JP2003513988A - ワクチンに含まれる組換えゼラチン - Google Patents
ワクチンに含まれる組換えゼラチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、組換えゼラチンを含むワクチン、かかるワクチンを生産および使用する方法、およびワクチン接種用キットに関する。
Description
【0001】発明の技術分野
本発明は、ワクチン、特に組換えゼラチンを含むワクチン製剤に関する。
【0002】発明の背景
ワクチンは、微生物の死細胞または改変した微生物、生存している弱毒化生物
、もしくは生存している十分に毒性のある生物、または天然の、合成の、もしく
は半合成の他のあらゆる感染性物質(ペプチド、タンパク質生物学的高分子もし
くは核酸を含むがこれらに限定はされない)からなる、被検体に投与されると免
疫応答を刺激し得る調剤である。ワクチンは、その後の類似する微生物への暴露
またはその感染の重篤性を予防または和らげるために提供される。弱毒化生ワク
チンでは、典型的には微生物を処理して感染防護免疫を誘導しうる無毒性の株が
作製されている。不活化ワクチンでは、該微生物のウイルス被覆または菌の外膜
タンパク質の抗原性または免疫原性に影響を与えることなく、投与の前に感染性
微生物の核酸構成成分が破壊されている。
、もしくは生存している十分に毒性のある生物、または天然の、合成の、もしく
は半合成の他のあらゆる感染性物質(ペプチド、タンパク質生物学的高分子もし
くは核酸を含むがこれらに限定はされない)からなる、被検体に投与されると免
疫応答を刺激し得る調剤である。ワクチンは、その後の類似する微生物への暴露
またはその感染の重篤性を予防または和らげるために提供される。弱毒化生ワク
チンでは、典型的には微生物を処理して感染防護免疫を誘導しうる無毒性の株が
作製されている。不活化ワクチンでは、該微生物のウイルス被覆または菌の外膜
タンパク質の抗原性または免疫原性に影響を与えることなく、投与の前に感染性
微生物の核酸構成成分が破壊されている。
【0003】
ワクチンにより、世界の保健衛生において根本的な変化が達成された。例えば
、1980年には、世界保健機構(WHO)は、国際的ワクチン接種の結果、天然痘
は根絶したと宣言した。子供の死亡率のうち高い比率を占めるジフテリア、百日
咳、麻疹は、先進国では幼児または子供の免疫計画の確立に重点がおかれ、発展
途上国ではこのような計画を確立するための努力が続けられている。免疫化によ
り、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹(rubella/German measles)、ジフテ
リア、百日咳(pertussis/whooping cogh)、ニワトリポックス(chicken pox)
、B型肝炎、B型インフルエンザ菌髄膜炎をはじめとする疾患から子供が保護さ
れる。現在の免疫スケジュールは、誕生から12時間以内に始められ、最初の2
年間多数の免疫が必要である。ワクチンの投与は、ヒトの生存期間中に渡って様
々な時点で行われる。例えば、季節性ワクチン(例えば、インフルエンザワクチ
ン)および旅行者に投与されるワクチンなどがある。ワクチンは様々な方法で投
与されうる。現在、ワクチンは注射または経口投与により送達されるのが基本的
である。ワクチン製剤は、例えば目値気応答を増大させるためのアジュバントな
どを含む得、これによってより少ないワクチンで所望の防御的免疫応答が得られ
るようになる。様々な賦活剤および担体もまた、ワクチンの一貫性(consistenc
y)および送達可能性に寄与するために、提供されうる。
、1980年には、世界保健機構(WHO)は、国際的ワクチン接種の結果、天然痘
は根絶したと宣言した。子供の死亡率のうち高い比率を占めるジフテリア、百日
咳、麻疹は、先進国では幼児または子供の免疫計画の確立に重点がおかれ、発展
途上国ではこのような計画を確立するための努力が続けられている。免疫化によ
り、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹(rubella/German measles)、ジフテ
リア、百日咳(pertussis/whooping cogh)、ニワトリポックス(chicken pox)
、B型肝炎、B型インフルエンザ菌髄膜炎をはじめとする疾患から子供が保護さ
れる。現在の免疫スケジュールは、誕生から12時間以内に始められ、最初の2
年間多数の免疫が必要である。ワクチンの投与は、ヒトの生存期間中に渡って様
々な時点で行われる。例えば、季節性ワクチン(例えば、インフルエンザワクチ
ン)および旅行者に投与されるワクチンなどがある。ワクチンは様々な方法で投
与されうる。現在、ワクチンは注射または経口投与により送達されるのが基本的
である。ワクチン製剤は、例えば目値気応答を増大させるためのアジュバントな
どを含む得、これによってより少ないワクチンで所望の防御的免疫応答が得られ
るようになる。様々な賦活剤および担体もまた、ワクチンの一貫性(consistenc
y)および送達可能性に寄与するために、提供されうる。
【0004】
ワクチンは、ワクチンの安定性を維持するためにワクチン製剤の中に様々な成
分を含みうる。このような安定剤は、ワクチンの完全性(integrity)を維持し
、投与により防御免疫応答を誘発しうるワクチンの能力を保持することを目的と
している。
分を含みうる。このような安定剤は、ワクチンの完全性(integrity)を維持し
、投与により防御免疫応答を誘発しうるワクチンの能力を保持することを目的と
している。
【0005】
ワクチン製剤に用いられる安定剤は、限定はされないが、さまざまな機能を果
たす化学的および生物学的化合物を含み、例えば、界面活性剤、緩衝化剤、塩、
糖および様々なタンパク質成分などがあり、ゼラチン、特に加水分解されたゼラ
チンが含まれる。
たす化学的および生物学的化合物を含み、例えば、界面活性剤、緩衝化剤、塩、
糖および様々なタンパク質成分などがあり、ゼラチン、特に加水分解されたゼラ
チンが含まれる。
【0006】ゼラチンの製造
ゼラチンは、動物の主要な構造・結合タンパク質であるコラーゲンの誘導体で
ある。ゼラチンはコラーゲンの変性から誘導されるもので、Gly-X-Y反復配列(
ここで、XおよびYはほとんどプロリンおよびヒドロキシプロリン残基であること
が多い)をもつポリペプチド配列を含む。これらの配列は三重らせん構造に寄与
し、ゼラチンポリペプチドのゲル化能に影響を及ぼす。現在入手できるゼラチン
は動物の皮革と骨(典型的には、ウシおよびブタの供給源)の加工処理を経て抽
出されている。ゼラチンは、その生物物理的性質により、多種多様な用途および
産業において汎用される万能材料となっている。例えば、ゼラチンは数多くの医
薬品、写真製品、工業製品、化粧品、食品および飲料、ならびに製造方法におい
て広く用いられている。したがって、ゼラチンは商業的に価値のある多用途製品
