PL213166B1 - Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagów - Google Patents
Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagówInfo
- Publication number
- PL213166B1 PL213166B1 PL386381A PL38638108A PL213166B1 PL 213166 B1 PL213166 B1 PL 213166B1 PL 386381 A PL386381 A PL 386381A PL 38638108 A PL38638108 A PL 38638108A PL 213166 B1 PL213166 B1 PL 213166B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phage
- purified
- preparation
- extract
- bacteriophage
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 20
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 title claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 16
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 6
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 2
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241001655328 Bifidobacteriales Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N N-methylacetamide Chemical compound CNC(C)=O OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000221300 Puccinia Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N bromo cyanate Chemical compound BrOC#N RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy oczyszczonych i zliofilizowanych preparatów bakteriofagowych o podwyższonej trwałości i aktywności przeciwbakteryjnej.
Stale obserwowany wzrost liczby patogennych bakterii opornych na obecnie stosowane antybiotyki wymusza konieczność poszukiwania alternatywnych środków antybakteryjnych [1]. Uważa się, że bakteriofagi, ze względu na sposób funkcjonowania są potencjalnie idealnym kandydatem na nowoczesne, skuteczne czynniki bakteriobójcze. Wzrost zainteresowania terapią bakteriofagami lub białkami izolowanymi z fagów jest związany z wykazaną w kilku ośrodkach ich skutecznością w zwalczaniu zakażeń nie dających się leczyć antybiotykami [2,3]. Bakteriofagi mają szereg zalet w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków, głównie swoistość pozwalającą niszczyć bakterie patogenne bez zabijania bakterii symbiotycznych, przez co nie narusza się subtelnej równowagi mikrobiologicznej organizmu [2,4-7]. Stężenie bakteriofagów w płynach chorego organizmu nie maleje od momentu podania, lecz podlega samoregulacji, liczba fagów rośnie ekspotencjalnie w obecności bakterii i szybko spada w przypadku ich braku. Nie zanotowano jak dotąd znaczących skutków ubocznych terapii fagami, które można stosować u pacjentów uczulonych na antybiotyki. Właściwie dobrane i wyselekcjonowane fagi mogą być zastosowane w profilaktyce antybakteryjnej w tym również do sanizacji, np. pomieszczeń szpitalnych. Znacznie rzadziej obserwuje się selekcję opornych bakterii, co często ma miejsce w przypadku antybiotyków; ponadto w przypadku wystąpienia oporności na danego faga u danej bakterii można dobrać innego faga zdolnego infekować oporną bakterię. Wreszcie mogą być stosowane równolegle z antybiotykami w terapii kombinowanej. Wprowadzenie terapii fagami do powszechnego zastosowania w lecznictwie wymaga opracowania metod szybkiego, skutecznego typowania odpowiednich fagów, monitorowania przebiegu namnażania fagów i penetracji przez nie ludzkiego organizmu, uwalniania przez niszczone bakterie toksyn mogących powodować wstrząs septyczny, usuwania fagów z organizmu [8,9], wreszcie przygotowania stabilnych wysokowydajnych preparatów terapeutycznych. W uprzednim zgłoszeniu patentowym opracowaliśmy procedury wydajnej hodowli bakteriofagów i ich dokładnego oczyszczania, co pozwoliło uzyskiwać duże ilości czystych fagów o wysokim mianie aktywności, bez zanieczyszczeń endotoksynami i innymi składnikami bakteryjnymi, uniemożliwiających szereg aplikacji [10]. Dalsze nasze badania doprowadziły do oryginalnych obserwacji będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia, które dotyczą otrzymywania farmakologicznej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów bakteriofagowych.
