MX2008014398A

MX2008014398A - Formulacion de vacuna de nicotina-portador.

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Publication number: MX2008014398A
Application number: MX2008014398A
Authority: MX
Inventors: Rainer Lang; Gerhard Winter; Lorenz Vogt
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2009-02-06
Also published as: CN101443038B; CN101443038A; BRPI0711635A2; IL194656A0; AU2007251604A1; TNSN08453A1; MA30479B1; ECSP088877A; ZA200808489B; RU2008148830A; RU2465007C2; IL194656A; EP1854478A1; WO2007131972A1; AU2007251604B2; NO20084935L; JP2009536936A; MY146654A; EP2021024A1; US20090238797A1

Abstract

La presente invención está en el campo de la medicina, la salud pública, y la formulación de vacunas y fármacos. La invención proporciona formulaciones de composición que comprenden un conjugado de nicotina-portador y un estabilizante, en donde el estabilizante comprende un disacárido no reductor y un tensoactivo no iónico. Las formulaciones de composición son estables después de un largo tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente.

Description

FORMULACIÓN DE VACUNA DE NICOTINA-PORTADOR ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención está en el campo de la medicina, y de la formulación de vacunas y productos farmacéuticos. La invención proporciona formulaciones que comprenden un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, y un estabilizante, en donde este estabilizante comprende un disacárido no reductor y un tensoactivo no iónico. Las formulaciones liofilizadas son estables después de un largo tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente. Técnica Relacionada Las vacunas para el tratamiento o la prevención de la adicción a la nicotina han atraído recientemente la atención del público. Estas vacunas típicamente contienen moléculas de nicotina que se enlazan covalentemente con un portador, debido a que la nicotina es un compuesto orgánico de bajo peso molecular y no es capaz de provocar una respuesta inmune por sí misma. Más aún, debido a que la nicotina no posee grupos funcionales adecuados para este enlace con un portador, típicamente se requiere la introducción de una secuencia de enlace en las moléculas de nicotina. Recientemente se ha reportado el desarrollo de varias vacunas, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5'876'727, US 6'232'082, US 6'656'469 y US 5'932'971. Los conjugados descritos no solamente varían en la naturaleza del portador, sino también en la naturaleza de la secuencia de enlace y en el sitio en donde se introduce la secuencia de enlace en la nicotina. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6'932'971 describe el acoplamiento de moléculas de nicotina con una partícula tipo virus (VLP), mediante una secuencia de enlace con una funcionalidad de éster, que forma un conjugado de nicotina-portador ordenado y repetitivo, y conduce a la producción de una alta titulación de anticuerpos específicos de nicotina. Los mismos autores han demostrado recientemente que una vacuna que comprende una partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN ?ß con el que se enlazan covalentemente las moléculas de nicotina mediante una secuencia de enlace con una funcionalidad de éster, puede ser eficaz para dejar de fumar en los seres humanos (Maurer y colaboradores, Eur. J. Immun.200535:2031-40). El requerimiento de que las composiciones de vacuna sean estables y minimicen o eviten la degradación química y/o física implica la necesidad de desarrollar formulaciones que satisfagan estos requerimientos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora hemos encontrado, de una manera sorprendente, una formulación liofilizada que estabiliza los conjugados de nicotina-partícula tipo virus que contienen moléculas de nicotina covalentemente enlazadas a la partícula tipo virus por medio de una secuencia de enlace, la cual comprende cuando menos una funcionalidad de éster carboxílico. Más aún, sorprendentemente hemos encontrado que esta formulación liofilizada es estable durante un largo período de tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente, o inclusive a una temperatura acelerada (40°C). En adición, la formulación liofilizada de la presente invención comprende una composición estabilizante simple y económica, debido a un número mínimo de excipientes incluidos en la misma. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una formulación liofilizada, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) cuando menos un disacárido no reductor, en donde la concentración del disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos un tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6 antes de la liofilización. En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para la elaboración de la formulación liofilizada de la invención. En todavía otro aspecto, la invención proporciona una formulación reconstituida que comprende la formulación liofilizada de la invención disuelta y/o suspendida en una solución fisiológica aceptable o en agua estéril, de preferencia en agua para inyección (WFI). En una modalidad preferida adicional, la formulación reconstituida comprende además un adyuvante. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados que son entendidos comúnmente por un experto ordinario en la materia a la que pertenece esta invención. Adyuvante: El término "adyuvante" como se utiliza en la presente, se refiere a estimulantes no específicos de la respuesta inmune, o a sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped, que, cuando se combinan con la vacuna y la composición farmacéutica, respectivamente, de la presente invención, pueden proporcionar una respuesta inmune todavía más mejorada. Se pueden utilizar una variedad de adyuvantes. Los ejemplos incluyen adyuvante completo e incompleto de Freund, hidróxido de aluminio, y dipéptido de muramilo modificado. Los adyuvantes adicionales son geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias de actividad superficial, tales como lisolecitina, polioles Pluronics, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianinas de limpete de orificio, dinitrofenol, y los adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como DCG (el bacilo Calmette Guerin), y Corynebacterium parvum. Estos adyuvantes también son bien conocidos en este campo. Los adyuvantes adicionales que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, inmunomodulador de monofosforilo-lípido, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294, y la tecnología de adyuvante Virosomal. Los adyuvantes también pueden comprender una mezcla de estas sustancias. La partícula tipo virus se ha descrito en general como un adyuvante. Sin embargo, el término "adyuvante", como se utiliza dentro del contexto de esta solicitud, se refiere a un adyuvante que no es la partícula tipo virus utilizada para la formulación de la invención, y más bien es en adición a esta partícula tipo virus. Proteína de recubrimiento: El término "proteína de recubrimiento" y el término intercambiablemente utilizado "proteína de capsida" dentro de esta solicitud, se refiere a una proteína viral, de preferencia a una subunidad de una capsida natural de un virus, de preferencia de un bacteriófago de ARN, que es capaz de incorporarse en una capsida de virus o en una partícula tipo virus. Formulación antes de la liofilización: El término "formulación antes de la liofilización" se refiere a la formulación líquida de la presente invención, que se somete al proceso de liofilización, típicamente y de preferencia dentro de 24 horas, y además típicamente y de preferencia dentro de 8 horas, y todavía más típicamente y de preferencia dentro de 2 a 4 horas. El término "proceso de liofilización" y el término "proceso de secado por congelación" se utilizan de una manera intercambiable en la presente, y se considerarán como sinónimos. Formulación liofilizada: El término "formulación liofilizada" se refiere a la composición que se obtiene o que se puede obtener mediante el proceso de secado por congelación de una formulación líquida. Típicamente y de preferencia, es una composición sólida que tiene un contenido de agua menor del 5 por ciento, de preferencia menor del 3 por ciento. De una manera preferible, el término "formulación liofilizada" se refiere a la composición obtenida o que se puede obtener mediante el proceso para la elaboración de la formulación liofilizada de la presente invención. Formulación reconstituida: El término "formulación reconstituida" se refiere a la formulación líquida resultante de la disolución y/o suspensión de la formulación liofilizada en una solución fisiológicamente aceptable. Secuencia de enlace: El término "secuencia de enlace", como se utiliza en la presente, se refiere a una entidad molecular que enlaza covalentemente la molécula de nicotina con la partícula tipo virus. Temperatura ambiente: El término "temperatura ambiente", como se utiliza en la presente, se refiere a una temperatura de 15°C a 30°C, de preferencia de 20°C a 27°C, y más preferiblemente de 25°C. Estable: El término "estable" como se utiliza en la presente, se refiere al estado de la formulación liofilizada de la invención que comprende conjugados de nicotina-partícula tipo virus, que comprende de preferencia conjugados de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y todavía más preferiblemente que comprende Nic-?ß, en donde, hasta 15 semanas, de preferencia hasta 20 semanas, más preferiblemente hasta 25 semanas de almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura acelerada (40°C), (i) la cantidad total de nicotina libre y derivados de nicotina es menor del 7 por ciento, de preferencia es menor del 5 por ciento, más preferiblemente menor del 3 por ciento, y todavía de una manera muy preferible menor del 2 por ciento de la cantidad total de nicotina en la formulación; y (ii) la cantidad de la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, preferiblemente la suma y agregados de Nic-?ß, no aumenta más del 10 por ciento, de preferencia no aumenta más del 7 por ciento, más preferiblemente no aumenta más del 4 por ciento, comparándose con la cantidad de la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y preferiblemente la suma de oligómeros y agregados de Nic-?ß, en la formulación, antes de la liofilización. La cantidad de la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus en la formulación después del almacenamiento, sustraída de la cantidad de la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus antes de la liofilización, da el porcentaje de incremento, como se utiliza en la presente. Por ejemplo, si en la formulación antes de la liofilización hay el 1 por ciento de oligómeros y agregados de Nic-Qp, y después de la liofilización de acuerdo con la presente invención y de 15 semanas de almacenamiento, hay el 4 por ciento de oligómeros y agregados de Nic-Qp en la formulación reconstituida, entonces el porcentaje de incremento es del 3 por ciento. El término "nicotina libre y derivados de nicotina", como se utiliza en la presente, se refiere a la nicotina y a los derivados de nicotina que no están enlazados covalentemente a la partícula tipo virus de la invención. El método para determinar la cantidad total de nicotina, así como la nicotina libre o los derivados de nicotina, de preferencia es el ensayo de RP-HPLC, como se describe en el Ejemplo 1 de la presente. El método para determinar la cantidad de la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia la suma de oligómeros y agregados de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN QP, de preferencia la suma de oligómeros y agregados de Nic-QP, de preferencia es el ensayo de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4), como se describe en el Ejemplo 1 de la presente, en donde se combinan en el cálculo las fracciones que contengan partículas mayores que los monómeros y dímeros de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia mayores que los monómeros y dímeros de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN Qp, preferiblemente mayores que los monómeros y dímeros de Nic-?ß. Oligómero: El término "oligómero", como se utiliza en el término de "oligómero de nicotina-partícula tipo virus", "oligómero de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y oligómero de "Nic-Q ", se refiere a la acumulación de cuando menos 3 y hasta 10 partículas tipo virus, o partículas tipo virus de ?ß, respectivamente. Agregado: El término "agregado", como se utiliza en el término "agregado de nicotina-partícula tipo virus", "agregado de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß", y "agregado de Nic- ?ß", se refiere a la acumulación de cuando menos 10 partículas tipo virus, o partículas tipo virus de ?ß, respectivamente. Partícula de virus: El término "partícula de virus", como se utiliza en la presente, se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus, comprende un genoma rodeado por una capsida de proteína; otros tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etc.). Partícula tipo virus (VLP), como se utiliza en la presente, se refiere a una partícula de virus que no se replica o no infecciosa, de preferencia una partícula de virus que no se replica y no infecciosa, o se refiere a una estructura que no se replica o no infecciosa, de preferencia una estructura que no se replica y no infecciosa, que se parece a una partícula de virus, de preferencia una capsida de un virus. El término "que no se replica", como se utiliza en la presente, se refiere a que es incapaz de replicar el genoma comprendido por la partícula tipo virus. El término "no infeccioso", como se utiliza en la presente, se refiere a que es incapaz de entrar a la célula huésped. De preferencia, una partícula tipo virus de acuerdo con la invención no se replica y/o no es infecciosa, debido a que carece de todo o parte del genoma viral o de la función del genoma. En una modalidad, una partícula tipo virus es una partícula de virus, en donde el genoma viral se ha inactivado físicamente o químicamente. Típicamente y de una manera más preferible, una partícula tipo virus carece de todos o parte de los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula tipo virus de acuerdo con la invención puede contener un ácido nucleico distinto de su genoma. Una modalidad típica y preferida de una partícula tipo virus de acuerdo con la presente invención es una capsida viral, tal como la capsida viral del virus correspondiente, del bacteriófago, de preferencia del fago de ARN. Los términos "capsida viral" o "capsida", se refieren a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteína viral. Típicamente, hay 60, 120, 180, 240, 300, 360 y más de 360 subunidades de proteína viral. Típicamente y de preferencia, las interacciones de estas subunidades conducen a la formación de la capsida viral o de la estructura tipo capsida viral, con una organización repetitiva inherente, en donde esta estructura es típicamente esférica o tubular. Por ejemplo, las capsidas de los fagos de ARN o de los HBcAgs, tienen una forma esférica de simetría icosahédrica. El término "estructura tipo capsida", como se utiliza en la presente, se refiere a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteína viral que se parecen a la morfología de la capsida en el sentido anteriormente definido, pero que se desvían del ensamble simétrico típico, mientras que mantienen un grado suficiente de orden y repetitividad. Una característica común de la partícula de virus y de la partícula tipo virus es su arreglo altamente ordenado y repetitivo de sus subunidades. Partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN: Como se utiliza en la presente, el término "partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN" se refiere a una partícula tipo virus que comprende, o que consiste de preferencia esencialmente en, o que consiste en, proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de las mismas, de un bacteriófago de ARN. En adición, la partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN que se parece a la estructura de un bacteriófago de ARN, que no es replicativa y/o que no es infecciosa, y que carece de cuando menos el gen o los genes que codifican para la maquinaria de réplica del bacteriófago de ARN, y típicamente que también carece del gen o genes que codifican la proteína o las proteínas responsables de la unión viral a, o su entrada en, el huésped. Sin embargo, esta definición también debe abarcar a las partículas tipo virus de bacteriófagos de ARN, en donde todavía están presentes el gen o los genes anteriormente mencionados, pero son inactivos, y por consiguiente, también conducen a partículas tipo virus no replicativas y/o no infecciosas de un fago de ARN. Las partículas tipo virus preferidas derivadas a partir de bacteriófagos de ARN exhiben una simetría icosahédrica, y consisten en 180 subunidades. Dentro de la presente divulgación, el término "subunidad" y "monómero" se utilizan de una manera intercambiable y equivalente dentro de este contexto. Los métodos preferidos para hacer que una partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN sea no replicativa y/o no infecciosa, es mediante inactivación física y química, tal como irradiación ultravioleta, tratamiento con formaldehído, típicamente y de preferencia mediante manipulación genética. Uno, un, o una: Cuando se utilizan los términos "uno", "un", o "una", en esta divulgación, significan "cuando menos" o "uno o más", a menos que se indique de otra manera. En un aspecto, la invención proporciona una formulación liofilizada, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo, disacárido no reductor, en donde la concentración del disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos un tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6 antes de la liofilización. Como se conoce en la técnica, la liofilización de la composición de proteína normalmente da como resultado un producto que es más estable, y por consiguiente, tiene una vida de anaquel más larga. Adicionalmente, la formulación liofilizada tiene una mejor estabilidad de la funcionalidad de éster presente en el conjugado de nicotina-partícula tipo virus, y una mejor estabilidad del componente de ARN. De una manera alternativa, en otro aspecto, la invención proporciona una formulación líquida, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, en donde la concentración del disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación; (d) cuando menos uno, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6. Adicionalmente, la invención proporciona una formulación que se puede obtener mediante un método de liofilización, el cual comprende el paso de congelar la formulación líquida, y secar esta formulación líquida. En otro aspecto alternativo, la invención proporciona una formulación líquida, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus, y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente con la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende o consiste en: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en esta formulación; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6. En una modalidad preferida, la formulación líquida o liofilizada de la invención comprende solamente un carbohidrato, de preferencia solamente un azúcar, y el azúcar es de preferencia un disacárido no reductor. En una modalidad preferida, la formulación líquida o liofilizada de la invención no comprende un aminoácido agregado. Esto significa que no se agrega ningún aminoácido adicional a la formulación. Sin embargo, la formulación puede comprender una cantidad de traza de aminoácidos, debido a la degradación de la partícula tipo virus. En una modalidad preferida, la formulación líquida o liofilizada de la invención no comprende una albúmina de suero bovino o una albúmina de suero humano. En una modalidad preferida adicional, la formulación de la invención no comprende ninguna clase de una proteína de suero. La exclusión de suero convenientemente elimina el problema potencial de la contaminación del suero. En una modalidad preferida, la formulación líquida o liofilizada de la invención, en particular la formulación liofilizada de la invención, no comprende cloruro de sodio. La exclusión de NaCI evita la alta osmolaridad innecesaria en la formulación. Más aún, la exclusión de sal elimina adicionalmente el posible efecto adverso de la sal sobre la estabilidad de la proteína durante la liofilización. En una modalidad preferida, el cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, es sacarosa o trehalosa. En otra modalidad preferida, el disacárido no reductor es trehalosa.

