SE446539B - Forfarande for termisk destabilisering av mikrobiellt lope och dess anvendning vid osttillverkning - Google Patents

Description

15 25 50 i35 , ._ _. . _ _ N a,_, ___ _ ¿_gynnsamma egenskaperna hos mikrob1ellt~1ope; f” ~"- 446 539 termisk destabilisering. termiska destabiliseringen av det karbamylerade enzymet är allt- för liten för att lösa ovannämnda problem med löpets aktivitet i pastöriserad vassla. En annan lösning omtalas i den belgiska patentansökningen 6/UYOH8 inlämnad den 2Ä december 1979, vari det föreslås en acylering av enzymet för destabiliseringsända- Praktiska försök har visat att den mål.

Syftet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett ekonomiskt användbart förfarande för termisk destabilisering av mikrobiellt löpe i sådan omfattning att nackdelarna härrörande från kvarvarande aktivitet av mikrobiellt löpe i pastöriserad vassla i huvudsak elimineras.

Enligt en första aspekt av uppfinningen åstadkommes sålunda ett förfarande för termisk destabilisering av mikrobiellt löpe genom modifikation av det mikrobiella löpet genom behandling i ett vattenbaserat medium med ett okidationsmedel valt ur grup- pen bestående av halogenhaltiga föreningar, vari halogenen upp- visar ett oxidationstal av mellan O och 3, Den drastiska minskningen av den använda mängden reagens innebär åtminstone två fördelar. För det första undvikes den annars obligatoriska inaktiveringen av överskott av reagens. På grund av det faktum att det mikrobiella löpet användes i samband med varor för humankonsumtion, bör för det andra kontaminering därav med extra reagens hållas på lägsta möjliga nivå. Det har visat sig, att det enligt uppfinningen modifierade mikrobiella löpet är signifikant destabiliserat och att destabiliserings- graden är tillräckligíför att kraven avseende vasslaanvändning skall vara uppfyllda, utan att det förekommer någon starkt skad- lig effekt på lagringsstabiliteten vid löpetillverkningen. Det har överraskande befunnits, att det enligt uppfinningen är möj- -ligt att erhålla en destabiliseringsnivå (vilken kommer att de- finieras nedan) av minst 500, företrädesvis 7-ll°C, vilken inom det föredragna området gör att den termiska stabiliteten för det modifierade enzymet'motsvarar'stabiliteten,för kalvlöpe, vari- _genom de gynnsamma egenskaperna_hos kalvlöpet kombinerae.med de ,Löpeaktiyiteten¿mäteš_enligt,5ritisn¿$tandardÅ§É “ftfißlfiñ»h%nrfifimti@aQfJMJk- fidß ngfiufivr ._ ...__..._ ___-.._..._._._.._._._,.........7.. 10 15 25 30 5 446 539 Eftersom föreliggande uppfinning hänför sig till reglerad termisk destabilisering av míkrobiellt löpe, ges nedan vissa detaljer vad beträffar teknik för mätning av termisk stabili- tet och för kvantifiering av reduktionen av termisk stabilitet, dvs. destabiliseringen, varvid denna destabilisering uttryckas 1 °c. i Under ideala betingelser kan ett enzym denatureras vid lämp- lig (hög) temperaturnívâ på ett sådant sätt att den kvarvarande aktiviteten för enzymet minskar som en funktion av tiden längs en exponentiellt avtagande kurva, dvs. med en väldefinierad hal- veringstid, varvid halveringstiden är en funktion av tempera- turen (OC). Halveringstiden Tl/2 kan beräknas enligt formeln: (ta-ul) 1n2 Ti/2 = lnA - lnA2 1 där Al är enzymaktiviteten uppmätt efter upphettning till en speoifícerad temperatur för tiden tl, medan A2 är enzymaktivi- teten uppmätt efter upphettning till samma specificerade tempe- Halveringstiden'är kortare ju högre tempe- För många ratur för tiden t2. raturen är, om alla andra betingelser är desamma. enzymer påverkar en förändring i pH-värdet för enzymlösningen och jonstyrkan samt närvaron av vissa salter halveringstiden Vidare kan en kemisk modifikatíon av enzymet för- Om en kemisk modifikation väsentligt. ändra halveringstiden avsevärt. av ett speciellt enzym förorsakar termisk destabilisering av en- zymet, sägs graden av destabilisering vara n°C, om det ursprung- liga (icke derivatiserade) enzymet och det devatiserade enzymet har samma aktiveringstid vid NOC resp. (N-n)°C- Det torde emellertid observeras, att destabiliseringsvärdena i viss grad är approximativa, beroende på den approximativa karak- tären av värdet för halveringstiden. Samtliga destabiliserings- värden i föreliggande beskrivning mätes vid pH 6,0, eftersom re- sultaten av destabiliseringsmätningen är pH-beroende.

Normalt åtföljes behandlingen enligt uppfinningen av en aktivitetsförlust. Det har visat sig, att destabíliseringsreak- tionen av ekonomiska skäl inte bör drivas förbi det steg som motsvarar vn därmed sammanhängande akLivíteLnfür]unt av en 50%, företrädesvis av ca 50%, ännu hellre mindre än lU%. f "jl)lÄi§-»ii uAury WW lO 15 P0 25 30 3.5 Åísom alla proteinmolekyler kan en2ymet"dtan"tvekan, '.aktioner som deaktiverar enzymet"icke.önskvärda, medan sådana' 446 539 M I ett typiskt fall tycks en destabilisering av ca 15 eller ll°C med en aktivitetsförlust begränsad till mindre än 10% vara en lämplig kompromiss mellan ovannämnda motstridiga faktorer.