である。
ある。ゼラチンはコラーゲンの変性から誘導されるもので、Gly-X-Y反復配列(
ここで、XおよびYはほとんどプロリンおよびヒドロキシプロリン残基であること
が多い)をもつポリペプチド配列を含む。これらの配列は三重らせん構造に寄与
し、ゼラチンポリペプチドのゲル化能に影響を及ぼす。現在入手できるゼラチン
は動物の皮革と骨(典型的には、ウシおよびブタの供給源)の加工処理を経て抽
出されている。ゼラチンは、その生物物理的性質により、多種多様な用途および
産業において汎用される万能材料となっている。例えば、ゼラチンは数多くの医
薬品、写真製品、工業製品、化粧品、食品および飲料、ならびに製造方法におい
て広く用いられている。したがって、ゼラチンは商業的に価値のある多用途製品
である。
【0007】
ゼラチンは一般的にウシおよびブタ源(特に、皮革と骨)からの天然のコラー
ゲンより製造される。場合によっては、ゼラチンを、例えば、魚、ニワトリ、ウ
マなどの供給源から抽出することもできる。典型的なゼラチン製造用の、ウシの
皮革や骨のような原料は、政府により承認された検査を受けてヒト消費用に合格
した動物に由来するものである。この原料の感染性に対しては、例えば、伝染性
海綿状脳症(TSE)、特にウシ海綿状脳症(BSE)、スクレイピーなどの混入病原体の
存在のために、関心がもたれている(例えば、Rohwer, R.G. (1996), Dev Biol
Stand 88:247-256を参照のこと)。こうした問題は製薬および医療用途で使用す
るゼラチンにとって特に重大である。
ゲンより製造される。場合によっては、ゼラチンを、例えば、魚、ニワトリ、ウ
マなどの供給源から抽出することもできる。典型的なゼラチン製造用の、ウシの
皮革や骨のような原料は、政府により承認された検査を受けてヒト消費用に合格
した動物に由来するものである。この原料の感染性に対しては、例えば、伝染性
海綿状脳症(TSE)、特にウシ海綿状脳症(BSE)、スクレイピーなどの混入病原体の
存在のために、関心がもたれている(例えば、Rohwer, R.G. (1996), Dev Biol
Stand 88:247-256を参照のこと)。こうした問題は製薬および医療用途で使用す
るゼラチンにとって特に重大である。
【0008】
近年、これらの材料(その大部分はウシ源に由来するものであるが)の安全性
についての関心が高まってきており、様々なゼラチン含有製品は、ヒトの致死的
な神経疾患である新型クロイツフェルト・ヤコブ病(nvCJD)に関連したウシ海綿
状脳症(BSE)の伝染のリスクを減らすための、いくつかの規制措置の中心になっ
ている。動物の組織や骨からゼラチンを抽出する過程で現在用いられている精製
工程は、SE混入組織(すなわち、脳組織など)による感染の可能性を除くのに十
分ではないという懸念がある。米国や欧州の製造業者は、動物またはヒトの食品
、あるいは製薬、医療または化粧品の分野で用いられるゼラチン用の原料は、次
第にその数が増しているBSE諸国から得られたものであってはならない、と取り
決めている。さらに、ゼラチンの製造にはある種の材料(例えば、ウシの脳組織
)を使わないという制約がある。
についての関心が高まってきており、様々なゼラチン含有製品は、ヒトの致死的
な神経疾患である新型クロイツフェルト・ヤコブ病(nvCJD)に関連したウシ海綿
状脳症(BSE)の伝染のリスクを減らすための、いくつかの規制措置の中心になっ
ている。動物の組織や骨からゼラチンを抽出する過程で現在用いられている精製
工程は、SE混入組織(すなわち、脳組織など)による感染の可能性を除くのに十
分ではないという懸念がある。米国や欧州の製造業者は、動物またはヒトの食品
、あるいは製薬、医療または化粧品の分野で用いられるゼラチン用の原料は、次
第にその数が増しているBSE諸国から得られたものであってはならない、と取り
決めている。さらに、ゼラチンの製造にはある種の材料(例えば、ウシの脳組織
)を使わないという制約がある。
【0009】
現在の精製プロセスはいくつかの精製・洗浄工程を含み、苛酷で非常に長った
らしい抽出法を必要とする。動物の皮革と骨を溶出(rendering)工程で処理し、
溶出した材料を各種の化学的処理にかける(高酸性または高アルカリ性条件に長
時間さらす)。多くの精製工程では、洗浄、濾過、様々な熱処理が必要となる。
酸による無機物の除去および石灰による処理を行って、非コラーゲン性タンパク
質のような不純物を除去する。骨は脱脂しなければならない。この材料をさらに
精製するために、上記工程に更なる洗浄・濾過工程、イオン交換、その他の化学
的および滅菌的処理を加える。その上、かかる処理の後にも汚染物や不純物がま
だ残っていることがあり、それゆえ、得られたゼラチン製品は一般的に清澄化、
精製、時には更なる濃縮を行なってから使用に供しなければならない。
らしい抽出法を必要とする。動物の皮革と骨を溶出(rendering)工程で処理し、
溶出した材料を各種の化学的処理にかける(高酸性または高アルカリ性条件に長
時間さらす)。多くの精製工程では、洗浄、濾過、様々な熱処理が必要となる。
酸による無機物の除去および石灰による処理を行って、非コラーゲン性タンパク
質のような不純物を除去する。骨は脱脂しなければならない。この材料をさらに
精製するために、上記工程に更なる洗浄・濾過工程、イオン交換、その他の化学
的および滅菌的処理を加える。その上、かかる処理の後にも汚染物や不純物がま
だ残っていることがあり、それゆえ、得られたゼラチン製品は一般的に清澄化、
精製、時には更なる濃縮を行なってから使用に供しなければならない。
【0010】
商用ゼラチンは通常A型またはB型として分類される。これらの分類は抽出工
程の一部として行なう予備処理抽出源を反映したものである。一般に、A型は酸
で処理した材料(通常、ブタの皮革)から誘導され、B型はアルカリまたは石灰
で処理した材料(通常、ウシの骨(骨素: ossein)と皮革)から誘導される。
程の一部として行なう予備処理抽出源を反映したものである。一般に、A型は酸
で処理した材料(通常、ブタの皮革)から誘導され、B型はアルカリまたは石灰
で処理した材料(通常、ウシの骨(骨素: ossein)と皮革)から誘導される。
【0011】
A型ゼラチンを抽出する場合には、一般に、新鮮なまたは凍結したブタ皮革を
水で連続的に洗浄し、希酸で処理する必要がある。酸処理した皮革を再度洗浄し
てから、反復抽出工程にかけるが、この工程では温水で処理して存在するコラー
ゲンを部分的に加水分解する。得られた抽出物(希薄なゼラチン溶液)を濾過し
、蒸発させ、得られた濃縮液を冷却してゲルにする。続いてそのゲルをトンネル
乾燥機、連続乾燥機または他の乾燥装置で処理する。
水で連続的に洗浄し、希酸で処理する必要がある。酸処理した皮革を再度洗浄し
てから、反復抽出工程にかけるが、この工程では温水で処理して存在するコラー
ゲンを部分的に加水分解する。得られた抽出物(希薄なゼラチン溶液)を濾過し
