FI66728C - Foerfarande foer destabilisering av mikrobloepe med hjaelp av vaerme - Google Patents

Description

---—.1 m„KUULUTUS|ULKAISU e ί n o Q

Vtty W C^UTLkeeNINOSSKKirT Ob//0 C Patentti inySnnetty 10 12 1934

Patent ceddelnt ^ ^ (51) K*Jt/fc».a.3 A 23 C 19/032 SUOMI—FINLAND (M) 801072 f») 1 lii.......... AmHwUa<n 02.04.30 (23) 02.04.80 (41) IWNtHMmImI —MMt <w««| 10.10.80 ru"*^1^ il (44) yng··»fi*- 31.08.8if (32)(33)(31) ««»*— W»t«H prtdftm 09.0if.79

Tanska-Danmark(DK) 1A56/73 Toteennäytetty-Styrkt (71) Novo Industri A/S, Novo A116, DK-2880 Bagsvaerd, Tanska-Danmark(DK) (72) Sven Branner-Jdrgensen, CharlottenJund, Palle Schneider, Ballerup, Peter Eigtved, Ktfbenhavn, Tanska-Danmark(DK) (7if) Berggren Oy Ab (5if) Menetelmä mikrobijuoksuttimen destabiloimiseksi lämmön avulla -Förfarande för destabi1isering av mikroblöpe med hjälp av värme

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää mikrobijuoksuttimen lämpöstabiloimiseksi. Juoksuttimellä tarkoitetaan maitoa koa-guloivaa entsyymituotetta.

Juustoa valmistettaessa koaguloidaan maito tarkoituksella kyetä erottamaan kvarkki herasta. Tuotteita, jotka sisältävät juoksutinta, joka on maitoa koaguloiva entsyymi, joka on erotettu vasikan mahasta, on käytetty pitkään tässä tarkoituksessa. Viime aikoina juoksutintarve on voitu tyydyttää vasikanjuoksuttimen avulla, mutta viime vuosina on kehitetty useita vasikanjuoksuttimen korvaavia aineita, joihin sisältyvät mm. mikrobijuoksuttimet, jotka ovat peräisin kannoista Mucor miehei ja Mucor pusillus. Mucor miehei-juoksutin on edullinen juuston valmistuksessa alhaisesta hinnastaan johtuen ja johtuen sen epäspesifisestä proteolyyttisestä aktiivisuudesta, ja myös sen johdosta, että se muistuttaa suuresti juoksutinta kalsiumioni-herkkyyden suhteen. Kannan Mucor miehei erinomainen varastoimisstabiilisuus on toinen edullinen ominaisuus, joka ainakin osaksi johtuu sen suuresta lämpö-stabiilisuudesta.

2 66728

Muutamia pastöroituja heroja on käytetty kokomaidon lisäaineena, esimerkiksi herajauheen muodossa, rikastetun maidon valmistamiseksi esimerkiksi pikkulasten ruokia varten. Pastöroitu hera, joka on saatu juustosta, joka on valmistettu käyttäen Mucor miehei-juoksutinta, voi silti sisältää vähäisen juoksutinak-tiivisuuden Mucor miehei-juoksuttimen suuresta lämpöstabiili-suudesta johtuen. Pienikin juoksuttimen jäännösaktiivisuus hera-jauheessa on haitallinen, koska proteiinin koaguloitumista ei tässä vaiheessa haluta. Tällainen voisi tapahtua mikäli hera-jauhetta käytettäisiin rikastetun maidon valmistamiseksi esimerkiksi pikkulasten ruokia varten. Rikastunut maito voi hyytyä ennen joutumistaan lapsen vatsaan, esim. syöttöpullossa, mikä aiheuttaisi maidon virtauksen estymisen pullosta.

Aikakausjulkaisussa Biochem. Biophys. Acta 271 (1972), 93-101 (W.S. Rickert, Structural and Functional Determinants of Mucor miehei protease, I. Modification of the NI^ terminus and lysine residues by carbamylation), on esitetty, että Mucor miehei-proteaasi (Mucor miehei-juoksuttimen aktiivinen aineosa) voidaan karbamyloida kaliumsyanaatilla, ja että karbamyloidulla tuotteella on vähäinen lämpödestabiloitumisaste. Käytännön kokeet ovat osoittaneet, että karbamyloidun entsyymin lämpödestabiloi-tuminen on liian alhainen ratkaisemaan edellä mainitun juoksuttimen aktiivisuusprobleemin pastöroidussa herassa. Eräs toinen yritys on kuvattu belgialaisessa patenttihakemuksessa n:o 6/47048, jossa on esitetty entsyymin asyloiminen destabi-loimistarkoituksissa.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on aikaansaada taloudellisesti edullinen menetelmä mikrobijuoksuttimen lämpödestabiloi-miseksi siinä määrin, että ne haitat, jotka aiheutuvat mikrobi-juoksuttimen jäännösaktiivisuudesta pastöroidussa herassa, voidaan oleellisesti välttää.

Näin ollen keksintö käsittää menetelmän mikrobiologisen juoksuttimen termiseksi destabiloimiseksi aktiivisuuden vähenemiseen asti, joka ei ylitä 50 %, ja keksintö on tunnettu siitä, että juoksutinta käsitellään vesiväliaineessa pH-arvossa 3-10 haloge-noitujen yhdisteiden ryhmän hapetusaineella, jolloin halogeeni-atomin hapetusluku on 0-3 ja reaktioseoksessa hapetusaineen ja entsyymivalmisteen kokonaisproteiinimäärän painosuhde on 0,01-1.

3 66728

On todettu, että keksinnön mukaisesti modifioitu mikrobijuoksutin destabiloituu huomattavasti ja että destabiloimisaste on riittävä täyttämään heran hyväksikäytölle asetettavat vaatimukset ilman, että sillä on huomattavaa haitallista vaikutusta juoksutinpreparaatin varastoimisstabiilisuuteen. Yllättäen on todettu, että keksinnön mukaisesti on mahdollista aikaansaada sellainen destabiloimisaste (määritelty tarkemmin jäljempänä), joka on vähintään 5°C, edullisesti 7-ll°C, joka tällä edullisella alueella saattaa modifioidun entsyymin läm-pöstabiilisuuden vastaamaan vasikan juoksuttimen vastaavaa arvoa, jolloin vasikan juoksuttimen edulliset ominaisuudet yhdistyvät mikrobijuoksuttimen edullisten ominaisuuksien kanssa.