Exempel på enligt uppfinningen användbara lämpliga oxida- tionsmedel är ett hypokloni, t.ex. natriumhypoklorit, ett hypo- bromit, t.ex. natriumhypobromit, fri klor, N-klorsuccinimid, kloramin-T samt triklorisocyanursyra.

Oxidationsmedlet bör användas i sådan koncentration att den önskade graden av destabilisering erhålles på rimlig tid, vil- ket kan vara någonting från några minuter upp till 48 timmar el- ler t.o.m. längre i de fall, då reaktionen tillåtes förlöpa okyld eller oavbruten. Om koncentrationen av oxidationsmedlet är allt- för liten, kommer destabiliseringen att bli alltför liten, och om koncentrationen av oxidationsmedlet är alltför hög, kommer även aktivitetsiörlusten att bli alltför hög. De optimala kon- centrationerna motsvarar vanligen en viktandel mellan oxidations- medlet och den totala mängden protein i enzympreparatet av från ca 5 till 30 delar oxidatíonsmedel per lO0 delar totalt protein.

Om det mikrobiella löpepreparatet renas till hög enhetsaktivitet, kan kvantiteten oxidationsmedel reduceras till så liten mängd' som l gram per 100 gram totalt protein. _ ' _ Det pH-värde, vid vilket reaktionen äger rum, kan variera inom vida gränser, dvs. mellan ca pH 3 och 10, varvid de föredrag- na områdena i huvudsak beror på oxidationsmedlet. Med hypoklo- rit som oxidationsmedel är sålunda det föredragna pH-området från 5_ti11_ 9, annu_he11er från 6"ti11 8. p I Reaktíonstemperaturen är ej kritisk när reaktíonstemperatu- rerna hålles på sådana nivåer, t.ex. under ca 3000, där stabili- teten för enzymet är.tillfredsställande. Enzymets stabilitet-kan emellertid förbättras genom tillsats av kända proteinstabilise- rande medel, t.ei. NaCl.i en mängd av ät- 20% av_enZympreparatßt, _ De bakomliggande reaktionsmekanismerna är-Gå klarlagda, och. ej-neiigr år det säkere_puruviaa den siupiiga destabiiisèæanè "' enzvmmolekylen«innenållerflnâgra«halogensubstituenterfdärpåt «Så-' i D fvilket=också__ __eller_sorbitolfi_de vanliga¿enzymstabilisarande§mängderna,,_¿_.¿e 1 r-flallet,'undergå*talrika'ocbloï reaktioner,: f 't.ex. oxidations+'och kioreringsreaktioner. Eftersom det intres- santa i föreliggande fall ligger i destabiliseringen, är al¿a¿re- a! 10 15 20 25 30 55 5 446 539 reaktioner som termiskt destabiliserar enzymet utan att reducera enzymaktíviteten är önskvärda. " Destabiliseringsnivån av minst 5°C, företrädesvis YOC till ll°C och den därmed sammanhängande aktivitetsförlusten av högst 30%, företrädesvis mindre än 10%, får betraktas som gränser vid utövandet av föreliggande uppfinning. De aktiva halogenoxidan- terna uppfyller dessa krav. Fri klor införlivad i ett vattenba- serat medium cmvandlas till klorid- och hypokloritjoner. De tidigare uppräknade N-klorreagenserna omvandlas på lämpligt sätt till hypokloritjoner. Det föredragna reagenset är natríumhypo- klorit, som användes vid pH 5-9, företrädesvis vid pH 6-8.

Acylering, såsom beskrivs i den belgiska patentansökníngen 6/U7OH8, resulterar i en destabilisering på ca 3°C. Oxidation med väteperoxid resulterar också i destabilisering.

Direkt behandling av enzymet med ett aktivt halogenreagens, t.ex. natriumhypoklorit, uppvisar flera processfördelar jämfört med peroxidreaktionen. Den huvudsakliga fördelen tros vara att det aktiva halogenreagenset kan förbrukas fullständigt i reak- tionsblandningen, under det att reaktion med peroxiden måste termineras, t.ex. genom tillsats av katalas.

En föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen innebär behandling av ett oxidationsmedel som är en klor- haltig förening.

En annan föredragen utföringsform av förfarandet enligt upp- finningen innebär behandling till en destabiliseringsnivå av minst 5°C, företrädesvis 7-ll°C, med en förlust av löpeaktívitet av högst 50%, företrädesvis högst 30%.

Ytterligare en föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen innebär behandling med ett oxidationsmedel som är en halogenhaltig_förening, vari halogenen uppvisar ett oxidationstal av 0 eller 1.

Ytterligare en annan föredragen utföringsform av förfaran- det enligt uppfinningen innebär behandling med hypøklorit.

En annan föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen innebär behandling av Mucor miehei-löpe.

Ytterligare en föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen innebär behandling med ett oxidationsmedel, där viktförhållandet i reaktionsblandningen mellan oxidations- medlet och den totala mängden protein i enzympreparatet ligger mellan 0,01 och 1, företrädesvis mellan 3,03 och 0,3.