、蒸発させ、得られた濃縮液を冷却してゲルにする。続いてそのゲルをトンネル
乾燥機、連続乾燥機または他の乾燥装置で処理する。
【0012】
石灰処理法では、提供動物の刈り込んだ皮革を洗浄し、次いで石灰で処理する
とB型ゼラチンが得られる。石灰処理には1〜3ヶ月もの長い期間を要し、通常
約60日かかる。石灰処理した皮革を洗浄し、希酸で処理する。次に、この皮革を
温水で加水分解し、得られた抽出物を、酸処理法に関して上述したように処理す
る。
とB型ゼラチンが得られる。石灰処理には1〜3ヶ月もの長い期間を要し、通常
約60日かかる。石灰処理した皮革を洗浄し、希酸で処理する。次に、この皮革を
温水で加水分解し、得られた抽出物を、酸処理法に関して上述したように処理す
る。
【0013】
B型ゼラチンは骨素源からも処理することができる。硬骨を洗浄し、脱脂し、
塩酸などの希酸で連続処理して浸出する。骨の無機質分は酸処理により反応する
ので、これを酸溶液と共に除去し、骨素つまり無機質を取り除いた骨をあとに残
す。この有機骨物質を、残留する酸を洗浄して除いてから、保存のために乾燥す
るか、直ちに石灰で処理する。石灰処理後、ウシ皮革からのゼラチン製造に関し
て上述したように骨素を処理する。あらゆる場合に、最終的な濾過、無機質除去
、濃縮および乾燥工程の後、得られたゼラチン製品をバッチごとに分けて、様々
な物理的、化学的および細菌学的検査にかけて等級および純度を決定し、商業上
の必要性に応じて粉砕し、ブレンドする。A型およびB型の両方の抽出法とも、
得られるゼラチン製品は典型的には2,3千ダルトンから数十万ダルトンまでの大
きさのゼラチン分子の混合物から成っている。
塩酸などの希酸で連続処理して浸出する。骨の無機質分は酸処理により反応する
ので、これを酸溶液と共に除去し、骨素つまり無機質を取り除いた骨をあとに残
す。この有機骨物質を、残留する酸を洗浄して除いてから、保存のために乾燥す
るか、直ちに石灰で処理する。石灰処理後、ウシ皮革からのゼラチン製造に関し
て上述したように骨素を処理する。あらゆる場合に、最終的な濾過、無機質除去
、濃縮および乾燥工程の後、得られたゼラチン製品をバッチごとに分けて、様々
な物理的、化学的および細菌学的検査にかけて等級および純度を決定し、商業上
の必要性に応じて粉砕し、ブレンドする。A型およびB型の両方の抽出法とも、
得られるゼラチン製品は典型的には2,3千ダルトンから数十万ダルトンまでの大
きさのゼラチン分子の混合物から成っている。
【0014】
魚のゼラチンはゲル化型または非ゲル化型に分類され、典型的にはA型ゼラチ
ンとして処理されるものであるが、これもまた幾つかの商業用途に使われている
。ゲル化型は通常温水に生息している魚の皮膚から誘導され、一方非ゲル化型は
冷水魚から誘導される。魚のゼラチンはアミノ酸組成が広範囲に変化しており、
典型的にはプロリンおよびヒドロキシプロリン残基の割合がより低いという点で
動物のゼラチンと相違する。動物のゼラチンとは対照的に、魚のゼラチンは典型
的には、匹敵する平均分子量でさえも、かなりの低温で液体のままである。他の
動物のゼラチンと同様、魚のゼラチンも魚の皮膚を処理し、続いて加水分解する
ことにより抽出される。この場合も、動物の抽出法と同様、均質性を欠く製品が
得られる。
ンとして処理されるものであるが、これもまた幾つかの商業用途に使われている
。ゲル化型は通常温水に生息している魚の皮膚から誘導され、一方非ゲル化型は
冷水魚から誘導される。魚のゼラチンはアミノ酸組成が広範囲に変化しており、
典型的にはプロリンおよびヒドロキシプロリン残基の割合がより低いという点で
動物のゼラチンと相違する。動物のゼラチンとは対照的に、魚のゼラチンは典型
的には、匹敵する平均分子量でさえも、かなりの低温で液体のままである。他の
動物のゼラチンと同様、魚のゼラチンも魚の皮膚を処理し、続いて加水分解する
ことにより抽出される。この場合も、動物の抽出法と同様、均質性を欠く製品が
得られる。
【0015】ワクチン中のゼラチン
麻疹、流行性耳下腺炎および風疹ワクチン、ならびに麻疹−流行性耳下腺炎−
風疹(MMR)混合ワクチンに対するアナフィラキシー反応が報告されている(Sak
aguchiおよびInouye, 2000, Vaccine, 18:2055-2058; Sakaguchiら, 1999, J Al
lergy Clin Immunol, 104:695-699)。これらのアレルギー反応がワクチン中に
存在する卵タンパク質に対するアレルギーにより引き起こされたという推測とは
関係なく、アナフィラキシー反応はまた、卵に耐性を有している子供へのMMRワ
クチンの投与後にも起こると報告されている。生ワクチンに対する反応の多くが
、これらワクチン中に含まれるウシのゼラチンに対する後天的な感受性によって
引き起こされるということが明らかになってきた(例、Nakayamaら(1999) J All
ergy Clin Immunol 103:321-325、および該文献中の引用文献、ならびにSakaguc
hiら(1999) Immunology, 96:286-290)。
風疹(MMR)混合ワクチンに対するアナフィラキシー反応が報告されている(Sak
aguchiおよびInouye, 2000, Vaccine, 18:2055-2058; Sakaguchiら, 1999, J Al
lergy Clin Immunol, 104:695-699)。これらのアレルギー反応がワクチン中に
存在する卵タンパク質に対するアレルギーにより引き起こされたという推測とは
関係なく、アナフィラキシー反応はまた、卵に耐性を有している子供へのMMRワ
クチンの投与後にも起こると報告されている。生ワクチンに対する反応の多くが
、これらワクチン中に含まれるウシのゼラチンに対する後天的な感受性によって
引き起こされるということが明らかになってきた(例、Nakayamaら(1999) J All
ergy Clin Immunol 103:321-325、および該文献中の引用文献、ならびにSakaguc
hiら(1999) Immunology, 96:286-290)。
【0016】
ゼラチンを含む弱毒化ウィルスの生ワクチンに対する反応における子供のアナ
フィラキシー症がゼラチンによって引き起こされ、かつ、ゼラチン含有ジフテリ
ア−破傷風−無細胞性百日咳(DTaP)ワクチンが子供をゼラチンに対して敏感に
させるらしいということが研究により明らかとなってきている。特に、ゼラチン
を含むDtaPワクチンと、抗ゼラチンIgEの生産と、ウシゼラチンを含む生ウィル
スワクチンによるその後の免疫化の後に起こるアナフィラキシー症の危険性との
間に強い因果関係が確認されてきた(SakaguchiおよびInouye, 前述; Nakayama
ら前述)。
フィラキシー症がゼラチンによって引き起こされ、かつ、ゼラチン含有ジフテリ
ア−破傷風−無細胞性百日咳(DTaP)ワクチンが子供をゼラチンに対して敏感に
