JPH11338090A - 写真応用に適した組換コラ―ゲンを有するハロゲン化銀乳剤及びその調製 - Google Patents
写真応用に適した組換コラ―ゲンを有するハロゲン化銀乳剤及びその調製Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ハロゲン化銀乳剤の製造に使用するゼラチン
を、組替えＯＮＡ技術を用いて、低価格で高品質のもの
を提供する。 【解決手段】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上
を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、この乳剤が
核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペ
プタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有
し、ペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純
粋なコラーゲン様材料であり、ペプタイザーが４個を超
える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有するハロ
ゲン化銀乳剤及び該ＡｇＸ乳剤の調製方法。組換えコラ
ーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、0.95グラム
／リットルを超える程度まで微生物によるコラーゲン様
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有し、組換
えコラーゲンがらせん構造を有さず、この発現が大腸菌
またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起
こる製造方法。
を、組替えＯＮＡ技術を用いて、低価格で高品質のもの
を提供する。 【解決手段】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上
を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、この乳剤が
核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペ
プタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有
し、ペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純
粋なコラーゲン様材料であり、ペプタイザーが４個を超
える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有するハロ
ゲン化銀乳剤及び該ＡｇＸ乳剤の調製方法。組換えコラ
ーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、0.95グラム
／リットルを超える程度まで微生物によるコラーゲン様
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有し、組換
えコラーゲンがらせん構造を有さず、この発現が大腸菌
またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起
こる製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、改良された写真製
品と、該製品の改良された生産方法に関する。特に、こ
の改良は写真製品の成分の製造において組換えＤＮＡ技
術を利用することによりなされた。この興味ある成分と
はコラーゲンである。
品と、該製品の改良された生産方法に関する。特に、こ
の改良は写真製品の成分の製造において組換えＤＮＡ技
術を利用することによりなされた。この興味ある成分と
はコラーゲンである。
【０００２】
【従来の技術】写真製品の製造過程は、多くのことが開
示され、特許された複雑な操作である。一般的に言え
ば、印画紙やトリアセテート・セルロースフィルム等の
写真製品を製造する方法は、ラミネート紙又は透明なポ
リマー支持体上部に幾つかの層でコーティングすること
からなる。これらの層は、最も重要な成分として放射線
感受性ハロゲン化銀の結晶を含み得る乳剤層又はこれら
の感光性成分を持たない中間層として知られている。本
発明は感光層それ自体を向上させ、かつ写真層の製造方
法を向上させることに関する。
示され、特許された複雑な操作である。一般的に言え
ば、印画紙やトリアセテート・セルロースフィルム等の
写真製品を製造する方法は、ラミネート紙又は透明なポ
リマー支持体上部に幾つかの層でコーティングすること
からなる。これらの層は、最も重要な成分として放射線
感受性ハロゲン化銀の結晶を含み得る乳剤層又はこれら
の感光性成分を持たない中間層として知られている。本
発明は感光層それ自体を向上させ、かつ写真層の製造方
法を向上させることに関する。
【０００３】フィルムの製造方法においてゼラチンが使
われる段階がいくつかある。ゼラチンの機能は各段階で
異なるために各段階で必要とされる特性も異なり、コラ
ーゲン様物質がそれぞれの特定の応用に合うように明確
に適応させることが期待されることになる。
われる段階がいくつかある。ゼラチンの機能は各段階で
異なるために各段階で必要とされる特性も異なり、コラ
ーゲン様物質がそれぞれの特定の応用に合うように明確
に適応させることが期待されることになる。
【０００４】写真応用のためのハロゲン化銀乳剤の製造
方法に多くの注目が集められている。ＡｇＸ核形成の過
程およびその後の成熟過程に影響を与える、ハロゲン化
銀の粒子構造の役割及び特徴に多くの注意が払われてい
る。写真製品の乳剤層で最も重要な成分は、ハロゲン化
銀粒子と普通呼ばれ、ヨウ化物を任意に含む放射線感受
性臭化銀、放射線感受性塩化銀、または放射線感受性塩
化臭化銀微結晶からなる。粒子の析出中にペプタイザー
を導入して、制御できない凝集を避ける。さもなけれ
ば、その凝集は多くの欠点を示す。即ち、薄い中間物お
よび高いアスペクト比の平板粒子乳剤の形成を制限し
て、その後の写真撮影に不利をもたらす。多様な形態の
ゼラチンはペプタイザーとして写真の製造方法で用いら
れてきた。高いアスペクト比を有する平板状粒子は、鮮
明度の高さ、感度粒状性関係の向上、青色とマイナス青
色（minus blue）との感度分離の増大、より速い現像能
力およびより高い銀被覆力等の幾つかの写真上の利点を
持つことがよく知られている（Research Disclosure Vo
l. 225 Jan. 1983, Item 22534; EP-A-0.610.796）。ア
スペクト比が高いだけではなく、粒子サイズ分布が狭い
（これらは単分散あるいは均質拡散の要望として表され
る）平板状粒子を生産することも望まれている。
方法に多くの注目が集められている。ＡｇＸ核形成の過
程およびその後の成熟過程に影響を与える、ハロゲン化
銀の粒子構造の役割及び特徴に多くの注意が払われてい
る。写真製品の乳剤層で最も重要な成分は、ハロゲン化
銀粒子と普通呼ばれ、ヨウ化物を任意に含む放射線感受
性臭化銀、放射線感受性塩化銀、または放射線感受性塩
化臭化銀微結晶からなる。粒子の析出中にペプタイザー
を導入して、制御できない凝集を避ける。さもなけれ
ば、その凝集は多くの欠点を示す。即ち、薄い中間物お
よび高いアスペクト比の平板粒子乳剤の形成を制限し
て、その後の写真撮影に不利をもたらす。多様な形態の
ゼラチンはペプタイザーとして写真の製造方法で用いら
れてきた。高いアスペクト比を有する平板状粒子は、鮮
明度の高さ、感度粒状性関係の向上、青色とマイナス青
色（minus blue）との感度分離の増大、より速い現像能
力およびより高い銀被覆力等の幾つかの写真上の利点を
持つことがよく知られている（Research Disclosure Vo
l. 225 Jan. 1983, Item 22534; EP-A-0.610.796）。ア
スペクト比が高いだけではなく、粒子サイズ分布が狭い
（これらは単分散あるいは均質拡散の要望として表され
る）平板状粒子を生産することも望まれている。
【０００５】現在まで、工業的な方法に用いられるゼラ
チンは一般に、単に動物の骨及び皮からの導出により動
物源から得られている。この物質の欠点は、不純物の存
在と、その組成の性質が明確に定められていないため再
現性がないことである。どのような成分が存在し、どの
ような量であるのかも明らかでない。さらに、最適活性
に、どの成分が実際に必要とされるのかも不明である。
写真製造方法の種々の段階で使用されるゼラチン組成の
ばらつきがあるため写真製造方法の再現性は疑わしい。
チンは一般に、単に動物の骨及び皮からの導出により動
物源から得られている。この物質の欠点は、不純物の存
在と、その組成の性質が明確に定められていないため再
現性がないことである。どのような成分が存在し、どの
ような量であるのかも明らかでない。さらに、最適活性
に、どの成分が実際に必要とされるのかも不明である。
写真製造方法の種々の段階で使用されるゼラチン組成の
ばらつきがあるため写真製造方法の再現性は疑わしい。
【０００６】写真応用でのゼラチンの欠点は、長年にわ
たり詳細に取り組まれ、種々の特許出願の課題となって
きた。これらの文献のほとんどは、修飾ゼラチンの特性
に特別な改良を取り入れるために、動物源からの導出後
の該修飾ゼラチンを改良する方法に取り組むことに向け
られている。1984年、米国特許4,439,520 号は、結晶の
50％以上がアスペクト比８を越えることが望ましいと記
載しているが、これによって青色の感度が高められるか
らである。1987年の米国特許4,713,320 号は、メチオニ
ン含量が１グラムあたり30マイクロモル以下、好ましく
は１グラムあたり５マイクロモル以下のゼラチンを使用
して、台形、六角形および三角形の薄い平板状粒子を得
ることが記載されている。ゼラチン１グラムあたり30マ
イクロモル以下のメチオニンレベルを得るために酸化し
ておいた正常な骨由来のゼラチンが使用された。それよ
りも低いメチオニン含量は、析出条件中に広い範囲のｐ
Ｂｒを提供するものとして1990年の米国特許4,914,014
号にも記載されている。多くの刊行物がゼラチンのメチ
オニン含量を減少させる方法を包含している。1993年に
公開されたEP-558,410号は、アルカリ次亜塩素酸塩また
はＨ2 Ｏ2 の酸化性試薬反応を、J. Phot. Sci., 40, 2
30-230(Nippi) 、1992年のJ. Photo. Sci.,37, 14-18(A
GFA) および1989年のJ. Imag. Sci., 33, 13-17の論文
におけるように記載している。1959年の初期でさえ、酸
化が不純物を除去するための方法として示唆されてい
た。
たり詳細に取り組まれ、種々の特許出願の課題となって
きた。これらの文献のほとんどは、修飾ゼラチンの特性
に特別な改良を取り入れるために、動物源からの導出後
の該修飾ゼラチンを改良する方法に取り組むことに向け
られている。1984年、米国特許4,439,520 号は、結晶の
50％以上がアスペクト比８を越えることが望ましいと記
載しているが、これによって青色の感度が高められるか
らである。1987年の米国特許4,713,320 号は、メチオニ
ン含量が１グラムあたり30マイクロモル以下、好ましく
は１グラムあたり５マイクロモル以下のゼラチンを使用
して、台形、六角形および三角形の薄い平板状粒子を得
ることが記載されている。ゼラチン１グラムあたり30マ
イクロモル以下のメチオニンレベルを得るために酸化し
ておいた正常な骨由来のゼラチンが使用された。それよ
りも低いメチオニン含量は、析出条件中に広い範囲のｐ
Ｂｒを提供するものとして1990年の米国特許4,914,014
号にも記載されている。多くの刊行物がゼラチンのメチ
オニン含量を減少させる方法を包含している。1993年に
公開されたEP-558,410号は、アルカリ次亜塩素酸塩また
はＨ2 Ｏ2 の酸化性試薬反応を、J. Phot. Sci., 40, 2
30-230(Nippi) 、1992年のJ. Photo. Sci.,37, 14-18(A
GFA) および1989年のJ. Imag. Sci., 33, 13-17の論文
におけるように記載している。1959年の初期でさえ、酸
化が不純物を除去するための方法として示唆されてい
た。
【０００７】組換え核酸技術を用いてコラーゲンおよび
コラーゲン様タンパク質自体になされた多くの研究も存
在する。しかし、コラーゲンと組合わせて組換えＤＮＡ
技術を用いることおよび写真応用においてそれを適用す
ることは意外なことに欠如している。組換えコラーゲン
の領域で発表された文献のほとんどはコラーゲンをコー
ドする配列の発現を必要とさえしない染色体核酸のＰＣ
Ｒ技術を用いる診断応用に向けられていた。染色体中の
該配列の単なる存在がこれらの実例での診断にとっては
十分である。コラーゲンをコードする配列の発現を実際
に示すそうした文献のいずれもが、確かに高レベルの発
現を必要としなかった。もしくは、発現が示されていて
も、完全な配列ではなく、むしろコード配列の単なる部
分が発現された。しばしば、これらの部分的な配列は、
必要とされるタンパク質材料の量が最小となるように抗
体を得るために用いられている。さらに、抗体がいった
ん得られたら、該配列は医薬応用のためにはそれ以上は
必要とされない。したがって、これらの例では、低い発
現は実際的な問題ではない。また、コード配列の小さい
部分の発現は、コード配列の高い程度の繰返しが原因と
なる発現問題を排除することが期待できる。
コラーゲン様タンパク質自体になされた多くの研究も存
在する。しかし、コラーゲンと組合わせて組換えＤＮＡ
技術を用いることおよび写真応用においてそれを適用す
ることは意外なことに欠如している。組換えコラーゲン
の領域で発表された文献のほとんどはコラーゲンをコー
ドする配列の発現を必要とさえしない染色体核酸のＰＣ
Ｒ技術を用いる診断応用に向けられていた。染色体中の
該配列の単なる存在がこれらの実例での診断にとっては
十分である。コラーゲンをコードする配列の発現を実際
に示すそうした文献のいずれもが、確かに高レベルの発
現を必要としなかった。もしくは、発現が示されていて
も、完全な配列ではなく、むしろコード配列の単なる部
分が発現された。しばしば、これらの部分的な配列は、
必要とされるタンパク質材料の量が最小となるように抗
体を得るために用いられている。さらに、抗体がいった
ん得られたら、該配列は医薬応用のためにはそれ以上は
必要とされない。したがって、これらの例では、低い発
現は実際的な問題ではない。また、コード配列の小さい
部分の発現は、コード配列の高い程度の繰返しが原因と
なる発現問題を排除することが期待できる。
【０００８】長い繰返し配列に関連する発現問題を克服
する努力において、および新しいタイプのタンパク質、
即ち合成タンパク質を設計する努力において合成核酸が
設計されてきた。しかし、そのような合成ポリペプチド
は生産に非常に費用がかかる。よって、写真フィルム生
産の分野に必要とされるラージスケール生産を必要とす
る利用にそれを応用することはできない。
する努力において、および新しいタイプのタンパク質、
即ち合成タンパク質を設計する努力において合成核酸が
設計されてきた。しかし、そのような合成ポリペプチド
は生産に非常に費用がかかる。よって、写真フィルム生
産の分野に必要とされるラージスケール生産を必要とす
る利用にそれを応用することはできない。
【０００９】よって、先行技術の多くの応用は工業的規
模での生産に必要とされる高い程度の発現を必要としな
いし、実際に所望の結果も提供してはいない。その結
果、これらの種類の応用を考察する文献は天然コラーゲ
ン配列または対応する長さと構造の配列の高い発現を得
る問題を扱ってもいないし解決もしていない。
模での生産に必要とされる高い程度の発現を必要としな
いし、実際に所望の結果も提供してはいない。その結
果、これらの種類の応用を考察する文献は天然コラーゲ
ン配列または対応する長さと構造の配列の高い発現を得
る問題を扱ってもいないし解決もしていない。
【００１０】先行技術が天然の配列またはその部分を発
現することを示唆する場合は一般に、一般用語が用いら
れ、さらに詳細を示すことなく一般的な形質転換法のハ
ンドブックが照会される。生産用生物と発現程度が重要
性が低く、注目されてこなかったために、提供されるど
の具体例も大腸菌およびサッカロミセス・セレビシアエ
である。
現することを示唆する場合は一般に、一般用語が用いら
れ、さらに詳細を示すことなく一般的な形質転換法のハ
ンドブックが照会される。生産用生物と発現程度が重要
性が低く、注目されてこなかったために、提供されるど
の具体例も大腸菌およびサッカロミセス・セレビシアエ
である。
【００１１】コラーゲン様タンパク質の発現問題を扱う
場合、これは修飾大腸菌または高等動物細胞および昆虫
細胞のいずれかを用いることにより生じている。後者の
生物は、翻訳後プロセスについても修飾される。しか
し、後者の種類の細胞利用は、細胞、培地および産物の
単離の費用が高いために、大規模生産ではひどく費用が
かさむ。大腸菌の欠点は、それが所望の産物を分泌でき
ないことである。さらに、発現される核酸配列の繰返し
は形質転換バクテリアの不安定性をもたらし、その結
果、コラーゲン様コード配列の発現量が低下する。よっ
て、写真フィルム生産の分野で要求される大規模生産を
必要とする応用においてそのような生産（微）生物を適
用することができない。
場合、これは修飾大腸菌または高等動物細胞および昆虫
細胞のいずれかを用いることにより生じている。後者の
生物は、翻訳後プロセスについても修飾される。しか
し、後者の種類の細胞利用は、細胞、培地および産物の
単離の費用が高いために、大規模生産ではひどく費用が
かさむ。大腸菌の欠点は、それが所望の産物を分泌でき
ないことである。さらに、発現される核酸配列の繰返し
は形質転換バクテリアの不安定性をもたらし、その結
果、コラーゲン様コード配列の発現量が低下する。よっ
て、写真フィルム生産の分野で要求される大規模生産を
必要とする応用においてそのような生産（微）生物を適
用することができない。
【００１２】多くの研究努力は、動物源に存在するコラ
ーゲンの状態、すなわち工業的規模の写真応用で現在使
用されているコラーゲンの状態である繊維原状または三
重らせんを得るために必要とされる翻訳後修飾を行うこ
とに向けられている。三重らせんを有するコラーゲンを
達成するため、より具体的には繊維原コラーゲンを達成
するためにコラーゲン様材料を発現させる場合、翻訳後
プロセス装置それ自体を有するか、または翻訳後プロセ
シング酵素のコード配列を付加することにより該プロセ
ス装置を有する宿主細胞を用いるべきであることは一般
的に認められている。この形態のコラーゲンが応用に有
用な形態であることが通常認められている。
ーゲンの状態、すなわち工業的規模の写真応用で現在使
用されているコラーゲンの状態である繊維原状または三
重らせんを得るために必要とされる翻訳後修飾を行うこ
とに向けられている。三重らせんを有するコラーゲンを
達成するため、より具体的には繊維原コラーゲンを達成
するためにコラーゲン様材料を発現させる場合、翻訳後
プロセス装置それ自体を有するか、または翻訳後プロセ
シング酵素のコード配列を付加することにより該プロセ
ス装置を有する宿主細胞を用いるべきであることは一般
的に認められている。この形態のコラーゲンが応用に有
用な形態であることが通常認められている。
【００１３】組換えコラーゲンが写真応用に利用できる
ことを確定的でないにせよ、先行技術が実際に示唆して
いる場合、コラーゲン材料の特別な形態の関連性は、応
用のために特異な要件に対して通常は取り上げられなか
った。ある特許出願は、組換えコラーゲンを写真フィル
ム用に用いることを見過ごしてきた一方で、他の特許出
願は写真応用を具体的にさえ示している。しかし、そう
した文献の教示は明らかに他の問題に関するもので、写
真応用およびその特定の要件には具体的には向けられて
いない。さらに分析するならば、さまざまな理由から、
それら出願で提供される具体例のいずれも写真フィルム
への応用に実際に適することを示してはいない。これら
特許出願は組換えコラーゲンを写真製造方法に応用しよ
うとするときには実施不能であり、単なる自然の推論と
みなされる。そのような文献の具体例を以下に示す。
ことを確定的でないにせよ、先行技術が実際に示唆して
いる場合、コラーゲン材料の特別な形態の関連性は、応
用のために特異な要件に対して通常は取り上げられなか
った。ある特許出願は、組換えコラーゲンを写真フィル
ム用に用いることを見過ごしてきた一方で、他の特許出
願は写真応用を具体的にさえ示している。しかし、そう
した文献の教示は明らかに他の問題に関するもので、写
真応用およびその特定の要件には具体的には向けられて
いない。さらに分析するならば、さまざまな理由から、
それら出願で提供される具体例のいずれも写真フィルム
への応用に実際に適することを示してはいない。これら
特許出願は組換えコラーゲンを写真製造方法に応用しよ
うとするときには実施不能であり、単なる自然の推論と
みなされる。そのような文献の具体例を以下に示す。
【００１４】WO90／05177 号は、小さい繰返し配列を有
する新規なポリマーの生産を記載し、具体的には絹等の
繰返し基が開示されている。コラーゲンは繰返し単位を
提供することのできる構造の一つとして示唆されてい
る。「ＣＬＰの性質は高温で熱可逆的なゲル化を受け、
ならびに免疫原性を有さないように設計される。らせん
の高い安定性により、ＣＬＰから形成された繊維または
膜が高い引張り強度をもたらすに違いない。これらの鎖
性質により、硬質基体に塗布される場合に柔軟な被膜と
して働くに違いない水溶液中のハイドロゲルコロイドが
生成されるべきである」ことが述べられている。次に、
細胞レセプターのリガンドを有する柔軟な被膜材料が示
唆されている。ＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤ
ＧＳＰの配列がＣＬＰモノマーに加えられるべきであっ
て、大腸菌から発現される構築物の一例が提供されてい
る。この組成物に関して、「本組成物は傷の包帯として
の利用を見出し、血管新生、目への適用、人工器官のマ
トリックス等を可能とする」と開示されている。ＣＬＰ
と他の繰返しの機能単位との組合せにより機能を組み合
せることも示唆されている。しかし、使用される配列の
具体例は提供されていない。
する新規なポリマーの生産を記載し、具体的には絹等の
繰返し基が開示されている。コラーゲンは繰返し単位を
提供することのできる構造の一つとして示唆されてい
る。「ＣＬＰの性質は高温で熱可逆的なゲル化を受け、
ならびに免疫原性を有さないように設計される。らせん
の高い安定性により、ＣＬＰから形成された繊維または
膜が高い引張り強度をもたらすに違いない。これらの鎖
性質により、硬質基体に塗布される場合に柔軟な被膜と
して働くに違いない水溶液中のハイドロゲルコロイドが
生成されるべきである」ことが述べられている。次に、
細胞レセプターのリガンドを有する柔軟な被膜材料が示
唆されている。ＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤ
ＧＳＰの配列がＣＬＰモノマーに加えられるべきであっ
て、大腸菌から発現される構築物の一例が提供されてい
る。この組成物に関して、「本組成物は傷の包帯として
の利用を見出し、血管新生、目への適用、人工器官のマ
トリックス等を可能とする」と開示されている。ＣＬＰ
と他の繰返しの機能単位との組合せにより機能を組み合
せることも示唆されている。しかし、使用される配列の
具体例は提供されていない。
【００１５】提供された唯一の具体例は、Ｎ末端および
Ｃ末端スペーサーを有する組換えで作られた合成ＣＬＰ
ポリペプチド［［ＧＡＰ（ＧＰＰ）３］２［ＧＰＶＧＳ
Ｐ］ｎを示している。該スペーサーは長さがそれぞれ３
３アミノ酸および２５アミノ酸である。例えば、長さが
２４アミノ酸のポリマーの繰返しＧＰＰ部分は３３＋２
５＋６アミノ酸により分けられる。このようにして、大
腸菌は７６０アミノ酸、すなわちＭｗ63,800のＣＬＰタ
ンパク質を見かけ上うまく発現する。細胞結合性ＣＬＰ
は同一の基本的な構造を有するが、ヘキサマーが上記の
細胞配列により置き換えられるために、８１４アミノ酸
のアミノ酸長およびＭｗ70,560をもたらす。発現される
繰返しＧＸＹ部分は短く、長い非繰返し配列により分け
られている。スペーサーＤＮＡは２個のシステイン残基
および３個のメチオニン残基もコードする。
Ｃ末端スペーサーを有する組換えで作られた合成ＣＬＰ
ポリペプチド［［ＧＡＰ（ＧＰＰ）３］２［ＧＰＶＧＳ
Ｐ］ｎを示している。該スペーサーは長さがそれぞれ３
３アミノ酸および２５アミノ酸である。例えば、長さが
２４アミノ酸のポリマーの繰返しＧＰＰ部分は３３＋２
５＋６アミノ酸により分けられる。このようにして、大
腸菌は７６０アミノ酸、すなわちＭｗ63,800のＣＬＰタ
ンパク質を見かけ上うまく発現する。細胞結合性ＣＬＰ
は同一の基本的な構造を有するが、ヘキサマーが上記の
細胞配列により置き換えられるために、８１４アミノ酸
のアミノ酸長およびＭｗ70,560をもたらす。発現される
繰返しＧＸＹ部分は短く、長い非繰返し配列により分け
られている。スペーサーＤＮＡは２個のシステイン残基
および３個のメチオニン残基もコードする。
【００１６】この挙げられた文献は、コラーゲンに関す
る導入部で「化学的に加水分解された天然コラーゲンを
加熱と冷却により変成、再生させて、他の応用の中でも
写真および医薬応用に用いられるゼラチンを作ることが
できる。この現象の原因となるコラーゲンの鎖性質は、
三重らせんと呼ばれる高次構造を有する相互鎖凝集体を
自発的に形成する能力である。」と述べている。よっ
て、この先行技術の文献では、らせん構造が必要とされ
ることが特に注目されている。その後の文章は写真応用
については実際のところ何も示していなく、明らかに完
全に他の事項に向けられている。その後の文章も大腸菌
により得られた発現の実際の程度について何も示してい
ない。繰返し構造は低い程度で存在しているので、写真
応用に有用なように十分なコラーゲン様活性を保持する
ことは起こりにくい。さらに、発現生成物中において、
システインとメチオニン残基が実際に提供されるレベル
で存在することにより、実際に写真応用にＡｇＸ乳剤中
で使用するのを不適当なものとしている。さらに、ここ
で記載の繰返しの少ない配列の利用が大腸菌の向上レベ
ルの発現を実際に提供したのかどうかが明らかでない。
よって、写真応用の当業者らは写真応用におけるこの文
献の教示を適用することを思いとどまるであろう。第一
に、工業的な規模の生産が可能かどうかが明らかでない
からである。繰返し配列の不安定性を考慮すると、この
ことはありそうにもない。第二に、それは、写真応用の
ためのＡｇＸ乳剤における不所望なシステインおよびメ
チオニンの存在のためにありそうにもない。第三に、こ
のことは、発現生成物のらせん構造がないためにありそ
うにもない。その影響は発現産物の安定性に対して、お
よび現在のゼラチンの主要な構造的違いを鑑みて写真で
の利用可能性に対して完全には予測することはできな
い。
る導入部で「化学的に加水分解された天然コラーゲンを
加熱と冷却により変成、再生させて、他の応用の中でも
写真および医薬応用に用いられるゼラチンを作ることが
できる。この現象の原因となるコラーゲンの鎖性質は、
三重らせんと呼ばれる高次構造を有する相互鎖凝集体を
自発的に形成する能力である。」と述べている。よっ
て、この先行技術の文献では、らせん構造が必要とされ
ることが特に注目されている。その後の文章は写真応用
については実際のところ何も示していなく、明らかに完
全に他の事項に向けられている。その後の文章も大腸菌
により得られた発現の実際の程度について何も示してい
ない。繰返し構造は低い程度で存在しているので、写真
応用に有用なように十分なコラーゲン様活性を保持する
ことは起こりにくい。さらに、発現生成物中において、
システインとメチオニン残基が実際に提供されるレベル
で存在することにより、実際に写真応用にＡｇＸ乳剤中
で使用するのを不適当なものとしている。さらに、ここ
で記載の繰返しの少ない配列の利用が大腸菌の向上レベ
ルの発現を実際に提供したのかどうかが明らかでない。
よって、写真応用の当業者らは写真応用におけるこの文
献の教示を適用することを思いとどまるであろう。第一
に、工業的な規模の生産が可能かどうかが明らかでない
からである。繰返し配列の不安定性を考慮すると、この
ことはありそうにもない。第二に、それは、写真応用の
ためのＡｇＸ乳剤における不所望なシステインおよびメ
チオニンの存在のためにありそうにもない。第三に、こ
のことは、発現生成物のらせん構造がないためにありそ
うにもない。その影響は発現産物の安定性に対して、お
よび現在のゼラチンの主要な構造的違いを鑑みて写真で
の利用可能性に対して完全には予測することはできな
い。
【００１７】前述の特許出願と同一の発明者らは、WO93
／10154 号においてプロリン含量が減少した繰返し三つ
組残基（repetitive triads)を有する高分子量コラーゲ
ン様タンパク質ポリマーを開示する。該ポリマーは、高
分子量および高頻度で単細胞微生物において産生が可能
なものとして述べられている。これらは、「コラーゲン
繰返しトリペプチドの独自性は、配列中の高い繰返し性
と組成中のアミノ酸であるグリシン及びプロリンの配列
を頻繁に利用する観点から組換え技術に対する挑戦であ
る。グリシンおよびプロリンを高レベルで有するタンパ
ク質をコードする遺伝子は、必要により自己相補的配列
中の高レベルのヌクレオチドであるグアニジン及びシチ
ジンからなる。例えば、遺伝子を合成するにしたがっ
て、ストランドがループから外れ、一本鎖ＤＮＡが切除
され、組換えが起こって遺伝子セグメントの損失と非能
率的な転写および／または翻訳をもたらしうる実質的な
機会が存在する。よって、コラーゲンの有利な性質を提
供しながら、同時に高分子量コラーゲン様タンパク質の
安定な発現を可能とする技術および組成物の開発に実質
的な興味がある。」ことを示している。さらに、「該ポ
リマーは、らせんを提供し、コラーゲンのように変成と
再生が可能であり、ゲルを形成するなどの点でさらに特
性付けられよう」と述べられている。分子量30〜150 ｋ
Ｄが示唆され、グリシン間のアミノ酸の数の少なくとも
45％がプロリンであり、三つ組残基の少なくとも80重量
％が第一のアミノ酸としてグリシンを有し、三つ組残基
の数の少なくとも40％は少なくとも一つのプロリンを有
する。その具体例は、繰返しＧＸＯをコードする配列お
よびＮ末端とＣ末端スペーサー配列の３タイプの使用を
示している。前記特許出願と同じスペーサー配列が用い
られた。繰返し配列の構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］
２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）２４（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）
２］２＝［［Ｃ］２［Ａ］２４［Ｃ］２］２であった。
作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ46.409ダルトンの
561アミノ酸であった。別の実施例において、繰り返し
配列は、［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧ
ＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］５＝［［Ｃ］２
［Ａ］１２［Ｃ］２］５であった。作られたポリペプチ
ドの長さは、Ｍｗ64.094ダルトンの777 アミノ酸であ
り、100ｋＤの観察されたタンパク質バンドを有した。
第三の具体例において、その構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧ
ＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＤＰＧＰＰ）１２
（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］４＝［［Ｃ］２［ＡＢ］１
２［Ｃ］２］４であった。その具体例は1065アミノ酸お
よびＭｗ91,966を有し、 135ｋＤに見えるタンパク質バ
ンドを有した。明らかに小さいバージョンも28ｋＤ、64
ｋＤおよび98ｋＤのタンパク質バンド重量を有して作ら
れた。発現に関して、提供される唯一の詳細は、抗血清
を用いるウエスタンブロットによる検出が実施され、全
長ポリマーの発現が遺伝子サイズとともに減少する一方
で、全長ｍＲＮＡの合成は等しいレベルにあったことで
ある。二つの異なる繰返し単位を有するポリマーのもう
一つのグループは、作られた［［Ｃ］２［ＤＢ］１２
［Ｃ］２］４、［［Ｃ］２［ＤＢ］６［Ｃ］２］４およ
び［［Ｃ］２［Ｄ］２４［Ｃ］２］４であり、ここでＢ
とＣは上記の通りであり、Ｄ＝ＧＡＱＧＰＡＧＰＧであ
る。これらの３つのタンパク質はそれぞれ、1065アミノ
酸およびＭｗ91,533Ｄ、 633アミノ酸およびＭｗ55,228
Ｄ、1065アミノ酸およびＭｗ85,386Ｄを有し、140 ｋＤ
に見えるタンパク質バンドを有した。これらの例のう
ち、産物の特性に関する唯一の情報はナンバー６につい
て提供されている。この産物は非常に水溶性である。室
温以上では、８％を超えるその水溶液は粘性があるが、
流動性があり０℃に冷却すると固体のゲルを形成する。
28℃以上の加熱で、ゲルは濃厚な溶液を形成する。液体
とゲルとの熱的可逆性変移がこうして示される。最終的
な具体例は、同一のスペーサーと1077アミノ酸およびＭ
ｗ91.266Ｄを有する構造（ＧＡＰＳＱＧＡＰＧＬＱ）６
８に関した。そのようなポリペプチドの利用に関して、
これらの発明者らの前に挙げた出願以上のことは何も述
べられていない。明らかに、繰返しＧＸＯ部分のブロッ
クコポリマー構造を変えることにより、さらに長い繰返
し配列の発現が起こることは可能となった。しかし、そ
のようなタンパク質が如何に効率的に発現されるかは明
らかでない。さらにまた、繰返しによる発現の問題は解
決されているものとしては示されていない。工業的規模
の発現が達成できたことには疑問がある。具体的に写真
応用に関する教示は提供されていない。特に、すべての
具体例は写真応用で望まれないシステインとメチオニン
を有するスペーサーを利用する。よって、写真応用の当
業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思い
とどまったであろう。
／10154 号においてプロリン含量が減少した繰返し三つ
組残基（repetitive triads)を有する高分子量コラーゲ
ン様タンパク質ポリマーを開示する。該ポリマーは、高
分子量および高頻度で単細胞微生物において産生が可能
なものとして述べられている。これらは、「コラーゲン
繰返しトリペプチドの独自性は、配列中の高い繰返し性
と組成中のアミノ酸であるグリシン及びプロリンの配列
を頻繁に利用する観点から組換え技術に対する挑戦であ
る。グリシンおよびプロリンを高レベルで有するタンパ
ク質をコードする遺伝子は、必要により自己相補的配列
中の高レベルのヌクレオチドであるグアニジン及びシチ
ジンからなる。例えば、遺伝子を合成するにしたがっ
て、ストランドがループから外れ、一本鎖ＤＮＡが切除
され、組換えが起こって遺伝子セグメントの損失と非能
率的な転写および／または翻訳をもたらしうる実質的な
機会が存在する。よって、コラーゲンの有利な性質を提
供しながら、同時に高分子量コラーゲン様タンパク質の
安定な発現を可能とする技術および組成物の開発に実質
的な興味がある。」ことを示している。さらに、「該ポ
リマーは、らせんを提供し、コラーゲンのように変成と
再生が可能であり、ゲルを形成するなどの点でさらに特
性付けられよう」と述べられている。分子量30〜150 ｋ
Ｄが示唆され、グリシン間のアミノ酸の数の少なくとも
45％がプロリンであり、三つ組残基の少なくとも80重量
％が第一のアミノ酸としてグリシンを有し、三つ組残基
の数の少なくとも40％は少なくとも一つのプロリンを有
する。その具体例は、繰返しＧＸＯをコードする配列お
よびＮ末端とＣ末端スペーサー配列の３タイプの使用を
示している。前記特許出願と同じスペーサー配列が用い
られた。繰返し配列の構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］
２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）２４（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）
２］２＝［［Ｃ］２［Ａ］２４［Ｃ］２］２であった。
作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ46.409ダルトンの