' -L uumfiv 10 l5 20 30 35 446 539 6 Enligt ytterligare en föredragen utföringsform av förfa- randet enligt uppfinningen har det vattenbaserade mediet ett pH-värde av mellan 5 och 9. _ _ Ännu en annan utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen innebär att det vattenbaserade mediet har en temperatur av mellan 0 och 5000. 7 Enligt en andra aspekt av uppfinningen åstadkommes det de- stabíliserade mikrobiella löpa, som framställes medelst förfa- randet enligt föreliggande uppfinning. _ g Enligt en tredje aspekt av uppfinningen åstadkommas ett för- farande för osttillverkning, där löpet enligt föreliggande upp- finning användes för mjölkkoagulation. Vasslan härrörande från denna osttillverkningsprocess kan utan några problem användas efter pastörisering som proteinhaltig beståndsdel. I I praktiken har det upptäckts att användningen av destabi- liserat löpe föredras för framställning av ost avsedd för lång- varig lagring. 7 I två parallella osttillverkningsbehållare på vardera 150 l tillverkades ost med hjälp av modifierat Mucor miehei-löpe fram- ställt enligt exempel 16 i föreliggande beskrivning samt med hjälp av omodifierat Mucor míéhei-löpe. Två gånger sex försök utfördes. På basis av dessa försök konstaterades det att löpet enligt uppfinningen kunde användas för framställning av de tra- ditionella danska ostsorterna som Samsó och Danbo med åtminstone samma goda egenskaper som motsvarande omodifierade.löpe.

Destabiliseringsprocessen kan, vilket odksâ'är det föredrag- na, utföras som sista steg vid framställningen av det mikrobi- ella löpet. I realiteten kan (kommersiellt}:rent7mikrobiellt“ -löpa eller löpekoncentratïanvändas vid utövandet av föreliggande uppfinning. Sålunda justeras t.ex. pH-värdet förlenlmikrobiell löpelösning, som i övrigt är färdig för de vanliga sluthearbet- níngsoperationerna före leverans, till den förutbestämda behand- lingsnivån (t.ex. pH 7), varefter'lösningen blandas under omrö- ring vid rumstemperatur med en lösning av oxidationsmedlet, var- vid mängden av'nämnda oxidationsmedel föreligger inom ovannämnda område vad beträffar viktförhållandet, nämligen 3-30 delarÉ(en “exemplifierande mängd av natríumklorit_är'ëQ_delar§1per¿lQQ¿delar;- ~ -~' totaltgpreteinffijÖdag~mirkobïe1laflöpelösningenkf 'lämnas därefter'att.stå under några timmar till dess att den ön- skade destabiliseringsnivân uppnås, t.exÄ i 2:5 timmar. Reak- "oon Bmw, 10 15 20 25 30 446 539 tionen kan avbrytas genom tillsats av aktivt kol eller ett reduk- tionsmedel, såsom natriumsulfit, efter lämplig reaktionsperiod.

Den destabiliserade enzymprodukten kan därefter utsättas för de vanliga slutbearbetningsoperationerna, t.ex. filtrering, juste- ring av pH-värde och enhetsenzymaktivitet till standardiserade nivåer, etc.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas mera i detalj genom följande exempel.

Utgångsmateríalet i följande exempel är ett löpekoncentrat framställt såsom beskrivs i "2. Pilot plant experiment" i den brittiska patentskriften 1 108 287, varvid dock gäller att kul- turvätskan koncentrerades till en aktivitet approximativt mot- svarande en 1%-ig lösning av det rena enzymet (Comptes Rendus des Traveaux du Laboratoire Carlsberg (1970), Vol. 37, No. lä, 301-325) och 18% NaCl sattes till råkoncentratet. För enkelhets skull kommer i fortsättningen detta koncentrat att benämnas "RENNILASE H6".

EXEMPEL 1 _ Två uppsättningar om tre 25 ml portioner framställda genom blandning av 12,5 ml RENNILASE H6 och 12,5 ml vatten justerades till pH 7,0, 8,0 resp. 9,0 genom tillsats av l N NaOH, och till var och en av dessa blandningar sattes 0,ü ml av en 2,25 M lös- ning av NaClO, varigenom pH-värdet hölls konstant på ovan angiv- na värden.

Den första uppsättningen omfattande tre portioner placera- des i ett kylskåp över natten (ca 18 timmar). Den andra uppsätt- ningen omfattande tre portioner lämnades att stå vid rumstempera- tur i två timmar. Vid slutet av de angivna tidsperioderna upp- mättes pH-sänkningen. Därefter utspäddes portionerna genom blandning av 0,2 ml därav med 50 ml vatten, och samtidigt juste- rades pH-värdet till 6,0 med natriumacetat/ättiksyra.

Uppträdande pH-sänkningar och kvarvarande aktivitet efter reaktionen mellan löpet och natriumhypokloritet framgår av föl- jande tabell. 446 539 3 Ursprungi på efter å Kvarvarande aktivitet ligt pH g % efter 2 timmar É 18 timmar 2 2 timmar l8 timmar 1,0 6,9 6,9 86,3 83,1 3,0 T,6 7,6 35,1 81,7 9,0 8,2 8,2 I 78,N 75,H Därefter behandlades de utspädda proverna vid.55°C i 30 minuter vid pH 6,0, varefter kvarvarande aktiviteter uppmättes.