させるらしいということが研究により明らかとなってきている。特に、ゼラチン
を含むDtaPワクチンと、抗ゼラチンIgEの生産と、ウシゼラチンを含む生ウィル
スワクチンによるその後の免疫化の後に起こるアナフィラキシー症の危険性との
間に強い因果関係が確認されてきた(SakaguchiおよびInouye, 前述; Nakayama
ら前述)。
【0017】
安定剤としてゼラチンを含むMMRワクチンに対するアナフィラキシー反応が報
告されてきており、また、これらのワクチンに含まれるウシゼラチンによって引
き起こされることが示されてきている。特に、ウシI型コラーゲンのα1およびα
2鎖に対するIgE反応がウシゼラチンアレルギーを持つ子供において確認されてき
た(Sakaguchiら, 前述、および本文中の参照)。ゼラチンを含む、麻疹、流行
性耳下腺炎、および風疹ワクチンに対する非常に多くのアナフィラキシー反応お
よびある種のじん麻疹反応が、ゼラチンに対するIgEを介したアレルギー反応と
関連付けられてきた(Nakayamaら, 前述)。ゼラチン特異的IgG抗体が、MMRワク
チンに対して全身性即効型および非即効型反応を有する子供において確認されて
きており、このことは、非ヒトゼラチンに対する免疫反応が、生ウイルスワクチ
ンに対する全身性反応の病因においてある役割を担っていることを示唆している
(Miyazawaら(1999) Vaccine 17:2176-2180およびKelso (1999) J Aller. Clin
Immunol. 103:200-202、ならびにこれらの文献中の引用文献)。
告されてきており、また、これらのワクチンに含まれるウシゼラチンによって引
き起こされることが示されてきている。特に、ウシI型コラーゲンのα1およびα
2鎖に対するIgE反応がウシゼラチンアレルギーを持つ子供において確認されてき
た(Sakaguchiら, 前述、および本文中の参照)。ゼラチンを含む、麻疹、流行
性耳下腺炎、および風疹ワクチンに対する非常に多くのアナフィラキシー反応お
よびある種のじん麻疹反応が、ゼラチンに対するIgEを介したアレルギー反応と
関連付けられてきた(Nakayamaら, 前述)。ゼラチン特異的IgG抗体が、MMRワク
チンに対して全身性即効型および非即効型反応を有する子供において確認されて
きており、このことは、非ヒトゼラチンに対する免疫反応が、生ウイルスワクチ
ンに対する全身性反応の病因においてある役割を担っていることを示唆している
(Miyazawaら(1999) Vaccine 17:2176-2180およびKelso (1999) J Aller. Clin
Immunol. 103:200-202、ならびにこれらの文献中の引用文献)。
【0018】
この様なゼラチン誘導性ワクチン特異的反応は、例えば医薬用途および摂取に
おいて、ヒトおよび動物に使用するための動物由来(例えばウシ由来の)材料を使
用することに関連して増加する懸念に関連して、ますます重大になっている。ウ
シ由来材料の安全性に関連したこの様な懸念は、動物源からのゼラチンの抽出お
よび精製の過程において残存あるいは混入し得る感染性物質にさらす危険性を指
摘する(Asher(1999) Dev. Biol. Stand. 99:41-44、およびVerdrager(1999) La
ncet 354:1304-1305参照)。英国産の胎児仔ウシ血清がワクチンの製造に使用さ
れていることがわかって以降、英国およびアイルランド共和国においてのみ使用
されていたある種の経口ポリオワクチンの使用が最近廃止された(BBC News Rep
ort, Polio vaccine in BSE scare, 20 October 2000、World Health Organizat
ion,WHO Position Stamement on Recall of Evans/Medeva Polio Vaccine in UK
, 20 October 2000)。TSEsなどの感染性物質の存在、ならびに抽出後に存在す
るであろう細菌および他の病原体および内毒素に対する懸念から、動物源から現
在得ている材料の代わりに使用可能な、安全かつ非免疫原性材料の必要性が確立
されてきている。
おいて、ヒトおよび動物に使用するための動物由来(例えばウシ由来の)材料を使
用することに関連して増加する懸念に関連して、ますます重大になっている。ウ
シ由来材料の安全性に関連したこの様な懸念は、動物源からのゼラチンの抽出お
よび精製の過程において残存あるいは混入し得る感染性物質にさらす危険性を指
摘する(Asher(1999) Dev. Biol. Stand. 99:41-44、およびVerdrager(1999) La
ncet 354:1304-1305参照)。英国産の胎児仔ウシ血清がワクチンの製造に使用さ
れていることがわかって以降、英国およびアイルランド共和国においてのみ使用
されていたある種の経口ポリオワクチンの使用が最近廃止された(BBC News Rep
ort, Polio vaccine in BSE scare, 20 October 2000、World Health Organizat
ion,WHO Position Stamement on Recall of Evans/Medeva Polio Vaccine in UK
, 20 October 2000)。TSEsなどの感染性物質の存在、ならびに抽出後に存在す
るであろう細菌および他の病原体および内毒素に対する懸念から、動物源から現
在得ている材料の代わりに使用可能な、安全かつ非免疫原性材料の必要性が確立
されてきている。
【0019】概要
現在の抽出方法では、タンパク質の異種混合物で幅広い分子量分布を有するポ
リペプチドを含むゼラチン産物が得られる。所望の用途において使用するのに適
した物理的特徴を有するゼラチン混合物を得るため、多様なロットの産物を調合
することが必要な場合もある。さらに、現在の抽出方法を用いて、例えばタンパ
ク質、脂質、多糖類などのゼラチンではない不純物を含まないゼラチンを得るこ
とは実質的に不可能である。
リペプチドを含むゼラチン産物が得られる。所望の用途において使用するのに適
した物理的特徴を有するゼラチン混合物を得るため、多様なロットの産物を調合
することが必要な場合もある。さらに、現在の抽出方法を用いて、例えばタンパ
ク質、脂質、多糖類などのゼラチンではない不純物を含まないゼラチンを得るこ
とは実質的に不可能である。
【0020】
より均質な産物、およびより再現性を有する手段によって生産されたものが望
ましい。再現性のある物理的特性を有する均質な材料が利用可能であることが望
ましく、例えば、多様な産物および工程において、定められた分子量の幅といっ
た様な特定の特徴を有するゼラチンである可能性が、再現性および管理された作
業を可能とさせるであろう。従って、管理された特性を有する確実な産物を供給
する、ゼラチン生産の確実かつ再現性を有する手段が必要である。