Dotąd preparaty bakteriofagowe w formie lizatów lub oczyszczanych fagów przygotowywano i przechowywano w postaci płynnej. Taka postać farmakologiczna, chociaż względnie trwała dla lizatów, w przypadku oczyszczonych preparatów powoduje szybki spadek aktywności bakteriolitycznej. Wadą postaci płynnej preparatów fagowych jest to, że nie są one dogodnym w przechowywaniu i stosowaniu środkiem farmaceutycznym, oczyszczone fagi nadające się do celów terapeutycznych są nietrwałe, technologie ampułkowania płynów są kosztowne i skomplikowane, produkt wymaga dużo przestrzeni chłodniczej. Najdogodniejszą postacią leku jest produkt w formie stałej, na przykład proszku, tabletki, granulatu lub liofilizatu. Taki produkt odwodniony cechuje się prostotą produkcji i jest tańszy, łatwiejszy w przechowywaniu i stosowaniu. Wymagana jest ponadto stabilność i wysoka aktywność preparatu. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy oczyszczonych i zliofilizowanych preparatów bakteriofagowych o podwyższonej trwałości i aktywności przeciwbakteryjnej, znamienny tym, że otrzymany wpierw z bakteryjnego Iizatu fagowego na przykład sposobem ultrafiltracji z detergentem na membranach uItrafiItracyjnych, zawierający wysokocząsteczkowy preparat oczyszczonego faga, stabilizuje się najkorzystniej ekstraktem probiotyku w obecności lub nieobecności soli obojętnych lub/oraz rozpuszczalników organicznych, liofilizuje się, charakteryzuje metodą chromatografii HPLC, w elektroforezie w obecności siarczanu dodecylu, w testach biologicznych Iizy bakteryjnej, przechowuje się pod próżnią i aktywny przeznacza do terapii fagowej zakażeń i nowotworów.
Niniejszy wynalazek rozwiązuje szereg powyższych problemów i polega w pierwszej części na liofilizacji oczyszczonych fagów w obecności czynnika stabilizującego, np. trehalozy, najkorzystniej zmodyfikowanego ekstraktu probiotyku. Liofilizacja jest popularną metodą przechowywania na przykład drobnoustrojów, dzięki której możliwe jest utrzymanie ich długoterminowej żywotności [11]. Na efektywność procesu liofilizacji mikroorganizmów wpływają takie czynniki jak szczep mikroorganizmu, kształt komórek, szybkość i faza wzrostu, temperatura inkubacji, skład pożywki, pH, zawartość wody
PL 213 166 B1 i tłuszczów w komórce oraz jej skład, szybkość ochładzania i ogrzewania, temperatura i okres przechowywania [12]. Skład medium, w którym zawiesza się mikroorganizmy przed zamrożeniem, jest tutaj bardzo ważny, gdyż dodatek odpowiednich substancji zapewnia przeżywalność mikroorganizmów po liofilizacji. Początkowo stosowano glicerol i dimetylosulfotlenek do ochrony komórek mikroorganizmów przed zniszczeniem, które może nastąpić podczas zamrażania [13,14], Znane są substancje ochronne które mogą być nisko- i wysoko-cząsteczkowe [15], szybko wnikające do komórki (w przeciągu 30 minut od wprowadzenia), jak metanol, etanol, glikol etylenowy, glikol propylenowy, dimetyloformamid, metylacetamid i dimetylosulfotlenek, wolniej penetrujące, jak glikol, lub nie penetrujące, jak glukoza, trehaloza, dekstran, skrobia hydroksyetylowa, mannitol, sorbitol, albumina, żelatyna, inne białka, glikol polietylenowy, tlenek polietylenowy lub alkohol poliwinylowy. Sorbitol, jako środek stabilizujący i ochronny, używany jest w mikrobiologii w stężeniach 1-36% (najczęściej 9%). W zależności od mikroorganizmów wobec których stosowano sorbitol, obserwowano różnorodną efektywność jego działania. Traktowanie organizmów 5% mannitolem daje lepsze efekty ochronne aniżeli traktowanie ich sorbitolem. Glukoza używana jest w stężeniach 1 - 18% (najczęściej 