Ursprung- Kvarvarande aktivgtet (%) efter 30 minuters värme- ligt pH behandling vid 55 C. 2 timmars prov 18 timmars prov 7 16,3 . ¶u,2 8 16,3 ü,3 9 32,3 1H,6 Referens ä 93,7 Ovan angivna kvarvarande aktiviteter*motsvarar följande värden för halveringstid och destabilísering. 'gï:ïrgäg- Tyg, miguter;'30-minu- Desüaëåliseríng, oc ter, 55 C, pH 6,0' ' :2 timmar I8 timmar-N É timmar~_hl8 timmar ' "f" ' n;- en “en u 8 "L _ -sufl Iáäfif ,;1Wïí}¿¿m1 10 15 20 446 539 gggmrst 2 pH-värdet för tre 150 ml portioner av REN§ILASE M6 juste- rades till 5 Q, 5,0 resp. 7,0. Var och en av dessa tre por- tioner uppdelades i tre delar, till vilka sattes 0,8 ml, l,2 ml och 1,6 ml av en kommersiell 2,25 M lösning av Na0Cl, varigenom pH-värdet hölls konstant på ovan angivna värden.

Dessa nio prover lagrades därefter vid rumstemperatur (2200) i lö-20 timmar, varefter ett l0 ml prov uttogs från vart och ett av de nio proverna. Till vart och ett av dessa tio ml prover sattes 0,ü, 0,6 resp. 0,8 ml l M Na2S03-lösning, beroende på hur mycket NaOCl som sattes till motsvarande portion, i syfte att avlägsna eventuellt överskott av hypoklorit, om sådant var närvarande. d _ Av de sålunda behandlade proverna utspäddes 0,2 ml med 50 ml vatten, och pH-värdet justerades till 6,0 med ättiksyralnatri- De utspädda och pH-justerade proverna värmebehandla- Aktivitetsutbytet, den kvarvarande umacetat. des vid 55°c 1 so minuter. aktiviteten efter värmebehandling samt den beräknade halverrings- tiden och destabiliseringen framgår av följande tabell.

H Tillsatt Aktivi- Kvarv.' Tç¿, min. Destabili- p mängd av tetsut- aktivi- 3OOminuter, sering NaOCl byte, % tet, %, 55 C, oc i ml _30Omin. pH 6,0 155 C, :pH 6,0 9:8 i 99:24 5911; 8 5>° 1,2 . 95,5 57,6 51,7 9 1,6 8H,8 i 56,1 56,0 9 0.8 ¿ 100 } 55,9 55,6 9 6,9 1,2 3 91,6 I 50,5 50,H 9 1,6 ä 81,u § 47,9 28,3 9 0,8 5 98,1 É u9,1 29,2 9 7=° 1,2 87,7 u2,7 2u,u in 1,6 78,3 l 35,7 20,2 10 EXEMPEL E 600 ml av RENNILASE 36 justerades vid en temperatur av ca lOOC till ett pH-värde av 6,0 med hjälp av U K HaOH. Denna por- tion uppdelades i sex delar om 100 ml vardera. Till var och en i 0 POORiVi QUALITY 10 20 \_| \."| 446 559 10 av dessa sex delar sattes 0, 0,5, 1,2, 1,6, 2,0 resp. ?,U ml av en kommersieli 2,25 M NaOCl-lösning, och pH-värdet juste- rades till 7 i alla sex delarna. . 7 Efter sa 15 timmar vid approximativt SCC tillsattes 2 ml lM Na2S03 i syfte att avlägsna överskott av hypoklorit, om så- dant var närvarande. Tillsats av sulfit förändrar. inte löpets stabilitet. Aktivitetsförändringen uppmättes. 5 ml av proverna 10 gånger i 0,l'M acetatbuffert med pH 6,0, 'Vidare utspäddes varefter 5 ml av de utspädda proverna värmebehandlades vid ÉOOC i lä minuter. Den kvarvarande aktiviteten efter värmebeband- lingen bestämdes, och halveringstiden och destabiliseringen be- räknades. Siffrorna framgår av följande tabell. -des vid aa 59 Tillsatt [ Förändring % kvarv. |T¶L,_min}; Destabi- :ïsevv : artist, äïëtlïlëšz- Naocl, m1 š 7; mebehandl. xš6° c* PH 6=° °c ¿* i 0 ¿ - 99 - - a 0,8 + 0,6 35 9,9 ~ 9 1,2 0 19 i 6,5 10 1,6 - 4,11 111 5,3 10 2,0 - 8,5 10 0,5 10 2,U - lU,9 z 7 5,9 ll EXEMPEL Ä Utgångsmaterialet i detta exempel var inte RENNILASE Ä6 utan RENNILASE H6 utan tillsatsen av 18% NaCl.

På basis av ovan angivna utgångsmaterial framställdes fem stycken 200 g prover med 0, 5, 10, 15 resp. 20% NaCl. pH-vär- det justerades till 6,0 med hjälp av U N Na0H. ¿_ _ , _ Av vart och ett av ovanstående fem É00 gnpromerïuttqgs ett l00 ml prov. Till vart och ett av de fem 100 mi proverna sat- tes limifav en kommersiell 2,25 N NaOCl-lösning, varigenom tem- peraturan hölls mellan'É och l0°C. pš-värdet för samtliga fem l00 ml prover justerades Sedanntiil 7,0:med_Ä N NaOH och lagra- C .., . H ,,_H ,,. . _ Liter en Iaprinçstid på ca 1* timmar testëmdes aktivitets- 'örüncring u. Vidare utsattes w ml av proverna för utspäiníng IIa//í/A vimn rqußllflfgi UI ll 446 539 10 gånger med med 0,1 M acetatbuffert med på 6,0, varefter 5 ml av de utspädda uch pH-justerade proverna Den kvarvarande aktiviteten bestämmes. 6000 i 15 minuter. värmebehandlades vid ECC icke värmebehandlat prov utföres parallellt som jämförelseprov.

Försöksparametrarna och -resultaten framgår av följande tabell. i _ Tillsatt Tíllsatt Förändring Kvarv. Ty¿, min. Destabi- procent mängd av av total aktivi- 15 min lisering, NaCl 2,25 M aktivitet, tet ef- _ ° O Naocl, ter vär- 60%, c ml mebeh. pH 6,0 i 15 min, % O O - 98 - - o 1 - 11,2 31 8,9 9 5 1 + 7,8 52 9,1 8 10 1 + 14,0 us 11,5 8 15 1 + 6,8 H6 l},H 8 20 l + 2,U Bl l5,U 8 I EXEMPEL 5 |._1 Tio serier av försök utfördes vid olika pH-värden, nämli- gen 2,5, 3,0, M,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 och 11,0. je serie bestod av 3 prover framställda genom utspädning av provmängder av 12,5 ml RENNILASE U6 med lika stor volym vatten.

Till det första provet i varje serie sattes 75 /ul av en kommer- Var- siell ¿,25 M lösning av natriumhypoklorit, till den andra 150 /ul och till den tredje 300 /ul, vilka mängder motsvarar (approxima- tivt) H, 8 resp. 16 gram natriumhypokloritïper 100 gram totalt protein i provet. I varje serie hölls pH-värdet konstant vid de angivna värdena. Reaktionstemperaturen var densamma för alla serier (approximativt 500).

Efter ruaktionstidor på approximativt 110, 00 och 90 timmar För detförsta, andra resp. tredje provet i varje serie bereddes samtliga prover upp till 50 ml. Prover för analys bereddes genom lämplig ut:pädning (approximativt 1:12? , varvid pH-värdet sam- tidigt justerade: till 6,00 med hjälp av ïztiksyra och natrium- UALfiy 446 559 1, acetatlösningar. O Dessa prover värmebehandlades därefter vid 55 C í 50 minu- ter.. Aktivítetsutbytet, kvarvarande aktivitet efter värmebe- handlingen, den beräknade halveringstiden samt destabiliseríng- en beräknad därur presenteras i följande tabell.

Urspr. Mängd Slut- Aktiví- Kvarv. j Tyg Destabili- pH ' tillsatt ligt pH tetsut- aktívi-; . sering, .Naoc1 7 byte, 7 tet, 7 ' m1n° oc /ul/25 _ V ml prov » 75 2,52 95,0 77,5 80,8 6 55 šä 353 ïêê 7%? äšå 5 ' s s a s 75 5,00 101,5 76,9 79,2 6 5 150 5,15 97,6 60,5 01,0 8 500 5,00 52," 70,0 22,7 9 75 5,96 106,1 71,8 62,8 7 0 150 0,05 102,0 60,2 06,9 8 500 5,90 69,3 01,5 25,5 9 75 0 95 100 0 70 5 70 6 7 5 15° 0,99 9910 62,2 05É8 8 500 0,80 71,1 05,1 26,1 10 75 5,86 101,7 59,0 59,9 8 6 150 5,98 90,8 00,8 25,2 9 - ' 300 5,66 61,5 8,6 8,08 ll 75 6,61 96,5 59,5 22,0 9 7 150 É,60 90,2 1,1 š,âÉ. 11 -5 500 ,51 9,2 ,0 , 11 75 7,00 90,5 08,5 28,6 8 8 1â0 7,26 87,1 56,0. 7,57 11 5 0 - - - - 75 8 02 90,0 68,2 50,5 7 9 150 7179 77,7 17,5 x)11,9 ) 10 300 7,50 07,5 9,5 2,92 13 75 8,50 ,2 78,6- ßéiëfid- 6 lo BÄJO x)3-.'9:V3\ WX) 9 500 7,85 00,0 9,5 2,92 13 75 10,50 ' 57,2 9535- 50,9 0 ' x) 10 min. värmebehandling.

Dessa data visar att följande betingelser är optimala för ies:abiliser*ng med natríumhypok1:rít: pH-zmrådez 6 - 8. 5600? uAuTv 10 15 20 15 446 539 Mängd natriumhypoklorit: prov, motsvarande (approximativt) 5 g natrigmhypoklorit per 150 /ul av 2,55 M lösning per 100 g totalt protein.

EXEMPEL 6 Två portioner framställdes av en blandning av 25 ml RENNI- LASE H6 och 20 g isvatten, varvid pH-värdet justerades till 7,0 med hjälp av M N NaOH.

