WO2017183710A1 - 多孔質ゼラチンシートの製造方法、多孔質ゼラチンシートおよびその利用 - Google Patents

多孔質ゼラチンシートの製造方法、多孔質ゼラチンシートおよびその利用 Download PDF

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ボクステル ハウベルト アルベルトゥス ファン
セバスティアヌス ヘラルドゥス ヨハンネス マリア クラウトマンス
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フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ
富士フイルム株式会社
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a porous gelatin sheet. Furthermore, the present invention relates to a porous gelatin sheet, its use, and a porous gelatin sheet / cell composite material.
  • Patent Document 1 describes a microcarrier, but does not describe a sheet.
  • Patent Document 2 describes that a gelatin foam having a spherical chamber and a fibrous pore wall is produced using paraffin spheres of 150 ⁇ m or more, but there is no description regarding the size distribution of the chamber.
  • Patent Document 3 describes that a spherical product is produced by a double emulsification method using two kinds of emulsifiers, but a single emulsifier is not used.
  • Patent Document 4 describes a pore structure having a pore size of 100 ⁇ m to 900 ⁇ m.
  • Patent Document 5 describes the production of a porous structure by using three different biocompatible porogens and cells in the emulsification process. The average pore size is described as being greater than 10, 20, 40, 80, 100 or 200 ⁇ m and / or smaller than 500, 300, 200, 100, 80, 40 or 20 ⁇ m. In Patent Document 5, cells are used when producing a porous structure.
  • the following inventions are provided. ⁇ 1> The following steps: (A) mixing a composition comprising water, gelatin, a water-immiscible liquid, and an emulsifier to obtain an emulsion; (B) pouring an emulsion at a temperature higher than the temperature at which gelatin present in the composition forms a gel; (C) cooling the emulsion present on the support to a temperature below the gel point of the gelatin present in the composition; (D) removing water-immiscible liquid from gelatin; and (e) drying the gelatin to provide a porous gelatin sheet, the method for producing a porous gelatin sheet comprising a chamber comprising: Said production method wherein at least half of the chamber is spherical and / or at least half of the chamber has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber and the average diameter of the chamber is less than 100 ⁇ m.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the steps (a) to (e) are steps containing no cells.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the emulsifier has an HLB of 9 or more.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the sheet further comprises a network of pores interconnecting the chambers and providing a passage for cells to enter the chamber.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the porosity of the sheet is at least 50% by volume.
  • the porosity of the sheet is at least 50% by volume, and the sheet includes pores having an average diameter of at least 5 ⁇ m, (I) at least half of the chamber is spherical; and (ii) at least 80% of the chamber has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber;
  • the porosity of the sheet is at least 50% by volume, the sheet includes surface holes having an average diameter of at least 5 ⁇ m, and at least half of the chamber has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber,
  • ⁇ 11> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein at least 50% of the chamber is spherical.
  • ⁇ 12> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the gelatin is a recombinant gelatin.
  • Gelatin is a genetically modified gelatin containing at least two lysine residues, wherein the lysine residue is an end lysine residue, and the first end lysine residue is at the N-terminus of the gelatin
  • the closest lysine residue, the second end lysine residue is the lysine residue closest to the C-terminus of gelatin, and the end lysine residue is at least 25% of the total number of amino acid residues in gelatin
  • the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, which is separated.
  • ⁇ 16> A porous gelatin sheet produced by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>.
  • ⁇ 17> Use of the porous gelatin sheet according to ⁇ 16> as a cell carrier.
  • ⁇ 18> Use of the porous gelatin sheet according to ⁇ 16> as a scaffold for tissue damage repair.
  • ⁇ 19> A composite material comprising the porous gelatin sheet according to ⁇ 16> and living cells.
  • ⁇ 17A> The porous gelatin sheet according to ⁇ 16>, for use as a cell carrier.
  • ⁇ 17B> A method for treating a subject, comprising administering the porous gelatin sheet according to ⁇ 16> to the subject as a cell carrier.
  • ⁇ 18A> The porous gelatin sheet according to ⁇ 16>, for use as a scaffold for tissue damage repair.
  • FIG. 2 is an SEM photograph of a cross-section of a CollaTape (registered trademark) base material available from Zimmer Dental, taken at a magnification of 85 times. The thickness of the sheet in FIG. 2 is 700 ⁇ m.
  • the sheets shown in FIGS. 1a, b and c are precisely flat and include spherical chambers having a uniform chamber size distribution, with at least half of the chambers having a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber.
  • the sheet shown in FIG. 1d includes a spherical chamber, at least half of which is spherical, and at least half of which has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber.
  • chamber (1) in the sheet of FIG. 1d has a more uniform size and shape than the chamber found in the sheet shown in the comparative example shown in FIG.
  • the sheet (comparative example) shown in FIG. 2 includes an irregular, very irregular chamber, which is generally large at the top surface (2a) of the sheet and small at the bottom surface (2b) of the sheet.
  • the sheet of the present invention provides a support for cell culture and provides particularly good cell growth in terms of cell growth rate and number of cells grown.
  • the sheet is plastic, can be folded and can be cut with scissors.
  • the chambers (2a and 2b) present in the commercial sheet shown in FIG. 2 are irregular, irregular, and of diameter compared to the chamber shown in the inventive sheet of FIGS. 1a-1d. The range is extensive.
  • the term “gelatin” includes collagen.
  • the gelatin preferably has an average molecular weight of less than 150 kDa, preferably less than 100 kDa.
  • the gelatin has an average molecular weight of at least 5 kDa, preferably at least 10 kDa, more preferably at least 30 kDa.
  • Preferred ranges for the average molecular weight of the genetically modified gelatin are 50 kDa to 100 kDa, 20 kDa to 75 kDa, and 5 kDa to 40 kDa. Due to the low viscosity of gelatin, lower molecular weights are preferred when high mass concentration gelatin is required.
  • the molecular weight of gelatin may be measured by gel permeation chromatography.
  • Gelatin is preferably genetically modified gelatin.
  • the genetically modified gelatin may be obtained commercially from, for example, FUJIFILM Corporation.
  • the genetically modified gelatin may be prepared by known methods, for example, as described in European patent applications EP0926543 and EP1014176, the contents of which are incorporated herein by reference. Methods for preparing genetically modified gelatin are also described in “High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris”, M. W. T. Werten et al., Yeast 15, 1087-1096 (1999). Suitable genetically modified gelatin is also described in International Publication No. WO 2004/85473.
  • the recombinant gelatin comprises at least two amino acid residues, wherein the two amino residues are extreme amino acid residues (extreme amino acid residues), each of which is Independently, selected from aspartic acid residues and glutamic acid residues, wherein the first aspartic acid residue or glutamic acid residue is the aspartic acid residue or glutamic acid residue closest to the N-terminus of the polypeptide, and the second The terminal aspartic acid residue or glutamic acid residue is the aspartic acid residue or glutamic acid residue closest to the C-terminus of the polypeptide, and the terminal aspartic acid residue and / or glutamic acid residue is At least 25% away from the total number of amino acids in the peptide.
  • extreme amino acid residues extreme amino acid residues
  • the genetically modified gelatin comprises at least one aspartic acid residue and / or glutamic acid residue between the end aspartic acid residue and / or glutamic acid residue.
  • the gelatin has excellent cell adhesion and preferably does not exhibit any health related risks. This is advantageously achieved by using RGD-enriched recombinant gelatin, such as a recombinant gelatin with a percentage of RGD motif of at least 0.4 based on the total number of amino acids.
  • RGD enriched gelatin contains 350 or more amino acids
  • each stretch of 350 amino acids preferably contains at least one RGD motif.
  • the percentage of RGD motif to the total number of amino acids is at least 0.6, more preferably at least 0.8, more preferably at least 1.0, more preferably at least 1.2, Most preferably it is at least 1.5.
  • a percentage of the RGD motif of 0.4 corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids.
  • the number of RGD motifs is an integer, so a gelatin of 251 amino acids should contain at least two RGD sequences in order to fit the 0.4% feature.
  • the RGD enriched genetically modified gelatin comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, most preferably 250 amino acids. Contains at least 4 RGD sequences per.
  • the gelatin is an RGD-enriched gelatin comprising at least 4 RGD motifs, preferably comprising at least 6, more preferably at least 8, even more preferably at least 12 to 16 RGD motifs.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is preferably derived from a collagen sequence. Nucleic acid sequences encoding collagen sequences are generally described in the art. (For example, Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al.
  • a genetically modified gelatin containing a large amount of RGD motif may be prepared, for example, by a general method described in US Pat. No. 2006/0241032.
  • recombinant gelatin containing an amino acid sequence closely related or identical to the amino acid sequence of natural human collagen is preferred. More preferably, the gelatin includes one or more (eg, repetitive) amino acid sequences found in native human collagen, and in particular includes a sequence that includes an RGD motif (to make RGD-enriched recombinant gelatin).
  • the percentage of RGD motifs in such a selected sequence depends on the selected length of the selected sequence, and by selecting a shorter sequence, it is inevitably necessary to select the RGD motif in the final recombinant gelatin. The percentage of becomes higher.
  • the selected amino acid sequence can be used repeatedly to provide a genetically modified gelatin having a molecular weight greater than that of natural gelatin.
  • non-antigenic RGD enriched genetically modified gelatin may be obtained (compared to natural gelatin).
  • the genetically modified gelatin includes a natural human gelatin sequence or a portion thereof.
  • the genetically modified gelatin is RGD-enriched gelatin comprising at least 80% (or consisting of at least 80%) one or more portions of one or more natural human gelatin amino acid sequences.
  • each such portion of the human gelatin sequence has a length of at least 30 amino acids, more preferably at least 45 amino acids, most preferably at least 60 amino acids, eg 240 In the following, the length is preferably 150 or less, most preferably 120 or less, and each part preferably contains one or more RGD sequences.
  • the RGD enriched genetically modified gelatin comprises (or consists of) one or more sites of one or more natural human collagen sequences.