4%). Już wcześnie opisywano większą przeżywalność różnych gatunków bakterii w -20°C z użyciem glukozy. Okazała się ona efektywna dla bakteriofaga T4, (wraz z sacharozą), Enterobacter aerogenes, drożdży, spor Puccinia. Wady większości powyższych stabilizatorów polegają na tym, że są to bądź ciecze, albo substancje toksyczne (np. metanol), immunogenne (np. albumina, żelatyna), lub środki syntetyczne zazwyczaj kosztowne w produkcji lub otrzymywaniu, bądź też reaktywne (np. glukoza). Trehaloza jednakże jest naturalnym środkiem ochronnym, występuje w roślinach i komórkach drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae i jako jedyny disacharyd posiada dwie cząsteczki wody w swoich kryształach, jest obojętna chemicznie. Używa się jej w stężeniach 5 - 19% (średnio 10%) jako środek ochronny dla różnych wirusów, Lactobacillus bulgaricus i innych drobnoustrojów [12]. Preparaty fagowe można przechowywać w formie zliofilizowanej, jednak ze względu na utratę aktywności w trakcie procesu liofilizacji, wskazane jest stosowanie czynników, które posiadają właściwości stabilizujące. Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu stabilizowania liofilizowanych fagów ekstraktem otrzymanym z probiotyków i modyfikowanym. Otrzymano wpierw oczyszczone preparaty fagowe według znanych metod, jak z użyciem detergentu i membran ultrafiltracyjnych [10] lub na kolumnie z immobilizowaną polilizyną [16], w przypadku kiedy detergent inaktywuje bakteriofaga. W przeprowadzonych doświadczeniach dla określenia warunków stabilizacji faga podczas procesu liofilizacji wykazano, że spośród użytych czynników stabilizujących, między innymi trehalozy, glukozy, czy sorbitolu i ekstraktu probiotyku, najlepsze wyniki uzyskano dla trehalozy i ekstraktu probiotyku, którego dodatek wpływał najkorzystniej na aktywność oczyszczonego faga po liofilizacji. Sposób według wynalazku jest pozbawiony wad dotychczas znanych metod przechowywania fagów w postaci lizatów. Przechowywanie bakteriofaga T4, Im11 lub K1 przez dwa miesiące, w formie zliofilizowanej z trehalozą lub ekstraktem probiotyku w różnych stężeniach, gwarantuje utrzymanie jego aktywności. Po półrocznym przechowywaniu fagów w stanie zliofilizowanym aktywność zmniejszyła się tylko z 8,0 x 107 pfu/ml do miana faga 4,0 x 106 pfu/ml. Aktywność ta nie obniżała się i została zachowana w stanie niezmienionym, gdy Iiofilizat przechowywano w ampułkach pod próżnią. Aktywność faga była najwyższa przy zawartości 2 - 4% trehalozy lub ekstraktu i zmniejszała się w wyższych stężeniach trehalozy, ekstraktu lub innych stabilizatorów, co świadczy o tym, że 2% stężenie stabilizatora jest optymalną jego zawartością. Niższe miano uzyskano w obecności 1% glukozy. Najniższe miano faga otrzymano przy użyciu sorbitolu. Chociaż wszystkie cztery odczynniki stabilizowały faga utrzymując jego aktywność, jednak największą uzyskano przy zastosowaniu 2 - 4% trehalozy lub ekstraktu. Nowość niniejszego wynalazku polega na liofilizacji i przechowywaniu pod próżnią fagów oczyszczonych w obecności ekstraktu probiotyku jako stabilizatora, co stanowi znaczące ulepszenie w stosunku do wcześniej opatentowanych sposobów przechowywania preparatów fagowych. Sposób otrzymywania formy farmakologicznej jest prosty, wymaga jednego etapu, mianowicie do roztworu oczyszczonych cząstek fagowych dodaje się zmodyfikowanego ekstraktu probiotyku, najkorzystniej z Bifidobacterium, do stężenia 2%, zamraża i przeprowadza liofilizację z ampułkowaniem pod próżnią. Wynalazek dotyczy nowej formy farmakologicznej faga, innej niż dotychczas opatentowano.
