KR20160003301A - 안정하게 장기간 보존할 수 있는 일본뇌염 백신의 제조방법 및 그 백신의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 일본뇌염 바이러스 백신의 불활화처리방법의 개량과, 복수의 백신을 혼합해서, 제조된 백신의 안전성의 검토를 행하였다. 그 결과, 종래의 일본뇌염 백신보다도 안정하게 장기간 보존할 수 있고, 세포 배양에 의해 제조한 안전성이 높은 일본뇌염 백신을 제조하는 것에 성공하였다. 또한, 다른 바이러스 백신에 있어서도, 동일한 제조방법에 의해, 보존 안정성이 양호한 백신을 제조할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

안정하게 장기간 보존할 수 있는 일본뇌염 백신의 제조방법 및 그 백신의 용도{Method of producing Japanese encephalitis vaccine stably storable over long time and use of the vaccine}

본 발명은 장기간의 보존에 있어서도 역가(titer)가 실질적으로 유지되는 특징을 갖는 일본뇌염 백신의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 당해 제조방법에 의해 제조된 일본뇌염 백신, 및 일본뇌염 백신 및 다른 종류의 항원 백신으로 되는 혼합 백신에 관한 것이다. 또한, 당해 백신을 대상자에게 투여하는 공정을 포함하는, 대상자에게 있어서 세균 및/또는 바이러스에 기인하는 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.

일본뇌염은, 작은 빨간집모기(Culex tritaeniorhyncus) 등의 모기가 매개하는 일본뇌염 바이러스의 감염에 의해 유발되는 감염증으로, 생후 조기부터 이환(罹患)할 수 있다. 바이러스 감염에 의해 유발되는 뇌증으로 사망률은 높고, 후유증은 심각하다. 예방을 위해서는 유아기(乳兒期)의 조기부터 백신에 의한 면역이 유효하다. 일본뇌염 바이러스는 플라비바이러스(Flaviviridae)에 속한다. 일본뇌염의 예방에 사용되는 백신은 이미 제조 판매되고 있고, 일본에서는 정기접종에 포함되어 있다. 일본뇌염 백신을 제법으로 분류하면, 마우스 뇌법(mouse brain method)에 의해 제조되는 백신과 세포 배양법에 의해 제조되는 백신이 있다. 또한 불활화 일본뇌염 백신(inactivated Japanese encephalitis vaccine)과 약독 생 일본뇌염 백신(attenuated live Japanese encephalitis vaccine)이 있다. 또한, 제형에 따라, 액상 백신과 동결건조 백신이 제조 판매되고 있다. 이하에 마우스 뇌법에 의해 제조되는 불활화 일본뇌염 백신에 대해 종래의 학설을 간단히 설명한다.

최초의 일본뇌염 백신, 즉 마우스 뇌 유래 백신은 1954년에 실용화되었으나, 그 정제도는 낮아, 알레르기성 중추신경장애를 유발할 위험성이 지적되고 있었다. 그 후 개량이 거듭되어, 1965년에 바이러스 정제가 진전되어 품질이 향상된 개량 일본뇌염 백신이 실용화되고, 현재까지 그 제조기술이 답습되어 왔다.

마우스 뇌법에 의해 제조되는 불활화 일본뇌염 백신은, 전술하는 바와 같이 정제도도 높아, 유효성이 높은 백신이다. 그러나, 이 불활화 일본뇌염 백신은, 안전성과 보존 안정성에 문제가 있다고 지적되어 왔다.

안전성에 관해서는, 충분히 관리되고 있지 않은 환경에서 사육된 마우스를 사용하기 때문에, 오늘날 요구되는 안전성 수준에서 본 경우, 미입인자(迷入因子, adventitious agent)가 백신 제품에 혼입될 가능성을 배제할 수 없는 것이 문제시된다. 이 점은 세포 배양법에 의한 제조법의 채용으로 기본적으로 해결된다. 최근, 세포 배양법에 의해 제조되는 백신이 세계적으로 주목을 모아, 선진국, 발전도상국을 불문하고 세계적으로 요망이 높아져 있다. 보존 안정성에 관해서는, 안정제로서 젤라틴이 백신에 첨가되었다. 그러나, 젤라틴은 알레르기반응을 유발할 위험성이 지적되어, 안정제로서 사용되지 않게 되고 있다. 보존 안정성을 확보하는 별도의 방법으로서, 동결건조제품을 제조함으로써, 냉실(冷室) 보존으로 장기 보존이 가능해진다. 그러나, 동결건조제품은 제조비용이 고가이고, 차가운 곳(冷所) 보존이나 냉동 보존에는, 보존을 위한 시설, 냉장고 등의 기기가 필요하여, 보존 비용이 든다는 결점이 있다.

즉, 불활화 일본뇌염 백신의 유해성, 안전성, 보존 안정성에 관하여 이하와 같이 정리할 수 있다. 먼저, 유효성은 비교적 만족스러운 정황에 있다. 안전성의 문제는 세포 배양 제조법의 개발에 의해 개량될 가능성이 높다. 그러나, 보존 안정성의 문제는 동결건조법에 의한 해결법은 있으나, 제조비용이 고가가 되는 결점이 있어, 액상제품의 보존 안정성은 확보되어 있지 않다. 즉, 안정하게 장기간 보존할 수 있는 새로운 일본뇌염 백신이 요구되고 있다.

또한, 다른 이유에서, 액상제품의 보존 안정성의 향상이 요구되고 있다. 액상제품은 통상 주사법으로 접종된다. 그러나, 충분한 의료시설과 의료전문가가 부족한 지역에 있어서 경비(經鼻)접종 또는 경피(經皮)접종에 사용하기 위해 안정한 액상 일본뇌염 백신제품의 공급이 요망되고 있다.

일본뇌염 백신과 마찬가지로, 다른 바이러스 백신에 있어서도, 저렴한 제조비용을 유지하면서, 보존 안정성이 우수한 백신의 개발이 요구되고 있다.

또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌정보를 이하에 나타낸다.

특허문헌 1: CA 2,390,995

특허문헌 2: US 6,841,374

특허문헌 3: EP 841,942

특허문헌 4: US 5,891,705

비특허문헌 1: TF Tsai et al(1999): In, Vaccines(3 rd Ed.)( ed. by S A Plotkin and WA Orenstein, 1999), pp 672-710: Japanese Encephaitis vaccine.

비특허문헌 2: K Sugawara et al(2002): Biologicals, 30, 303-314: Development of Vero cell-derived Inactivated Japanese Encephalitis vaccine.

비특허문헌 3: SC Wu, G Y-L Huang(2002): Biotechnol. Prog. 18, 124-128: Stationary and microcarrier cell culture processes for propagating Japanese Encephalitis virus.

비특허문헌 4: AK Srivastava et al(2001): Vaccine 19, 4557-75: A purified inactivated Japanese Encephalitis vaccine made in vero cells.

비특허문헌 5: A Lyons et al.(2007): Vaccine 25, 3445-53: A phase 2 study of a purified inactivated virus vaccine to prevent Japanese Encephalitis.

비특허문헌 6: SJ Barteling, R. Woortmeyer(1984): Arch Virol.80(2-3), 103-17: Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus: Conditions for the preparation of safe vaccine.

비특허문헌 7: B Metz et al.(2004): J. Biol. Chem., 279(8), 6235-6243: Identification of Formaldehyde-induced Modifications in Proteins: reactions with model peptides.

비특허문헌 8: C Marquie et al.(1998): Nahrung/Food(3/4), 42, 264-265: How to monitor the protein cross-linking by formaldehyde, glutaraldehyde or glyoxal in cotton-seed protein protein-based films?(short communication)

비특허문헌 9: WM McClurg et al.(1996): J Heart Valve Dis. 5(3), 343-7: Formaldehyde replaces glutaraldehyde in porcine bioprosthetic heart valves.

본 발명은 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, 마우스 뇌법으로 제조되는 불활화 일본뇌염 백신의 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 세포 배양법으로 얻어진 일본뇌염 바이러스에 대해, 복수의 불활화처리를 조합해서 행하는 공정을 포함하는, 실온 부근에 있어서도 장기간 안정하게 보존할 수 있어, 유효하며 안전한 액상 불활화 일본뇌염 백신의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 당해 제조방법에 의해 제조된 일본뇌염 백신, 또는 당해 안정한 일본뇌염 백신과 다른 종류의 항원 백신을 혼합한 혼합 백신을 제공하는 것도 목적으로 한다. 또한, 이들의 사용방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 세포 배양법으로 얻어지는 일본뇌염 바이러스의 불활화처리방법을 검토하였다. 또한, 복수의 백신을 혼합하여, 제조된 혼합 백신의 보존 안정성의 검토를 행하였다.

먼저, 일본뇌염 바이러스의 불활화처리조건을 검토하였다. 그 결과, 아미노산 등의 존재하에서 불활화처리를 행함으로써, 실온 부근에서 안정하게 장기간(예를 들면 2년(24개월) 이상) 보존할 수 있는 액상 불활화 일본뇌염 백신을 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 다음으로 아미노산 등의 존재하에서 물리화학적 처리에 의한 추가의 불활화처리를 행하는 공정, 또는 가온하면서 포르말린 불활화를 행하는 공정 등을 조합함으로써도, 실온 부근에서 안정하게 장기간 보존할 수 있는 액상 불활화 일본뇌염 백신을 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 다음으로, 상기의 방법으로 얻은 보존 안정성이 개선된 액상 불활화 일본뇌염 백신과 다른 백신을 혼합하여, 혼합 백신의 평가를 행하였다. 그 결과, 혼합 백신에 있어서도 일본뇌염 백신은, 안정하게 장기간 보존할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 불활화시에 아미노산을 첨가하는 것에 더하여, 정제 후에 아미노산 등의 안정제를 첨가함으로써, 일본뇌염 백신의 안정성이 유지되는 것을 명백히 하였다.

즉, 본 발명자들은, 종래의 마우스 뇌법에 의해 제조된 불활화 일본뇌염 백신에 비해, 안전성과 보존 안정성 양쪽이 개선된 일본뇌염 백신을, 복수의 불활화처리공정을 조합함으로써 저렴하게 제조하는 것에 성공하고, 이것에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 [1]~[20]을 제공하는 것이다.

[1] 일본뇌염 바이러스에 대해, 이하의 (a) 및/또는 (b)에 기재된 불활화처리를 행하는 공정을 포함하는, 불활화 전입자 일본뇌염 백신(inactivated whole Japanese encephalitis vaccine)의 제조방법.

(a) 아미노산, 아민류, 아미드류, 및/또는 유기산의 존재하에 있어서 화학적 수법에 의한 불활화처리를 행하는 공정

(b) 물리화학적 수법에 의한 불활화처리를 행하는 공정

[2] [1](a)에 기재된 아미노산이 아스파라긴산, γ-아미노부티르산, 알라닌, β-알라닌, 아르기닌, 글리신, 글루타민산, 이소류신, 류신, 리신, 세린, 트레오닌, 및 발린으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산인, [1]에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[3] [1](a)에 기재된 아민류가 에틸아민, 에탄올아민, 및 프로판올아민으로부터 선택되는 하나 이상의 아민류이고, 또는 (a)에 기재된 아미드류가 요소, 글리신아미드, 및 β-알라닐아미드로부터 선택되는 하나 이상의 아미드류이며, 또는 (a)에 기재된 유기산이 숙신산, 타르타르산, 글루콘산, 올레산, 락토비온산으로부터 선택되는 하나 이상의 유기산인, [1] 또는 [2]에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[4] [1](b)에 기재된 불활화처리가 가온, γ선 조사, 전자선 조사, 및 레이저광 조사로부터 선정되는 하나 이상의 처리방법인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[5] 가온에 의한 불활화처리가 24℃ 이상에서 행해지는 것을 특징으로 하는 [4]에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[6] 일본뇌염 바이러스가 임상 분리주(야외주), 인공 변이주, 유전자 재조합주, 또는 역유전학에 의한 회수주 중 어느 하나인 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[7] 세포 배양법으로 제조된 일본뇌염 바이러스를 사용하는 것을 특징으로 하는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[8] 무혈청 배양법으로 제조된 일본뇌염 바이러스를 사용하는 것을 특징으로 하는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[9] 무혈청 배양법으로 제조된 마스터 세포 뱅크를 세포 배양의 파종에 있어서 사용하는 것을 특징으로 하는, [7] 또는 [8]에 기재된 일본뇌염 백신의 제조방법.

[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조되는, 역가가 유지된 채 장기간 보존할 수 있는 특징을 갖는 불활화 전입자 일본뇌염 백신.