Juoksutinaktiivisuus määrätään menetelmällä British Standard 3624: 1963 (Menetelmä juoksuttimen maidon koaguloimiskyvyn määräämiseksi).

Koska tämä keksintö koskee mikrobijuoksuttimen säädettyä lämpödestabilointia, on jäljempänä selitetty niitä menetelmiä, joita käytetään lämpöstabiilisuuden mittaamiseksi ja lämpöstabiilisuuden määrän pienentämiseksi, so. destabiloitu-misen määrän pienentämiseksi, jolloin tämä destabiloituminen esitetään yksikössä °C.

Ihanteellisissa olosuhteissa voidaan entsyymi inaktivoida sopivan korkealla lämpötilatasolla siten, että entsyymin jään-nösaktiivisuus pienenee ajan funktiona alenevan eksponentti-käyrän mukaisesti, so. jossa esiintyy selvästi määriteltävä puoliintumisaika, joka on lämpötilan (°C) funktio. Puoliintumisaika Tjy2 voidaan laskea kaavasta (t9-t.) In2 lnAl “ lnA2 jossa A^ on entsyymiaktiivisuus mitattuna kuumentamisen jälkeen määrättyyn lämpötilaan ajan t^ kuluessa, kun taas A2 on entsyymiaktiivisuus mitattuna ajan t2 pituisen kuumentamisen jälkeen samaan määrättyyn lämpötilaan. Puoliintumisaika on sitä lyhyempi mitä korkeampi on lämpötila muiden olosuhteiden 4 66728 pysyessä ennallaan. Useita entsyymejä käytettäessä vaikuttaa entsyymiliuoksen pH-arvo ja ionivahvuus sekä määrättyjen suolojen esiintyminen oleellisesti puoliintumisaikaan. Lisäksi voi entsyymin kemiallinen modifiointi muuttaa puoliintumisai-kaa oleellisesti. Mikäli määrätyn entsyymin kemiallinen modifiointi aiheuttaa entsyymin lämpödestabiloitumisen, sanotaan destabiloitumisasteen olevan n°C jos alkuperäisellä (modifioi-mattomalla) entsyymillä ja modifioidulla entsyymillä on sama puoliintumisaika lämpötilassa N°C ja vastaavasti lämpötilassa (N-n) °C.

On kuitenkin huomattava, että destabiloimisarvot ovat likiarvoja määrättyyn asteeseen saakka johtuen puoliintumisajan likiarvoluonteesta. Kaikki destabiloitumisarvot on tässä selityksessä mitattu pH-arvossa 6,0, koska destabiloimismittaus-ten tulokset riippuvat pH-arvosta.

Normaalisti seuraa keksinnön mukaista käsittelyä aktiivisuuden pieneneminen. On todettu, että taloudellisista syistä destabiloitumista ei tule suorittaa siinä määrin, että vastaava aktiivisuuden menetys on suurempi kuin noin 50 %, edullisesti suurempi kuin noin 30 %, ja kaikkein edullisimmin sen tulee olla alle 10 %.

Tyypillisessä tapauksessa noin 10°C suuruinen destabiloitu-minen, aktiivisuuden menetyksen ollessa rajoitettuna alle 10 %, näyttää olevan sopiva kompromissi edellä mainittujen vastakkaisten tekijöiden välillä.

Esimerkkejä sopivista hapettavista aineista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat hypokloriitti, esim. natriumhypokloriitti, hypobromiitti, esim. natriumhypobromiitti, vapaa kloori, N-kloori-meripihkahappoimidi, kloramiini-T ja trikloori-isosyanuurihappo.

Hapetusainetta on käytettävä sellaisessa väkevyydessä, että haluttu destabiloitumisaste aikaansaadaan kohtuullisessa ajassa, joka voi olla muutamasta minuutista aina 48 tuntiin tai vielä pitempi niissä tapauksissa, joissa reaktion annetaan tapahtua sitä keskeyttämättä. Siinä tapauksessa, että 5 66728 hapetusaineen väkevyys on liian pieni, on destabiloituminen myös liian pieni, ja siinä tapauksessa, että hapetusaineen väkevyys on liian suuri, on myös aktiivisuuden menetys liian suuri. Optimiväkevyydet vastaavat varsinaisesti hapetusaineen ja entsyymipreparaatissa olevan proteiinin kokonaismäärän välistä painosuhdetta, noin 3-30 osaa hapetusainetta per 100 osaa kaikkiaan proteiinia. Jos mikrobijuoksutinvalmiste puhdistetaan suureen yksikköaktiivisuuteen, voidaan hapetusaineen määrä pienentää niinkin pieneen arvoon kuin 1 g per 100 g kaikkiaan proteiinia.

Se pH-arvo, jossa reaktio tapahtuu, voi vaihdella laajoissa rajoissa, so. välillä noin pH 3 ja 10, jolloin edullisimmat alueet riippuvat pääasiallisesti hapetusaineesta. Täten hypokloriitin ollessa hapetusaineena on edullisin pH-alue 5-9, vielä edullisemmin 6-8.

Reaktiolämpötila ei ole kriittinen silloin, kun reaktiolämpö-tiloja pidetään sellaisissa arvoissa, esim. alle noin 30°C, joissa entsyymin stabiilisuus on tyydyttävä. Entsyymistabiili-suutta voidaan kuitenkin parantaa lisäämällä tunnettuja pro-teiininstabiloimisaineita, esim. NaCl, määrässä 5-20 % entsyy-mipreparaattia, tai sorbitolia tavanomaisissa entsyymiä stabiloivissa määrissä.