561アミノ酸であった。別の実施例において、繰り返し
配列は、［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧ
ＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］５＝［［Ｃ］２
［Ａ］１２［Ｃ］２］５であった。作られたポリペプチ
ドの長さは、Ｍｗ64.094ダルトンの777 アミノ酸であ
り、100ｋＤの観察されたタンパク質バンドを有した。
第三の具体例において、その構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧ
ＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＤＰＧＰＰ）１２
（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］４＝［［Ｃ］２［ＡＢ］１
２［Ｃ］２］４であった。その具体例は1065アミノ酸お
よびＭｗ91,966を有し、 135ｋＤに見えるタンパク質バ
ンドを有した。明らかに小さいバージョンも28ｋＤ、64
ｋＤおよび98ｋＤのタンパク質バンド重量を有して作ら
れた。発現に関して、提供される唯一の詳細は、抗血清
を用いるウエスタンブロットによる検出が実施され、全
長ポリマーの発現が遺伝子サイズとともに減少する一方
で、全長ｍＲＮＡの合成は等しいレベルにあったことで
ある。二つの異なる繰返し単位を有するポリマーのもう
一つのグループは、作られた［［Ｃ］２［ＤＢ］１２
［Ｃ］２］４、［［Ｃ］２［ＤＢ］６［Ｃ］２］４およ
び［［Ｃ］２［Ｄ］２４［Ｃ］２］４であり、ここでＢ
とＣは上記の通りであり、Ｄ＝ＧＡＱＧＰＡＧＰＧであ
る。これらの３つのタンパク質はそれぞれ、1065アミノ
酸およびＭｗ91,533Ｄ、 633アミノ酸およびＭｗ55,228
Ｄ、1065アミノ酸およびＭｗ85,386Ｄを有し、140 ｋＤ
に見えるタンパク質バンドを有した。これらの例のう
ち、産物の特性に関する唯一の情報はナンバー６につい
て提供されている。この産物は非常に水溶性である。室
温以上では、８％を超えるその水溶液は粘性があるが、
流動性があり０℃に冷却すると固体のゲルを形成する。
28℃以上の加熱で、ゲルは濃厚な溶液を形成する。液体
とゲルとの熱的可逆性変移がこうして示される。最終的
な具体例は、同一のスペーサーと1077アミノ酸およびＭ
ｗ91.266Ｄを有する構造（ＧＡＰＳＱＧＡＰＧＬＱ）６
８に関した。そのようなポリペプチドの利用に関して、
これらの発明者らの前に挙げた出願以上のことは何も述
べられていない。明らかに、繰返しＧＸＯ部分のブロッ
クコポリマー構造を変えることにより、さらに長い繰返
し配列の発現が起こることは可能となった。しかし、そ
のようなタンパク質が如何に効率的に発現されるかは明
らかでない。さらにまた、繰返しによる発現の問題は解
決されているものとしては示されていない。工業的規模
の発現が達成できたことには疑問がある。具体的に写真
応用に関する教示は提供されていない。特に、すべての
具体例は写真応用で望まれないシステインとメチオニン
を有するスペーサーを利用する。よって、写真応用の当
業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思い
とどまったであろう。
【００１８】フランス特許2685347 号は、ゼラチンに性
質の類似する組換え材料を作ることが望ましいことを論
じている。その利点は、再現性の問題を解決するさらに
均質な製品およびその化学的機能を改良する機会であろ
う。その考えはオリゴペプチドをゼラチン代用物として
作ることである。選択された微生物は大腸菌であり、大
腸菌に共通するグリコシル化等の翻訳後修飾がないこと
は問題ではないことが述べられている。他の宿主が可能
であることが述べられている。しかし、そうした可能な
宿主の具体例は示されていない。適用される核酸配列
は、選択を起こすためのＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔコドンに結合させた（Ｇｌ
ｙ−Ｘ−Ｙ）ｎのゼラチンペプチドをコードする配列を
有さなければならない。具体的に挙げられた配列はＧｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔをコードす
る。当該発明者による後の論文で、発現度は実際にどの
ような種類の工業的な応用にも不十分であることが実際
にわかったことが明らかとなった。さらに、作られたア
ミノ酸の回収方法は複雑であった。大腸菌は上記の宿主
細胞であり、実際のところ、工業的な規模での生産に興
味のある当業者のために上記で既に紹介された欠点、す
なわち分泌の欠如、繰返し配列の不安定性、よって低い
発現度を、事実として明らかに示していた。最終的に、
この先行技術において提案されたコラーゲンの写真フィ
ルムへの応用に関して実際には何も示されなかった。よ
って、そのような構造的に異なる材料の予想できない結
果のために当業者はこの文献の教示を写真応用に適用す
ることを思いとどまったであろう。
質の類似する組換え材料を作ることが望ましいことを論
じている。その利点は、再現性の問題を解決するさらに
均質な製品およびその化学的機能を改良する機会であろ
う。その考えはオリゴペプチドをゼラチン代用物として
作ることである。選択された微生物は大腸菌であり、大
腸菌に共通するグリコシル化等の翻訳後修飾がないこと
は問題ではないことが述べられている。他の宿主が可能
であることが述べられている。しかし、そうした可能な
宿主の具体例は示されていない。適用される核酸配列
は、選択を起こすためのＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔコドンに結合させた（Ｇｌ
ｙ−Ｘ−Ｙ）ｎのゼラチンペプチドをコードする配列を
有さなければならない。具体的に挙げられた配列はＧｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔをコードす
る。当該発明者による後の論文で、発現度は実際にどの
ような種類の工業的な応用にも不十分であることが実際
にわかったことが明らかとなった。さらに、作られたア
ミノ酸の回収方法は複雑であった。大腸菌は上記の宿主
細胞であり、実際のところ、工業的な規模での生産に興
味のある当業者のために上記で既に紹介された欠点、す
なわち分泌の欠如、繰返し配列の不安定性、よって低い
発現度を、事実として明らかに示していた。最終的に、
この先行技術において提案されたコラーゲンの写真フィ
ルムへの応用に関して実際には何も示されなかった。よ
って、そのような構造的に異なる材料の予想できない結
果のために当業者はこの文献の教示を写真応用に適用す
ることを思いとどまったであろう。
【００１９】最後に、具体的に改良されたコラーゲン様
ポリペプチドおよび写真応用目的のためのその利用に関
する1996年にイーストマンコダックに交付された米国特
許5,580,712 号は、銀結合力が50ｍＶ以下のコラーゲン
様ペプタイザーが高度の薄い平板状粒子を導きうること
を記載している。この文献はこれを２５アミノ酸の長さ
を有する多くの合成ポリペプチドを示している。この文
献はコラーゲン様構造が組換え技術により作られたこと
も示している。この組換えポリペプチドは単に４つの異
なるアミノ酸からなるブロックコポリマー構造の合成ポ
リペプチドである。実際の発現の詳細はこの組換えポリ
ペプチドには提供されていなく、標準的な分子生物学生
産方法およびサッカロミセス・セレビシアエの発現宿主
としての利用が単に言及されているだけである。その分
子量は約26ｋＤａである。よって、それと同じ日および
それ以降の他の文献に詳細に示された発現の問題に親し
い分子生物学者がそうした生産に真摯に取り組んだかど
うかは疑問がある。さらに、組換えで生産された産物の
結合力に関して詳細が提供されていないので、写真応用
の当業者が写真製品のためにハロゲン化銀乳剤にこの製
品を用いることを真摯に考えるか、もしくはそれが、開
示された短い合成ポリペプチドの特性を示すことを真摯
に期待するかどうも疑問がある。また、当文献は、ヒス
チジンおよびメチオニンを特定の部位、つまり下記式の
Ｘａａに有する開示された特定のポリペプチドが高い結
合力を示し、非平板状粒子形成を示すことを示唆してい
る。該化合物の式は、ＧｌｙＰｒｏＸａａ１ＧｌｙＬｅ
ｕＸａａ２ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌ
ｙＡｌａＳｅｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＧｌｙＰｈｅＧｌｎ
Ｇｌｙである。イーストマンコダックにより研究された
化合物の詳細を提供する表を分析すると、高い結合力を
有する化合物は全て、２５アミノ酸毎に少なくとも一つ
の還元アミノ酸（＝ヒスチジンまたはメチオニン）を有
することでポリペプチド１グラムあたりのメチオニン含
量が 400マイクロモルを超えることとなる。そのような
化合物は、写真応用の核形成／成長ＡｇＸ−乳剤プロセ
スに有用ではないであろう。低い結合力と平板状粒子形
成に利するものとして示されている合成化合物は、還元
アミノ酸のＭｅｔもＨｉｓも有さない。多くの他の米国
特許が関連する主題でイーストマンコダックに交付され
ている。これらの特許（米国5,580,712 号および米国5,
670,616 号）は、平板状粒子形成のために有用であると
主張された他の合成断片を明らかにしたが、同じ単一の
組換え産物の実例が記載されているので、これらの特許
は組換えコラーゲン発現およびＡｇＥ乳剤を用いた写真
応用への組換えコラーゲンの利用に対して何の新しいこ
とも提供していない。
ポリペプチドおよび写真応用目的のためのその利用に関
する1996年にイーストマンコダックに交付された米国特
許5,580,712 号は、銀結合力が50ｍＶ以下のコラーゲン
様ペプタイザーが高度の薄い平板状粒子を導きうること
を記載している。この文献はこれを２５アミノ酸の長さ
を有する多くの合成ポリペプチドを示している。この文
献はコラーゲン様構造が組換え技術により作られたこと
も示している。この組換えポリペプチドは単に４つの異
なるアミノ酸からなるブロックコポリマー構造の合成ポ
リペプチドである。実際の発現の詳細はこの組換えポリ
ペプチドには提供されていなく、標準的な分子生物学生
産方法およびサッカロミセス・セレビシアエの発現宿主
としての利用が単に言及されているだけである。その分
子量は約26ｋＤａである。よって、それと同じ日および
それ以降の他の文献に詳細に示された発現の問題に親し
い分子生物学者がそうした生産に真摯に取り組んだかど
うかは疑問がある。さらに、組換えで生産された産物の
結合力に関して詳細が提供されていないので、写真応用
の当業者が写真製品のためにハロゲン化銀乳剤にこの製
品を用いることを真摯に考えるか、もしくはそれが、開
示された短い合成ポリペプチドの特性を示すことを真摯
に期待するかどうも疑問がある。また、当文献は、ヒス
チジンおよびメチオニンを特定の部位、つまり下記式の
Ｘａａに有する開示された特定のポリペプチドが高い結
合力を示し、非平板状粒子形成を示すことを示唆してい
る。該化合物の式は、ＧｌｙＰｒｏＸａａ１ＧｌｙＬｅ
ｕＸａａ２ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌ
ｙＡｌａＳｅｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＧｌｙＰｈｅＧｌｎ
Ｇｌｙである。イーストマンコダックにより研究された
化合物の詳細を提供する表を分析すると、高い結合力を
有する化合物は全て、２５アミノ酸毎に少なくとも一つ
の還元アミノ酸（＝ヒスチジンまたはメチオニン）を有
することでポリペプチド１グラムあたりのメチオニン含
量が 400マイクロモルを超えることとなる。そのような
化合物は、写真応用の核形成／成長ＡｇＸ−乳剤プロセ
スに有用ではないであろう。低い結合力と平板状粒子形
成に利するものとして示されている合成化合物は、還元
アミノ酸のＭｅｔもＨｉｓも有さない。多くの他の米国
特許が関連する主題でイーストマンコダックに交付され
ている。これらの特許（米国5,580,712 号および米国5,
670,616 号）は、平板状粒子形成のために有用であると
主張された他の合成断片を明らかにしたが、同じ単一の
組換え産物の実例が記載されているので、これらの特許
は組換えコラーゲン発現およびＡｇＥ乳剤を用いた写真
応用への組換えコラーゲンの利用に対して何の新しいこ
とも提供していない。
【００２０】イーストマンコダックのこれらの記載か
ら、サッカロミセス・セレビシアエに存在し、示された
特定の配列の発現は実際のところ非常に低かったと推論
することもできる。20リットルの培養物を用いて、単に
約600 ｍｇの生成物を単離することができただけであっ
た。しかし、この記載におけるこの点には何の注意も払
われていない。実際、これらの記載から推論できる情報
は当業者がこのシステムをコラーゲンを作るために用い
ることを思いとどまったことであろう。既に扱ったよう
に、この低い発現度は転写および／または翻訳される配
列の繰返し、および／またはプロテアーゼの存在による
ものであろう。特に、非らせんコラーゲンの開口構造の
ために、非らせんコラーゲン発現産物はプロテアーゼの
攻撃を著しく受け易い。
ら、サッカロミセス・セレビシアエに存在し、示された
特定の配列の発現は実際のところ非常に低かったと推論
することもできる。20リットルの培養物を用いて、単に
約600 ｍｇの生成物を単離することができただけであっ
た。しかし、この記載におけるこの点には何の注意も払
われていない。実際、これらの記載から推論できる情報
は当業者がこのシステムをコラーゲンを作るために用い
ることを思いとどまったことであろう。既に扱ったよう
に、この低い発現度は転写および／または翻訳される配
列の繰返し、および／またはプロテアーゼの存在による
ものであろう。特に、非らせんコラーゲンの開口構造の
ために、非らせんコラーゲン発現産物はプロテアーゼの
攻撃を著しく受け易い。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、組換えＤＮ
Ａ技術の利用に向けられることで、今回最終的に大量の
実質的に純粋なコラーゲン材料の生産を可能として上記
の困難性を克服した。組換えコラーゲン産生方法を実行
して、高価な培地、発現宿主または非分泌発現宿主を必
要とせずに高レベルの発現を初めて提供する。さらに、
現在までゼラチンを適用すべき写真製品の製造方法の特
定の各段階での最適使用のために選択されるか、および
／または適合させたコラーゲンを作ることが今回可能と
なった。それによりさらに向上を可能とする。また、改
良ＡｇＸ乳剤生産方法が現在可能であり生産費用を減少
を導く。
Ａ技術の利用に向けられることで、今回最終的に大量の
実質的に純粋なコラーゲン材料の生産を可能として上記
の困難性を克服した。組換えコラーゲン産生方法を実行
して、高価な培地、発現宿主または非分泌発現宿主を必
要とせずに高レベルの発現を初めて提供する。さらに、
現在までゼラチンを適用すべき写真製品の製造方法の特
定の各段階での最適使用のために選択されるか、および
／または適合させたコラーゲンを作ることが今回可能と
なった。それによりさらに向上を可能とする。また、改
良ＡｇＸ乳剤生産方法が現在可能であり生産費用を減少
を導く。
【００２２】本発明者らは、より均一な写真用ＡｇＸ乳
剤材料を得ることに興味を持ち、工業的写真紙およびフ
ィルム生産方法で現在用いられている動物源由来のコラ
ーゲンに匹敵するコラーゲンを作る可能性を研究する決
心をした。本発明者らは、組換えで作られたコラーゲン
を利用することにより、多数の不純物及び定義されてい
ない性質とコラーゲンのタイプＩを主要な成分として有
する可変的な性質のコラーゲンタイプの混合物とを有す
る天然源に対してより均一な性質のためにハロゲン化銀
乳剤生産に向上がもたらすことができることを予期し
た。この考えは、各ブロックコポリマー構造を多く有す
る新しく設計されたコラーゲン様ポリペプチドを使用す
るよりも、天然コラーゲンに近くなっている物質を用い
ることであった。この希望は、天然配列に対応する配列
の発現問題が、先行技術に詳細に記載されているよう
に、合成的に設計されたコラーゲン様ポリペプチド配列
において遭遇する問題よりも小さいことであった。これ
は、発現される配列の低い繰返し性に基づいて予想する
ことができた。一方、よりランダムな配列を利用するこ
とは、多様なプロテアーゼによる攻撃をさらに受け易く
するだろう。
剤材料を得ることに興味を持ち、工業的写真紙およびフ
ィルム生産方法で現在用いられている動物源由来のコラ
ーゲンに匹敵するコラーゲンを作る可能性を研究する決
心をした。本発明者らは、組換えで作られたコラーゲン
を利用することにより、多数の不純物及び定義されてい
ない性質とコラーゲンのタイプＩを主要な成分として有
する可変的な性質のコラーゲンタイプの混合物とを有す
る天然源に対してより均一な性質のためにハロゲン化銀
乳剤生産に向上がもたらすことができることを予期し
た。この考えは、各ブロックコポリマー構造を多く有す
る新しく設計されたコラーゲン様ポリペプチドを使用す
るよりも、天然コラーゲンに近くなっている物質を用い
ることであった。この希望は、天然配列に対応する配列
の発現問題が、先行技術に詳細に記載されているよう
に、合成的に設計されたコラーゲン様ポリペプチド配列
において遭遇する問題よりも小さいことであった。これ
は、発現される配列の低い繰返し性に基づいて予想する
ことができた。一方、よりランダムな配列を利用するこ
とは、多様なプロテアーゼによる攻撃をさらに受け易く
するだろう。
【００２３】コラーゲンの天然の条件とはどんなに異な
っても、我々は組換え技術を用いるらせん様構造を作る
試みを放棄することを決定した。「適当な数のｙ位プロ
リル残基がプロリル４ヒドロキラーゼにより4-ヒドロキ
シプロリンにヒドロキシル化されていない場合、新しく
合成された鎖は、37℃で三重らせん立体配座に折りたた
むことができない。ヒドロキシル化が起こらない場合、
ポリペプチドは非らせんのままであり、細胞から十分に
は分泌されず、コラーゲン繊維原に自己集合することは
できない」と述べられているWO93／07889 の１ページを
参考にして、分泌を確実とするために分泌細胞を用いる
際に問題が起こることが予想することができた。また、
プロテアーゼ攻撃の潜在性は、得られたオープンな非折
りたたみ構造のためにかなり高いものであろう。よっ
て、我々の組換え配列が、発現宿主により高い量でかな
り容易に分泌される発現産物をもたらすことは驚くべき
ことである。また、組換えコラーゲン化合物が、写真応
用に現在用いられている天然コラーゲンに特徴的な繊維
原構造または三重らせん構造を形成できないような条件
下で組換えコラーゲンを産生することは、写真応用自体
に対して疑問のある効果も有しえた。現在の市販されて
いる製品とのこの違いを鑑みて、得られた組換え化合物
が、現在使用されている化合物を有するらせんと同じよ
うに写真応用に適するかどうかも勿論疑問があった。
っても、我々は組換え技術を用いるらせん様構造を作る
試みを放棄することを決定した。「適当な数のｙ位プロ
リル残基がプロリル４ヒドロキラーゼにより4-ヒドロキ
シプロリンにヒドロキシル化されていない場合、新しく
合成された鎖は、37℃で三重らせん立体配座に折りたた
むことができない。ヒドロキシル化が起こらない場合、
ポリペプチドは非らせんのままであり、細胞から十分に
は分泌されず、コラーゲン繊維原に自己集合することは
できない」と述べられているWO93／07889 の１ページを
参考にして、分泌を確実とするために分泌細胞を用いる
際に問題が起こることが予想することができた。また、
プロテアーゼ攻撃の潜在性は、得られたオープンな非折
りたたみ構造のためにかなり高いものであろう。よっ
て、我々の組換え配列が、発現宿主により高い量でかな
り容易に分泌される発現産物をもたらすことは驚くべき
ことである。また、組換えコラーゲン化合物が、写真応
用に現在用いられている天然コラーゲンに特徴的な繊維
原構造または三重らせん構造を形成できないような条件
下で組換えコラーゲンを産生することは、写真応用自体
に対して疑問のある効果も有しえた。現在の市販されて
いる製品とのこの違いを鑑みて、得られた組換え化合物
が、現在使用されている化合物を有するらせんと同じよ
うに写真応用に適するかどうかも勿論疑問があった。
【００２４】しかし、コラーゲンタイプのＩおよびＩＩ
Ｉのゲノム配列をクローニングする際の、十分な量を作
ってそれを写真応用に利用するための発現の問題を克服
する多くの難しい研究後の結果は、すべての有り得る失
敗にもかかわらず、思いかけなかったことに良好であっ
た。第一に、発現速度は意外に高く、0.95グラム／リッ
トルより高く、実際には全体として３グラム／リットル
より高かった。これは、コラーゲンまたはコラーゲン様
材料を発現しようとする試みがあったとしても１リット
ルあたり数ミリグラムより多くは産生できなかった先行
技術とは顕著な対照である。よって、この驚くべき高い
発現速度は、先行技術に記載された全ての問題を鑑みて
当初はまったく予想されないと思われた。しかし、発現
速度は、他のタンパク質に関しての発現宿主ピヒア・パ
ストリスにより得られた生産速度をかなり上回りさえし
た。かなり具体的には、コラーゲンのような高い量で作
ることは難しいとは予想されなかったタンパク質の生産
速度さえも上回った。遂には、組換えコラーゲンの形態
が経済的に興味のある量で経済的に興味のある発現宿主
により作ることができると今や考えられている。発現が
多い他の宿主は、真菌タイプの微生物中に見出すことが
できる。特に高い発現酵母および最も具体的には低いタ
ンパク質分解活性を有するプロテアーゼ陰性株が望まし
い。適切に使用することができる酵母は、かなり特異的
にメチロトローフである酵母（methylotropic yeasts）
である。特に適切な例は酵母のピヒア・パストリスであ
る。コラーゲンの発現のために関連があるものとして達
成された基準に基づいて、十分に高い程度までおよび経
済的に実施可能な条件下で発現が可能な適当な宿主細胞
が発見され使用できる。
Ｉのゲノム配列をクローニングする際の、十分な量を作
ってそれを写真応用に利用するための発現の問題を克服
する多くの難しい研究後の結果は、すべての有り得る失
敗にもかかわらず、思いかけなかったことに良好であっ
た。第一に、発現速度は意外に高く、0.95グラム／リッ
トルより高く、実際には全体として３グラム／リットル
より高かった。これは、コラーゲンまたはコラーゲン様
材料を発現しようとする試みがあったとしても１リット
ルあたり数ミリグラムより多くは産生できなかった先行
技術とは顕著な対照である。よって、この驚くべき高い
発現速度は、先行技術に記載された全ての問題を鑑みて
当初はまったく予想されないと思われた。しかし、発現
速度は、他のタンパク質に関しての発現宿主ピヒア・パ
ストリスにより得られた生産速度をかなり上回りさえし
た。かなり具体的には、コラーゲンのような高い量で作
ることは難しいとは予想されなかったタンパク質の生産
速度さえも上回った。遂には、組換えコラーゲンの形態
が経済的に興味のある量で経済的に興味のある発現宿主
により作ることができると今や考えられている。発現が
多い他の宿主は、真菌タイプの微生物中に見出すことが
できる。特に高い発現酵母および最も具体的には低いタ
ンパク質分解活性を有するプロテアーゼ陰性株が望まし
い。適切に使用することができる酵母は、かなり特異的
にメチロトローフである酵母（methylotropic yeasts）
である。特に適切な例は酵母のピヒア・パストリスであ
る。コラーゲンの発現のために関連があるものとして達
成された基準に基づいて、十分に高い程度までおよび経
済的に実施可能な条件下で発現が可能な適当な宿主細胞
が発見され使用できる。
【００２５】大規模生産が本発明者らにより可能とされ
たことは、写真応用分野での実際の試験を最終的に実施
可能とさえもした。写真応用のための試験は、十分な組
換えコラーゲンが比較的大量に作られた後にのみ可能で
あり、これは先行技術で詳細に記載された医薬応用のた
めに必要とされる少量とは対照的である。写真応用に関
するこれらの試験を行った後、平板状粒子形成が高いこ
とがわかった（表ＩＩを参照されたい）。実質的に純粋
なコラーゲンタイプＩＩＩの利用がペプタイザーとして
写真乳剤に初めて利用された。その結果は傑出したもの
であった。しかし、我々は、平板状粒子形成が80％を超
えるものであることを思いもかけずに発見した。これは
低い結合力を有するポリペプチドのイーストマンコダッ
クポリペプチド性能よりもまさり、これは、69.5ｍＶの
結合力がこの生成物に関して見出されたので、イースト
マンコダック教示にしたがえば非平板状粒子形成を予想
しなければならなかったことを鑑みれば最も驚くべきも
のと思われた。よって、80％の平板状粒子形成を得るた
めには結合力が50ｍＶ以下でなければならないとする要
件に関するイーストマンコダックによって仮定された理
論が覆された。よって、80％を超えるレベルでの平板状
粒子を必要とするハロゲン化銀乳剤における応用のため
に適当であると先行技術に述べられているものよりもさ
らに高い銀結合力を有する多くのペプタイザーを開発す
るための経路が開かれた。この経路は、写真乳剤におけ
るペプタイザーの主要コラーゲン成分としてタイプＩＩ
Ｉ以外のコラーゲンのタイプを適用するためにも開かれ
た。種々の天然コラーゲン間の相同性の程度が40〜50％
であることを考慮すれば、わずかに操作された天然配列
からも良好な結果を期待することができる。天然コラー
ゲンアミノ酸配列に対して50％を超える相同性を示すア
ミノ酸配列が良好な結果を提供すると期待することがで
きる。天然配列の変異は、天然配列に対する挿入、欠損
および置換を有してもよい。それ以外に、天然ＤＮＡ配
列に対してある程度の相同性を有する合成ＤＮＡ配列を
使用することができる。しかし、本発明に有用な配列
は、それらのコードする核酸配列の発現の問題を防止す
るために、最小程度の可変性を保持しなければならな
い。例えば、変異は４個を超えて異なるアミノ酸を有す
るアミノ酸配列を常にもたらさななければならない。Ｇ
ＸＹ部分はブロックコポリマーの形態であってはなら
ず、多くのＧＸＹ部分間のスペーサー配列を有してはな
らない。好ましくは、８個を超え、さらには９個を超え
て異なるアミノ酸が存在しなければならない。実施例に
おいて、19個もの多くの異なるアミノ酸を有するタンパ
ク質が用いられる。天然に存在するのは僅かに20アミノ
酸である。適切には、10〜20アミノ酸または10〜19アミ
ノ酸を用いることができる（しかし好ましくはシステイ
ンは避けられる）。
たことは、写真応用分野での実際の試験を最終的に実施
可能とさえもした。写真応用のための試験は、十分な組
換えコラーゲンが比較的大量に作られた後にのみ可能で
あり、これは先行技術で詳細に記載された医薬応用のた
めに必要とされる少量とは対照的である。写真応用に関
するこれらの試験を行った後、平板状粒子形成が高いこ
とがわかった（表ＩＩを参照されたい）。実質的に純粋
なコラーゲンタイプＩＩＩの利用がペプタイザーとして
写真乳剤に初めて利用された。その結果は傑出したもの
であった。しかし、我々は、平板状粒子形成が80％を超
えるものであることを思いもかけずに発見した。これは
低い結合力を有するポリペプチドのイーストマンコダッ
クポリペプチド性能よりもまさり、これは、69.5ｍＶの
結合力がこの生成物に関して見出されたので、イースト
マンコダック教示にしたがえば非平板状粒子形成を予想
しなければならなかったことを鑑みれば最も驚くべきも
のと思われた。よって、80％の平板状粒子形成を得るた
めには結合力が50ｍＶ以下でなければならないとする要
件に関するイーストマンコダックによって仮定された理
論が覆された。よって、80％を超えるレベルでの平板状
粒子を必要とするハロゲン化銀乳剤における応用のため
に適当であると先行技術に述べられているものよりもさ
らに高い銀結合力を有する多くのペプタイザーを開発す
るための経路が開かれた。この経路は、写真乳剤におけ
るペプタイザーの主要コラーゲン成分としてタイプＩＩ
Ｉ以外のコラーゲンのタイプを適用するためにも開かれ
た。種々の天然コラーゲン間の相同性の程度が40〜50％
であることを考慮すれば、わずかに操作された天然配列
からも良好な結果を期待することができる。天然コラー
ゲンアミノ酸配列に対して50％を超える相同性を示すア
ミノ酸配列が良好な結果を提供すると期待することがで
きる。天然配列の変異は、天然配列に対する挿入、欠損
および置換を有してもよい。それ以外に、天然ＤＮＡ配
列に対してある程度の相同性を有する合成ＤＮＡ配列を
使用することができる。しかし、本発明に有用な配列
は、それらのコードする核酸配列の発現の問題を防止す
るために、最小程度の可変性を保持しなければならな
い。例えば、変異は４個を超えて異なるアミノ酸を有す
るアミノ酸配列を常にもたらさななければならない。Ｇ
ＸＹ部分はブロックコポリマーの形態であってはなら
ず、多くのＧＸＹ部分間のスペーサー配列を有してはな
らない。好ましくは、８個を超え、さらには９個を超え
て異なるアミノ酸が存在しなければならない。実施例に
おいて、19個もの多くの異なるアミノ酸を有するタンパ
ク質が用いられる。天然に存在するのは僅かに20アミノ
酸である。適切には、10〜20アミノ酸または10〜19アミ
ノ酸を用いることができる（しかし好ましくはシステイ
ンは避けられる）。
【００２６】
【課題を解決するための手段】よって、本発明は、平板
状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロ
ゲン化銀乳剤を有し、該乳剤が核形成ペプタイザーの存
在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成
長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプ
タイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラ
ーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異
なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。このよう
な乳剤は、適切には天然コラーゲンに対して50％を超
え、好ましくは60％を超える相同性を示すアミノ酸配列
を有するペプタイザーを有することができる。適切に
は、ペプタイザーは少なくとも10ｋＤａのサイズを有す
る。実施例から明らかであるように、20〜80ｋＤａのサ
イズが写真応用に有用である。約 600アミノ酸のペプタ
イザーを示す。
状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロ
ゲン化銀乳剤を有し、該乳剤が核形成ペプタイザーの存
在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成
長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプ
タイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラ
ーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異
なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。このよう
な乳剤は、適切には天然コラーゲンに対して50％を超
え、好ましくは60％を超える相同性を示すアミノ酸配列
を有するペプタイザーを有することができる。適切に
は、ペプタイザーは少なくとも10ｋＤａのサイズを有す
る。実施例から明らかであるように、20〜80ｋＤａのサ
イズが写真応用に有用である。約 600アミノ酸のペプタ
イザーを示す。
【００２７】乳剤は、コラーゲンに関して自然に存在す
るものと同等のアミノ酸を有することができる。ここで
同等であるとは天然に存在するものとアミノ酸同一性が
少なくとも80％、好ましくは90％であることを意味す
る。
るものと同等のアミノ酸を有することができる。ここで
同等であるとは天然に存在するものとアミノ酸同一性が
少なくとも80％、好ましくは90％であることを意味す
る。
【００２８】乳剤は、天然に存在するものと実質的に同
一のアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することが
できる。ここで実質的とは、アミノ酸の変異が５個未
満、好ましくは３個未満であることを意味する。適切な
種類のコラーゲンはＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。活性
を確保し、且つ発現問題を避けるために、配列は天然配
列に近いことが好ましい。ペプタイザーのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、天然であっても合成であっても
よい。本発明によるコラーゲンタイプＩＩＩアミノ酸配
列は、適切には図３の配列を有するか、またはそれであ
る。本発明によるコラーゲンタイプＩアミノ酸配列は、
図８、10 または12の配列を有するか、またはそれであ
る。コラーゲンタイプＩＩＩは実施例１の参考文献５に
定められたアミノ酸を有する。この文献は、参照により
本明細書に含まれる。
一のアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することが
できる。ここで実質的とは、アミノ酸の変異が５個未
満、好ましくは３個未満であることを意味する。適切な
種類のコラーゲンはＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。活性
を確保し、且つ発現問題を避けるために、配列は天然配
列に近いことが好ましい。ペプタイザーのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、天然であっても合成であっても
よい。本発明によるコラーゲンタイプＩＩＩアミノ酸配
列は、適切には図３の配列を有するか、またはそれであ
る。本発明によるコラーゲンタイプＩアミノ酸配列は、
図８、10 または12の配列を有するか、またはそれであ
る。コラーゲンタイプＩＩＩは実施例１の参考文献５に
定められたアミノ酸を有する。この文献は、参照により
本明細書に含まれる。
【００２９】
【発明の実施の形態】ペプタイザーが実質的に純粋な形
で存在する本発明の乳剤とは、ペプタイザーが、核酸、
多糖類および他のタンパク質を実質的に含まないことを
意味する。本実施例は、これが実際に可能であることを
具体的に示している。糖および核酸の存在が微量でさ
え、結晶形成に対して幾分かの影響を持つことができ、
具体的な写真応用のための十分に純粋な組換え材料が作
ることができるかどうかを実際に疑ってみなければなら
なかった。
で存在する本発明の乳剤とは、ペプタイザーが、核酸、
多糖類および他のタンパク質を実質的に含まないことを
意味する。本実施例は、これが実際に可能であることを
具体的に示している。糖および核酸の存在が微量でさ
え、結晶形成に対して幾分かの影響を持つことができ、
具体的な写真応用のための十分に純粋な組換え材料が作
ることができるかどうかを実際に疑ってみなければなら
なかった。
【００３０】ピヒア・パストリスを発現宿主として用い
るとき、ＭＧＰＲの配列がコラーゲンＩの天然配列には
存在していたとしても、それを持たないアミノ酸配列を
コードする核酸配列を用いるのが有利である。なぜなら
ばこの配列は、一部のコラーゲンタイプが受けるピヒア
・パストリスに存在するプロテアーゼの新しい認識部位
であることを我々が思いもかけずに発見したからであ
る。プロテアーゼはＫｅｘ−２様プロテアーゼであり、
Ｋｅｘ−２様プロテアーゼのネガティブ宿主株が適当な
宿主細胞であろうと予想されている。宿主としてピヒア
・パストリスを用いるときの一般条件において、対応す
るアミノ酸配列が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］
−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（式中、ＸａａおよびＹａａ
はＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応してお
り、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）
のないコラーゲンをコードする核酸配列を用いるのが有
利であろう。非らせんコラーゲンのオープン構造はタン
パク質分解を受け易いので、宿主が選択され、および／
