SU1109054A3 - Способ дестабилизации микробного сычужного фермента - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНОГО СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА посредством химической модификации, осуществл емой путем обработки сычуж- , ного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, отличающийс  тем, что, с целью снижени  термической стабильности, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенрв - хлор, бром или иод или их производные, в которых галоген Имеет число окислени  1-3, а массовое отношение окислител  к общему содержанию белка в реакционной смеси составл ет 0,01-1,0. 2.Способ поп.1,отлич ающ и и с   тем, что обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровн  дестабилизации при потере активности СО до 50%, предпочтительно до 30%. 3.Способ по пп.1,2, отличающийс  тем, что в качестве микробного сычужного фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei.

Description

со

о

СП 4

Изобретение относитс  к способу дестабилизации микробного сычужного фермента.

В производстве сыра молоко свертывают дл  отделени  творога от сыворотки . Дл  этих целей используют продукты, содержащие реннин, который  вл етс  свертывающим молоко энзимом вьщёленньм из желудка теленка.

Известно Несколько заменителей сычужного фермента теленка, включающих известные микробные сычужнйе ферменты из Mucor miehei и Mucor pusillus iH.

Сычужный фермент, вырабатьшаемый Mucor miehei, предпочтителен в сыроварении благодар  его низкой стоимости , низкой неспецифической протеолитической активности и большому сходству с реннином в отношении чувствительности к иону кальци . Кроме того, Mucor miehei отличаетс  стабильностью при хранении сычужного фер .мента, что объ сн етс  его высокой термостабильностью.

Некоторые пастеризованные сыворотки используютс  в качестве добавок к цельному молоку, например, в виде порошка дл  получени  обогащенного молока, например дет(;кого питани . Пастеризованна  сыворотка, полученна  и  сыра, изготовленного с помощью сычужного фермента Mucor miehei, имеет незначительный уровень активности сычужного фермента благодар  высокой термостабильности последнего, продуцируемого Mucor miehei.

Известен способ дестабилизации микробного сыжучного фермента посредством химической модификации, осуществл емой путем обработки сычужного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, где в качестве модифицирующего агента используют цианат кали  С23

Полученный карбамилированный продукт термически менее стабилен. Однако дестабилизаци  карбамилированного .фермента слишком мала ().

I

.Целью изобретени   вл етс  снижение термической стабильности микробного сычужного фермента.

Поставленна  цель достигаетс  тем что согласно способу дестабилизации Микробного сычужного фермента прсредством химической модификации, осуществл емой путем обработки фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенов - хлор, бром или иод - или их производные, в которых галоген имеет число окислени  1-3, а массовое отношение окислител  к общему содержанию белка в реакционной смеси .составл ет 0,01-1,0.

Обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровн  дестабилизации 5-11 С при потере активности до 50% предпочтительно до 30%, а в качестве микробного сычужного фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei.

Степень дестабилизации сычужного фермента, модифицированного согласно изобретению, достаточна дл  удовлетворени  требований, предъ вл емых к использованию сыворотки, и не оказывает вредного воздействи  на стабильность при хранении препаратов сычужного фермента.

В идеальных услови х фермент может быть инактивирован при соответствующей (высокой) температуре таким образом, что остаточна  активность фермента уменьшаетс  как функци  времени по экспоненциальной кривой спада , т.е. характеризуетс  легко определ емым прлупериодом долговечности и этот полупериод  вл етс  функцией температуры ). Полупериод долговечности TII-J может быть вычислен по формуле

(t,-t)1.n2

Т,

/t In Ад-ln Aj

где A . - активность фермента, измеренна  после нагрева до определенной температуры за врем  t;, ;

А2 - активность фермента, измеренна  после нагрева до той же температуры в течение времени t .