  • An example of a suitable source of genetically modified gelatin that can be used to prepare the sheet of the present invention is human COL1A1-1.
  • a part of 250 amino acids containing the RGD sequence is described in International Publication No. WO 04/85473.
  • RGD sequences in genetically modified gelatin can adhere to specific receptors on the cell surface called integrins.
  • RGD enriched genetically modified gelatin is, for example, a genetic recombination method described in the examples of European Patents EP-A-0926543, EP-A-1014176 or International Publication WO 01/34646, particularly the first two patent publications. You may manufacture by.
  • a preferred method for producing RGD-enriched recombinant gelatin involves starting with a natural nucleic acid sequence that encodes a portion of a collagen protein comprising an RGD amino acid sequence. By repeating this sequence, RGD-enriched recombinant gelatin may be obtained.
  • genetically modified gelatin can be obtained by expressing a nucleic acid encoding such gelatin with a suitable microorganism.
  • This method can be suitably carried out using fungal cells or yeast cells.
  • the host cell is Hansenula, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces, Kluyveromyces, Neurospora or Pichia or Pichia Such as a high expression host cell.
  • Fungi and yeast cells are preferred over bacteria because they are less susceptible to inappropriate expression of repetitive sequences.
  • the host does not have a high level of proteases that attack the expressed gelatin structure.
  • Pichia or Hansenula are examples of highly suitable expression systems.
  • Pichia pastoris as an expression system is disclosed in European Patents EP0926543 and EP1014176.
  • the microorganism may be free of active post-translational processing mechanisms such as specific hydroxylation of proline and hydroxylation of lysine.
  • the host system may have endogenous proline hydroxylation activity that hydroxylates gelatin with high efficiency.
  • genetically modified gelatin has a higher glass transition temperature (Tg) than natural gelatin, for example, Tg is higher than 170 ° C., particularly higher than 180 ° C., even higher than 190 ° C.
  • Tg glass transition temperature
  • Genetically modified gelatin having a higher Tg than natural gelatin is described in International Publication WO 05/11740.
  • the genetically modified gelatin is less glycosylated than the natural gelatin, eg, the glycosylation is less than 2% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight, especially 0.2% by weight. Less than, especially less than 0.1% by weight. In a preferred embodiment, the genetically modified gelatin is not glycosylated.
  • the degree or mass% of glycosylation refers to the total carbohydrate mass per unit mass of gelatin and is measured, for example, by MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry) or by titration with Dubois.
  • the term “glycosylation” refers not only to monosaccharides but also to polysaccharides such as disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides.
  • Glycosylation is a post-translational modification whereby the carbohydrate is covalently linked to a specific amino acid in gelatin.
  • both the amino acid sequence and the host cell in which the amino acid sequence is produced and enzymes, particularly glycosyltransferases) determine the extent of glycosylation.
  • the degree of gelatin glycosylation can be controlled by selecting an appropriate expression host and / or by modifying or selecting sequences lacking the consensus site recognized by the host glycosyltransferase. In particular, it can be reduced or prevented.
  • gelatin can also be used to prepare gelatin without glycosylation.
  • Genetically modified gelatin containing glycosylation may be processed post-production to remove all or most of the carbohydrate, or unglycosylated gelatin may be separated from glycosylated gelatin using known methods. May be.
  • less than 10%, more preferably less than 5% of the amino acid residues of gelatin are hydroxyproline residues.
  • the gelatin does not contain a hydroxyproline residue. It is also preferred that the gelatin does not contain hydroxylated amino acid residues.
  • the sheets of the present invention are spherical at least half of the chamber and / or at least half of the chamber has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber.
  • the average diameter of the chamber in the sheet of the present invention is less than 100 ⁇ m.
  • the sheet further comprises a network of holes interconnecting the chambers and providing a passage for viable cells to enter the chamber.
  • the network of holes is connected to at least one other chamber in which at least half (at least 50%), more preferably at least 75%, in particular at least 90% of the chamber is present in the sheet.
  • the chamber includes a porous wall (eg, a wall containing holes) through which cells may enter, for example through the pore network described above, and capable of nutrient diffusion.
  • a porous wall eg, a wall containing holes
  • the average diameter of the holes and holes in the chamber wall is at least 1 ⁇ m, more preferably at least 5 ⁇ m.
  • the gelatin present in the sheet of the present invention preferably provides a scaffold that defines the walls of the chamber and the walls of the pores. Cells or pharmaceutical substances may enter the chamber through the pores.
  • a perfect sphere is defined by an aspect ratio of 1: 1 and a single radius.
  • the spherical chamber of the present invention is generally spherical and may have an irregular shape as long as it has mostly concave walls.
  • the aspect ratio of the chamber is preferably 1: 1 to 4: 1, preferably 1: 1 to 3: 1, in particular 1: 1 to 2: 1.
  • the spherical chamber preferably has a spherical cross-section (eg, soccer ball-like), an elliptical cross-section (eg, rugby ball-like), and even a potato-shaped chamber.
  • steps (a) to (e) are preferably steps not containing cells. That is, the method according to the preferred embodiment of the present invention is characterized in that it does not contain cells (cell-free).
  • the pH of the composition used in step (a) is preferably in the range of 3 to 11, more preferably 4 to 8.
  • the composition used in step (a) comprises an emulsifier having a hydrophilic / lipophilic balance (“HLB”) of 9 or more, in particular 10 or more, in particular 13-19. Two or more of such emulsifiers may be used. Examples of suitable emulsifiers include the following:
  • Enzymatic cross-linking agents such as transglutaminase are also useful.
  • the crosslinker may have more than two functional groups, for example, cyanuric chloride (trifunctional group), and compounds containing two epoxides and one anhydride group.
  • Such crosslinkers typically react with amine groups and / or sulfhydryl groups present in the amino acids of gelatin.
  • each stretch of 50 amino acids present in gelatin comprises at least 1, preferably at least 2, lysine residues, or at least 1, preferably at least 2 It contains aspartic acid or glutamic acid residues, or contains at least one lysine residue and at least one aspartic acid or glutamic acid residue.
  • each stretch of 40 amino acids present in gelatin is at least one lysine residue and / or at least one aspartic acid or glutamic acid residue. including.
  • the gelatin comprises crosslinkable amino acid residues that are not adjacent to each other, for example, at least 5, more preferably at least 10, noncrosslinkable amino acid residues separated by non-crosslinkable amino acid residues.
  • the crosslinkable amino acid residues may contain primary amine groups (in addition to primary amine groups typically used to form amide bonds in protein backbones), -SH and / or carboxylic acid groups ( In addition to the carboxylic acid groups typically used to form amide bonds in the protein backbone.
  • the gelatin is cross-linked by a method comprising contacting the gelatin with 0.02-1.0 mmol of cross-linking agent per gram of gelatin.
  • 0.02-1.0 mmol of cross-linking agent per gram of gelatin.
  • about 0.02, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0 per gram of gelatin. 3.0, 4.0 and 5.0 mmol crosslinkers may be used.
  • the number of crosslinkable amino acid residues can be utilized along with the amount of crosslinking compound used.
  • the large number of crosslinkable residues and / or the high concentration of the crosslinkable compound can provide a sturdy sheet that is particularly useful for applications exposed to mechanical stress. It is possible to obtain a sheet that is more easily deformable and particularly suitable for minimally invasive delivery techniques and pharmaceutical applications by reducing the number of crosslinkable amino acid residues and / or by reducing the concentration of the crosslinking compound. it can.
  • thermal dehydration crosslinking is preferred because it avoids the possibility of chemical contamination of gelatin.
  • the degree of crosslinking also affects the time required for dissolution or degradation of the gelatin sheet in the body. Thus, it is possible to control the dissolution or decomposition rate of the sheet for the desired application.
  • the volume: volume ratio of water: water immiscible liquid is preferably in the range of 5: 1 to 1:10, more preferably 1: 1 to 1: 5, especially 2. : 3 to 1: 3.
  • the composition used in step (a) (and the resulting emulsion) is preferably 1 to 15%, more preferably 1.5 to 10%, especially 3 to 5% by weight of gelatin; 10 to 70% by weight of water, more preferably 20 to 50% by weight, especially 30 to 40% by weight of water; 20 to 90% by weight, more preferably 40 to 80% by weight, especially 50 to 70% by weight of a water-immiscible liquid; and 0.5 to 20% by weight, more preferably 1 to 10% by weight, in particular 2 to 6%.
  • Step (a) is preferably carried out at a temperature in the range of 10 to 100 ° C., more preferably 20 to 80 ° C., in particular 30 to 60 ° C.
  • the mixing performed in step (a) may be performed by any suitable method such as shaking or stirring.
  • the mixing is carried out by stirring, particularly when using a dissolver type stirrer, especially at a speed of 20 to 5,000 revolutions per minute (“rpm”), more preferably 200 to 1,000 rpm, especially This is done by stirring at a speed of 250 to 600 rpm.
  • step (b) the resulting emulsion is poured onto a support at a temperature at which the gelatin present in the composition is not in the form of a gel; for example, the emulsion used in step (b) It has a temperature at least 3 ° C., more preferably at least 5 or 10 ° C. above the gel point of the gelatin present.
  • the support may be, for example, a non-porous mold (for example, made of Teflon (registered trademark) or a plastic material) or a flat non-porous sheet (for example, a glass plate).
  • the cooling performed in the step (c) may be passive or active.
  • passive cooling may be provided simply by allowing the emulsion to naturally cool to a temperature at which the gelatin present in the composition solidifies / gels. Cooling is provided using a cooling means that reduces the temperature (eg, by placing ice, cold water, or the product of step (b) in the refrigerator) at or without a controlled cooling rate. May be. Active cooling is useful for adjusting the final sheet properties.
  • step (c) is carried out so that the emulsion is cooled at a rate of 0.1 to 20 ° C./min, more preferably at a rate of 1 to 10 ° C./min.
  • a cooling rate can provide a sheet having particularly useful properties.
  • the preferred cooling rate is 1.8 ° C./min.