Większość opatentowanych rozwiązań dotyczy fagów przechowywanych w postaci lizatów komórkowych, które są stabilne w formie ciekłej lub odwodnionych liofilizatów i nie wymagają dodatkowych stabilizatorów. Lizat stanowi naturalny stabilizator dla faga nawet podczas liofilizacji. Konieczność stabilizowania, ochrony aktywności faga, pojawia się po jego oczyszczeniu z lizatu, kiedy następuje drastyczny spadek aktywności. Nieoczywistość niniejszego rozwiązania polega na tym, że nie
PL 213 166 B1 dotyczy lizatów lecz ogranicza się do fagów oczyszczonych, gdyż każda ich forma ciekła i stała wymagają zasadniczo czynnika stabilizującego. Drugi aspekt tego rozwiązania dotyczy liofilizacji pod próżnią z równoczesnym ampułkowaniem. Ampułkowanie próżniowe liofilizatów stosuje się do długotrwałego przechowywania bakterii i korzystne jest zastosowanie tego sposobu do wieloletniego przechowywania w obecności stabilizatora aktywnych fagów oczyszczonych. Liofilizacja próżniowa w ampułkach jest jednoetapowa, prosta, tania, wydajna i łatwa technologicznie. Trzecim elementen niniejszego rozwiązania jest zastosowanie ekstraktu probiotycznego jako stabilizatora. Prosty sposób jego przygotowania polega na tym, że z ekstraktu etanolowego masy komórkowej bifidobakterii zadanej amoniakiem dla usunięcia kwasów tłuszczowych, wykorzystuje się po odparowaniu, wysuszoną fazę wodną jako stabilizatora fagów. Szczepy bifidobakterii są znanymi probiotykami używanymi w przemyśle spożywczym, hodowanymi na podłożu kukurydzianym lub proponowanym uprzednio (17), zaś metoda przygotowania wyciągu jest prosta technologicznie, ekonomiczna, produkt nietoksyczny, pochodzący z surowców spożywczych.
Niniejszy wynalazek oparto na wynikach badań trzech fagów swoistych dla E. coli, laboratoryjnego faga K1 dogodnego do eksperymentów, co ułatwiło opracowanie metod i testów, faga Im11 często typowanego w prowadzonej terapii eksperymentalnej oraz faga wieloważnego T4, zdolnego zakażać szerokie spektrum szczepów E. coli. Bakterie te są częstą przyczyną wielu schorzeń. Nowość niniejszego wynalazku, poza użyciem niezwykle istotnych, nowoczesnych metod analizy czystości preparatów, które przeprowadzano metodami chromatograficznymi, w elektroforezie SDS-PAGE, testami na zawartość endotoksyn i składników ściany bakteryjnej, jak testem LAL i metodami analiz chemicznych przy pomocy systemu GLC-MS (metoda Kdo), dotyczy stabilizacji ekstraktem probiotycznym oczyszczonego faga w formie Iiofilizatu i przechowywania pod próżnią. Dotychczas nie dysponowano wystarczająco czułymi i specyficznymi metodami analizy czystości fagów.
Cała cząstka fagowa otrzymywana, oczyszczana i analizowana sposobem według wynalazku stanowi pełny zestaw antygenowy i może być niezbędna do szeregu aplikacji, w biotechnologii i medycynie. Podkreślić należy korzystne wprowadzenie liofilizowanego preparatu terapeutycznego na skalę komercyjną, jako wymagającego mniejszych nakładów finansowych i łatwiejsze dla przemysłu farmaceutycznego. Stabilne liofilizowane preparaty fagowe otrzymane według tego wynalazku przeznaczone są do kontrolowanej terapii fagowej zakażeń i nowotworów oraz do wytwarzania fagopochodnych preparatów farmaceutycznych. Uzyskiwanie nowych, przydatnych terapeutycznie szczepów fagowych, a także przygotowanie preparatów leczniczych jest wielokrotnie tańsze niż poszukiwanie nowych antybiotyków oraz terapia nimi. Rozwiązania proponowane w niniejszym wynalazku są proste, nie wymagają kosztownych odczynników, oparte są na trzech różnych preparatach, dlatego mają zastosowanie dla szerszego zakresu fagów.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie preparatu stabilizującego
Komórki Bifidobacterium adolescentis (PCM 2555) hodowano metodą wgłębną na wzbogaconej glukozą półpłynnej pożywce kukurydzianej w temperaturze 37°C przez 48 godzin bez wytrząsania w warunkach mikroaerofilnych. Odwirowaną zliofilizowaną masę bakteryjną ekstrahowano 80% roztworem wodnym etanolu i po usunięciu pozostałości komórkowych przez wirowanie (3000 obr/min, 30 min., 4°C) ekstrakt suszono dla usunięcia rozpuszczalnika. Do pozostałości dodano wodny roztwór amoniaku do końcowego stężenia 12% i po 24 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej odwirowano celem usunięcia materiału nierozpuszczalnego (10000 obr./min, 30 min, 4°C), natomiast warstwę wodną odparowano na wyparce i zliofilizowano produkt docelowy.