Till dessa båda portioner sattes 55 resp. 66 mg N-klorsuc- cinimid upplöst i 5 ml ísvatten, varigenom pH-värdet samtidigt justerades till 7,0.

Två timmar senare utspädes 0,2 ml av portionerna med 50 ml vatten, varvid pH-värdet samtidigt justeras till 6,0 med hjälp av natriumacetat/ättíksyra.

Den kvarvarande aktiviteten efter reaktionen mellan löpet och N-klorsuccinimiden var följande: Tillsatt mängd av N-klor- Kvarvarande aktivitet, % succinimid, mg 53 99,0 66 96,5 På samma sätt som i exempel l utfördes värmebehandling vid 5500 i 50 minuter vid pH 6,0. de aktiviteten och halveringstiden, och destabiliseringarna be- Resultaten framgår av följande tabell.

Därefter bestämdes den kvarvaran- räknades.

Tillsatt mängd av N-klor- Kvarv. Tya, min., Desta- succinimid, mg aktivitet, 30 minuter bilise- o - ' rin 5f_5 c 1 30 5500, pH o g* min., pH 6,0,¿6 O C % É ' 55 Ul,5 23,6 l0 66 26,u - 15,6 io EXEMPEL 7 En Na0Br-lösning med en molaritet av approximativt 2 fram- ställdes genom droppvis tillsats av 3 g Br: till 10 ml omrörd U N Na0H med kylning i ett bad av isvatten: 25 ml REANILASE H6 blandades med 25 ml vatten, och pH- , spoon" 7 QUALITY kfl 10 15 20 25 30 35 2446 559 in värdet justerades till 7,5 med 1 N NaOH. Till 25 ml av denna lösning sattes 3,5 ml av ovanstående natriumhypobromitlösning på ca l timme, varvid pH-värdet hölls mellan 7,3 och 7,8 genom tillsats av 1 N Hcl. i Cirka 30 minuter senare bestämdes aktivitetsförlusten och termostabiliteten. Aktivitetsförlusten visade sig vara ca 20%, och den kvarvarande aktiviteten efter värmebehandling i 20 min. vid 60QC och pH 5,0 var lü procent, vilket motsvarar en halve- ringstid på ca 7 minuter eller en destabilisering av ca 8°C.

EXEMPEL 8 50 ml RENNILASE H6 späddes med 50 ml vatten. _Blandningen kyldes i ett isbad, och pH-värdet justerades till 7,0 med l N Na0H. Därefter infördes ca 0,1 g fri C12, varigenom pH-värdet sjönk till ca 3,8, och vätskan blev grumlig samt ljusare. Re- aktionsblandningen lämnades att stå i ca 10 minuter, och där- efter tillsattes H ml l M Na2SO3-lösning i syfte att avlägsna överskott av C12. 0,2 ml prover före och efter C12-tillsats utspäddes med 50 ml vatten, och pH-värdet justerades till 6,0 med natrium- acetat/ättiksyra. Den med reaktionen mellan löpe-och klor förenade aktivitetsförlusten var 21%. I _ Efter värmebehandlingen av det med klor behandlade löpet vid 55°C på 30 minuter konstaterades en kvarvarande aktivitet av_63%. Detta motsvarar en halveringstid på ca H5 minuter eller en destabilisering av ca 800.

EXEMPEL 9 ~ , -.

Två portioner framställdes av 25 mi RENNILASE us ooh 25 g isvatten, och pH-värdet justerades till 7,0 med_H N Na0H.

Till dessa båda blandningar sattes 60 resp. 120 mg triklorw isocyanursyra, och samtidigt justerades pH-värdet till 7,0.

Ungefär H timmar senare utspäddes 0,2 ml av ovanstående blandningar med 50 ml vatten, och samtidigt justerades pHrvär~ det till 6,0 med natriumacetat/ättiksyra. De sålunda utspädda proverna värmebehandlades vid 55°C i 30 minuter.

Akti§§tetsutbytena,.de kvarvarande aktiviteterna efter värmebehandlingen och de beräknade halveringstiderna och destaj biliseringarna framgår av följande.tabe1l. “^_ _' ,.°" // e, DDR of» unc, [U \J l 446 539 15 z Tillsatt mangd Aktivitets- i T7L, minuter; Destabili- pH 6,0 °c 50 93,0 35 9 120 81,5 16 V 10 x I EXEMPEL 10 Två portioner om 25 ml RENNILASE Ä6 blandades med 20 g is- vatten för varje portion, och pH-värdet justerades till 7,0 med U N NaOH.

Därefter tillsattes 70 resp. 100 mg kloramin-T, upplöst i 5 ml isvatten till ovanstående portioner, och samtidigt justera- des pH-värdet till 7,0.

Ungefär 2 timmar senare utspäddes 0,2 ml av ovanstående prover med 50 ml vatten, varvid pH-värdet samtidigt justerades till 6,0 med natriumacetat/ättiksyra, och de sålunda utspädda och pH-justerade proverna värmebehandlades vid 5500 i 50 minuter.

Aktivitetsutbytena, kvarvarande aktiviteter efter värmebehand- ling och beräknade värden för halveringstid och destabilisering framgår av nedanstående tabell.