Kysymyksessä olevaa reaktiomekanismia ei täysin ymmärretä eikä myöskään ole varmaa sisältääkö lopullinen destabiloitu entsyymimolekyyli halogeenisubstituentteja. On ilmeistä, että entsyymissä, samoin kuin kaikissa proteiinimolekyyleissä, voi tapahtua ja tapahtuu useita erilaisia reaktioita, esim. hapetus- ja kloorausreaktioita. Koska mielenkiinto tässä yhteydessä kohdistuu destabiloitumiseen, ovat kaikki sellaiset reaktiot, jotka deaktivoivat entsyymin, haitallisia, kun taas sellaiset reaktiot, jotka termisesti destabiloivat entsyymiä pienentämättä entsyymiaktiivisuutta, ovat toivottavia.

Destabiloimisarvo vähintään 5°C, edullisesti 7-ll°C, ja tätä seuraava aktiivisuuden menetys, joka ei ole suurempi kuin 30 %, ja on edullisesti alle· 10 %, katsotaan rajoiksi keksintöä toteutettaessa. Aktiiviset halogeeni-hapetusaineet täyttä- 6 66728 vät nämä ehdot. Vapaa kloori, joka johdetaan vesipitoiseen väliaineeseen, muuttuu kloridi- ja hypokloriitti-ioneiksi. Edellä mainitut U-kloorireagenssit muuttuvat vastaaviksi hypokloriitti-ioneiksi. Edullinen reagenssi on natriumhypokloriitti, jota käytetään pH-alueella 5-9, edullisesti 6-8.

Asyloiminen, joka kuvataan belgialaisessa patenttihakemuksessa n:o 6/47048, aiheuttaa noin 3°C suuruisen destablloitumisen. Hapettaminen vetyperoksidilla aikaansaa myös destabiloitu-misen.

Entsyymin suora käsittely aktiivisella halogeenireagenssilla esim. natriumhypokloriitilla, aikaansaa useita käsittelyetu-ja peroksidireaktioon verrattuna. Pääedun oletetaan olevan sen, että aktiivinen halogeenireagenssi voi kulua täydellisesti reaktioseoksessa, kun taas reaktio peroksidia käytettäessä on lopetettava esimerkiksi katalaasia lisäämällä.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräs edullinen toteuttamismuoto käsittää käsittelyn sellaisella hapetusaineella, jonka muodostaa klooripitoinen yhdiste.

Eräs toinen edullinen keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamismuoto käsittää käsittelyn destabiloimisasteeseen vähintään 5°C, edullisesti 7-ll°C, siten, että juoksutinaktiivisuuden pieneneminen ei ylitä 50 % eikä ole edullisesti suurempi kuin 30 %.

Eräs toinen edullinen keksinnön toteuttamismuoto esittää käsittelyn hapetusaineella, joka on halogeenipitoinen yhdiste, jonka halogeenin hapetusluku on 0 tai 1.

Eräs toinen edullinen keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamismuoto käsittää hypokloriittikäsittelyn.

Eräs toinen keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamismuoto käsittää Mucor miehei-juoksuttimen käsittelyn.

Eräs toinen edullinen keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamismuoto käsittää käsittelyn hapetusaineella, jolloin hapetusaineen ja entsyymipreparaatissa olevan proteiinin kokonaismäärän 66728 välinen painosuhde reaktioseoksessa on välillä 0,01 ja 1 ja edullisesti välillä 0,03 ja 0,3.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään toisen edullisen toteuttamismuodon mukaisesti on vesipitoisen väliaineen pH-arvo välillä 5 ja 9.

Eräässä toisessa keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa toteuttamismuodossa on vesipitoisen väliaineen lämpötila välillä 0 ja 30°C.

Keksinnön erään toisen toteuttamismuodon mukaisesti keksintö käsittää destabiloidun mikrobijuoksuttimen, joka on valmistettu keksinnön mukaista menetelmää käyttäen.

Keksinnön kolmannen toteuttamismuodon mukaisesti se käsittää menetelmän juuston valmistamiseksi, jonka mukaisesti keksinnön mukaista juoksutinta käytetään maidon koaguloimiseksi. Se hera, joka on peräisin tästä juustonvalmistuskäsittelystä, voidaan käyttää pastöroimisen jälkeen proteiinipitoisena aineosana ilman vaikeuksia.

Käytännössä on todettu, että destabiloidun juoksuttimen käyttö on edullista valmistettaessa kestojuustoja.

Kahdessa samanlaisessa 150 litran suuruisessa juustonvalmis-tussäiliössä valmistettiin kukin juusto käyttäen modifioitua Mucor miehei-juoksutinta, joka oli valmistettu tämän selityksen esimerkin 16 mukaisesti, ja käytetään modifioimatonta Mucor miehei-juoksutinLa. Kuusi koetta suoritettiin kahteen kertaan. Näiden kokeiden tuloksina voitiin todeta, että keksinnön mukainen juoksutin kykeni aikaansaamaan tavanomaisia tanskalaisia juustolaatuja, kuten Sams0 ja Danbo, joilla oli vähintään yhtä hyvät ominaisuudet kuin käytettäessä vastaavaa modifioimatonta juoksutinta.

Destabiloimismenetelmä voidaan toteuttaa ja edullisesti toteutetaan lopullisena vaiheena mikrobijuoksutinta valmistettaessa. Todellisuudessa voidaan (kaupallisesti) puhdasta mikrobijuoksutinta tai juoksutinkonsentraattia käyttää tätä 66728 keksintöä toteutettaessa. Niinpä esim. mikrobijuoksutin-liuoksen, joka muutoin on valmista tavanomaisiin viimeistelykä-sittelyihin ennen käyttöä, pH-arvo säädetään määrätylle käsittelyalueelle (esimerkiksi pH 7) ja sekoitetaan sitten ympäristön lämpötilassa hapetusaineliuoksen kanssa, jonka hape-tusaineen määrä on edellä mainitulla painosuhdealueella 3-30 osaa (esimerkiksi natriumhypokloriitin määrä on 20 osaa) 100 osaa kohden mikrobijuoksutinliuoksessa olevan proteiinin kokonaismäärästä. Seoksen annetaan sitten seistä muutamia tunteja siksi, kunnes haluttu destabiloimisaste on saavutettu, esim.