P r z y k ł a d 2
Liofilizacja bakteriofaga K1 w obecności różnych substancji stabilizujących
Preparat fagowy oczyszczony dializowano do buforu PBS z jonami Ca2+ i Mg2+, w temperaturze 4°C, na mieszadle magnetycznym, przez noc. Do wyprażonych sterylnych pakardówek i ampułek wprowadzono sterylnie po 0,5 - 1 ml dializowanego do PBS preparatu fagowego, a następnie dodano takie ilości czynnika stabilizującego trehalozy, glukozy, sorbitolu lub ekstraktu probiotyku, aby końcowe stężenie wynosiło 0.1%, 1%, 2%, 4%, 10%, 20%. Wszystkie roztwory zamrożono w -70°C i zliofilizowano. Preparaty w ampułkach zliofilizowano i przechowywano zatopione pod próżnią. W takiej formie przechowywano preparaty przez kilka miesięcy w temp. 4°C, a następnie próbki rozpuszczano w 1 ml wody milli Q i miano fagów oznaczono metodą RTD. Kontrolą była zliofilizowana próbka dializowanego preparatu fagowego bez dodatku czynników stabilizujących - w tej próbce fag nie wykazyPL 213 166 B1 wał aktywności. Doświadczenie pozwoliło na wykazanie, iż trehaloza i ekstrakt probiotyku, w stężeniach 2 - 4%, najlepiej stabilizują faga podczas liofilizacji.
P r z y k ł a d 3
Oczyszczanie faga z Iizatu metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie z immobilizowaną polilizyną
Przygotowano kolumnę powinowactwa ze związaną polilizyną. Żel agarozowy np. Sepharose 4B (Pharmacia) (10 - 20 ml) aktywowano za pomocą BrCN (FIuka) według standardowej procedury korzystnie przez około 30 minut przy stałym pH=11 w temperaturze pokojowej. Następnie nadmiar bromocjanu odpłukano wodą oraz 0,1 M NaHCO3 o pH 8,2. Do 10 ml zaktywowanego żelu dodano 30 mg polilizyny (Sigma) w 5 ml 0,1 M NaHCO3 o pH 8,2 i mieszano żel przez 2 godziny na mieszadle rotacyjnym. Następnie do żelu dodano roztwór 1 M etanolaminy (POCh) w ilości odpowiadającej objętości żelu i dodanego roztworu preparatu i mieszano dalej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie w 4°C przez noc. Następnego dnia żel wypłukano wodą i pozostawiono na 30 minut w 2 M K2HPO4, a następnie płukano wodą. Na koniec żelem zawieszonym w PBS bez jonów Mg2+, Ca2+ upakowano szklaną kolumienkę (1x10 cm).
Lizat bakteriofagowy (20 ml) podawano na kolumnę powinowactwa ze związaną polilizyną. Po naniesieniu materiału, kolumnę płukano przy pomocy PBS bez jonów Mg2+, Ca2+. Zbierane 2 ml frakcje sprawdzano na zawartość białka mierząc absorpcję przy 280 nm. Po odpłukaniu niezwiązanego z żelem materiału, eluowano bakteriofaga za pomocą 1 M NaCI w PBS bez jonów Mg2+, Ca2+ a następnie drugą frakcję za pomocą 3 M KCNS (Reachim) w PBS bez jonów Mg2+, Ca2+. Na koniec kolumnę intensywnie płukano PBS bez jonów Mg2+, Ca2+. Materiał związany do żelu przed zagęszczeniem dializowano kilkakrotnie zmieniając PBS.