ましい。再現性のある物理的特性を有する均質な材料が利用可能であることが望
ましく、例えば、多様な産物および工程において、定められた分子量の幅といっ
た様な特定の特徴を有するゼラチンである可能性が、再現性および管理された作
業を可能とさせるであろう。従って、管理された特性を有する確実な産物を供給
する、ゼラチン生産の確実かつ再現性を有する手段が必要である。
【0021】
さらに、動物源からの産物およびそれらの調製方法から得られたゼラチン含有
産物の免疫原性および感染性に関する懸念がある(例、SakaguchiおよびInouye, 前述、Sakaguchiら, 前述、Nakayamaら, 前述、Asher, 前述、およびVerdrager
, 前述参照。)。従って、ウシ、ブタ、および他の動物源から現在抽出されるも
のとは別のゼラチンの供給源が必要である。
産物の免疫原性および感染性に関する懸念がある(例、SakaguchiおよびInouye, 前述、Sakaguchiら, 前述、Nakayamaら, 前述、Asher, 前述、およびVerdrager
, 前述参照。)。従って、ウシ、ブタ、および他の動物源から現在抽出されるも
のとは別のゼラチンの供給源が必要である。
【0022】
ゼラチン製造者および末端利用者は、現在入手可能な動物源ゼラチンに代わる
多くの天然および合成代用物質を探索しそして試験してきた。VCAPS皮膜内のセ
ルロース製の非加熱処理の材料(CAPSUGEL; Morris Plains, NJ)、または写真
の感光乳剤中のマウスおよびラットコラーゲン配列由来の非天然ゼラチン様タン
パク質の提案使用といった様ないくつかの応用のための代用物質が同定されてき
た(例、Werten, M. W.ら(1999) Yeast 15:1087-1096、およびDe Wolf, Antonら
, ヨーロッパ出願番号第 EP1014176A2号。)。しかし、多くのゼラチンを基とし
た工程および産物に対して、この重要な材料の作業特性が繰り返されることはな
く、また代用物質として適用されてきていない。従って、合成的な再現性のある
方法におけるゼラチン生産の方法が必要であり、ここで、生じた産物は望ましい
作業特性を有する合理的な基質を供することができる。
多くの天然および合成代用物質を探索しそして試験してきた。VCAPS皮膜内のセ
ルロース製の非加熱処理の材料(CAPSUGEL; Morris Plains, NJ)、または写真
の感光乳剤中のマウスおよびラットコラーゲン配列由来の非天然ゼラチン様タン
パク質の提案使用といった様ないくつかの応用のための代用物質が同定されてき
た(例、Werten, M. W.ら(1999) Yeast 15:1087-1096、およびDe Wolf, Antonら
, ヨーロッパ出願番号第 EP1014176A2号。)。しかし、多くのゼラチンを基とし
た工程および産物に対して、この重要な材料の作業特性が繰り返されることはな
く、また代用物質として適用されてきていない。従って、合成的な再現性のある
方法におけるゼラチン生産の方法が必要であり、ここで、生じた産物は望ましい
作業特性を有する合理的な基質を供することができる。
【0023】
非動物源由来の用途の広いゼラチンで、異なる用途に難なく適応し、そして存
在する健康と特定の懸念に応えるものが必要である。特に、ワクチンに関しては
、動物由来産物からの免疫学性、抗原性、および/または感染性の危険性を安全
に最小限にする一方で、ワクチン製剤の効果的な安定剤および成分として機能す
る材料が必要である。
在する健康と特定の懸念に応えるものが必要である。特に、ワクチンに関しては
、動物由来産物からの免疫学性、抗原性、および/または感染性の危険性を安全
に最小限にする一方で、ワクチン製剤の効果的な安定剤および成分として機能す
る材料が必要である。
【0024】
本発明は、組換えにより得られ、現在ゼラチンが使われる用途の非常に多岐に
渡る範囲における利用に適応した、万能の代用材料の提供によりこれらの必要性
に応える。特に、本発明はワクチン製剤における使用に適した組換えゼラチンを
提供する。本材料は、特定の用途に望ましい特徴および特性を有するように設計
可能であり、従ってまた、一般的に入手可能な動物源ゼラチンに代わるものであ
り、同時に、新しい特徴およびこれまで入手不可能だった用途を提供し得る。
渡る範囲における利用に適応した、万能の代用材料の提供によりこれらの必要性
に応える。特に、本発明はワクチン製剤における使用に適した組換えゼラチンを
提供する。本材料は、特定の用途に望ましい特徴および特性を有するように設計
可能であり、従ってまた、一般的に入手可能な動物源ゼラチンに代わるものであ
り、同時に、新しい特徴およびこれまで入手不可能だった用途を提供し得る。
【0025】発明の要旨
本発明は、組換えゼラチンおよび、特にワクチン中への組換えゼラチンの利用
に関する。したがって、1実施形態において、本発明は組換えゼラチンを含むワ
クチン製剤を提供する。好ましい実施形態において、組換えゼラチンはヒトゼラ
チンである。本発明のさらなる態様は、非免疫性である組換えゼラチンを提供す
る。
に関する。したがって、1実施形態において、本発明は組換えゼラチンを含むワ
クチン製剤を提供する。好ましい実施形態において、組換えゼラチンはヒトゼラ
チンである。本発明のさらなる態様は、非免疫性である組換えゼラチンを提供す
る。
【0026】
1つの実施形態において、本発明は組換えゼラチンを含むワクチン製剤を提供
し、該組換えゼラチンは周囲温度での安定性を供与する。別の実施形態において
、該ゼラチンは非天然コラーゲン配列に由来する。
し、該組換えゼラチンは周囲温度での安定性を供与する。別の実施形態において
、該ゼラチンは非天然コラーゲン配列に由来する。
【0027】
特定の組換えゼラチンを含む製剤が意図される。1つの態様において、組換え
ゼラチンは、組換えゼラチンが約0〜50kDa、約10〜30kDa、約30〜50kDa、約10〜
70kDa、約50〜70kDa、約50〜100kDa、約100〜150kDa、約150〜200kDa、約200〜2
50kDa、約250〜300kDaおよび約300〜350kDaからなる群より選択される分子量範
囲を有する。ある実施形態において、組換えゼラチンは、約1kDa、約5kDa、約8k
Da、約9kDa、約14kDa、約16kDa、約22kDa、約23kDa、約44kDaおよび約65kDaから
なる群より選択される分子量を有する。
ゼラチンは、組換えゼラチンが約0〜50kDa、約10〜30kDa、約30〜50kDa、約10〜
70kDa、約50〜70kDa、約50〜100kDa、約100〜150kDa、約150〜200kDa、約200〜2
50kDa、約250〜300kDaおよび約300〜350kDaからなる群より選択される分子量範
囲を有する。ある実施形態において、組換えゼラチンは、約1kDa、約5kDa、約8k