または発現しようとする配列が宿主および発現配列の特
定の組合せについてタンパク質分解が最小化されるよう
に好ましくは変異されるか、選択されなければならな
い。共通する一般的知識、および挙げられた文献の内容
を含めた本開示に基づいて、これを実現するために当業
者に開かれた多数のオプションが存在する。
るとき、ＭＧＰＲの配列がコラーゲンＩの天然配列には
存在していたとしても、それを持たないアミノ酸配列を
コードする核酸配列を用いるのが有利である。なぜなら
ばこの配列は、一部のコラーゲンタイプが受けるピヒア
・パストリスに存在するプロテアーゼの新しい認識部位
であることを我々が思いもかけずに発見したからであ
る。プロテアーゼはＫｅｘ−２様プロテアーゼであり、
Ｋｅｘ−２様プロテアーゼのネガティブ宿主株が適当な
宿主細胞であろうと予想されている。宿主としてピヒア
・パストリスを用いるときの一般条件において、対応す
るアミノ酸配列が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］
−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（式中、ＸａａおよびＹａａ
はＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応してお
り、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）
のないコラーゲンをコードする核酸配列を用いるのが有
利であろう。非らせんコラーゲンのオープン構造はタン
パク質分解を受け易いので、宿主が選択され、および／
または発現しようとする配列が宿主および発現配列の特
定の組合せについてタンパク質分解が最小化されるよう
に好ましくは変異されるか、選択されなければならな
い。共通する一般的知識、および挙げられた文献の内容
を含めた本開示に基づいて、これを実現するために当業
者に開かれた多数のオプションが存在する。
【００３１】発現を増加させるための別の方法は、配列
が発現のために導入されている宿主細胞のために最適化
されたコドン利用に存在するであろう。マルチコピー形
質転換体の利用は、発現の増大が達成できる方法でもあ
る。最大レベルのタンパク質分泌が小胞体のタンパク質
折り畳み能力により最終的に決定されることが、ウシ膵
臓トリプシンインヒビターのサッカロミセス・セレビシ
アエ発現の技術で示唆されている。マルチコピー形質転
換体を利用することによりこの能力を超えることは、小
胞体での折り畳まれていないタンパク質の蓄積および生
理学的不安定性による発現レベルでの付随的な莫大な減
少をもたらすと考えられている。これは1995年Parekh
（Protein Expr. Purif. 6, 537-545 ）および1997年Pa
rekh及びWittrup （Biotechnol. Prog. 13, 117-122 ）
に記載されている。折りたたまれていない分子として発
現されている我々の組換えコラーゲンの場合、このネガ
ティブな特徴が打ち消されるか、および／またはこの現
象が他の発現宿主で、特に他の酵母宿主であまり関連が
ないようである。酵母宿主および細菌宿主において、プ
ロリルヒドロキシル化機構が存在せず、それ自体ではコ
ラーゲンのそれら宿主内での発現は折りたたまれていな
いコラーゲンをもたらすであろう。コラーゲンが折りた
たまれていない場合、それは小胞体の折りたたみ能力を
消耗させないだろう。また、顕著な可溶性のために、折
りたたまれておらず、かつヒドロキシル化されていない
コラーゲンは、小胞体中で凝集も蓄積もしないだろう。
発現の程度に関連するようになる、そうした折り畳みの
危険を除くために、コラーゲンはヒドロキシル化され
ず、またはできるだけ低い程度まで少なくともヒドロキ
シル化されているのが望ましい。
が発現のために導入されている宿主細胞のために最適化
されたコドン利用に存在するであろう。マルチコピー形
質転換体の利用は、発現の増大が達成できる方法でもあ
る。最大レベルのタンパク質分泌が小胞体のタンパク質
折り畳み能力により最終的に決定されることが、ウシ膵
臓トリプシンインヒビターのサッカロミセス・セレビシ
アエ発現の技術で示唆されている。マルチコピー形質転
換体を利用することによりこの能力を超えることは、小
胞体での折り畳まれていないタンパク質の蓄積および生
理学的不安定性による発現レベルでの付随的な莫大な減
少をもたらすと考えられている。これは1995年Parekh
（Protein Expr. Purif. 6, 537-545 ）および1997年Pa
rekh及びWittrup （Biotechnol. Prog. 13, 117-122 ）
に記載されている。折りたたまれていない分子として発
現されている我々の組換えコラーゲンの場合、このネガ
ティブな特徴が打ち消されるか、および／またはこの現
象が他の発現宿主で、特に他の酵母宿主であまり関連が
ないようである。酵母宿主および細菌宿主において、プ
ロリルヒドロキシル化機構が存在せず、それ自体ではコ
ラーゲンのそれら宿主内での発現は折りたたまれていな
いコラーゲンをもたらすであろう。コラーゲンが折りた
たまれていない場合、それは小胞体の折りたたみ能力を
消耗させないだろう。また、顕著な可溶性のために、折
りたたまれておらず、かつヒドロキシル化されていない
コラーゲンは、小胞体中で凝集も蓄積もしないだろう。
発現の程度に関連するようになる、そうした折り畳みの
危険を除くために、コラーゲンはヒドロキシル化され
ず、またはできるだけ低い程度まで少なくともヒドロキ
シル化されているのが望ましい。
【００３２】サッカロミセス・セレビシアエおよびピヒ
ア・パストリス等の酵母細胞中で、不均一プロリル−4-
ヒドロキシラーゼの共発現によりヒドロキシル化を行う
ことができることが最近わかった。これは1997年にVuor
ela ら（EMBO J. 16, 6702-6712 ）および1998年にVaug
han ら（DNA cell Biol. 17, 511-518）により記載され
ている。ゼラチンのゲル化温度がヒドロキシル化度に依
存するので、現在、種々のゲル化温度を有する発現産物
をもたらす方法でヒドロキシル化度を変えることができ
るであろう。これは、コラーゲンの経済的利用を以前に
禁止した特異的温度要件を有する方法、すなわち所望と
されないゲル化を妨げるために室温以上の温度を必要と
する方法に特別な興味を有するだろう。
ア・パストリス等の酵母細胞中で、不均一プロリル−4-
ヒドロキシラーゼの共発現によりヒドロキシル化を行う
ことができることが最近わかった。これは1997年にVuor
ela ら（EMBO J. 16, 6702-6712 ）および1998年にVaug
han ら（DNA cell Biol. 17, 511-518）により記載され
ている。ゼラチンのゲル化温度がヒドロキシル化度に依
存するので、現在、種々のゲル化温度を有する発現産物
をもたらす方法でヒドロキシル化度を変えることができ
るであろう。これは、コラーゲンの経済的利用を以前に
禁止した特異的温度要件を有する方法、すなわち所望と
されないゲル化を妨げるために室温以上の温度を必要と
する方法に特別な興味を有するだろう。
【００３３】ペプタイザーは、それが、天然コラーゲン
をコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片で
あり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有
し、アミノ酸ベースで該断片の重さが少なくとも 2.5ｋ
Ｄａであるような長さである点で、天然配列と同一であ
る必要はない。適切には、重量は 2.5〜 100ｋＤａであ
ってよい。多様な大きさの断片が適切である。５〜50ｋ
Ｄａ、さらには20〜50ｋＤａが適用される適切な態様で
ある。該ペプタイザーは、合成核酸配列から新たに（de
novo)で作ることができる。
をコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片で
あり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有
し、アミノ酸ベースで該断片の重さが少なくとも 2.5ｋ
Ｄａであるような長さである点で、天然配列と同一であ
る必要はない。適切には、重量は 2.5〜 100ｋＤａであ
ってよい。多様な大きさの断片が適切である。５〜50ｋ
Ｄａ、さらには20〜50ｋＤａが適用される適切な態様で
ある。該ペプタイザーは、合成核酸配列から新たに（de
novo)で作ることができる。
【００３４】らせん構造の非存在を確保する多様な方法
が利用可能である。例えば、ペプタイザーにヒドロキシ
プロリンが存在しないこと、および／またはプロコラー
ゲンおよびテロペプチドが存在しないことを確保するこ
とである。好ましくは、写真応用のために、ペプタイザ
ーはシステインが存在すべきではない。ペプタイザーが
脱アミン化されていない本発明によるＡｇＸ乳剤は、等
電点が７〜10のペプタイザーである本発明の興味あるさ
らなる態様である。
が利用可能である。例えば、ペプタイザーにヒドロキシ
プロリンが存在しないこと、および／またはプロコラー
ゲンおよびテロペプチドが存在しないことを確保するこ
とである。好ましくは、写真応用のために、ペプタイザ
ーはシステインが存在すべきではない。ペプタイザーが
脱アミン化されていない本発明によるＡｇＸ乳剤は、等
電点が７〜10のペプタイザーである本発明の興味あるさ
らなる態様である。
【００３５】さらに、他のどのパラメーターを用いてそ
の結果を向上させることができるかを定義するために他
に何を発見することができるかを確認するために、さら
に研究が行われた。これを行うために、我々は多数の修
飾コラーゲン、すなわち非組換え産生コラーゲンを我々
の組換えコラーゲンで試験に用いて分析し、関連するパ
ラメーターを決定した。次に我々は、平板状粒子形成に
必要とされる程度のハロゲン化銀を作成するのに適切な
ものとして種々のカテゴリーの化合物を定めた。
の結果を向上させることができるかを定義するために他
に何を発見することができるかを確認するために、さら
に研究が行われた。これを行うために、我々は多数の修
飾コラーゲン、すなわち非組換え産生コラーゲンを我々
の組換えコラーゲンで試験に用いて分析し、関連するパ
ラメーターを決定した。次に我々は、平板状粒子形成に
必要とされる程度のハロゲン化銀を作成するのに適切な
ものとして種々のカテゴリーの化合物を定めた。
【００３６】さらに、該ペプタイザー１グラムあたりの
メチオニンの還元力 0.1〜 200マイクロモルに等しいレ
ベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有す
るペプタイザーを有する、既に示された他の態様のいず
れかにおける本発明の乳剤が適切な態様である。好まし
くは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンが16
0マイクロモル未満、好ましくは120 マイクロモル未満
で存在するのがよい。還元力は低いレベルが好ましいの
で、本発明による好ましい乳剤は、還元性アミノ酸が該
ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1
〜80マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化
された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを含有する
のがよい。該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニン
の還元力30〜80マイクロモルに等しいレベルで還元性ア
ミノ酸が存在する程度のかなり高いレベルの還元性アミ
ノ酸も十分な結果を提供することができる。これは、多
くの先行技術刊行物における平板状粒子形成のための要
件、低い還元力値という要件に関する以前の教示を考慮
すれば、かなり驚くべきことである。本発明は、80μｍ
ｏｌｅ以下のレベルのメチオニンを有するそれら修飾コ
ラーゲン、例えば修飾タイプＩも包含する。例えばタイ
プＩコラーゲンへの修飾は、必ずしも酸化によるもので
はなく、還元性アミノ酸が非還元アミノ酸により必要と
される程度まで置換されたコード配列の変異の結果であ
ってもよい。このことは、ハロゲン化銀乳剤中における
使用前のコラーゲンの化学処置工程を省略することがで
き、付随的に生産工程に対する時間と費用の利点をもた
らす。明らかに、80μｍｏｌｅを超える還元アミノ酸を
有さない天然コラーゲン、例えば修飾タイプＩＩＩも適
用できる。
メチオニンの還元力 0.1〜 200マイクロモルに等しいレ
ベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有す
るペプタイザーを有する、既に示された他の態様のいず
れかにおける本発明の乳剤が適切な態様である。好まし
くは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンが16
0マイクロモル未満、好ましくは120 マイクロモル未満
で存在するのがよい。還元力は低いレベルが好ましいの
で、本発明による好ましい乳剤は、還元性アミノ酸が該
ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1
〜80マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化
された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを含有する
のがよい。該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニン
の還元力30〜80マイクロモルに等しいレベルで還元性ア
ミノ酸が存在する程度のかなり高いレベルの還元性アミ
ノ酸も十分な結果を提供することができる。これは、多
くの先行技術刊行物における平板状粒子形成のための要
件、低い還元力値という要件に関する以前の教示を考慮
すれば、かなり驚くべきことである。本発明は、80μｍ
ｏｌｅ以下のレベルのメチオニンを有するそれら修飾コ
ラーゲン、例えば修飾タイプＩも包含する。例えばタイ
プＩコラーゲンへの修飾は、必ずしも酸化によるもので
はなく、還元性アミノ酸が非還元アミノ酸により必要と
される程度まで置換されたコード配列の変異の結果であ
ってもよい。このことは、ハロゲン化銀乳剤中における
使用前のコラーゲンの化学処置工程を省略することがで
き、付随的に生産工程に対する時間と費用の利点をもた
らす。明らかに、80μｍｏｌｅを超える還元アミノ酸を
有さない天然コラーゲン、例えば修飾タイプＩＩＩも適
用できる。
【００３７】さらに、最初に示され、1996年に発表され
たイーストマンコダックの教示とは対照的に、示された
他の実施態様のいずれかにおいても本発明の乳剤は50ｍ
Ｖを超える銀の結合力を有するペプタイザーを有し、平
板状粒子の高い形成レベルを有す乳剤としてかなりよく
機能できる。適切なペプタイザーは、銀への結合力100
ｍＶ以下を有する。先行技術の教示とは対照的に、ペプ
タイザーは銀への結合力50〜100 ｍＶを有することがで
き、優れた平板状粒子パーセントを有する乳剤を提供す
る。
たイーストマンコダックの教示とは対照的に、示された
他の実施態様のいずれかにおいても本発明の乳剤は50ｍ
Ｖを超える銀の結合力を有するペプタイザーを有し、平
板状粒子の高い形成レベルを有す乳剤としてかなりよく
機能できる。適切なペプタイザーは、銀への結合力100
ｍＶ以下を有する。先行技術の教示とは対照的に、ペプ
タイザーは銀への結合力50〜100 ｍＶを有することがで
き、優れた平板状粒子パーセントを有する乳剤を提供す
る。
【００３８】そのようなコラーゲン様材料の適用から得
られるハロゲン化銀乳剤は、適切には80％を超える平板
状粒子、好ましくは90％を超える平板状粒子を示すだろ
う。95％を超える平板状粒子パーセントが最も好まし
い。粒子は、実施例記載の反応条件下の単一噴流法を用
いて測定した場合、平均アスペクト比が５を超える値を
示すだろう。これらの反応条件は最大のアスペクト比を
得るための実際の写真乳剤方法に用いられる最適化反応
条件ではなく、そのような最適化条件が使用されるとき
に高いアスペクト比を達成するのに適切かどうかを示す
ことを単に提供していることに注意されたい。例えば二
重噴流法および付加的な成熟法を用いる通常のコラーゲ
ンに現在用いられている最適化条件を適用すると、本発
明の化合物はさらに高いアスペクト比を示すと予想され
る。使用される試験は高いアスペクト比形成能の迅速な
単なる指標であり、当業者はその結果をさらに高めるた
めにどのような対策を取ることができるかを理解しよ
う。
られるハロゲン化銀乳剤は、適切には80％を超える平板
状粒子、好ましくは90％を超える平板状粒子を示すだろ
う。95％を超える平板状粒子パーセントが最も好まし
い。粒子は、実施例記載の反応条件下の単一噴流法を用
いて測定した場合、平均アスペクト比が５を超える値を
示すだろう。これらの反応条件は最大のアスペクト比を
得るための実際の写真乳剤方法に用いられる最適化反応
条件ではなく、そのような最適化条件が使用されるとき
に高いアスペクト比を達成するのに適切かどうかを示す
ことを単に提供していることに注意されたい。例えば二
重噴流法および付加的な成熟法を用いる通常のコラーゲ
ンに現在用いられている最適化条件を適用すると、本発
明の化合物はさらに高いアスペクト比を示すと予想され
る。使用される試験は高いアスペクト比形成能の迅速な
単なる指標であり、当業者はその結果をさらに高めるた
めにどのような対策を取ることができるかを理解しよ
う。
【００３９】我々の試験において、成熟プロセスを、ペ
プタイザーまたは余分な銀をさらに添加することなしに
行う。明らかに、本発明の方法において、成熟工程は、
そのような、さらに添加することを有することができ
る。ペプタイザーは核形成および成熟段階の双方で同一
の材料とすることができる。成熟段階でさらに添加する
ことは、この段階での立体安定性の増大のために有利で
ありえよう。
プタイザーまたは余分な銀をさらに添加することなしに
行う。明らかに、本発明の方法において、成熟工程は、
そのような、さらに添加することを有することができ
る。ペプタイザーは核形成および成熟段階の双方で同一
の材料とすることができる。成熟段階でさらに添加する
ことは、この段階での立体安定性の増大のために有利で
ありえよう。
【００４０】本発明による好ましいＡｇＸ乳剤は、ｐＨ
４〜８でハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定なペ
プタイザーを有する。石灰骨およびヒドロキシル化ゼラ
チン由来の従来のゼラチンは、ｐＨ 5.5を超えた値で、
そのような平板状粒子形成の結果を示さない。本発明に
よるペプタイザー、例えば天然組換えコラーゲンＩＩＩ
はそのような特徴を示さず、乳剤生産保存と適用中の厳
密なｐＨ調節を不要にする。天然組換えコラーゲンはメ
チオニンの酸化を受け、向上した挙動を示すこともでき
る。適切には、メチオニンレベルは１グラムあたり80マ
イクロモル未満である。よって、本発明による乳剤は、
平板状粒子形成に否定的な影響を与えずにｐＨ４〜８で
核形成および成長することができる。乳剤生産の工程に
おいて、ｐＨの変化は、写真生産に関して得られる乳剤
をさらに処理する際に、否定的な影響をその結果に与え
ることはないであろう。
４〜８でハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定なペ
プタイザーを有する。石灰骨およびヒドロキシル化ゼラ
チン由来の従来のゼラチンは、ｐＨ 5.5を超えた値で、
そのような平板状粒子形成の結果を示さない。本発明に
よるペプタイザー、例えば天然組換えコラーゲンＩＩＩ
はそのような特徴を示さず、乳剤生産保存と適用中の厳
密なｐＨ調節を不要にする。天然組換えコラーゲンはメ
チオニンの酸化を受け、向上した挙動を示すこともでき
る。適切には、メチオニンレベルは１グラムあたり80マ
イクロモル未満である。よって、本発明による乳剤は、
平板状粒子形成に否定的な影響を与えずにｐＨ４〜８で
核形成および成長することができる。乳剤生産の工程に
おいて、ｐＨの変化は、写真生産に関して得られる乳剤
をさらに処理する際に、否定的な影響をその結果に与え
ることはないであろう。
【００４１】本発明による乳剤は、ハロゲン化銀乳剤を
有する従来のコラーゲンよりも、ペプタイザーが均質分
散性を有するとの利点を提供する。このために結晶化法
はすべての上記利点によりさらに均質でもある。ハロゲ
ン化銀の核形成および成長の多様な段階で、明確に定義
され、実質的に純粋なさらに均質なペプタイザーを添加
することで、コスト効果性と組合わせて、かつコラーゲ
ン様ペプタイザーによっては以前には可能ではなかった
調節された方法で結晶化性質を調節することができる。
多くのタイプのコラーゲンが自然に存在するので、これ
らは本発明による写真ハロゲン化乳剤に適用することも
できる。
有する従来のコラーゲンよりも、ペプタイザーが均質分
散性を有するとの利点を提供する。このために結晶化法
はすべての上記利点によりさらに均質でもある。ハロゲ
ン化銀の核形成および成長の多様な段階で、明確に定義
され、実質的に純粋なさらに均質なペプタイザーを添加
することで、コスト効果性と組合わせて、かつコラーゲ
ン様ペプタイザーによっては以前には可能ではなかった
調節された方法で結晶化性質を調節することができる。
多くのタイプのコラーゲンが自然に存在するので、これ
らは本発明による写真ハロゲン化乳剤に適用することも
できる。
【００４２】現在まで発見された２３コラーゲン遺伝子
が存在する。これらの多くが部分的または全体として配
列決定されている。データバンクはそのための多様な配
列を有している。例えばGenbank は寄託番号Genbank U0
8020でｃｏｌＩ配列を有しており、ｃｏｌＩＩＩ配列が
実施例１の参考文献５で示されている。これらの天然コ
ラーゲン遺伝子は、それら自体と比較して40〜50％の相
同性を示す。配列データに関して挙げられた参考文献の
関連情報は、本明細書で参考として含まれる。例えばWO
95／31473 の５ページを参照のこと。上述のように、本
発明のコラーゲン様化合物（この化合物はその後写真応
用のためにハロゲン化銀乳剤で使用される）を作るため
に、天然源からの単離または化学合成により得られた、
これらの天然配列それ自体または修飾しての利用が本発
明に包含される。適切には、これら配列が利用され、す
なわち天然アミノ酸配列または天然アミノ酸配列に類似
したポリペプチドをコードする配列は、コードされたポ
リペプチドが上記のパラメーターに入る限り利用され
る。ハロゲン化銀乳剤ゼラチンの源は動物の骨であり、
そのうちタイプＩコラーゲンが最も主要に存在するコラ
ーゲンタイプであるために、タイプＩがハロゲン化銀乳
剤で最も多く適用されるタイプであった。現在、ハロゲ
ン化銀乳剤での適性のために他のコラーゲンタイプも試
験し、適用することもできる。他のコラーゲンタイプ
は、写真応用での先行技術ではそれ自体として適用され
ず、ハロゲン化乳剤中ではそれ自体では確かに適用され
ていない。当然、多くのコラーゲンタイプは現在まで使
用されてきた動物組織中に存在している。現在、これら
のコラーゲンタイプは、以前に認識されなかった写真製
品に対するさらに有利な性質に実際にもたらしているの
かどうか、または寄与しているのかどうかを理解するこ
ともできるようになっている。コラーゲン様成分として
タイプＩ以外の組換えコラーゲン様ポリペプチドを有す
る写真感光性乳剤も、上記の特定要件が満足される限
り、本発明の適切な態様を形成するとみなされる。具体
的には、ハロゲン化銀中の利用が包含される。ハロゲン
化乳剤の場合、コラーゲンの100 ％の均一な源は、結晶
形成の最大均質分散性を提供することが予想される。均
質分散性の要件およびその値が本発明の説明のいずれか
で扱われている。ペプタイザーは全長コラーゲンを有す
ることは必要でなく、その断片を有してもよい。しか
し、適切には、そのような断片は少なくとも2.5 ｋＤ
ａ、好ましくは10ｋＤａ以上の長さで、ペプタイザーに
必要とされるコラーゲン特徴を保持しながら、発現の十
分なランダム性を確保する。
が存在する。これらの多くが部分的または全体として配
列決定されている。データバンクはそのための多様な配
列を有している。例えばGenbank は寄託番号Genbank U0
8020でｃｏｌＩ配列を有しており、ｃｏｌＩＩＩ配列が
実施例１の参考文献５で示されている。これらの天然コ
ラーゲン遺伝子は、それら自体と比較して40〜50％の相
同性を示す。配列データに関して挙げられた参考文献の
関連情報は、本明細書で参考として含まれる。例えばWO
95／31473 の５ページを参照のこと。上述のように、本
発明のコラーゲン様化合物（この化合物はその後写真応
用のためにハロゲン化銀乳剤で使用される）を作るため
に、天然源からの単離または化学合成により得られた、
これらの天然配列それ自体または修飾しての利用が本発
明に包含される。適切には、これら配列が利用され、す
なわち天然アミノ酸配列または天然アミノ酸配列に類似
したポリペプチドをコードする配列は、コードされたポ
リペプチドが上記のパラメーターに入る限り利用され
る。ハロゲン化銀乳剤ゼラチンの源は動物の骨であり、
そのうちタイプＩコラーゲンが最も主要に存在するコラ
ーゲンタイプであるために、タイプＩがハロゲン化銀乳
剤で最も多く適用されるタイプであった。現在、ハロゲ
ン化銀乳剤での適性のために他のコラーゲンタイプも試
験し、適用することもできる。他のコラーゲンタイプ
は、写真応用での先行技術ではそれ自体として適用され
ず、ハロゲン化乳剤中ではそれ自体では確かに適用され
ていない。当然、多くのコラーゲンタイプは現在まで使
用されてきた動物組織中に存在している。現在、これら
のコラーゲンタイプは、以前に認識されなかった写真製
品に対するさらに有利な性質に実際にもたらしているの
かどうか、または寄与しているのかどうかを理解するこ
ともできるようになっている。コラーゲン様成分として
タイプＩ以外の組換えコラーゲン様ポリペプチドを有す
る写真感光性乳剤も、上記の特定要件が満足される限
り、本発明の適切な態様を形成するとみなされる。具体
的には、ハロゲン化銀中の利用が包含される。ハロゲン
化乳剤の場合、コラーゲンの100 ％の均一な源は、結晶
形成の最大均質分散性を提供することが予想される。均
質分散性の要件およびその値が本発明の説明のいずれか
で扱われている。ペプタイザーは全長コラーゲンを有す
ることは必要でなく、その断片を有してもよい。しか
し、適切には、そのような断片は少なくとも2.5 ｋＤ
ａ、好ましくは10ｋＤａ以上の長さで、ペプタイザーに
必要とされるコラーゲン特徴を保持しながら、発現の十
分なランダム性を確保する。
【００４３】上記の乳剤以外に、本発明は、平板状粒子
が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化
銀乳剤の調製方法も関する。該方法は、核形成ペプタイ
ザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長
ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を成長させる
ことを有し、双方のペプタイザーが所定の量で存在し、
少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製され
たコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超
える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。本
発明のそのような方法は、核形成工程において、および
／または粒子成長工程中で、ペプタイザーを添加するこ
とを有することができ、該ペプタイザーが上記態様のい
ずれかまたは請求の範囲から選択できる。ある特別の態
様において、本方法は、核角形成工程において、及び粒
子成長工程中の双方において、ペプタイザーを添加する
ことを有することができる。両工程が取られる場合に用
いられるペプタイザーは、その場合の環境によるが、同
一であっても異なってもよい。
が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化
銀乳剤の調製方法も関する。該方法は、核形成ペプタイ
ザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長
ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を成長させる
ことを有し、双方のペプタイザーが所定の量で存在し、
少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製され
たコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超
える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。本
発明のそのような方法は、核形成工程において、および
／または粒子成長工程中で、ペプタイザーを添加するこ
とを有することができ、該ペプタイザーが上記態様のい
ずれかまたは請求の範囲から選択できる。ある特別の態
様において、本方法は、核角形成工程において、及び粒
子成長工程中の双方において、ペプタイザーを添加する
ことを有することができる。両工程が取られる場合に用
いられるペプタイザーは、その場合の環境によるが、同
一であっても異なってもよい。
【００４４】本発明にしたがってＡｇＸ乳剤を調製した
後、ＡｇＸ乳剤は、写真要素を調製する標準的操作を受
けることができる。該乳剤は、写真材料上にハロゲン化
銀乳剤層を得るためにそれ自体公知の方法で塗布するこ
とができ、該層のハロゲン化銀結晶は５以上のアスペク
ト比を有する。
後、ＡｇＸ乳剤は、写真要素を調製する標準的操作を受
けることができる。該乳剤は、写真材料上にハロゲン化
銀乳剤層を得るためにそれ自体公知の方法で塗布するこ
とができ、該層のハロゲン化銀結晶は５以上のアスペク
ト比を有する。
【００４５】該写真要素は、適切には、光、レーザーま
たはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素は白黒
リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフ
ィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分が
デジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒
紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタ
ルデータベースからのレーザー照射により感光された紙
から選択される。そのような方法にしたがって得られる
写真要素、ならびに内部感光化ハロゲン化銀乳剤を用い
る直接ポジプロセスおよび熱現像を用いる要素も本発明
に包含される。
たはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素は白黒
リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフ
ィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分が
デジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒
紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタ
ルデータベースからのレーザー照射により感光された紙
から選択される。そのような方法にしたがって得られる
写真要素、ならびに内部感光化ハロゲン化銀乳剤を用い
る直接ポジプロセスおよび熱現像を用いる要素も本発明
に包含される。
【００４６】本発明のもう一つの特徴は、0.95グラム／
リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換
えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法にある。該組換
えコラーゲンはらせん構造が存在しない。発現は、高い
発現および好ましくは分泌を確実とするように大腸菌ま
たはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物中で起
こるのが好ましい。本方法は、真菌細胞、好ましくは酵
母細胞を用いて適切に実施することができる。適切に
は、宿主細胞は、ハンセヌラ、トリコデルマ、アスペル
ギルスおよびピヒアのような高い発現宿主細胞からなる
群から選択される。真菌および特に酵母細胞は、繰り返
し配列の悪い発現をあまり受けないので、バクテリアよ
りも好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるコ
ラーゲン構造を攻撃する高いレベルのプロテアーゼを有
さないのがよい。この点で、ピヒアは非常に適切な発現
システムの具体例を提供する。好ましくは、該微生物
は、コラーゲン様配列を繊維原へと加工する活性のある
翻訳後プロセス機構がないことにより、発現産物中にら
せん構造の欠如を確実とする。また、そうしたプロセス
は、微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんに加工す
る活性のある翻訳後プロセス機構を持たないとき、およ
び／または発現される核酸配列がプロコラーゲンおよび
テロペプチドをコードする配列を持たないときに起こり
うる。使用される宿主は、コラーゲン生産に関して当分
野での以前の示唆とは対照的に、コラーゲン三重らせん
構築物に必要とされる酵素であるプロリル−4-ヒドロキ
シラーゼの発現のために遺伝子の存在を必要としない。
本発明の組換えコラーゲンの発現に適する宿主細胞を、
発現される配列と宿主細胞に関する知識との組合せにお
ける写真技術に適するようにするために、本明細書に記
載される必要なパラメーターに基づいて、公知の工業的
な酵素産生真菌宿主細胞、具体的には酵母細胞からの適
切な宿主細胞の選択は当業者には可能であろう。
リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換
えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法にある。該組換
えコラーゲンはらせん構造が存在しない。発現は、高い
発現および好ましくは分泌を確実とするように大腸菌ま
たはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物中で起
こるのが好ましい。本方法は、真菌細胞、好ましくは酵
母細胞を用いて適切に実施することができる。適切に
は、宿主細胞は、ハンセヌラ、トリコデルマ、アスペル
ギルスおよびピヒアのような高い発現宿主細胞からなる
群から選択される。真菌および特に酵母細胞は、繰り返
し配列の悪い発現をあまり受けないので、バクテリアよ
りも好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるコ
ラーゲン構造を攻撃する高いレベルのプロテアーゼを有
さないのがよい。この点で、ピヒアは非常に適切な発現
システムの具体例を提供する。好ましくは、該微生物
は、コラーゲン様配列を繊維原へと加工する活性のある
翻訳後プロセス機構がないことにより、発現産物中にら
せん構造の欠如を確実とする。また、そうしたプロセス
は、微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんに加工す
る活性のある翻訳後プロセス機構を持たないとき、およ
び／または発現される核酸配列がプロコラーゲンおよび
テロペプチドをコードする配列を持たないときに起こり
うる。使用される宿主は、コラーゲン生産に関して当分
野での以前の示唆とは対照的に、コラーゲン三重らせん
構築物に必要とされる酵素であるプロリル−4-ヒドロキ
シラーゼの発現のために遺伝子の存在を必要としない。
本発明の組換えコラーゲンの発現に適する宿主細胞を、
発現される配列と宿主細胞に関する知識との組合せにお
ける写真技術に適するようにするために、本明細書に記
載される必要なパラメーターに基づいて、公知の工業的
な酵素産生真菌宿主細胞、具体的には酵母細胞からの適
切な宿主細胞の選択は当業者には可能であろう。
【００４７】非切断配列の生産を確実とするために、組
換えコラーゲン様材料を作るための本発明の方法は、発
現宿主細胞でプロテアーゼ活性のあるプロテアーゼ切断
部位が実質的に存在しない組換えコラーゲンアミノ酸配
列をコードする核酸配列を用いることを有する。例えば