  • the resulting sheet will have a final temperature of 6 ° C.
  • the cooling rate may be linear or non-linear.
  • the water-immiscible liquid may be removed from the gelatin, for example by washing the gelatin with a solvent having a lower boiling point than the water-immiscible liquid, such as corn oil (high boiling point ) May be washed away with acetone (low boiling point).
  • a solvent having a lower boiling point than the water-immiscible liquid such as corn oil (high boiling point ) May be washed away with acetone (low boiling point).
  • the liquid used to wash away the water immiscible liquid will then volatilize due to its relatively low boiling point.
  • the drying method used is not critical and includes, for example, drying in an oven, blowing hot air, vacuum drying, and simply natural drying of the resulting sheet.
  • the method of the invention is performed under aseptic conditions.
  • the method according to the second aspect of the present invention preferably has the following characteristics: (I) The composition used in step (a) is: 3-5% by weight gelatin; 30-40% by weight of water; 50 to 70% by weight of a water immiscible liquid; and 2 to 6% by weight of an emulsifier; (Ii) mixing in step (a) is carried out by stirring at a speed of 250-600 revolutions per minute; (Iii) In step (a), the volume to volume ratio of the water to water immiscible liquid is in the range of 2: 3 to 1: 3; (Iv) the emulsion poured onto the support in step (b) has a temperature above the gel point of gelatin present in the composition; (V) Preferably step (c) is carried out so that the emulsion present on the support cools at a rate of 1-10 ° C./min; (Vi)
  • the method further comprises the step of
  • the gelatin sheet of the first aspect of the present invention has one or more of the following characteristics: (A) the surface pores have a minimum average diameter of at least 1 ⁇ m, such as at least 3 ⁇ m, even more preferably at least 5 ⁇ m; (B) the porosity is at least 50% by volume, for example 51 to 95% by volume, in particular 60 to 90% by volume; (C) the density is 0.04 to 0.50 g / cm 3 , for example 0.06 to 0.25 g / cm 3 , in particular 0.1 to 0.2 g / cm 3 ; (D) the volume is 2 to 25 cm 3 / g, such as 4 to 17 cm 3 / g, in particular 5 to 10 cm 3 / g; (E) the average diameter of the chamber is less than 100 ⁇ m, preferably at least 80% of the chamber has a diameter of ⁇ 30% of the average diameter of the chamber; and (f) a network of holes interconnects the chambers; Preferably, the
  • the average diameter of the chambers and holes was determined by analysis of scanning electron micrographs (eg, using Joel JSM 6330F), and a Skyscan 1172 MicroCT instrument (Brucker with Microcomputer Tomography (CT) (VGStudio MAX2.2 software). You may measure by manufacture)).
  • scanning electron micrographs eg, using Joel JSM 6330F
  • CT Microcomputer Tomography
  • P is the average porosity of the sheet
  • pvl is the average total spatial volume inside the sheet
  • V is the average total volume of the sheet.
  • pvl may be measured by micro CT measurement (eg, using a Skyscan 1172 MicroCT apparatus (manufactured by Bruker)) or by mercury intrusion (applicable when the holes are interconnected).
  • the gelatin sheet of the present invention preferably has one or more of the above-mentioned features (a) to (f) and / or has one or more of the following features.
  • the porous gelatin sheet may be obtained by the method described above.
  • the above features (a) to (f) apply to both the crosslinked and non-crosslinked sheets of the present invention.
  • the method described above may be used to provide a gelatin sheet having a three-dimensional structure that differs significantly from currently available film feet. More specifically, the method described above can be used to provide a porous gelatin sheet as described in the first aspect of the invention.
  • a composite material comprising a porous gelatin sheet and living cells according to the first aspect of the present invention.
  • living cells are present in the chamber and / or in the pores of the sheet of the invention, particularly in the chamber.
  • the composite material further comprises one or more nutrients for living cells.
  • a living cell is a cell that is capable of proliferating when given nutrients under conditions normally present in the human or animal body from which it is derived or will be used.
  • the composite material of the present invention may be prepared by culturing the sheet of the present invention together with desired cells.
  • the specific nutrients used for cell proliferation are typically selected to be compatible with the cells being grown.
  • Numerous nutritional products are commercially available, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Basal Medium Eagle (BME), DMEM / F12 medium, Ham F-10 and F-12 medium, medium 199, MEM, Ames medium, BGJb medium (Fitton-Jackson modified), Click medium, CMRL-1066 medium, Fischer medium, Glasgow minimal essential medium (GMEM), Iskov modified Dulbecco medium (IMDM), L-15 medium (Leibovitz), McCoy 5A modified medium, NCTC medium, Examples include Swim S-77 medium, Weymouth medium, William medium E and RPMI 1640 medium.
  • the sheets and composites of the first and third aspects of the present invention can be used in a number of applications, for example as a cell carrier for regenerative medicine therapy or as a scaffold for tissue damage repair.
  • the sheet of the first aspect is fused with a living cell to provide the composite material according to the third aspect of the present invention, for supplying or culturing artificial skin, artificial organs, adipose tissue, muscles, blood vessels and the like.
  • Sheets and composites can be used as cell carriers in cell culture and as cell carriers present to produce the desired substance before or after implantation into the human or animal body.
  • the cells may be cells of the host itself (autologous) or cells of other origin (characteristic or foreign species). In some cases, the cells themselves can be the desired product, for example, early stage adipocytes (preadipocytes) attached on a carrier that can proliferate after transplantation for later conversion to adipocytes. ).
  • the sheets and composites of the present invention are particularly useful in the field of plastic surgery and also in toxicity and drug screening assays.
  • the sheet according to the first aspect of the present invention may form colonies with viable cells suitable for use for toxicity or drug screening.
  • the sheet of the present invention advantageously organizes cells in a more natural spatial structure, which is typical of cell organization found in living organisms. It is also possible to transplant the sheet according to the invention into the human or animal body without first fusing it with living cells. After the sheet is transplanted into the human or animal body, adjacent cells in the body settle into, for example, chambers and / or holes and then proliferate to migrate into the sheet and form colonies. After the transplanted sheet has been lysed, the cells that have formed colonies will form a structure corresponding to the transplant.
  • RG1 is a 10% by weight solids aqueous composition having a pH of 5.4 and comprising RGD enriched genetically modified gelatin (MWT: 51.2 kDa) having the sequence shown below as SEQ ID NO: 1 Means.
  • This RGD-enriched recombinant gelatin was produced by modifying this nucleic acid sequence based on a nucleic acid sequence encoding a part of the gelatin amino acid sequence of human COLlAl-I.
  • the method used is disclosed in European patents EP-A-0926543, EP-A-1014176 and international patent WO01 / 34646.
  • RG1 does not contain hydroxyproline and contains the following amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Example 1 Step (a) Preparation of First Emulsion
  • RG1 15 g, 10 wt% solids
  • Tween® 80 1.0 g
  • the mixture contained water from RG1 (90% by weight water).
  • a water immiscible liquid corn oil, 30 ml
  • stirring was continued for another 3 minutes at 550 rpm to obtain a first emulsion.
  • Step (b) Preparation of coating The first emulsion was further cast at 60 ° C. onto glass plates to various thicknesses.
  • Step (c) Cooling of the coating Glass plates coated with various thicknesses of the first emulsion were cooled in a refrigerator at 4 ° C. for 30 minutes to solidify RG1 as a porous gelatin sheet on the glass plate.
  • Step (d) Removal of Water Immiscible Liquid
  • a glass plate with a porous gelatin sheet was transferred to a cooled acetone bath. The sheet was washed several times with fresh acetone until water and corn oil were removed from the sheet. The sheet was then dried in an oven at 60 ° C.
  • Optional step (e) The sheet obtained in the crosslinking step (d) was crosslinked by thermal dehydration as follows to obtain a crosslinked porous gelatin sheet: the dried sheet obtained in step (d) Was placed in a Binder VD53 vacuum stove at a temperature of 145 ° C. under vacuum for 96 hours.
  • Example 2 Example 2 was repeated except for the changes shown in Table 2 below.
  • the properties of the resulting sheet are shown in Table 3:
  • the sheets FS1 to FS4 and the sheet of Comparative Example 1 were analyzed by SEM. SEM photographs of the sheets FS1, FS2, and FS3 are shown in FIGS. 1a, 1b, and 1c, respectively, and an SEM photograph of Comparative Example 1 is shown in FIG.
  • the C2C12 cells obtained above were placed at a density of 5 ⁇ 10 5 cells per circular sheet on a circular sheet FS1 having a diameter of 5 mm and a sheet used in the comparative example (CollaTape (registered trademark) of Zimmer Dental).
  • the seeding was carried out by the dynamic shaking method.