Da、約9kDa、約14kDa、約16kDa、約22kDa、約23kDa、約44kDaおよび約65kDaから
なる群より選択される分子量を有する。
【0028】
本発明は、1つの実施形態において、他のあらゆる型のコラーゲンのうちの1
種のコラーゲンに由来する組換えゼラチンを含むワクチン製剤を提供する。多様
な態様において、組換えゼラチンを含むワクチン製剤が提供され、ここで該組換
えゼラチンは組換えコラーゲンの加工により提供されるか、または改変されたコ
ラーゲン構築物から直接製造される。
種のコラーゲンに由来する組換えゼラチンを含むワクチン製剤を提供する。多様
な態様において、組換えゼラチンを含むワクチン製剤が提供され、ここで該組換
えゼラチンは組換えコラーゲンの加工により提供されるか、または改変されたコ
ラーゲン構築物から直接製造される。
【0029】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号15〜25、配列番号30、配
列番号31、および配列番号33からなる群より選択される配列を含むワクチン
製剤を包含する。
列番号31、および配列番号33からなる群より選択される配列を含むワクチン
製剤を包含する。
【0030】
本発明のワクチン製剤は、注射による送達、鼻腔からの送達、経口送達、経皮
送達、および肺深部送達を含む多様な方法による送達様式に適用することが可能
である。本発明のワクチン製剤は、例えば液体中、乾燥物、粉末、噴霧剤、およ
び吸入剤などの多くの方法で製剤することが可能である。多様な実施形態におい
て、本ワクチン製剤は、生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、
1回用量、複数回用量、コンジュゲート、核酸、DNA、複合、および無細胞性のワ
クチンを含むことができる。特定のワクチンが考えられ、ワクシニアウイルス(
スモールポックス)、ポリオウイルス(ソークおよびセービン)、流行性耳下腺
炎、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘帯状疱疹(ニワトリポックス/帯状
疱疹)、百日咳(whopping cough)、カルメット・ゲラン杆菌(BCG、結核)、
インフルエンザ菌、髄膜炎、狂犬病、コレラ、日本脳炎ウイルス、チフス菌、赤
痢菌、A型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペス
ウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイ
ルス、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス(マレク病)、インフルエンザおよび炭
疽病からなる群より選択される疾患の予防のためのワクチン製剤を含むが、それ
らに限定されない。
送達、および肺深部送達を含む多様な方法による送達様式に適用することが可能
である。本発明のワクチン製剤は、例えば液体中、乾燥物、粉末、噴霧剤、およ
び吸入剤などの多くの方法で製剤することが可能である。多様な実施形態におい
て、本ワクチン製剤は、生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、
1回用量、複数回用量、コンジュゲート、核酸、DNA、複合、および無細胞性のワ
クチンを含むことができる。特定のワクチンが考えられ、ワクシニアウイルス(
スモールポックス)、ポリオウイルス(ソークおよびセービン)、流行性耳下腺
炎、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘帯状疱疹(ニワトリポックス/帯状
疱疹)、百日咳(whopping cough)、カルメット・ゲラン杆菌(BCG、結核)、
インフルエンザ菌、髄膜炎、狂犬病、コレラ、日本脳炎ウイルス、チフス菌、赤
痢菌、A型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペス
ウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイ
ルス、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス(マレク病)、インフルエンザおよび炭
疽病からなる群より選択される疾患の予防のためのワクチン製剤を含むが、それ
らに限定されない。
【0031】
いくつかの実施形態において、本発明は組換えゼラチンを含むワクチン製剤を
提供し、ここで該組換えゼラチンは、1.000EU/mg、0.500EU/mg、0.050EU/mgおよ
び0.005EU/mgより低い内毒素(endotoxin)濃度を有する。1つの態様において、
本発明は、組換えゼラチンを含むワクチン製剤を包含し、該組換えゼラチンはタ
ンパク質分解に対して安定である。組換えゼラチンを含むワクチン安定剤は特に
意図される。本発明は、組換えゼラチンを含むワクチン製剤を生産する方法を提
供する。1つの実施形態において、該方法は組換えゼラチンの提供およびワクチ
ンの提供、ならびに組換えゼラチンとワクチンの混合が含まれる。被検体におい
て免疫応答を誘導する方法もまた提供され、その方法は該被検体への組換えゼラ
チンを含むワクチンの接種を含むものである。さらに、組換えゼラチンを含むワ
クチンおよびワクチンの送達デバイスを含むキットもまた意図される。様々な実
施形態において、送達デバイスは、例えば注射、鼻腔内、粘膜およびエアロゾル
送達に適したデバイスである。
提供し、ここで該組換えゼラチンは、1.000EU/mg、0.500EU/mg、0.050EU/mgおよ
び0.005EU/mgより低い内毒素(endotoxin)濃度を有する。1つの態様において、
本発明は、組換えゼラチンを含むワクチン製剤を包含し、該組換えゼラチンはタ
ンパク質分解に対して安定である。組換えゼラチンを含むワクチン安定剤は特に
意図される。本発明は、組換えゼラチンを含むワクチン製剤を生産する方法を提
供する。1つの実施形態において、該方法は組換えゼラチンの提供およびワクチ
ンの提供、ならびに組換えゼラチンとワクチンの混合が含まれる。被検体におい
て免疫応答を誘導する方法もまた提供され、その方法は該被検体への組換えゼラ
チンを含むワクチンの接種を含むものである。さらに、組換えゼラチンを含むワ
クチンおよびワクチンの送達デバイスを含むキットもまた意図される。様々な実
施形態において、送達デバイスは、例えば注射、鼻腔内、粘膜およびエアロゾル
送達に適したデバイスである。
【0032】発明の説明
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、および方法を説明する前に、本発明
はここに記載する特定の方法論、プロトコール、細胞系、ベクター、および試薬
に限定されるものでなく、これらは変更しうることが理解されよう。また、本明