При прочих равных услови х полупериод долговечности будет тем короче , чем выше температура. Дл  многих ферментов изменение рН ферментативного раствора и силы, а также присутствие некоторых солей может существенно вли ть на полупериод долговечности. Химическа  модификаци  специфического фермента иызывает термическую дестабилизацию фермента , поэтому степень дестабилизации составл ет п °С, если исходный (немодифицированный) и модифицированный ферменты имеют одинаковый полупериод при. N и (N-n) С соответственно . Однако значени  дестабилизации в известной мере приближенные вслед .ствие приблизительного характера зна чени  полупериода. Все значени  дестабилизации , приведенные в этом опи . сании, измерены при рН 6,0, поскольку результаты измерений завис т от значени  рН. Обычно обработка фермента согласно изобретению сопровождаетс  потерей активности. Установлено, что по экономическим причинам дестабилизацию не следует проводить на стадии, соответствующей потере активности в среднем более 50%, предпочтительно на стадии при потере 30% и более предпочтительно при потере активности -мене 10%, Обычно дестабилизацию провод т до уровн  tOC и при потере активности менее 10%. В качестве оксил ющих агентов, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, используют гипохлорит, например гипохлорит натри , гипобромид, например гйпобромид натри ,свободный хлор, N-хлорсукцинимид, хлорамин-Т и трихлоризоциануровую кислоту. Окислитель должен примен тьс  в такой концентрации,чтобы желаема  степень дестабилизации достигалась за приемлемое врем , которое может исчисл тьс  от нескольких минут до 48 ч и более в тех случа х, когда протекает не прерываема  охлаждением реакци . Если концентраци  окислител  слишком мала, то дестабилизаци  слишком слаба, если же концентраци  окислител  очень высока , то потер  активности слишком велика. Оптимальные концентрации окислител  обычно соответствуют весовому соотношению между окислителем и общим количество белка, содержащегос  в ферментном препарате, и составл ет 3-30 ч. оки лител  на 100 ч. общего белка. Если препарат микробного сычужного ферме та очищен до высокой степени единичной активности, то количество окислител  может быть снижено до 1 г на 100 г общего белка. Значени  рН, при которых протекает реакци , могут варьироватьс  в широких пределах, т.е. примерно от 3 до 10, что главным образом заивисит от окислител . Так, например, если окислителем служит гипохлорит, то предпочтительный предел значений рН 5-9 и более предпочтительный 6-8. Температура реакции не  вл етс  критической, если ее поддерживать на определенном уровне, т.е. ниже 30°С, когда стабильность фермента удовлетворительна  . Однако стабильность фермента может быть повышена добавкой известных стабилизирующих белок агентов , например поваренной соли в коли-. честве 5-20% от препарата фермента, или сорбита в обычных дл  стабилизации ферментов количествах. Сычужный фермент, модифицированный согласно изобретению, способен производить традиционный детский сыр, по свойм качествам подобный сыру Sams и Danbo и по меньшей мере с такими же свойствами, как и соответствующий немодифицированный сычужный фермент. Операци  дестабилизации может и предпочтительно должна проводитьс  как конечна  операци  получени  микробного сычужного фермента. рН раствора микробного сь1чужного ферменте, готового дл  обычных конечных операций до введени , устанавливают на заданном уровне дл  обработки (например , равным 7), затем сычужный фермент смешивают, перемешива  при комнатной температуре, с раствором окислител  (3-30 ч., например 20 ч. гипохлорита на 100 ч. общего белка). Затем смесь оставл ют на ч дл  достижени  желаемого уровн  дестабилизации . Реакцию можно прервать добавкой активированного угл  или восстановител , такого как сульфит натри , после завершени  соответствующего периода реакции. Дестабилизированный ферментативный продукт подвергают затем обычным конечньш операци м, т:е. фильтрации установлению рН и единичной ферментативной активности до стандартных уровней и т.д. Пример 1. Исходным материалом служит концентрат сычужного фермента (культуральна  жидкость концентрируетс  до активности, примерно соответствующей 1%-ному раствору чистого фермента, 18%-ный раствор поваренной соли добавл етс  к сырому кон центрату) . Этот концеHTpiar носит название Реннилаза-46. В двух сери х пробы, включакицих по три порции (25 мп), приготовленных смешением 12,5 мп реннилазы-46 и 12.5 МП воды, устанавливают рН 7,0, 8,0 и 9,0 соответственно добавлением 1 н, NaOH и к каждой из этих смесей добавл ют 0,4 мп 2,25 М раствора гипохлорита натри  (NaGlO), при этом значени  рН сохран ют посто нными на указанном уровне. Первую серию, включающую три порции , помещают в холодильник на ночь (приблизительно на 18 ч). Вторую серию , включакщую три порции, оставл ют при комнатной температуре на 2ч. Снижение значени  рН измер ют по прошествии указанных периодов времени . Затем порции разбавл ют смешением 0,2 мл смеси с 50 мп воды и одновременно устанавливают значение рН 6,0 смесью ацетата натри  и уксус ной кислоты. Вли ние гипохлорита натри  на остаточную активность фермента рН приведено в табл. 1. Затем разбавленные образцы подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин при рН 6,0, после чего измер ют остаточную активность. Вли ние тепловой обработки на остаточную активность модифицированного гипохлоритом сычужного фермента приведено в табл. 2. Вли ние тепловой обработки на уро вень дестабилизации фермента, модифицированного гипохлоритом, приведено в табл. 3. П р и м е р 2. Значение рН трех порций реннилазы-Аб по 150 мл в каждой устанавливают 5,0, 6,0 и 7,0 соответственно . Каждую из трех порций раздел ют на три части, к каждой из которьк добавл ют 0,8, 1,2 и 1,6мп коммерческого 2,25 М раствора NaOCl соответственно, при этом рН поддержи вают посто нным в указанных выше зна чени х. Эти дев ть образцов хран т затем при комнатной температуре () в течение 20 ч, после чего из каждого образца берут пробу (10 мл). К каждой такой пробе добавл ют 0,4, 0,6 или 0,8 мл 1 М раствора Na,SOj соответственно дл  удалени  избытка гипо хлорита, 0,2 мл обработанных таким образом проб разбавл ют 50 мп воды и устанавливают рН 6,0 смесью уксусной кислоты и ацетата натри . Разбавленные пробы с установленным значением рН подвергают тепловой обработке при 55С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации сычужного фермента гипохлоритом в услови х рН 5,0-7,0 и t 18-20°С приведены в табл. 4. Пример 3. В 600 мл реннилазы-46 при температуре около устанавливают значение рН 6,0 4 н. NaOH. Эту порцию раздел ют на 6 ч. по 100 МП в каждой. К каждой из этих 6 ч. добавл ют О, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 и 2,4 мл коммерческого 2,25 М раствора NaOCl соответственно и устанавливают рН 7,0. После вьздержки окодо 15 ч примерно при добавл ют 2 мп 1 М , с целью устранени  избыточного гипохлорита . Добавка сульфита не измен ет стабильности сычужного фермента. Измер ют изменение активности. Пробы по 5 мл разбавл ют 10-кратно 0,1 Н ацетатным буфером с рН 6,0, после чего разбавленные пробы подвергают тепловой обработке при 60°С в течение 15 мин. Определ ют остаточную активность после тепловой обработки и вычисл ют полупериод долговечности и дестабилизацию . Результаты представлены в табл.5. П р и м е р 4. Исходным материалом дл  этого примера, служит реннелаза-46 без 18% NaCl. На основе указанного исходного материала готов т п ть образцов по 200 г с добавкой 0,5; 10; 15 и 20% NaCl соответственно. Устанавливают значение рН 6,0 с помощью 4 н. NaOH. От каждого из п ти образцов берут пробы по 100мл. К каждой такой пробе добавл ют 1 МП коммерческого 2,25 н. NaOCl при . Затем дл  всех п ти проб устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH и хран т примерно при . По истечении времени хранени  (около 20 ч) определ ют изменение активности. Пробы по 5 wi разбавл ют 10-кратно О,1 М ацетатным буфером с рН 6,0, после чего разбавленные пробы с установившимс  значением рН подвергают тепловой обработке при 60 С в течение 15 мин. Определ ют остаточную активность (не подвергнутую тепловой обработке пробу анализируют параллельно в качестве контрол ). Результаты испытаний приведены в табл. 6. Пример 5. Готов т две порции смеси 25 мл реннилазы-46 и 20 г лед ной воды, устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH, К этим двум по ци м добавл ют 33 и 66 мг N-хлорсукцинимида соответственно, раствор  ют в 5 мп лед ной воды, при этом рН посто нно поддерживают, равным 7,0. Через 2 ч 0,2 мл этих порций разбавл ют 50 мл воды, одновременно устанавлива  рН 6,0 с помощью смеси ацетат натри  и уксусной кислоты. Остаточна  активность после реакции сычужного фермента с N-хлорсукцинимидом следующа : при использовании 33 мг N-хлорсукцинимида 99%, а при использовании - 66 мг - 96,5% Провод т тепловую обработку при 55 С в течение 30 мин при рН 6,0. После этого определ ют остаточную активность и вычисл ют полупериод долговечности и дестабилизацию. Результаты приведены в табл. 7. „, г Пример 6. Готов т раствор NaOBr (примерно 2 М), добавл   по капл м бром к 10 мл перемешиваемого 4 н. NaOH при охлаждении в лед ной бане. 25 мл реннилазы-46 смешивают с 25 мл воды и устанавливают рН 7,5 однонормальным раствором NaOH. К 25 м полученного раствора в течение часа добавл ют 0,5 мл раствора гипобромида натри , при этом поддерживают рН 7,3-7,8 добавкой 1 н. НС1. Примерно через 30 мин определ ют потерю активности и термостабильность . Потер  активности около 20%, остаточна  активность после тепловой обработки в течение 20 мин при и рН 6,0 составл ет 14%, что соответствует полупериоду долговечности около 7 мин или дестабилизации около 8°С, Пример 7. 50 мл реннш1азыразбавл ют 50 мл воды. Смесь охлаждают в лед ной бане и устанавливают рН 7,0 с помощью 1 н. NaOH. Затем ввод т около О,1 г свободного хлора при этом значение рН падает до 3,8, жидкость становитс  мутной, а, затем прозрачной. Реакционную смесь остав 1 48 л ют на 10 мин и затем добавл ют 4 МП 1 М раствора Naj SO, с целью удалени  избыточного хлора. 