶中起着至关重要的作用。蛋白质凝胶是由蛋白质分子之间的交联网络形成的三维结构，这种网络通常由半胱氨酸残基之间的二硫键交联所支撑。蛋白质中的半胱氨酸残基在酸性条件下发生氧化反应，形成二硫键。这些二硫键将不同的蛋白质分子连接在一起，形成一个稳定的交联网络结构。这种网络结构使得蛋白质分子之间产生了一个网状结构，从而形成了凝胶的三维结构。半胱氨酸交联的数量和位置可以调节蛋白质凝胶的性质。通过调整反应条件、半胱氨酸的含量和蛋白质的类型，可以控制凝胶的孔隙结构、孔径大小、孔隙分布以及凝胶的交联密度，从而调节凝胶的吸水性、稳定性和渗透性等性质。蛋白凝胶中的半胱氨酸交联不仅影响凝胶的物理性质，还可能对蛋白质的生物活性和功能产生影响。交联可能导致蛋白质构象的改变，从而影响其在细胞中的相互作用、信号传导以及与其他生物分子的结合等生物学行为。

在本申请说明书中，“二硫键”是一种较为稳定的化学键，它们的形成能够增加凝胶结构的稳定性。由于这些交联点的存在，蛋白质分子在凝胶中相互保持着相对固定的位置，从而增加了凝胶的机械强度和耐久性。

在本申请的一个具体实施方式中，所述角蛋白为经机械法、酸碱处理法、还原法、氧化法、电化学还原法、铜氨溶液法、金属盐法、生物法或基因工程制备的角蛋白，基因工程制备的角蛋白。

在本申请的一个具体实施方式中，所述角蛋白优选为基因工程制备的重组角蛋白。

在本申请的一个具体实施方式中，所述角蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或者是SEQ ID NO.1的保守突变体。

在本申请提供的一种上述可注射凝胶的制备方法，其中，包括如下步骤：

首先取适量的重组角蛋白溶于生理盐水中，调节pH至11.0，重组角蛋白在生理盐水中的占比为5-15wt％，例如可以是5wt％、5.5wt％、6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％、8wt％、8.5wt％、9wt％、9.5wt％、10wt％、10.5wt％、11wt％、11.5wt％、12wt％、12.5wt％、13wt％、13.5wt％、14wt％、14.5wt％、15wt％；

向重组角蛋白生理盐水溶液中加入1-2.5wt％半胱氨酸，例如可以是1wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.4wt％、2.5wt％；用盐酸调其pH至9.0±0.5，例如可以是pH＝8.5、pH＝8.6、pH＝8.7、pH＝8.8、pH＝8.9pH＝9.0、pH＝9.1、pH＝9.2、pH＝9.3、pH＝9.4、pH＝9.5，静置约3-5h使其形成凝胶，例如静置时间可以是3h、3.5h、4h、4.5h、5h；

将凝胶切块，用纯化水或PBS清洗3-5次至凝胶透明状，缓冲溶液和凝胶的体积比为20:1～50:1，例如可以是20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、此时凝胶的pH值下降至7.0左右；

将凝胶用均质机破碎，离心后收取沉淀，用生理盐水重悬，形成稳定的重组角蛋白凝胶混悬液，使其能够通过注射器注入体内。

在本申请的一个具体实施方式中，重组角蛋白溶液自交联形成凝胶的温度在4-27℃，例如可以是4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃。

本申请提供了上述可注射凝胶在诸如美容注射填充剂的医疗产品以及美容整形领域中的应用，包括软组织填充、药物递送。

实验例1重组角蛋白的制备

1.1重组角蛋白氨基酸序列的合成和筛选

角蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白全长416个氨基酸在其结构区域中，首位的氨基酸形成的结构域具有强疏水性，而角蛋白的活性结构主要为中间的α-螺旋结构，本申请在此基础上，进一步对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行改造：原始序列中前端存在大量的半胱氨酸，大肠杆菌表达及纯化工艺过程中易形成大量二硫键及错配，造成效率降低。经改造后，本申请的角蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本申请的重组角蛋白同时保留SEQ ID NO.1所示的氨基酸序的活性区域。改造后的角蛋白序列如下SEQ IDNO.2所示，留取56-367的氨基酸。