  • a sheet to be evaluated is placed in a suspension of C2C12 cells, the mixture is rotated at 200 rpm for 4 hours, and then the sheet to be evaluated is cultured in a cell culture in DMEM containing 10% FBS. Moved to plate. Thereafter, the cells were cultured for 7 days in DMEM containing 10% FBS in the presence of the sheet to be evaluated. Thereafter, the amount of living cells present in the sheet to be evaluated was measured by DNA quantification (CyQuant pico green assay). The results are shown in Table 4:

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Abstract

本発明の課題は、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートの製造方法、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートおよびその利用を提供することである。本発明によれば、チャンバーを含む多孔質ゼラチンシートであって、上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有し、チャンバーの平均直径が１００μｍ未満であるシートの製造方法が提供される。

Description

多孔質ゼラチンシートの製造方法、多孔質ゼラチンシートおよびその利用
　本発明は、多孔質ゼラチンシートの製造方法に関する。さらに、本発明は、多孔質ゼラチンシート、その使用、多孔質ゼラチンシート・細胞複合材料に関する。
　ヒトや動物の体が傷害を受けた場合、小規模な組織損傷であれば、通常は自身の（本来備わっている）修復機構により修復することができる。しかしながら、心筋梗塞や外傷等の重度の組織損傷を伴う傷害は、しばしば身体の再生能力を超える。重度の組織損傷の場合には、組織修復を支援する処置が必要である。
　特許文献１には、マイクロキャリアが記載されているが、シートの記載はない。
　特許文献２には、１５０μｍ以上のパラフィン球状物を使用して、球状チャンバーと繊維状の孔壁を有するゼラチンフォームを製造することが記載されているが、チャンバーのサイズ分布に関する記載はない。
　特許文献３には、２種の乳化剤を用いて二重乳化法により球状物を製造することが記載されているが、単一の乳化剤を使用するものではない。
　特許文献４には、１００μｍ～９００μｍの孔サイズを有する孔構造が記載されている。
　特許文献５には、乳化工程において３種の異なる生体適合性ポロゲンと細胞を使用することによって多孔質構造を製造することが記載されている。平均孔径は１０、２０、４０、８０、１００または２００μｍより大きく、および／または５００、３００、２００、１００、８０、４０または２０μｍより小さいことが記載されている。特許文献５においては多孔質構造を製造する際に細胞が使用されている。
ＷＯ２０１６／０６３９３５ ＵＳ２００８／２１３５６４ ＷＯ０３／１０４３１３ ＷＯ２０１４／１９５８６４ ＵＳ２０１４／１６１８４３
　広範囲の組織傷害から生じる問題の１つは、生じた空間または穴をどのように閉じるかまたは埋めるかということである。この問題を考慮して、組織が欠損している空間または穴に詰める（半）永久的な充填材として、足場を使用することができる。また、足場は、増殖因子や薬品等を放出するため、または細胞を送達するための、徐放用の貯蔵場所として使用することもできる。身体に注入または移植する前に、所望の細胞を足場に事前に播種することにより、細胞送達を行うことができる。
　本発明は、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートの製造方法、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートおよびその利用を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らの研究において、例えば空間を詰めるための足場または充填材として、傷の修復に使用し得る良好な細胞増殖性を有する多孔質シートの製造を試みた。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の第１の側面において定義されるシートが、後述する通り、特に良好な細胞増殖性を有することを見出した。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　以下の工程：
（ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、および乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
（ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
（ｃ）支持体上に存在するエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
（ｄ）ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
（ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程
を含む、チャンバーを含む多孔質ゼラチンシートの製造方法であって、
上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有し、チャンバーの平均直径が１００μｍ未満である、上記の製造方法。
＜２＞　工程（ａ）～（ｅ）が細胞を含まない工程である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　乳化剤のＨＬＢが９以上である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞　上記シートが、チャンバーを相互接続し、細胞がチャンバーに入る通路を提供する孔のネットワークをさらに含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞　上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞　上記シートの孔の平均直径が少なくとも５μｍである、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞　上記シートの密度が０．０４～０．５ｇ／ｃｍ3である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞　上記シートの体積が２～２５ｃｍ3／ｇである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞　上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、上記シートが平均直径が少なくとも５μｍである孔を含み、
（ｉ）上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり；および
（ｉｉ）チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、
＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞　上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、上記シートが平均直径が少なくとも５μｍである表面孔を含み、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞　チャンバーの少なくとも５０％が球状である、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。
＜１２＞　ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載の方法。
＜１３＞　ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法。
＜１４＞　ゼラチンが、少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の方法。
＜１５＞　ゼラチンが、少なくとも２個のリシン残基を含む遺伝子組み換えゼラチンであり、上記リシン残基が端のリシン残基であって、第１の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチンのアミノ酸残基の総数の少なくとも２５％離れている、＜１＞から＜１４＞の何れか一に記載の方法。
＜１６＞　＜１＞から＜１５＞の何れか一に記載の方法により製造される多孔質ゼラチンシート。
＜１７＞　＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートの、細胞キャリアとしての使用。
＜１８＞　＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートの、組織損傷修復のための足場としての使用。
＜１９＞　＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートおよび生細胞を含む、複合材料。
＜１７Ａ＞　細胞キャリアとしての使用するための、＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシート。
＜１７Ｂ＞　＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートを細胞キャリアとして対象に投与することを含む、対象の処置方法。
＜１８Ａ＞　組織損傷修復のための足場として使用するための、＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシート。
＜１８Ｂ＞　　＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートを組織損傷修復のための足場として対象に投与することを含む、組織損傷の修復方法。
　本発明による多孔質ゼラチンシートの製造方法によれば、一段階の乳化工程のみで多孔質ゼラチンシートを製造することができる。
図１ａ～１ｄは、本発明のシートの断面の走査型電子顕微鏡（「ＳＥＭ」）写真である。 図２は、市販のＺｉｍｍｅｒ　ＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標）の断面のＳＥＭ写真である（比較例）。
　図１ａは、本発明のシートの断面を、３５０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ａのシートの厚さは１４０μｍである。
　図１ｂは、本発明のシートの断面を、７０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｂのシートの厚さは９００μｍである。
　図１ｃは、本発明のシートの断面を、２５倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｃのシートの厚さは２５００μｍである。
　図１ｄは、本発明のシートの断面を、６５０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｄのシートの厚さは１４０μｍである。
　図２は、Ｚｉｍｍｅｒ　Ｄｅｎｔａｌより市販されているＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標）基材の断面を、８５倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図２のシートの厚さは７００μｍである。
　図１ａ、ｂおよびｃに示すシートは精密に平坦であり、均一なチャンバーサイズ分布を有する球状のチャンバーを含み、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。
　図１ｄに示すシートは球状のチャンバーを含み、その少なくとも半分は球状であり、かつ、その少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。
　図１ｄのシートにおけるチャンバー（１）は、図２に示す比較例に示すシートに見られるチャンバーよりも、均一なサイズおよび形状を有することに注目すべきである。
　図２に示すシート（比較例）は、不定形の非常に不規則なチャンバーを含み、チャンバーは一般にシートの上面（２ａ）では大きく、シートの底面（２ｂ）では小さい。
　本発明のシートは、細胞培養のための支持体を提供し、細胞成長速度および成長した細胞数の点で特に良好な細胞増殖を提供する。
　好ましくは、シートは可塑性であり、折り畳むことができ、ハサミで切ることが可能である。
　このように、図２に示す市販のシートに存在するチャンバー（２ａおよび２ｂ）は、図１ａ～１ｄの本発明のシートに示すチャンバーと比較して、不規則で、不定形であり、直径の範囲が広範である。
　本明細書に使用される用語「ゼラチン」は、コラーゲンを含む。ゼラチンは、好ましくは平均分子量が１５０ｋＤａ未満であり、好ましくは１００ｋＤａ未満である。好ましくは、ゼラチンは、平均分子量が少なくとも５ｋＤａであり、好ましくは少なくとも１０ｋＤａであり、より好ましくは少なくとも３０ｋＤａである。遺伝子組み換えゼラチンの平均分子量の好ましい範囲は、５０ｋＤａ～１００ｋＤａ、２０ｋＤａ～７５ｋＤａ、および５ｋＤａ～４０ｋＤａである。ゼラチンの粘度が低いため、高い質量濃度のゼラチンが求められる場合は、より低い分子量が好ましい。ゼラチンの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定してもよい。