ピヒア・パストリスの場合、およびおそらく他の宿主細
胞にも関しても、対応するアミノ酸が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ
−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（ここ
で、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他
のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なく
とも一つが変えられる）を有さないコラーゲンをコード
する核酸配列が望ましいであろう。本発明の好ましい方
法は、発現宿主として微生物ピヒア・パストリスを用い
ることを有する。
換えコラーゲン様材料を作るための本発明の方法は、発
現宿主細胞でプロテアーゼ活性のあるプロテアーゼ切断
部位が実質的に存在しない組換えコラーゲンアミノ酸配
列をコードする核酸配列を用いることを有する。例えば
ピヒア・パストリスの場合、およびおそらく他の宿主細
胞にも関しても、対応するアミノ酸が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ
−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（ここ
で、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他
のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なく
とも一つが変えられる）を有さないコラーゲンをコード
する核酸配列が望ましいであろう。本発明の好ましい方
法は、発現宿主として微生物ピヒア・パストリスを用い
ることを有する。
【００４８】本方法は、３グラム／リットルを超えるペ
プチド収穫をもたらす発現を適切に提供する。本方法
は、本発明の乳剤に対して上記で定義した組換えコラー
ゲン様ペプタイザーのいずれかを用いて適切に実施する
ことができる。そこに記載の環境下の実施例から明らか
であるように、マルチコピー形質転換体は、バイオマス
湿潤重量 435ｇ／リットルで、清澄化ブロス１リットル
あたり14ｇを超えるゼラチンを提供する。最も適切に
は、他のタンパク質、多糖類および核酸が実質的に存在
しなくなるまで、微生物発現から得られる生成物を単離
し、精製する。実施例から明らかなように、多くの方法
がこれを達成するために当業者に利用できる。本発明に
よる方法は、核酸含量 100ｐｐｍ未満、多糖類含量５％
未満、他のタンパク質が市販製品中の含量未満の程度ま
で少なくとも単離され精製された発現生成物を提供する
ことができる。より好ましくは、ＤＮＡ含量１ｐｐｍ未
満、ＲＮＡ含量10ｐｐｍ未満、さらには５ｐｐｍ未満、
および多糖類含量１％未満を得ることができる。
プチド収穫をもたらす発現を適切に提供する。本方法
は、本発明の乳剤に対して上記で定義した組換えコラー
ゲン様ペプタイザーのいずれかを用いて適切に実施する
ことができる。そこに記載の環境下の実施例から明らか
であるように、マルチコピー形質転換体は、バイオマス
湿潤重量 435ｇ／リットルで、清澄化ブロス１リットル
あたり14ｇを超えるゼラチンを提供する。最も適切に
は、他のタンパク質、多糖類および核酸が実質的に存在
しなくなるまで、微生物発現から得られる生成物を単離
し、精製する。実施例から明らかなように、多くの方法
がこれを達成するために当業者に利用できる。本発明に
よる方法は、核酸含量 100ｐｐｍ未満、多糖類含量５％
未満、他のタンパク質が市販製品中の含量未満の程度ま
で少なくとも単離され精製された発現生成物を提供する
ことができる。より好ましくは、ＤＮＡ含量１ｐｐｍ未
満、ＲＮＡ含量10ｐｐｍ未満、さらには５ｐｐｍ未満、
および多糖類含量１％未満を得ることができる。
【００４９】本発明のもう一つの特徴は、新規な組換え
コラーゲン様ペプチドを包含する。特に、本発明は、コ
ラーゲンをコードする核酸の遺伝子工学により調製され
た実質的に純粋なコラーゲン様材料を包含し、該ペプタ
イザーが天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を
示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸
タイプを有する。核酸配列は天然配列に由来するか、ま
たは新たに（de novo)合成された合成核酸であってよ
い。他の適切な態様は、本発明による乳剤の態様に記載
したペプタイザーである。相同性が50％を超える、好ま
しくは80％のオーダー、さらに80〜100 ％が好ましいの
で、できるだけ近い相同性が望ましい。具体的には、産
物はＧＸＹ部分配列内にブロックコポリマー構造がない
のが好ましい。
コラーゲン様ペプチドを包含する。特に、本発明は、コ
ラーゲンをコードする核酸の遺伝子工学により調製され
た実質的に純粋なコラーゲン様材料を包含し、該ペプタ
イザーが天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を
示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸
タイプを有する。核酸配列は天然配列に由来するか、ま
たは新たに（de novo)合成された合成核酸であってよ
い。他の適切な態様は、本発明による乳剤の態様に記載
したペプタイザーである。相同性が50％を超える、好ま
しくは80％のオーダー、さらに80〜100 ％が好ましいの
で、できるだけ近い相同性が望ましい。具体的には、産
物はＧＸＹ部分配列内にブロックコポリマー構造がない
のが好ましい。
【００５０】本発明の好ましい態様として、コラーゲン
様材料はシステイン残基を有さない。写真製品にシステ
インが存在することにより、製品製造方法が妨げられる
であろう。よって、システインはできるだけ少量で存在
するのが好ましい。これは、組換え産物の化学的修飾に
よるか、またはシステインがもはやコードされない程度
にシステインをコードする配列の変異または削除による
産物をコードする核酸配列の変異により達成することが
できる。適切には、写真応用は、システインを0.1％未
満で有する材料を用いる。
様材料はシステイン残基を有さない。写真製品にシステ
インが存在することにより、製品製造方法が妨げられる
であろう。よって、システインはできるだけ少量で存在
するのが好ましい。これは、組換え産物の化学的修飾に
よるか、またはシステインがもはやコードされない程度
にシステインをコードする配列の変異または削除による
産物をコードする核酸配列の変異により達成することが
できる。適切には、写真応用は、システインを0.1％未
満で有する材料を用いる。
【００５１】特に、最適なハロゲン化銀乳剤のために、
コラーゲン材料の相同性が最も重要性を持つ。それは、
改良を提供する不純物がないという単なる問題ではな
く、結晶化の非常に感受性のある方法の良好なコントロ
ールを可能とし、均一な結晶成長をも可能とする正確に
同一の組成と長さの分子を提供する可能性である。この
ため、組換えコラーゲン様材料は、写真製造法のこの部
分に価値を持ちうるだろう。さらに、現在まで完全に見
過ごされてきた特徴である、繊維原形成と三重らせんの
形成がないことが写真製造方法におけるこの特別な利用
に必要とされる。写真材料における還元基の数の関連性
における洞察も大きな重要性を有する。これは平板状粒
子形成に必要とされる先行技術に示唆された厳密な低い
量ではない。よって、適用されるコラーゲン様材料にお
いて、システイン、ヒスチジンおよびメチオニンレベル
を低減することにより、本発明の好ましい態様が形成さ
れる。
コラーゲン材料の相同性が最も重要性を持つ。それは、
改良を提供する不純物がないという単なる問題ではな
く、結晶化の非常に感受性のある方法の良好なコントロ
ールを可能とし、均一な結晶成長をも可能とする正確に
同一の組成と長さの分子を提供する可能性である。この
ため、組換えコラーゲン様材料は、写真製造法のこの部
分に価値を持ちうるだろう。さらに、現在まで完全に見
過ごされてきた特徴である、繊維原形成と三重らせんの
形成がないことが写真製造方法におけるこの特別な利用
に必要とされる。写真材料における還元基の数の関連性
における洞察も大きな重要性を有する。これは平板状粒
子形成に必要とされる先行技術に示唆された厳密な低い
量ではない。よって、適用されるコラーゲン様材料にお
いて、システイン、ヒスチジンおよびメチオニンレベル
を低減することにより、本発明の好ましい態様が形成さ
れる。
【００５２】本発明による化合物はさらに別の利点も明
らかにした。公知のコラーゲン材料、例えば、骨および
皮等の動物源からの規則的で加水分解されたコラーゲン
は、ｐＨ5.5 を超えるｐＨで写真フィルム乳剤の低い平
板状粒子形成をもたらす。組換えコラーゲンの新しいグ
ループは、ｐＨ5.5 だけでなく、より高いｐＨ、例えば
ｐＨ７以上でも、同一で目覚しく高い平板状粒子形成程
度をもたらすことがわかった。これにより、新しい化合
物が非組換えコラーゲンよりも明らかに低いｐＨ依存性
を有するので、厳密性を低くして調整したｐＨを有する
ハロゲン化銀乳剤を調製する可能性がもたらされる。よ
って、本発明は、高い平板状粒子パーセント、すなわち
50％を超え、好ましくは80％を超えるパーセントに到達
しながらｐＨ４〜８でハロゲン化銀乳剤の生産に用いる
ことのできる組換えコラーゲン様化合物にも関する。有
用であると考えることのできる組換えコラーゲンの付加
的な特徴は、等電点が、酸性ＩＥＰを有する1996年に記
載されたイーストマンコダック組換えポリペプチドとは
反対に塩基性である。本発明による組換えコラーゲン
が、４個を超えるアミノ酸が存在するアミノ酸組成物を
有することは、コード配列において可変性の増大がもた
らされ、よって高い発現度を可能とすることが予期され
る。全ＧＸＹ配列中で33％プロリン未満のＧＸＹ部分を
有する配列を用いることにより、付加的な変化が導入さ
れる。この良好な発現は、ＧＸＹ配列におけるブロック
コポリマーアミノ酸配列構造を用いることなく達成され
る。
らかにした。公知のコラーゲン材料、例えば、骨および
皮等の動物源からの規則的で加水分解されたコラーゲン
は、ｐＨ5.5 を超えるｐＨで写真フィルム乳剤の低い平
板状粒子形成をもたらす。組換えコラーゲンの新しいグ
ループは、ｐＨ5.5 だけでなく、より高いｐＨ、例えば
ｐＨ７以上でも、同一で目覚しく高い平板状粒子形成程
度をもたらすことがわかった。これにより、新しい化合
物が非組換えコラーゲンよりも明らかに低いｐＨ依存性
を有するので、厳密性を低くして調整したｐＨを有する
ハロゲン化銀乳剤を調製する可能性がもたらされる。よ
って、本発明は、高い平板状粒子パーセント、すなわち
50％を超え、好ましくは80％を超えるパーセントに到達
しながらｐＨ４〜８でハロゲン化銀乳剤の生産に用いる
ことのできる組換えコラーゲン様化合物にも関する。有
用であると考えることのできる組換えコラーゲンの付加
的な特徴は、等電点が、酸性ＩＥＰを有する1996年に記
載されたイーストマンコダック組換えポリペプチドとは
反対に塩基性である。本発明による組換えコラーゲン
が、４個を超えるアミノ酸が存在するアミノ酸組成物を
有することは、コード配列において可変性の増大がもた
らされ、よって高い発現度を可能とすることが予期され
る。全ＧＸＹ配列中で33％プロリン未満のＧＸＹ部分を
有する配列を用いることにより、付加的な変化が導入さ
れる。この良好な発現は、ＧＸＹ配列におけるブロック
コポリマーアミノ酸配列構造を用いることなく達成され
る。
【００５３】本発明を実施例によりさらに詳しく説明す
る。
る。
【００５４】
【実施例】実施例１ 組換えＤＮＡ技術による写真応用のための酵母、真菌等
の発現宿主生物中で組換え異種タンパク質として発現さ
れたゼラチン、コラーゲンまたはコラーゲン断片は幾つ
かの利点を有している。（ｉ）例えば慣用のゼラチンと
は対照的に、組換え分子が厳密に非架橋物として作るこ
とができる。（ii）分子組成が正確に定められる。（ii
i)作られる分子は単一種類（またはわずかに数個の分子
の明確な混合物）を有し、他のタンパク質性分子または
非タンパク質性分子による汚染が少量であるかまたは無
視できる。分子量分布は非常に狭く、単分散（単一成分
ゼラチン）または多分散（oligo-disperse）である。
（iv）生成物は高い再現性のある方法で、すなわち一定
の品質をもって産生することができる。特に、酵母は、
繰り返し性の高いグリシンに富んだ配列及びプロリンに
富んだ配列を有するポリペプチドのためによく適した産
生生物である。
の発現宿主生物中で組換え異種タンパク質として発現さ
れたゼラチン、コラーゲンまたはコラーゲン断片は幾つ
かの利点を有している。（ｉ）例えば慣用のゼラチンと
は対照的に、組換え分子が厳密に非架橋物として作るこ
とができる。（ii）分子組成が正確に定められる。（ii
i)作られる分子は単一種類（またはわずかに数個の分子
の明確な混合物）を有し、他のタンパク質性分子または
非タンパク質性分子による汚染が少量であるかまたは無
視できる。分子量分布は非常に狭く、単分散（単一成分
ゼラチン）または多分散（oligo-disperse）である。
（iv）生成物は高い再現性のある方法で、すなわち一定
の品質をもって産生することができる。特に、酵母は、
繰り返し性の高いグリシンに富んだ配列及びプロリンに
富んだ配列を有するポリペプチドのためによく適した産
生生物である。
【００５５】これらの分子的特徴が細菌システム中で遺
伝的不安定性（例えば遺伝子の一部の組換えおよびシャ
フリング（shuffling)）をしばしば引き起こす一方で、
これは酵母中では大きな問題ではないように思えた［1,
2］。それらは真核細胞であり、該細胞中ではヒドロキ
シル化等の翻訳後修飾が引き起こされうるが、効率的な
分泌または細胞内発現のいずれかのための選択を可能と
させる。幾つかの種は、動物細胞培養とは対照的にメタ
ノール等の安い基質で効率的に生育する。分泌産生は
（植物とは対照的に）培養中または培養後の産物の十分
な回収を可能とする。幾つかの強くしっかりと調節され
た誘導性プロモーターが酵母システムに利用可能であ
り、効率の良い発現が可能となり、宿主細胞の生存と成
長に対する起こりうる否定的な効果を最小限にする。利
用可能な幾つかのよく適合させたシステムの一つとし
て、我々はメチロトローフである（methylotropic)酵母
ピヒア・パストリスによる分泌産生のために選択した。
我々の発現レベルは組換えタンパク質についてこれまで
報告された最大のものの中にあり、遺伝子（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ）およびタンパク質レベルでのゼラチン／コラーゲ
ン構造の上述のものを処理することのできるこの発現宿
主の能力を示している。宿主の形質転換後、統合物は酵
母の染色体中に取り込まれ、形質転換体の遺伝的安定性
をもたらす（プラスミドの損失は、その後は重要性では
ない）。組換え遺伝子がＨＩＳ４座またはＡＯＸ１座の
いずれかに導入されている形質転換体（例えばアルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターの調節下に外来
標的遺伝子を有するもの）を作ることができる。後者の
場合、統合のタイプにしたがって、ＡＯＸ１遺伝子が壊
され、メタノールの遅い利用およびメタノールによる遅
い成長をもたらす（Ｍｕｔ S 表現型）。機能的ＡＯＸ１
遺伝子がなおも存在する場合、表現型はＭｕｔ+ であ
る。両表現型を用いることができるが、我々は一般的に
は迅速な成長を好むので、我々のプロトコールは主にＭ
ｕｔ+ 形質転換体の生成と選択に向けられた。Ｐ．パス
トリス発現系以外の酵母または真菌発現系が、原則とし
て、産生される分子の正確な種類および品質、意図され
る産生規模、並びに生産コスト及び適用可能な市場価格
に依存するが、組換えゼラチンの効率的な産生に同じく
よく用いることができることは自明である。ピヒア系が
パイロット生産および比較的容易な産物回収のための迅
速で効率的なシステムとして用いられた。
伝的不安定性（例えば遺伝子の一部の組換えおよびシャ
フリング（shuffling)）をしばしば引き起こす一方で、
これは酵母中では大きな問題ではないように思えた［1,
2］。それらは真核細胞であり、該細胞中ではヒドロキ
シル化等の翻訳後修飾が引き起こされうるが、効率的な
分泌または細胞内発現のいずれかのための選択を可能と
させる。幾つかの種は、動物細胞培養とは対照的にメタ
ノール等の安い基質で効率的に生育する。分泌産生は
（植物とは対照的に）培養中または培養後の産物の十分
な回収を可能とする。幾つかの強くしっかりと調節され
た誘導性プロモーターが酵母システムに利用可能であ
り、効率の良い発現が可能となり、宿主細胞の生存と成
長に対する起こりうる否定的な効果を最小限にする。利
用可能な幾つかのよく適合させたシステムの一つとし
て、我々はメチロトローフである（methylotropic)酵母
ピヒア・パストリスによる分泌産生のために選択した。
我々の発現レベルは組換えタンパク質についてこれまで
報告された最大のものの中にあり、遺伝子（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ）およびタンパク質レベルでのゼラチン／コラーゲ
ン構造の上述のものを処理することのできるこの発現宿
主の能力を示している。宿主の形質転換後、統合物は酵
母の染色体中に取り込まれ、形質転換体の遺伝的安定性
をもたらす（プラスミドの損失は、その後は重要性では
ない）。組換え遺伝子がＨＩＳ４座またはＡＯＸ１座の
いずれかに導入されている形質転換体（例えばアルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターの調節下に外来
標的遺伝子を有するもの）を作ることができる。後者の
場合、統合のタイプにしたがって、ＡＯＸ１遺伝子が壊
され、メタノールの遅い利用およびメタノールによる遅
い成長をもたらす（Ｍｕｔ S 表現型）。機能的ＡＯＸ１
遺伝子がなおも存在する場合、表現型はＭｕｔ+ であ
る。両表現型を用いることができるが、我々は一般的に
は迅速な成長を好むので、我々のプロトコールは主にＭ
ｕｔ+ 形質転換体の生成と選択に向けられた。Ｐ．パス
トリス発現系以外の酵母または真菌発現系が、原則とし
て、産生される分子の正確な種類および品質、意図され
る産生規模、並びに生産コスト及び適用可能な市場価格
に依存するが、組換えゼラチンの効率的な産生に同じく
よく用いることができることは自明である。ピヒア系が
パイロット生産および比較的容易な産物回収のための迅
速で効率的なシステムとして用いられた。
【００５６】材料、方法および分析 一般的な分子生物学的技術 クローニング操作は基本的にはManiatisら［３］にした
がって行った。ウィザードプラスＳＶミニプレプ（Wiza
rd Plus SV miniprep)、またはキアゲン（Qiagen）ミジ
プレプシステム（midiprep systems）を用いてＤＮＡを
単離した。ＤＮＡをＱＩＡクイックゲル抽出キット（QI
Aquick Gel Extraction Kit)（キアゲン）を用いてアガ
ロースゲルから単離した。用いられる酵素はすべて、特
記しない限り、ファルマシア（Pharmacia)からのもので
あり、製造業者の推薦にしたがって用いた。大腸菌の形
質転換を、バイオラッド（BioRad）のジーンパルサー
（GenePulser）を用いる標準的な泳動により行った。ピ
ヒア・パストリスの扱いと形質転換を伴なうすべての操
作およびこの宿主微生物におけるタンパク質の発現は、
ピヒア発現キット（インビトロゲン（Invitrogen))のマ
ニュアルにしたがって行った［４］。
がって行った。ウィザードプラスＳＶミニプレプ（Wiza
rd Plus SV miniprep)、またはキアゲン（Qiagen）ミジ
プレプシステム（midiprep systems）を用いてＤＮＡを
単離した。ＤＮＡをＱＩＡクイックゲル抽出キット（QI
Aquick Gel Extraction Kit)（キアゲン）を用いてアガ
ロースゲルから単離した。用いられる酵素はすべて、特
記しない限り、ファルマシア（Pharmacia)からのもので
あり、製造業者の推薦にしたがって用いた。大腸菌の形
質転換を、バイオラッド（BioRad）のジーンパルサー
（GenePulser）を用いる標準的な泳動により行った。ピ
ヒア・パストリスの扱いと形質転換を伴なうすべての操
作およびこの宿主微生物におけるタンパク質の発現は、
ピヒア発現キット（インビトロゲン（Invitrogen))のマ
ニュアルにしたがって行った［４］。
【００５７】ラットＣＯＬ３Ａ１ ｃＤＮＡ断片の酵母
（ピヒア・パストリス）発現ベクターへの挿入 部分的ラットプロα１（ＩＩＩ）コラーゲンｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＲＧＲ５は、Vuorio博士より贈呈され
たものである［５］。それをＰｓｔＩで消化し、らせん
領域の約０．７ｋｂ断片を得た。Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を用いて、該断片
を平滑末端化し、次にＳｎａＢＩ消化されたＣＩＰ脱リ
ン酸化ｐＰＩＣ９ピヒア・パストリス発現ベクター（イ
ンビトロゲン）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次に、この連結反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換した。
（ピヒア・パストリス）発現ベクターへの挿入 部分的ラットプロα１（ＩＩＩ）コラーゲンｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＲＧＲ５は、Vuorio博士より贈呈され
たものである［５］。それをＰｓｔＩで消化し、らせん
領域の約０．７ｋｂ断片を得た。Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を用いて、該断片
を平滑末端化し、次にＳｎａＢＩ消化されたＣＩＰ脱リ
ン酸化ｐＰＩＣ９ピヒア・パストリス発現ベクター（イ
ンビトロゲン）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次に、この連結反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換した。
【００５８】可能で適当なベクターの選択はｐＰＩＣ９
に限定されないことは理解されよう。当業者であれば誰
でもｐＨＩＬ−Ｓ１等の多くの他の可能なベクターを使
用し、適合させることができ、ここで、サッカロマイセ
スセレビシアエ由来のα接合因子（alpha-mating facto
r)（αＭＦ）プレプロ（prepro）シグナルのかわりにピ
ヒア・パストリス酸性ホスファターゼ１（Ｐｈｏ１）−
シグナルが用いられるか、または細胞内発現のためにｐ
ＨＩＬ−Ｄ１および多くの他のものが用いられる。
に限定されないことは理解されよう。当業者であれば誰
でもｐＨＩＬ−Ｓ１等の多くの他の可能なベクターを使
用し、適合させることができ、ここで、サッカロマイセ
スセレビシアエ由来のα接合因子（alpha-mating facto
r)（αＭＦ）プレプロ（prepro）シグナルのかわりにピ
ヒア・パストリス酸性ホスファターゼ１（Ｐｈｏ１）−
シグナルが用いられるか、または細胞内発現のためにｐ
ＨＩＬ−Ｄ１および多くの他のものが用いられる。
【００５９】プラスミドＤＮＡを単離し、こうして作ら
れたｐＣＯＬ３Ａ１構築物の配列（図１）を、自動化シ
ーケンサー（ＡＬＦ ＤＮＡシーケンサー、ファルマシ
ア）およびピヒア・パストリス発現キットで示唆された
5'ＡＯＸ１、3'ＡＯＸ１およびα−因子（αＭＦ）配列
決定プライマーを用いてサンガー（Sanger）の方法
［６］による配列決定で確認した（図２を参照のこ
と）。発現したタンパク質について予想されたタンパク
質配列を図３に示す。
れたｐＣＯＬ３Ａ１構築物の配列（図１）を、自動化シ
ーケンサー（ＡＬＦ ＤＮＡシーケンサー、ファルマシ
ア）およびピヒア・パストリス発現キットで示唆された
5'ＡＯＸ１、3'ＡＯＸ１およびα−因子（αＭＦ）配列
決定プライマーを用いてサンガー（Sanger）の方法
［６］による配列決定で確認した（図２を参照のこ
と）。発現したタンパク質について予想されたタンパク
質配列を図３に示す。
【００６０】ｐＣＯＬ３Ａ１によるピヒア・パストリス
の形質転換 ピヒア・パストリスの形質転換でＭｕｔ+ 形質転換体を
得るために、該構築物をＳａｌＩで一本鎖とした。Ｍｕ
ｔS 形質転換体を得るために、構築物をＢｇｌＩＩで消
化した。フェノール抽出およびエタノール析出後、次に
この構築物を用いて、バイオラッドジーンパルサー（15
00Ｖ、25μＦおよび 200Ωに設定し、 0.2ｃｍキュベッ
トを用いたもの）を用いて、BeckerおよびGuarente
［７］によるエレクトロポレーションを用いて、ピヒア
・パストリス株ＧＳ１１５（インビトロゲン）を形質転
換した。Ｈｉｓ- 株ＧＳ１１５をＨｉｓ+ に変換するベ
クターの存在について選択するために最小デキストロー
スプレート（ＭＤプレート；1.34％ＹＮＢ、４×10-5％
ビオチン、１％デキストロースおよび1.5 ％寒天）に形
質転換混合物を塗布した。30℃で３日間の生育後、幾つ
かのコロニーがＭｕｔ遺伝子型のＰＣＲ確認のために選
択した。ゲノムＤＮＡを Lee［８］の酵母ミニプレプ法
にしたがって単離し、ＲＮａｓｅ Ａで処理した。ＰＣ
Ｒを、全体積50μｌに、ゲノムＤＮＡ 100ｎｇ、5'ＡＯ
Ｘ１プライマー50ｐｍｏｌ、3'ＡＯＸ１プライマー50ｐ
ｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ1.25Ｕ（ファルマシア）、
0.2 ｍＭｄＮＴＰｓ（ファルマシア）および１×Ｔａｑ
緩衝液（ファルマシア）を用いて行った。94℃で５分間
の最初の変成後、94℃で１分間、57℃で１分間および72
℃で２分間からなるサイクルを30回行った。最終的な伸
長は72℃で10分間であった。使用されたＰＣＲ装置はパ
ーキンエルマー（Perkin-Elmer）GeneAmp 480 であっ
た。アガロースゲル電気泳動により、Ｍｕｔ+ 形質転換
体に関して 2.2ｋｂ内因性ＡＯＸ１バンドを示すはずで
ある。 2.2ｋｂバンドのない形質転換体はＭｕｔS であ
る。Ｍｕｔ+ およびＭｕｔS 遺伝子型の双方の確認済形
質転換体を、50ｍｌコニカルチューブ（角度をつけて置
かれ、キャップをゆるく付けた）中、または100 ｍｌも
しくは１Ｌ（バッフル付き）フラスコ中での小規模発現
について選択した。
の形質転換 ピヒア・パストリスの形質転換でＭｕｔ+ 形質転換体を
得るために、該構築物をＳａｌＩで一本鎖とした。Ｍｕ
ｔS 形質転換体を得るために、構築物をＢｇｌＩＩで消
化した。フェノール抽出およびエタノール析出後、次に
この構築物を用いて、バイオラッドジーンパルサー（15
00Ｖ、25μＦおよび 200Ωに設定し、 0.2ｃｍキュベッ
トを用いたもの）を用いて、BeckerおよびGuarente
［７］によるエレクトロポレーションを用いて、ピヒア
・パストリス株ＧＳ１１５（インビトロゲン）を形質転
換した。Ｈｉｓ- 株ＧＳ１１５をＨｉｓ+ に変換するベ
クターの存在について選択するために最小デキストロー
スプレート（ＭＤプレート；1.34％ＹＮＢ、４×10-5％
ビオチン、１％デキストロースおよび1.5 ％寒天）に形
質転換混合物を塗布した。30℃で３日間の生育後、幾つ
かのコロニーがＭｕｔ遺伝子型のＰＣＲ確認のために選
択した。ゲノムＤＮＡを Lee［８］の酵母ミニプレプ法
にしたがって単離し、ＲＮａｓｅ Ａで処理した。ＰＣ
Ｒを、全体積50μｌに、ゲノムＤＮＡ 100ｎｇ、5'ＡＯ
Ｘ１プライマー50ｐｍｏｌ、3'ＡＯＸ１プライマー50ｐ
ｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ1.25Ｕ（ファルマシア）、
0.2 ｍＭｄＮＴＰｓ（ファルマシア）および１×Ｔａｑ
緩衝液（ファルマシア）を用いて行った。94℃で５分間
の最初の変成後、94℃で１分間、57℃で１分間および72
℃で２分間からなるサイクルを30回行った。最終的な伸
長は72℃で10分間であった。使用されたＰＣＲ装置はパ
ーキンエルマー（Perkin-Elmer）GeneAmp 480 であっ
た。アガロースゲル電気泳動により、Ｍｕｔ+ 形質転換
体に関して 2.2ｋｂ内因性ＡＯＸ１バンドを示すはずで
ある。 2.2ｋｂバンドのない形質転換体はＭｕｔS であ
る。Ｍｕｔ+ およびＭｕｔS 遺伝子型の双方の確認済形
質転換体を、50ｍｌコニカルチューブ（角度をつけて置
かれ、キャップをゆるく付けた）中、または100 ｍｌも
しくは１Ｌ（バッフル付き）フラスコ中での小規模発現
について選択した。
【００６１】ＣＯＬ３Ａ１断片の発現 基本的にはピヒア・パストリス発現キットマニュアルに
記載のように発現を行った。簡単には、形質転換体を一
晩ＢＭＧ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％Ｙ
ＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）を
ＯＤ600 ＝２〜６まで生育させた。次に培養物を遠心し
てＢＭＭ（グリセロールを 0.5％メタノール変えた以外
はＢＭＧと同じ）でＯＤ600 が 1.0になるまで再懸濁し
た。細胞を４日間30℃および 250ｒｐｍで、毎日メタノ
ールを 0.5％まで加えて生育させた。
記載のように発現を行った。簡単には、形質転換体を一
晩ＢＭＧ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％Ｙ
ＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）を
ＯＤ600 ＝２〜６まで生育させた。次に培養物を遠心し
てＢＭＭ（グリセロールを 0.5％メタノール変えた以外
はＢＭＧと同じ）でＯＤ600 が 1.0になるまで再懸濁し
た。細胞を４日間30℃および 250ｒｐｍで、毎日メタノ
ールを 0.5％まで加えて生育させた。
【００６２】培養上清10μｌをLaemmli ［９］によるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで、バイオラッドのミニPROTEAN IIシス
テムを用いて分析した。クーマシーブリリアントブルー
染色から、幾つかのバンドが明らかになり、そのうちの
最大のバンドは、見掛けの長さが約29ｋＤという予想さ
れた値を有していた。ゼラチン、コラーゲンおよびコラ
ーゲン断片は、見掛けのＭｗにより移動し、少なくとも
部分的には比較的低い平均残基Ｍｗ［12］のため、真の
Ｍｗよりも約 1.4倍高い見掛けのＭｗにより移動するこ
とに注意すべきである。
ＤＳ−ＰＡＧＥで、バイオラッドのミニPROTEAN IIシス
テムを用いて分析した。クーマシーブリリアントブルー
染色から、幾つかのバンドが明らかになり、そのうちの
最大のバンドは、見掛けの長さが約29ｋＤという予想さ
れた値を有していた。ゼラチン、コラーゲンおよびコラ
ーゲン断片は、見掛けのＭｗにより移動し、少なくとも
部分的には比較的低い平均残基Ｍｗ［12］のため、真の
Ｍｗよりも約 1.4倍高い見掛けのＭｗにより移動するこ
とに注意すべきである。
【００６３】それらを同定するために、アセトン分画さ
れたＣＯＬ３Ａ１発酵上清（分画操作については下記を
参照のこと）をかけたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、バイオ
ラッドミニトランスブロットセルを用いてImmobilon Ｐ
SQメンブレン（ミリポア）にブロットした。定量的な移
動が、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたり
ＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間か
けることにより得られた。クーマシーブリリアントブル
ーによる染色後、４本の最も主なバンドを切り出して、
そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。29ｋＤ
バンドは何のシグナルも示さなかったが、おそらくＮ末
端がブロックされているためであろう。二つの小さい断
片のうち一つは、配列決定するほどには純粋ではなかっ
た。他の二つの小さいバンドは読み取り可能なシグナル
を示し、図３で下線を付けている。バンドはタンパク質
分解の一部の形により引き起こされていることは明らか
である。これは、ゼラチンがランダムコイル立体配座中
の非常にオープンなタンパク質であるためにタンパク質
分解を非常に受け易いとのことにより説明することがで
きる。
れたＣＯＬ３Ａ１発酵上清（分画操作については下記を
参照のこと）をかけたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、バイオ
ラッドミニトランスブロットセルを用いてImmobilon Ｐ
SQメンブレン（ミリポア）にブロットした。定量的な移
動が、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたり
ＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間か
けることにより得られた。クーマシーブリリアントブル
ーによる染色後、４本の最も主なバンドを切り出して、
そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。29ｋＤ
バンドは何のシグナルも示さなかったが、おそらくＮ末
端がブロックされているためであろう。二つの小さい断
片のうち一つは、配列決定するほどには純粋ではなかっ
た。他の二つの小さいバンドは読み取り可能なシグナル
を示し、図３で下線を付けている。バンドはタンパク質
分解の一部の形により引き起こされていることは明らか
である。これは、ゼラチンがランダムコイル立体配座中
の非常にオープンなタンパク質であるためにタンパク質
分解を非常に受け易いとのことにより説明することがで
きる。
【００６４】プロテアーゼ活性 コラーゲンの分解は、ｐＨ5.0 での発酵中にコラーゲン
タイプＩおよびＩＩＩで観察された。この分解をさらに
特性付けるために試験を行った。この分解は、低いｐＨ
で発酵プロセスを実施するとき、顕著に減少した。具体
的には、ｐＨ3.0 で良好な結果を得た。我々はカザミノ
酸の添加の効果も調べた。この添加により、ｐＨ5.0 で
両タイプのコラーゲンが保護された。さらに、この添加
により、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩに対して良好な
保護をもたらした。この添加保護は、ｐＨ3.0 でコラー
ゲンタイプＩＩＩの場合には観察できなかった。細胞外
中性プロテアーゼは、ランダムな立体配座から起こるタ
ンパク質分解にかなり冒されやすいコラーゲンを攻撃す
ると思われる。（発酵操作の記載について下記参照のこ
と。）ｐＨ3.0 でのｐＣＯＬ３ＡＩ発酵のコラーゲン含
有上清を用いて試験を行い、発酵中の分解を最小限とし
た。遠心分離により細胞を除去した後、上清のｐＨを5.
0 に調整した。次に、平行インキュベーションを下記の
添加と共に行った。 （１）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱ（Milli
Q）で洗浄したもの） （２）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱで洗浄し
たもの）およびガラスビーズ：この混合物を攪拌した
（陽性コントロールＩ）。 （３）何も加えないもの（陰性コントロール） （４）トリプシン（５ｍｇ／ｍｌ）（陽性コントロール
ＩＩ）。
タイプＩおよびＩＩＩで観察された。この分解をさらに
特性付けるために試験を行った。この分解は、低いｐＨ
で発酵プロセスを実施するとき、顕著に減少した。具体
的には、ｐＨ3.0 で良好な結果を得た。我々はカザミノ
酸の添加の効果も調べた。この添加により、ｐＨ5.0 で
両タイプのコラーゲンが保護された。さらに、この添加
により、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩに対して良好な
保護をもたらした。この添加保護は、ｐＨ3.0 でコラー
ゲンタイプＩＩＩの場合には観察できなかった。細胞外
中性プロテアーゼは、ランダムな立体配座から起こるタ
ンパク質分解にかなり冒されやすいコラーゲンを攻撃す
ると思われる。（発酵操作の記載について下記参照のこ
と。）ｐＨ3.0 でのｐＣＯＬ３ＡＩ発酵のコラーゲン含
有上清を用いて試験を行い、発酵中の分解を最小限とし
た。遠心分離により細胞を除去した後、上清のｐＨを5.