En una modalidad preferida, la concentración de cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, es del 3 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), preferiblemente del 5 por ciento al 10 por ciento (peso/volumen), de una manera preferible del 7.5 al 10 por ciento (peso/volumen), y muy preferiblemente del 10 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. La concentración de trehalosa expresada en la aplicación global, a menos que se indique de una manera explícita de otra manera, se refiere a la concentración de dihidrato de trehalosa (2H20). Es un conocimiento general para una persona experta convertir entre la concentración de dihidrato de trehalosa y la concentración de trehalosa libre de agua. Por ejemplo, el dihidrato de trehalosa al 10 por ciento es igual a la trehalosa libre de agua al 9 por ciento. En una modalidad preferida, la composición estabilizante de la formulación líquida o liofilizada de la invención, de preferencia de la formulación liofilizada, comprende además cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen. En una modalidad preferida adicional, la concentración total de este disacárido no reductor y del agente de volumen es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), con la condición de que la concentración del disacárido no reductor es de cuando menos el 0.5 por ciento (peso/volumen), de preferencia de cuando menos el 1 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida todavía adicional, la concentración total del cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, y del cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, es del 3 por ciento al 10 por ciento, de preferencia del 3 por ciento al 8 por ciento (peso/volumen), preferiblemente del 3 por ciento al 7 por ciento, de una manera preferible del 4.5 al 7 por ciento, y muy preferiblemente del 4.5 por ciento al 6 por ciento (peso/volumen) en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida, la concentración total del cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, y el cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, es del 3 por ciento al 10 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 4.5 al 7 por ciento (peso/volumen), en la formulación antes de la liofilización, en donde la concentración de este disacárido no reductor es de cuando menos el 1 por ciento (peso/volumen). De una manera preferible, la osmolaridad de la formulación es de 250 a 350 mOsm/kg, más preferiblemente de aproximadamente 300 mOsm/kg. En una modalidad preferida, la concentración total del cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, y del cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, es del 3 por ciento al 10 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 4.5 al 7 por ciento (peso/volumen), en la formulación antes de la liofilización, en donde la concentración del agente de volumen es de cuando menos el 1 por ciento (peso/volumen). De una manera preferible, la osmolaridad de la formulación es de 250 a 350 mOsm/kg, más preferiblemente de aproximadamente 300 mOsm/kg. En una modalidad preferida, la concentración total del cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, y del cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, es del 3 por ciento al 10 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 4.5 por ciento al 7 por ciento (peso/volumen) en la formulación antes de la liofilización, en donde la concentración del agente de volumen es de cuando menos el 1 por ciento (peso/volumen), y la concentración del disacárido no reductor es de cuando menos el 1 por ciento (peso/volumen). De una manera preferible, la osmolaridad de la formulación es de 250 a 350 mOsm/kg, más preferiblemente de aproximadamente 300 mOsm/kg. En una modalidad preferida, el disacárido no reductor es trehalosa, y el agente de volumen es manitol. En una modalidad muy preferida, la concentración total de cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, y del cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, es del 5.0 al 6.5 por ciento (peso/volumen) en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida adicional, la proporción entre el agente de volumen y el disacárido no reductor es de 3.5:1 a 4.5:1, de preferencia de 4:1. En una modalidad preferida todavía adicional, el disacárido no reductor es trehalosa, y el agente de volumen es manitol. En una modalidad muy preferida, la concentración de trehalosa es del 1.1 por ciento (peso/volumen), y la concentración de manitol es del 4.4 por ciento (peso/volumen), en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida, el agente de volumen es manitol o glicina. En una modalidad preferida adicional, el agente de volumen es manitol. La inclusión del agente de volumen, de preferencia manitol, contribuye a la obtención de una estructura de torta estable, y puede permitir tener una temperatura de secado primario más alta en el proceso de liofilización, que reduzca convenientemente el costo de producción. En una modalidad preferida, el pH de la composición estabilizante es de 5.4 a 6.6, de preferencia de 5.6 a 6.4, preferiblemente de 5.8 a 6.4, de preferencia de 6.0 a 6.4, y de una manera preferible de 6.2. En una modalidad preferida adicional, el pH es de 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 y 6.6. En una modalidad preferida, el tensoactivo no iónico es del 0.0025 por ciento al 0.01 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 0.0025 por ciento al 0.01 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 0.005 por ciento (peso/volumen), en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de concentración en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida, el tensoactivo no iónico es polisorbato 20 o polisorbato 80. En una modalidad preferida, el tensoactivo no iónico es polisorbato 20. Las partículas tipo virus pueden ser de cualquier virus conocido en este campo, que tenga una estructura ordenada y repetitiva. Los virus de ADN o de ARN ilustrativos, cuya proteína de recubrimiento o de caCpsida se puede utilizar para la preparación de las partículas tipo virus, se han dado a conocer en la Publicación Internacional Número WO2004/009124, en la página 25, líneas 10-21, en la página 26, líneas 11-28, y en la página 28, línea 4 a página 31, línea 4. Estas divulgaciones se incorporan a la presente a manera de referencia. En una modalidad preferida adicional, la partícula tipo virus es de un virus seleccionado a partir del grupo que consiste en: a) bacteriófagos de ARN; b) bacteriófagos; c) virus de hepatitis B, de preferencia su proteína de capsida (Ulrich, y colaboradores, Virus Res. 50:141-182 (1998)), o su proteína superficial (Publicación Internacional Número WO 92/11291); d) virus de sarampión (Warnes, y colaboradores, Gene 160:173-178 (1995)); e) virus Sindbis; f) rotavirus (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5,071,651 y US 5,374,426); g) virus de enfermedad de pie y boca (Twomey, y colaboradores, Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) virus de Norwalk (Jiang, X., y colaboradores, Science 250:1580-1583 (1990) ; Matsui, S. M., y colaboradores, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991) ); i) Alfavirus; j) retrovirus, de preferencia su proteína GAG (Publicación Internacional Número WO 96/30523); k) retrotransposón Ty, de preferencia la proteína pi; I) virus de papiloma humano (Publicación Internacional Número WO 98/15631); m) virus de Polioma; n) virus de mosaico de tabaco; o) virus de mosaico de guisante; y p) virus de establo; q) virus moteado clorótico de guisante; y r) virus de mosaico de alfalfa. Los métodos para producir la partícula tipo virus del virus moteado clorótico de guisante, del virus de mosaico de alfalfa, y del virus de mosaico de guisante, se han descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 2005/0260758, y en la Publicación Internacional Número WO WO05067478. En una modalidad preferida, la partícula tipo virus es de un bacteriófago de ARN. En una modalidad preferida adicional, el bacteriófago de ARN se selecciona a partir del grupo que consiste en: a) bacteriófago ?ß; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95;k) bacteriófago f2; I) bacteriófago PP7, y m) bacteriófago AP205. En una modalidad preferida, la partícula tipo virus es una partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN ?ß. Los métodos para la producción de la partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN, en particular de la partícula tipo virus del bacteriófago ?ß, y la partícula tipo virus del bacteriófago AP205, se han descrito en las páginas 37 a 47 de la Publicación Internacional Número WO 04009124, y en los Ejemplos 1 y 21 de la misma. En una modalidad preferida, la partícula tipo virus es del bacteriófago de ARN ?ß. En una modalidad preferida adicional, la partícula tipo virus es del bacteriófago de ARN ?ß, que se expresa de una manera recombinante en E. coli. En una modalidad preferida, el conjugado de nicotina-partícula tipo virus es desde 0.1 miligramos/mililitro a 2.5 miligramos/mililitro en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida, el conjugado de nicotina-partícula tipo virus es de 0.2 miligramos/mililitro a 2 miligramos/ mililitro en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. En otra modalidad preferida de la presente invención, la concentración del conjugado de nicotina-partícula tipo virus en la formulación líquida, típicamente y de preferencia en términos de la concentración en lá formulación antes de la liofilización, es de 0.2 miligramos/mililitro, de 0.6 miligramos/ mililitro, de 1.0 miligramos/mililitro, o de 2 miligramos/mililitro. Nuevamente en otra modalidad preferida de la presente invención, la concentración del conjugado de nicotina-partícula tipo virus en la formulación líquida, típicamente y de preferencia en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización, es de 0.2 miligramos/mililitro, o de 0.6 miligramos/mililitro, de preferencia de 0.2 miligramos/mililitro. Varias secuencias de enlace que comprenden una funcionalidad de éster carboxilico con las que se pueden enlazar covalentemente las moléculas de nicotina con un portador, se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5876727, US 6656469 y US 6932971. Estas enseñanzas específicas se incorporan a la presente a manera de referencia. Las secuencias de enlace utilizables para la presente invención, y que comprenden una funcionalidad de éster, son, por ejemplo, las secuencias de enlace denominadas como CJ2, CJ2.1, CJ2.2, CJ2.3, CJ4, CJ4.1, CJ5, CJ5.1, CJ8, CJ8.1, CJ9 y CJ11, como se dan a conocer en la columna 17 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5876727. En una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia de enlace comprende A-X-CO(0)-Y-Z-B, en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus, y en donde X=(CH2)m con m = 1-4, Y = (CH2)n con m = 1-8, y Z=C(0). En una modalidad muy preferida, la secuencia de enlace comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CH2OCO(CH2)mCO, en donde n = 1-8, de preferencia n = 1-4, preferiblemente n=1 ó 2, y más preferiblemente n=2. Nuevamente en una modalidad muy preferida, la secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus. La secuencia de enlace puede enlazarse covalentemente al anillo de piridina o de pirrolidina de la molécula de nicotina. Los ejemplos de las mismas se dan a conocer en particular en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 5876727, US 6656469 y US 6932971. En una modalidad muy preferida, la secuencia de enlace se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina. La totalidad de las moléculas de nicotina covalentemente enlazadas están presentes en la misma configuración absoluta, es decir, todas las moléculas de nicotina tienen la configuración (R), o todas las moléculas de nicotina tienen la configuración (S) que se presenta naturalmente, o están presentes en cualquier mezcla de las mismas. De una manera preferible, las moléculas de nicotina se enlazan covalentemente de tal manera que está presente una mezcla aproximadamente igual, o una mezcla igual de tanto la configuración (R) como la configuración (S) que se presenta naturalmente. En una modalidad muy preferida, el conjugado de nicotina-partícula tipo virus comprendido por las formulaciones de la invención se puede obtener o se obtiene mediante la utilización de una mezcla racémica de moléculas de nicotina o derivados de nicotina, típicamente y de preferencia mediante la utilización de una mezcla racémica de moléculas de nicotina o derivados de nicotina que comprenden a las moléculas de nicotina con la secuencia de enlace covalentemente enlazada a las mismas, para la reacción de acoplamiento con la partícula tipo virus, que conduce al conjugado de nicotina-partícula tipo virus de conformidad con la invención. En una modalidad preferida, el conjugado de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, preferiblemente Nic-?ß, se forma a partir del material de partida de 0-succinil-3'-hidroxi-metil-nicotina, y el material de partida de partícula tipo virus de ?