2-3 tuntia. Reaktio voidaan lopettaa lisäämällä aktivoitua hiiltä tai pelkistysainetta, kuten natriumsulfiittia, sopivan reaktioajan kuluttua. Destabiloitua entsyymituotetta voidaan sitten käsitellä tavanomaisten viimeistelykäsittelyjen avulla, esim. suodattamalla, säätämällä pH-arvo ja entsyymin yk-sikköaktiivisuus tavanomaisille tasoille jne.

Keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin alla oleviin esimerkkeihin viitaten.

Lähtöaine on seuraavissa esimerkeissä juoksutinväkevöite, joka on valmistettu brittiläisen patentin n:o 1 108 287 toisen koetehdaskokeen mukaisesti, jolloin ainoastaan viljely-liuos väkevöitiin aktiivisuuteen, joka vastasi suunnilleen puhtaan entsyymin 1 %:sta liuosta (Comptes Rendus des Traveaux du Laboratoire Carlsberg (1970), Voi. 37, n:o 14, 301-325), ja raakaan väkevöitteeseen lisättiin 18 % NaCl. Yksinkertaisuuden vuoksi nimitetään tätä väkevöitettä seuraavassa nimellä "RENNILASE 46".

Esimerkki 1

Kaksi kolmen 25 ml:n erän sarjaa, jotka oli valmistettu sekoittamalla 12,5 ml RENNILASE 46 ja 12,5 ml vettä, säädettiin vastaavasti pH-arvoihin 7,0, 8,0 ja 9,0 lisäämällä 1-n NaOH, ja kuhunkin näihin seoksiin lisättiin 0,4 ml 2,25 M NaClO-liuosta, jolloin pH-arvo pidettiin vakiona edellä mainituissa arvoissa.

Ensimmäinen sarja, joka käsitti kolme erää, sovitettiin jäähdytyslaitteeseen yli yön (noin 18 tuntia). Toinen sarja, joka 9 66728 käsitti kolme erää, pidettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Mainittujen jaksojen jälkeen mitattiin pH-arvon aleneminen. Tämän jälkeen nämä annokset laimennettiin sekoittamalla 0,2 ml 50 ml:n kanssa vettä ja samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 6,0 natriumasetaatti/etikkahapolla.

Ne pH-arvon alenemiset ja jäännösaktiivisuudet, jotka saatiin juoksuttimen ja natriumhypokloriitin reaktion jälkeen, on esitetty seuraavassa taulukossa.

pH kun on kulunut Jäännösaktiivisuus (%) kun

Alku pH on kulunut 2 tunti'a 18 tuntia 2 tuntia 18 tuntia 7.0 6,9 6,9 86,3 83,1 8.0 7,6 7,6 86,1 81,7 9.0 8,2 8,2 78,4 75,4 Tämän jälkeen lämpökäsiteltiin laimennettuja näytteitä lämpötilassa 55°C 30 min pH-arvossa 6,0, jonka jälkeen mitattiin j äännösaktiivisuudet.

Jäännösaktiivisuus (%) 30 minuutin pituisen Alku pH lämpökäsittelyn jälkeen lämpötilassa 55°C

2 tunnin näyte 18 tunnin näyte 7 16,3 4,2 8 16,3 4,3 9 32,3 14,6

Vertailu 98,7

Edellä mainitut jäännösaktiivisuudet vastaavat seuraavia puoliintumisajan ja destabiloitumisen arvoja.

mu,, T, /0 min? 30 min. 55°C, _ . . .. .,

Alku pH 1/2 Destabiloitummen pH 6,0 2 tuntia 18 tuntia 2 tuntia 18 tuntia 7 11,5 6,5 11 12 8 11,5 6,6 11 12 9 18,4 10,8 10 11

Vertailu 10 66728

Esimerkki 2

Kolmen 150 ml suuruisen RENNILASE 46-erän pH säädettiin vastaavasti arvoihin 5,0, 6,0 ja 7,0. Kukin näistä kolmesta erästä jaettiin kolmeksi osaksi, joihin lisättiin vastaavasti 0,8 ml, 1,2 ml ja 1,6 ml kaupan olevaa 2,25 M NaOCl-liuosta, jolloin pH pidettiin vakiona mainituissa arvoissa.

Näitä yhdeksää näytettä varastoitiin sitten ympäristön lämpötilassa (22°C) 18-20 tuntia, jonka jälkeen kustakin yhdeksän näytteen sarjasta otettiin 10 ml:n näyte. Kuhunkin näihin 10 ml:n näytteisiin lisättiin vastaavasti 0,4, 0,6 tai 0,8 ml 1 M Na2SO-j-liuosta riippuen siitä, kuinka paljon NaOCl:ä oli lisätty vastaavaan erään, tarkoituksella poistaa mahdollisesti läsnä oleva ylimääräinen hypokloriitti.

0,2 ml täten käsiteltyjä näytteitä laimennettiin 50 ml:11a vettä ja pH säädettiin arvoon 6,0 etikkahappo/natriumasetaa-tilla. Laimennetut ja pH-arvoltaan säädetyt näytteet lämpö-käsiteltiin lämpötilassa 55°C 30 min. Aktiivisuussaanto, jäännösaktiivisuus lämpökäsittelyn jälkeen ja laskettu puoliintumisaika sekä destabiloituminen ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätty Aikaansaa- Jäännösaktii- T.» minuut- Destabi- pH NaOCl- tu aktii- visuus, %, / _ . loituni-

määrä, visuus, % 30 min, 55PC, nen, °C

_ ml_ _ pH 6,0 55 C, pH 6,0 _ 0,8 99,4 59,4 39,9 8 5.0 1,2 95,3 57,6 37,7 9 1.6 84,8 56,1 36,0 9 0,8 100 53,9 33,6 9 6.0 1,2 91,6 50,5 30,4 9 1.6 81,4 47,9 28,3 9 0,8 98,1 49,1 29,2 9 7.0 1,2 87,7 42,7 24,4 10 1.6 78,3 35,7 20,2 10

Esimerkki 3 600 ml RENNILASE 46 säädettiin lämpötilassa noin 10°C pH-ar-voon 6,0 4-n NaOH:n avulla. Tämä osa jaettiin kuuteen 100 11 66728 ml:n erään. Kuhunkin näihin kuuteen erään lisättiin vastaavasti O, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 ja 2,4 ml kaupallista 2,25 M NaOCl-liuosta ja kaikkien kuuden osan pH säädettiin arvoon 7.