0,2 мл пробы до и после введени  хлора разбавл ют 50 мп воды и устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натри  и уксусной кислоты. Потер  активности , св занна  с реакцией между сычужным ферментом и хлором, составл ет 21 После нагревани  обработанного хлором сычужного фермента при в течение 30 мин остаточна  актив- . ность равна 63%, что соответствует полупериоду долговечности около 45 мин или дестабилизации около . Пример 8. Готов т две порции по 25 мл реннилазы-46 и 25 г лед ной воды. Устанавливают рН 7,0 4 н. NaOH. К этим смес м добавл ют 60 и 120 мг трихлоризоциануровой кислоты соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0. Через 4 ч 0,2 мл полученных смесей разбавл ют 50 МП воды и одновременно устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натри  и уксусной кислоты. Разбавленные пробы подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации сычужного фермента трихлоризоциануровой кислотной приведены в табл. 8, Пример 9. Две порции реннилазы-46 по 25 мл смешивают с 20 г лед ной воды дл  каждой порции и устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH. Затем к каждой из этих порций добавл ют 70 и 140 мг хлорамина Т, растворенного в 5 мл лед ной воды, соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0.. Примерно через 2 ч 0,2 мл каждого образца разбавл ют 50 мл воды с одновременным регулированием значени  рН до 6,0 с помощью смеси ацетата натри  и уксусной кислоты. Разбавленные пробы с установленным рН подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации фермента хлорамином-Т приведены в табл. 9. Пример 10. Реннилазу-46 без добавки NaCl 3-кратно разбавл ют. 20 мл разбавленной реннилазы-46 довод т до рН 8,5 и охлаждают до 0°С, после чего добавл ют 0,7 мл 0,05 М раствора иода в 0,25 М йодистом калии. Примерно через 15 мин устанав ливают рН 6,0 добавкой 0,1 М NaHSO. Дл  анализа этот образец разбавл  ют и одновременно устанавливают рН 6,0 с помощью смеси уксусной кислоты и ацетата натри . Затем образец нагревают пои в течение 30 мин. Обца  активность составила 42,6%; остаточна  активность после тепловой обработки 35%, полупериод долговечности при и рН 6,0 20 мин, что соответствует дестабилизации примерно 5®С (контрольный образец дает такой же .полупериод при 65°С). Пример 11. Зг протеазы, продуцируемой штаммом микроорганизмов Mucor pusillus (питательна  среда , 1:220000), раствор ют в 30 мл 10%-ного NaCl и устанавливают рН 6,5 при . Добавл ют 15%-ный NaOCl По 50 мкл трижды с интервалом 30 мин После перемешивани  в течение 3 ч смесь ввдерживают при в течение 16 ч и затем устанавливают рН 5,0. Пробы отбирают дл  определени  актив ности и термостабильности. В табл. 10 представлено вли ние 20-часового хранени  на уровень дестабилизации . Пример 12. Исходным материа лом служит реннилаза-46, в которую вместо 18% NaCl добавлено 6%. 1 л исходного материала раздел ют на 4 ч по 250. мл. Температуру под держивают- и в трех част х устанавливают рН 6,5 с помощью 4 н. NaOH. К этим трем част м добавл ют 1, 1,2 и 1,4 об.% 10,5%-ного (по весу) NaOCl соответственно, после чего устанавливают рН 7,5 с помощью 4 н. NaOH и пробы вьщерживают в термостате при 5С. . По истечении времени реакции (3,27 и 53 ч соответственно) отбирают 50 мл пробы от каждой из обработанных гипохлоритом натри  частей и к каждой отобранной пробе добавл ют 250 мг (0,5 вес.% к объему) активированного угл . Через день после введени  активированного угл  пробы фильтруют и испытывают на стабильность и активность сычужного фермен та (1-е определение) Пробы после добавки гипохлорита вьщерживают при -в течение 9 дней после чего их снова испытывают на стабильность и активность сычужного фермента (2-е определение). 1 4Ш После 4-дневной вьдержки при 5С и 2-дневной при 25°С снова определ ют активность сычужного фермента и вычисл ют общую активность (3-е определейие ). Полученные результаты сведены в табл. 11 и 12. Из табл. 11 и 12 видно, что не наблюдаетс  существенного изменени  дестабилизации или общей активности с увеличением времени реакции от 3 ч до 53 ч. Пример 13. П ть образцов реннилазы-46 по 25 мл готов т с рН 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 и 6,О соответственно . К каждому из этих образцов добавл ют 0,04 г гипохлорита натри , при этом значени  рН поддерживают на указанном уровне. Образцы хран т при 5°С в течение 6 дней, после чего анализируют оста- , точную активность и термостабнльность при и рН 6,0. Результаты представлены в табл.134 Пример 14. Исходным материалом служит реннилаза-46, модифицированна  в двух отношени х: культураль-ную питательную среду концентрируют до активности, соответствующей 1,6%-ному раствору чистого фермента, к неочищенному концентрату добавл ют 9% NaCl. Таким образом модифицируют 5952 кг реннилазы-46 на опытной установке. Устанавливают рН 6,4 при с помощью 34%-ного NaOH и добавл ют 10 кг 12,5%-ного (по объему) раствора NaOCl к ферменту. Во врем  этой обработки рН увеличиваетс  до 8,0 значение рН 7,4 устанавливают посредством 37%г-иой НС1. Через 18 ч при значение рН снижают до 6,9. Затем добавл ют 1% активированного угл  при 4-5°С. Спуст  26 ч провод т фильтрацию через фильтр-пресс и снова измер ют дестабилизацию, после чего поверхностный слой концентрируют при пониженном давлении при и рН 6,7 и добавл ют NaCl до общего содержани  18%. Полупериод долговечности конечного продукта равен 11 мин, а дестабилизаци  составл ет 1бС. Таким образом, реализаци  изобретени  обеспечивает снижение термической стабильности сычужного ферменгв, сохран   ее в необходимом интервале