[11] 15℃ 이상 40℃ 이하의 보존온도에 있어서, 역가가 유지된 채 장기간 보존할 수 있는 특징을 갖는, [10]에 기재된 일본뇌염 백신.

[12] 아미노산, 아민류, 및/또는 아미드류를 안정제로서 포함하는, [10]에 기재된 일본뇌염 백신.

[13] 1년 이상, 4년 미만의 보존기간에 있어서 안정한 특징을 갖는 [10]에 기재된 일본뇌염 백신.

[14] 애쥬번트를 추가적으로 포함하는 [10]에 기재된 일본뇌염 백신.

[15] 애쥬번트 첨가 백신의 1 투여량(dose)의 항원량이 애쥬번트 무첨가 백신의 경우보다 적은 것을 특징으로 하는 [14]에 기재된 백신.

[16] 제형이 액상인 것을 특징으로 하는 [10] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 백신.

[17] [10] 내지 [16] 중 어느 하나에 기재된 일본뇌염 백신 및 다른 종류의 항원으로 되는 혼합 백신.

[18] 다른 종류의 항원이, 디프테리아톡소이드, 파상풍톡소이드, 백일해 백신, 인플루엔자균 백신, 수막염균 백신, 경구 폴리오 백신(oral poliomyelitis vaccine), 불활화 폴리오 백신, 또는 간염 백신으로부터 선택되는 하나 이상의 항원인 [17]의 혼합 백신.

[19] [10]에 기재된 일본뇌염 백신 또는 [17]에 기재된 혼합 백신을 대상자에게 투여하는 공정을 포함하는, 대상자에게 있어서 세균 및/또는 바이러스에 기인하는 질환을 예방하는 방법.

[20] 질환이, 일본뇌염 바이러스에 기인하는 질환인 것을 특징으로 하는 [19]에 기재된 방법.

이하에, 세포 배양법으로 제조하는 액상 불활화 일본뇌염 백신에 대해 설명한다.

본 발명은 세포 배양법으로 얻어진 일본뇌염 바이러스에 대해, 복수의 불활화처리를 조합하여 행하는 공정을 포함하는, 실온 부근에 있어서도 장기간 안정하게 보존할 수 있어, 유효하며 안전한 액상 불활화 일본뇌염 백신의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 당해 제조방법에 의해 제조된 일본뇌염 백신, 또는 당해 안정한 일본뇌염 백신과 다른 종류의 항원 백신을 혼합한 혼합 백신을 제공하는 것도 목적으로 한다. 또한, 그들의 사용방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.

이하의 기술에 있어서 「보존 안정성」이란, 일본뇌염 백신을 실온 부근에서 보존한 경우의 잔존 역가가 유지되는 것을 의미한다. 특별히 언급하지 않는 한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 백신은 액상제품을 의미한다. 실온 부근이란, 15℃ 이상 40℃ 이하의 온도를 의미한다. 본 발명에 있어서, 보존기간으로서, 바람직하게는 1년 이상의 기간이고, 보다 바람직하게는 2년 이상 4년 미만의 기간이다. 당연히, 본 발명의 백신을 동결건조품으로서 제조한 경우, 종래대로, 차가운 곳에서 장기간, 안정하게 보존할 수 있다.

본 발명의 일본뇌염 백신의 제조에 사용하는 바이러스주는 항원성이 있으면, 임상 분리주, 야생주, 인공 변이주, 약독성 백신주, 유전자 재조합주 중 어느 것도 사용할 수 있다. 유전자 재조합주 중에는 역유전학의 수법으로 회수되는 바이러스주를 포함한다. 또한, 바이러스 취득법으로서는 마우스 뇌법과, 세포 배양법 중 어느 것이어도 되나, 세포 배양법이 바람직하다.

바이러스주의 세포 배양에 사용하는 세포는 일본뇌염 바이러스에 감수성이 있는 세포라면 어느 것이어도 된다. 예를 들면, Vero 세포, MDCK 세포(부유 세포), Per.C6 등의 세포를 들 수 있다.

백신 제조를 위한 일본뇌염 바이러스의 세포 배양은 혈청 첨가 배지에서 실시하는 것이 통례이다. 그러나, 백신의 안전성의 관점에서는 무혈청 배양으로 얻은 바이러스를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 세포 배양에 파종하기 위한 마스터 세포 뱅크(master cell bank), 작업용 세포 뱅크(working cell bank)는, 특별히 언급하지 않는 한 혈청 첨가 배양으로 제작하는 것이 통례이다. 그러나, 무혈청 배양법으로 제작하여 얻은 마스터 세포 뱅크(master cell bank), 작업용 세포 뱅크(working cell bank)를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 이것에 의해, 제조된 백신의 안전성을 높일 수 있다.

본 발명에서 발명자들이 사용한 세포 배양법에 의한 액상 불활화 일본뇌염 백신의 제조방법의 개략은 이하와 같다.

Vero 세포(ATCC CCL-81)를 ATCC로부터 구입 후, 무혈청 배지에서 순화(馴化)하고, 마스터 세포 뱅크 및 작업용 세포 뱅크를 제작하였다. 바이러스는, 마우스 뇌 유래 일본뇌염 백신 제조용 주 북경-1주를 Vero 세포로 수 대 계대하여 마스터 바이러스 뱅크 및 워킹 바이러스 뱅크를 제작하였다.

Vero 세포를 마이크로캐리어(Cytodex-1 또는 3, GE 헬스케어사제) 상에서, 무혈청 배지에서 5~7일간 배양하고, 세포 수가 1×10⁶ cells/㎖의 농도에 도달했을 때, 일본뇌염 바이러스를 접종하여, 약 3일간 배양하고, 그 후, 배양상청을 회수하여, 바이러스 부유액을 얻었다.

포르말린으로 불활화 후, 자당 밀도구배 원심에 의해 바이러스 부유액을 정제하여, 백신으로 하였다. 그때, 즉 정제 후에 안정제를 첨가하는 것도 가능하다. 안정제로서는, 아미노산 또는 아민류, 아미드류, 유기산 등을 들 수 있다.

본 발명의 액상 불활화 일본뇌염 백신은 실온 부근에서 장기간 보존하는 경우의 안정성이 현저히 개선된다. 본 발명의 개량 불활화 일본뇌염 백신의 제조방법은, 종래의 불활화처리방법의 개량법이다. 본 발명에서 행한 개량은 하기 2종의 처리 중 어느 하나, 또는 그의 조합을 불활화시에 행하는 것이다.