Piśmiennictwo:
1. Biswas B., Adhya S., Washart P., Brain P.,Trostel A.N., Powell B., Carlton R., and Merril
C.R. (2002): Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from clinical isolate of vancomycineresistant Enterococcus faecium. Infect. Immun., 204-210.
2. Kucharewicz-Krukowska A., Ślopek S. (1987): Immunogenic effect of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35: 553-561.
3. Sulakvelidze A., Morris J.G. (2001): Bacteriophages as therapeutic agents. Ann Med. 33(8):507-509.
4. Zaremba M. L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska, Warszawa (1997) Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
5. Ross F. C.: Introductory Microbiology, (1983), Merril C. E Publishing Co., A. Bell and Howell Company.
6. Loeffler J.M., Nelson D., Fischetti V.A. (2001): Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294 (5549):2170-2172.
7. Carlton R. M. (1999): Phage therapy: past history and future prospects. Arch. Immunol. Ther. Exp., 47, 267-274.
8. Merril CR., Biswas B., Carlton R., Jensen NC., Creed GJ., Zullo S. and Adhya S. (1996): Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93:3188-3192.
9. Górski A., Weber-Dabrowska B., The potential role of endogenous bacteriophages in controlling invading pathogens, Cellular Molec. Life Sci., 62, 2005, 511-519.
10. Lipiński T., Gamian A., Zuziak E., Korzeniowska-Kowal A., Górski A. Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowania, Zgł. Pat. 381730 z 10.02.2007.
11. Miyamoto-Shinohara Y., Imaizumi T., Sukenobe J., Murakami Y., Kawamura S., Komatu Y. (2000) Survival rate of microbes after freeze-drying and long-term storage. Cryobiology 41, 251-255.
12. Hubalek Z. (2003) Protectants used in the cryopresarvation of microorganisms. Cryobiology 46, 205-229.
13. Lovelock J.E., Bishop M.W.H.(1959) Prevention of freezing damage to living cells by dimetylsulphoxide. Nature 183, 1394-1395.
14. Polge C., Smith A.U., Parkes A.S. (1949) Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 164, 666.
15. Nash T. (1966) Chemical constitution and physical properties of compounds able to protect living cells against damage due to freezing and thawing. Cryobiology, 179-211
16. Sundberg L., Hoglund S., Purification of T4 phage by adsorption on polylysine agarose, FEBS Letters, 37, (1), 1973, 70-73.
PL 213 166 B1
17. Szponar B., Pawlik J.K., Gamian A., Szwajcer-Dey E., Zastosowanie frakcji białkowej z młóta browarnianego oraz podłoże mikrobiologiczne, Zgł. Pat. Nr P-357694 z dn. 11.12.2002 r.
Claims (6)
1. Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy oczyszczonych i zliofilizowanych preparatów bakteriofagowych o podwyższonej trwałości i aktywności przeciwbakteryjnej, znamienny tym, że otrzymany z bakteryjnego Iizatu fagowego wysokocząsteczkowy preparat zawierający oczyszczonego faga, stabilizuje się przez dodanie preparatu stabilizującego, korzystnie 2 - 4% ekstraktu probiotyku, i w obecności lub nieobecności soli obojętnych i/lub rozpuszczalników organicznych preparat poddaje się liofilizacji w warunkach sterylnych.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat stabilizujący zawiera trehalozę.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że procedurę oczyszczania faga z Iizatu prowadzi się w procesie ciągłym w aparacie Pelicon wyposażonym w system selektywnie przepuszczalnych membran uItrafiItracyjnych, z użyciem lizozymu, chelatora i detergentu, lub kolumny powinowactwa z immobilizowaną polilizyną w przypadku gdy fag ulega inaktywacji detergentem.
4. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że w celu otrzymania preparatu stabilizującego bakteriofaga z masy komórkowej probiotycznego szczepu korzystnie bifidobakterii, otrzymuje się wyciąg np. etanolowy i wysuszony zadaje się roztworem amoniaku aby wykorzystać warstwę wodną po odparowaniu jako stabilizatora fagów.
5. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że stabilną formę oczyszczonych aktywnych preparatów bakteriofagowych tabletkuje się lub przygotowuje w innej dogodnej formie preparatu farmaceutycznego, korzystnie ampułkowanego Iiofilizatu próżniowego, który jest stabilny i aktywny w około 4°C przez okres przynajmniej 6 miesięcy.
6. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że aktywność preparatów bakteriofagowych oznacza się kompleksowo w testach biologicznych Iizy bakteryjnej oraz metodą chromatografii HPLC, w elektroforezie w obecności siarczanu dodecylu, i aktywny przeznacza do terapii fagowej zakażeń i nowotworów oraz do wytwarzania diagnostycznego preparatu immunologicznego.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386381A PL213166B1 (pl) | 2008-10-29 | 2008-10-29 | Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagów |
| ES09775370.1T ES2619521T3 (es) | 2008-10-29 | 2009-10-29 | Un método para producir una forma farmacológicamente estable de preparaciones activas liofilizadas de bacteriófagos purificados |
| PCT/PL2009/050032 WO2010050833A2 (en) | 2008-10-29 | 2009-10-29 | A method of producing a pharmacologically stable form of lyophilised, active preparations of purified bacteriophages |
| US13/059,815 US9238798B2 (en) | 2008-10-29 | 2009-10-29 | Method of producing a pharmacologically stable form of lyophilised, active preparations of purified bacteriophages |
| EP09775370.1A EP2340304B1 (en) | 2008-10-29 | 2009-10-29 | A method of producing a pharmacologically stable form of lyophilised, active preparations of purified bacteriophages |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386381A PL213166B1 (pl) | 2008-10-29 | 2008-10-29 | Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL386381A1 PL386381A1 (pl) | 2010-05-10 |
| PL213166B1 true PL213166B1 (pl) | 2013-01-31 |
Family
ID=41796512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL386381A PL213166B1 (pl) | 2008-10-29 | 2008-10-29 | Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagów |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9238798B2 (pl) |
| EP (1) | EP2340304B1 (pl) |
| ES (1) | ES2619521T3 (pl) |
| PL (1) | PL213166B1 (pl) |
| WO (1) | WO2010050833A2 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3002948B1 (fr) * | 2013-03-06 | 2017-09-08 | Colcom | Procede de capture de virus. |
| DE102013106455A1 (de) | 2013-06-20 | 2014-12-24 | Airbus Defence and Space GmbH | Verfahren zur Dekontamination von bakteriologischen Verunreinigungen |
| CN109837251B (zh) * | 2017-11-27 | 2022-01-28 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 一种噬菌体保护剂及其制备方法和应用 |
| CN108651522A (zh) * | 2018-04-09 | 2018-10-16 | 广州诺晶生物技术有限公司 | 一种溶藻弧菌噬菌体制剂、制备方法及其应用 |
| CN112940942A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-11 | 江苏省农业科学院 | 一种高耐热稳定剂、微生物制剂及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8801338D0 (en) * | 1988-01-21 | 1988-02-17 | Quadrant Bioresources Ltd | Preservation of viruses |
| RU2059723C1 (ru) * | 1993-05-20 | 1996-05-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных | Способ получения фагового препарата "стрептофагин" |
| US6461607B1 (en) * | 1998-08-24 | 2002-10-08 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof |
| CA2428370A1 (en) * | 2000-11-13 | 2002-05-16 | Nakhyung Lee | Compositions and methods for reducing the amount of salmonella in livestock |