1109054-12

---- .«. ,р

сходное рН через Остаточна  актив- . начениеность, Z

рН ,.-.

2ч t8 ч 2 ч 18 ч

7,0 6,9 6,9 86,3 83.1 8,0 7,6 7,6 86,1 81,7 9.0 8,2 8,2 78,4

Исходное Остаточна  активность обзначение раэцов, Z, серии рН

. J

716,34,2

816,34,3

932,314,6 Эталон98,7

Исходное . Полупериод Т|. , Дестабилизаци , €, значение мин через

рНчерез

2ч tS ч 2ч 18 ч

Таблица 1

. Таблнца2

Таблица 3

И.5 11,5

18,4

12 12 ft

11

11 10

10.8

Таблица 5

Т а б л и ц а 7

ПолупериДестабиОстаточод Т 1/2 на  аклизаци , С тивность. долговечности , мин

41,5

23,6

10 10 15,6 26,4

70

96,5 19,2 140 77,9 8,5

Т а б ли ц а 8

93,0

35 16

9 10 81 5

Таблица 9

10 12

Таблица 10

Claims (3)

1. СПОСОБ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНОГО СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА посредством химической модификации, осуществляемой путем обработки сычуж- ₍ ного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, отличающийся тем, что, с целью снижения термической стабильности, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенов - хлор, бром или иод или их производные, в которых галоген имеет число окисления 1-3, а массовое отношение окислителя к общему содержанию белка в реакционной смеси составляет 0,01-1,0.

2. Способ поп.1,отличающ и й с я тем, что обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при pH 5-9 до уровня дестабилизации 5-11°С при потере активности до 50Z, предпочтительно до 30Z.

3. Способ по пп.1,2, отличающийся тем, что в качестве микробного сычужного фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei.