CN1695737A - 冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗及其制备方法属于生物制品技术领域。是在液体剂型HIV重组MVA病毒载体疫苗中加入由海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和肌醇等按比例配伍而成的保护剂，充分混匀，在真空冷冻干燥条件下制备成冻干剂型。本发明疫苗稳定性能好，费用低，容易进行生产和使用。产品在4～8℃保存两年后，仍能保持冻干后的外观，并克服了液体疫苗低温冻结保存及运输过程中严格冷链，有效期短的缺点。本发明还适用于其它利用重组MVA病毒作为表达载体的冷冻干燥剂型疫苗的制备，具有一定的社会经济效益和实施价值。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，特别涉及利用重组MVA病毒作为表达载体的冷冻干燥剂型疫苗的制备。
背景技术
艾滋病(HIV)被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病。95％以上的HIV感染者发生在发展中国家。迄今为止，宣传教育及对高危行为的干预仅起到减缓传播速度的作用，而无法终止其流行。高效抗病毒疗法对大多数感染者来说价格昂贵并且过于复杂，此外，还不能达到彻底清除体内病毒的目的。在这种情况下，只有艾滋病疫苗才能真正有效地预防和控制艾滋病。特别是需要接种到安全的、免疫原性强的、高效的艾滋病疫苗。
近年来，活载体疫苗的研究受到越来越多的重视。活载体疫苗是将编码病毒蛋白的基因插入活的病毒载体，通过病毒使外源基因在宿主细胞中表达，由此刺激机体产生更广的特异的免疫应答，这可能是最有希望用于预防人类AIDS的疫苗之一。其主要优点是能够诱导较强的细胞免疫反应。
人们日趋一致认为：有效的HIV疫苗不是单一疫苗模式，多种不同疫苗混合应用有可能达到任何单一形式的疫苗难以达到的理想效果。许多研究者提出Prime-Boost策略，既用一种疫苗初始免疫，再用另一种疫苗加强免疫。通常是DNA疫苗和活载体疫苗或蛋白类疫苗联合应用类似艾滋病治疗中的联合用药。因此，研制出单一使用及能与VLPs疫苗或DNA疫苗联合使用的HIV活载体疫苗应是HIV疫苗研究的重要领域。常用来作载体的病毒有，委内瑞拉马脑炎病毒、痘苗病毒、金丝雀痘病毒、脊髓灰质炎病毒及腺病毒等。最有希望的结果是以痘病毒作为载体的疫苗。
修饰的痘病毒安卡拉(Ankara)株(即Modified Vaccinia Virus Ankara，缩写为MVA)为人体内复制缺陷型痘病毒，是线性双链DNA病毒。德国教授Anton Mayr领导的研究小组将从Ankara地区分离得到的痘病毒CVA株，在鸡胚成纤维细胞中传代致弱。当传到516代时，这株致弱毒株被命名为MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA免疫原性好，同时在近600次的传代过程中，MVA丢失了9％的基因组DNA，MVA对细胞的毒性也极大地降低。MVA的繁殖对细胞基质具有极大的依赖性，它只能在鸡胚成纤维细胞(CEF)和BHK细胞中有效复制，而不能在人类等哺乳细胞中繁殖。所以MVA虽然在人体内能感染人体细胞，表达出MVA病毒蛋白及其携带的外源基因蛋白，但是却不能形成完整病毒颗粒。这一特点为MVA成为安全，高效的表达载体奠定了良好的基础。
因此，MVA作为病毒载体，具备许多优点。如：(1)外源基因容量大，MVA不但能够表达大的外源基因，而且能够同时容纳，表达多个外源基因，从而可以同时刺激产生针对多种抗原的免疫反应或表达免疫辅助因子，诱导产生高效保护反应；(2)表达水平高；(3)感染多种细胞，使抗原有效地提呈到不同的组织；(4)同时MVA还具有独特的安全性。
因而MVA成为目前最广泛用于人类疫苗和基因治疗研究的病毒载体之一。以MVA为载体构建重组疫苗，表达重要的基因产物，均是目前医学、生物学、兽医学等研究的热门课题。
但是，MVA病毒对反复冻融敏感，容易失活。目前的MVA载体疫苗为液体剂型，在使用过程中的关键问题是由于热稳定性较差，从生产场地到使用现场均要求疫苗严格的冷链，于-20℃以下冷冻贮藏和运输，并要避免反复冻融。如果保存和运输不能严格冷链，致使疫苗的病毒滴度下降，影响接种效果，还会增加生产及使用部门的费用，给疫苗的大规模推广应用及保证疫苗的接种效果带来困难。
生物技术药物的基本剂型是冻干剂型。冻干活疫苗由于能较好地克服液体疫苗稳定性较差的问题，应用前景会更为广阔。迄今为止，国内外尚未有能够大规模应用于人体的冻干剂型的艾滋病(HIV)重组MVA病毒载体疫苗。以MVA作为表达载体的其它形式的重组病毒载体疫苗也未见有冻干制剂的报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种安全、高效、稳定性好、有效期长的艾滋病重组MVA病毒载体疫苗新剂型——即含有冷冻干燥保护剂的冻干剂型的HIV重组MVA病毒载体疫苗的制备方法。
本发明的冷冻干燥HIV重组MVA病毒载体疫苗(简称HIV-MVA疫苗)，包括HIV重组MVA病毒和保护剂及其平衡盐溶液。
冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗，其中保护剂的成分及它们在组合物悬液中的终浓度(W/V)是海藻糖2～4％、甘露醇1～3％、右旋糖苷2％、肌醇0.5～1％。
右旋糖苷可以是高，中，低分子的右旋糖苷，如右旋糖苷70，40，20；优选低分子的右旋糖苷20。
海藻糖、甘露醇、右旋糖苷均优选医用规格制品。
冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗，其中所用的平衡盐溶液使用磷酸盐溶液(PB)或磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)，PH值为7.0～7.7。优选可耐高温灭菌的磷酸盐溶液。
冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗的制备方法，有混料和真空冷冻干燥两个过程；所说的混料过程是，在平衡盐溶液中加入保护剂，按每100ml平衡盐溶液加入5～10g保护剂的比例溶解后过滤，再按每0.1ml溶液中含107～1010病毒量的比例加入艾滋病重组痘病毒安卡拉株病毒的浓缩液，得到疫苗液灌装，保护剂组成按质量比为海藻糖∶甘露醇∶右旋糖苷∶肌醇＝2～4∶1～3∶2∶0.5～1；所说的冷冻干燥过程是，将疫苗液于-35℃～-40℃低温条件下，预冷冻3～4小时，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度为9～12Pa下，干燥10～12小时，待制品完全成型后，使搁板温度逐渐升至28℃，真空度为9～12Pa下再干燥4～5小时。
所得到的冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗产品，外观良好，呈白色疏松体，残余水分小于或等于3％(g/g)，活的HIV重组MVA病毒的滴度不低于7LgPFU/ml。
本发明的冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗的制备方法还适用于其它利用MVA作为表达载体的冷冻干燥剂型疫苗的制备。例如，2002年就已进入II期临床试验的肿瘤疫苗MVA-Mucl-Il2、狂犬病毒基因重组MVA疫苗、乙型肝炎病毒基因HBsAg重组MVA疫苗等。
本发明的重组MVA病毒在冻干状态下得到更好的保护，疫苗稳定性能好，费用低，容易进行生产和使用。4～8℃有效期为18个月以上，在4～8℃保存两年后，仍能保持冻干后的外观；克服了液体疫苗低温冻结保存及运输过程中严格冷链，有效期短的缺点。本发明的方法还适用于其它利用重组MVA病毒作为表达载体的冷冻干燥剂型疫苗的制备，具有一定的社会经济效益和实施价值。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明。
实施例1：
冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗的制备方法是：在100毫升PH值在7.0～7.7的磷酸盐溶液(PB)中，加入海藻糖3克，甘露醇2克，右旋糖苷2克，肌醇0.8克。充分溶解后，用孔径0.22um滤膜过滤除菌，再将HIV重组MVA病毒浓缩液按每人份接种病毒量108比例加入到上述含有冷冻干燥剂的溶液中进行灌装，每支安瓶分装0.1毫升后，开始进行真空冷冻干燥。将疫苗液于-35℃低温条件下，预冷冻3.5小时，然后在搁板温度-31℃，真空度为10Pa下，第一阶段干燥10～12小时。待制品完全成型后，使搁板温度逐渐升至28℃，真空度为10Pa下再二次干燥4.5小时。干燥结束即制成冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗。
右旋糖苷优选低分子的右旋糖苷20。
实施例2：
将实施例1中的磷酸盐溶液(PB)用PH值在7.0～7.7的磷酸盐生理氯化钠溶液替代，效果与实施例1相同。
将实施例1中的预冷冻温度改为-40℃；或将真空度改为12Pa，所得产品与实施例1相同。
将实施例1中的保护剂中海藻糖和甘露醇的用量在100毫升的磷酸盐溶液(PB)中多或少使用1g，不影响制成冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗的效果。
实施例3：
将含有疫苗冻干保护剂的HIV-MVA疫苗，按每人份分装量0.1ml，内含病毒量6.0LgPFU～7.0LgPFU，一部分于4℃保存，用来检测疫苗冻干前的感染性滴度；另一部分疫苗用来进行冷冻干燥。四个不同批号的含有疫苗冻干保护剂的HIV-MVA疫苗经冷冻干燥后，再检测疫苗的感染性滴度，与冻干前的感染性滴度相比较。
表1 疫苗冻干前后的滴度比较
| LgPFU/ml | |||
| 冻干前 | 冻干后 | 前后差 | |
| 020A1 | 8.08 | 8.01 | 0.07 |
| 020A2 | 7.18 | 7.09 | 0.09 |
| 020A3 | 8.22 | 8.05 | 0.17 |
| 020A4 | 8.56 | 8.41 | 0.15 |
感染性滴度检测表明：冻干后感染性滴度比冻干前平均下降值仅在0.12个LgPFU/ml左右。
实施例4
同一批号的，冻干的HIV-MVA疫苗和未经冻干的液体对照苗，存放在同一4℃～8℃冰箱内，定期随机取样检测疫苗的感染性滴度。
表2 HIV-MVA疫苗4℃～8℃保存感染性滴度测定
| 疫苗LgPFU/ml | |||||||
| 0月 | 2月 | 6月 | 10月 | 13月 | 17月 | 21月 | |
| 液体苗 | 8.08 | 6.78 | 5.01 | 4.02 | ND | ND | ND |
| 冻干苗 | 8.01 | 7.82 | 7.70 | 7.65 | 7.61 | 7.50 | 7.39 |
结果说明，冷冻干燥剂型HIV-MVA疫苗具有良好的稳定性，在4℃条件下存放17个月，疫苗感染性滴度下降约0.5LgPFU/ml。而未经冷冻干燥的液体对照苗存放2个月后感染性滴度就明显下降，下降值约达到1.3LgPFU/ml。
实施例5
表3 HIV-MVA疫苗37℃加速稳定性试验结果
| 疫苗LgPFU/ml | |||||
| 0天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 | |
| 冻干苗 | 8.01 | 7.67(0.34) | 7.43(0.58) | 7.0(1.01) | 6.77(1.24) |
| 8.41 | 8.03(0.38) | 7.76(0.65) | 7.29(1.12) | 6.99(1.42) | |
| 液体苗 | 7.59 | 6.69(0.90) | 5.21(2.38) | 4.36(3.23) | ND |
37℃放置7天后，冻干苗滴度下降平均不超过0.5LgPFU/ml；而无保护剂的对照液体疫苗，放置一周后滴度下降接近一个LgPFU/ml；
37℃放置21天后，冻干苗滴度总下降值平均不超过一个LgPFU/ml。
而液体疫苗的感染性滴度总下降值在3.5个LgPFU/ml左右。
Claims (3)
1、一种冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗，组成有艾滋病重组痘病毒安卡拉株病毒，其特征是，组成还有保护剂和平衡盐溶液；所说的保护剂及它们在组合物悬液中的终浓度是海藻糖2～4％(W/V)和甘露醇1～3％(W/V)和右旋糖苷2％(W/V)和肌醇0.5～1％(W/V)；所说的平衡盐溶液是磷酸盐溶液或磷酸盐生理氯化钠溶液，PH值为7.0～7.7。
2、按照权利要求1所述的冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗，其特征是，外观呈白色疏松体，残余水分小于或等于3％(g/g)。
3、一种冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗的制备方法，冻干剂型艾滋病重组痘病毒安卡拉株载体疫苗的组成有艾滋病重组痘病毒安卡拉株病毒和保护剂和平衡盐溶液；所说的保护剂是海藻糖和甘露醇和右旋糖苷和肌醇；所说的平衡盐溶液是磷酸盐溶液或磷酸盐生理氯化钠溶液；制备有混料和真空冷冻干燥两个过程；所说的混料过程是，在平衡盐溶液中加入保护剂，按每100ml平衡盐溶液加入5～10g保护剂的比例溶解后过滤，保护剂组成按质量比为海藻糖∶甘露醇∶右旋糖苷∶肌醇＝2～4∶1～3∶2∶0.5～1，再按每0.1ml溶液中含107～1010病毒量的比例加入艾滋病重组痘病毒安卡拉株病毒的浓缩液，得到疫苗液灌装；所说的冷冻干燥过程是，将疫苗液于-35℃～-40℃低温条件下，预冷冻3～4小时，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度为9～12Pa下，干燥10～12小时，待制品完全成型后，使搁板温度逐渐升至28℃，真空度为9～12Pa下再干燥4～5小时。
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