본 발명에 있어서의 불활화처리방법에 있어서의 제1 개량점으로서는, 불활화처리시에 아미노산 등을 존재시키는 것을 들 수 있다. 본 발명에서는 일본뇌염 바이러스의 불활화처리시에, 완충액 중에 불활화제(예를 들면 포르말린)와 함께 아미노산 또는 아민류, 아미드류, 유기산을 존재시킨다. 이것에 의해 실온 부근에서 장기간 보존해도 역가가 실질적으로 유지되는 불활화 일본뇌염 백신을 제조할 수 있다.

세균이나 전입자 바이러스, 또는 단백질 톡신의 불활화시에 아미노산이나 암모니아, 아민류 등을 존재시켜서, 불활화의 진행도를 제어하는 방법은 공지이다(비특허문헌 6 참조). 일례로서 리신은 포르말린과 반응하여 과잉의 포르말린을 포착하고, 포르말린의 작용을 중화하여, 불활화가 과도하게 진행되는 것을 제어, 내지는 불활화를 사실상 정지시키는 효과가 있는 것이 널리 받아들여져 왔다. 또한, 포르말린과 리신의 말단 아미노기와의 반응으로 시프염(Shiff base)이 형성되는 것이 증명되어 있다(비특허문헌 7-9 참조).

종래, 불활화 일본뇌염 백신 제조에 있어서는, 불활화처리는 가능한 한 완전히 진행되는 것, 즉 바이러스를 완전히 불활화시키는 것이 바람직하다고 생각되었다. 그 때문에, 지금까지 일본뇌염 바이러스의 포르말린에 의한 불활화처리시에는, 바이러스의 불활화를 저해하는 효과가 있다고 생각되고 있던 아미노산은 첨가되어 있지 않았다. 본 발명자들은, 불활화 백신의 제조에 있어서, 포르말린 농도와 처리시간을 변화시켜서, 불활화의 정도와의 상관을 조사하였다. 그 중에서, 불활화를 제어하는 하나의 방법으로서 아미노산을 첨가한 바, 예상 외의 신규 효과로서 보존 안정성이 개선되는 것을 발견하고, 실온 부근에서 장기간 보존해도 안정한 불활화 일본뇌염 백신의 개발에 성공하였다.

일본뇌염 백신의 불활화시에 아미노산 또는 아민류, 아미드류, 유기산을 공존시키는 것이 보존 안정성을 개선시키는 효과를 초래하는 것은 본 발명자들이 발견한 신규하고 유용한 지견(知見)이다.

본 발명의 불활화처리시에 사용하는 아미노산의 종류는 입수 가능한 아미노산이라면 어느 것이어도 되고, 그 중에서도 단백질 구성 아미노산이 바람직하다. 또한, 염기성 아미노산이 보다 바람직하다. 때때로, 수용성 아미노산이 바람직하나, 발린 등 비수용성 아미노산이 효과적인 경우도 있다. 천연형(L-형), 비천연형(D-형) 모두 사용 가능하다. 보다 바람직한 아미노산으로서는, 아스파라긴산, γ-아미노부티르산, 알라닌, β-알라닌, 아르기닌, 글리신, 글루타민산, 이소류신, 류신, 리신, 세린, 트레오닌, 발린, 이들을 포함하는 펩티드, 및 아미노산 올리고머 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

바람직한 아민류, 아미드류로서는, 에틸아민, 에탄올아민, 프로판올아민 등의 알킬아민류, 요소, 글리신아미드, β-알라닐아미드 등의 아미드류, 암모니아, 및 상기 물질의 무기염류 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

산성 아미노산이나 염기성 아미노산, 아민류는 염으로서도 사용 가능하고, 또한, 아미노산의 메틸에스테르, 및 에틸에스테르 등, 간단한 에스테르도 사용 가능하다.

바람직한 유기산으로서는 숙신산, 타르타르산, 글루콘산, 올레산, 락토비온산, 및 이들의 무기염 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 그 밖에, 의약상 허용되는 산과 그의 염이 사용 가능하다. 예를 들면, 말레산, 말산, 스테아르산, 리놀산, 글루코헵톤산, 카르복시비닐 폴리머 등, 및 그의 무기염이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 아미노산 또는 아민류, 아미드류, 유기산의 농도는, 0.005 M~0.5 M의 범위가 실용적으로 사용 가능하고, 바람직하게는 0.02 M~0.2 M의 범위이다. 단, 최적의 농도는 일본뇌염 바이러스의 농도, 완충액의 pH, 불활화 반응액의 온도 등에 따라 상이하다. 백신 종사자에게는 최적 농도를 결정하는 방법은 공지이다.

본 처리에 있어서의 아미노산 또는 아민류, 아미드류, 유기산의 첨가방법은, 처음부터 한 번에 첨가해도 되고, 또는 일주간에 1-2회 정도의 간격으로 분할 첨가해도 된다.

본 발명의 일본뇌염 백신을 제조하는 데 적합한 일본뇌염 바이러스주는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 백신 제조에 사용한 경우에 항원성을 나타내는 능력이 있으면, 임상 분리주(즉 야생주), 인공 변이주, 약독주, 유전자 재조합주(역유전학에 의한 회수주를 포함함) 중 어느 것이라도 사용 가능하다.

본 발명에 의해 제조된 일본뇌염 바이러스 백신제품의 보존 안정성은, 보존 중의 잔존 역가를 측정하여 판정할 수 있다. 일본뇌염 백신의 역가 측정방법으로서는, 중화항체가법, HI법, ELISA법 등의 면역학적 측정법 등을 들 수 있다. 이 중에서 중화항체가법이 간편하고 또한 신뢰성이 높다고 하여 일본 생물제제기준에 채용되고 있기 때문에 바람직하다. 중화항체가 측정법은, 별명, 50% 플라크 감소법으로도 불린다. 면역 항혈청을 희석한 시료와 기지량의 일본뇌염 바이러스액을 혼합하고, Vero 세포와 접촉해서 생성되는 플라크 수로 잔존 바이러스량을 측정하여, 플라크 수가 50% 감소하는 희석도를 중화항체가로 하는 방법이다. 이 방법은 백신을 취급하는 전문가에게 있어서는 공지이다.