　ゼラチンは、好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンである。遺伝子組み換えゼラチンは、例えば富士フイルム（株）より、商業的に入手してもよい。遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、欧州特許出願ＥＰ０９２６５４３号およびＥＰ１０１４１７６号に記載されたような、公知の方法で調製してもよく、これらの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。遺伝子組み換えゼラチンを調製する手法は「High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris」, M. W. T. Werten et al., Yeast 15, 1087-1096 (1999)にも記載されている。好適な遺伝子組み換えゼラチンは、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号にも記載されている。
　１つの態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも２個のリシン残基を含み、上記リシン残基は端のリシン残基(extreme lysine residues)であって、第１の端のリシン残基は、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基は、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基は、ゼラチンのアミノ酸の総数の少なくとも２５％離れている。このような遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、米国特許ＵＳ２００９／０２４６２８２号に記載の方法で得てもよい。
　本発明のさらなる態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、上記２個のアミノ残基は、端のアミノ酸残基(extreme amino acid residues)であって、それらは、それぞれ独立に、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から選択され、第１のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、第２の端のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、上記端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基は、遺伝子組み換えゼラチンポリペプチドのアミノ酸の総数の少なくとも２５％離れている。
　さらに、他の態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも１個のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基を、上記端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基の間に含む。
　好ましい態様では、ゼラチンは、優れた細胞接着性を有し、好ましくは、いかなる健康関連のリスクをも示さない。このことは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチン、例えば、アミノ酸の総数に対して、ＲＧＤモチーフのパーセンテージが少なくとも０．４である遺伝子組み換えゼラチンを使用することにより、有利に達成される。ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０個以上のアミノ酸を含む場合、３５０個のアミノ酸の各ストレッチは、好ましくは少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含有する。好ましくは、アミノ酸の総数に対するＲＧＤモチーフのパーセンテージは、少なくとも０．６であり、より好ましくは少なくとも０．８であり、より好ましくは少なくとも１．０であり、より好ましくは少なくとも１．２であり、最も好ましくは少なくとも１．５である。
　ＲＧＤモチーフのパーセンテージの０．４は、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも１個のＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、従って、０．４％という特徴に適合するためには、２５１個のアミノ酸よりなるゼラチンは、少なくとも２個のＲＧＤ配列を含むべきである。好ましくは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも２個のＲＧＤ配列を含み、より好ましくは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも３個のＲＧＤ配列を含み、最も好ましくは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも４個のＲＧＤ配列を含む。
　さらなる態様では、ゼラチンは少なくとも４個のＲＧＤモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンであり、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも８個、さらにより好ましくは少なくとも１２個から１６個までのＲＧＤモチーフを含む。
　本発明に使用される遺伝子組み換えゼラチンは、好ましくはコラーゲン配列に由来する。コラーゲン配列をコードする核酸配列は、当技術分野において一般的に記載されている。（例えば、Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61 : 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48 ; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; およびAla-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516参照）。
　ＲＧＤモチーフを多く含む遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、米国特許ＵＳ２００６／０２４１０３２号に記載されている一般的な方法により調製してもよい。
   医薬および医療用途には、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸配列と近縁または同一のアミノ酸配列を含む、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。より好ましくは、ゼラチンは、天然ヒトコラーゲンに見られる１以上の（例えば、反復）アミノ酸配列を含み、特に、（ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを作るために）ＲＧＤモチーフを含むような配列を含む。このような選択された配列中のＲＧＤモチーフのパーセンテージは、選択された配列の選択された長さによって決まり、より短い配列を選択することにより、必然的に、最終的な遺伝子組み換えゼラチン中のＲＧＤのパーセンテージがより高くなる。天然ゼラチンより分子量の大きい遺伝子組み換えゼラチンを提供するため、選択されたアミノ酸配列を反復使用することができる。さらに、（天然ゼラチンと比較して）非抗原性のＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを得てもよい。
　このように、好ましい態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然のヒトゼラチン配列またはその一部を含む。好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、１以上の天然のヒトゼラチンアミノ酸配列の１以上の部分を少なくとも８０％含む（または少なくとも８０％よりなる）ＲＧＤエンリッチゼラチンである。好ましくは、ヒトゼラチン配列のこのような部分は、それぞれ、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも４５個のアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも６０個のアミノ酸の長さを有し、例えば２４０個以下、好ましくは１５０個以下、最も好ましくは１２０個以下の長さであって、それぞれの部分は、好ましくは１以上のＲＧＤ配列を含有する。好ましくは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、１以上の天然のヒトコラーゲン配列の１以上の部位を含む（またはそれらよりなる）。
　本発明のシートを調製するために使用し得る遺伝子組み換えゼラチンの好適な起源の例は、ヒトCOL1A1-1である。ＲＧＤ配列を含む２５０個のアミノ酸の一部は国際公開ＷＯ０４／８５４７３号に記載されている。遺伝子組み換えゼラチン中のＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞表面上の特異的なレセプターに接着することができる。
　ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、欧州特許ＥＰ－Ａ－０９２６５４３号、ＥＰ－Ａ－１０１４１７６号または国際公開ＷＯ　０１／３４６４６号、特に最初の２つの特許公報の実施例に記載された遺伝子組み換え方法により製造してもよい。ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンの好ましい製造方法は、ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列を用いて開始することを含む。この配列を繰り返すことにより、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを得てもよい。
　このように、遺伝子組み換えゼラチンは、好適な微生物によってそのようなゼラチンをコードする核酸を発現させることにより、得ることができる。この方法は、真菌細胞または酵母細胞を用いて好適に実施することができる。好適には、宿主細胞は、ハンゼヌラ（Hansenula）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、アカパンカビ（Neurospora）またはピチア（Pichia）のような、高発現宿主細胞である。真菌および酵母細胞は、反復配列の不適切な発現の影響を受け難いため、細菌より好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されたゼラチン構造を攻撃するプロテアーゼを高レベルで有さない。この点において、ピチア（Pichia）またはハンゼヌラ（Hansenula）は非常に好適な発現系の例である。発現系として、ピチアパトリス（Pichia pastoris）の使用が、欧州特許ＥＰ０９２６５４３号およびＥＰ１０１４１７６号に開示されている。この微生物は、プロリンの特定の水酸化およびリシンの水酸化等の、能動的な翻訳後プロセシング機構がなくともよい。代わりに、宿主系は、ゼラチンを高い効率で水酸化する、内因性のプロリン水酸化活性を有してもよい。
　別の態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンよりガラス転移温度（Ｔｇ）が高く、例えばＴｇは１７０℃より高く、特に１８０℃より高く、さらには１９０℃より高い。天然ゼラチンよりＴｇが高い遺伝子組み換えゼラチンは、国際公開ＷＯ　０５／１１７４０号に記載されている。
　さらなる態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンよりグリコシル化が少なく、例えば、グリコシル化は２質量％未満、好ましくは１質量％未満、より好ましくは０．５質量％未満、特に０．２質量％未満、とりわけ０．１質量％未満である。好ましい態様では、遺伝子組み換えゼラチンはグリコシル化されない。
　グリコシル化の程度または質量％は、ゼラチンの単位質量当たりの総炭水化物質量を言い、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry）により、またはデュボア（Dubois）による滴定法により測定される。「グリコシル化」という用語は、単糖だけでなく、多糖、例えば、二糖、三糖および四糖にも言及する。
　ゼラチンにグリコシル化が少ないか、存在しないことを確認する、種々の方法がある。グリコシル化は翻訳後修飾であり、それにより、炭水化物がゼラチンの特定のアミノ酸に共有結合する。従って、アミノ酸配列およびアミノ酸配列が産生される宿主細胞（および酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼ）の両者がグリコシル化の程度を決定する。２種類のグリコシル化があり、Ｎ－グリコシル化は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）のアミド基に、ＧｌｃＮＡｃ （Ｎ－アセチルグルコサミン）を結合することより始まり、Ｏ－グリコシル化は、通常、アミノ酸のセリン（ＳまたはＳｅｒ）またはスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）にＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）を結合する。
　従って、適切な発現宿主を選択することにより、および／または、宿主のグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるコンセンサス部位を欠如する配列を修飾または選択することにより、ゼラチンのグリコシル化の程度を制御することができ、特に、低下させるか、または防止することができる。
　ゼラチンの化学合成もまた、グリコシル化のないゼラチンを調製するために用いることができる。グリコシル化を含む遺伝子組み換えゼラチンを生成後に処理して、炭水化物の全部または大部分を除去してもよいし、またはグリコシル化されていないゼラチンを既知の方法を用いてグリコシル化されたゼラチンから分離してもよい。
　さらに好ましい態様では、ゼラチンのアミノ酸残基の１０％未満、より好ましくは５％未満がヒロドキシプロリン残基である。好ましくは、ゼラチンはヒロドキシプロリン残基を含まない。また、ゼラチンがヒドロキシル化されたアミノ酸残基を含まないことも好ましい。
　別の態様では、ゼラチンは、等電点が少なくとも５（例えば、５～１１）であり、好ましくは６より高く、最も好ましくは７より高い。上記の等電点の目的は、生理学的条件下で正味の正電荷を有するゼラチンを提供することである。あらゆる理論に拘泥することなく、本発明のシートを創傷修復に使用する場合、正味の正電荷は、細胞のシートへの誘引、相互作用および結合を助け、それによって細胞増殖を増進させると考えられる。
　本発明のシートは、チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。本発明のシートにおけるチャンバーの平均直径は１００μｍ未満である。
　好ましくは、シートは、チャンバーを相互接続し、生細胞がチャンバーに入る通路を提供する孔のネットワークをさらに含む。好ましくは、孔のネットワークは、チャンバーの少なくとも半分（少なくとも５０％）、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも９０％が、シート中に存在する少なくとも１つの他のチャンバーと連結している。
　好ましくは、チャンバーは、例えば上記の孔のネットワークを通って、細胞が入ってもよく、栄養素の拡散が可能な、多孔性の壁（例えば、穴を含む壁）を含む。好ましくは、チャンバー壁の孔および穴の平均直径は、少なくとも１μｍであり、より好ましくは少なくとも５μｍである。
　好ましくはチャンバーの少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％は、直径が、チャンバーの平均直径の±３０％以内（すなわち、チャンバーの平均直径の７０～１３０％）である。
　好ましくはチャンバーの少なくとも７５％、特に少なくとも８０％が球状である。
　好ましくはチャンバーの少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％は、凹面の壁を有する。
　チャンバーの平均直径は、１００μｍ未満であり、好ましくは９５μｍ以下であり、より好ましくは９０μｍ以下である。
　このように、本発明のシートに存在するゼラチンは、好ましくは、上記チャンバーの壁および孔の壁を定める、足場を提供する。細胞または薬学的物質は孔を通ってチャンバーに入ってもよい。
　完全な球はアスペクト比が１：１であり、半径が単一であることで定義される。本発明の球状のチャンバーは、概して球状であり、大部分が凹面の壁を有する限り、不規則な形状を有していてもよい。チャンバーのアスペクト比は、好ましくは１：１～４：１であり、好ましくは１：１～３：１であり、特に１：１～２：１である。このように、球状のチャンバーは、好ましくは球形の(spherical)横断面（例えばサッカーボール様）を有し、楕円の横断面（例えばラグビーボール様）、さらにはジャガイモ形状のチャンバーも可能である。
　ゼラチンシートは、ゼラチンに加えて、他のポリマー、生分解性ポリマー、バイオポリマー、軟化剤等の他の成分を含んでもよい。
　本発明のゼラチンシートは、基質または型の形態に依存するあらゆる形状のものであってもよい。本発明のプロセスは、ガラスまたはテフロン（登録商標）プレートを使用する平坦なシートの製造に、特に好適である。従って、本発明のシートは、好ましくは平坦なフィルムまたはシートである。
　本発明のシートは、好ましくは厚さが２０μｍ～２ｃｍであり、より好ましくは５０μｍ～１ｃｍであり、特に７５μｍ～３００μｍである。
　本発明のシートの最大面の断面積は、好ましくは少なくとも０．１ｃｍ2であり、より好ましくは少なくとも１ｃｍ2であり、特に少なくとも１００ｃｍ2である。
　本発明のシートは、あらゆる好適な方法で製造してもよく、例えば、以下の工程を含む、本発明の第２の側面を提供する方法によって製造してもよい：
（ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、および乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
（ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度（すなわち、ゼラチンのゲル化点より高い温度）のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
（ｃ）支持体上に存在するエマルジョンをゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
（ｄ）例えば、限定されないがアセトン等の好適な溶媒を用いて、例えばゼラチンを洗浄することにより、ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
（ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程。
　上記の工程（ａ）～（ｅ）は、好ましくは、細胞を含まない工程である。即ち、本発明の好ましい形態の方法においては、細胞を含まない（cell-free）ことを特徴とする。
　工程（ａ）で使用される組成物のｐＨは、好ましくは３～１１の範囲内であり、より好ましくは４～８である。工程（ａ）で使用される組成物は、親水性親油性バランス（「ＨＬＢ」）が９以上、特に１０以上、とりわけ１３～１９である乳化剤を含む。このような乳化剤を２種以上使用してもよい。好適な乳化剤の例としては、以下が挙げられる：
　ＰＥＧ４００モノオレエート　ポリオキシエチレンモノオレエート（ＨＬＢ　１１．４）、
　ＰＥＧ４００モノステアレート　ポリオキシエチレンモノステアレート（ＨＬＢ　１１．６）、
　ＰＥＧ　４００モノラウレート　ポリオキシエチレンモノラウレート（ＨＬＢ　１３．１）、
　オレイン酸カリウム（ＨＬＢ　２０．０）、
　ラウリル硫酸ナトリウム（ＨＬＢ　４０）、
　オレイン酸ナトリウム（ＨＬＢ　１８）、
　Ｍｙｒｊ（登録商標）５２（ポリオキシエチレンステアリン酸、ＨＬＢ　１７）、
　Ｂｒｉｊ（登録商標）５８（ポリオキシエチレンセチルアルコール、ＨＬＢ　１６）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ　１６．７）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ　１３．３）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ＨＬＢ　１５．６）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ＨＬＢ　１４．９）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ＨＬＢ　９．６）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ＨＬＢ　１０．５）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ　１５．０）、
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８１（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ　１０．０）、および
　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、ＨＬＢ　１１．０）。
　上記の乳化剤の中でも、特に好ましくは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｍｙｒｊ（登録商標）５２およびＢｒｉｊ（登録商標）５８、ならびにそれらの２以上を含む組合せである。
　本発明においては、好ましくは単一の乳化剤を使用することができ、乳化工程を一段階で行うことができる。
　工程（ａ）で使用し得る、好適な水非混和性液体としては、酢酸アルキル（例えば、酢酸エチル）、炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、トルエン、キシレン等）、ハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン等）、およびオイル（例えば、植物油（例えば、コーン油）、灯油または工業潤滑油）、および上記の２種以上を含む組合せが挙げられる。特に好ましい水非混和性液体はコーン油である。
　代表的には、エマルジョンは２相：水非混和性相および水相を含む。
　好ましくは、工程（ａ）は、水非混和性相の体積量が、水相の体積量と同量であるか、水相の体積量より大きい、例えば２倍以上で、実施される。
　所望により、本発明の方法は、工程（ｂ）の間、および／または、工程（ｂ）の後に、ゼラチンを架橋する工程をさらに含む。このような架橋は、例えば架橋剤を使用する、化学的架橋であってもよく、または、より好ましくは、例えば熱脱水架橋である、熱架橋であってもよい。
　ゼラチンは、例えば、ゼラチン中に存在する官能基が互いに反応してイオン結合または共有結合を形成することによって、架橋することができ、例えば、リシンのアミノ基がゼラチンのグルタミン酸および／またはアスパラギン酸のカルボキシル基と架橋することができ、または、ゼラチンがアクリル化ゼラチン等、化学的に修飾されてもよい。
　化学的架橋に好適な架橋剤は、好ましくは、生分解の間、放出された時に毒性または抗原性作用を引き起こさないものである。好適な架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ビス－ヒドロキシ－スクシンイミド、グリシジルエーテル（アルキレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリグリセロールポリグリシジルエーテル等）、ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネート等）、ジフェニルホスホリルアジド、Ｄ－リボース、ゲニピン、およびそれらの２種以上を含む組合せのうちの１またはそれ以上が挙げられる。架橋技術は、Weadockらによる、Evaluation of collagen cross-linking techniques (Biomater. Med. Devices Artif. Organs, 1983-1984, 11 (4): 293-318)にも記載されている。好ましい態様では、水溶性の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が使用される。別の好ましい態様では、ヘキサメチレンジイソシアネートが架橋剤として使用される。他の好適な架橋剤としては、例えば塩化シアヌルおよびジクロロヒドロキシトリアジン等の反応性トリアジンが挙げられる。その他の架橋化合物としては、ジビニルスルホン、２無水物、２官能性のイミデート、ジエポキシドまたはジマレイイミジン(dimaleiimidine)が挙げられる。１分子中にエポキシドおよび無水物基を含む２官能性の架橋化合物等の、異なる反応基を有する、２官能性の架橋剤を使用することもできる。
　酵素的架橋剤、例えば、トランスグルタミナーゼも有用である。
　架橋剤は、２個より多い官能基を有してもよく、例えば、塩化シアヌル（三官能基）、および、２個のエポキシドと１個の無水物基を含む化合物が挙げられる。このような架橋剤は、典型的には、ゼラチンのアミノ酸中に存在するアミン基および／またはスルフヒドリル基と反応する。
　要すれば、１種より多い架橋剤を使用してもよい。架橋剤がゼラチンと接触したとき、または、例えばｐＨを調整した後、または光開始により、または他の活性化メカニズムを用いた後、架橋は自発的に開始し得る。
　特に有用な架橋剤はグルタルアルデヒドであり、これは２つのリシン残基を架橋する。別の好適な生体適合性架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であり、これはアミン基とカルボキシル基とを結合させる。また、ヘキサメチレンジイソシアネートも架橋剤として使用し得る。
　脱水熱架橋は、ゼラチン中に存在するアミン基とカルボキシル基との縮合により架橋を引き起こし、アミド基を形成する。脱水熱架橋は、好ましくは、１２０℃より高い温度で、真空中で実施される。
　シートの形成に寄与するため、ゼラチンは、好ましくは少なくとも２つのリシン残基を含む。好ましくは、ゼラチンは、少なくとも３個、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または少なくとも１２個のリシン残基を含む、遺伝子組み換えゼラチンである。さらなる態様では、ゼラチンは、少なくとも２個のリシン残基に加えて、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含む。より好ましくは、ゼラチンは、好ましくは少なくとも２個のリシン残基に加えて、少なくとも３個、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または少なくとも１２個のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含む。
　多孔質ゼラチンシートであって、上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、シートの形成を助けるため、ゼラチンは、好ましくは、ゼラチン分子の長さに沿って分布した、リシン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸を含む。このように、１つの態様では、ゼラチン中に存在する５０個のアミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のリシン残基を含むか、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含むか、または、少なくとも１個のリシン残基と少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基とを含む。好ましくは、ゼラチン中に存在する４０個のアミノ酸の各ストレッチ（より好ましくは、２５個のアミノ酸の各ストレッチ）は、少なくとも１個のリシン残基および／または少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含む。
　好ましくは、ゼラチンは、互いに隣接していない架橋可能なアミノ酸残基を含み、例えば、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個の、架橋可能でないアミノ酸により離れている、架橋可能なアミノ酸残基を含む。架橋可能なアミノ酸残基は、第１級アミン基（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するために典型的に使用される第１級アミン基の他に）、－ＳＨおよび／またはカルボン酸基（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するすために典型的に使用されるカルボン酸基の他に）を含む。
　ゼラチンは、特にその後の架橋を助けるため、好ましくは、天然ゼラチンよりもリシン残基のパーセンテージ（％）または数が大きい、遺伝子組み換えゼラチンである。
　多くの架橋剤は、リシン残基および／またはＮ末端アミンに結合する。天然ゼラチンは、典型的には、アミノ酸残基１，０００個当たり、２５～２７個のリシン残基および１１２～１３３個のグルタミン酸およびアスパラギン酸残基を含有する。本発明に使用される遺伝子組み換えゼラチンでは、リシン残基の数を、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、約２０、１５、１０または５個以下に減らすことができ、または、要すれば、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、約３０、４０または５０個以上に増やすことができる。
　本発明に使用されるゼラチン中に存在する、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基の数は、例えば、アミノ酸残基１，０００個当たり、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５個以下に減らすことができ、または、要すれば、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、１５０個以上に増やすことができる。
　要すれば、ゼラチン中に存在する、いくつかまたは全てのグルタミンおよびアスパラギン残基を脱アミノ化し、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基に変換することができる。
　１つの態様では、ゼラチンは、ゼラチン１ｇ当たり０．０２～１．０ｍｍｏｌの架橋剤とゼラチンを接触させることを含む方法により、架橋される。例えば、ゼラチン１ｇ当たり、約０．０２、０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０および５．０ｍｍｏｌの架橋剤を使用してもよい。
　このように、シートの物理的性質をカスタマイズするため、使用される架橋化合物の量と共に、架橋可能なアミノ酸残基の数を利用することができる。架橋可能な残基の数が多いこと、および／または、架橋化合物の濃度が高いことにより、機械的ストレスに晒される用途に特に有用な、頑丈なシートを得ることができる。架橋可能なアミノ酸残基の数が少ないこと、および／または、架橋化合物の濃度が低いことにより、より容易に変形可能で、かつ、低侵襲送達技術および医薬用途に特に好適なシートを得ることができる。
　シートが医学的用途に使用される場合に特に望ましいことであるが、熱脱水架橋は、ゼラチンの化学的コンタミネーションの可能性を回避することから、好ましい。
　架橋の程度もまた、ゼラチンシートの体内での溶解または分解に要する時間に影響する。従って、所望の用途のために、シートの溶解または分解速度を制御することが可能である。
　工程（ａ）において、水：水非混和性液体の体積：体積の比は、好ましくは、５：１～１：１０の範囲内であり、より好ましくは１：１～１：５、特に２：３～１：３である。
　工程（ａ）で使用される組成物（および得られるエマルション）は、好ましくは、
　１～１５質量％、より好ましくは１．５～１０質量％、特に３～５質量％のゼラチン；
　１０～７０質量％、より好ましくは２０～５０質量％、特に３０～４０質量％の水；
　２０～９０質量％、より好ましくは４０～８０質量％、特に５０～７０質量％の水非混和性液体；および
　０．５～２０質量％、より好ましくは１～１０質量％、特に２～６質量％の乳化剤を含む。
　工程（ａ）は、好ましくは１０～１００℃の範囲内の温度で実施し、より好ましくは２０～８０℃、特に３０～６０℃の範囲内の温度で実施する。
　工程（ａ）で行われる混合は、例えば、振とうまたは攪拌等の、いずれの好適な方法で行ってもよい。好ましくは、混合は攪拌によって行われ、特に溶解槽タイプの攪拌機を用いる場合、１分当たり特に２０～５，０００回転（「ｒｐｍ」）の速度の撹拌、より好ましくは２００～１，０００ｒｐｍ、特に２５０～６００ｒｐｍの速度の攪拌によって行われる。
　工程（ｂ）において、得られたエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンがゲルの形態でない温度で、支持体上に流し込まれ、例えば、工程（ｂ）において用いられるエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より、少なくとも３℃、より好ましくは少なくとも５または１０℃高い温度を有する。支持体は、例えば、無孔の型（例えば、テフロン（登録商標）製またはプラスチック材製）または平坦な無孔のシート（例えばガラス板）であってもよい。
　工程（ｃ）で行われる冷却は、受動的であっても能動的であってもよい。例えば、受動的冷却は、単にエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンが固化／ゲルを形成する温度まで自然に冷却させることによって提供されてもよい。冷却は、制御された冷却速度で、または制御せずに、温度を低下させる冷却手段（例えば、氷、冷水、または工程（ｂ）の生成物を冷蔵庫内に置くことによる）を用いて提供されてもよい。能動的冷却は、最終的なシートの性質の調整に有用である。
　しかしながら、好ましくは、工程（ｃ）は、エマルジョンが０．１～２０℃／分の速度で、より好ましくは１～１０℃／分の速度で冷却するように行われる。このような冷却速度により、特に有用な性質を有するシートを提供することができる。例えば、工程（ｂ）が６０℃位の温度のエマルジョンを使用して実施される場合、好ましい冷却速度は１．８℃／分となる。３０分後、得られたシートは最終温度が６℃ということになる。冷却速度は線形であっても、非線形であってもよい。
　工程（ｄ）において、水非混和性液体は、例えば、ゼラチンを、水非混和性液体よりも沸点の低い溶媒で洗浄することにより、ゼラチンから除去してもよく、例えば、コーン油（高沸点）は、アセトン（低沸点）を用いて洗い流してもよい。水非混和性液体を洗い流すために使用される液体は、その後、相対的に低沸点であるために揮発する。用いられる乾燥方法は重要ではなく、例えば、オーブン中での乾燥、温風の吹き付け、真空乾燥、および単なる得られたシートの自然乾燥が挙げられる。
　好ましくは、本発明の方法は、無菌条件下で実施される。
　上記を考慮すると、本発明の第２の側面による方法は、好ましくは以下の特徴を有する：
（ｉ）工程（ａ）で使用される組成物は：
　３～５質量％のゼラチン；
　３０～４０質量％の水；
　５０～７０質量％の水非混和性液体；および
　２～６質量％の乳化剤
を含み；
（ｉｉ）工程（ａ）における混合は、１分当たり２５０～６００回転の速度で撹拌することによって行われ；
（ｉｉｉ）工程（ａ）において、水対水非混和性液体の体積：体積の比は、２：３～１：３の範囲内であり；
（ｉｖ）工程（ｂ）において支持体上に流し込まれるエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点よりも温度が高く；
（ｖ）好ましくは、工程（ｃ）は、支持体上に存在するエマルジョンが１～１０℃／分の速度で冷却するように実施され；
（ｖｉ）所望により、この方法は、得られた多孔性ゼラチンシートを、好ましくは熱脱水架橋により、架橋する工程をさらに含む。
　本発明の好ましい側面によれば、本発明の第１の側面のゼラチンシートは、以下の特徴の１以上を有する：
（ａ）表面孔は、最小平均直径が、少なくとも１μｍ、例えば少なくとも３μｍ、さらにより好ましくは少なくとも５μｍである；
（ｂ）空隙率が、少なくとも５０体積％、例えば、５１～９５体積％、特に６０～９０体積％である；
（ｃ）密度が、０．０４～０．５０ｇ／ｃｍ3、例えば０．０６～０．２５ｇ／ｃｍ3、特に０．１～０．２ｇ／ｃｍ3である；
（ｄ）体積が、２～２５ｃｍ3／ｇ、例えば４～１７ｃｍ3／ｇ、特に５～１０ｃｍ3／ｇである；
（ｅ）チャンバーの平均直径が、１００μｍ未満であり、好ましくは、チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する；および
（ｆ）孔のネットワークはチャンバーを相互接続し、好ましくは、このような孔の平均直径は、少なくとも１μｍ、例えば少なくとも３μｍ、好ましくは少なくとも５μｍである。
　チャンバーおよび孔の平均直径は、走査型電子顕微鏡像（例えば、Ｊｏｅｌ　ＪＳＭ６３３０Ｆを用いて）の分析により、および、マイクロコンピューテッドトモグラフィー（ＣＴ）（ＶＧＳｔｕｄｉｏ　ＭＡＸ２．２ソフトウェアを有するＳｋｙｓｃａｎ１１７２　ＭｉｃｒｏＣＴ装置（Ｂｒｕｋｅｒ社製））によって測定してもよい。
　シートの平均空隙率は、以下の通り、式（１）で示される以下の計算を実施することによって測定してもよい：
　Ｐ＝（ｐｖｌ／Ｖ）ｘ１００％
　式（１）
式中：
Ｐは、シートの平均空隙率であり、
ｐｖｌは、シート内部の平均総空間体積であり；および
Ｖは、シートの平均総体積である。
　ｐｖｌはマイクロＣＴ測定（例えば、Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２　ＭｉｃｒｏＣＴ装置　（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を使用）により、または、水銀圧入（孔が相互接続されている場合に適用可能）により測定してもよい。
　シートの平均空隙率（Ｐ）を計算する別の方法は、シートの既知の体積の質量を測定し、ゼラチンの密度（１．３４ｇ／ｃｍ3）から求める。例えば、１ｃｍ3のシートの質量を測定し、式（２）によって平均空隙率を計算する：
　Ｐ＝（１－Ｗ／ｄ）ｘ１００％
　式（２）
式中：
Ｐは、シートの平均空隙率であり、
Ｗは、シート１ｃｍ3の質量であり；および
ｄは、ゼラチンの密度（１．３４ｇ／ｃｍ3）である。
　本発明のゼラチンシートは、好ましくは、上述の特徴（ａ）～（ｆ）の１以上を有し、および／または、下記の特徴の１以上を有する。多孔性ゼラチンシートは、上述の方法によって得てもよい。
　上記の特徴（ａ）～（ｆ）は、本発明の架橋および非架橋シートの両者に適用する。
　上述の方法は、現在、市販で入手可能なフィルムフィートと大きく異なる３次元構造を有するゼラチンシートを提供するために使用してもよい。より具体的には、上述の方法は、本発明の第１の側面において記載される多孔性ゼラチンシートを提供するために使用することができる。
　本発明の第３の側面によれば、本発明の第１の側面による多孔性ゼラチンシートおよび生細胞を含む複合材料が提供される。
　代表的には、生細胞は、本発明のシートのチャンバー内および／またな孔内、特にチャンバー内に存在する。所望により、複合材料は、生細胞のための１以上の栄養素をさらに含む。
　本発明の複合材料中に存在する生細胞の種類としては、制限はなく、ヒトまたは動物細胞が挙げられる。例えば、皮膚の細胞を使用することができ、得られる複合材料は、様々な種類の皮膚損傷の治療に使用することができる。別の例は、例えば心筋梗塞の治療に使用できる、筋芽細胞（筋細胞）である。もう１つの例は、肝臓病変中の毒性物質の無毒化に使用できる、肝細胞である。好ましい態様では、生細胞は幹細胞であり、例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、および間葉幹細胞である。使用し得る他の細胞としては、多分化能（multipotent）細胞、内皮細胞、前駆細胞、および骨髄由来細胞が挙げられる。
　生細胞は、由来元であるか使用される予定のヒトまたは動物の体内に通常存在する条件下で栄養素を与えられた場合に、増殖する能力がある細胞である。
　本発明の複合材料は、本発明のシートを所望の細胞と共に培養することにより調製してもよい。
　細胞の増殖に使用される特定の栄養素は、代表的には、成長させる細胞に適合するように選択される。多数の栄養製剤が市販されており、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハムＦ－１０およびＦ－１２培地、培地１９９、ＭＥＭ、Ａｍｅｓ培地、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ改変）、Ｃｌｉｃｋ培地、ＣＭＲＬ－１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ－１５培地　（リーボビッツ）、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ　Ｓ－７７培地、ウェイマウス培地、ウィリアム培地ＥおよびＲＰＭＩ　１６４０培地が挙げられる。
　本発明の第１および第３の側面のシートおよび複合材料は、多数の用途に使用することができ、例えば再生医学療法のための細胞キャリアまたは組織損傷修復のための足場として使用することができる。このように、第１の側面のシートは、生細胞と融合して、本発明の第３の側面による複合材料を供し、人工皮膚、人工器官、脂肪組織、筋肉、血管等の供給または培養に使用することができる。シートおよび複合材料は、細胞培養における細胞のキャリアとして、および、ヒトまたは動物の体への移植前または後に所望の物質を生産させるために存在する細胞のキャリアとして、使用することができる。細胞は、宿主自身（自家移植）の細胞または他の起源の細胞（特性種または外来種）であってもよい。いくつかのケースでは、細胞自体が所望の生成物であることができ、例えば、後に脂肪細胞に変換するために、移植後に増殖し得る、キャリア上に付着した初期段階の脂肪細胞（前脂肪細胞）であることができる。