| EP1487273B1 (en) * | 2002-02-13 | 2009-01-21 | Immunology Laboratories, Inc. | Compositions and methods for treatment of microbial infections |
| MX2007005279A (es) * | 2004-11-02 | 2008-03-11 | Gangagen Life Sciences Inc | Composiciones de bacteriofagos. |
| EP1854478A1 (en) * | 2006-05-12 | 2007-11-14 | Cytos Biotechnology AG | Nicotine-carrier vaccine formulation |
| PL212099B1 (pl) * | 2007-02-09 | 2012-08-31 | Inst Immunologii I Terapii Doświadczalnej Pan | Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowanie |
-
2008
- 2008-10-29 PL PL386381A patent/PL213166B1/pl unknown
-
2009
- 2009-10-29 WO PCT/PL2009/050032 patent/WO2010050833A2/en not_active Ceased
- 2009-10-29 ES ES09775370.1T patent/ES2619521T3/es active Active
- 2009-10-29 US US13/059,815 patent/US9238798B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-29 EP EP09775370.1A patent/EP2340304B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL386381A1 (pl) | 2010-05-10 |
| EP2340304A2 (en) | 2011-07-06 |
| WO2010050833A2 (en) | 2010-05-06 |
| ES2619521T3 (es) | 2017-06-26 |
| US20110256103A1 (en) | 2011-10-20 |
| US9238798B2 (en) | 2016-01-19 |
| WO2010050833A3 (en) | 2010-06-24 |
| EP2340304B1 (en) | 2016-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vandenheuvel et al. | Bacteriophage therapy: advances in formulation strategies and human clinical trials | |
| ES2747964T3 (es) | Tratamiento con bacteriófagos para infecciones por E. coli | |
| US20080229609A1 (en) | Preservation by Vaporization | |
| US9255251B2 (en) | Purified bacteriophage, its preparation and application | |
| JP6053727B2 (ja) | 抗細菌組成物 | |
| PL213166B1 (pl) | Sposób otrzymywania farmakologicznej stabilnej formy zliofilizowanych aktywnych preparatów oczyszczonych bakteriofagów | |
| CN109988753B (zh) | 肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂及其制备方法和应用 | |
| Verlhac et al. | Experimental study and optimization of freeze-drying cycles of a model Casei type probiotic bacteria | |
| Lovett | PBP1: A flagella specific bacteriophage mediating transduction in Bacillus pumilus | |
| CN113230215A (zh) | 噬菌体冻干粉制剂及其制备方法、保存方法和应用 | |
| Marton et al. | Polymer-mediated cryopreservation of bacteriophages | |
| CN111286469B (zh) | 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法 | |
| Oslan et al. | Improved stability of live attenuated vaccine gdhA derivative Pasteurella multocida B: 2 by freeze drying method for use as animal vaccine | |
| CA2618710A1 (en) | Methods and compositions for dried cellular forms | |
| Majdani et al. | Isolation and characterization of lytic bacteriophages against Pseudomonas aeruginosa isolates from human infections in the north-west of Iran | |
| RU2113476C1 (ru) | Штамм бактериофага pseudomonas aeruginosa гнц пм n 02, используемый при изготовлении поливалентного лечебного препарата против синегнойной палочки | |
| RU2730615C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против грамотрицательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae и Salmonella typhi (варианты) | |
| CN116694581A (zh) | 哈维氏弧菌噬菌体v-ydf132的冻干保护剂及其保藏方法 | |
| RU2317089C2 (ru) | Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме и способ его получения | |
| JP2025539486A (ja) | 活性成分の最適な安定性と効率を備えたバクテリオファージと溶菌酵素を含む、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌に対する抗菌効果を持つ凍結乾燥錠剤の調製のための混合物 | |
| RU2727906C2 (ru) | Способ хранения сибиреязвенных бактериофагов контактно-сорбционным высушиванием (обезвоживанием) на ионообменной смоле марки кб-4п-2 | |
| Babita et al. | Phage Therapy Reimagined: Viral | |
| Malik et al. | Isolation and Partial Characterization of Bacteriophage against Salmonella gallinarum | |
| RU2730613C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) | |
| Mukherjee et al. | Bacteriophage Associated Inhibition of Biofilm: A Review |