본 발명의 처리방법에 있어서, 불활화시에 아미노산 또는 아민류, 아미드류나 유기산을 공존시킴으로써 안정화효과가 초래되는 메커니즘을 고찰하면 이하와 같다. 글리신이나 리신 등 말단에 아미노기를 갖는 아미노산을 예로 설명한다. 간결하게 요약하면, 아미노산 존재하의 불활화에서는 바이러스 표층의 다당 기타 구조물의 입체구조가 변화하여, 보다 안정한 구조를 취하는 한편, 포르말린 불활화가 보다 완전히 진행되기 때문이라고 추측된다. 즉, 일본뇌염 바이러스 표층에는 엔벨로프 단백과 함께 큰 다당 구조물이나 기타 고분자량의 산성분자가 뒤얽혀 존재한다. 이 때문에, 바이러스 표층 상의 포르말린과 반응 가능한 부위의 일부는 덮어 가려져 있다고 생각된다. 따라서, 포르말린 분자는 바이러스 표층 단백질분자의 유리 아미노기(free amino group)의 일부에 도달하기 어렵다.

즉, 종래법의 아미노산 비존재하에 있어서의 불활화에 있어서, 포르말린은 바이러스 표면에 노출된 부분의 단백을 불활화하나, 감추어진 부분의 단백을 불활화할 수 없어, 일부 바이러스 단백은 활성을 유지한 채 감추어져 존재하는 것으로 생각된다. 이것은 반불활화제품이다.

여기서 본 발명과 같이, 글리신이나 리신 등 말기에 아미노기가 있는 아미노산을 공존시킨 경우, 아미노산이 산성물질과 염을 형성하는 성질이 있어, 바이러스의 커다란 구조물의 어딘가와 결합 가능하다. 아미노산이 새롭게 어딘가에 결합하면 바이러스 표층 상의 뒤얽힌 다당 분자의 고차구조에 변화가 발생하여, 지금까지 감추어져 있었던 부분의 아미노기가 노출된다. 이때, 근방에 존재하는 유리 포르말린이 결합한다. 이와 같은 과정을 거쳐, 바이러스 표층 단백질로의 포르말린의 결합이 보다 완전하게 진행되고, 그 과정에서 불활화 바이러스입자 표층의 단백질이 보다 안정한 고차구조로 변화한다고 상상된다. 또는, 포르말린에 의한 불활화가 보다 완전해지는 결과, 백신제품 중에 미량으로 혼재하는 단백분해효소의 공격에 대한 저항성이 증대될 가능성이 있다. 이와 같이 생각하면, 아미노산 등의 존재하에서 포르말린처리함으로써, 안정하게 장기간 보존할 수 있는 일본뇌염 바이러스 백신을 제조할 수 있는 것을 설명할 수 있다.

본 발명의 불활화처리방법에 있어서의 제2 개량점으로서는, 바이러스에 물리화학적 수법에 의한 제2 불활화처리를 실시하는 것을 들 수 있다. 제2차 불활화는 화학적 불활화제의 존재하, 비존재하 중 어느 것이어도 된다.

종래, 전입자 바이러스나 단백질의 불활화처리에 있어서는 화학처리법과 물리화학적 처리법 양쪽이 사용되어 왔다. 그러나, 포르말린이나 글루타르알데히드에 의한 화학적 불활화처리, 또는 γ선처리나 자외선처리 등의 물리화학적 수단에 의한 불활화처리에 있어서도, 오로지 1종류의 처리만 실시하여, 복수의 방법을 조합해서 불활화가 행해지는 경우는 없었다. 지금까지는, 전입자 바이러스의 불활화처리의 경우는 바이러스의 불활화를 확인할 수 있으면, 또한, 유리 단백질의 불활화에 있어서는 기능활성의 소실을 확인할 수 있으면, 불활화가 완료된다고 이해되어 왔다. 따라서, 복수의 불활화처리를 조합하여 실시하는 것은 낭비라고 생각되어, 굳이 시도되는 경우는 없었다. 본 발명자들은 화학적 수단을 사용한 불활화로 제조한 일본뇌염 바이러스 백신이, 보존 중에 품질의 열화(劣化)를 일으키는 원인의 하나는 불완전한 불활화에 있다고 생각하고, 일본뇌염 바이러스의 불활화방법을 검토하였다. 그 결과 화학적 불활화처리에 더하여 물리화학적 수단에 의한 제2차 불활화를 추가 실시하는 것이 백신의 보존 안정화에 유효하다는 것을 발견하였다.

제2차 불활화는 각종 물리화학적 처리방법으로 실시할 수 있다. 이하에 예를 나타내나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 사용 가능한 조건의 일례를 함께 나타내나, 이들에 한정되지 않는다.

<물리화학적 처리법 및 그의 조건>

가온처리(온도: 15~40℃; 가온시간: 10~120분), γ선 조사(선원: 코발트 60; 5~50 kGy(킬로그레이)), 레이저광 조사(광원: 각종 레이저 조사장치; 파장 500~700 ㎚; 광량: 0.01-1 J(줄)/㎠), 전자선 조사(전자렌지), 초음파 조사.

또한, 전입자 바이러스를 마이크로캡슐화함으로써 품질 열화를 방지하는 것도 가능하다. 이들의 1종 또는 복수의 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 동일한 방법을 복수회 반복하여 실시해도 된다. 처리조건은 고정적이 아니라, 부유 바이러스량, 온도, 완충액의 pH, 처리시간 등을 변화시켜서, 적합한 조건을 설정할 수 있다. 상기 물리화학적 처리는, 무균조건하에서 조작한다.

제1차와 제2차 불활화에 있어서, 처리조건에 따라서는, 처리의 결과, 항원 단백질이 과도하게 변성되어 항원성을 상실하는 경우가 있다. 그 때문에, 처리 후에 면역원성, 기타 성질을 조사하여, 최적의 수단과 최적의 처리조건을 종합적으로 고려해서 선택한다.

본 발명의 제2차 불활화는, 물리화학적 불활화처리 중 하나 이상의 처리를 행하는 것이다. 복수의 처리를 조합하여 불활화를 행하는 경우는, 화학적 불활화처리 후, 물리화학적 불활화처리를 행해도 되고, 물리화학적 불활화처리 후, 화학적 불활화처리를 행해도 된다.