Noin 15 tunnin kuluttua lisättiin suunnilleen lämpötilassa 5°C 2 ml 1 M NajSO^ia tarkoituksella poistaa mahdollinen ylimääräinen hypokloriitti. Sulfiitin lisäys ei muuttanut juok-suttimen stabiilisuutta. Aktiivisuuden muutos mitattiin. Myös 5 ml näytteitä laimennettiin 10 kertaisesti 0,1 M asetaatti-puskurissa, pH 6,0, jonka jälkeen 5 ml laimennettuja näytteitä lämpökäsiteltiin lämpötilassa 60°C 15 min. Jäännösaktiivisuus lämpökäsittelyn jälkeen määrättiin ja puoliintumisaika ja de-stabiloituminen laskettiin. Arvot ilmenevät seuraavasta taulukosta .

Lisätty Kokonais- Jäännösak- T. min* Destabi- määrä 2,25 M aktiivi- tiivisuus-% . J . crf>c l°itu-

NaOCl, ml suuden lämpökäsitte- „ ' minen, _ muutos, % ly n jälkeen ^ '___ £c_ 0-99 - - 0,8 + 0,6 35 9,9 9 1,2 0 19 6,3 10 1,6 - 4,4 14 5,3 10 2,0 - 8,5 10 4,5 10 2,4 -14,9 7 3,9 11

Esimerkki 4 Tämän esimerkin lähtöaine ei ollut RENNILASE 46 vaan sellainen RENNILASE 46, johon ei ollut lisätty 18 % NaCl.

Edellä mainitun lähtöaineen perusteella valmistettiin viisi 200 g näytettä, jotka sisälsivät vastaavasti 0, 5, 10, 15 ja 20 % NaCl. pH säädettiin arvoon 6,0 4-n NaOHrn avulla.

Kustakin edellä mainitusta viidestä 200 g näytteestä otettiin 100 ml:n näyte. Kuhunkin viiteen 100 ml:n näytteeseen lisättiin 1 ml kaupallista 2,25-n NaOCl-liuosta, jolloin lämpötila pidettiin välillä 5 ja 10°C. Kaikkien viiden 100 ml:n näytteen pH säädettiin sitten arvoon 7,0 4-n NaOH:n avulla ja seisotettiin lämpötilassa noin 5°C.

12 66728

Noin 20 tunnin pituisen seisottamisajan jälkeen määrättiin aktiivisuuden muutos. Myös 5 ml näytteitä laimennettiin 10-kertaisesti 0/1 M asetaattipuskurilla, pH 6,0, jonka jälkeen 5 ml suuruisia laimennettuja ja pH-arvoltaan säädettyjä näytteitä lämpÖkäsiteltiin lämpötilassa 60°C 15 min. Tämän jälkeen määrättiin jäännösaktiivisuus. Ei-lämpökäsitelty näyte käsiteltiin rinnakkain vertailunävtteenä.

Koeparametrit ja tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätty Lisätty Aktiivi- Jäännösak- T. min Destabi-

NaCl- määrä suuden tiivisuus . loituni- prosent- 2,25 M muutos, 15 min pitui- nen, timäärä NaDCl, ml % sen lämpökä- 9c sittelyn P« 6,0 jälkeen, % 0 0 - 98 - 0 1 4,2 31 8,9 9 5 1 +7,8 32 9,1 8 10 1 + 4,0 40 11,3 8 15 1 + 6,8 46 13,4 8 20 1 + 2,4 51 15,4 8

Esimerkki 5

Kymmenen koesarjaa suoritettiin erilaisissa pH-arvoissa, nimittäin arvoissa 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ja 11,0. Kussakin sarjassa oli kolme näytettä, jotka oli valmistettu laimentamalla 12,5 ml suuruisia eriä RENNILASE 46 yhtä suurella tilavuusmäärällä vettä. Ensimmäiseen näytteeseen kussakin sarjassa lisättiin 75 ^ul kaupan olevaa 2,25 M nat-riumhypokloriittiliuosta, toiseen 150 ^ul ja kolmanteen 300 ^,ul, jotka määrät vastaavat (noin) vastaavasti 4, 8 ja 16 g natriumhypokloriittia 100 g kohden näytteessä olevaa koko-naisproteiinia. Kunkin sarjan pH pidettiin vakiona esitetyissä arvoissa. Reaktiolämpötila oli sana kaikissa sarjoissa (noin 5°C) .

Suunnilleen 114, 66 ja 90 tunnin pituisten reaktioaikojen jälkeen, käytettäessä vastaavasti kunkin sarjan ensimmäistä, toista ja kolmatta näytettä, laimennettiin kaikki näytteet 50 ml:ksi. Analyysissä käytettävät näytteet valmistettiin 66728 laimentamalla sopivasti (suunnilleen suhteessa 1:125), jolloin pH säädettiin samanaikaisesti arvoon 6,00 etikkahapon ja nat-riumasetaattiliuosten avulla.

Näitä näytteitä lämpökäsiteltiin sitten lämpötilassa 55°C 30 min. AktiivisuusaEvo, jäännösaktiivisuus lämpökäsittelyn jälkeen, laskettu puoliintumisaika ja siitä laskettu destabi-loituminen on esitetty seuraavassa taulukossa.