Tillsatt mängd Aktivitets- Til, minuter, Destabili~ 1 . _ _ . kioramin T mg ätbyte, 30 m1n_; 5500, âering, pH 6,0 C 70 95,5 19,2 10 lfl0 77,9 8,5 - 12 EXEMPEL ll pH-värdet för 25 ml RENNILASE H6 justerades till 10,0 med 1 N Naon. ' Blandningen kyldes i isvatten, och portioner om 2 ml av en lösning innehållande 0,05 M I2 i 0,25 M KI sattes till ovan- stående 25 ml av pH-justerad RENNILASE H6, varvid samtidigt pH- värdet justerades till 10 med 1 N NaOH efter varje 2 ml till- sats av jodreagenset. Ett referensprov uttogs, och vidare togs även ett prov om 0,5 ml före varje ny tillsats av en 2 ml portion av jodreagenset. i /pggeeeeeesss f auALiiv FJ (f) 15 20 446 559 16 iFör analytiska ändamål utsattes 0,5 ml proverna för utspäd- ning,pH-värdet justerades till 6,0 med ättiksyra/natriumacetat.

Därefter värmebehandlades devñ 6000 i 50 minuter.

Försöksresultaten framgår av följande tabell.

Mängd tillsatt Aktivitets- Kvarv.' Tàa, minuter; Desta- lösning av I2 utbyte, aktivitet 30 minuter, bili- i KI, ml % öooc, 50 6300, PH 6,0 âering, minuter, C % o 1oo 88 163 o 2 100 88 165' O U 96 90 197 O 6 91 88 163 O 8 76 85 128 1 10 65 71 61 3 .EXEMPEL 12 RENNILASE H6 utan någon tillsats NaCl utspäddes tre gånger. 20 ml av sålunda utspädd RENNILASE H6 pH-justerades till 8,5 och kyldes till 0°C, varefter 0,7 ml av en lösning av 0,05 M I2 i 0,25 M KI tillsattes. Ca 15 minuter senare justerades pH-vär- det till 6 genom tillsats av 0,1 M NaHSO5. U För analytiska ändamål utspäddes detta prov, och samtidigt justerades pH-värdet till 6,0 med ättiksyra/natriumacetat. Där- efter värmebehandlades provet vid 6000 i 50 minuter.

Aktivitetsutbytet var 02,6 procent. I Den kvarvarande aktiviteten efter värmebehandlingen var 55 procent. _ I Den beräknade halveringstiden vid 60°C och pH 6 var 20 min- uter. Detta motsvarar en destabilisering av ca 500, medan ett referensprov¿uppvisade samma halveringstid på ca 20 minuter vid 65°c.

EXEMPEL if* _3 g av Mucor pusíllus-proteas (Noury,fl: 220Ä000)_löses'i;: __3Q ml int-ig Naci;;oqn pH-värqetaiusteras tili 6;5Lvia 5-1o°c. 3 x 50 /ul av l§%ïig'Nn0Cl tillsättes i intervall om 30 minuter.

Efter omröring i 3 timmar hålles blandningen vid NCC i 16 timmar, *WOT ÛUALÜL 10 15 20 25 1. 446 559 och pH-värdet justeras sedan till 5,0. Prover uppsamlas för bestämning av aktivitet och termostabilitet. Resultaten fram- går av nedanstående tabell.

Prov/reak-I Aktivitetsut- Halverings-* Destabili- tionstid byte tid vid pH sering, % 6,0, 0-50 o minuter vid C (min.) 5o°c 55°c Referens 100 lüü-l55 19-51 - 24 timmar SN-91 26-22 5-ll 5 EXEMPEL IÄ Utgångsmaterialet i detta exempel var inte RENNILASE 46 utan RENNILASE H6 med tillsats av 6% NaCl i stället för 18% NaCl.

En liter av utgångsmaterialet uppdelades i M portioner om 250 ml vardera. Temperaturen justerades till 5-l0°C,och pH-vär- det för de tre portionerna justerades till 6,5 med H N Na0H.

Vidare sattes l, 1,2 resp. l,Ä% (vol/vol) av en l5,5%-ig (viktl vikt) NaOCl till de tre portionerna, varefter pH-värdet juste- rades till 7,5 med H N NaOH, och proverna inkuberades vid ca 500.

Efter en reaktionstid på 3, 27 resp. 55 timmar uttogs 50 ml prover av vardera av de hypokloritbehandlade portionerna, och till var och en av 50 ml proverna sattes*250 mg (0,5%; vikt/vol) aktivt kol (Carboraffin BGN). Dagen efter tillsatsen av aktivt kol filtrerades proverna samt testades vad beträffar stabilitet och löpeaktivítet (l'-bestämning). Proverna hölls vid 500 i 9 dagar efter hypoklorittillsatsen, varefter de testades på nytt vad beträffar stabilitet och löpeaktivitet (utbyte) (2'-bestäm- ning).' Efter ytterligare H dagar vid 500 och 2-dagar vid 2500 bestämdes löpeaktiviteten på nytt, och utbytet beräknades (5'- bestämning).