SEQ ID NO.1如下：

MPYNFCLPSLSCRTSCSSRPCVPPSCHSCTLPGACNIPANVSNCNWFCEGSFNGSEKETMQFLNDRLASYLEKVRQLERDNAELENLIRERSQQQEPLLCPSYQSYFKTIEELQQKILCTKSENARLVVQIDNAKLAADDFRTKYQTELSLRQLVESDINGLRRILDELTLCKSDLEAQVESLKEELLCLKSNHEQEVNTLRCQLGDRLNVEVDAAPTVDLNRVLNETRSQYEALVETNRREVEQWFTTQTEELNKQVVSSSEQLQSYQAEIIELRRTVNALEIELQAQHNLRDSLENTLTESEARYSSQLSQVQSLITNVESQLAEIRSDLERQNQEYQVLLDVRARLECEINTYRSLLESEDCNLPSNPCATTNACSKPIGPCLSNPCTSCVPPAPCTPCAPRPRCGPCNSFVR

SEQ ID NO.2如下：

KETMQFLNDRLASYLEKVRQLERDNAELENLIRERSQQQEPLLCPSYQSYFKTIEELQQKILCTKSENARLVVQIDNAKLAADDFRTKYQTELSLRQLVESDINGLRRILDELTLCKSDLEAQVESLKEELLCLKSNHEQEVNTLRCQLGDRLNVEVDAAPTVDLNRVLNETRSQYEALVETNRREVEQWFTTQTEELNKQVVSSSEQLQSYQAEIIELRRTVNALEIELQAQHNLRDSLENTLTESEARYSSQLSQVQSLITNVESQLAEIRSDLERQNQEYQVLLDVRARLECEINTYRSLL ESEDCNL

1.2重组角蛋白的制备

1.2.1扩增目的片段

1)目的基因的合成

按照大肠杆菌密码子使用偏爱性数据表中大肠杆菌的密码子使用偏好，对上述经初筛的重组角蛋白的编码区序列进行优化，在保证重组角蛋白的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在大肠杆菌中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子，改为用使用频率较高的密码子进行替换，得到密码子优化后的核酸序列，得到的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

根据所示的目的基因的核酸序列，经全基因合成并测序验证，得到模板基因，如SEQ ID NO:3所示。

SEQ ID NO.3如下：

GAAAAAGAAACCATGCAGTTTCTGAATGATCGTCTGGCGAGCTACCTGGAGAAAGTACGCCAGCTGGAACGCGATAATGCCGAACTGGAAAATCTGATTCGCGAACGCAGCCAGCAGCAGGAACCGCTGCTGTGCCCGAGCTACCAGAGCTATTTTAAAACCATTGAAGAACTGCAGCAGAAAATTCTGTGCACCAAAAGCGAAAACGCGCGCCTGGTTGTACAGATTGATAACGCCAAACTGGCGGCCGATGATTTCCGCACCAAATATCAGACCGAACTGAGCCTGCGCCAGCTGGTGGAAAGCGATATTAACGGTCTGCGCCGTATCCTGGATGAACTGACCCTGTGCAAATCCGATCTGGAAGCGCAGGTGGAAAGCCTGAAAGAAGAACTGCTGTGCCTGAAAAGCAACCATGAACAGGAAGTGAACACCCTGCGCTGCCAGCTGGGCGATCGTCTGAATGTGGAGGTGGATGCGGCCCCGACGGTGGATCTGAACCGCGTGCTGAACGAAACCCGTAGCCAATATGAAGCGCTGGTGGAAACCAACCGTCGTGAAGTGGAACAGTGGTTTACGACTCAGACCGAAGAACTGAATAAACAGGTGGTGAGTAGCTCAGAACAGCTGCAGTCATATCAGGCCGAAATCATTGAACTGCGCCGCACCGTGAACGCGCTGGAAATTGAACTGCAGGCCCAGCACAATCTGCGTGATAGCCTGGAAAATACCCTGACCGAAAGCGAAGCGCGCTATAGCAGCCAGCTGAGCCAGGTACAGAGCCTGATCACCAACGTGGAAAGCCAGCTGGCCGAAATTCGCAGCGATCTGGAACGCCAGAACCAGGAATATCAGGTGCTGCTGGATGTGCGCGCGCGCCTGGAATGCGAAATTAACACCTATCGCAGTCTGCTGGAAAGCGAAGACTGCAACCTG