66728

Alku Lisätty Lopul- Aktiivi- Jäännös- T , Destabi- pH NaClO- linen suus- aktiivi- l'2 loituni- määrä, pH- saanto, suus, min nen, yUl/25 ml arvo % % o _ näytettä _ ______ _ _ ^ 75 2,52 93,0 77,3 80,8 6 2,5 150 2,75 80,5 71,6 62,2 7 300 2,50 16,2 40,7 23,1 9 75 3,00 101,3 76,9 79,2 6 3 150 3,15 97,6 60,5 41,4 8 300 3,00 32,4 70,0 22,7 9 75 3,96 106,1 71,8 62,8 7 4 150 4,05 102,4 64,2 46,9 8 300 3,94 69,8 41,3 23,5 9 75 4,95 104,4 74,5 70,6 7 5 150 4,99 99,4 62,2 43,8 8 300 4,80 71,1 45,1 26,1 10 75 5,86 101,7 59,4 39,9 8 6 150 5,98 94,8 40,8 23,2 9 300 5,66 61,5 8,6 8,48 11 75 6,61 96,3 39,5 22,4 9 7 150 6,64 90,2 7,1 7,86 11 300 6,51 49,2 4,0 6,46 11 75 7,40 94,3 48,3 28,6 8 8 150 7,26 87,1 6,4 7,57 11 300 - - - 75 8,02 90,4 68,2 54,3 7 9 150 7,79 77,7 17,5 . 11,9 . 10 300 7,34 47,3 9,3 K) 2,92 XJ 13 75 8,34 81,2 78,6 36,4 6 10 150 8,23 68,5 34,0 . 19,3 9 300 7,83 44,4 9,3 XJ 2,92 X) 13 75 10,34 57,2 93,5 30,9 4 11 150 10,02 42,2 74,4 70,3 7 300 9,80 9,9 x) 10 min pituinen lämpökäsittely.

Nämä arvot osoittavat, että seuraavat olosuhteet ovat optimaaliset suoritettaessa destabiloiminen natriumhypokloriitilla .

ph-alue: 6-8.

66728

Natriumhypokloriittimäärä: 150 ui 2,55 M liuosta per näyte, vastaa (suunnilleen) 8 g natriumhypokloriittia per 100 g kaikkiaan proteiinia.

Esimerkki 6

Valmistettiin kaksi erää seoksesta, jossa oli 25 ml RENNILASE 46 ja 20 g jäävettä, jolloin pH säädettiin arvoon 7,0 4-n NaOH:n avulla.

Näihin kahteen erään lisättiin vastaavasti 33 ja 66 mg N-kloo-rimeripihkahappoimidiä liuotettuna 5 ml:an jäävettä, jolloin pH säädettiin samanaikaisesti arvoon 7,0.

Kaksi tuntia myöhemmin laimennettiin 0,2 ml erät 50 ml:11a vettä, jolloin pH säädettiin samanaikaisesti arvoon 6,0 nat-riumasetaatti/etikkahapon avulla.

Jäännösaktiivisuus reaktion jälkeen juoksuttimen ja N-kloori-meripihkahappoimidin avulla oli seuraava: N-kloorimeripihkahappoimidin Jäännösaktiivisuus, % lisätty määrä _523_ ______ 33 99,0 66 96,5 Lämpökäsittely suoritettiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1 lämpötilassa 55°C 30 min pH-arvossa 6,0. Tämän jälkeen jään-nösaktiivisuudet määrättiin ja laskettiin puoliintumisajat ja destabiloitumiset. Tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätty N-kloo- Jäännösaktii- T, ro*·11' Destabiloi- rimeripihkahap- visuus, 55°C, . tuminen, poimidi-määrä, 30 min, pH cco?TnAw a n °r

mg 6,00, % 55 C' pH 6,0 C

33 41,5 23,6 10 66 26,4 15,6 10

Esimerkki 7

NaOBr-liuos, jonka molaarisuus oli noin 2, valmistettiin lisäämällä tipottain 3 g Br2:a 10 ml:an sekoitettua 4-n NaOH-liuosta jääkylvyn avulla jäähdyttäen.

16 66728 25 ml RENNILASE 46 sekoitettiin 25 ml:n kanssa vettä ja pH säädettiin arvoon 7,5 1-n NaOH:lla. 25 ml:an tätä liuosta lisättiin 0,5 ml edellä mainittua natriumhypobromiittiliuos-ta noin tunnin kuluessa, jolloin pH pidettiin arvossa välillä 7,3 ja 7,8 1-n HCl:ää lisäämällä.

Noin 30 min myöhemmin määrättiin aktiivisuuden menetys ja lämpöstabiilisuus. Aktiivisuuden menetys oli noin 20 % ja jäännösaktiivisuus 20 min pituisen käsittelyn jälkeen lämpötilassa 60°C ja pH-arvossa 6,0 oli 14 %, mikä vastasi noin 7 minuutin puoliintumisaikaa tai noin 8°C suuruista destabi-loitumista.

Esimerkki 8 50 ml RENNILASE 46 laimennettiin 50 ml:11a vettä. Seos jäähdytettiin jääkylvyn avulla ja pH säädettiin arvoon 7,0 1-n NaOH:lla. Tämän jälkeen lisättiin noin 0,1 g vapaata C^ia, jolloin pH aleni arvoon noin 3,8 ja neste tuli sameaksi ja vaaleammaksi. Reaktioseoksen annettiin vaikuttaa noin 10 min ja sitten lisättiin 4 ml 1 M Na2S03~liuosta ylimääräisen poistamiseksi.

0,2 ml näytteet laimennettiin ennen Cl2^n lisäämistä ja sen jälkeen 50 ml:11a vettä ja pH säädettiin arvoon 6,0 natrium-asetaatti/etikkahapolla. Se aktiivisuuden menetys, joka liittyi juoksuttimen ja kloorin väliseen reaktioon, oli 21 %.

Kloorilla käsitellyn juoksuttimen lämpökäsittelyn jälkeen lämpötilassa 55°G 30 minuutin kuluessa oli jäännösaktiivisuus 63 %. Tämä vastaa noin 45 minuutin puoliintumisaikaa ja noin 8°C destabiloitumista.

Esimerkki 9

Valmistettiin kaksi erää 25 ml:sta RENNILASE 46 ja 25 g:sta jäävettä ja pH säädettiin arvoon 7,0 4-n NaOH:lla.

Näihin kahteen seokseen lisättiin vastaavasti 60 ja 120 mg trikloori-isosyanuurihappoa ja samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 7,0.

17 66728

Suunnilleen 4 tuntia nyöheminin laimennettiin 0,2 ml edellä mainittuja seoksia 50 ml :11a vettä ja samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 6,0 natriumasetaatti/etikkahapolla. Täten laimennettuja näytteitä lämpökäsiteltiin lämpötilassa 55°C 30 min.

Aktiviteettisaannot, jäännösaktiivisuudet lämpökäsittelyn jälkeen ja laskettu puoliintumisaika ja destabiloituminen ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätyn trikloo- Aktiivi- Tl/2 min' Destabiloi- ri-isosyanuuri- suussaanto, 3/ -n 55oc tuminen, hapon määrä, mg % „ ^ «/ ' o„ pn o / v/ L> 60 93,0 35 9 120 81,5 16 10

Esimerkki 10

Kaksi 25 ml:n erää RENNILASE 46 sekoitettiin 20 g:n kanssa jäävettä kummassakin erässä ja pH säädettiin arvoon 7,0 4-n NaOHtn avulla.

Molempiin edellä mainittuihin eriin lisättiin sitten vastaavasti 70 ja 140 mg kloramiini-T:tä liuotettuna 5 ml:an jäävettä, ja samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 7,0.

Noin 2 tuntia myöhemmin laimennettiin 0,2 ml edellä mainittuja näytteitä 50 ml:11a vettä, jolloin pH säädettiin samanaikaisesti arvoon 6,0 natriumasetaatti/etikkahapolla, ja täten laimennetut ja pH-arvoltaan säädetyt näytteet lämpökäsiteltiin lämpötilassa 55°C 30 min. Aktiivisuussaannot, jäännösaktiivisuudet lämpökäsittelyn jälkeen ja lasketut puoliintumisaika-arvot sekä destabiloituminen ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätty klora- Aktiivi- Ti/2 m^n' Destabi- miini T-määrä, suus- _n' loituminen,

**_ saanto' % 55°C,ΠρΗ 6,0 °C

70 96,5 19,2 10 140 77,9 8,5 12

Esimerkki 11 25 ml RENNILASE 46 säädettiin pH-arvoon 10,0 1-n NaOH:lla.

18 66728

Seos jäähdytettiin jäävedessä ja 2 ml:n liuoseriä, jotka sisälsivät 0,05 M I2 0,25 M KItssä, lisättiin edellä mainittuun 25 mitan pH-arvoltaan säädettyä RENNILASE 46, jolloin samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 10 1-n NaOHtlla kunkin 2 ml:n suuruisen jodireagenssin lisäämisen jälkeen. Otettiin vertailunäyte ja myös 0,5 ml näyte ennen jokaista uutta jodireagenssin 2 ml suuruisen lisäämisen suorittamista.

Analyyttisissä tarkoituksissa laimennettiin 0,5 ml näytteet ja pH säädettiin arvoon 6,0 etikkahappo/natriumasetaatilla. Tämän jälkeen suoritettiin lämpökäsittely lämpötilassa 60°C 30 minuutin kuluessa.

Koetulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Lisätty Aktiivi- Jäännösak- Ti/2 Destabi- I,-liuoksen suus- tiivisuus, * . no loituni- nlärä KI:ssä, 60QC' 30 ”*"· $ To

ml % % C

0 100 88 163 0 2 100 88 163 0 4 96 90 197 0 6 91 88 163 0 8 76 85 128 1 10 63 71 61 3

Esimerkki 12 RENNILASE 46 laimennettiin käyttämättä lisättyä NaClta kolmasti. 20 ml täten laimennettua RENNILASE 46 säädettiin pH-arvoon 8,5 ja jäähdytettiin lämpötilaan 0°C, jonka jälkeen lisättiin 0,7 ml liuosta, jossa oli 0,05 M I2 0,25 M KI:ssä. Noin 15 minuuttia myöhemmin säädettiin pH arvoon 6 lisäämällä 0,1 M NaHS03:a.

Tämä näyte laimennettiin analyyttisiin tarkoituksiin ja samanaikaisesti pH säädettiin arvoon 6,0 etikkahappo/natriumasetaa-tin avulla. Tämän jälkeen näytettä lämpökäsiteltiin lämpötilassa 60°C 30 min.

Aktiivisuussaanto oli 42,6 %.

19 66728 Jäännösaktiivisuus lämpökäsittelyn jälkeen oli 35 %.

Laskettu puoliintumisaika lämpötilassa 60°C ja pH-arvossa 6 oli 20 min. Tämä vastaa noin 5°C suuruista destabiloitumis-ta, ja vertailunäytteellä oli sama puoliintumisaika, noin 20 min, lämpötilassa 65°C.

Esimerkki 13 3 g Mucor pusillus-proteaasia (Noury, 1:220 000) liuotetaan 30 ml:an 10 %:sta NaCl ja pH säädetään arvoon 6,5 lämpötilassa 5-10°C. 3 x 50 yUl 15 %:sta NaOCl lisätään 30 minuutin väliajoin. Kolmen tunnin pituisen sekoittamisen jälkeen seosta pidetään lämpötilassa 4°C 16 tuntia ja pH säädetään arvoon 5,0. Näytteet otetaan talteen aktiivisuuden ja lämpöstabiili-suuden määräämiseksi. Tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta .

Näyte/reak- Aktiivi- Puoliintumisaika Destabi- tioaika suussaanto, pH-arvossa 6,0, loituminen, a 0-30 min lämpöti- o lassa: c (min) _ _ 5 0°C_55°C __

Vertailu 100 144-155 18-31 24 tuntia 84-91 26-22 5-11 5

Esimerkki 14 Tämän esimerkin mukainen lähtöaine ei ollut RENNILASE 46 vaan RENNILASE 46, johon oli lisätty 6 % NaCl 18 %:n NaCl sijasta.

1 litra lähtöainetta jaettiin neljään 250 ml:n suuruiseen erään. Lämpötila säädettiin arvoon 5-10°C ja näiden kolmen erän pH säädettiin arvoon 6,5 4-n NaOH:n avulla. Näihin kolmeen erään lisättiin myös vastaavasti 1, 1,2 ja 1,4 % (tilavuus /tilavuus) 13,5 %:sta paino/paino NaOCl:ää, jonka jälkeen pH säädettiin arvoon 7,5 4-n NaOH:lla, ja näytteitä haudottiin lämpötilassa noin 5°C.

Vastaavasti 3, 27 ja 53 tunnin pituisten reaktioaikojen jälkeen poistettiin 50 ml näytteet kustakin hypokloriitin avulla käsitellystä erästä, ja kuhunkin 50 ml:n suuruiseen näytteeseen 66728 20 lisättiin 250 mg (0,5 % paino/tilavuus) aktiivista hiiltä ("Carboraffin BGN"). 1 vuorokausi aktiivisen hiilen lisäämi sen jälkeen näytteet suodatettiin ja kokeiltiin stabiilisuu-den ja juoksutinaktiivisuuden suhteen (1* määräys). Näytteitä pidettiin lämpötilassa 5°C 9 vrk. hypokloriitin lisäämisen jälkeen, jonka jälkeen kokeiltiin uudelleen niiden stabiilisuus ja juoksuttimen aktiivisuus (saanto) (2’ määräys). Seis-tyään vielä 4 vrk lämpötilassa noin 5°C ja 2 vrk lämpötilassa noin 25°C, määrättiin juoksutinaktiivisuus jälleen ja tulos laskettiin (3' määräys).

Tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa, joista ilmenee, ettei tapahdu oleellista destabiloitumisen tai aktiivisuus-saannon muutosta kun reaktioaika pidennetään 3 tunnista 53 tunniksi.

Taulukko 1

Hypoklorii- Määräys Destabiloituminen, °C

tin lisäys, - % tilavuus/ Reaktioaika tilavuus 3 tuntia 27 tuntia 53 tuntia 1 1. 9,2 9,4 9,1 2. 9,3 9,4 9,3 1,2 1. 10,0 10,1 9,8 2. 10,0 10,1 10,1 1,4 1. 10,6 10,7 10,5 2. 10,6 10,6 10,7

Taulukko 2

Hypoklorii- Määräys Saanto, % tin lisäys, - % tilavuus/ Reaktioaika tilavuus 3 tuntia 27 tuntia 53 tuntia 1 1. 96 99 97 2. 97 99 95 3. 97 97 98 1,2 1. 90 93 92 2. 94 90 92 3. 92 94 94 1,4 1. 89 91 90 2. 92 89 91 3. 91 89 88 21 66728

Esimerkki 15

Viisi 25 ml:n näytettä RENNILASE 46 säädettiin vastaavasti pH-arvoihin 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ja 6,0.

Kuhunkin näihin näytteisiin lisättiin 0,04 g natriumkloriit-tia, jolloin pH-arvot pidettiin vakiona mainituissa arvoissa.

Näytteiden annettiin seistä lämpötilassa 5°C 6 vrk, jonka jälkeen ne analysoitiin jäännösaktiivisuuden ja lämpöstabiilisuu-den suhteen lämpötilassa 55°C ja pH-arvossa 6,0.

Alku-ph Jäännös- Puoliintumisaika (min) Destabiloi- aktiivi- (30 minuutin lämpökäsit- tuminen, suus, % te ly n jälkeen) o^, 2.0 23 122 5,5 2.5 73 63 6,7 3.0 90 53 7,0 3.5 97 48 7,3 6.0 94 49 7,2

Esimerkki 16 Lähtöaine tässä esimerkissä ei ollut RENNILASE 46 vaan sellainen RENNILASE 46, joka oli modifioitu kahdessa suhteessa: 1) viljelyväliaine väkevöitiin aktiivisuuteen, joka vastasi sellaisen liuoksen väkevyyttä, jossa on noin 1,6 % puhdasta entsyymiä (eikä 1 % puhdasta entsyymiä), ja 2) 9 % NaCl (eikä 18 % NaCl) lisättiin raakaväkevöitteeseen.

Tällä tavoin valmistettiin 5952 kg modifioitua RENNILASE 46 koetehtaassa.

pH säädettiin arvoon 6,4 lämpötilassa 9°C 34 %:sella NaOH:lla ja tähän lisättiin 109 kg 12,5 %:sta (paino/paino) NaOCl-liuos-ta. Tämän käsittelyn aikana pH nousi arvoon 8,0 ja pH säädettiin arvoon 7,4 37 %:sen HCl:än avulla.

18 tunnin pituisen seisottamisen jälkeen lämpötilassa 9-5°C oli pH pudonnut arvoon 6,9. Tämän jälkeen lisättiin 1 % aktiivista hiiltä lämpötilassa 4-5°C. 26 tuntia myöhemmin suo ritettiin suodattaminen suodatinpuristimen avulla ja destabi-loituminen mitattiin jälleen. Lopuksi väkevöitiin sakan yläpuolella oleva liuos alipaineessa lämpötilassa 30°C ja pH-ar-vossa 6,7 ja NaCl:ää lisättiin kaikkiaan 18 %.

Todettiin, että lopputuotteen puoliintumisaika oli 11 min ja destabiloituminen 10°C.

Claims (8)

66728 22

1. Menetelmä mikrobiologisen juoksuttimen termiseksi destabi-loimiseksi aktiivisuuden vähenemiseen asti, joka ei ylitä 50 %, tunnettu siitä, että juoksutinta käsitellään vesiväli-aineessa pH-arvossa 3-10 halogenoitujen yhdisteiden ryhmän ha-petusaineella, jolloin halogeeniatomin hapetusluku on 0-3 ja reaktioseoksessa hapetusaineen ja entsyymivalmisteen kokonais-proteiinimäärän painosuhde on 0,01-1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että halogeeni on kloori.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetusaineena käytetään halogeenipitoista yhdistettä, jolloin halogeeniatomin hapetusluku on 0 tai 1.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetusaineena käytetään hypokloriittia.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään reaktioseoksessa hapetusaineen ja entsyymivalmisteen proteiinin kokonaismäärän painosuhdetta, joka on 0,03-0,3.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suoritetaan vesiväliaineessa pH-arvossa 5-9.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suoritetaan vesiväliaineessa 0-30°C:n lämpötilassa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisesti valmistetun juoksuttimen käyttö maidon koaguloimiseksi juustonvalmistuksessa.