細書中で用いる技術用語は特定の実施形態のみを説明するためのもので、本発明
の範囲を制限するものでないことを理解すべきである。
はここに記載する特定の方法論、プロトコール、細胞系、ベクター、および試薬
に限定されるものでなく、これらは変更しうることが理解されよう。また、本明
細書中で用いる技術用語は特定の実施形態のみを説明するためのもので、本発明
の範囲を制限するものでないことを理解すべきである。
【0033】
本明細書中で用いるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、特に指示し
ないかぎり、複数形への言及を含むことに留意すべきである。したがって、例え
ば、「宿主細胞(a host cell)」という記載は1以上のそのような宿主細胞およ
び当業者に公知のその等価物を意味し、「抗体(an antibody)」という記載は1
以上の抗体および当業者に公知のその等価物を指す、といった具合である。
ないかぎり、複数形への言及を含むことに留意すべきである。したがって、例え
ば、「宿主細胞(a host cell)」という記載は1以上のそのような宿主細胞およ
び当業者に公知のその等価物を意味し、「抗体(an antibody)」という記載は1
以上の抗体および当業者に公知のその等価物を指す、といった具合である。
【0034】
特に定義しないかぎり、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本
発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味を表す。本明細書中
に記載するものと類似のまたは同等の方法および材料はどれも本発明の実施また
は試験に使用することができるが、ここでは好適な方法、装置および材料につい
て記載する。本明細書に挙げた全ての刊行物は、本発明との関連において使用し
うる、刊行物に報告された細胞系、ベクター、および方法論を記載および開示す
ることを目的に、参考として本明細書に含めるものとする。本発明が先行発明に
よるそのような開示に先行する資格がないことを認めたものとして何事も解釈さ
れるべきでない。本明細書に引用した文献はそれぞれをそのまま参照によりここ
に組み入れるものとする。
発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味を表す。本明細書中
に記載するものと類似のまたは同等の方法および材料はどれも本発明の実施また
は試験に使用することができるが、ここでは好適な方法、装置および材料につい
て記載する。本明細書に挙げた全ての刊行物は、本発明との関連において使用し
うる、刊行物に報告された細胞系、ベクター、および方法論を記載および開示す
ることを目的に、参考として本明細書に含めるものとする。本発明が先行発明に
よるそのような開示に先行する資格がないことを認めたものとして何事も解釈さ
れるべきでない。本明細書に引用した文献はそれぞれをそのまま参照によりここ
に組み入れるものとする。
【0035】
本発明の実施には、特に示さないかぎり、当分野の技術の範囲内で、通常の化
学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬学的方法が用いられる。そ
のような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Gennaro, A.R.編 (1990)
Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co.; Colow
ick, S.ら編, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Ex
perimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編, 1986
, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T.ら編 (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press; Ausubel, F.M.ら編 (1999) Short Protocols in Molecular Bio
logy, 第4版, John Wiley & Sons; Reamら編 (1998) Molecular Biology Techni
ques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction
to Biotechniques Series), 第2版, (Newton & Graham編, 1997, Springer Ver
lag)を参照のこと。
学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬学的方法が用いられる。そ
のような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Gennaro, A.R.編 (1990)
Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co.; Colow
ick, S.ら編, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Ex
perimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編, 1986
, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T.ら編 (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press; Ausubel, F.M.ら編 (1999) Short Protocols in Molecular Bio
logy, 第4版, John Wiley & Sons; Reamら編 (1998) Molecular Biology Techni
ques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction
to Biotechniques Series), 第2版, (Newton & Graham編, 1997, Springer Ver
lag)を参照のこと。
【0036】定義
用語「コラーゲン」は、I型からXX型までのコラーゲンを含めて、既知のコラ
ーゲン型のいずれか1つ、ならびに、天然、合成、半合成、または組換えであろ
うとなかろうと、任意の他のコラーゲンを意味する。この用語はプロコラーゲン
も包含する。用語「コラーゲン」は、単一のポリヌクレオチドによりコードされ
る一本鎖ポリヌクレオチド、ならびにコラーゲン鎖のホモ三量体およびヘテロ三
量体のアセンブリを包含する。用語「コラーゲン」は特にその変異体および断片