2)根据目的基因的核酸序列，分别设计引物。以合成的模板基因为模板，以F-KRT31:CCCATATGGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGA(SEQ ID NO.4)和R-KRT31:CGGGATCCCAGGTTGCAGTCTTCGCTTTCCAG(SEQ ID NO.5)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μmol/L的引物1μL，1μL目的基因或线性化pET28a-His-TEV载体基因，dNTP(各2.5mM)4μL，10×Buffer(含Mg²⁺)5μL，1μL Pfu DNA Polymerase，加水补至总体积为50μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。

3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段(1.0kb左右)与预期片段大小相同，即获得目的基因片段及pET28a-His-TEV载体基因片断。

1.2.2构建重组质粒

1)将纯化的目的基因片段4μL及pET28a-His-TEV线性化载体6μL，10XCloneEZBuffer 2μL，CloneEZ Enzyme 2μL，去离子水补足20μL，混合，22℃保持30分钟，之后在冰上保持5分钟。

2)取100μL的DH5α或者Top10大肠杆菌感受态细胞，加入上述混合液，轻弹数下，置冰上孵育30分钟；42℃水浴中热激90秒，冰上孵育5分钟；向细胞中加入1mL SOC培养基，37℃轻摇1小时，转速为200rpm；5000rpm离心5分钟收集菌体，用100μL SOC液体培养基重悬菌体。

3)将菌体均匀地涂布在含抗生素平板上，37℃过夜培养。分别挑取3个阳性克隆接于含50μg/mL卡那霉素(Kan)抗生素的5mL LB培养基中37℃，220rpm/min过夜培养。

4)分别对每一个样品的菌液取3mL提取质粒(天根质粒提取试剂盒)，送南京金斯瑞进行测序，测序正确的命名为pET28a-His-TEV-KERATIN质粒。

1.2.3构建大肠杆菌基因工程菌

1)取BL21(DE3)感受态细胞于冰中溶解，取1μL重组质粒加入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀。在冰中静置30min后，于42℃热激60s迅速放回冰中。然后向感受态细胞中加入450μL室温LB培养基并于摇床37℃，220rpm摇1小时。

2)再从管中取100μL菌液涂于含Kan抗生性的LB平板，37℃过夜培养。从平板上挑2个阳性克隆接于含50μg/mL Kan抗生素的5mL LB培养基中，37℃，220rpm摇菌培养3h左右，OD600＝0.6，取菌液保种。即获得大肠杆菌基因工程菌。

1.2.4诱导重组蛋白表达

1)取上述收集的沉淀菌体细胞20g，用100mL Tris缓冲液重悬，缓冲液中50mMTris(pH 8.0)，500mM NaCl,5％wt Glycerol。均质机破碎2次，混匀，4000rpm 4℃离心0.5h，由于目的蛋白存在于包涵体中，所以收集沉淀备用。

2)将收集的沉淀用40mL变性buffer(50mM Tris(pH 8.0)，500mM NaCl，5％甘油，20mMβ-巯基乙醇，8M尿素，余量为去离子水)重悬溶解。充分溶解后，12000rpm离心1h取上清液，再将上清液转入5mL HisFF亲和柱中(经变性Buffer平衡)。

3)用10倍变性buffer冲洗层析柱。然后依次用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和500mM咪唑的变性buffer进行阶段洗脱，收集洗脱蛋白液，以透析液(25mMTris pH＝8.0，10mM咪唑，20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)脱盐换缓冲。

4)向步骤3)获得的蛋白液中加入TEV酶，在25℃条件下酶解2小时，除去蛋白N-末端的融合HIS标签，离心收集上清液。转入5mL HisFF亲和柱中(经透析液平衡)，用3倍透析液冲洗，收集流穿液。

5)以透析液(20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)透析脱盐，透析时间为12h，冻干，即得目标蛋白。

实施例1重组角蛋白凝胶的制备

取实验例1的经改造后的重组角蛋白冻干粉，先后加入生理盐水以及半胱氨酸，使重组角蛋白的终浓度为10wt％，半胱氨酸的终浓度为1wt％。角蛋白与半胱氨酸质量比为10：1，用3M盐酸调试其pH值至pH1＝9.0，蛋白原液粘度会发生明显变化，当溶液颜色从白色透明变为乳白色停止搅拌，25℃静置约4h使其自交联形成凝胶。将凝胶切块，用PBS缓冲液清洗至其成为透明状，此时凝胶的pH值为pH2，下降至7.0左右。将凝胶用均质机进行破碎后收取沉淀，用生理盐水重悬，得到稳定的重组角蛋白凝胶颗粒悬液，凝胶粒径50-1000微米，可通过注射针头直接挤出。该实施例在不添加交联剂的情况下可以产生质量可靠的凝胶，且该实施例中交联效果最优，凝胶质量最佳。

实施例2

与实施例1相比不同之处在于，重组角蛋白的终浓度为5wt％，由于重组角蛋白的含量有所降低，交联效果稍差，凝胶弹性模量低。

实施例3

与实施例1不同之处在于，静置3h形成凝胶，该实施例的交联效果较优，凝胶质量佳。

实施例4

与实施例1不同之处在于，用5M盐酸调试凝胶pH至pH1＝9.0，静置2h形成凝胶，该实施例的交联效果较优，凝胶质量佳。

实施例5

与实施例1不同之处在于，用1M盐酸调试凝胶pH至pH1＝9.0，静置5h形成凝胶，该实施例的交联效果优，凝胶质量佳。

实施例6

与实施例1不同之处在于，使用3M柠檬酸进行pH值的调节，该实施例的交联效果优，凝胶质量佳。

实施例7

与实施例1不同之处在于，在温度为4℃的条件下，静置过夜形成凝胶，由于温度过低，凝胶的形成速度过慢。

实施例8

与实施例1相比不同之处在于，使重组角蛋白的终浓度为15wt％，半胱氨酸的终浓度为1wt％，角蛋白与半胱氨酸质量比为15:1，用盐酸调试其pH值，由于重组角蛋白浓度过高，调试pH值时容易出现局部严重聚集，很难有效的形成立体凝胶。

对比例1

与实施例1不同之处在于，重组角蛋白自交联原液温度为40℃的条件下，静置过夜，由于温度过高，始终保持溶液状，不能形成凝胶。

对比例2

与实施例1不同之处在于，用3M盐酸调试凝胶pH至pH1＝8.0，静置5h，由于pH过低，并未形成凝胶。

对比例3

与实施例1不同之处在于，用3M盐酸调试凝胶pH至pH1＝10.0，静置4h形成凝胶，由于pH过高，所形成的凝胶强度较低，容易破碎。

对比例4

与实施例1不同之处在于，用3M盐酸调试凝胶pH至pH1＝9.0，静置1h，由于静置时长过短，并未形成凝胶。

对比例5

与实施例1相比不同之处在于，使重组角蛋白的终浓度为15wt％，半胱氨酸的终浓度为0.8wt％，角蛋白与半胱氨酸质量比为18.75:1，用盐酸调试pH，静置超过5h未形成凝胶。

对比例6

与实施例1相比不同之处在于，使重组角蛋白的终浓度为15wt％，半胱氨酸终浓度为0.5wt％，角蛋白与半胱氨酸质量比为30:1，用盐酸调试pH至pH1＝9.0，静置过夜未形成凝胶。

表1

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注：交联程度的评级由好到差依次为“+++”、“++”、“+”、“-”、“--”；“无”表示当前条件下无法产生凝胶。

结合表1所示各实施例及对比例的实验数据：

实施例1的效果最佳；

通过实施例2可以看出，由于重组角蛋白的含量有所降低，交联效果稍差，凝胶弹性模量低；

实施例3-实施例6的交联效果均为优或较优，凝胶质量佳；

通过实施例7可以看出，由于温度过低，凝胶的形成速度过慢，但凝胶质量佳；

通过实施例8可以看出，由于重组角蛋白浓度过高，调试pH值时容易出现局部严重聚集，很难有效的形成立体凝胶；

通过对比例1可以看出，由于温度过高，始终保持溶液状，不能形成凝胶；

通过对比例2可以看出，由于pH过低，不能形成凝胶；

通过对比例3可以看出，由于pH过高，所形成的凝胶强度较低，容易破碎；

通过对比例4可以看出，由于静置时长过短，不能形成凝胶；

通过对比例5-6可以看出，由于半胱氨酸含量较低，不能形成凝胶。

对比实施例1与对比例6所制备的重组角蛋白凝胶效果图如图2A、图2B所示。

实验例2弹性模量测试

选择实施例1-7制备的注射重组角蛋白凝胶，在测试温度25℃的条件下，狭缝宽度0.052mm，振动频率在0.1-100Hz范围，对注射重组角蛋白凝胶进行弹性模量测定。记录0.1Hz频率下的弹性模量，结果如表2所示。

实验例3体外降解研究

精密称取实施例1-7重组角蛋白凝胶颗粒混悬液0.5g，加入2mL的磷酸盐缓冲液(0.l mol/L，pH 7.0)和2mL胰蛋白酶液(0.1g/mL，碧云天，批号：20190201)，混合均匀后，置于42℃水浴中，不同酶解时间点取50μL混合液稀释至3mL，用紫外分光光度计测定280nm处的吸光度值，吸光度值不再变化的时间即为酶解时间，结果如表2所示。

表2

组别	弹性模量(Pa)	降解周期(小时)
			实施例1	1429	27
实施例2	680	17.5
			实施例3	963	20
实施例4	1107	26
			实施例5	1080	26.5
实施例6	925	25
			实施例7	1074	24

结果表明，实施例1-7在不添加交联剂的情况下均可以产生质量可靠的凝胶，其中，实施例1所制备的重组角蛋白凝胶质量最佳，其弹性模量最高，为1429Pa，其降解周期最长，为27h。综合实施例1-7的结果，当重组角蛋白和半胱氨酸的质量比α在5:1≤α＜15:1的范围内时，重组角蛋白浓度越高，形成的凝胶网状结构越致密，凝胶越稳定，抗酶解时间越长。另外，交联时间越长，重组角蛋白自身交联以及与半胱氨酸的交联越充分，对于形成凝胶的稳定性越好。

实验例4重组角蛋白注射凝胶的细胞活性测试

将L929细胞加入MEM培养基(10％马血清、1％双抗)中放入培养箱培养，将实施例1中重组角蛋白凝胶进行细胞活性测试，阳性对照组选用市面购买的重组胶原蛋白产品，空白对照组组则为配置好的新鲜培养基。然后在96孔板中分别放置重组角蛋白凝胶、重组角蛋白产品以及新鲜培养基，并以10000个细胞/孔的密度分别将L929细胞接种在96孔板中。将细胞在5％CO₂、37℃的培养箱中培养24h。吸出上清液后，分别加入上述准备好的不同待测组别。在孵育24、48和72h后将CCK8加入孔板，1h后用酶标仪测量溶液在450nm处的吸光值，实验结果如图1所示，

结果表明，重组角蛋白凝胶能够促进L929细胞的增殖分化、增强细胞活性。在24h、48h、72h重组角蛋白凝胶对于细胞活性的影响作用都大于其余两组，促进细胞增殖的效果显著优于市面购买的重组胶原蛋白。