본 발명의 제2차 불활화효과의 메커니즘에 대해, 가온하의 불활화를 예로 고찰하면 이하와 같다. 아미노산 존재하에서의 포르말린에 의한 불활화의 경우와 동일한 메커니즘을 가정할 수 있다. 즉 간결하게 요약하면, 온화한 물리화학적 처리, 예를 들면, 온화한 가온처리를 실시하면서 포르말린으로 불활화하는 경우, 바이러스 표층의 다당 기타 구조물의 입체구조가 변화하여, 포르말린의 바이러스 표면으로의 결합이 보다 완전하게 진행되는 결과, 안정성이 증대되는 것으로 추측된다. 아미노산 존재하의 화학적 불활화처리와 물리화학적 수단에 의한 제2 불활화처리의 조합으로서, 예를 들면, 아미노산 존재하, 완만히 가온하면서 포르말린으로 불활화하는 것이 포함된다.

상기 메커니즘을 지지하는 사실로서는, 처리효과가 확인된 가온처리, γ선처리, 초음파처리 등은, 온화한 조건하에서는 어느 것도, 다당과 복합단백질 등 고분자구조물의 입체구조를 변화시키는 효과가 있는 점에서 공통된다.

상기 안정한 일본뇌염 백신의 제조방법은, 다른 플라비바이러스에 속하는 바이러스의 전입자 백신의 제조에도 적용할 수 있다. 다른 플라비바이러스에는 뎅기 바이러스(dengue virus), 황열병 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBE), 웨스트 나일 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스 등이 포함된다. 그 밖에, 전입자 인플루엔자 백신의 제조에도 사용된다.

본 발명의 안정한 일본뇌염 백신은, 다른 종류의 항원 백신과 혼합한 혼합 백신의 제조에 사용할 수 있다. 예를 들면, 파상풍톡소이드, 디프테리아톡소이드, 백일해 백신의 3종류를 혼합한 DTP 3종 혼합 백신과 본 발명의 일본뇌염 백신을 혼합한 4종 혼합 백신으로서 사용하는 것이 가능하다. 다른 세균 백신 항원으로서 인플루엔자균 백신 B형(Haemophilus influenza type B), 수막염균(Neisseria meningitidis), 티푸스균(Salmonella typhi), 독소 산생 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli), 콜레라균(Vibrio cholera), 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 또는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)을 들 수 있다. 바이러스 항원으로서, 경구 폴리오 백신, 불활화 폴리오 백신, 간염 백신, 및 인플루엔자 백신을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

백신에 유효한 애쥬번트를 첨가하여 백신의 효과를 증강시키는 것은 공지이다. 따라서 본 발명의 백신(혼합 백신을 포함함)에도 적절한 애쥬번트를 첨가할 수 있다. 본 발명의 백신에 사용되는 애쥬번트로서는, 수산화알루미늄과 그의 무기염류, 스쿠알렌이나 오일 등의 탄화수소류, 콜레라 톡신 등, 세균독소, 이눌린 등의 다당류, 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 일반적인 백신 항원의 면역작용을 증강시키는 데 유효한 애쥬번트의 종류에 규칙성은 발견할 수 없다. 또한, 유효한 애쥬번트의 종류는 투여방법에 따라서도 상이하다. 그러나, 당업자에게 있어서 공지의 시행착오법에 의해, 백신에 유효한 애쥬번트의 종류와 농도를 결정할 수 있다.

백신의 통례로서, 본 발명의 백신제품은 항원 외에, 안정제(예를 들면 젤라틴), 보존제(예를 들면 티메로살, 페녹시 에탄올), 착색제(예를 들면 페놀 레드) 등을 함유시킬 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 백신을 대상자에게 투여하는 공정을 포함하는, 대상자에게 있어서 세균 및/또는 바이러스에 기인하는 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 질환으로서는, 일본뇌염 바이러스에 기인하는 질환을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「투여하는」이란, 경구적, 또는 비경구적으로 투여하는 것이 포함된다. 경구적인 투여로서는, 경구제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 경구제로서는, 정제, 캡슐제, 용제, 또는 현탁제 등의 제형을 선택할 수 있다. 또한 적절한 제형을 선택하면, 경비접종, 경피접종도 가능하다.

비경구적인 투여로서는, 주사제라는 형태로의 투여를 들 수 있다.

투여량, 투여방법은, 대상자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.

이하에 실시예를 들어 설명하나, 이것은 본 발명을 한정하지 않는다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.

실시예

[실시예 1] 불활화시의 아미노산 첨가가 백신의 보존 안정성에 미치는 효과

아미노산의 존재하에서 포르말린에 의해 바이러스를 불활화처리하여 얻어진 개량 일본뇌염 바이러스 백신을 보존하여, 보존 안정성을 조사하였다. 실시방법은 이하와 같다.

일본뇌염 바이러스주는, 북경-1을 사용하였다. 배양 배지는, 세포 배양용 무혈청 배지 VP-SFM(Invitrogen사제)을 사용하였다. 배양은 80 L용량의 발효조(fermenter)에 50 L 배지를 넣고 세포 배양을 실시하였다.

Vero 세포(ATCC CCL-81)를 ATCC로부터 구입 후, 무혈청 배지에서 순화하고, 마스터 셀 뱅크 및 워킹 셀 뱅크를 제작하였다. 바이러스는, 마우스 뇌 유래 일본뇌염 백신 제조용 주 북경-1주를 Vero 세포에서 수 대 계대하여 마스터 바이러스 뱅크 및 워킹 바이러스 뱅크를 제작하였다.

무혈청 배지에서 Vero 세포를 마이크로캐리어(Cytodex-1 또는 3) 상에서 5~7일간 배양하고, 세포 수가 1×10⁶ cells/㎖의 농도에 도달한 시점에서 일본뇌염 바이러스를 접종하고, 약 3일간 배양 후, 배양상청으로부터 바이러스를 회수하여, 기타사토켄큐쇼의 일본뇌염 바이러스 백신 제조방법에 따라 정제한 후, 인산완충식염수(PBS)에 현탁하여, 바이러스 부유액으로 하였다.

그 후, 0.05%(v/v) 포르말린 존재하, 4℃, 3개월간 방치함으로써 불활화하였다. 이때, 바이러스 부유액에 0.5% 아미노산 또는 다른 시험물질을, 각각 1종류 또는 수 종류 첨가하였다(표 1).

불활화처리 후에, 자당 밀도구배 원심법에 의해 불순물 및 포르말린과 첨가물질을 제거하고, PBS 중에서 바이러스 농도를 조정하였다. 그 후, 0.7 mL씩 바이알에 분주하여 일본뇌염 백신을 제작하였다.

각 바이알을 4℃의 차가운 곳에 보존하였다. 보존 개시로부터 9개월 후까지 3개월마다 바이알을 개봉하고, 동일 조건에서 제작한 시료의 바이알 5개분을 모아 1 검체로 하였다. 5 검체를 사용하여, 일본 생물제제기준에 따라 역가측정법에 의해, 각 보존기간 후의 잔존 역가를 측정하였다. 표 1에 있어서, 각 보존기간의 잔존 역가를 중화항체가로 나타낸다.

표 1의 보존 6개월 후와 9개월 후의 결과에 있어서, 포르말린에 의한 일본뇌염 바이러스의 불활화처리시에, 글리신, 글루타민 등의 아미노산을 첨가한 경우(시험번호 1-4), 및 아미노산과 함께 당알코올을 첨가하여(시험번호 2-4) 제작한 경우의 일본뇌염 백신제품이, 무첨가 조건하에서 불활화한 종래법의 제품(시험번호 5)과 비교하여 잔존 역가가 높은 것이 명백해졌다. 즉, 장기간 보존한 경우이더라도, 상기 첨가물을 첨가한 후에 불활화처리를 행한 경우에는, 무첨가의 경우와 비교하여 보존 안정성이 증대하는 것이 명백해졌다. 아미노산 및 당알코올 양쪽 모두 무첨가로 불활화처리한 종래법의 제품(대조)에서는 역가의 저하가 현저했다.

[실시예 2] 액체 일본뇌염 백신제품의 장기 보존에 있어서의 아미노산류의 첨가효과

실시예 1과 동일한 방법으로 바이러스 부유액을 얻었다. 이것을 사용하여 0.5% 글리신 첨가 조건하, 또는 무첨가 조건하에 있어서, 포르말린으로 일본뇌염 바이러스를 불활화하였다. 그 후, 자당 밀도구배 원심으로 정제하여 불순물을 제거하였다. 그 후, 바이러스 단백량 10 ㎍/㎖에서 PBS로 재부유하여 백신으로 하고, 바이알에 0.7 mL씩 분주하였다. 이때, 바이알 중의 백신에 안정제로서 아미노산과 당알코올을 첨가하였다. 그 후, 4℃ 및 28℃에서 보존하여, 보존 안정성을 조사하였다. 구체적으로는, 3개월마다 생물학적 제제기준에 규정되는 방법으로 바이알 중의 잔존 역가를 측정하였다. 이상의 결과를 표 2에 나타낸다. 역가는 중화항체가로 나타낸다.

표 2에 나타낸 결과로부터, 이하의 사실이 명백하다.

1. 시험번호 1과 3의 비교, 및 시험번호 2와 4의 비교로부터, 아미노산을 첨가한 조건에서 바이러스를 불활화하여 제조한 일본뇌염 백신의 액체제품은, 15개월간 보존 후에, 무첨가 조건하에서 불활화한 제품보다 높은 역가를 유지하고 있었다. 즉, 불활화처리에 있어서의 아미노산 첨가는, 안정한 일본뇌염 백신을 제조하기 위해 유효한 방법이다.

2. 시험번호 3과 4의 비교에 있어서, 백신 중에 안정제로서 아미노산과 당알코올을 첨가한 경우, 보존 개시로부터 15개월 후에, 무첨가보다 높은 역가를 유지하고 있었다. 그러나, 시험번호 1과 2의 비교에 있어서, 아미노산 존재하에 포르말린으로 불활화한 본 발명의 일본뇌염 백신에서는, 충분히 안정성을 획득하고 있어, 12개월간 보존 후에 있어서, 아미노산과 당알코올의 추가적 안정화 효과는 명백하지 않았다. 15개월간 보존 후에 있어서, 시험번호 1이 잔존 역가가 높은 경향이 있었다.

3. 시험번호 1에 있어서, 4℃에서의 보존과 28℃에서의 보존 어느 경우도, 무첨가 대조(시험번호 3)보다 높은 역가가 유지되고 있었으나, 28℃의 보존에 있어서 보다 명백하였다. 시험번호 2에 있어서도 동일한 경향이 확인되었다.

4. 24개월째에서는, 28℃ 보존에 있어서 시험번호 1이 무첨가 대조(시험번호 3)보다, 높은 역가가 유지되고 있는 것이 명백해졌다. 즉, 불활화처리에 있어서의 아미노산 첨가는, 안정한 일본뇌염 백신을 제조하기 위해 유효한 방법인 것이 명백해졌다.

[실시예 3] 백신의 보존 2년 후의 감염 방어효과

실시예 1과 동일하게 무혈청 배지에서 세포 배양을 실시하여 바이러스 부유액을 얻었다. 실시예 2와 동일하게, 0.5% 글리신 첨가 조건하에서 포르말린 불활화처리를 4℃에서 3개월간 행하고, 자당 밀도구배로 정제하여 불순물을 제거한 후, 바이알에 0.7 mL씩 분주하여 백신으로 하였다. 백신을 4℃ 또는 28℃에서 25개월 보존하였다. 보존 백신의 유효성을 확인하기 위해, 보존 백신으로 면역한 마우스를 바이러스로 공격하여, 감염 방어능을 조사하였다. ddY 마우스(4주령)에 3일 간격으로 보존 백신을 4회 면역하였다. 그 2주간 후에 일본뇌염 바이러스 0.03 ㎖(50 LD₅₀)를 뇌 내에 접종하고, 2주간 마우스의 생존을 관찰하였다. 생존 마우스의 수와 생존률을 표 3에 나타낸다. 대조로서, 불활화처리시에도 백신 중의 안정제로서도 아무 것도 첨가하지 않고 제조한 세포 배양 유래 백신을 사용하였다. 또한, 역가측정용 표준 백신(참조 백신)으로서, 국가 검정에 사용하는 마우스 뇌 유래 백신(감염증 연구소로부터 구입, 동결건조품)을 측정시마다 규정된 방법으로 PBS에 용해하여 사용하였다.

표 3의 시험번호 1에 있어서, 0.5% 글리신 존재하에서 불활화하고, 정제 후와 백신제품 중에는 아미노산은 무첨가의 제품을 28℃에서 25개월간 보존한 경우, 바이러스 공격 후의 마우스의 생존률이 83%였다(시험번호 1, 28℃ 보존). 한편, 참조 백신을 사용하여 동일하게 처리한 경우, 생존률은 80%였다(시험번호 4). 이상의 결과로부터, 본 발명의 백신은, 액상으로, 28℃에서 2년 이상 안정하게 보존할 수 있는 것이 확인되었다.