0 に調整した。次に、平行インキュベーションを下記の
添加と共に行った。 （１）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱ（Milli
Q）で洗浄したもの） （２）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱで洗浄し
たもの）およびガラスビーズ：この混合物を攪拌した
（陽性コントロールＩ）。 （３）何も加えないもの（陰性コントロール） （４）トリプシン（５ｍｇ／ｍｌ）（陽性コントロール
ＩＩ）。
【００６５】すべての試料を96時間、30℃、ｐＨ5.0 で
インキュベートした（これらは発酵中ゼラチンの分解を
引き起こす条件であった）。最後に、インキュベートさ
れた試料をバイオラッドミニPROTEAN IIシステムでLaem
mli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った後、ク
ーマシーブリリアントブルー染色により分析した。
インキュベートした（これらは発酵中ゼラチンの分解を
引き起こす条件であった）。最後に、インキュベートさ
れた試料をバイオラッドミニPROTEAN IIシステムでLaem
mli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った後、ク
ーマシーブリリアントブルー染色により分析した。
【００６６】結果は以下通りであった。 （１）ｐＨ5.0 で、洗浄された無傷の細胞とのインキュ
ベーションは、おそらく細胞表面会合タンパク質分解酵
素活性の結果としてｐＣＯＬ３Ａ１（元々はｐＨ3.0 で
作られたもの）を４〜５の別々のバンドへの分解を引き
起こした。 （２）壊れた細胞を添加することにより、両方のコラー
ゲンタイプが多くのタンパク質分解産物へとその分解が
引き起こされた（陽性コントロールＩ）。 （３）ｐＨ5.0 で細胞の不存在下で、分解は起こらなか
った。 （４）トリプシンの添加はゼラチンの大量分解を引き起
こした（陽性コントロールＩＩ）。
ベーションは、おそらく細胞表面会合タンパク質分解酵
素活性の結果としてｐＣＯＬ３Ａ１（元々はｐＨ3.0 で
作られたもの）を４〜５の別々のバンドへの分解を引き
起こした。 （２）壊れた細胞を添加することにより、両方のコラー
ゲンタイプが多くのタンパク質分解産物へとその分解が
引き起こされた（陽性コントロールＩ）。 （３）ｐＨ5.0 で細胞の不存在下で、分解は起こらなか
った。 （４）トリプシンの添加はゼラチンの大量分解を引き起
こした（陽性コントロールＩＩ）。
【００６７】異なる実験において、我々は、発酵の最後
に細胞の除去後、無細胞発酵ブロス中の組換えゼラチン
が温度範囲０〜30℃で、ｐＨ範囲3.0 〜7.0 で７日間安
定であったことを確かめた。よって、ゼラチンのタンパ
ク質分解の一部が発酵中に起こったが、細胞の除去後、
関連性のあるタンパク質分解活性は保持されず、生成物
を安定化するためのさらなる注意は必要ではない。類似
の安定性が下記のＣＯＬ−１Ａ１生成物について観察さ
れた。組換えゼラチンは（下記のようにアミノ酸組成の
分析により示されているように）ヒドロキシル化されな
いので、非らせん、すなわち二次構造を持たないため
に、それら組換えゼラチンの安定性は驚きであった。二
次構造（すなわちコラーゲンタイプのらせん）およびヒ
ドロキシプロリンがまったくないことを、参考文献［1
3］による円偏光二色性スペクトロスコピー（ＣＤ）に
より、およびペプチド結合の全加水分解後のアミノ酸組
成のＨＰＬＣ分析によりそれぞれ確認した。５℃で、発
現産物は主にランダムコイル立体配座にとどまり、よっ
て基本的にはゲル化しないことが確認された。これは、
実験により確認されたように、らせん安定化させるヒド
ロキシプロリンがないことによる。よって、組換えゼラ
チンは、タンパク質分解を著しく受けやすいのに違いな
い、著しくオープンな分子（およびそれ自体として非平
行ポリペプチド）である。この発現宿主での生成物の予
想されない安定性は（分泌後でも）、この発現系からの
生成物の下流プロセシングおよび単離を非常に容易に
し、タンパク質分解活性の高価で不安定な阻害剤（例え
ばパラ−メチル−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））
を繰返し添加する必要がない。さらに、単純なマイクロ
濾過または栄養ブロスに対する透析により、および細胞
を発酵糟（fermenter)へ再循環させることによって、発
酵中細胞からの生成物を連続的に分離することに対し
て、高い細胞密度発酵中のゼラチン分解を最小限にする
可能性を開発している。前もって三重らせんコラーゲン
または折りたたみポリペプチドのみが作られている。こ
れらはプロテアーゼに対してより耐性がある。三重らせ
んコラーゲンはトリプシン、ペプシン、および他の周知
のプロテアーゼに対してさえも十分に耐性がある。対照
的に、そのままの非ヒドロキシル化で折りたたまれてい
ないゼラチンの保護はしたがって著しく難しいと予想さ
れた。
に細胞の除去後、無細胞発酵ブロス中の組換えゼラチン
が温度範囲０〜30℃で、ｐＨ範囲3.0 〜7.0 で７日間安
定であったことを確かめた。よって、ゼラチンのタンパ
ク質分解の一部が発酵中に起こったが、細胞の除去後、
関連性のあるタンパク質分解活性は保持されず、生成物
を安定化するためのさらなる注意は必要ではない。類似
の安定性が下記のＣＯＬ−１Ａ１生成物について観察さ
れた。組換えゼラチンは（下記のようにアミノ酸組成の
分析により示されているように）ヒドロキシル化されな
いので、非らせん、すなわち二次構造を持たないため
に、それら組換えゼラチンの安定性は驚きであった。二
次構造（すなわちコラーゲンタイプのらせん）およびヒ
ドロキシプロリンがまったくないことを、参考文献［1
3］による円偏光二色性スペクトロスコピー（ＣＤ）に
より、およびペプチド結合の全加水分解後のアミノ酸組
成のＨＰＬＣ分析によりそれぞれ確認した。５℃で、発
現産物は主にランダムコイル立体配座にとどまり、よっ
て基本的にはゲル化しないことが確認された。これは、
実験により確認されたように、らせん安定化させるヒド
ロキシプロリンがないことによる。よって、組換えゼラ
チンは、タンパク質分解を著しく受けやすいのに違いな
い、著しくオープンな分子（およびそれ自体として非平
行ポリペプチド）である。この発現宿主での生成物の予
想されない安定性は（分泌後でも）、この発現系からの
生成物の下流プロセシングおよび単離を非常に容易に
し、タンパク質分解活性の高価で不安定な阻害剤（例え
ばパラ−メチル−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））
を繰返し添加する必要がない。さらに、単純なマイクロ
濾過または栄養ブロスに対する透析により、および細胞
を発酵糟（fermenter)へ再循環させることによって、発
酵中細胞からの生成物を連続的に分離することに対し
て、高い細胞密度発酵中のゼラチン分解を最小限にする
可能性を開発している。前もって三重らせんコラーゲン
または折りたたみポリペプチドのみが作られている。こ
れらはプロテアーゼに対してより耐性がある。三重らせ
んコラーゲンはトリプシン、ペプシン、および他の周知
のプロテアーゼに対してさえも十分に耐性がある。対照
的に、そのままの非ヒドロキシル化で折りたたまれてい
ないゼラチンの保護はしたがって著しく難しいと予想さ
れた。
【００６８】プロテアーゼ欠損株における産生 ｐｅｐ４プロテアーゼＡ欠損株ＳＤＭ１１６８（インビ
トロゲン）がプロテアーゼ感受性ゼラチン配列の発現に
よく適合しているかどうかを調べるために、この株もｐ
ＣＯＬ３Ａ１構築物で形質転換した。方法論は上記のと
おりであった。不幸にも、振とうフラスコおよび発酵糟
発現実験の両方で明らかな陽性の（positive）効果は存
在しなかった。
トロゲン）がプロテアーゼ感受性ゼラチン配列の発現に
よく適合しているかどうかを調べるために、この株もｐ
ＣＯＬ３Ａ１構築物で形質転換した。方法論は上記のと
おりであった。不幸にも、振とうフラスコおよび発酵糟
発現実験の両方で明らかな陽性の（positive）効果は存
在しなかった。
【００６９】グリコシル化の分析 該タンパク質がグリコシル化されているかどうかを証明
するために、過ヨウ素酸による酸化後にシッフ試薬の適
用を伴なうＰＡＳ染色をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行っ
た。ゲルを、12.5％ＴＣＡ中で１時間、１％過ヨウ素酸
／３％酢酸中で１時間、15％酢酸中で１時間（10分毎に
交換）およびシッフ試薬中で１時間（暗室中４℃で）イ
ンキュベートした。次にゲルを 0.5％亜硫酸水素ナトリ
ウムで５分間、２度洗浄し、７％酢酸で脱色した。発現
されたタンパク質バンドはシグナルを示さなかったが、
陽性コントロール（カルボキシぺプチダーゼＹ）からの
シグナルが存在した。予想されたように、陰性コントロ
ール（大腸菌抽出物）を用いてシグナルは得られなかっ
た。発現されたタンパク質はグリコシル化しないと結論
することができる。
するために、過ヨウ素酸による酸化後にシッフ試薬の適
用を伴なうＰＡＳ染色をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行っ
た。ゲルを、12.5％ＴＣＡ中で１時間、１％過ヨウ素酸
／３％酢酸中で１時間、15％酢酸中で１時間（10分毎に
交換）およびシッフ試薬中で１時間（暗室中４℃で）イ
ンキュベートした。次にゲルを 0.5％亜硫酸水素ナトリ
ウムで５分間、２度洗浄し、７％酢酸で脱色した。発現
されたタンパク質バンドはシグナルを示さなかったが、
陽性コントロール（カルボキシぺプチダーゼＹ）からの
シグナルが存在した。予想されたように、陰性コントロ
ール（大腸菌抽出物）を用いてシグナルは得られなかっ
た。発現されたタンパク質はグリコシル化しないと結論
することができる。
【００７０】ノーザンブロット メタノール成長細胞のノーザンブロットを行った。Schm
itt らの方法［10］にしたがってＲＮＡを単離した。ｐ
ＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏ−ＲＩ／ＳｐｈＩで消化
して 0.5ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。該断片を32Ｐ
ランダムプライマーで標識し、ブロットにハイブリダイ
ズし、その後ブロットを0.2 ×ＳＳＣの最終濃度になる
まで65℃で洗浄した。オートラジオグラフィーは予期さ
れた長さ(1.3ｋｂ）のメッセンジャーを明らかにした。
itt らの方法［10］にしたがってＲＮＡを単離した。ｐ
ＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏ−ＲＩ／ＳｐｈＩで消化
して 0.5ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。該断片を32Ｐ
ランダムプライマーで標識し、ブロットにハイブリダイ
ズし、その後ブロットを0.2 ×ＳＳＣの最終濃度になる
まで65℃で洗浄した。オートラジオグラフィーは予期さ
れた長さ(1.3ｋｂ）のメッセンジャーを明らかにした。
【００７１】異種ＣＯＬ３Ａ１遺伝子のマルチコピーを
含むピヒア形質転換体 ゼラチン発現量をさらに高めることができるかどうかを
調べるために、ScorerらのＧ４１８マルチコピー選択法
［11］が利用された。ｐＰＩＣ９ＫベクターをＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＩで消化し、9.0 ｋｂバンドを単離した。
ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターもＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消
化し、得られた1.0 ｋｂ断片を9.0 ｋｂのｐＰＩＣ９Ｋ
バンドに連結し、その後それを用いて大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換した。こうして得られた構築物ｐＣＯＬ３Ａ
１Ｋ（図４）を制限消化により確認した。
含むピヒア形質転換体 ゼラチン発現量をさらに高めることができるかどうかを
調べるために、ScorerらのＧ４１８マルチコピー選択法
［11］が利用された。ｐＰＩＣ９ＫベクターをＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＩで消化し、9.0 ｋｂバンドを単離した。
ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターもＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消
化し、得られた1.0 ｋｂ断片を9.0 ｋｂのｐＰＩＣ９Ｋ
バンドに連結し、その後それを用いて大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換した。こうして得られた構築物ｐＣＯＬ３Ａ
１Ｋ（図４）を制限消化により確認した。
【００７２】ピヒア・パストリスＧＳ１１５を上記のよ
うに（Ｍｕｔ+ 形質転換体を得るためにＳａｌＩで消化
された）ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋベクターで形質転換した。マ
ルチコピー形質転換体を選択するために、ＭＤプレート
上のｈｉｓ+ コロニーを集め（約6000個）、0.25〜4.0
ｍｇ／ｍｌの範囲の一連の10種類の異なるＧ４１８（ギ
ブコＢＲＬ）濃度を含有するプレート上で二次スクリー
ニングに供した。細胞をプレート１枚あたり約105 個の
細胞の密度で塗布した。４日間、30℃でのインキュベー
ション後、各Ｇ４１８濃度の幾つかの耐性コロニーをＧ
４１８の対応する量の新しいプレートに移してそれらの
耐性を確認した。
うに（Ｍｕｔ+ 形質転換体を得るためにＳａｌＩで消化
された）ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋベクターで形質転換した。マ
ルチコピー形質転換体を選択するために、ＭＤプレート
上のｈｉｓ+ コロニーを集め（約6000個）、0.25〜4.0
ｍｇ／ｍｌの範囲の一連の10種類の異なるＧ４１８（ギ
ブコＢＲＬ）濃度を含有するプレート上で二次スクリー
ニングに供した。細胞をプレート１枚あたり約105 個の
細胞の密度で塗布した。４日間、30℃でのインキュベー
ション後、各Ｇ４１８濃度の幾つかの耐性コロニーをＧ
４１８の対応する量の新しいプレートに移してそれらの
耐性を確認した。
【００７３】Ｇ４１８耐性形質転換体におけるｐＣＯＬ
３Ａ１Ｋのコピー数を決定するために、半定量的ドット
ブロットを行った。確認されたＧ４１８耐性形質転換体
のゲノムＤＮＡをLee の方法［８］にしたがって単離
し、ＲＮａｓｅ Ａ処理した。40個（Ｇ４１８の濃度あ
たり４）の形質転換体のそれぞれの染色体ＤＮＡ約 200
ｎｇを、真空ブロット装置（ギブコＢＲＬ変換システ
ム）を用いて、正電荷ナイロンメンブレン（ベーリンガ
ーマンハイム（Boehringer Mannheim)）に移した。１コ
ピーコントロールとして、サザンブロットにより僅かに
１コピーを含むと証明されたｐＣＯＬ３Ａ１形質転換体
をブロットに（デュプロで（in duplo))移し、また非形
質転換コントロールもブロットに（デュプロで）移し
た。
３Ａ１Ｋのコピー数を決定するために、半定量的ドット
ブロットを行った。確認されたＧ４１８耐性形質転換体
のゲノムＤＮＡをLee の方法［８］にしたがって単離
し、ＲＮａｓｅ Ａ処理した。40個（Ｇ４１８の濃度あ
たり４）の形質転換体のそれぞれの染色体ＤＮＡ約 200
ｎｇを、真空ブロット装置（ギブコＢＲＬ変換システ
ム）を用いて、正電荷ナイロンメンブレン（ベーリンガ
ーマンハイム（Boehringer Mannheim)）に移した。１コ
ピーコントロールとして、サザンブロットにより僅かに
１コピーを含むと証明されたｐＣＯＬ３Ａ１形質転換体
をブロットに（デュプロで（in duplo))移し、また非形
質転換コントロールもブロットに（デュプロで）移し
た。
【００７４】ｐＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏＲＩ／Ｓ
ｐｈＩで消化し0.5 ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。こ
の断片は32Ｐプライマー標識し、ドットブロットフィル
ターにハイブリダイズさせた。65℃で0.5 ×ＳＳＣの最
終濃度まで洗浄した後、オートラジオグラフィーを行っ
た。（効率をチェックした）ストリップ後、メンブレン
を確認済ピヒア・パストリスＵＲＡ−３断片由来のプロ
ーブにハイブリダイズさせ、異種ＵＲＡ３プライマーに
よるＰＣＲにより選択した。このコントロールは、かけ
られたＤＮＡの量に関してＣＯＬ３Ａ１シグナルの標準
化に役立つ。メンブレンを洗浄し、ＣＯＬ−３Ａｌプロ
ーブについて記載したようにオートラジオグラフィーに
供した。両オートラジオグラフにおけるシグナルをゲル
スキャナー（ＰＤＩ、ファルマシア）を用いて濃度によ
る定量を行った。予想されたように、０コピーコントロ
ールについてはＣＯＬ３Ａ１シグナルが存在しなかった
一方、ＵＲＡ３シグナルは存在した。そのコピー数は、
各ＵＲＡ３シグナルの比により標準化するように、各形
質転換体についてのＣＯＬ３Ａ１シグナルと１コピーコ
ントロールに対して得られた平均ＣＯＬ３Ａ１シグナル
との比を計算することで見積もることができる（即ち、
メンブレンにブロットされたＤＮＡ量の違いを計算に入
れる）。約１〜15コピーを含む形質転換体がこうして得
られた。
ｐｈＩで消化し0.5 ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。こ
の断片は32Ｐプライマー標識し、ドットブロットフィル
ターにハイブリダイズさせた。65℃で0.5 ×ＳＳＣの最
終濃度まで洗浄した後、オートラジオグラフィーを行っ
た。（効率をチェックした）ストリップ後、メンブレン
を確認済ピヒア・パストリスＵＲＡ−３断片由来のプロ
ーブにハイブリダイズさせ、異種ＵＲＡ３プライマーに
よるＰＣＲにより選択した。このコントロールは、かけ
られたＤＮＡの量に関してＣＯＬ３Ａ１シグナルの標準
化に役立つ。メンブレンを洗浄し、ＣＯＬ−３Ａｌプロ
ーブについて記載したようにオートラジオグラフィーに
供した。両オートラジオグラフにおけるシグナルをゲル
スキャナー（ＰＤＩ、ファルマシア）を用いて濃度によ
る定量を行った。予想されたように、０コピーコントロ
ールについてはＣＯＬ３Ａ１シグナルが存在しなかった
一方、ＵＲＡ３シグナルは存在した。そのコピー数は、
各ＵＲＡ３シグナルの比により標準化するように、各形
質転換体についてのＣＯＬ３Ａ１シグナルと１コピーコ
ントロールに対して得られた平均ＣＯＬ３Ａ１シグナル
との比を計算することで見積もることができる（即ち、
メンブレンにブロットされたＤＮＡ量の違いを計算に入
れる）。約１〜15コピーを含む形質転換体がこうして得
られた。
【００７５】マルチコピー形質転換体におけるＣＯＬ３
Ａ１断片の発現 １〜15コピーを含有する一連の形質転換体を上記のよう
に小規模発現に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高いコピ
ー数で高い収量を示したので、さらに試験を100 ｍｌの
規模で２、５、10および15コピーの形質転換体を用いて
行った。これらを、ＢＭＧ25ｍｌ（100 ｍＭリン酸カリ
ウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよ
び１％グリセロール）を含む100 ｍｌフラスコ中で一晩
生育させた。1500〜3000ｇで５分間の遠心後、細胞をＢ
ＭＭ100 ｍｌ（グリセロールの代りに0.5 ％メタノール
とした以外はＢＭＧと同じ）に再懸濁した。１リットル
のバッフル付きフラスコ中、30℃、 250ｒｐｍ、４日
間、メタノールを毎日 0.5％まで加えながら細胞を生育
させた。試料１ｍｌを毎日採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析した。高いコピー数は、高い量のゼラチン産物をも
たらした。選択された５〜15コピーの形質転換体を発酵
糟で１Ｌの規模で発現試験のために用いた。最大のＣＯ
Ｌ３Ａ１生産が15コピー形質転換体を用いて得られた
（乾燥バイオマス177 ｇ／Ｌで約184 時間発酵後に細胞
外培地中約14.8ｇゼラチン／Ｌ、即ち全体で約7.7 ｇ／
Ｌ、即ち42ｍｇ／（Ｌ．時間）；乾燥バイオマス110 ｇ
／Ｌで約120 時間発酵後、細胞外培地中約７ｇゼラチン
／Ｌ、すなわち全体で約3.7 ｇ／Ｌ、または31ｍｇ／
（Ｌ．時間））。
Ａ１断片の発現 １〜15コピーを含有する一連の形質転換体を上記のよう
に小規模発現に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高いコピ
ー数で高い収量を示したので、さらに試験を100 ｍｌの
規模で２、５、10および15コピーの形質転換体を用いて
行った。これらを、ＢＭＧ25ｍｌ（100 ｍＭリン酸カリ
ウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよ
び１％グリセロール）を含む100 ｍｌフラスコ中で一晩
生育させた。1500〜3000ｇで５分間の遠心後、細胞をＢ
ＭＭ100 ｍｌ（グリセロールの代りに0.5 ％メタノール
とした以外はＢＭＧと同じ）に再懸濁した。１リットル
のバッフル付きフラスコ中、30℃、 250ｒｐｍ、４日
間、メタノールを毎日 0.5％まで加えながら細胞を生育
させた。試料１ｍｌを毎日採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析した。高いコピー数は、高い量のゼラチン産物をも
たらした。選択された５〜15コピーの形質転換体を発酵
糟で１Ｌの規模で発現試験のために用いた。最大のＣＯ
Ｌ３Ａ１生産が15コピー形質転換体を用いて得られた
（乾燥バイオマス177 ｇ／Ｌで約184 時間発酵後に細胞
外培地中約14.8ｇゼラチン／Ｌ、即ち全体で約7.7 ｇ／
Ｌ、即ち42ｍｇ／（Ｌ．時間）；乾燥バイオマス110 ｇ
／Ｌで約120 時間発酵後、細胞外培地中約７ｇゼラチン
／Ｌ、すなわち全体で約3.7 ｇ／Ｌ、または31ｍｇ／
（Ｌ．時間））。
【００７６】マウスＣＯＬ１Ａ１断片（ＣＯＬ１Ａ１−
１）マウスのクローニング プライマーを公知の配列に基づいて設計した（図５）。
全体積20μｌ中、マウス17日目の胎児QUICK クローン
（QUICK-Clone)（登録商標）（繊維芽細胞）ｃＤＮＡ
（クローンテック（Clontech))に対して、ｃＤＮＡ 0.4
ｎｇ、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＦＷプライマー（図５）、
0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＲＶ１プライマー（図５）、１×
Advantage Klen Taqポリメラーゼミックス（クローンテ
ック）、0.2ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ（ファルマシア）およ
び１×Klen TaqＰＣＲ反応緩衝液（クローンテック）を
用いて、ＰＣＲを行った。94℃で４分間の最初の変成後
に、94℃で１分間、68℃で１分間および72℃で２分間か
らなるサイクルを35回行った。最終的な伸長（extensio
n)は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動
は、配列から予想された大きさである１ｋｂバンドを示
している。ＤＮＡをアガロースゲルから単離し、次にＮ
ｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された
断片をアガロースゲルから単離して、下記の方法にした
がってピヒア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９にク
ローニングした（図６）。最初に、ＮｃｏＩおよびＸｈ
ｏＩ部位を有するアダプターをｐＰＩＣ９のマルチクロ
ーニング部位に挿入して、ｐＰＩＣ９* を得た。該アダ
プターを、図５と図６に示されたように合成オリゴヌク
レオチドＮ−Ｘ−ＦＷおよびＮ−Ｘ−ＲＶにアニーリン
グすることにより調製した。オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ
−ＲＶの5'末端から生じた一本鎖の突出部は、ＥｃｏＲ
Ｉ消化ベクターでのアニーリング後にＥｃｏＲＩ部位を
形成するように設計した。Ｎ−Ｘ−ＦＷ（ＸｈｏＩ* ）
からの5'突出部はベクター上のＸｈｏＩの作用により作
られた突出部に相補的であったが、連結後、ＸｈｏＩ部
位を作らなかった。標的ベクターであるｐＰＩＣ９がマ
ルチクローニング部位の外側にＮｃｏＩ部位を有してい
るため、ｐＵＣ１８をこの断片のクローニング用中間ベ
クターとして用いた。ｐＰＩＣ９* の変更マルチクロー
ニング部位のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの間の部分を、
ｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニング部位に移し
て、ｐＵＣ１８* が得られた。ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ消化
断片ＣＯＬ−１Ａ１−１をＮｃｏＩとＸｈｏＩ部位との
間のｐＵＣ１８* ベクターに連結した。このｐＵＣ１８
−ＣＯＬ１Ａ１−１構築物から、ＣＯＬ１Ａ１−１断片
を、ｐＰＩＣ９からのマルチクローニング部位の部分と
ともに、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰＩＣ９
に連結して、構築物ｐＣＯＬ１Ａ−１が得られた（図
７）。よって、ｐＰＩＣ９の部分的ＮｃｏＩ消化は必要
ではなかった。ｐＰＩＣ９の正しい挿入を制限分析によ
り最初にチェックし、次にＤＮＡ配列決定によりチェッ
クした。
１）マウスのクローニング プライマーを公知の配列に基づいて設計した（図５）。
全体積20μｌ中、マウス17日目の胎児QUICK クローン
（QUICK-Clone)（登録商標）（繊維芽細胞）ｃＤＮＡ
（クローンテック（Clontech))に対して、ｃＤＮＡ 0.4
ｎｇ、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＦＷプライマー（図５）、
0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＲＶ１プライマー（図５）、１×
Advantage Klen Taqポリメラーゼミックス（クローンテ
ック）、0.2ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ（ファルマシア）およ
び１×Klen TaqＰＣＲ反応緩衝液（クローンテック）を
用いて、ＰＣＲを行った。94℃で４分間の最初の変成後
に、94℃で１分間、68℃で１分間および72℃で２分間か
らなるサイクルを35回行った。最終的な伸長（extensio
n)は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動
は、配列から予想された大きさである１ｋｂバンドを示
している。ＤＮＡをアガロースゲルから単離し、次にＮ
ｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された
断片をアガロースゲルから単離して、下記の方法にした
がってピヒア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９にク
ローニングした（図６）。最初に、ＮｃｏＩおよびＸｈ
ｏＩ部位を有するアダプターをｐＰＩＣ９のマルチクロ
ーニング部位に挿入して、ｐＰＩＣ９* を得た。該アダ
プターを、図５と図６に示されたように合成オリゴヌク
レオチドＮ−Ｘ−ＦＷおよびＮ−Ｘ−ＲＶにアニーリン
グすることにより調製した。オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ
−ＲＶの5'末端から生じた一本鎖の突出部は、ＥｃｏＲ
Ｉ消化ベクターでのアニーリング後にＥｃｏＲＩ部位を
形成するように設計した。Ｎ−Ｘ−ＦＷ（ＸｈｏＩ* ）
からの5'突出部はベクター上のＸｈｏＩの作用により作
られた突出部に相補的であったが、連結後、ＸｈｏＩ部
位を作らなかった。標的ベクターであるｐＰＩＣ９がマ
ルチクローニング部位の外側にＮｃｏＩ部位を有してい
るため、ｐＵＣ１８をこの断片のクローニング用中間ベ
クターとして用いた。ｐＰＩＣ９* の変更マルチクロー
ニング部位のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの間の部分を、
ｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニング部位に移し
て、ｐＵＣ１８* が得られた。ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ消化
断片ＣＯＬ−１Ａ１−１をＮｃｏＩとＸｈｏＩ部位との
間のｐＵＣ１８* ベクターに連結した。このｐＵＣ１８
−ＣＯＬ１Ａ１−１構築物から、ＣＯＬ１Ａ１−１断片
を、ｐＰＩＣ９からのマルチクローニング部位の部分と
ともに、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰＩＣ９
に連結して、構築物ｐＣＯＬ１Ａ−１が得られた（図
７）。よって、ｐＰＩＣ９の部分的ＮｃｏＩ消化は必要
ではなかった。ｐＰＩＣ９の正しい挿入を制限分析によ
り最初にチェックし、次にＤＮＡ配列決定によりチェッ
クした。
【００７７】ｐＣＯＬ１Ａ１−１によるピヒアの形質転
換およびＣＯＬ１Ａ１−１断片の発現 ピヒア・パストリスＧＳ１１５を、ｐＣＯＬ３Ａ１ベク
ターについて記載されたようにｐＣＯＬ１Ａ１−１で形
質転換した。ＳａｌＩ消化ＤＮＡを、具体的にはＭｕｔ
+ 形質転換体を作るために用いた。いくつかの形質転換
体を振とうフラスコ中の小規模発現のために用い、その
うちの一形質転換体を発酵糟中で１〜100 Ｌの規模での
発現のために選択した。典型的な収率は（細胞外）培地
１リットルあたり、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ
（全体でゼラチン約３ｇ／Ｌ）であり、ゼラチン４〜５
ｇ（下記のようにアセトン分画後に測定されたもの）の
範囲にある。目的のゼラチン（図８）は、理論Ｍｗ27.4
ｋＤを有している。コラーゲン性タンパク質およびゼラ
チンは、見掛けのＭｗであり、真のＭｗよりも1.4 倍速
く移動することが知られている［10］。一致するよう
に、約38ｋＤの見掛けのＭｗで移動するＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅバンドが観察された（球状タンパク質Ｍｗマーカーを
用いて得られた内挿値）。さらに、見掛けのＭｗ24、18
および15ｋＤ（内挿値）を有する３種類の短い産物が観
察された。これらは、細胞間の細胞表面会合もしくは細
胞外区画中、または翻訳レベルでの問題からの初期タン
パク質分解活性の結果であろう。分解産物は、誘導のご
く初期段階に存在し、それ以上の分解は起こらなかっ
た。ｐＨ5.0 および30℃での96時間の洗浄されたそのま
まの細胞の存在下でのインキュベーションでさえ、ｐＨ
3.0 での発酵後の場合についてｐＣＯＬ１Ａ１−１のそ
れ以上の分解を引き起こさなかった。（大量の分解は、
陽性コントロールとしてのトリプシンの存在下で起こっ
た）。ｍＲＮＡレベルでの問題が24、18および15ｋＤ産
物の存在の原因ではないことを確認するために、プロー
ブとして、ｐＣＯＬ１Ａ１−１からの32Ｐランダムプラ
イマー標識化 1.0ｋｂＮｃｏＩ／ＸｈｏＩＣＯＬ−１Ａ
１−１断片を用いて、ＣＯＬ３Ａ１について記載された
ように、ノーザンブロットを行った。予想された 1.6ｋ
ｂメッセンジャーが見出された。
換およびＣＯＬ１Ａ１−１断片の発現 ピヒア・パストリスＧＳ１１５を、ｐＣＯＬ３Ａ１ベク
ターについて記載されたようにｐＣＯＬ１Ａ１−１で形
質転換した。ＳａｌＩ消化ＤＮＡを、具体的にはＭｕｔ
+ 形質転換体を作るために用いた。いくつかの形質転換
体を振とうフラスコ中の小規模発現のために用い、その
うちの一形質転換体を発酵糟中で１〜100 Ｌの規模での
発現のために選択した。典型的な収率は（細胞外）培地
１リットルあたり、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ
（全体でゼラチン約３ｇ／Ｌ）であり、ゼラチン４〜５
ｇ（下記のようにアセトン分画後に測定されたもの）の
範囲にある。目的のゼラチン（図８）は、理論Ｍｗ27.4
ｋＤを有している。コラーゲン性タンパク質およびゼラ
チンは、見掛けのＭｗであり、真のＭｗよりも1.4 倍速
く移動することが知られている［10］。一致するよう
に、約38ｋＤの見掛けのＭｗで移動するＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅバンドが観察された（球状タンパク質Ｍｗマーカーを
用いて得られた内挿値）。さらに、見掛けのＭｗ24、18
および15ｋＤ（内挿値）を有する３種類の短い産物が観
察された。これらは、細胞間の細胞表面会合もしくは細
胞外区画中、または翻訳レベルでの問題からの初期タン
パク質分解活性の結果であろう。分解産物は、誘導のご
く初期段階に存在し、それ以上の分解は起こらなかっ
た。ｐＨ5.0 および30℃での96時間の洗浄されたそのま
まの細胞の存在下でのインキュベーションでさえ、ｐＨ
3.0 での発酵後の場合についてｐＣＯＬ１Ａ１−１のそ
れ以上の分解を引き起こさなかった。（大量の分解は、
陽性コントロールとしてのトリプシンの存在下で起こっ
た）。ｍＲＮＡレベルでの問題が24、18および15ｋＤ産
物の存在の原因ではないことを確認するために、プロー
ブとして、ｐＣＯＬ１Ａ１−１からの32Ｐランダムプラ
イマー標識化 1.0ｋｂＮｃｏＩ／ＸｈｏＩＣＯＬ−１Ａ
１−１断片を用いて、ＣＯＬ３Ａ１について記載された
ように、ノーザンブロットを行った。予想された 1.6ｋ
ｂメッセンジャーが見出された。
【００７８】観察されたフラグメントの同定を確立する
ために、アセトン分画化ＣＯＬ１Ａ１−１発酵上清を充
填したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをバイオラッドミニトラン
スブロットセルを用いるImmobilon ＰSQメンブラン（ミ
リポア）にブロットした。（アセトン分画操作の記載に
ついては下記を参照のこと）。定量的移動は、ＣＡＰＳ
緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2
ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間印加することに
より行った。クーマシーブリリアントブルーによる染色
後、４本の主なバンドを切り出し、そのＮ末端配列をエ
ドマン分解により決定した。得られた配列決定シグナル
は、充填された材料の量と比較して著しく低かった（平
均５％程度）。したがって、該断片はほとんどがＮ末端
でブロックされていると思われる。これは、ＣＯＬ１Ａ
１−１のタンパク質分解が細胞内で起こるとの考えを支
持する。それにもかかわらず、供給された大量のＣＯＬ
１Ａ１はＮ末端配列の容易な決定を可能とした。得られ
たＮ末端配列は、トランスフェクトされたＣＯＬ１Ａ１
−１遺伝子によりコードされたタンパク質配列（図８）
に下線を付す。38ｋＤと18ｋＤの両方の見掛けのＭｗを
有する断片は、該タンパク質のＮ末端について予想され
た配列を与えたが、‘ＥＡ’により伸長した。この伸長
（即ちＥＡＥＡ）は、サッカロミセス・セレビシアエ由
来のα接合因子（αＭＦ）プレプロシグナルを利用する
発現ベクターから発現される幾つかのタンパク質上に存
在することが知られている。この効果はＳＴＥ１３切断
活性の立体的妨げによるものと思われる。しかし、タン
パク質のほとんどがおそらくＮ末端でブロックされてい
るために、この伸長したバージョンは配列決定可能な小
さいフラクションのみを表すのであろう。Ｎ末端および
内部配列に基づいて、見掛けのＭｗ38、24、18および15
ｋＤを有する断片が、図８に示されているように、標的
産物の残基１〜310 、126 〜310 、１〜125 および42〜
125 からそれぞれなる断片であると割り当てられた。残
基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜310（理論Ｍｗ2
4ｋＤ、見掛けのＭｗ34ｋＤ）に対応する断片は観察さ
れなかった。これは、残基41と42との間よりも残基125
と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるもの
であろう。
ために、アセトン分画化ＣＯＬ１Ａ１−１発酵上清を充
填したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをバイオラッドミニトラン
スブロットセルを用いるImmobilon ＰSQメンブラン（ミ
リポア）にブロットした。（アセトン分画操作の記載に
ついては下記を参照のこと）。定量的移動は、ＣＡＰＳ
緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2
ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間印加することに
より行った。クーマシーブリリアントブルーによる染色
後、４本の主なバンドを切り出し、そのＮ末端配列をエ
ドマン分解により決定した。得られた配列決定シグナル
は、充填された材料の量と比較して著しく低かった（平
均５％程度）。したがって、該断片はほとんどがＮ末端
でブロックされていると思われる。これは、ＣＯＬ１Ａ
１−１のタンパク質分解が細胞内で起こるとの考えを支
持する。それにもかかわらず、供給された大量のＣＯＬ
１Ａ１はＮ末端配列の容易な決定を可能とした。得られ
たＮ末端配列は、トランスフェクトされたＣＯＬ１Ａ１
−１遺伝子によりコードされたタンパク質配列（図８）
に下線を付す。38ｋＤと18ｋＤの両方の見掛けのＭｗを
有する断片は、該タンパク質のＮ末端について予想され
た配列を与えたが、‘ＥＡ’により伸長した。この伸長
（即ちＥＡＥＡ）は、サッカロミセス・セレビシアエ由
来のα接合因子（αＭＦ）プレプロシグナルを利用する
発現ベクターから発現される幾つかのタンパク質上に存
在することが知られている。この効果はＳＴＥ１３切断
活性の立体的妨げによるものと思われる。しかし、タン
パク質のほとんどがおそらくＮ末端でブロックされてい
るために、この伸長したバージョンは配列決定可能な小
さいフラクションのみを表すのであろう。Ｎ末端および
内部配列に基づいて、見掛けのＭｗ38、24、18および15
ｋＤを有する断片が、図８に示されているように、標的
産物の残基１〜310 、126 〜310 、１〜125 および42〜
125 からそれぞれなる断片であると割り当てられた。残
基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜310（理論Ｍｗ2
4ｋＤ、見掛けのＭｗ34ｋＤ）に対応する断片は観察さ
れなかった。これは、残基41と42との間よりも残基125
と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるもの
であろう。
【００７９】マウスＣＯＬ１Ａ１−２のクローニングと
発現 マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ
（クローンテック）に対してマウスＣＯＬ１Ａ１−Ｉと
同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ２プ
ライマーを用いてＰＣＲを行った。94℃で４分間での変
成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分
間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃
で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列か
ら予想された大きさである1.8 ｋｂバンドを示してい
る。ＣＯＬ１Ａ１−２のｐＰＩＣ９発現ベクターへのク
ローニングが、ＣＯＬＩＡ−１と同じように、さらに行
われてｐＣＯＬ１Ａ１−２が得られた（図９）。
発現 マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ
（クローンテック）に対してマウスＣＯＬ１Ａ１−Ｉと
同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ２プ
ライマーを用いてＰＣＲを行った。94℃で４分間での変
成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分
間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃
で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列か
ら予想された大きさである1.8 ｋｂバンドを示してい
る。ＣＯＬ１Ａ１−２のｐＰＩＣ９発現ベクターへのク
ローニングが、ＣＯＬＩＡ−１と同じように、さらに行
われてｐＣＯＬ１Ａ１−２が得られた（図９）。
【００８０】ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについて記載した
ように、ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ
１−２ベクターで形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を
特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。振と
うフラスコ中での小規模での発現のために幾つかの形質
転換体を用いて、それらの一つを、１〜100 Ｌ規模での
発酵糟中発現のために選択した。図10は予想されたＣＯ
Ｌ１Ａ１−２アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、バ
イオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン３ｇ／Ｌ）
において、（細胞外）培地中、４〜５ｇ／Ｌゼラチンの
範囲である。標的ゼラチン（図10）は、理論Ｍｗ53ｋＤ
を有する。この値と一致して（およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
でのゼラチンの公知の異常な移動［10］により）、見掛
けのＭｗ約74ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用い
て得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド
が観察された。さらに、見掛けのＭｗ56、18および15ｋ
Ｄ（内挿値）を有する３つの短い産物が観察された。タ
ンパク質分解切断がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ
１−２の発現産物に対応する部位で生じる場合（図８、
10）、ＣＯＬ１Ａ１−２産物の残基１〜595 、126 〜59
5 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が生じるこ
とが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが74、58、
17および11ｋＤに対応する、理論Ｍｗそれぞれ53、42、
12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは、
観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−
２の切断が主に残基125 と126 の間の結合、および（さ
らに）41と42の結合に制限されていたことを示してい
る。また、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜59
5 （理論Ｍｗ50ｋＤ、見掛けのＭｗ70ｋＤ）に対応する
断片は観察されなかった。ＣＯＬ１Ａ１−１で示された
ように、これは残基41と42との間よりも残基125 と126
との（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
ように、ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ
１−２ベクターで形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を
特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。振と
うフラスコ中での小規模での発現のために幾つかの形質
転換体を用いて、それらの一つを、１〜100 Ｌ規模での
発酵糟中発現のために選択した。図10は予想されたＣＯ
Ｌ１Ａ１−２アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、バ
イオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン３ｇ／Ｌ）
において、（細胞外）培地中、４〜５ｇ／Ｌゼラチンの
範囲である。標的ゼラチン（図10）は、理論Ｍｗ53ｋＤ
を有する。この値と一致して（およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
でのゼラチンの公知の異常な移動［10］により）、見掛
けのＭｗ約74ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用い
て得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド
が観察された。さらに、見掛けのＭｗ56、18および15ｋ
Ｄ（内挿値）を有する３つの短い産物が観察された。タ
ンパク質分解切断がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ
１−２の発現産物に対応する部位で生じる場合（図８、
10）、ＣＯＬ１Ａ１−２産物の残基１〜595 、126 〜59
5 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が生じるこ
とが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが74、58、
17および11ｋＤに対応する、理論Ｍｗそれぞれ53、42、
12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは、
観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−
２の切断が主に残基125 と126 の間の結合、および（さ
らに）41と42の結合に制限されていたことを示してい
る。また、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜59
5 （理論Ｍｗ50ｋＤ、見掛けのＭｗ70ｋＤ）に対応する
断片は観察されなかった。ＣＯＬ１Ａ１−１で示された
ように、これは残基41と42との間よりも残基125 と126
との（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００８１】マウスＣＯＬ１Ａ１−３のクローニングと
発現 マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ
（クローンテック）に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１
と同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ３
プライマーを用いてＰＣＲを実施した。94℃で４分間の
変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３
分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72
℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列
から予想された大きさである 2.8ｋｂバンドを示してい
る。
発現 マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ
（クローンテック）に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１
と同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ３
プライマーを用いてＰＣＲを実施した。94℃で４分間の
変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３
分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72
℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列
から予想された大きさである 2.8ｋｂバンドを示してい
る。
【００８２】ＰＵＣ１８* プラスミドをＮｃｏＩで消化
し、脱リン酸化した。Ｃ１Ａ１−ＦＷ／Ｃ１Ａ１−ＲＶ
３ ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩで消化し、得られた 2.5ｋ
ｂ断片をゲル精製し、これを、該ＮｃｏＩ消化され且つ
脱リン酸化したベクターに連結した。大腸菌ＸＬ１Ｂｌ
ｕｅの形質転換後、得られたクローンの挿入物の正確な
向きをＰｖｕＩＩ消化により確認した。さらに、ＣＯＬ
１Ａ１−３のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニング
が、ＣＯＬＩＡ−１について記載した方法と同じように
さらに行われて、ｐＣＯＬ１Ａ１−３が得られた（図1
1）。
し、脱リン酸化した。Ｃ１Ａ１−ＦＷ／Ｃ１Ａ１−ＲＶ
３ ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩで消化し、得られた 2.5ｋ
ｂ断片をゲル精製し、これを、該ＮｃｏＩ消化され且つ
脱リン酸化したベクターに連結した。大腸菌ＸＬ１Ｂｌ
ｕｅの形質転換後、得られたクローンの挿入物の正確な
向きをＰｖｕＩＩ消化により確認した。さらに、ＣＯＬ
１Ａ１−３のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニング
が、ＣＯＬＩＡ−１について記載した方法と同じように
さらに行われて、ｐＣＯＬ１Ａ１−３が得られた（図1
1）。
【００８３】ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ
１Ａ１−３ベクターで、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについ
記載したように形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特
異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。幾つか
の形質転換体を振とうフラスコ中での小規模発現のため
に用いて、それらの一つを発酵糟中、１〜100 Ｌ規模で
の発現のために選択した。図12は予想されたＣＯＬ１Ａ
１−３アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、（細胞
外）培地中、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌにおい
て、４〜５ｇゼラチン／Ｌの範囲（アセトン分画後に測
定）である（全体で３ｇゼラチン／Ｌ）。標的ゼラチン
（図12）は、理論Ｍｗ72ｋＤである。この値に一致し
て、見掛けのＭｗ約100 ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマー
カーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗが85、
18および15ｋＤ（内挿値）の３つの短い産物が観察され
た。タンパク質分解がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１
Ａ１−３の発現産物の均一部位で起こる場合（図８，1
2）、ＣＯＬ１Ａ１−３産物の残基１〜812 、126 〜812
、１〜125 、および42〜125 からなる断片が存在する
ことが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが100 、
84、17および11ｋＤのそれぞれに対応する理論上のＭｗ
72、60、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、
これは観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１
Ａ１−３の切断が主に残基125 と126 の間の結合および
（さらに少ない程度で）41と42の結合に限定されている
ことを示している。再び、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋ
Ｄ）および42〜812 （理論Ｍｗ68ｋＤ、見掛けのＭｗ96
ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、Ｃ
ＯＬ１Ａ１−１に示されたように、残基41と42との間よ
りも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切
断によるものであろう。
１Ａ１−３ベクターで、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについ
記載したように形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特
異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。幾つか
の形質転換体を振とうフラスコ中での小規模発現のため
に用いて、それらの一つを発酵糟中、１〜100 Ｌ規模で
の発現のために選択した。図12は予想されたＣＯＬ１Ａ
１−３アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、（細胞
外）培地中、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌにおい
て、４〜５ｇゼラチン／Ｌの範囲（アセトン分画後に測
定）である（全体で３ｇゼラチン／Ｌ）。標的ゼラチン
（図12）は、理論Ｍｗ72ｋＤである。この値に一致し
て、見掛けのＭｗ約100 ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマー
カーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗが85、
18および15ｋＤ（内挿値）の３つの短い産物が観察され
た。タンパク質分解がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１
Ａ１−３の発現産物の均一部位で起こる場合（図８，1
2）、ＣＯＬ１Ａ１−３産物の残基１〜812 、126 〜812
、１〜125 、および42〜125 からなる断片が存在する
ことが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが100 、
84、17および11ｋＤのそれぞれに対応する理論上のＭｗ
72、60、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、
これは観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１
Ａ１−３の切断が主に残基125 と126 の間の結合および
（さらに少ない程度で）41と42の結合に限定されている
ことを示している。再び、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋ
Ｄ）および42〜812 （理論Ｍｗ68ｋＤ、見掛けのＭｗ96
ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、Ｃ
ＯＬ１Ａ１−１に示されたように、残基41と42との間よ
りも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切
断によるものであろう。
【００８４】表１は、分子量マーカータンパク質（ＬＭ
Ｗキャリブレーションキット；ファルマシア）との比較
により得られた見掛けＣＯＬ１Ａ１断片サイズを、配列
から計算したサイズとともにまとめた。
Ｗキャリブレーションキット；ファルマシア）との比較
により得られた見掛けＣＯＬ１Ａ１断片サイズを、配列
から計算したサイズとともにまとめた。
【００８５】
【表１】
【００８６】表１から、「ＭＧＰＲ」モデルは、実際に
見出された断片によく適合していることがわかる。
見出された断片によく適合していることがわかる。
【００８７】残基１〜41（４ｋＤ；１Ａ１−１，２，
３）および残基42〜310 （理論Ｍｗ：24ｋＤ、見掛けの
Ｍｗ：34ｋＤ；１Ａ１−１）、残基42〜595 （理論Ｍ
ｗ：50ｋＤ、見掛けのＭｗ：70ｋＤ；１Ａ１−２）、ま
たは残基42〜595 （理論Ｍｗ：68ｋＤ、見掛けのＭｗ：
96ｋＤ；１Ａ１−３）の断片も予想できるであろう。こ
れらの断片がゲル上に見られないということは、第２の
「ＭＧＰＲ」部位での切断速度が、第１の部位よりもさ
らに高いとみなすことにより説明がつくだろう。このこ
とは、タンパク質分子が切断される場合、それが常に第
２の部位で最初に起こることを意味する。切断速度にお
けるこの違いは、第１の部位がプロテアーゼを立体的に
妨げる可能性のあるプロリン残基の前に存在するとのこ
とで説明がつくだろう。
３）および残基42〜310 （理論Ｍｗ：24ｋＤ、見掛けの
Ｍｗ：34ｋＤ；１Ａ１−１）、残基42〜595 （理論Ｍ
ｗ：50ｋＤ、見掛けのＭｗ：70ｋＤ；１Ａ１−２）、ま
たは残基42〜595 （理論Ｍｗ：68ｋＤ、見掛けのＭｗ：
96ｋＤ；１Ａ１−３）の断片も予想できるであろう。こ
れらの断片がゲル上に見られないということは、第２の
「ＭＧＰＲ」部位での切断速度が、第１の部位よりもさ
らに高いとみなすことにより説明がつくだろう。このこ
とは、タンパク質分子が切断される場合、それが常に第
２の部位で最初に起こることを意味する。切断速度にお
けるこの違いは、第１の部位がプロテアーゼを立体的に
妨げる可能性のあるプロリン残基の前に存在するとのこ
とで説明がつくだろう。
【００８８】マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−
２およびＣＯＬ１Ａ１−３‘ＲＧＰＭ’変異体 我々は、タンパク質分解酵素の認識部位として働く同じ
アミノ酸配列がすべてのＣＯＬ１Ａ１産物（ＣＯＬ１Ａ
１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬＩＡ１−３）の分解
の原因である可能性を考慮した。驚くことに、ＣＯＬ１
Ａ１−１断片15ｋＤおよび24ｋＤから得られた両内部Ｎ
末端配列は、同一の配列「ＭＧＰＲ」よりも前に存在す
る。さらに、この配列は、残基83〜41および残基 122〜
125に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１
−２、またはＣＯＬ１Ａ１−３遺伝子中に２回のみ存在
する。（ＣＯＬ１Ａ１−１と比較して、ＣＯＬ１Ａ１−
２及びＣＯＬ１Ａ１−３は、付加的なＭＧＰＲ部位を含
まない。）また、ラットからのＣＯＬ３Ａ１断片はその
ような部位を含まなかった。これは観察された切断パタ
ーンにうまく対応する。したがって、我々は、「ＭＧＰ
Ｒ」が特定のプロテアーゼにより認識される部分であ
り、ＣＯＬ１Ａ１タンパク質の切断をもたらすと考えて
いる。このＭＧＰＲプロテアーゼ認識部位は以前には記
載されていない。この部分のさらに一般化された表示
は、おそらくＭＸＸＲ、ＭＸＸ［ＲＫ］、または［ＭＬ
ＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨ］であろう。前者２つの部分は実際
に全マウスＣＯＬ１Ａ１遺伝子中にわずかに２回存在す
るだけであり、ＣＯＬ３Ａ１断片には存在いない。一
方、三番目の部分は広いために非切断部位（ＣＯＬ１Ａ
１中の残基85〜88のＭＫＧＨおよび残基169 〜172 のＶ
ＧＡＫ、並びにＣＯＬ３Ａ１中の残基198 〜201 のＩＫ
ＧＨ）を含む。よって、ＭＸＸＲまたはＭＸＸ［ＲＫ］
は［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨよりもさらに一般化された
部分である。図13はＣＯＬ−１Ａ１−２配列中の「ＭＧ
ＰＲ」部分を示している。このタンパク質切断部位が、
それが比較的オープンで、折りたたまれていない構造
（我々のゼラチンのように）で存在するが、さらにコン
パクトに折りたたまれた構造（球状タンパク質のよう
に）では容易に存在しない場合、関与する酵素により単
に認識されることが予想できる。よって、それは、ゼラ
チンおよび折りたたまれていないコラーゲン等のある種
のタンパク質及びポリペプチドにのみ重要であろう。
２およびＣＯＬ１Ａ１−３‘ＲＧＰＭ’変異体 我々は、タンパク質分解酵素の認識部位として働く同じ
アミノ酸配列がすべてのＣＯＬ１Ａ１産物（ＣＯＬ１Ａ
１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬＩＡ１−３）の分解
の原因である可能性を考慮した。驚くことに、ＣＯＬ１
Ａ１−１断片15ｋＤおよび24ｋＤから得られた両内部Ｎ
末端配列は、同一の配列「ＭＧＰＲ」よりも前に存在す
る。さらに、この配列は、残基83〜41および残基 122〜
125に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１
−２、またはＣＯＬ１Ａ１−３遺伝子中に２回のみ存在
する。（ＣＯＬ１Ａ１−１と比較して、ＣＯＬ１Ａ１−
２及びＣＯＬ１Ａ１−３は、付加的なＭＧＰＲ部位を含
まない。）また、ラットからのＣＯＬ３Ａ１断片はその
ような部位を含まなかった。これは観察された切断パタ
ーンにうまく対応する。したがって、我々は、「ＭＧＰ
Ｒ」が特定のプロテアーゼにより認識される部分であ
り、ＣＯＬ１Ａ１タンパク質の切断をもたらすと考えて
いる。このＭＧＰＲプロテアーゼ認識部位は以前には記
載されていない。この部分のさらに一般化された表示
は、おそらくＭＸＸＲ、ＭＸＸ［ＲＫ］、または［ＭＬ
ＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨ］であろう。前者２つの部分は実際
に全マウスＣＯＬ１Ａ１遺伝子中にわずかに２回存在す
るだけであり、ＣＯＬ３Ａ１断片には存在いない。一
方、三番目の部分は広いために非切断部位（ＣＯＬ１Ａ
１中の残基85〜88のＭＫＧＨおよび残基169 〜172 のＶ
ＧＡＫ、並びにＣＯＬ３Ａ１中の残基198 〜201 のＩＫ
ＧＨ）を含む。よって、ＭＸＸＲまたはＭＸＸ［ＲＫ］
は［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨよりもさらに一般化された
部分である。図13はＣＯＬ−１Ａ１−２配列中の「ＭＧ
ＰＲ」部分を示している。このタンパク質切断部位が、
それが比較的オープンで、折りたたまれていない構造
（我々のゼラチンのように）で存在するが、さらにコン
パクトに折りたたまれた構造（球状タンパク質のよう
に）では容易に存在しない場合、関与する酵素により単
に認識されることが予想できる。よって、それは、ゼラ
チンおよび折りたたまれていないコラーゲン等のある種
のタンパク質及びポリペプチドにのみ重要であろう。
【００８９】３つの他の主要バンドが存在することな
く、完全長のＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およ
びＣＯＬ１Ａ１−３を作ることができるために、「ＭＧ
ＰＲ」部分が部位特異的変異誘発により除去しなければ
ならない。天然のＣＯＬ１Ａ１ゼラチンの元のアミノ酸
組成を保持するために、「ＭＧＰＲ」部分を「ＲＧＰ
Ｍ」に変換することにより除去した。下記の相補的プラ
イマーの二対が合成された。
く、完全長のＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およ
びＣＯＬ１Ａ１−３を作ることができるために、「ＭＧ
ＰＲ」部分が部位特異的変異誘発により除去しなければ
ならない。天然のＣＯＬ１Ａ１ゼラチンの元のアミノ酸
組成を保持するために、「ＭＧＰＲ」部分を「ＲＧＰ
Ｍ」に変換することにより除去した。下記の相補的プラ
イマーの二対が合成された。
【００９０】 ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷ： Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ 5'-GAG-CCT-GGC-GGT-TCA-GGT-CCA-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CCC-CCT-GG-3' ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ： 5'-CC-AGG-GGG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-TGG-ACC-TGA-ACC-GCC-AGG-CTC-3' ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷ： Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ 5'-GGA-GCT-CCT-GGC-CAG-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CTG-CCC-GGT-GAG-AG-3' ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＲＶ： 5'-CT-CTC-ACC-GGG-CAG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-CTG-GCC-AGG-AGC-TCC-3' 注意：変異部位に下線が引かれている；Ｐｒｏ残基の元
のＣがＡに変換されてＮｃｏＩ部位の生成を避ける。
のＣがＡに変換されてＮｃｏＩ部位の生成を避ける。
【００９１】３プライマーの組合せが用いられた： １．5'ＡＯＸ１プライマーとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ ２．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２
ＲＶ ３．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷと3'ＡＯＸ１
ＲＶ ３．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷと3'ＡＯＸ１
【００９２】反応物は、1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ
（ユーロゲンテック（Eurogentec))、各プライマー50ｐ
ｍｏｌ、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）、１×
Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）およびｐＣＯＬ−１
Ａ１−１テンプレートＤＮＡ15ｎｇを全反応体積50μｌ
中に含んだ。使用したＰＣＲ装置は、GeneAmp 9700（パ
ーキンエルマー）であった。94℃で５分間の最初のイン
キュベーション後、94℃で30秒間、60℃で30秒間および
72℃で45秒間からなるサイクルを18回行った。最終伸長
は72℃で10分間行った。ＰＣＲ反応のアガロース電気泳
動は予想された大きさ（それぞれ0.5 、0.3 および0.7
ｋｂ）の産物であることがわかった。バンドをゲルから
切り出して精製した。次に、単離した断片をオーバーラ
ップ伸長ＰＣＲに供した。各断片約0.1 ｐｍｏｌを共に
混合した。5'ＡＯＸ１ 50ｐｍｏｌおよび3'ＡＯＸ１プ
ライマー、ならびにＰｗｏポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓお
よび上記の緩衝液を加えた。72℃での伸長を45秒間の代
りに90秒間実施した以外、サイクル条件は上記と同じで
ある。アガロースゲル電気泳動により、予期された1.5
ｋｂ産物であることがわかった。ＰＣＲ反応の残りはＱ
ＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精
製した。精製されたＤＮＡを次にＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ
で消化し、その後、得られた1.0 ｋｂ断片をゲルから精
製した。ＡｐａＩ部位のｄｃｍメチル化を除去するため
に、大腸菌株ＪＭ１１０をｐＣＯＬ１Ａ１−１、ｐＣＯ
Ｌ１Ａ１−２およびｐＣＯＬ１Ａ１−３で形質転換し
た。ＤＮＡ単離後、プラスミドをＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ
で消化した。それぞれ7.9 、8.8 および9.5 ｋｂの得ら
れたベクター断片をアガロースゲルから精製し、Ｂａｍ
ＨＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ生成物に連結した。大腸菌Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅをこれらの連結反応物で形質転換し、Ｐ
ＣＲで証明された挿入物を含有するクローンのプラスミ
ドＤＮＡを単離し、自動化配列決定法により証明した。
こうして作られた変異体プラスミドｐＣＯＬ１Ａ１−１
* 、ｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３*
をＳａｌＩで消化してピヒア・パストリス株ＧＳ１１５
を形質転換するために用いた。小規模および発酵糟規模
の発現を、ＣＯＬＩＡ１−１で記載したように行った。
（ユーロゲンテック（Eurogentec))、各プライマー50ｐ
ｍｏｌ、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）、１×
Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）およびｐＣＯＬ−１
Ａ１−１テンプレートＤＮＡ15ｎｇを全反応体積50μｌ
中に含んだ。使用したＰＣＲ装置は、GeneAmp 9700（パ
ーキンエルマー）であった。94℃で５分間の最初のイン
キュベーション後、94℃で30秒間、60℃で30秒間および
72℃で45秒間からなるサイクルを18回行った。最終伸長
は72℃で10分間行った。ＰＣＲ反応のアガロース電気泳
動は予想された大きさ（それぞれ0.5 、0.3 および0.7
ｋｂ）の産物であることがわかった。バンドをゲルから
切り出して精製した。次に、単離した断片をオーバーラ
ップ伸長ＰＣＲに供した。各断片約0.1 ｐｍｏｌを共に
混合した。5'ＡＯＸ１ 50ｐｍｏｌおよび3'ＡＯＸ１プ
ライマー、ならびにＰｗｏポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓお
よび上記の緩衝液を加えた。72℃での伸長を45秒間の代
りに90秒間実施した以外、サイクル条件は上記と同じで
ある。アガロースゲル電気泳動により、予期された1.5
ｋｂ産物であることがわかった。ＰＣＲ反応の残りはＱ
ＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精
製した。精製されたＤＮＡを次にＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ
で消化し、その後、得られた1.0 ｋｂ断片をゲルから精
製した。ＡｐａＩ部位のｄｃｍメチル化を除去するため
に、大腸菌株ＪＭ１１０をｐＣＯＬ１Ａ１−１、ｐＣＯ
Ｌ１Ａ１−２およびｐＣＯＬ１Ａ１−３で形質転換し
た。ＤＮＡ単離後、プラスミドをＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ
で消化した。それぞれ7.9 、8.8 および9.5 ｋｂの得ら
れたベクター断片をアガロースゲルから精製し、Ｂａｍ
ＨＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ生成物に連結した。大腸菌Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅをこれらの連結反応物で形質転換し、Ｐ
ＣＲで証明された挿入物を含有するクローンのプラスミ
ドＤＮＡを単離し、自動化配列決定法により証明した。
こうして作られた変異体プラスミドｐＣＯＬ１Ａ１−１
* 、ｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３*
をＳａｌＩで消化してピヒア・パストリス株ＧＳ１１５
を形質転換するために用いた。小規模および発酵糟規模
の発現を、ＣＯＬＩＡ１−１で記載したように行った。
【００９３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予期された完全
長サイズの僅かに一つの主要バンドがｐＣＯＬ１Ａ１−
１* ならびにｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ
１−３* について形成された。
長サイズの僅かに一つの主要バンドがｐＣＯＬ１Ａ１−
１* ならびにｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ
１−３* について形成された。
【００９４】合成遺伝子の構築と発現 極性ゼラチン（Ｐ単量体）をコードする合成遺伝子は、
オーラーラップ伸長ＰＣＲにより構築した。理論上の分
子量及び等電点は、それぞれ9.1 ｋＤ及び4.9であっ
た。該遺伝子は、ピヒア・パストリスの高度に発現され
た遺伝子のコドン利用を有するように設計された（Sree
krishna, K. and Kropp, K. E. (1996) Pichia pastori
s, Wolf, K. (Ed), Nonconventional yeasts in biotec
hnology. Ahandbook, Springer-Verlag, pp. 6/203-6/2
53 ）。二つの別々のＰＣＲ反応を下記のオリゴヌクレ
オチドを用いて実施した。
オーラーラップ伸長ＰＣＲにより構築した。理論上の分
子量及び等電点は、それぞれ9.1 ｋＤ及び4.9であっ
た。該遺伝子は、ピヒア・パストリスの高度に発現され
た遺伝子のコドン利用を有するように設計された（Sree
krishna, K. and Kropp, K. E. (1996) Pichia pastori
s, Wolf, K. (Ed), Nonconventional yeasts in biotec
hnology. Ahandbook, Springer-Verlag, pp. 6/203-6/2
53 ）。二つの別々のＰＣＲ反応を下記のオリゴヌクレ
オチドを用いて実施した。
【００９５】ＯＶＬ−ＰＡ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ
−ＰＡ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ 50ｐ
ｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。 ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ
１ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよび
ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
−ＰＡ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ 50ｐ
ｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。 ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ
１ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよび
ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
【００９６】オリゴヌクレオチド配列は次の通りであ
る。 ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ：5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC-3' ＯＶＡＬ−ＰＡ−ＦＷ： 5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGATCTCCTGGTAAC CAAGGACAGCCCGGTAACAAGGGTTCTCCAGGTAATCCA-3' ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ： 5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAACCTGGCTCACCAGGTTGTCCGTTCTGACCAGGTTGACCAGGTTGA CCTTCGTTTCCTGGTTGACCTGGATTACCTGGAGAACCCTT-3' ＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ：5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAA-3' ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ：5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCA-3' ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ： 5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCAGGGTAACCCTGGAAAGAATGGTCAACCTGGATCCCCAGGTTCACA AGGCTCTCCAGGTAACCAAGGTTCCCCTGGTCAGCCAGGTAACCCT-3' ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ： 5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGCCACCGGCTGGACCCTGGTTTCCTGGTTTACCTTGTTCACCTGG TTGACCAGGGTTACCTGGCTGACCAGGGGAACCTTGGTT-3' ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ：5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGC-3'
る。 ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ：5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC-3' ＯＶＡＬ−ＰＡ−ＦＷ： 5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGATCTCCTGGTAAC CAAGGACAGCCCGGTAACAAGGGTTCTCCAGGTAATCCA-3' ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ： 5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAACCTGGCTCACCAGGTTGTCCGTTCTGACCAGGTTGACCAGGTTGA CCTTCGTTTCCTGGTTGACCTGGATTACCTGGAGAACCCTT-3' ＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ：5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAA-3' ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ：5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCA-3' ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ： 5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCAGGGTAACCCTGGAAAGAATGGTCAACCTGGATCCCCAGGTTCACA AGGCTCTCCAGGTAACCAAGGTTCCCCTGGTCAGCCAGGTAACCCT-3' ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ： 5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGCCACCGGCTGGACCCTGGTTTCCTGGTTTACCTTGTTCACCTGG TTGACCAGGGTTACCTGGCTGACCAGGGGAACCTTGGTT-3' ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ：5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGC-3'
【００９７】ＰＣＲ反応物50μｌは、0.2 ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ’ｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲ
ンテック）および1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロ
ゲンテック）を含んでいた。反応１は、94℃で15秒間お
よび72℃で15秒間からなる18サイクルを伴なった。反応
２はタッチダウンＰＣＲを伴なうことで、各サイクルは
94℃で15秒間、アニーリング温度で15秒間および72℃で
15秒間からなった。アニーリング温度は最初の５サイク
ルで72℃から68℃まで低下させ、その後、67℃でのアニ
ーリング温度でさらに20サイクルを行った。
Ｐ’ｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲ
ンテック）および1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロ
ゲンテック）を含んでいた。反応１は、94℃で15秒間お
よび72℃で15秒間からなる18サイクルを伴なった。反応
２はタッチダウンＰＣＲを伴なうことで、各サイクルは
94℃で15秒間、アニーリング温度で15秒間および72℃で
15秒間からなった。アニーリング温度は最初の５サイク
ルで72℃から68℃まで低下させ、その後、67℃でのアニ
ーリング温度でさらに20サイクルを行った。
【００９８】ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し
た。各断片0.3 ｐｍｏｌと外側プライマーＨＬＰ−ＰＡ
−ＦＷ50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶをオーバー
ラップ伸長ＰＣＲに供した。94℃で15秒間、67℃で15秒
間および72℃で15秒間からなる25サイクルを行った。得
られた0.3 ｋｂ ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで
消化し、クローニングベクターｐＭＴＬ２３にクローニ
ングした。遺伝子の配列を自動化ＤＮＡ配列決定により
確認した。
た。各断片0.3 ｐｍｏｌと外側プライマーＨＬＰ−ＰＡ
−ＦＷ50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶをオーバー
ラップ伸長ＰＣＲに供した。94℃で15秒間、67℃で15秒
間および72℃で15秒間からなる25サイクルを行った。得
られた0.3 ｋｂ ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで
消化し、クローニングベクターｐＭＴＬ２３にクローニ
ングした。遺伝子の配列を自動化ＤＮＡ配列決定により
確認した。
【００９９】Ｐテトラマー（Ｐ４；理論分子量36.8ｋ
Ｄ）を作るために、ベクターをＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９
１Ｉで消化することにより該断片を放出させた。別の反
応において、ベクターをＶａｎ９１Ｉで消化し、脱リン
酸化した。次に、ＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉ断片をこ
のＶａｎ９１Ｉ消化ベクターに挿入した。これによりＰ
ダイマーを有するベクターを得た。このダイマーはＤｒ
ａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉによる消化により放出させ、ダ
イマーを有するベクターのＶａｎ９１Ｉ部位中に再挿入
して、Ｐテトラマー（Ｐ４）を得た。次に、Ｐ断片とＰ
４断片をベクターｐＩＣ９のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位
にクローニングした。成熟（プロセシング後の）Ｐモノ
マーおよびテトラマーのコードされたアミノ酸配列は下
記の通りである。
Ｄ）を作るために、ベクターをＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９
１Ｉで消化することにより該断片を放出させた。別の反
応において、ベクターをＶａｎ９１Ｉで消化し、脱リン
酸化した。次に、ＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉ断片をこ
のＶａｎ９１Ｉ消化ベクターに挿入した。これによりＰ
ダイマーを有するベクターを得た。このダイマーはＤｒ
ａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉによる消化により放出させ、ダ
イマーを有するベクターのＶａｎ９１Ｉ部位中に再挿入
して、Ｐテトラマー（Ｐ４）を得た。次に、Ｐ断片とＰ
４断片をベクターｐＩＣ９のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位
にクローニングした。成熟（プロセシング後の）Ｐモノ
マーおよびテトラマーのコードされたアミノ酸配列は下
記の通りである。
【０１００】 モノマー（Ｐ）： １ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP 61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGG テトラマー（Ｐ４）： １ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP 61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGEPGNPGS PGNQGQPGNK 121 GSPGNPGQPG NEGQPGQPGQ NGQPGEPGSN GPQGSQGNPG KNGQPGSPGS QGSPGNQGSP 181 GQPGNPGQPG EQGKPGNQGP AGEPGNPGSP GNQGQPGNKG SPGNPGQPGN EGQPGQPGQN 241 GQPGEPGSNG PQGSQGNPGK NGQPGSPGSQ GSPGNQGSPG QPGNPGQPGE QGKPGNQGPA 301 GEPGNPGSPG NQGQPGNKGS PGNPGQPGNE GQPGQPGQNG QPGEPGSNGP QGSQGNPGKN 361 GQPGSPGSQG SPGNQGSPGQ PGNPGQPGEQ GKPGNQGPAG G
【０１０１】ＰおよびＰ４ゼラチンの起こりうるＣ末端
分解を防止するために、ＰとＰ４と同一の配列を有する
が、Ｇｌｙ残基の代りにＣ末端Ｐｒｏを有する構築物を
作った（それぞれをＰＣとＰ４Ｃとした）。
分解を防止するために、ＰとＰ４と同一の配列を有する
が、Ｇｌｙ残基の代りにＣ末端Ｐｒｏを有する構築物を
作った（それぞれをＰＣとＰ４Ｃとした）。
【０１０２】ベクターをＳａｌＩによる消化により直鎖
とし、これを用いてピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を
形質転換した。発酵を、ＣＯＬ１Ａ１について記載した
ように（すなわちｐＨ３およびカザミノ酸の存在下での
成長）行った。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
し、予想されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質
バンドを明らかにした。収率は１グラム／Ｌ発酵培地と
算出された。生産物を上天然のゼラチンについて上記し
たようにアセトン分画（すなわち40％アセトンでの内因
性タンパク質の除去と80％アセトンでのゼラチンの析
出）により精製することができた。
とし、これを用いてピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を
形質転換した。発酵を、ＣＯＬ１Ａ１について記載した
ように（すなわちｐＨ３およびカザミノ酸の存在下での
成長）行った。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
し、予想されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質