实验例5重组角蛋白凝胶的炎症反应测试

将20只健康成年小鼠随机分为4组，5只为一组，用脱毛剂进行背部脱毛备皮，用水清洁皮肤后用碘酒对小鼠备皮皮肤消毒，用75％酒精脱碘。第1组为空白对照不注射任何试剂，第2组为阴性对照注射生理盐水，第3组为阳性对照注射市面购买的重组胶原蛋白，第四组为实验组，注射实施例1制备的重组角蛋白凝胶。每只小鼠皮下注射0.2mL，将注射过的小鼠置于相同的环境下饲养分别于饲养后3天、1周、2周、3周和5周时，每次处死小鼠各一只，处死采用断颈法，然后取其背部注射处皮肤，将注射实验材料部位皮肤用手术刀切下置于中性甲醛中固定，然后使用苏木精—伊红染色法染色并用普通光学显微镜拍照并作病理组织分析，观察其炎症反应，实验结果如图3至图5所示。

实验结果如图3A、图3B、图3C显示，重组角蛋白凝胶组、重组胶原蛋白组及生理盐水对照组注射一周后，H&E检测未见粒细胞浸润和细胞坏死，皮肤组织的表皮恢复完整，真皮层、皮肤附属器毛囊、皮脂腺和皮下组织等未见明显异常(如图4所示)。在对小鼠皮下进行相应注射1周、2周、3周和5周后，小鼠均无明显的炎症反应。这表明本申请所制备的重组角蛋白可注射水凝胶是一种更为安全、无毒、具有更好生物相容性的生物材料，可以有效解决传统生物材料生物相容性差和病毒隐患的问题。如图5A、图5B、图5C所示的Masson染色结果表明，重组角蛋白凝胶注射后可在真皮层观察到大面积胶原纤维，明显高于重组胶原蛋白和生理盐水对照组，表明重组角蛋白注射后，能够一定程度刺激真皮层成纤维细胞表达分泌胶原蛋白，起到更好、更持久的填充效果。

Claims (13)

1.一种可注射凝胶，其中，包括：

角蛋白和半胱氨酸；所述可注射凝的pH为中性。

2.根据权利要求1所述的可注射凝胶，其中，

所述角蛋白和半胱氨酸的质量比α为5:1≤α＜15:1。

3.根据权利要求1所述的可注射凝胶，其中，

所述角蛋白为经由经机械法、酸碱处理法、还原法、氧化法、电化学还原法、铜氨溶液法、金属盐法、生物法或基因工程制备的角蛋白。

4.一种权利要求1-3任一项所述的凝胶在制备医疗软组织修复或美容用填充剂中的应用。

5.一种可注射凝胶的制备方法，其中，

向上述重组角蛋白原液中加入半胱氨酸，调其pH至碱性，静置一段时间使其形成凝胶；

将凝胶切块，用大量的纯化水或PBS缓冲液清洗至透明状；

将凝胶用均质机破碎，离心后收取沉淀，用生理盐水重悬，形成稳定的重组角蛋白凝胶颗粒混悬液。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，加入的所述角蛋白原液与半胱氨酸的质量比大于等于5：1且小于15：1。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，调节加入半胱氨酸后的角蛋白溶液的所述酸溶液为盐酸或柠檬酸。

8.根据权利要求5所述的凝胶，其中，所述pH调节至弱碱性是指调节加入半胱氨酸后的角蛋白溶液至pH为8.5～9.5。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述静置时间为3小时以上。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，控制所述角蛋白溶液交联的温度保持在4-27℃。

11.一种填充剂，其包括权利要求1～3中任一项所述的凝胶或权利要求5～10中任一项所述的方法制备的凝胶。

12.根据权利要求11所述的填充剂，其为医疗软组织修复或美容用填充剂。

13.权利要求1～3中任一项所述的凝胶或权利要求5～10中任一项所述的方法制备的凝胶用于促进成纤维细胞增殖和迁移，以及促进成纤维细胞表达分泌胶原蛋白的用途。