ß. En una modalidad preferida, la composición estabilizante comprende un agente regulador, tal como succinato, acetato, maleato, citrato, lactato, tartrato, tris, bis-tris, trietanolamina, tricina, bicina, histidina, aspartato, glicinato, glutamato, lisina, ftalato, formiato, alanina, fenilalanina, arginina, y prolina. En una modalidad preferida, el agente regulador se selecciona a partir del grupo que consiste en fosfato de sodio, fosfato de potasio, e histidina/HCI de histidina, acetato de sodio, succinato de sodio. En una modalidad preferida adicional, la concentración del agente regulador es de 10 a 20 mM en términos de la concentración en la formulación líquida, o con respecto a la formulación liofilizada, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad preferida adicional, el agente regulador es fosfato de sodio o fosfato de potasio, de preferencia fosfato de sodio. En una modalidad preferida, el agente regulador es histidina/HCI de histidina. En una modalidad preferida, el agente regulador es acetato de sodio. En una modalidad preferida, el agente regulador es succinato de sodio. En una modalidad preferida, la formulación líquida o liofilizada de la invención comprende además cloruro de sodio, de 0 a 90 mM, de preferencia de 0 a 60 mM, más preferiblemente de 0 a 30 mM. Primordialmente, la inclusión de cloruro de sodio es para estabilizar la solución líquida, o para ajustar la osmolaridad de las formulaciones líquidas o liofilizadas de la invención. En una modalidad muy preferida adicional, la invención proporciona una formulación liofilizada de la invención que comprende, o que alternativamente consiste esencialmente en, o que consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus que comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste en: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, en donde la concentración de este disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 3 por ciento al 12 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos uno, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) un agente regulador, en donde este agente regulador de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en fosfato de sodio, fosfato de potasio, acetato de sodio, succinato de sodio, e histidina/HCI de histidina; (f) opcionalmente de 0 a 30 mM de NaCI en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6 antes de la liofilización. En una modalidad alternativamente preferida, la invención proporciona una formulación liofilizada de la invención que comprende, o que de una manera alternativa consiste esencialmente en, o consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste en: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, en donde la concentración de este disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos uno, de preferencia un solo agente de volumen, en donde la concentración total del disacárido no reductor y de este agente de volumen es de 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), con la condición de que la concentración del disacárido no reductor es de cuando menos el 0.5 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) cuando menos, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (f) un agente regulador, en donde este agente regulador de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en fosfato de sodio, fosfato de potasio, acetato de sodio, succinato de sodio, e histidina/HCI de histidina; (g) opcionalmente de 0 a 30 mM de NaCI en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6 antes de la liofilización. En una modalidad muy preferida, la invención proporciona una formulación liofilizada de la invención que comprende, o que alternativamente consiste esencialmente en, o consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, de preferencia cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN, de preferencia cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, todavía más preferiblemente un conjugado de Nic-?ß, la cual comprende: (a) una partícula tipo virus, de preferencia una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, en donde la concentración de este conjugado es de preferencia de 0.1 miligramos/mililitro a 2 miligramos/mililitro, preferiblemente de 0.2 miligramos/mililitro a 1 miligramo/mililitro, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus, de preferencia a la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste en: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, preferiblemente trehalosa, en donde la concentración de este disacárido no reductor es del 5 por ciento al 12 por ciento, de preferencia del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos uno, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, preferiblemente polisorbato 20, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen), preferiblemente del 0.005 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) un agente regulador, en donde este agente regulador es de preferencia fosfato de sodio, fosfato de potasio, acetato de sodio, succinato de sodio, o histidina/HCI de histidina; más preferiblemente es histidina/HCI de histidina, en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 5.6 a 6.2 antes de la liofilización. La presente invención proporciona una formulación liofilizada que comprende, o que alternativamente consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, y en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y en donde esta secuencia de enlace se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) un disacárido no reductor, en donde este disacárido no reductor es trehalosa, y en donde la concentración de trehalosa es del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) un tensoactivo no iónico, en donde este tensoactivo no iónico es polisorbato 20, y en donde la concentración de polisorbato 20 es del 0.005 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 6.2 antes de la liofilización. La presente invención proporciona una formulación liofilizada, la cual comprende, o alternativamente consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente con la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, y en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y en donde la secuencia de enlace mencionada se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste esencialmente en, o consiste en: (c) un disacárido no reductor, en donde este disacárido no reductor es trehalosa, y en donde la concentración de trehalosa es del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración de la formulación antes de la liofilización; (d) un tensoactivo no iónico, en donde este tensoactivo no iónico es polisorbato 20, y en donde la concentración de polisorbato 20 es del 0.005 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) un agente regulador, en donde este agente regulador es fosfato de sodio o histidina/HCI de histidina, y en donde la concentración del fosfato de sodio o de la histidina/HCI de histidina es de 20 mM; y en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 6.2 antes de la liofilización. En una modalidad muy preferida adicional, la invención proporciona una formulación liofilizada de la invención que comprende, o alternativamente que consiste esencialmente en, o que consiste en: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste en: (c) cuando menos uno, de preferencia un solo disacárido no reductor, en donde la concentración de este disacárido no reductor es del 5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 10 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) cuando menos uno, de preferencia un solo tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 0.005 por ciento, en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) un agente regulador, en donde este agente regulador de preferencia se selecciona a partir de acetato de sodio, succinato de sodio, e histidina/HCI de istidina; (f) opcionalmente de 0 a 30 mM de NaCI en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante mencionada tiene un valor de pH de 6.0 a 6.4, de preferencia de 6.2, antes de la liofilización. En una modalidad preferida, la composición liofilizada de la invención es estable durante cuando menos 15 semanas, de preferencia durante cuando menos 25 semanas, a temperatura ambiente, o inclusive a temperatura acelerada (40°C). En un aspecto, la presente invención proporciona una formulación reconstituida, la cual comprende la composición liofilizada de la invención disuelta y/o suspendida en una solución fisiológicamente aceptable o en agua estéril, de preferencia en agua para inyección. En otra modalidad preferida, la solución es una solución de NaCI. De preferencia, la formulación reconstituida tiene un valor de osmolaridad fisiológicamente aceptable. En una modalidad preferida, la formulación reconstituida comprende además un adyuvante. En una modalidad preferida adicional, el adyuvante es de geles hidratados con hidróxido de aluminio o de geles hidratados con fosfato de aluminio. En un aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la elaboración de la formulación liofilizada de la invención, el cual comprende los pasos de: (i) congelar la formulación antes de la liofilización, mediante la reducción de la temperatura de anaquel debajo de -35°C, de preferencia debajo de -38°C, preferiblemente debajo de -40°C, de una manera preferible debajo de -45°C, y muy preferiblemente debajo de -50°C; (ii) secar primariamente la formulación a la temperatura de anaquel de -45°C a -15°C, de preferencia de -40°C a -20°C, preferiblemente de -35°C a -25°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar; (iii) secar secundariamente la formulación a la temperatura de anaquel de 10°C a 40°C, de preferencia de 10°C a 30°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar. El proceso comprende opcionalmente un paso de secar la formulación a la temperatura de anaquel de -30°C a -15°C, de preferencia a -20°C, después del paso (ii), con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar. En una modalidad preferida, la presión de la cámara durante el secado primario y secundario es de 0.005 mbar a 0.2 mbar, de preferencia de 0.020 mbar a 0.2 mbar, preferiblemente de 0.03 a 0.1 mbar, y muy preferiblemente de 0.040 a 0.05 mbar. En otra modalidad preferida, la reducción de la temperatura de anaquel se lleva a cabo a una velocidad de 0.1°C a 1.0°C/minuto, de preferencia de 0.5°C a 1.0°C/minuto. En una modalidad preferida, el proceso de la invención comprende los pasos de: (i) congelar la formulación antes de la liofilización mediante la reducción de la temperatura de anaquel debajo de -40°C, de preferencia debajo de -50°C; (ii) secar primariamente la formulación a la temperatura de anaquel de -35°C durante cuando menos 10 horas, de preferencia durante 20 horas, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar; (iii) secar secundariamente la formulación a la temperatura de anaquel de 10°C a 30°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar. El proceso comprende opcionalmente un paso de secar la formulación a la temperatura de anaquel a -20°C después del paso (ii), con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un proceso para la elaboración de la formulación liofilizada de la invención, el cual comprende los pasos de: (i) congelar la formulación antes de la liofilización, mediante la reducción de la temperatura de anaquel debajo de -40°C, de preferencia hasta -50°C; (¡i) secar primariamente la formulación a la temperatura de anaquel de-35°C, de preferencia durante 25 horas; elevar la temperatura de anaquel, y secar la formulación a la temperatura de anaquel de -20°C, de preferencia durantelO horas, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar, de preferencia a 0.045 mbar; (iii) secar secundariamente la formulación a la temperatura de anaquel de 20°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar, de preferencia a 0.045 mbar. En una modalidad preferida, el proceso de la invención comprende un paso de templado adicional, de preferencia de -10°C a -20°C, típicamente durante 2 a 5 horas, después de la congelación de la formulación mediante uno de los procesos de congelación descritos en la invención. Este paso de templado de preferencia se utiliza cuando la composición estabilizante de la invención comprende cuando menos un agente de volumen, tal como manitol o glicina. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un proceso para la elaboración de la formulación liofilizada de la invención, el cual comprende los pasos de: (i) congelar la formulación antes de la liofilización, mediante la reducción de la temperatura de anaquel debajo de -40°C, de preferencia a -50°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar, de preferencia a 0.045 mbar; (ii) opcionalmente templar a -15°C; (iii) secar primariamente la formulación a la temperatura de anaquel a -15°C, de preferencia durante 20 horas; (iv) secar secundariamente la formulación a la temperatura de anaquel de 40°C, con la presión de la cámara debajo de 0.2 mbar, de preferencia a 0.007 mbar. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Materiales y Métodos "Nic-Q " - El término "Nic-QP", como se utiliza en la presente, debe referirse a cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus que comprende: (a) una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus, mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, y en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y en donde la secuencia de enlace mencionada se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina. Nic-?ß se produjo como se describe en el Ejemplo 1 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6'932'971. La sustancia de fármaco de Nic-?ß se descongeló a temperatura ambiente. Protocolos de secado por congelación Tabla 1: Proceso de secado por congelación I Paso Tiempo Temperatura Presión [h] [°C] [mbar] Carga 0:00:00 20 1013 Congelación 1 :10:00 -50 1013 3:00:00 -50 1013 Secado 0:01 :00 -50 0.045 primario 0:15:00 -35 0.045 20:00:00 -35 0.045 Paso Tiempo Temperatura Presión [h] [°C] [mbar] Secado 2:30:00 -20 0.045 secundario 10:00:00 -20 0.045 1 :20:00 20 0.045 10:00:00 20 0.045 Tabla 2: Proceso de secado por congelación II Paso Tiempo Temperatura Presión [h] [°C] [mbar] Carga 0:00:00 20 1013 Congelación 1 :10:00 -50 1013 3:00:00 -50 1013 Secado 0:01 :00 -50 0.045 primario 4:00:00 -15 0.045 20:00:00 -15 0.045 Secado 0:01 :00 -15 0.007 secundario 6:00:00 40 0.07 Paso Tiempo Temperatura Presión [ ] [°C] [mbar] 10:00:00 40 0.007 Reconstitución de los Liofilizados Como es conocido por una persona experta, para algunos de los análisis descritos más adelante, los liofilizados se necesitan llevar hasta una solución acuosa. Por consiguiente, los liofilizados se reconstituyeron con agua filtrada estéril, típicamente y de preferencia con agua filtrada estéril de un volumen para ajusfar el volumen total de la formulación antes de la liofilización. A manera de ejemplo, si la formulación antes del proceso de liofilización consistía en 0.7 mililitros por frasco, entonces de preferencia la torta formada resultante del proceso de liofilización se reconstituye en un volumen tal de agua estéril que la composición final nuevamente consiste en 0.7 mililitros. Mediciones de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) para determinar los agregados de partícula tipo virus Las mediciones AF4 se condujeron utilizando un canal de separación Wyatt con un espaciador de 350 mieras, un sistema de separación Eclipse 2 (Wyatt Technology Corporation), una bomba ¡socrática Agilent 1100 G1310A, un desgasificador Agilent 1100 G1379A, un auto-muestreador Agilent 1100 G1329A, un termostato para auto-muestreador Agilent 1100 G1330B, un detector de distribución de peso molecular Agilent 1100 G1365B, un detector de Rl Agilent 1100 G1362A, y un detector de MALS Wyatt DAWN EOS. El flujo del canal fue de 1.5 mililitros/minuto. EL flujo cruzado fue de 2.0 mililitros/minuto durante 18 minutos, y subsiguientemente se redujo hasta 0.15 mililitros/minuto en 15 minutos, y se mantuvo durante 5 minutos a 0.15 mililitros/minuto. En un paso final, el flujo cruzado fue de 0.0 mililitros/minuto durante 5 minutos. La concentración de la partícula tipo virus se determinó a 260 nanómetros con el detector de distribución de peso molecular. El detector de MALS Wyatt DAWN EOS se utilizó para la determinación del radio hidrodinámico y del peso molecular de las especies de partículas tipo virus. Se inyectó una cantidad de alrededor de 20 microgramos de partícula tipo virus a partir de las formulaciones líquidas y de los liofilizados reconstituidos (reconstituidos con agua como se describe anteriormente) en el AF4, respectivamente. Mediciones de calorimetría de exploración diferencial (DSC) para determinar la temperatura de transición de cristal Se condujeron mediciones de calorimetría de exploración diferencial con un Calorímetro de Exploración Diferencial Netzch 204 Phoenix. Típicamente, se pesaron de 1 a 25 miligramos de la muestra en bandejas de aluminio. Luego las bandejas se cerraron herméticamente con una tapa de aluminio, utilizando una prensa de cierre universal. La bandeja de referencia permaneció vacía, y se preparó de la misma manera. Las bandejas se colocaron en la celda de medición. La celda se inundó con nitrógeno. Las muestras se midieron a una velocidad de calentamiento de 10°C/minuto. La temperatura de transición de cristal, Tg, de los liofilizados, se determinó por medio de las exploraciones individuales de calorimetría de exploración diferencial. Análisis de contenido de agua L-as mediciones de contenido de humedad de los liofilizados se condujeron con un titulador coulométrico Karl Fischer, con un horno de espacio superior (Analytic Jena AG). Los liofilizados se midieron justo en el frasco de vidrio 2R a la temperatura del espacio superior de 80°C. Las muestras se calentaron en la cámara del horno durante cuando menos 5 minutos. Mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) para determinar la homogeneidad de la formulación Se condujeron mediciones de dispersión de luz dinámica con un aparato Malvern Zetasizer Nano ZS. Se pasaron por pipeta de 0.5 a 1.0 mililitros de la formulación líquida o de los liofilizados reconstituidos (reconstituidos como se describe anteriormente) hacia micro-cubetas UV Plastibrand, y se midieron aplicando un protocolo estándar LMU Munich validado (proteína SOP_m_99 por ciento). Se calcularon el índice de polidispersidad Pl, la proporción del pico principal de Nic-?ß, y el tamaño del pico principal, aplicando los modelos de conversión de volumen e intensidad. Mediciones de bloqueo de luz para determinar la contaminación de partículas y los agregados de partículas tipo virus Se condujeron mediciones de bloqueo de luz con un aparato PAMAS SVSS-C. El sistema se inundó con una parte de la formulación, y subsiguientemente se evaluaron de 0.1 a 0.3 mililitros de la formulación líquida o de los liofilizados reconstituidos para determinar la contaminación de partículas. La solución se extrajo a través de la celda de medición, y se determinó la cantidad de partículas mayores de 1, 10, y 25 mieras calculadas por mililitro. SE-HPLC-Integridad de ARN Las partículas se homogeneizaron en el Reactivo TRI (una combinación de fenol y tiocianato de guanidina en una solución de mono-fase para inhibir la actividad de la ARNsa), seguido por extracción de ARN con 1 -bromo-3-cloro-propano (BCP) - Reactivo de Separación de Fases. El ARN extraído se precipitó con isopropanol, y el gránulo se lavó con etanol. Luego se disolvió el ARN en DEPC-H20, y se analizó mediante HPLC (monitoreando el efecto A260nm-elución ¡socrática). Se determinó el tiempo de retención del ARN extraído en relación con un estándar de ARNt analizado en la misma serie. RP-HPLC-nicotina libre Los derivados de nicotina solubles de hidroxi-metil-nicotina (debido a la hidrólisis del enlace de éster) y de succinil-hidroxi-metil-nicotina (debido a la degradación del enlace de amida) se separaron del Nic-?ß mediante filtración en filtros centrífugos. Se analizó el flujo atravesado mediante RP-HPLC (A260nm - longitud de onda de absorción de la nicotina y de los derivados de nicotina). La concentración de los derivados de nicotina se calculó a partir de la regresión de una curva estándar de nicotina llevada a cabo en paralelo. Los valores para la nicotina libre se vieron en porcentaje de nicotina total. RP-HPLC-nicotina total La fracción de nicotina covalentemente enlazada a la proteína Qp se disoció cuantitativamente durante una incubación de 3 horas a 40°C y a un pH >11, después de lo cual, se precipitaron las proteínas. El producto de hidrólisis de hidroxi-metil-nicotina permaneció en el sobrenadante, y se cuantificó mediante RP-HPLC (A26onm) utilizando una curva estándar de nicotina, debido a que tanto el producto de hidrólisis como la nicotina comparten el mismo cromóforo. SE-HPLC-Integridad de Partícula Tipo Virus La SE-HPLC es un método analítico para separar diferentes compuestos en una muestra de acuerdo con su tamaño. Por consiguiente, las partículas de Qp grandes se pueden separar de las moléculas más pequeñas, por ejemplo, los monómeros de proteína de recubrimiento de QP o los fragmentos de ácido nucleico, y por consiguiente, el método se utilizó para confirmar la integridad de la partícula tipo virus. El método también se empleó para confirmar la pureza de la sustancia de fármaco. Como un control, se analizó un estándar de partícula tipo virus con la muestra en la misma serie. La detección se llevó a cabo a 260 nanómetros. Las impurezas relacionadas con el producto pueden ser agregados de proteína, productos de disociación más pequeños, y/o ácidos nucleicos. Todas estas impurezas relacionadas con el producto se detectaron mediante SE-HPLC, que se ha demostrado que es capaz de separar estas impurezas del pico del producto. Para la detección, se utiliza una longitud de onda de 260 nanómetros. Mediciones de Turbiedad Se determinó el grado de opalescencia de las soluciones de muestra líquidas utilizando un turbidímetro de laboratorio (2100 AN, HACH Company). Se llevaron a cabo mediciones de turbiedad mediante el turbidímetro de proporción, el cual determina la proporción de luz transmitida y de luz dispersada por las partículas en la solución de muestra. El instrumento se calibró utilizando suspensiones estándares de turbiedad de formazina en células de muestras definidas. Para la medición de los volúmenes de muestra de 1 a 5 mililitros en tubos de ensayo más pequeños, se estableció una curva de calibración definida por el usuario en un intervalo de 0 a 200 NTU. Se midió 1 mililitro de muestra en tubos de ensayo de vidrio desechables, a los cuales se les ha aplicado aceite de silicona con el objeto de reducir los efectos de dispersión provocados por el vidrio. Mediciones de Transmisión de VIS Las mediciones de transmisión se condujeron con un Espectrofotómetro UV/visible de doble haz UV1 (Thermo Spectronic). Se pasaron por pipeta de 0.5 a 1.0 mililitros de la formulación líquida hacia las micro-cubetas UV Plastibrand. La transmisión se determinó a 600 nanómetros. EJEMPLO 2 Efecto del pH sobre la estabilidad de Nic-?ß Se analizó la estabilidad de Nic-?ß en diez pHs diferentes, en el intervalo de 4.6 a 8.2. El pH de los accesorios se ajustó utilizando ya sea una solución de NaOH 0.1N, o bien una solución de H3P04 0.1 N. Todas las muestras se diluyeron hasta una concentración de 1 miligramo/mililitro de Nic-?ß utilizando agua. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente hasta 14 días. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3: Resultados - Estudio de estabilidad al pH de Nic-Qp DLS RP-HPLC SE-HPLC Pico principal Contenido de Pico (determinado derivados de principal PH Pl utilizando el nicotina libres Área pico modelo de [% del total] relativa en conversión de en el día 7 el día 7 intensidad) 4.6 1.7 98.5 0.26 82.9 5.0 1.5 98.2 0.23 89.8 5.4 1.9 97.8 0.20 93.6 5.8 1.6 97.3 0.21 91.8 DLS RP-HPLC SE-HPLC Pico principal Contenido de Pico (determinado derivados de principal PH Pl utilizando el nicotina libres Área pico modelo de [% del total] relativa en conversión de en el día 7 el día 7 intensidad) 6.2 3.1 97.1 0.19 94.3 6.6 3.9 96.6 0.17 94.0 7.0 7.2 96.3 0.14 98.9 7.4 11.1 91.4 0.12 100.0 7.8 22.6 89.1 0.08 100.0 8.2 34.8 84.0 0.10 100.0 Se investigó la inestabilidad química del Nic-Qp utilizando los métodos de RP-HPLC y SE-HPLC. La inestabilidad química del Nic-?ß da como resultado la degradación de la partícula tipo virus en los monómeros o multímeros de la proteína de recubrimiento de ?ß y/o la disociación entre la nicotina y la partícula tipo virus de ?ß. El contenido de derivados de nicotina libres aumentó con los valores crecientes de pH. Entre un pH de 4.6 y 6.2, solamente se detectaron pequeños incrementos de los derivados de nicotina libres. Arriba de un pH de 6.2, la cantidad de derivados de nicotina libres aumentó rápidamente durante el tiempo de almacenamiento. Además, la integridad de la partícula tipo virus fue negativamente influenciada con los valores crecientes de pH. A un pH igual o más alto que 7.4, la integridad de la capsida de Qp disminuyó drásticamente después de 7 días, medida mediante SE-HPLC. El contenido relativo de Nic-QP a un pH de 7.0 después de 7 días a temperatura ambiente durante de alrededor del 96 por ciento, mientras que a un pH de 7.4 fue de alrededor del 91 por ciento. Se investigó la estabilidad física del Nic-QP mediante las mediciones de bloqueo de luz, DLS, y transmisión-VIS. Estabilidad física de Nic-QP: el término "estabilidad física de Nic-QP", como se utiliza en la presente, se refiere a la acumulación de las partículas tipo virus de Qp. Los tres métodos analíticos mostraron que Nic-QP tendió a acumularse en valores de pH iguales o debajo de 5.8. La medición DLS mostró que la proporción del pico principal disminuyó, mientras que el pico que comprendía los agregados de partículas tipo virus y oligómeros aumentó, y el índice de polidispersidad (Pl) aumentó en valores de pH iguales o debajo de 5.8. Los resultados obtenidos mediante las mediciones de bloqueo de luz y de transmisión-VIS validaron el descubrimiento de que, con un pH decreciente, el Nic-QP tendió hacia la acumulación.