4℃의 보존에서는, 생존률은 67%였다(시험번호 1, 4℃ 보존).

아미노산 존재하에서 불활화처리하고, 백신 보존 중에 보존제로서 아미노산과 당알코올을 첨가한 경우는, 시험번호 1에 비교하여 백신의 잔존 유효성이 낮았으나(시험번호 2), 무첨가 대조(시험번호 3)보다 높은 것이 나타내어졌다. 종래제품은 역가 저하가 현저하기 때문에, 안정하게 보존할 수 없었다.

[실시예 4] 정제 후의 아미노산 첨가가 백신의 보존 안정성에 미치는 효과

실시예 1과 동일한 방법으로 바이러스 부유액을 얻었다. 이것을 사용하여 0.5% 글리신과 1% 소르비톨 첨가 조건하, 포르말린에 일본뇌염 바이러스를 불활화하였다. 그 후, 자당 밀도구배 원심으로 정제하여, 불순물을 제거하였다. 그 후, 바이러스 단백질 10 ㎍/㎖에서 PBS로 재부유하여 백신으로 하고, 여기에 안정제로서 1% 소르비톨과 함께 각종 아미노산을 첨가하여 보존하고, 실시예 2와 동일하게 3개월 간격으로 6개월까지 잔존 역가를 측정하였다. 이상의 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타낸 결과로부터, 이하의 사실이 명백하다.

시험번호 7의 무첨가(28℃ 보존)와 비교한 경우, 시험번호 1의 글리신, 시험번호 2의 알라닌 및 시험번호 4의 아르기닌 첨가에 의해, 높은 역가가 얻어졌다. 불활화시에 아미노산을 첨가하는 것에 더하여, 추가적으로 정제 후에 아미노산을 첨가함으로써, 28℃ 보존에 있어서의 일본뇌염 백신의 안정성이 유지되는 것이 명백해졌다.

[실시예 5] DTP 3종 혼합 백신과 개량 일본뇌염 백신의 혼합 백신

실시예 2의 경우와 동일하게 불활화처리를 행하여, 바이러스 부유액을 얻었다. 포르말린으로 불활화처리할 때, 글리신 0.5%를 존재시키고, 24℃에서 10일간 방치함으로써 불활화처리하여, 일본뇌염 백신으로 하였다. 한편, 기타사토켄큐쇼제 DTP 3종 혼합 백신 및 본 발명의 안정한 일본뇌염 백신을 등량씩 혼합하여 혼합 백신을 제작하였다.

각각의 성분 항원의 역가를 일본 생물제제기준의 방법으로 측정하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 시험한 역가 시험에 있어서 모든 항목이 일본 생물제제기준에 적합하였다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 일본뇌염 백신은, 종래 제조되어 온 마우스 뇌법에 의한 액상 불활화 일본뇌염 백신과 동등 또는 그 이상의 유효성을 갖고, 또한 당해 종래 백신제품보다, 안전성과 보존 안정성이 개량되어 있는 것이다.

안전성에 대해서는, 불활화처리의 전단계에서, 무혈청 배양법으로 제작한 마스터 세포 뱅크를 세포 배양의 파종에 있어서 사용하고, 또한, 무혈청 세포 배양법으로 바이러스를 배양 제조하기 때문에, 예를 들면 BSE(광우병)나 간염 바이러스 등 혈청 유래의 미입인자가 백신에 혼입될 위험성이 낮다. 따라서, 본원의 제조방법에 의해 제조된 일본뇌염 백신은, 종래의 백신제품, 또는 혈청 첨가 배양에 의해 제조한 세포 배양법 일본뇌염 백신보다 안전하다.

장기간의 보존에 있어서 백신의 역가가 안정하게 유지되는 것은 중요하고 또한 유리한 것이다. 특히 액체제품을 실온 부근에서의 보존으로도 장기간 보존할 수 있는 것은 제조 관리상, 유통상, 또한 의료 현장에서의 보존상, 매우 편리하다. 아열대~열대지방에서 장기간에 걸쳐 맹위를 떨치는 일본뇌염 바이러스의 경우, 감염 방지를 백신으로 대처하기 위해서는, 다양한 종류의 백신을 간편한 온도관리조건에서 장기 보존할 필요가 있다. 본 발명의 백신은, 그와 같은 장기 보존의 필요성이 있는 경우에 유효하다.

Claims (7)

1. 일본뇌염 바이러스에 대해, 이하의 공정을 포함하는, 불활화 전입자 일본뇌염 백신(inactivated whole Japanese encephalitis vaccine)의 제조방법:
   (1) 이하의 (a) 또는 (a) 및 (b)에 기재된 불활화 처리를 행하는 공정
   (a) 글리신의 존재하에 있어서 포르말린에 의한 불활화처리를 행하는 공정
   (b) 물리화학적 수법에 의한 불활화처리를 행하는 공정
   (2) 불활화 바이러스를 정제하고, 안정화제로서 글리신을 첨가하지 않고서 백신을 조제하는 공정.
2. 제1항에 있어서,
   제1항 (b)에 기재된 불활화처리가 가온, γ선 조사, 전자선 조사, 및 레이저광 조사로부터 선정되는 하나 이상의 처리방법인, 일본뇌염 백신의 제조방법.
3. 제2항에 있어서,
   가온에 의한 불활화처리가 24℃ 이상에서 행해지는 것을 특징으로 하는 일본뇌염 백신의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   일본뇌염 바이러스가 임상 분리주(야외주), 인공 변이주, 유전자 재조합주, 또는 역유전학에 의한 회수주 중 어느 하나인 일본뇌염 백신의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   세포 배양법으로 제조된 일본뇌염 바이러스를 사용하는 것을 특징으로 하는 일본뇌염 백신의 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   무혈청 배양법으로 제조된 일본뇌염 바이러스를 사용하는 것을 특징으로 하는 일본뇌염 백신의 제조방법.
7. 제6항에 있어서,
   무혈청 배양법으로 제조된 마스터 세포 뱅크를 세포 배양의 파종에 있어서 사용하는 것을 특징으로 하는 일본뇌염 백신의 제조방법.