バンドを明らかにした。収率は１グラム／Ｌ発酵培地と
算出された。生産物を上天然のゼラチンについて上記し
たようにアセトン分画（すなわち40％アセトンでの内因
性タンパク質の除去と80％アセトンでのゼラチンの析
出）により精製することができた。
【０１０３】発酵糟中のゼラチンの発現／産生 供給バッチ発酵をインビトロゲン社のピヒア発酵法指針
にしたがって行った。細胞を、最初の実験段階で１リッ
トルの発酵糟（アップリコン）中で生育させて、タンパ
ク質産生を最適化した。その後、コラーゲンのパイロッ
ト規模生産のために、細胞を20リットルまたは140 リッ
トルの発酵糟（バイオベンチ２０、バイオパイロット１
４０、アップリコン（Aplikon)）で生育させた。作動体
積はそれぞれ１リットル、15リットルおよび100 リット
ルであった。AD1020コントローラ（アップリコン）を用
いて発酵パラメータをモニターし、調節した。プログラ
ムBioXpert（アップリコン）をデータ保存のために用い
た。溶解酸素レベルを、酸素電極（１リットル発酵につ
いてはインゴールド（Ingold）、大規模発酵についてメ
トラー・トレド（Mettler Toledo))を用いて発酵糟中で
モニターした。攪拌（500 〜1000ｒｐｍ）と通気（１〜
２ｖｖｍ、すなわち１〜２ＬＬ-1／分）を手動で調整し
て溶解酸素濃度を20％以上に保った。ｐＨをｐＨ電極
（ブロードリージェームス（Broadly James)社）で測定
し、水酸化アンモニウム（25％）の添加によりｐＨ3.0
またはｐＨ5.0 に自動的に維持し、該水酸化アンモニウ
ムは微生物成長のための窒素源としても機能した。消泡
電極を用いて過剰の発泡を防止した。必要であれば、消
泡Strutol J673（チル＆ザイラッハー（Schill & Seila
cher）、ハンブルグ、ドイツ）を用いた。微生物の成長
を細胞乾燥重量の測定によりモニターした。検量線を作
成することで細胞湿重量を細胞乾燥重量に換算すること
ができた。細胞湿重量は、試料２ｍｌを５分間15,000ｒ
ｐｍで遠心分離後、上清を除去することにより測定し
た。細胞乾燥重量は、細胞 200μｌを予備乾燥フィルタ
ー（0.45μｍメンブレン、シュライヒナー＆シェル、ダ
ッセル、ドイツ）に加え、脱イオン水25ｍｌで洗浄し、
乾燥（例えば電子レンジで1000Ｗ、15分間）した後に測
定した。細胞乾燥重量は、細胞湿重量の約１／３であっ
た。前培養はＭＧＹの初期発酵体積の合計10％を含有す
るフラスコ中でＭＧＹプレート上のコロニーから開始し
た。培地の体積は全フラスコ体積の20％以下であった。
細胞を30℃、200 ｒｐｍでロータリーシェーカー（ギャ
レンカンプ）で24〜60時間生育させた。
にしたがって行った。細胞を、最初の実験段階で１リッ
トルの発酵糟（アップリコン）中で生育させて、タンパ
ク質産生を最適化した。その後、コラーゲンのパイロッ
ト規模生産のために、細胞を20リットルまたは140 リッ
トルの発酵糟（バイオベンチ２０、バイオパイロット１
４０、アップリコン（Aplikon)）で生育させた。作動体
積はそれぞれ１リットル、15リットルおよび100 リット
ルであった。AD1020コントローラ（アップリコン）を用
いて発酵パラメータをモニターし、調節した。プログラ
ムBioXpert（アップリコン）をデータ保存のために用い
た。溶解酸素レベルを、酸素電極（１リットル発酵につ
いてはインゴールド（Ingold）、大規模発酵についてメ
トラー・トレド（Mettler Toledo))を用いて発酵糟中で
モニターした。攪拌（500 〜1000ｒｐｍ）と通気（１〜
２ｖｖｍ、すなわち１〜２ＬＬ-1／分）を手動で調整し
て溶解酸素濃度を20％以上に保った。ｐＨをｐＨ電極
（ブロードリージェームス（Broadly James)社）で測定
し、水酸化アンモニウム（25％）の添加によりｐＨ3.0
またはｐＨ5.0 に自動的に維持し、該水酸化アンモニウ
ムは微生物成長のための窒素源としても機能した。消泡
電極を用いて過剰の発泡を防止した。必要であれば、消
泡Strutol J673（チル＆ザイラッハー（Schill & Seila
cher）、ハンブルグ、ドイツ）を用いた。微生物の成長
を細胞乾燥重量の測定によりモニターした。検量線を作
成することで細胞湿重量を細胞乾燥重量に換算すること
ができた。細胞湿重量は、試料２ｍｌを５分間15,000ｒ
ｐｍで遠心分離後、上清を除去することにより測定し
た。細胞乾燥重量は、細胞 200μｌを予備乾燥フィルタ
ー（0.45μｍメンブレン、シュライヒナー＆シェル、ダ
ッセル、ドイツ）に加え、脱イオン水25ｍｌで洗浄し、
乾燥（例えば電子レンジで1000Ｗ、15分間）した後に測
定した。細胞乾燥重量は、細胞湿重量の約１／３であっ
た。前培養はＭＧＹの初期発酵体積の合計10％を含有す
るフラスコ中でＭＧＹプレート上のコロニーから開始し
た。培地の体積は全フラスコ体積の20％以下であった。
細胞を30℃、200 ｒｐｍでロータリーシェーカー（ギャ
レンカンプ）で24〜60時間生育させた。
【０１０４】発酵培地 発酵糟中の発酵基礎塩培地は、１リットルあたり、リン
酸26.7ｍｌ（85％）、硫酸カルシウム0.93ｇ、硫酸カリ
ウム18.2ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ 14.9ｇ、水
酸化カリウム4.13ｇおよびグリセロール40.0ｇを含んで
いた。ＰＴＭ1微量塩4.3 ｍｌの量を発酵基礎塩培地１
リットルあたり加えた。ＰＴＭ1 微量塩は、１リットル
あたり、塩化第二銅・２Ｈ2 Ｏ 4.5ｇ、ヨウ化カリウム
0.09ｇ、塩化マンガン・４Ｈ2 Ｏ 3.5ｇ、モリブデン酸
ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ 0.2ｇ、ホウ酸0.02ｇ、硫酸コバ
ルト・７Ｈ2 Ｏ1.08ｇ、硫酸亜鉛・７Ｈ2 Ｏ42.3ｇ、硫
酸鉄・７Ｈ2 Ｏ65.0ｇ、ビオチン 0.2ｇおよび硫酸5.0
ｍｌを含んでいた。微量塩はフィルター濾過（ポアサイ
ズ0.22μｍ、コスター、米国）で除菌した。カザミノ酸
（カゼイン加水分解物、メルク）を別に滅菌し、マウス
のコラーゲンタイプＩが発現されたときに（ＣＯＬ１Ａ
１−１、ＣＯＬ１Ａ１−１* 、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯ
Ｌ１Ａ１−２* 、ＣＯＬ１Ａ１−３、ＣＯＬ１Ａ１−３
* ）、５ｇ／ｌの量で発酵培地に加えた。発酵中、50時
間後に、５ｇ／ｌ滅菌カザミノ酸をさらに発酵培地に加
えた。
酸26.7ｍｌ（85％）、硫酸カルシウム0.93ｇ、硫酸カリ
ウム18.2ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ 14.9ｇ、水
酸化カリウム4.13ｇおよびグリセロール40.0ｇを含んで
いた。ＰＴＭ1微量塩4.3 ｍｌの量を発酵基礎塩培地１
リットルあたり加えた。ＰＴＭ1 微量塩は、１リットル
あたり、塩化第二銅・２Ｈ2 Ｏ 4.5ｇ、ヨウ化カリウム
0.09ｇ、塩化マンガン・４Ｈ2 Ｏ 3.5ｇ、モリブデン酸
ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ 0.2ｇ、ホウ酸0.02ｇ、硫酸コバ
ルト・７Ｈ2 Ｏ1.08ｇ、硫酸亜鉛・７Ｈ2 Ｏ42.3ｇ、硫
酸鉄・７Ｈ2 Ｏ65.0ｇ、ビオチン 0.2ｇおよび硫酸5.0
ｍｌを含んでいた。微量塩はフィルター濾過（ポアサイ
ズ0.22μｍ、コスター、米国）で除菌した。カザミノ酸
（カゼイン加水分解物、メルク）を別に滅菌し、マウス
のコラーゲンタイプＩが発現されたときに（ＣＯＬ１Ａ
１−１、ＣＯＬ１Ａ１−１* 、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯ
Ｌ１Ａ１−２* 、ＣＯＬ１Ａ１−３、ＣＯＬ１Ａ１−３
* ）、５ｇ／ｌの量で発酵培地に加えた。発酵中、50時
間後に、５ｇ／ｌ滅菌カザミノ酸をさらに発酵培地に加
えた。
【０１０５】ｍｕｔ+ 培養物の発酵 発酵糟を発酵基本塩培地とともに滅菌した。20リットル
と120 リットルの発酵糟をそれぞれ５〜7.5 リットルと
50リットルの容量の初期培地とともにその場で滅菌し
た。１リットル発酵糟を培地500 ｍｌとともにオートク
レーブ中で滅菌した。滅菌後、温度を30℃に設定し、攪
拌と通気をそれぞれ500 ｒｐｍと１ｖｖｍ（すなわ、１
ＬＬ-1／分）に設定した。ｐＨを25％水酸化アンモニウ
ムで設定点（通常ｐＨ5.0 ）に調整した。微量塩を培地
に無菌的に加えた。発酵糟にＭＧＹの前培養培地の初期
発酵体積の10％を接種した。バッチ培養物を、グリセロ
ールが完全に消費されるまで（18〜24時間）生育させ
た。これは、溶解酸素濃度の100 ％までの増加により示
された。細胞乾燥重量はこの段階で25〜35ｇ／ｌであっ
た。その後、グリセロール供給バッチ相を、グリセロー
ル１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む50％
（ｖ／ｖ）グリセロールの供給を始めることにより開始
した。グリセロール供給は、18ｍｌ／時間／１リットル
初期発酵体積に設定した。グリセロール供給は４時間、
または長期ラグ相の場合は一晩実施した。グリセロール
バッチ相中、発酵培地のｐＨを3.0 まで低下させた。タ
ンパク質誘導相は、メタノール１リットルあたりＰＴＭ
1 微量塩を12ｍｌ含む100 ％メタノール供給を始めるこ
とにより開始した。供給速度は３ｍｌ／時間／リットル
の初期発酵糟体積に設定した。最初の数時間、メタノー
ルは発酵糟中に蓄積した。２〜４時間後、溶解酸素量は
メタノールへの順応のために減少した。迅速溶解酸素の
上昇の場合、メタノール供給を、６ｍｌ／時間／リット
ルの初期発酵糟体積まで増加させた。炭素源が制限され
ている場合、炭素源を封じることにより培養の代謝速度
が減少して、溶解酸素濃度が高まる。さらに２時間後、
メタノール速度は９ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟
体積まで増加させた。この供給速度は残りの培養中にわ
たって維持した。培養は、70〜130 時間のメタノール供
給バッチ相後に止めた。培養中、試料２ｍｌを取り、遠
心し（５分間、15,000ｒｐｍ）、上清を−20℃で保存し
た。
と120 リットルの発酵糟をそれぞれ５〜7.5 リットルと
50リットルの容量の初期培地とともにその場で滅菌し
た。１リットル発酵糟を培地500 ｍｌとともにオートク
レーブ中で滅菌した。滅菌後、温度を30℃に設定し、攪
拌と通気をそれぞれ500 ｒｐｍと１ｖｖｍ（すなわ、１
ＬＬ-1／分）に設定した。ｐＨを25％水酸化アンモニウ
ムで設定点（通常ｐＨ5.0 ）に調整した。微量塩を培地
に無菌的に加えた。発酵糟にＭＧＹの前培養培地の初期
発酵体積の10％を接種した。バッチ培養物を、グリセロ
ールが完全に消費されるまで（18〜24時間）生育させ
た。これは、溶解酸素濃度の100 ％までの増加により示
された。細胞乾燥重量はこの段階で25〜35ｇ／ｌであっ
た。その後、グリセロール供給バッチ相を、グリセロー
ル１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む50％
（ｖ／ｖ）グリセロールの供給を始めることにより開始
した。グリセロール供給は、18ｍｌ／時間／１リットル
初期発酵体積に設定した。グリセロール供給は４時間、
または長期ラグ相の場合は一晩実施した。グリセロール
バッチ相中、発酵培地のｐＨを3.0 まで低下させた。タ
ンパク質誘導相は、メタノール１リットルあたりＰＴＭ
1 微量塩を12ｍｌ含む100 ％メタノール供給を始めるこ
とにより開始した。供給速度は３ｍｌ／時間／リットル
の初期発酵糟体積に設定した。最初の数時間、メタノー
ルは発酵糟中に蓄積した。２〜４時間後、溶解酸素量は
メタノールへの順応のために減少した。迅速溶解酸素の
上昇の場合、メタノール供給を、６ｍｌ／時間／リット
ルの初期発酵糟体積まで増加させた。炭素源が制限され
ている場合、炭素源を封じることにより培養の代謝速度
が減少して、溶解酸素濃度が高まる。さらに２時間後、
メタノール速度は９ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟
体積まで増加させた。この供給速度は残りの培養中にわ
たって維持した。培養は、70〜130 時間のメタノール供
給バッチ相後に止めた。培養中、試料２ｍｌを取り、遠
心し（５分間、15,000ｒｐｍ）、上清を−20℃で保存し
た。
【０１０６】ゼラチンおよび全タンパク質の濃度を、試
料（0.22μｍ）の濾過およびその後のアセトン分画（40
体積％アセトン後に60〜80体積％アセトン）後に測定し
た。メルクのゼラチンをリファレンスとして用いて、Ｂ
ＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce))を慣用的に
用いた。アミノ酸組成のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析に
したがって、非コラーゲンタンパク質は40％アセトンで
析出した一方、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ１Ａ１断片は
60〜80％で析出した。60％アセトンで、好ましくは高分
子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、
上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80
％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によりチェックされたように）析出物中に回収された。
小ペプチドと他の低分子量不純物が80％アセトンでは溶
液中にとどまった。
料（0.22μｍ）の濾過およびその後のアセトン分画（40
体積％アセトン後に60〜80体積％アセトン）後に測定し
た。メルクのゼラチンをリファレンスとして用いて、Ｂ
ＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce))を慣用的に
用いた。アミノ酸組成のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析に
したがって、非コラーゲンタンパク質は40％アセトンで
析出した一方、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ１Ａ１断片は
60〜80％で析出した。60％アセトンで、好ましくは高分
子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、
上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80
％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によりチェックされたように）析出物中に回収された。
小ペプチドと他の低分子量不純物が80％アセトンでは溶
液中にとどまった。
【０１０７】１リットルの培養の場合、培養の最後に、
細胞を遠心分離すること（10,000ｒｐｍ、30分、４℃）
により除去した。20リットルの培養の場合は、マイクロ
フィルター濾過により細胞を除去した。細胞ブロスを、
最初に孔径が0.50μｍのポリエーテルスルホンメンブレ
ンを含むマイクロ濾過モジュール（X-Flow社のRX 300濾
過モジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 05 M2）に
適用した。その後、上清を孔径が0.2 μｍのポリエーテ
ルスルホンメンブレンを含む類似のタイプのマイクロ濾
過モジュール（同様にX-Flow社のタイプMF 02 M1）に適
用した。120 リットルの発酵の場合、細胞を、孔径が0.
2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを有するパイ
ロットプラント規模のマイクロ濾過ユニット（R-10メン
ブレンモジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 02 M
1）により除去した。これらの濾過ユニットは、単に例
として示しただけである。細胞を除去するためにどのよ
うな適当なマイクロ濾過システムも利用できることを理
解されたい。任意に、細胞およびデブリ（debris）の塊
を遠心分離により除去し、上清および細胞を洗浄するた
めに用いられた培地のみをマイクロ濾過ユニットに適用
した。または、発酵ブロスから産物を回収し、産生した
ゼラチンを特異的に結合させる樹脂を用いる、適切な膨
張層クロマトグラフィーシステムに該発酵ブロスを適用
することにより産物を細胞から分離することができる。
我々は、ファルマシアのＳＰセファロースＸＬストリー
ムラインを膨張層モード中のカチオン交換体（ｐＨ３〜
４）としてうまく利用することができた。
細胞を遠心分離すること（10,000ｒｐｍ、30分、４℃）
により除去した。20リットルの培養の場合は、マイクロ
フィルター濾過により細胞を除去した。細胞ブロスを、
最初に孔径が0.50μｍのポリエーテルスルホンメンブレ
ンを含むマイクロ濾過モジュール（X-Flow社のRX 300濾
過モジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 05 M2）に
適用した。その後、上清を孔径が0.2 μｍのポリエーテ
ルスルホンメンブレンを含む類似のタイプのマイクロ濾
過モジュール（同様にX-Flow社のタイプMF 02 M1）に適
用した。120 リットルの発酵の場合、細胞を、孔径が0.
2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを有するパイ
ロットプラント規模のマイクロ濾過ユニット（R-10メン
ブレンモジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 02 M
1）により除去した。これらの濾過ユニットは、単に例
として示しただけである。細胞を除去するためにどのよ
うな適当なマイクロ濾過システムも利用できることを理
解されたい。任意に、細胞およびデブリ（debris）の塊
を遠心分離により除去し、上清および細胞を洗浄するた
めに用いられた培地のみをマイクロ濾過ユニットに適用
した。または、発酵ブロスから産物を回収し、産生した
ゼラチンを特異的に結合させる樹脂を用いる、適切な膨
張層クロマトグラフィーシステムに該発酵ブロスを適用
することにより産物を細胞から分離することができる。
我々は、ファルマシアのＳＰセファロースＸＬストリー
ムラインを膨張層モード中のカチオン交換体（ｐＨ３〜
４）としてうまく利用することができた。
【０１０８】Ｍｕｔs 培養物の発酵 グリセロールバッチおよび供給バッチ相を、ｍｕｔ+ 培
養物について記載されたように行った。Ｍｕｔs 培養物
はメタノールを十分には代謝しないので、それらの酸素
消費は低い。したがって、溶解酸素濃度の上昇は、培養
物を評価するのに用いることはできない。メタノール供
給は、0.3 ％を超えない培地中の過剰のメタノールを保
持するために調整した。メタノール供給は、１ｍｌ／ｈ
／リットルの初期発酵糟体積で始められ、ゆっくりと３
ｍｌ／ｈ／リットルまで高めた。Ｍｕｔs 培養物を用い
るときに必要とされる全発酵時間は、Ｍｕｔs 培養物が
用いられたときよりも比較的長い。
養物について記載されたように行った。Ｍｕｔs 培養物
はメタノールを十分には代謝しないので、それらの酸素
消費は低い。したがって、溶解酸素濃度の上昇は、培養
物を評価するのに用いることはできない。メタノール供
給は、0.3 ％を超えない培地中の過剰のメタノールを保
持するために調整した。メタノール供給は、１ｍｌ／ｈ
／リットルの初期発酵糟体積で始められ、ゆっくりと３
ｍｌ／ｈ／リットルまで高めた。Ｍｕｔs 培養物を用い
るときに必要とされる全発酵時間は、Ｍｕｔs 培養物が
用いられたときよりも比較的長い。
【０１０９】コラーゲン／ゼラチンの調製規模での調製
的精製 マイクロ濾過工程後、二つの代用精製方法にしたがった
（下記のＩ、ＩＩを参照のこと）。
的精製 マイクロ濾過工程後、二つの代用精製方法にしたがった
（下記のＩ、ＩＩを参照のこと）。
【０１１０】Ｉ．析出差（differential precipitatio
n）による精製アセトン分画 コラーゲンタイプＩおよびタイプＩＩＩを、40〜80％ア
セトン分画により上清のバッチ500 ｍｌ〜２リットルか
ら部分精製した。40％アセトンで、（ピヒア由来の）非
コラーゲンタンパク質が析出した一方、60〜80％アセト
ンで、コラーゲンならびにコラーゲン分解生成物が、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸組成物の分析により示さ
れたように、析出した。60％アセトンで、好ましくは高
分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度
で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られ
た。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによりチェックしたように）析出物中に回収され
た。小ペプチドと他の低分子量の不純物が80％アセトン
では溶液中にとどまった。アセトンを２〜４時間、−20
℃で冷却した。40％の氷冷アセトン（ｖ／ｖ）をマグネ
テックスターラーによる４℃での攪拌下で発酵からの予
備冷却した上清にゆっくりと加えた。上清を４℃で一晩
攪拌した。析出したタンパク質と粒子を遠心分離により
除去した（４℃、10,000ｒｐｍ、30分間）。ペレットを
40％の氷冷アセトンに再懸濁し、再び遠心分離した。両
方の40％アセトン上清フラクションを収集した。その
後、上清を60〜80％アセトン（ｖ／ｖ）とし、一晩攪拌
した。析出したタンパク質は遠心分離により収集した。
ペレットを60〜80％アセトンに懸濁し、再び遠心分離し
た。ペレットを５ｍＭ酢酸／水酸化アンモニウム緩衝
液、ｐＨ3.0 （緩衝液Ａ）の適切な量で20〜50ｇ／ｌタ
ンパク質濃度まで溶解した。
n）による精製アセトン分画 コラーゲンタイプＩおよびタイプＩＩＩを、40〜80％ア
セトン分画により上清のバッチ500 ｍｌ〜２リットルか
ら部分精製した。40％アセトンで、（ピヒア由来の）非
コラーゲンタンパク質が析出した一方、60〜80％アセト
ンで、コラーゲンならびにコラーゲン分解生成物が、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸組成物の分析により示さ
れたように、析出した。60％アセトンで、好ましくは高
分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度
で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られ
た。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによりチェックしたように）析出物中に回収され
た。小ペプチドと他の低分子量の不純物が80％アセトン
では溶液中にとどまった。アセトンを２〜４時間、−20
℃で冷却した。40％の氷冷アセトン（ｖ／ｖ）をマグネ
テックスターラーによる４℃での攪拌下で発酵からの予
備冷却した上清にゆっくりと加えた。上清を４℃で一晩
攪拌した。析出したタンパク質と粒子を遠心分離により
除去した（４℃、10,000ｒｐｍ、30分間）。ペレットを
40％の氷冷アセトンに再懸濁し、再び遠心分離した。両
方の40％アセトン上清フラクションを収集した。その
後、上清を60〜80％アセトン（ｖ／ｖ）とし、一晩攪拌
した。析出したタンパク質は遠心分離により収集した。
ペレットを60〜80％アセトンに懸濁し、再び遠心分離し
た。ペレットを５ｍＭ酢酸／水酸化アンモニウム緩衝
液、ｐＨ3.0 （緩衝液Ａ）の適切な量で20〜50ｇ／ｌタ
ンパク質濃度まで溶解した。
【０１１１】硫酸アンモニウム沈殿 次に、多糖類を60％飽和硫酸アンモニウムでのゼラチン
／コラーゲンの析出により除去する。ここで多糖類は溶
液中に残った。硫酸アンモニウムをゆっくりと４℃で60
％飽和まで加えた。60分間の攪拌後、試料を遠心分離し
た（30分間、４℃、10,000 ｒｐｍ）。そのペレットを60
％硫酸アンモニウムに再懸濁し、再び遠心分離した。１
％（ｗ／ｗ）を超える多糖類または糖が残っている場
合、硫酸アンモニウムの不存在下でゼラチン／コラーゲ
ンを完全に再溶解した後、上記の完全な硫酸アンモニウ
ム析出法を繰り返した。最後に、ペレットを脱イオン水
または緩衝液Ａに溶解し、タンパク質濃度を20〜50ｇ／
ｌとした。試料のｐＨを3.0に調整した。試料を緩衝液
Ａに対する透析により脱塩した。該緩衝液は４時間毎に
取替えた。排除分子量８ｋＤの再生セルロースの透析膜
（Spectra Por （登録商標）、スペクトラム（Spektru
m）社）を用いた。透析は、試料の電導度が十分に低い
（典型的にはバックグランド上の20〜150 μＳ．ｃ
ｍ-1）と判定されたときの２〜７日後に止めた。電導度
は、１ｍＭおよび10ｍＭのＫＣｌ溶液（それぞれ140 お
よび1400μＳ．ｃｍ-1）で検量したデジタル電導測定計
（ラジオメーター）を用いて測定した。透析に変わるも
のとして、限外濾過および透析濾過を用いて試料を脱塩
し、（任意に）濃縮した。適用可能であれば、生成物を
次に高濃度のアセトンによる析出およびアセトンの蒸発
により前乾燥し（任意）、最終的に凍結乾燥した。
／コラーゲンの析出により除去する。ここで多糖類は溶
液中に残った。硫酸アンモニウムをゆっくりと４℃で60
％飽和まで加えた。60分間の攪拌後、試料を遠心分離し
た（30分間、４℃、10,000 ｒｐｍ）。そのペレットを60
％硫酸アンモニウムに再懸濁し、再び遠心分離した。１
％（ｗ／ｗ）を超える多糖類または糖が残っている場
合、硫酸アンモニウムの不存在下でゼラチン／コラーゲ
ンを完全に再溶解した後、上記の完全な硫酸アンモニウ
ム析出法を繰り返した。最後に、ペレットを脱イオン水
または緩衝液Ａに溶解し、タンパク質濃度を20〜50ｇ／
ｌとした。試料のｐＨを3.0に調整した。試料を緩衝液
Ａに対する透析により脱塩した。該緩衝液は４時間毎に
取替えた。排除分子量８ｋＤの再生セルロースの透析膜
（Spectra Por （登録商標）、スペクトラム（Spektru
m）社）を用いた。透析は、試料の電導度が十分に低い
（典型的にはバックグランド上の20〜150 μＳ．ｃ
ｍ-1）と判定されたときの２〜７日後に止めた。電導度
は、１ｍＭおよび10ｍＭのＫＣｌ溶液（それぞれ140 お
よび1400μＳ．ｃｍ-1）で検量したデジタル電導測定計
（ラジオメーター）を用いて測定した。透析に変わるも
のとして、限外濾過および透析濾過を用いて試料を脱塩
し、（任意に）濃縮した。適用可能であれば、生成物を
次に高濃度のアセトンによる析出およびアセトンの蒸発
により前乾燥し（任意）、最終的に凍結乾燥した。
【０１１２】ＩＩ．陽イオン交換クロマトグラフィーに
よる精製 陽イオン交換樹脂は、ＳＰセファロースＸＬ（ファルマ
シア バイオテク）であったが、他の適当な樹脂も用い
ることができた。精製を、幾つかの規模で行った。よっ
て、ＸＫ１６カラム（ファルマシア）の25ｍｌベッドを
用いた。運転はＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて行っ
た。ベッドの高さは12.5ｃｍであった。流速は典型的に
は１ｍｌ／分であった。中間規模では、100 ｍｌのベッ
トを用いて、運転はエクタ・エクスプローラー統合ポン
プ／プロセッサー／複数バルブ／複数検出器装置（ファ
ルマシア）により調節した。パイロット規模では、イン
デックス１４０／２００カラム中の２リットルのベッド
を用いた。ベッドの高さは少なくとも13ｃｍであった。
運転はエクタ・エクスプローラーポンプ／プロセッサー
装置（ファルマシア）または他のポンプシステムを用い
て行った。流速は50〜100 ｍｌ／分以上であった。具体
例として、下記の緩衝液系と溶出条件を用いた。緩衝液
Ｘは５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.2)であり、緩衝液Ｙ
は１ＭのＮａＣｌを有する５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
3.0)であった。カラムを２〜５ベッド体積の緩衝液Ｘで
平衡化した。目的タンパク質を、５〜10カラム体積分の
０〜0.5 Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。
コラーゲンタイプＩＩＩのメインバンドを50〜100 ｍＭ
ＮａＣｌで溶出した。コラーゲンタイプＩのメインバ
ンドを70ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、他のバンドは30〜15
0 ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、それらの理論的等電点と合
致した。該カラムを１ベッド容積分の緩衝液Ｙで洗っ
た。パイロット規模では、プールしたフラクションを脱
塩し、例えば80％アセトンを加えることにより濃縮した
後に凍結乾燥した。
よる精製 陽イオン交換樹脂は、ＳＰセファロースＸＬ（ファルマ
シア バイオテク）であったが、他の適当な樹脂も用い
ることができた。精製を、幾つかの規模で行った。よっ
て、ＸＫ１６カラム（ファルマシア）の25ｍｌベッドを
用いた。運転はＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて行っ
た。ベッドの高さは12.5ｃｍであった。流速は典型的に
は１ｍｌ／分であった。中間規模では、100 ｍｌのベッ
トを用いて、運転はエクタ・エクスプローラー統合ポン
プ／プロセッサー／複数バルブ／複数検出器装置（ファ
ルマシア）により調節した。パイロット規模では、イン
デックス１４０／２００カラム中の２リットルのベッド
を用いた。ベッドの高さは少なくとも13ｃｍであった。
運転はエクタ・エクスプローラーポンプ／プロセッサー
装置（ファルマシア）または他のポンプシステムを用い
て行った。流速は50〜100 ｍｌ／分以上であった。具体
例として、下記の緩衝液系と溶出条件を用いた。緩衝液
Ｘは５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.2)であり、緩衝液Ｙ
は１ＭのＮａＣｌを有する５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
3.0)であった。カラムを２〜５ベッド体積の緩衝液Ｘで
平衡化した。目的タンパク質を、５〜10カラム体積分の
０〜0.5 Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。
コラーゲンタイプＩＩＩのメインバンドを50〜100 ｍＭ
ＮａＣｌで溶出した。コラーゲンタイプＩのメインバ
ンドを70ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、他のバンドは30〜15
0 ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、それらの理論的等電点と合
致した。該カラムを１ベッド容積分の緩衝液Ｙで洗っ
た。パイロット規模では、プールしたフラクションを脱
塩し、例えば80％アセトンを加えることにより濃縮した
後に凍結乾燥した。
【０１１３】ゼラチン／コラーゲン生成物の特性決定 アミノ酸組成を、非常に低いｐＨおよび高温で、ペプチ
ド結合をＨＣｌ媒介で完全に加水分解した後、アミノ酸
を蛍光体で誘導体化し、かつＨＰＬＣにより決定した。
ド結合をＨＣｌ媒介で完全に加水分解した後、アミノ酸
を蛍光体で誘導体化し、かつＨＰＬＣにより決定した。
【０１１４】純粋なコラーゲンから予測されたＧｌｙの
パーセントは33％である。これは、産生組換えゼラチン
の純度を評価する手段を提供する。ピヒア・パストリス
の内因性分泌タンパク質中のＧｌｙのパーセントを補正
するために、ｐＰＩＣ９のＭｕｔ+ 変異体の発酵上清の
アミノ酸組成分析を行った。観測されたＧｌｙのパーセ
ントは９％であった。試料の純度はここで下記式により
推定することができる。 （Ｇｌｙ（％）−９）／（３３−９）＝（Ｇｌｙ（％）
−９）／２４。
パーセントは33％である。これは、産生組換えゼラチン
の純度を評価する手段を提供する。ピヒア・パストリス
の内因性分泌タンパク質中のＧｌｙのパーセントを補正
するために、ｐＰＩＣ９のＭｕｔ+ 変異体の発酵上清の
アミノ酸組成分析を行った。観測されたＧｌｙのパーセ
ントは９％であった。試料の純度はここで下記式により
推定することができる。 （Ｇｌｙ（％）−９）／（３３−９）＝（Ｇｌｙ（％）
−９）／２４。
【０１１５】試料のミリＱ水（MilliQ water）への溶解
後、下記のアッセイを行った。
後、下記のアッセイを行った。
【０１１６】タンパク質含量は、メルク社のゼラチンを
参照として用いて、ピアス社のＢＣＡアッセイにより決
定した。
参照として用いて、ピアス社のＢＣＡアッセイにより決
定した。
【０１１７】タンパク質Ｍｗ分布を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により決定した。
により決定した。
【０１１８】糖含量はフェノールに基づくアッセイで決
定した。試料200 μＬを５％（ｗ／ｗ）フェノール200
μＬと混合した。Vortexミキサーを用いて完全に混合し
た後、濃硫酸１ｍｌを加えた。混合後、試料を室温で10
分間、続いて30℃で20分間インキュベートした。冷却
後、試料の 485ｎｍの光吸収を測定した。デンプン、グ
ルコースおよびスクロースを用いて検量線を作成した。
定した。試料200 μＬを５％（ｗ／ｗ）フェノール200
μＬと混合した。Vortexミキサーを用いて完全に混合し
た後、濃硫酸１ｍｌを加えた。混合後、試料を室温で10
分間、続いて30℃で20分間インキュベートした。冷却
後、試料の 485ｎｍの光吸収を測定した。デンプン、グ
ルコースおよびスクロースを用いて検量線を作成した。
【０１１９】ＤＮＡ含量は、モレキュラープローブ社の
希釈ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ核酸「ゲル」染色
（ＤＭＳＯ中10,000×濃度）のアリコートを試料と混合
することによって決定した。完全なスペクトル分析後
に、励起波長を 490ｎｍに選択し、発光波長を 523ｎｍ
に選択した。その検量は、内部標準としてわかっている
量のＤＮＡをこの同じ混合物に加えることによった。こ
うして、検量線を作った。さらに、ＤＮＡ−分解酵素を
その後に添加することにより、蛍光シグナルの完全な分
解がもたらされることがチェックされた。
希釈ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ核酸「ゲル」染色
（ＤＭＳＯ中10,000×濃度）のアリコートを試料と混合
することによって決定した。完全なスペクトル分析後
に、励起波長を 490ｎｍに選択し、発光波長を 523ｎｍ
に選択した。その検量は、内部標準としてわかっている
量のＤＮＡをこの同じ混合物に加えることによった。こ
うして、検量線を作った。さらに、ＤＮＡ−分解酵素を
その後に添加することにより、蛍光シグナルの完全な分
解がもたらされることがチェックされた。
【０１２０】ＲＮＡプラスＤＮＡ−含量を定量的に示す
ものを、次にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩの代りに
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ「ＲＮＡゲルステイ
ン」を用いることにより得られた。完全なスペクトル分
析後に、励起波長を490 ｎｍに選択し、発光波長を514
ｎｍに選択した。検量は、既知量のＲＮＡを加えること
によった。得られた値が該試料の「ＲＮＡ」含量を示し
た。ＤＮＡの不存在下では、それは真のＲＮＡ含量に対
応する。存在する場合、ＤＮＡに関連した蛍光はＲＮＡ
値に影響を与えたかもしれないが、ＲＮＡｓｅの最終添
加を用いて蛍光に対するＤＮＡおよびＲＮＡ由来の寄与
を見分けた。
ものを、次にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩの代りに
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ「ＲＮＡゲルステイ
ン」を用いることにより得られた。完全なスペクトル分
析後に、励起波長を490 ｎｍに選択し、発光波長を514
ｎｍに選択した。検量は、既知量のＲＮＡを加えること
によった。得られた値が該試料の「ＲＮＡ」含量を示し
た。ＤＮＡの不存在下では、それは真のＲＮＡ含量に対
応する。存在する場合、ＤＮＡに関連した蛍光はＲＮＡ
値に影響を与えたかもしれないが、ＲＮＡｓｅの最終添
加を用いて蛍光に対するＤＮＡおよびＲＮＡ由来の寄与
を見分けた。
【０１２１】試料の電導度を、デジタルラジオメーター
電導計を用いて測定して、ミリＱ水中の１ｍＭ及び10ｍ
Ｍ ＫＣｌ溶液がそれぞれ 140μＳ．ｃｍ-1及び1400μ
Ｓ．ｃｍ-1の読みを与えることをチェックした。
電導計を用いて測定して、ミリＱ水中の１ｍＭ及び10ｍ
Ｍ ＫＣｌ溶液がそれぞれ 140μＳ．ｃｍ-1及び1400μ
Ｓ．ｃｍ-1の読みを与えることをチェックした。
【０１２２】本発明により作られた幾つかのゼラチンバ
ッチの純度に関するデータ（実施例） ＧＡＴＯ４ａ（ｃｏｌ３ａｌ） ・約 2.4グラム ・精製 マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80
％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に
保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液
（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調
整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）
に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：12.7ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ：図１４）
ッチの純度に関するデータ（実施例） ＧＡＴＯ４ａ（ｃｏｌ３ａｌ） ・約 2.4グラム ・精製 マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80
％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に
保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液
（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調
整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）
に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：12.7ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ：図１４）
【０１２３】ＧＡＴＯ４ｂ（ｃｏｌ３ａｌ、ＧＡＴＯ４
ａよりもさらに精製されたもの） ・約１グラム ・精製 繰返し（２×追加）硫酸アンモニウム析出後に、試料を
ｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯ
Ｏ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐ
Ｈ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製され
た緩衝液）に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：0.56ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：3.2 ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：0.94％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった。 ・10ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約180 μＳｃｍ
-1（緩衝液の比電導度約100 μＳｃｍ-1） ・凍結乾燥および試料の溶解後の比電導度：10ｇゼラチ
ン／Ｌで180 μＳｃｍ-1、５ｇゼラチン／Ｌで100 μＳ
ｃｍ-1
ａよりもさらに精製されたもの） ・約１グラム ・精製 繰返し（２×追加）硫酸アンモニウム析出後に、試料を
ｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯ
Ｏ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐ
Ｈ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製され
た緩衝液）に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：0.56ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：3.2 ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：0.94％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった。 ・10ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約180 μＳｃｍ
-1（緩衝液の比電導度約100 μＳｃｍ-1） ・凍結乾燥および試料の溶解後の比電導度：10ｇゼラチ
ン／Ｌで180 μＳｃｍ-1、５ｇゼラチン／Ｌで100 μＳ
ｃｍ-1
【０１２４】ＧＡＴＯ５（ｃｏｌ１ａ１−１） ・約0.9 グラム ・精製 マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80
％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に
保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液
（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調
整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）
に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：87ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ：図15）
％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に
保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液
（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調
整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）
に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：87ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ：図15）
【０１２５】ＧＡＴＯ６（膨張層陽イオン交換クロマト
グラフィーにより精製されたｃｏｌ３ａ１） ・約50ｍｇ ・精製 ｐＨ３〜3.5 での膨張層陽イオン交換クロマトグラフィ
ー（ＳＰ−セファロースＸＬ“ストリームライン”樹脂
（ファルマシアバイオテック；カラムの副最適洗浄およ
び0.3 ＭＮａＣｌの溶出後の糖含量：1.8 ％（ｗ／
ｗ））、さらに一回の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出による糖
の除去後、５ｍＭのＮＨ4 + ／ＣＨ3 ＣＯＯ - 緩衝液
（ｐＨ約3.5 ）に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 析出および透析） ・ＲＮＡ：＜９ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 析出および透析） ・全糖類：1.1 ％（ｗ／ｗ） ・0.55ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約94μＳｃｍ
-1（緩衝液の比電導度：約100 μＳｃｍ-1） ・ゼラチンは精製中分解しなかった
グラフィーにより精製されたｃｏｌ３ａ１） ・約50ｍｇ ・精製 ｐＨ３〜3.5 での膨張層陽イオン交換クロマトグラフィ
ー（ＳＰ−セファロースＸＬ“ストリームライン”樹脂
（ファルマシアバイオテック；カラムの副最適洗浄およ
び0.3 ＭＮａＣｌの溶出後の糖含量：1.8 ％（ｗ／
ｗ））、さらに一回の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出による糖
の除去後、５ｍＭのＮＨ4 + ／ＣＨ3 ＣＯＯ - 緩衝液
（ｐＨ約3.5 ）に対する透析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 析出および透析） ・ＲＮＡ：＜９ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 析出および透析） ・全糖類：1.1 ％（ｗ／ｗ） ・0.55ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約94μＳｃｍ
-1（緩衝液の比電導度：約100 μＳｃｍ-1） ・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２６】ＧＡＴＯ７（ｃｏｌ１ａ１−２） ・400 ｍｇ ・精製 マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／71.5
％）、３×（ＮＨ4 ）2ＳＯ4 ）、アセトン沈殿による
予備脱塩：１×71.5％、１×80％、ミリＱ水に対する透
析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：0.79ｐｐｍ ・ＲＮＡ：9.5 ｐｐｍ ・全糖類：0.7 ％（ｗ／ｗ） ・４ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約15.5μＳｃｍ
-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった
％）、３×（ＮＨ4 ）2ＳＯ4 ）、アセトン沈殿による
予備脱塩：１×71.5％、１×80％、ミリＱ水に対する透
析、凍結乾燥 ・ＤＮＡ：0.79ｐｐｍ ・ＲＮＡ：9.5 ｐｐｍ ・全糖類：0.7 ％（ｗ／ｗ） ・４ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約15.5μＳｃｍ
-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２７】ＧＡＴＯ８（ｃｏｌ３ａ１） ・約６ｍｇ ・精製 マイクロ濾過、希釈、20ｍＭクエン酸、ｐＨ3.5 で平衡
化させた2.1 リットル層ＳＰセファロース−ＸＬ中の陽
イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシアバイオテ
ック）および同緩衝液中の0.1 〜１ＭＮａＣｌのグラジ
エントによる0.15ＭＮａＣｌでの溶出、濃縮、80％アセ
トンによる部分的な脱塩、遠心、ミリＱ水への再溶解、
ミリＱ水に対する透析および凍結乾燥 ・ＤＮＡ：1.55ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：10.9ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：1.2 ％（ｗ／ｗ） ・透析後の7.5 ｇゼラチン／Ｌの比電導度約90μＳｃｍ
-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった 図16は精製の結果を示す。
化させた2.1 リットル層ＳＰセファロース−ＸＬ中の陽
イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシアバイオテ
ック）および同緩衝液中の0.1 〜１ＭＮａＣｌのグラジ
エントによる0.15ＭＮａＣｌでの溶出、濃縮、80％アセ
トンによる部分的な脱塩、遠心、ミリＱ水への再溶解、
ミリＱ水に対する透析および凍結乾燥 ・ＤＮＡ：1.55ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：10.9ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：1.2 ％（ｗ／ｗ） ・透析後の7.5 ｇゼラチン／Ｌの比電導度約90μＳｃｍ
-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった 図16は精製の結果を示す。
【０１２８】ＧＡＴＯ９（ｃｏｌ１ａ１−１） ・ 1.7ｇ ・精製：ＧＡＴＯ８を参照。陽イオン交換体から0.74Ｍ
ＮａＣｌの１つの塩段階での溶出だけが異なる。 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：1.3 ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：2.2 ％（ｗ／ｗ） ・透析後の12ｇゼラチン／Ｌの比電導度約70μＳｃｍ-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった
ＮａＣｌの１つの塩段階での溶出だけが異なる。 ・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：1.3 ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：2.2 ％（ｗ／ｗ） ・透析後の12ｇゼラチン／Ｌの比電導度約70μＳｃｍ-1 ・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２９】ＧＡＴＯ１０（ｃｏｌ１ａ１−２）ここで
両ＭＧＰＲ配列はＲＧＰＭに変更した ・６ｇ ・精製：ＧＡＴＯ８を参照 ・ＤＮＡ：0.04ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：２ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：２％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった ・Ｎ末端アミノ酸配列はプロペプチドの不完全な除去の
ためにＮ末端伸長としてＧｌｕ−Ａｌａを有し、予想さ
れた通りであった。その結果を図１８に示す。
両ＭＧＰＲ配列はＲＧＰＭに変更した ・６ｇ ・精製：ＧＡＴＯ８を参照 ・ＤＮＡ：0.04ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・ＲＮＡ：２ｐｐｍ（ｗ／ｗ） ・全糖類：２％（ｗ／ｗ） ・ゼラチンは精製中分解しなかった ・Ｎ末端アミノ酸配列はプロペプチドの不完全な除去の
ためにＮ末端伸長としてＧｌｕ−Ａｌａを有し、予想さ
れた通りであった。その結果を図１８に示す。
【０１３０】結論として、すべての試料のアミノ酸組成
は理論的組成に合致した。外来タンパク質による不純物
は非常に低かった。グリシンベースでは、ＧＡＴＯ４−
ＧＡＴＯ８は不純物として１％未満の外来タンパク質を
有している。ＧＡＴＯ９およびＧＡＴＯ１０は５％未満
を有する。
は理論的組成に合致した。外来タンパク質による不純物
は非常に低かった。グリシンベースでは、ＧＡＴＯ４−
ＧＡＴＯ８は不純物として１％未満の外来タンパク質を
有している。ＧＡＴＯ９およびＧＡＴＯ１０は５％未満
を有する。
【０１３１】実施例１で挙げられた参考文献 [1] Capello, J & Ferrari, F. (1994) in: Plastics f
rom microbes (Mobley,D. P., ed.) Hanser, Munich, p
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B. L. (1990) A rapid and simple method for prepara
tion of RNA from Saccharomyces cerevisiae, Nucleic
Acids Res, 18 (10): 3091 。 [11] Scorer, C. A., Clare, J. J., McCombie, W. R.,
Romanos, M. A. & Sreekrishna, K. (1994) Rapid Sel
ection using G418 of high copy number transformant
s of Pichia pastoris for high-level foreign gene e
xpression. Bio/Technology 12: 181-184 。 [12] Butkowsky R. J., Noelken, M. E. & Hudson, B.
G. (1982) Estimation of the size of colagenous pro
teins by electrophoresis and gel chromatography.
Meth. Enzymol. 82: 410-423。 [13] De Wolf, F. A. & Keller R. C. A (1996) Charac
terization of the helical structures in gelatin ne
tworks and model polypeptides by circular dichrois
m. Progr. Colloid Polym. Sci. 102: 9-14。
【０１３２】実施例２（コントロール） 従来の標準タイプのゼラチンを有する臭化銀結晶の調製核形成 ： 2.1ｇ／ｌ標準ゼラチン（ＰＢゼラチンズ社の
標準的な脱イオン化ＩＡＧ骨ゼラチン、テッセンデルロ
ー、ベルギー）および7.3 ｍＭ臭化カリウムを含有する
反応溶液中35℃の温度で、そのｐＨを水酸化ナトリウム
または硫酸により5.5 の値に調整する。一回の噴射添加
により、144 ｍＭ硝酸銀の水溶液を10秒間一定の速度
で、激しい攪拌下、加える。硝酸銀の添加後、反応混合
物中のゼラチン濃度は2.0 ｇ／ｌとなり、臭素化物濃度
は１ｍＭとなった。
標準的な脱イオン化ＩＡＧ骨ゼラチン、テッセンデルロ
ー、ベルギー）および7.3 ｍＭ臭化カリウムを含有する
反応溶液中35℃の温度で、そのｐＨを水酸化ナトリウム
または硫酸により5.5 の値に調整する。一回の噴射添加
により、144 ｍＭ硝酸銀の水溶液を10秒間一定の速度
で、激しい攪拌下、加える。硝酸銀の添加後、反応混合
物中のゼラチン濃度は2.0 ｇ／ｌとなり、臭素化物濃度
は１ｍＭとなった。
【０１３３】成熟：核形成後、容器の内容物を成熟容器
に移し、温度を徐々に75℃まで上げて、3.4 Ｍ臭化カリ
ウム溶液を加えて臭化物濃度を15ｍｍｏｌ／ｌに上げ
る。成熟を56分間続け、その後に標準的な脱イオン化ゼ
ラチンを５ｇ／ｌの濃度まで加え；58分後に、メチルフ
ェニルテトラゾール溶液を加えて冷却することによりオ
ストワルド成熟を強く低下させる。この調製された乳剤
試料を直接透過型電子顕微鏡ならびにそのレプリカによ
り分析した。
に移し、温度を徐々に75℃まで上げて、3.4 Ｍ臭化カリ
ウム溶液を加えて臭化物濃度を15ｍｍｏｌ／ｌに上げ
る。成熟を56分間続け、その後に標準的な脱イオン化ゼ
ラチンを５ｇ／ｌの濃度まで加え；58分後に、メチルフ
ェニルテトラゾール溶液を加えて冷却することによりオ
ストワルド成熟を強く低下させる。この調製された乳剤
試料を直接透過型電子顕微鏡ならびにそのレプリカによ
り分析した。
【０１３４】結果： 表ＩＩに見られるように、平板状
粒子が非常に低い率で形成される。
粒子が非常に低い率で形成される。
【０１３５】実施例３（コントロール） 従来の加水分解ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製核形成 ： 反応混合物中のゼラチンを従来の加水分解ゼ
ラチン試料（日本のニッタゼラチン社により脱イオン化
されて供給されるもの）で置き換えた以外は実施例２と
同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成
を行う。
ラチン試料（日本のニッタゼラチン社により脱イオン化
されて供給されるもの）で置き換えた以外は実施例２と
同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成
を行う。
【０１３６】成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操
作にしたがって行う。
作にしたがって行う。
【０１３７】結果：平板状粒子の平均％が約40％である
ものが表ＩＩに示されている。
ものが表ＩＩに示されている。
【０１３８】実施例４（コントロール） 酸化ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製核形成 ： 反応混合物中のゼラチンを従来の酸化ゼラチ
ン試料（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ
社により供給されるもの）で置き換えた以外は実施例１
と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形
成を行う。
ン試料（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ
社により供給されるもの）で置き換えた以外は実施例１
と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形
成を行う。
【０１３９】成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操
作にしたがって行う。
作にしたがって行う。
【０１４０】結果：平均アスペクト比が５：１の平板状
粒子％が70％と高い、ｐＨ5.5 での酸化ゼラチンに対し
て表ＩＩに示されている。加水分解され標準のゼラチン
によるよりも良好な結果はこのゼラチンの低いメチオニ
ン含量によるものと説明がつく（11μｍｏｌ／ｇゼラチ
ン対50〜60μｍｏｌ／ｇの従来のゼラチン）。
粒子％が70％と高い、ｐＨ5.5 での酸化ゼラチンに対し
て表ＩＩに示されている。加水分解され標準のゼラチン
によるよりも良好な結果はこのゼラチンの低いメチオニ
ン含量によるものと説明がつく（11μｍｏｌ／ｇゼラチ
ン対50〜60μｍｏｌ／ｇの従来のゼラチン）。
【０１４１】実施例５（本発明） 発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製核形成 ： 反応混合物中のゼラチンを発明の天然ＣＯＬ
３Ａ１ゼラチン試料で置き換えた以外は実施例２と同じ
条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行
う。
３Ａ１ゼラチン試料で置き換えた以外は実施例２と同じ
条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行
う。
【０１４２】成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操
作にしたがって行う。
作にしたがって行う。
【０１４３】結果：平均アスペクト比が５：１、平板状
粒子の％が85％を超える高さのものが表ＩＩに示されて
いる。
粒子の％が85％を超える高さのものが表ＩＩに示されて
いる。
【０１４４】実施例６（コントロール） 異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ベルギー、テッセ
ンデルローのＰＢゼラチンズ社の標準的脱イオンＩＡＧ
骨ゼラチン）を用いる臭化銀結晶の調製核形成 ：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の
条件を実施例２に維持することで行う。
ンデルローのＰＢゼラチンズ社の標準的脱イオンＩＡＧ
骨ゼラチン）を用いる臭化銀結晶の調製核形成 ：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の
条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４５】成熟：成熟を、ｐＨを核形成中と同じｐＨ
＝７に保持する以外は実施例２で用いられた同じ操作に
したがって行う。
＝７に保持する以外は実施例２で用いられた同じ操作に
したがって行う。
【０１４６】結果：アスペクト比が５を超える平板状粒
子は、従来の市販ゼラチンでは表ＩＩに示されたように
得られなかった。
子は、従来の市販ゼラチンでは表ＩＩに示されたように
得られなかった。
【０１４７】実施例７（コントロール） 異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ニッタゼラチン
ズ、日本）を用いる臭化銀結晶の調製核形成 ：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の
条件を実施例２に維持することで行う。
ズ、日本）を用いる臭化銀結晶の調製核形成 ：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の
条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４８】成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保
持する以外、成熟を実施例２で用いられた同じ操作にし
たがって行う。
持する以外、成熟を実施例２で用いられた同じ操作にし
たがって行う。
【０１４９】結果：５％程度の平板状粒子の非常に低い
％が表ＩＩで示されたように得られた。
％が表ＩＩで示されたように得られた。
【０１５０】実施例８（本発明） 異なるｐＨでの発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化
銀結晶の調製核形成 ：核形成を異なるｐＨ条件、すなわちｐＨ＝７の
条件を適用する一方で他の条件は実施例４に維持するこ
とで行う。
銀結晶の調製核形成 ：核形成を異なるｐＨ条件、すなわちｐＨ＝７の
条件を適用する一方で他の条件は実施例４に維持するこ
とで行う。
【０１５１】成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保
持する以外、成熟を実施例４で用いられた同じ操作にし
たがって行う。
持する以外、成熟を実施例４で用いられた同じ操作にし
たがって行う。
【０１５２】結果：表ＩＩに示されたように、非常に高
い平板状粒子％（約80％、これは最新技術のゼラチンよ
りも明らかに高い）がこの条件で驚くべきことに見出さ
れている。
い平板状粒子％（約80％、これは最新技術のゼラチンよ
りも明らかに高い）がこの条件で驚くべきことに見出さ
れている。
【０１５３】実施例９ 結合力と平板状粒子形態との関係 ゼラチン45ｍｇを正確に計り取り、0.1 Ｍ硝酸カリウム
を含有する0.1 Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）15ｇを加え
る。この溶液を水浴中、45℃で15分間置く。溶液を室温
（23℃）まで冷却する。（ゼラチンを含有する）このｐ
Ｈ7.0 のリン酸緩衝液溶液10ｍｌを23℃で0.5ｍＭ硝酸
銀100 μｌと混合する。「ｖＡｇ」と称されるこの溶液
のポテンシャルをＡｇ／ＡｇＣｌ参照二重接点電極（Or
ion モデル90-02)に対するＡｇ電極（Orion モデル97-8
1)を用いて測定する。ゼラチンのない同じ緩衝液溶液も
硝酸銀溶液と混合し、ポテンシャル「ｖＡｇ」を同一の
方法で測定する。二つの測定されたポテンシャル間の違
いを計算して、これを、Ａｇイオンに対するゼラチンの
結合親和性である「デルタｖＡｇ」として表す。下記の
表ＩＩは、ｐＨ5.5 およびｐＨ７について、試験された
ペプタイザー、平板状粒子％およびゼラチン結合親和性
「デルタＶＡｇ」を有し、ここでは平板状の基準はアス
ペクト比＞５として定義されている。
を含有する0.1 Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）15ｇを加え
る。この溶液を水浴中、45℃で15分間置く。溶液を室温
（23℃）まで冷却する。（ゼラチンを含有する）このｐ
Ｈ7.0 のリン酸緩衝液溶液10ｍｌを23℃で0.5ｍＭ硝酸
銀100 μｌと混合する。「ｖＡｇ」と称されるこの溶液
のポテンシャルをＡｇ／ＡｇＣｌ参照二重接点電極（Or
ion モデル90-02)に対するＡｇ電極（Orion モデル97-8
1)を用いて測定する。ゼラチンのない同じ緩衝液溶液も
硝酸銀溶液と混合し、ポテンシャル「ｖＡｇ」を同一の
方法で測定する。二つの測定されたポテンシャル間の違
いを計算して、これを、Ａｇイオンに対するゼラチンの
結合親和性である「デルタｖＡｇ」として表す。下記の
表ＩＩは、ｐＨ5.5 およびｐＨ７について、試験された
ペプタイザー、平板状粒子％およびゼラチン結合親和性
「デルタＶＡｇ」を有し、ここでは平板状の基準はアス
ペクト比＞５として定義されている。
【０１５４】
【表２】
【図１】 ベクターｐＣＯＬ３Ａ１。
【図２】 ｐＣＯＬ３Ａ１構築物コントロール用ＰＣＲ
プライマー。
プライマー。
【図３】 予想されたＣＯＬ３Ａ１配列。Ｎ末端Ｙはｐ
ＰＩＣ９ベクターに由来する。配列の残りはラットのＣ
ＯＬ３Ａ１に由来する。下線を付けた配列はＣＯＬ３Ａ
１断片について得られたＮ末端配列に対応する。
ＰＩＣ９ベクターに由来する。配列の残りはラットのＣ
ＯＬ３Ａ１に由来する。下線を付けた配列はＣＯＬ３Ａ
１断片について得られたＮ末端配列に対応する。
【図４】 ベクターｐＣＯＬ３ＡＩＫ。
【図５】 ＣＯＬＩＡ１のクローニング用オリゴ配列。
下の配列はアニーリング後のアダプター。
下の配列はアニーリング後のアダプター。
【図６】 クローニング法。
【図７】 ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−１。
【図８】 予想されたＣＯＬ１Ａ１−１配列。一本下線
の配列はＣＯＬ１Ａ１断片について得られたＮ末端配列
に対応する。二重下線はこの配列を分け合っている。両
断片はＥＡによりＮ末端で延長する。
の配列はＣＯＬ１Ａ１断片について得られたＮ末端配列
に対応する。二重下線はこの配列を分け合っている。両
断片はＥＡによりＮ末端で延長する。
【図９】 ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−２。
【図１０】 予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列。
【図１１】 ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−３。
【図１２】 予想されたＣＯＬ１Ａ１−３* 配列。
【図１３】 予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列中のＭＧ
ＰＲ配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１−１断片につ
いて得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はＭＰＰ
Ｒ配列である。
ＰＲ配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１−１断片につ
いて得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はＭＰＰ
Ｒ配列である。
【図１４】 ＧＡＴＯ４のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染
色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータ
ンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量
94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。左か
ら第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ４を示す。
ル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染
色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータ
ンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量
94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。左か
ら第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ４を示す。
【図１５】 ＧＡＴＯ５のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染
色された。最も右のレーンにおいて、分子量マーカータ
ンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量
94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。右か
ら第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ５を示す。
ル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染
色された。最も右のレーンにおいて、分子量マーカータ
ンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量
94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。右か
ら第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ５を示す。
【図１６】 発現産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリア
ントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分
子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、
バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに
対応する。
クリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリア
ントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分
子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、
バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに
対応する。
【図１７】 ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現
産物ｃｏｌ１Ａ１−１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色
された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータン
パク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量9
4、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
産物ｃｏｌ１Ａ１−１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色
された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータン
パク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量9
4、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【図１８】 ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現
産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色
された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータン
パク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量9
4、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色
された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータン
パク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量9
4、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０３Ｃ 1/015 15/09 1/035 Ｈ Ｇ０３Ｃ 1/015 Ａ６１Ｋ 37/12 1/035 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 ジャン バスティアン ボウストラ オランダ国 ＮＬ−3721 ＡＪ ビルトホ ーヴェン セストディクセウェグ−Ｚ 202 (72)発明者 フレデリック アントン デ ウルフ オランダ国 ＮＬ−3981 ＢＲ ブンニク プリンセス イレーネストラート 16 (72)発明者 アントルアス モーイブレク オランダ国 ＮＬ−6871 ＴＴ レンクム ザンドウェグ ８ (72)発明者 マーク ウィレム セオドア ウェルテン オランダ国 ＮＬ−6702 ＣＲ ワゲニン ゲン グレン ヴァン プリンステラース トラート 129 (72)発明者 リシェル デオダタ ウィンド オランダ国 ＮＬ−6702 ＡＨ ワゲニン ゲン トレルストラウェグ 99 (72)発明者 タンジャ ジャコバ ヴァン デン ボッ シュ オランダ国 ＮＬ−3706 ＡＡ ゼイスト ラーン ヴァン ヴォレンホブ 528 ビス
Claims (53)
- 【請求項１】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上
を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、該乳剤が核
形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプ
タイザーの存在下で成長したハロゲン化銀粒子を有し、
少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製され
た実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイ
ザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配
列を有する、平板状ハロゲン化銀乳剤。 - 【請求項２】 該ペプタイザーが、４個を超え、さらに
10個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有
する請求項１記載の乳剤。 - 【請求項３】 ペプタイザーのアミノ酸配列が、天然コ
ラーゲンと40％を超える相同性を示し、好ましくは50％
を超える相同性を示す請求項１または２記載の乳剤。 - 【請求項４】 ペプタイザーが、コラーゲンに関して天
然に存在するものと同等であるアミノ酸配列を有し、こ
こで同等とは天然に存在するものとアミノ酸同一性が少
なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、最も好まし
くは同一であることを意味する、前記請求項のいずれか
１項記載の乳剤。 - 【請求項５】 ペプタイザーが、天然に存在するものと
実質的に同じアミノ酸配列を有し、ここで実質的とはア
ミノ酸の変異が５個未満、好ましくは３個未満を意味す
る、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項６】 ペプタイザーが、天然コラーゲンをコー
ドする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン
様材料である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項７】 ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、
ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと実質的
に同じアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１
項記載の乳剤。 - 【請求項８】 ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、
ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同等で
あるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項
記載の乳剤。 - 【請求項９】 ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、
ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同じア
ミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の
乳剤。 - 【請求項１０】 コラーゲンタイプＩが、図８、10また
は12またはＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０８０２０のアミ
ノ酸配列を有するか、またはそれである、前記請求項の
いずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項１１】 コラーゲンタイプＩＩＩが、図３また
はＥＭＢＬ寄託番号Ｘ７０−３６９のアミノ酸配列を有
するか、またはそれである、前記請求項１〜８のいずれ
か１項記載の乳剤。 - 【請求項１２】 ペプタイザーがコラーゲンタイプＩに
関して天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列
を有し、ペプタイザーが配列［ＭＬＩＶ］ＸＸＲおよび
好ましくはＭＧＰＲを有さない、前記請求項のいずれか
１項記載の乳剤。 - 【請求項１３】 ペプタイザーが、天然コラーゲンをコ
ードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片であ
り、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有し、
該断片量がアミノ酸をベースとして少なくとも2.5 ｋＤ
ａであるような長さである、前記請求項のいずれか１項
記載の乳剤。 - 【請求項１４】 ペプタイザーがヒドロキシルプリンを
有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項１５】 ペプタイザーが脱アミン化されていな
い、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項１６】 ペプタイザーが等電点７〜10である、
前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項１７】 ペプタイザーがアミノ酸をベースとし
て2.5 〜100 ｋＤａの質量である前記請求項のいずれか
１項記載の乳剤。 - 【請求項１８】 ペプタイザーがプロコラーゲンおよび
テロペプチドを有さない、前記請求項のいずれか１項記
載の乳剤。 - 【請求項１９】 ペプタイザーがらせん構造を有さな
い、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項２０】 ペプタイザーがシステインを有さな
い、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項２１】 ペプタイザーは、該ペプタイザー１グ
ラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜200 マイクロモ
ル、好ましくは0.1 〜120 マイクロモルと等しいレベル
で還元アミノ酸であるメチオニン及びヒスチジンが存在
する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求
項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項２２】 ペプタイザーは、該ペプタイザー１グ
ラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜80マイクロモル
と等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸
化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項
記載の乳剤。 - 【請求項２３】 ペプタイザーは、該ペプタイザー１グ
ラムあたりのメチオニンの還元力30〜80マイクロモルと
等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸
化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項
記載の乳剤。 - 【請求項２４】 ペプタイザーが50ｍＶよりも高い銀へ
の結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳
剤。 - 【請求項２５】 ペプタイザーが100 ｍＶよりも低い銀
への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の
乳剤。 - 【請求項２６】 ペプタイザーが50〜100 ｍＶの銀への
結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳
剤。 - 【請求項２７】 ハロゲン化銀粒子が５を超える平均ア
スペクト比を示す、前記請求項のいずれか１項記載の乳
剤。 - 【請求項２８】 ペプタイザーが、ｐＨ４〜８でのハロ
ゲン化銀平板状粒子形成に対して安定である、前記請求
項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項２９】 平板状粒子を、90％を超えるレベル、
好ましくは95％を超えるレベルで有する、前記請求項の
いずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項３０】 ペプタイザーが均質分散性を有する、
前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項３１】 ペプタイザーが実質的に純粋な形で存
在する、すなわち核酸、多糖類および他のタンパク質を
実質的に有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳
剤。 - 【請求項３２】 乳剤が、写真応用に適するものであ
り、さらに該応用に許容できる化合物、例えば明確に定
義された第二の量の成長ペプタイザーを含有する、前記
請求項のいずれか１項記載の乳剤。 - 【請求項３３】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以
上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤の調製方法であっ
て、該方法が核形成ペプタイザーの存在下でハロゲン化
銀粒子を核化し、その後成長ペプタイザーの存在下で該
ハロゲン化銀粒子を成長させることを有し、両ペプタイ
ザーが一定の量で存在し、少なくとも一つのペプタイザ
ーが遺伝子工学で調製されたコラーゲン様材料であり、
該ペプタイザーは４個を超える異なるアミノ酸を有する
アミノ酸配列を有する、乳剤の調製方法。 - 【請求項３４】 核形成工程で、および／または粒子成
長工程中にペプタイザーを添加することを有し、該ペプ
タイザーが請求項１〜32、52または53のいずれかに開示
された態様のいずれかから選択される、請求項33記載の
乳剤の製造方法。 - 【請求項３５】 核形成工程で、および粒子成長工程中
の双方でペプタイザーを添加することを有する、請求項
33または34記載の乳剤の製造方法。 - 【請求項３６】 核形成工程で、および粒子成長工程中
で同一のペプタイザーを添加することを有する、請求項
33〜35のいずれか１項記載の乳剤の製造方法。 - 【請求項３７】 請求項１〜32のいずれか１項記載の乳
剤を利用すること、または少なくとも一つのハロゲン化
銀乳剤層を用いた写真要素生産のためにそれ自体公知の
方法で適用されるハロゲン化銀乳剤を得るための請求項
33〜36のいずれか１項記載の方法により得られる乳剤を
利用することを有し、該層のハロゲン化銀結晶がアスペ
クト比５以上である、写真要素生産の方法。 - 【請求項３８】 写真要素が、光、レーザーまたはＸ線
照射に感光性のある材料であり、該要素が例えば白黒リ
バーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフィ
ルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分がデ
ジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒紙、
カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタルデ
ータベースからのレーザー照射により感光された紙から
選択される、請求項37記載の方法。 - 【請求項３９】 請求項37または38記載の方法にしたが
って得られる写真要素。 - 【請求項４０】 0.95グラム／リットルを超える程度ま
での微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードす
る核酸配列の発現を有する組換えコラーゲン様ポリペプ
チドの製造方法であって、該組換えコラーゲンがらせん
構造を有さず、好ましくは該発現が大腸菌またはサッカ
ロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起こる、組換え
コラーゲン様ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項４１】 発現が３グラム／リットルを超える、
請求項40記載の方法。 - 【請求項４２】 組換えコラーゲン様ペプチドが請求項
１〜32、52または53に開示された態様のいずれかから選
択される、請求項40または41記載の方法。 - 【請求項４３】 微生物が発現産物を分泌することがで
きる、請求項40〜42のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項４４】 微生物が真菌細胞、好ましくは酵母細
胞である、請求項40〜43のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項４５】 微生物が、コラーゲン様配列を原繊維
へ加工するための活性のある翻訳後プロセス機構を持た
ない、請求項40〜44のいずれ１項記載の方法。 - 【請求項４６】 微生物が、コラーゲン様配列を三重ら
せんへ加工するための活性のある翻訳後プロセス機構を
持たない、請求項40〜45のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項４７】 発現される核酸配列が、プロコラーゲ
ンおよびテロペプチドをコードする配列を有さない、請
求項40〜46のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項４８】 微生物が、ハンセヌラ、トリコデル
マ、アスペルギルスおよび好ましくはピヒア・パストリ
スからなる群から選択される請求項40〜47のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項４９】 組換えコラーゲンが、発現宿主細胞で
活性のあるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位を持た
ないアミノ酸配列を有する、請求項40〜48のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項５０】 発現産物が単離され、他のタンパク
質、多糖類および核酸を実質的に有さなくなるまで精製
される、請求項40〜49のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５１】 発現産物を単離し、核酸の量100 ｐｐ
ｍ未満、多糖類の量５％未満、適切にはＲＮＡの量10ｐ
ｐｍ未満、適切には、最も適切なＤＮＡの量１ｐｐｍ未
満になる程度まで少なくとも精製される、請求項40〜50
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５２】 ペプタイザーが、天然コラーゲンに対
して40％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有し、４
個を超える異なるアミノ酸タイプを有する、遺伝子工学
により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料。 - 【請求項５３】 請求項１〜32のいずれか１項で定義さ
れる組換えコラーゲン化合物。
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