EJEMPLO 3 Efecto de las condiciones de tensión por congelación- descongelación sobre la estabilidad de Nic-?ß Un total de 36 formulaciones diferentes de Nic-?ß se sometieron a ciclos de congelación/descongelación. Las muestras se congelaron a -80°C, y se descongelaron de 20°C a 25°C. Estos ciclos de congelación/descongelación se repitieron cinco veces. Las formulaciones se analizaron antes y después de los ciclos de congelación/descongelación mediante mediciones DLS y mediante mediciones de bloqueo de luz. Efecto de la trehalosa y de la adición de polisorbato 20 -Las formulaciones comprendieron 0.2 miligramos/mililitro de Nic-?ß, ya sea el 0 o el 10 por ciento de trehalosa, pH = 6.4, NaCI 30 mM, con o sin polisorbato 20 al 0.005 por ciento. Los resultados de las mediciones DLS obtenidas con las formulaciones que contenían trehalosa sin polisorbato mostraron una ligera disminución del pico principal y un aumento del índice de polidispersidad. Por consiguiente, la trehalosa condujo a un ligero incremento en el nivel de acumulación de Nic-?ß. Sin embargo, este efecto se podría prevenir mediante la adición de polisorbato 20. Los resultados del bloqueo de luz apoyaron las mediciones DLS. Se detectó un número significativamente más bajo de partículas >1 miera en las formulaciones que contenían polisorbato 20 después de la congelación/descongelación, comparándose con el número de partículas >1 mieras en las formulaciones sin polisorbato.