　本発明のシートおよび複合材料は、形成外科の分野において、並びに、毒性および薬物スクリーニングアッセイにおいても、特に有用である。後者の場合、本発明の第１の側面によるシートは、毒性または薬物スクリーニングのための使用に好適な生細胞によりコロニーを形成してもよい。本発明のシートにより、有利に、より自然な空間構造中で細胞が組織化し、これは、生体中に見られる細胞組織化の典型である。本発明によるシートを、先に生細胞と融合させずに、ヒトまたは動物の体に移植することも可能である。シートをヒトまたは動物の体に移植した後、体内の隣接する細胞は、例えばチャンバーおよび／または孔内に定着し、その後、増殖することにより、シート中に移動しコロニーを形成する。移植されたシートが溶解した後、コロニーを形成した細胞は、移植に対応した構造を形成しているであろう。
　本発明を、以下の限定されない実施例により説明する。以下の略称を使用する。
「ＲＧ１」は、１０質量％固体の水性組成物であって、ｐＨ５．４を有し、以下に配列番号１として示される配列を有するＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチン（ＭＷＴ：５１．２ｋＤａ）含む組成物を意味する。このＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、ヒトＣＯＬｌＡｌ－Ｉのゼラチンアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列を基に、この核酸配列を修飾することによって製造した。使用した方法は、欧州特許ＥＰ－Ａ－０９２６５４３号、同ＥＰ－Ａ－１０１４１７６号および国際特許ＷＯ０１／３４６４６号に開示されている。このように、ＲＧ１はヒドロキシプロリンを含まず、以下の配列番号１のアミノ酸配列を含む。
 配列番号１のアミノ酸配列：
GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG;
　配列番号１は、５７１個のアミノ酸長であり、１２個のＲＧＤモチーフを含む。
「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０」は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
「ＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地である。
実施例１
工程（ａ）－　第１のエマルションの調製
　ＲＧ１（１５ｇ、１０質量％が固体）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（１．０ｇ）の混合物を６０℃に加熱し、その温度で１５分間維持した。混合物は、ＲＧ１（９０質量％が水）由来の水を含んでいた。ＦＳ１については混合物を５５０ｒｐｍで攪拌しながら、水非混和性液体（コーンオイル、３０ｍｌ）を７分かけて添加した。６０℃（ＲＧ１のゲル化点より高い）の温度を維持しながら、さらに３分間、５５０ｒｐｍで攪拌を継続して、第１のエマルションを得た。チャンバーの平均直径が異なるＦＳ１ａおよびＦＳ１ｂを調製するために、攪拌速度を調節し、チャンバーの平均直径が所定のものを得た。
工程（ｂ）－　コーティングの調製
   第１のエマルジョンをさらに６０℃で、ガラスプレート上に、種々の厚さに流し込んだ。
工程（ｃ）－　コーティングの冷却
　第１のエマルジョンを種々の厚さでコーティングしたガラスプレートを、冷蔵庫中、４℃で３０分間冷却し、ＲＧ１をガラスプレート上で多孔性ゼラチンシートとして固化させた。
工程（ｄ）－　水非混和性液体の除去
　多孔性ゼラチンシートを有するガラスプレートを、冷却したアセトン浴に移した。シートを、水およびコーン油がシートから除去されるまで、新しいアセトンで数回洗浄した。その後、シートをオーブン中、６０℃で乾燥した。
任意工程（ｅ）－　架橋
　工程（ｄ）で得られたシートは、以下の通り、熱脱水処理により架橋して、架橋した多孔性ゼラチンシートを得た：工程（ｄ）で得られた乾燥シートを、真空下１４５℃の温度のＢｉｎｄｅｒＶＤ５３真空ストーブ中に９６時間置いた。
　上記で概説したように、ガラスプレート上に第１のエマルジョンの層を流し込んで生成した、架橋した多孔性ゼラチンシート（「シートＦＳ１」、「シートＦＳ１ａ」および「シートＦＳ１ｂ」）は、以下の表１に記載の性質を有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
注：
１：　シートＦＳ１、ＦＳ１ａおよびＦＳ１ｂ中のチャンバーの形状および平均直径は、ＳＥＭ画像およびマイクロＣＴデータ（ＧＳｔｕｄｉｏ　ＭＡＸ２．２ソフトウェアを備えたＢｒｕｋｅｒ社のＳｋｙｓｃａｎ　１１７２　ＭｉｃｒｏＣＴ装置を使用）を用いて測定した。
２：　シートＦＳ１の平均空隙率は、上述の式（１）により測定した。
３：　シートＦＳ１の平均密度は、１ｃｍ3のシートの総質量を測定することにより測定し、算出した。
４：　シートＦＳ１の平均体積は、１ｇのシートＦＳ１の体積を測定することにより測定した。
実施例２～４および比較例１
　以下の表２に示した変更以外は実施例１を繰り返した。得られたシートの性質を表３に示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（チャンバーの平均直径、平均空隙率、平均直径、平均密度および平均体積は、上記実施例１で記載した通り測定した。）
＊＝チャンバーのほとんどが球状ではなかったため、測定できなかった。
　シートＦＳ１～ＦＳ４、および比較例１のシートは、ＳＥＭによって分析した。シートＦＳ１、ＦＳ２およびＦＳ３のＳＥＭ写真を、それぞれ図１ａ、図１ｂおよび図１ｃに示し、比較例１のＳＥＭ写真を図２に示す。
複合材料の調製および試験
　本発明の第３の側面による複合材料および比較例の複合材料を以下の通り調製した：
殺菌工程
　シートＦＳ１～ＦＳ４をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含まない；「ＰＢＳ」と略す）中に置いた。ＰＢＳ緩衝液中、室温で１時間後、シートをオートクレーブにより殺菌した（ＰＢＳを除去せず）。殺菌後、ＰＢＳを除去し、新しいＰＢＳを加えた。殺菌、ＰＢＳ除去およびＰＢＳ置換のサイクルを３回繰り返した。最終的に得られた、殺菌したシートは、使用時まで、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）を含むＤＭＥＭ中、４℃で保存した。比較例１の市販のシート（Ｚｉｍｍｅｒ　Ｄｅｎｔａｌ社のＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標））は、追加の殺菌をせず、滅菌パーケージから直接使用した。
Ｃ２Ｃ１２細胞（筋線維芽細胞マウス、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７７２）の調製
   Ｃ２Ｃ１２細胞をＴ７５培養フラスコ中、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で前培養し、細胞が５０～６０％コンフルエントになり、活発に増殖したときに継代させた。その後、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ2）でリンスし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを除去した。続いて、ＰＢＳを吸引した。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を細胞に加え（３～４ｍｌ／７５ｃｍ2）、得られた混合物を３７℃で６分間インキュベートした。その後、再度、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを、トリプシン量に対して１：２の割合で加えて、トリプシンを中和させた。その後、得られた単一細胞溶液を室温で５分間、１２５ｒｐｍで遠心分離した。上澄を吸引し、得られた細胞ペレット内の生細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで穏やかに再懸濁し、Ｃ２Ｃ１２細胞を得た。細胞密度は顕微鏡を用いて測定した。
細胞培養
　上記で得られたＣ２Ｃ１２細胞を、直径５ｍｍの円形のシートＦＳ１、および比較例で使用したシート（Ｚｉｍｍｅｒ　Ｄｅｎｔａｌ社のＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標））上に、円形シート当たり細胞５ｘ１０5個の密度で、動的振とう法により播種した。動的振とう法は、評価対象のシートをＣ２Ｃ１２細胞の懸濁液中に置き、混合物を２００ｒｐｍで４時間回転させ、その後、評価対象のシートを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の細胞培養プレートに移動させた。その後、細胞を、評価対象のシートの存在下、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、７日間培養した。その後、評価対象のシート内に存在する生細胞の量を、ＤＮＡ定量化（ＣｙＱｕａｎｔピコグリーンアッセイ）によって測定した。結果を表４に示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
表４中、以下のスコアシステムを使用した。
+++  は非常に良好な細胞増殖を意味し；
++　 は良好な細胞増殖を意味し；および
+    は中等度の細胞増殖を意味する。
　表４から分かるように、本発明によるシートＦＳ１、ＦＳ１ａおよびＦＳ２～ＦＳ４の細胞増殖は、比較例の細胞増殖より優れていた。また、チャンバーの平均直径が１００μｍを超えるシートＦＳ１ｂは、低い細胞増殖を示した。

Claims (19)

  1. 以下の工程：
    （ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、および乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
    （ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
    （ｃ）支持体上に存在するエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
    （ｄ）ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
    （ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程
    を含む、チャンバーを含む多孔質ゼラチンシートの製造方法であって、
    前記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、前記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有し、チャンバーの平均直径が１００μｍ未満である、前記の製造方法。
  2. 工程（ａ）～（ｅ）が細胞を含まない工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 乳化剤のＨＬＢが９以上である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記シートが、チャンバーを相互接続し、細胞がチャンバーに入る通路を提供する孔のネットワークをさらに含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 前記シートの孔の平均直径が少なくとも５μｍである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記シートの密度が０．０４～０．５ｇ／ｃｍ3である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記シートの体積が２～２５ｃｍ3／ｇである、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  9. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、前記シートが平均直径が少なくとも５μｍである孔を含み、
    （ｉ）前記チャンバーの少なくとも半分は球状であり；および
    （ｉｉ）チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、
    請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  10. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、前記シートが平均直径が少なくとも５μｍである表面孔を含み、前記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  11. チャンバーの少なくとも５０％が球状である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
  13. ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
  14. ゼラチンが、少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. ゼラチンが、少なくとも２個のリシン残基を含む遺伝子組み換えゼラチンであり、前記リシン残基が端のリシン残基であって、第１の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチンのアミノ酸残基の総数の少なくとも２５％離れている、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
  16. 請求項１から１５の何れか一項に記載の方法により製造される多孔質ゼラチンシート。
  17. 請求項１６に記載の多孔質ゼラチンシートの、細胞キャリアとしての使用。
  18. 請求項１６に記載の多孔質ゼラチンシートの、組織損傷修復のための足場としての使用。
  19. 請求項１６に記載の多孔質ゼラチンシートおよび生細胞を含む、複合材料。
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