Resultaten summeras i följande tabeller, av vilka det fram- går att det inte föreligger någon signifikant förändring av de- stabiliseringen eller aktivitetsutbytet när reaktionstiden för- länges från 5 timmar till 55 timmar. g FOÖB *MW- ” QUALITY ' (n 446 539 18 TABELL l Hvpoklorit- Bestämning Destabilisering, OC É tillsats _ e ,' % vol/vol Reaktionstid 7= - år. 3 sim. 27 sim. 53 tim. 1 1. 9,2 _ 9,1: “ 9,1 9 2- 9,3 9,9 I 9,3 1,22 1. 10,0 10,1' 9,8 2. 10,0 10,1 10,1 1,3 1. 10,6 10,7 10,5 2. .10,6 10,6 10,7 TABELL 2 Hypoklorit- Bestämning Ytbyte, % tillsats % vol/vol Reaktionstid 5 tim. 27 tim. 55 tim. 1 l. 96 99 97 2. 97 99 95 5. 97 97 98 1,2 1. 90 93 } 92 2. 94 9G ' 92 3- 92 95 99 l,H 1. 89 91 _' f 90 2. 92 89 ' 91 3. 91 89 88 = EXEMPEL. 15 Fem 25 ml prover av "RENNILASE H6" justerades till pH 2,0, 2,5, 5,0, 3,5 och 6,0.

Till vart och ett av dessa prover sattes 0,0U g natrium- klorit, varigenom pH-värdena hölls konstant vid de angivna vär- dena. ' , _ , Proverna lagrades vid 500-i 6"da§ar, varefter~de analysera- des vad beträffar kvarvarande aktivitet och termostabilitet vid 55°c och pH 6,0. 2 9 Poon QUÅLIIY» i lO 15 20 19 446 559 Ursprungligt Kvarv. Halveringstíd Destabilísering pH aktivitet (mín.> (efter oc % 30 min. värme- behandling 2>9 23 6 122 5,5 2,5 lå 65 6 6,7 3,0 ¶ 90 53 7,0 3,5 97 UB 7,3 6,0 914 H9 7,2 EXEMPEL 16 Utgångsmaterialet i detta exempel var inte "RENNILASE H6" utan i stället "RENNILASE H6" modifierat i två avseenden: l) kulturvätskan koncentrerades till en aktivitet motsvarande en lösning av ca 1,6 procent rent enzym (och icke l procent rent enzym) samt _ 2) É procent NaCl (och icke l8 procent NaCl) sattes till råkon- centratet.

På detta sätt tillverkades 5952 kg modifierat "RENNILASE 46" i en pilot-plant-anläggning. pH-värdet justerades till 6,H vid 900 med BH %-ig NaOH, och 109 kg av en 12,5%-ig (vikt/vikt) NaOCl-lösning tillsattes. Under denna behandling ökade pH-värdet till 8,0, och pH-värdet justera- des till 7,M med 57 %~ig H01. r Efter 18 timmar vid 9 - 5°C hade pH-värdet sjunkit till 6,9.

Därefter tillsattes 1% aktivt kol vid H - 5°c. utfördes filtrering med hjälp av en filterpress, och destabili- 26 timmar senare seringen uppmättes på nytt. iSlutligen koncentrerades supernatant- chargen under reducerat tryck vid BOOC och pH 6,7, och NaCl till- sattes till totalt 18%.

Det visade sig att halveringstiden för slutprodukten var 11 minuter, een att destabiiieeringen var 10°c. vann ' QUALITY

Claims (10)

zo 446 539 PATENTKRAV

1. Förfarande för termisk destabilisering av mikro- biellt löpe, k ä n n e the c k n a t av att man modífierar det mikrobiella löpet genom behandling i vattenbaserat me- dium vid ett pH-värde inom området 3-10 med ett oxídations- medel valt ur gruppen bestående av halogenhaltiga föreningar, vari halogenen uppvisar ett oxídationstal av mellan 0 och 3, varvid viktförhållandet i reaktionsblandningen mellan oxida- tionsmedlet och enzympreparatets totala proteinmängd är mellan 0,01 och 1. 1

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t 6 c k n a t av att behandlingen utföres till en destabiliseringsnivå av minst 5°C, företrädesvis 7-11°C, med en förlust av löpeaktívi- tet av högst 50 %, företrädesvis högst 30 %.

3. Förfarande enligt något av kraven 1-Z, k ä n - n e t e c k n a t av att oxidationsmedlet är en halogen- haltig förening, vari halogenen uppvisar ett oxidationstal av 0 eller 1. _

4. Pörfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n - n e t e c k n a t av att oxidationsmedlet är ett hypo- klorit. c t t

5. Förfarande enligt något av kraven 1-5, k ä n - n e t e c k n a t av att halogenen är klor.

6. Pörfarande enligt något av kraven 1-S, k ä n n e t e c k n a t av att det mikrobiella löpet är Mucor mieheilöpe.

7. Förfarande enligt något av kraven 1-6,, k ä n - n e t e c k n a t av att behandlingen utföres med ett vikt- förhållande i reaktionsblandningen mellan oxidationsmedlet och den totala mängden protein i enzympreparatet av mellan 0,03 ech 0,3. ' '

8. Förfarande enligt något av kraven 1-7, k ä n - n e t e c k n a t av att det vattenhaserade mediet har ett pH-värde av mellan 5 och 9. '

9. Förfarande enligt något av kraven 1-8, k ä n - n e t e c kan a t av att det vattenbaserade mediet har.en tempeartur av mellan 0 och SOOC. , _ Å

10. Användning av enligt något av kraven T-9 desta- biliserat mikrohiellt löpe för mjölkkoagulatíon vid ost- tillverkning.