Efecto de la diferente concentración de NaCI y de la adición de polisorbato 20 - Las formulaciones comprendieron 0.2 miligramos/mililitro de ???-?ß, 10 por ciento de trehalosa, pH = 6.4, diferentes concentraciones de NaCI con o sin polisorbato 20 al 0.05 por ciento. Los resultados de la medición DLS mostraron que el NaCI tenía una influencia sobre el nivel de acumulación de ???-?ß después de haberse congelado/descongelado. Los índices de polidispersidad de las soluciones aumentaron con las concentraciones crecientes de NaCI después de los ciclos de congelación/descongelación. Por consiguiente, se redujo de una manera significativa la estabilidad física del Nic-?ß con las concentraciones crecientes de NaCI. Sin embargo, con la adición del polisorbato 20, se podría compensar esta inestabilidad física para concentraciones NaCI iguales y debajo de 90 mM. Estos resultados fueron apoyados por la medición de bloqueo de luz. Después de la congelación/descongelación, las formulaciones sin polisorbato mostraron un aumento significativo de partículas mayores de 1 miera, lo cual indicó una cantidad más alta de agregados. La adición de polisorbato 20 impidió la acumulación, debido a que casi no se detectaron partículas mayores de 1 miera. Efecto de diferentes pHs y de la adición de polisorbato 20 -Se investigó el efecto del pH en el intervalo de 5.4 a 7.2 sobre la estabilidad de las formulaciones en la presencia o en ausencia de polisorbato 20. Las formulaciones comprendieron 0.2 miligramos/ mililitro de Nic-?ß, 10 por ciento de trehalosa, diferentes pHs, NaCI 30 mM, con o sin polisorbato 20 al 0.005 por ciento. Los resultados apoyaron los hallazgos del estudio de estabilidad al pH descrito en el Ejemplo 2. Ya durante la preparación de las soluciones de formulación, la proporción del pico principal de ???-?ß fue disminuyendo al disminuir el pH, como se determinó mediante las mediciones DLS, utilizando el modelo de conversión de volumen. Por otra parte, el índice de polidispersidad fue creciendo. La adición de polisorbato 20 impidió la acumulación de Nic-?ß en los valores de pH probados de 6.4 y 7.2. Adicionalmente, la adición de polisorbato 20 redujo la acumulación de Nic-Qp a un pH de 5.4. En adición a las mediciones DLS, los resultados obtenidos mediante la medición de bloqueo de luz apoyaron estos hallazgos. Las observaciones anteriormente descritas hechas en el transcurso de este estudio de pH mediante DLS y medición de bloqueo de luz fueron consistentes para las concentraciones de NaCI de 30, 60, 90, y 50 mM. EJEMPLO 4 Influencias de composiciones variables sobre la estabilidad de Nic-?ß durante el secado por congelación El Nic-?ß se descongeló a temperatura ambiente. Se produjeron diferentes formulaciones (como se muestra en la Figura 1) con diferentes concentraciones de Nic-?ß, trehalosa, polisorbato, NaCI, y con diferente sistema regulador, pasando por pipeta el Nic-?ß hacia las soluciones de suministro de excipiente. Las soluciones se agitaron en un agitador magnético IKA durante 5 a 10 minutos. Las soluciones de fármaco finales se filtraron estériles (filtro de membrana de 0.22 mieras), y luego se liofilizaron. Dicho brevemente, las soluciones de fármaco se rellenaron en frascos de vidrio 2R estériles. A partir de las formulaciones F29RL, F48RL, y F49RL, se rellenaron 0.7 mililitros por frasco. A partir de las otras formulaciones, se rellenaron 0.6 mililitros por frasco. Se colocaron tapones de liofilización recubiertos con polidimetil-siloxano y ETFE (etilen-tetrafluoro-etileno) (West Pharmaceutical Services), sobre los frascos. Los frascos se transfirieron a la cámara de liofilización de una secadora por congelación Christ Epsilon 2-12 D (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). La temperatura de anaquel se disminuyó a 0.5°C-1.0°C/minuto hasta -40°C, y se mantuvo debajo de -40°C durante 3 horas. Luego se redujo la presión de la cámara a 0.045 mbar, se llevó al anaquel hasta -35°C a 1°C/minuto, y se mantuvo durante 20 horas. Posteriormente, se elevó la temperatura de anaquel a -20°C a 0.1 °C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas. Subsiguientemente, la temperatura de anaquel se elevó hasta 20°C a 0.5°C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas. Entonces la cámara de liofilización se aireó con nitrógeno seco filtrado a 800 mbar, y los frascos se taparon en la cámara de liofilización. Los frascos se removieron de la cámara y se sellaron con sellos Flip-Off®. Después del secado por congelación, se lograron liofilizados estables, y se dio una estructura de torta suficiente. Los resultados se muestran en la Figura 2. Por consiguiente, los liofilizados de las concentraciones antes de la liofilización con concentraciones variables de Nic-?ß (probadas desde 0.2 miligramos/mililitro hasta 2.0 miligramos/mililitro), trehalosa (probada del 5 por ciento al 10 por ciento), polisorbato (probado del 0.005 al 0.01 por ciento), NaCI (de 0 a 60 mM), tuvieron todos un contenido de humedad menor del 1 por ciento. La suma de las cantidades de oligómeros de Nic-?ß y agregados de Nic-?ß de las formulaciones anteriormente mencionadas no aumentó más del 1 por ciento después del secado por congelación, en comparación con la formulación antes del secado por congelación, como se analizó mediante AF4. Las mediciones DLS mostraron que esas formulaciones tuvieron índices de polidispersidad (Pl) típicamente iguales y debajo de 0.2, y la proporción del pico principal de ???-?ß fue más alta que el 98.5 por ciento, respectivamente, determinado mediante la utilización del modelo de conversión de volumen. Las mediciones analíticas llevadas a cabo condujeron a la conclusión de que estas formulaciones anteriormente mencionadas fueron capaces de estabilizar el Mic-?ß en la concentración de 0.20 miligramos/ mililitro a 2 miligramos/mililitro. F22RL, que no contenía polisorbato 20, tuvo un valor de índice de polidispersidad (Pl) de alrededor de 0.35. Adicionalmente, la suma de las cantidades de oligómeros de Nic-?ß y agregados de Nic-?ß aumentó por aproximadamente el 5.5 por ciento después del secado por congelación, en comparación con la formulación antes del secado por congelación. Estos resultados mostraron que es necesario el tensoactivo no iónico para la prevención de la acumulación de la partícula tipo virus. F08RL, F39RL, F37RL, F38RL comprendieron cloruro de sodio 30 mM, 60 mM, 90 mM, y 150 mM, respectivamente. Aunque la presencia de polisorbato 20 compensó el efecto del NaCI (en una concentración igual y debajo de 60 mM) sobre la estabilidad física del Nic-?ß, (F08RL y F39RL no tuvieron un aumento sustancial de las cantidades de oligómeros de Nic-Qp y agregados de Nic-Qp después de la liofilización) , la presencia de polisorbato 20 solamente compensó parcialmente el efecto de NaCI en concentraciones de NaCI iguales y más altas que 90 mM, a medida que aumentó la suma de las cantidades de oligómeros de Nic-Qp y agregados de Nic-Qp el2.8 y el 3.5 por ciento después del secado por congelación. Además, la presencia de NaCI igual o mayor de 90 mM, dio como resultado valores de osmolaridad más altos que 400 mOsm/kg. EJEMPLO 5 Prueba de las composiciones de manitol/trehalosa como estabilizantes para Nic-?ß durante el secado por congelación Tabla 4: Formulaciones Regulador Dihidrato Polisorbato Nic-Qp Manitol de 20 y Formulación molaridad trehalosa pH [mg/ml] [%] [mM] [%] [%] F30RL 1.0 0.005 Fosfato de 4.0 1.0 6.2 potasio 20 Regulador Dihidrato Polisorbato Nic-?ß Manitol de 20 y Formulación molaridad trehalosa pH [mg/ml] [%] [mM] [%] [%] F32RL 1.0 0.005 Fosfato de 5.3 1.3 6.2 potasio 20 F42RL 1.0 0.005 Fosfato de 4.4 1.1 6.2 sodio 20 F54RL 1.0 0.005 Fosfato de 5.0 0.0 6.2 sodio 20 Se produjeron cuatro formulaciones (F30RL, F32RL, F42RL, F54RL en la Figura 1) sustancialmente igual a como se describe en el Ejemplo 4. El volumen de llenado de los frascos fue de 0.6 mililitros. Las formulaciones F30RL, F32RL, y F42RL, se liofilizaron brevemente bajo las siguientes condiciones: la temperatura de anaquel se disminuyó a 1.0°C/minuto hasta -50°C, y se mantuvo a -50°C durante 3 horas. Entonces se redujo la presión de la cámara hasta 0.045 mbar, se llevó el anaquel hasta -15°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 20 horas. De una manera alternativa, las formulaciones F42RL y F54RL se liofilizaron aplicando el mismo proceso de secado por congelación, pero incluyendo un paso de templado conducido a -15°C durante 2 horas. Subsiguientemente, la presión de la cámara se redujo a 0.0007 mbar, y se llevó el anaquel hasta 40°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas adicionales. Entonces la cámara de liof ilización se aireó con nitrógeno seco filtrado a 800 mbar, y los frascos se taparon en la cámara de liofilización. Los frascos se removieron de la cámara, y se sellaron con sellos Flip-Off®. Los resultados se muestran parcialmente en la Figura 2. Después de la liofilización, se lograron liofilizados estables, y se obtuvo suficiente estructura de torta. El contenido de humedad de las tres formulaciones liofilizadas estuvo típicamente debajo del 0.3 por ciento. La osmolaridad de las formulaciones estuvo típicamente en el intervalo de 250a 340[mOsm/kg]. La osmolaridad aumentó con las concentraciones crecientes de trehalosa y manitol. La fracción de manitol en las fracciones F30RL, F32RL, y F42RL producida sin aplicar un paso de templado, fue amorfa o parcialmente amorfa. La fracción de manitol de las formulaciones F42RL y F54RL producida mediante la aplicación de un paso de templado, fue cristalina después del secado por congelación. Las formulaciones F30RL, F32RL, y F42RL no mostraron un aumento claro significativo de la suma de las cantidades de oligómeros de Nic-QP y agregados de Nic-Qp después del secado por congelación, como se analizó mediante las mediciones AF4. Las mediciones DLS mostraron que las tres formulaciones tuvieron índices de polidispersidad (Pl) debajo de 0.2, y la proporción del pico principal de Nic-Qp fue típicamente mayor del 99 por ciento, determinado mediante la utilización del modelo de conversión de volumen. Para la formulación F54RL, se pudo determinar un aumento en la suma de las cantidades de oligómeros de Nic-Qp y agregados de Nic-Qp después del secado por congelación mediante AF4. Las mediciones de bloqueo de luz mostraron que la contaminación de partículas de los liofilizados reconstituidos estuvo típicamente debajo de 100 partículas >10 mieras por mililitro, y la cantidad de partículas >1 miera estuvo típicamente debajo de 2,000 partículas por mililitro. Estos resultados mostraron que una mezcla de trehalosa y un agente de volumen, tal como manitol, puede estabilizar el Nic-Qp durante el secado por congelación. EJEMPLO 6 Estudios de estabilidad de las formulaciones de Nic-Qp secadas por congelación Se produjeron cinco formulaciones F42RL, F35RL, F10RL, F16RL, y F54RL sustancialmente igual a como se describe en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 5. El volumen de llenado de los frascos fue de 0.6 mililitros. Las formulaciones que contenían trehalosa solamente (F35RL, F10RL, F16RL) se liof i lizaron bajo las siguientes condiciones: la temperatura de anaquel se disminuyó a 1.0°C/m¡nuto hasta -50°C, y se mantuvo a -50°C durante 3 horas. Luego se redujo la presión de la cámara a 0.045 mbar, el anaquel se llevó hasta -35°C a 1°C/minuto, y se mantuvo durante 25 horas. Subsiguientemente, la temperatura de anaquel se elevó hasta -20°C a 0.1 °C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas. Subsiguientemente, la temperatura de anaquel se elevó hasta 20°C a 0.5°C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas. La formulación que contenía tanto trehalosa como manitol (F42RL) se liofilizó bajo las siguientes condiciones: la temperatura de anaquel se disminuyó a 1.0°C/minuto hasta -50°C, y se mantuvo a -50°C durante 3 horas. Luego se redujo la presión de la cámara a 0.045 mbar, y el anaquel se llevó hasta -15°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 20 horas. Subsiguientemente, la presión de la cámara se redujo hasta 0.007 mbar, y el anaquel se llevó hasta 40°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas adicionales. La formulación que contenía solamente manitol (F54RL) se liofilizó bajo las siguientes condiciones: la temperatura de anaquel se disminuyó a 1.0°C/minuto a -50°C, y se mantuvo a -50°C durante 2 horas. Se aplicó un paso de templado a -15°C durante 2 horas. La temperatura de anaquel se disminuyó hasta -50°C, y se mantuvo a -50°C durante 2 horas. Luego se redujo la presión de la cámara a 0.045 mbar, y el anaquel se llevó hasta -15°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 20 horas. Subsiguientemente, la presión de la cámara se redujo hasta 0.007 mbar, y el anaquel se llevó hasta 40°C a 0.15°C/minuto, y se mantuvo durante 10 horas adicionales. Después de la liofilización, se lograron liofilizados estables con todas las formulaciones secadas por congelación, y se obtuvo suficiente estructura de torta. Las muestras se almacenaron de 2°C a 8°C, a 25°C, y a 40°C durante hasta 25 semanas. Los resultados analíticos se mostraron parcialmente en la Figura 3. La estructura de torta de los liofilizados de todas las formulaciones basadas en trehalosa o en trehalosa/manitol, fue estable durante el almacenamiento, inclusive a temperaturas aceleradas. Esto se observó para todas las condiciones de almacenamiento y puntos del tiempo. La temperatura de transición de cristal de los liofilizados sin manitol estuvo típicamente en el intervalo de 60°C a 110°C, y no se alteró de una manera significativa durante el almacenamiento. La osmolaridad de las formulaciones estuvo en el intervalo de 300 a 350 [mOsm/kg], El contenido de humedad inicial de las formulaciones liofilizadas estuvo debajo del 1.0 por ciento. El contenido de humedad de los liofilizados almacenados a 2-8°C y a 25°C fue estable a través de todo el almacenamiento durante 25 semanas, con un incremento del contenido de agua de menos del 0.5 por ciento. Los liofilizados almacenados a 40°C condujeron a contenidos de humedad ligeramente incrementados; el contenido de agua después del almacenamiento estuvo típicamente debajo del 1.7 por ciento, comparándose con aproximadamente el 1 por ciento antes del almacenamiento. La suma de las cantidades de oligómeros de Nic-?ß y agregados de Nic-Q no aumentó en las formulaciones basadas en trehalosa o en trehalosa/manitol después del secado por congelación, como se analizó mediante las mediciones AF4. Después del almacenamiento, se observó un ligero aumento de menos del 3 por ciento en comparación con las formulaciones antes de la liofilización, como se analizó mediante AF4. La formulación basada en manitol mostró un claro incremento de la suma de las cantidades de oligómeros de Nic-Qp y agregados de Nic-?ß. Las mediciones de bloqueo de luz mostraron que la contaminación de partículas de los liofilizados reconstituidos después del almacenamiento fue típicamente debajo de 500 partículas > 10 mieras por mililitro a través de todas las formulaciones, condiciones de almacenamiento, y puntos del tiempo.

Las mediciones DLS mostraron que los liofilizados reconstituidos después del almacenamiento a partir de las cuatro formulaciones basadas en trehalosa o en trehalosa/manitol, tuvieron índices de polidispersidad (Pl) típicamente debajo de 0.2, y la proporción del pico principal de Nic-?ß fue típicamente mayor del 98.5por ciento, respectivamente, como se determinó utilizando el modelo de conversión de volumen. Esto se observó para todas las formulaciones, condiciones de almacenamiento, y puntos del tiempo. La formulación F54RL mostró un aumento del índice de polidispersidad de hasta 0.24 después de su almacenamiento durante 6 semanas a 40°C. Las mediciones de IEF, SE-HPLC (integridad de ARN), RP-HPLC (nicotina total), espectrometría (contenido de ARN), turbiedad, y LDS-Page, no mostraron cambios significativos en todas las formulaciones basadas en trehalosa y en trehalosa/manitol para todas las condiciones de almacenamiento y puntos del tiempo. La partícula tipo virus recombinantemente producido de ?ß típicamente contiene moléculas de ARN huésped, las cuales están en el espacio interno de las partículas tipo virus. El contenido de los derivados de nicotina libres fue para todas las formulaciones basadas en trehalosa y en trehalosa/manitol, para todas las condiciones de almacenamiento y puntos del tiempo, típicamente menor del 1.5 por ciento de nicotina acoplada total, como se determinó con las mediciones de RP-HPLC. La cantidad de derivados de nicotina libres aumentó hasta el 4.2 por ciento en la formulación F54RL después del almacenamiento a 40°C durante 6 semanas. Las mediciones de SE-HPLC (integridad de la partícula tipo virus) mostraron que el contenido relativo de ???-?ß fue mayor del 97 por ciento a través de todas las formulaciones basadas en trehalosa y en trehalosa/manitol, puntos del tiempo, y condiciones de almacenamiento. El contenido relativo de Nic-?ß se redujo hasta el 93 por ciento en la formulación F54RL después de su almacenamiento a 40°C durante 6 semanas. Las mediciones analíticas realizadas condujeron a la conclusión de que todas las formulaciones basadas en trehalosa y en trehalosa/manitol son capaces de estabilizar el Nic-Q durante la liofilización y en seguida del almacenamiento, inclusive a temperaturas aceleradas (40°C).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación liofilizada, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace comprende una funcionalidad de éster; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) cuando menos un disacárido no reductor, en donde la concentración del disacárido no reductor es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilizacion; (d) cuando menos un tensoactivo no iónico, en donde la concentración de este tensoactivo no iónico es del 0.0005 por ciento al 0.1 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilizacion; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 5.4 a 6.6 antes de la liofilización.

2. La formulación liofilizada de la reivindicación 1, en donde el disacárido no reductor mencionado es sacarosa o trehalosa.

3. La formulación liofilizada de la reivindicación 1 ó 2, en donde el disacárido no reductor mencionado es tre alosa.

4. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración del cuando menos un disacárido no reductor es del 3 por ciento al 12 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización, y en donde de preferencia la concentración del cuando menos un disacárido no reductor es del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización.

5. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición estabilizante mencionada comprende además un agente de volumen.

6. La formulación liofilizada de la reivindicación 5, en donde la concentración total del disacárido no reductor mencionado y el agente de volumen es del 0.5 por ciento al 15 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización, con la condición de que la concentración del disacárido no reductor es de cuando menos el 0.5 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización.

7. La formulación liofilizada de la reivindicación 5 ó 6, en donde el agente de volumen mencionado es manitol.

8. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración del tensoactivo no iónico mencionado es del 0.0025 por ciento al 0.01 por ciento (peso/volumen), de preferencia del 0.005 por ciento (peso/volumen), en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización.

9. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tensoactivo no iónico mencionado es polisorbato 20.

10. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la partícula tipo virus mencionada es una partícula tipo virus de un bacteriófago de ARN, y en donde de preferencia esta partícula tipo virus es una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß.

11. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de enlace mencionada consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus.

12. La formulación liofilizada de la reivindicación 11, en donde la secuencia de enlace mencionada se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina.

13. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición estabilizante mencionada comprende además un agente regulador seleccionado a partir de fosfato de sodio, fosfato de potasio, e histidina/HCI de histidina, y en donde de preferencia esta composición estabilizante comprende además un agente regulador que es histidina/HCI de histidina.

14. Una formulación liofilizada, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, Y en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y en donde la secuencia de enlace mencionada se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina; y (ii) una composición estabilizante, la cual comprende: (c) un disacárido no reductor, en donde este disacárido no reductor es trehalosa, y en donde la concentración de trehalosa es del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) un tensoactivo no iónico, en donde este tensoactivo no iónico es polisorbato 20, y en donde la concentración del polisorbato 20 es de 0.005 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 6.2 antes de la liofilización.

15. Una formulación liofilizada, la cual comprende: (i) cuando menos un conjugado de nicotina-partícula tipo virus, el cual comprende: (a) una partícula tipo virus del bacteriófago de ARN Q3; y (b) cuando menos una molécula de nicotina, en donde la cuando menos una molécula de nicotina se enlaza covalentemente a la partícula tipo virus mediante una secuencia de enlace, en donde esta secuencia de enlace consiste en A-CH2OCO(CH2)2CO-B, y en donde A representa la molécula de nicotina, y en donde B representa la partícula tipo virus del bacteriófago de ARN ?ß, y en donde la secuencia de enlace se enlaza covalentemente a la posición 3' de la molécula de nicotina; y (ii) una composición estabilizante, la cual consiste en: (c) un disacárido no reductor, en donde este disacárido no reductor es trehalosa, y en donde la concentración de trehalosa es del 10 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (d) un tensoactivo no iónico, en donde este tensoactivo no iónico es polisorbato 20, y en donde la concentración del polisorbato 20 es del 0.005 por ciento (peso/volumen) en términos de la concentración en la formulación antes de la liofilización; (e) un agente regulador, en donde este agente regulador es histidina/HCI de histidina, y en donde la concentración de la histidina/HCI de histidina es de 20 mM; y en donde la composición estabilizante tiene un valor de pH de 6.2 antes de la liofilización.

16. La formulación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde esta formulación liofilizada es estable a temperatura ambiente durante cuando menos 15 semanas, de preferencia durante cuando menos 25 semanas.