、ならびにその機能的等価物および誘導体を包含し、それらはコラーゲンの少な
くとも1つの構造的または機能的特性、例えば(Gly-X-Y)nドメインを保持するこ
とが好ましい。
ーゲン型のいずれか1つ、ならびに、天然、合成、半合成、または組換えであろ
うとなかろうと、任意の他のコラーゲンを意味する。この用語はプロコラーゲン
も包含する。用語「コラーゲン」は、単一のポリヌクレオチドによりコードされ
る一本鎖ポリヌクレオチド、ならびにコラーゲン鎖のホモ三量体およびヘテロ三
量体のアセンブリを包含する。用語「コラーゲン」は特にその変異体および断片
、ならびにその機能的等価物および誘導体を包含し、それらはコラーゲンの少な
くとも1つの構造的または機能的特性、例えば(Gly-X-Y)nドメインを保持するこ
とが好ましい。
【0037】
用語「プロコラーゲン」は、I型からXX型コラーゲンのいずれか1つに対応す
るプロコラーゲン、ならびに、天然、合成、半合成、または組換えであろうとな
かろうと、三量体アセンブリ、溶解性、精製、または他の何らかの機能を補助し
、その後続いてN-プロテイナーゼ、C-プロテイナーゼ、または他の酵素(例えば
、コラーゲン産生と関連したタンパク質加水分解酵素)により切断されるC-末端
および/またはN-末端のプロペプチドまたはテロペプチドを保有する、他のいず
れかのコラーゲンに対応するプロコラーゲンを意味する。用語「プロコラーゲン
」は特にその変異体および断片、ならびにその機能的等価物および誘導体を包含
し、それらはコラーゲンの少なくとも1つの構造的または機能的特性、例えば(G
ly-X-Y)nドメインを保持することが好ましい。
るプロコラーゲン、ならびに、天然、合成、半合成、または組換えであろうとな
かろうと、三量体アセンブリ、溶解性、精製、または他の何らかの機能を補助し
、その後続いてN-プロテイナーゼ、C-プロテイナーゼ、または他の酵素(例えば
、コラーゲン産生と関連したタンパク質加水分解酵素)により切断されるC-末端
および/またはN-末端のプロペプチドまたはテロペプチドを保有する、他のいず
れかのコラーゲンに対応するプロコラーゲンを意味する。用語「プロコラーゲン
」は特にその変異体および断片、ならびにその機能的等価物および誘導体を包含
し、それらはコラーゲンの少なくとも1つの構造的または機能的特性、例えば(G
ly-X-Y)nドメインを保持することが好ましい。
【0038】
本明細書中で用いる「ゼラチン」とは、伝統的方法による抽出、、組換えまた
は生合成の如何に係わりなく、あらゆるゼラチンまたはゼラチンの少なくとも1
つの構造的および/または機能的特性を有する分子を意味する。ゼラチンは現在
例えば骨および組織のような動物源(ウシ、ブタ、げっ歯類、ニワトリ、ウマ、
魚など)に由来するコラーゲンからの抽出により得られている。用語「ゼラチン
」は、ゼラチン製品中に含まれる2以上のポリペプチドの組成物と、ゼラチン材
料に寄与する個々のポリペプチドとの両方を包含する。したがって、本発明に関
して用いられる用語「組換えゼラチン」は、本発明のゼラチンポリペプチドを含
む組換えゼラチン材料と、本発明の個々のゼラチンポリペプチドとの両方を包含
する。
は生合成の如何に係わりなく、あらゆるゼラチンまたはゼラチンの少なくとも1
つの構造的および/または機能的特性を有する分子を意味する。ゼラチンは現在
例えば骨および組織のような動物源(ウシ、ブタ、げっ歯類、ニワトリ、ウマ、
魚など)に由来するコラーゲンからの抽出により得られている。用語「ゼラチン
」は、ゼラチン製品中に含まれる2以上のポリペプチドの組成物と、ゼラチン材
料に寄与する個々のポリペプチドとの両方を包含する。したがって、本発明に関
して用いられる用語「組換えゼラチン」は、本発明のゼラチンポリペプチドを含
む組換えゼラチン材料と、本発明の個々のゼラチンポリペプチドとの両方を包含
する。
【0039】
ゼラチンが誘導され得るポリペプチドは、コラーゲン、プロコラーゲン、およ
びコラーゲンの少なくとも1つの構造的および/または機能的特性を有する他の
ポリペプチドのようなポリペプチドである。そのようなポリペプチドとして、例
えば、単一のコラーゲン鎖、またはコラーゲンのホモ三量体もしくはヘテロ三量
体、または少なくとも1つのコラーゲン性ドメイン(Gly-X-Y領域)を含むその
断片、誘導体、オリゴマー、ポリマーもしくはサブユニットが挙げられる。この
用語は特に、自然界には存在しない遺伝子工学的に作製された配列、例えば改変
コラーゲン構築物などを含む。改変コラーゲン構築物は、天然のコラーゲン遺伝
子から欠失、付加、置換、または他の変化により改変されている配列を含むポリ
ヌクレオチドである。
びコラーゲンの少なくとも1つの構造的および/または機能的特性を有する他の
ポリペプチドのようなポリペプチドである。そのようなポリペプチドとして、例
えば、単一のコラーゲン鎖、またはコラーゲンのホモ三量体もしくはヘテロ三量
体、または少なくとも1つのコラーゲン性ドメイン(Gly-X-Y領域)を含むその
断片、誘導体、オリゴマー、ポリマーもしくはサブユニットが挙げられる。この
用語は特に、自然界には存在しない遺伝子工学的に作製された配列、例えば改変
コラーゲン構築物などを含む。改変コラーゲン構築物は、天然のコラーゲン遺伝
子から欠失、付加、置換、または他の変化により改変されている配列を含むポリ
ヌクレオチドである。
【0040】
「アジュバント」は、薬物またはワクチンの効果を高める、改善する、または
他の方法で補助するために薬物またはワクチンに添加される物質である。ワクチ
ン製剤に用いられるアジュバントは、免疫応答の非特異的刺激因子をもたらすこ
とによって免疫応答を改善する免疫学的薬剤でありうる。アジュバントはしばし
ば生ワクチン以外のワクチンで用いられる。
他の方法で補助するために薬物またはワクチンに添加される物質である。ワクチ
ン製剤に用いられるアジュバントは、免疫応答の非特異的刺激因子をもたらすこ
とによって免疫応答を改善する免疫学的薬剤でありうる。アジュバントはしばし
ば生ワクチン以外のワクチンで用いられる。
【0041】
用語「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、遺伝子配列の別の形態を指
す。対立遺伝子は核酸配列の少なくとも1つの突然変異から生じ、改変されたmR
NAまたはポリペプチド(その構造または機能は改変されていても、されていなく
てもよい)をもたらす。いかなる所与の天然または組換え遺伝子も、対立遺伝子
形態を全くもたないか、1個または多数の対立遺伝子形態をもつことができる。
対立遺伝子を生じさせる通常の突然変異変化は一般に、ヌクレオチドの天然の欠
失、付加または置換のせいであるとされている。こうした種類の変化は、それぞ
れ単独でまたは他との組合せで、所与の配列中に1回以上起こることがある。
す。対立遺伝子は核酸配列の少なくとも1つの突然変異から生じ、改変されたmR
NAまたはポリペプチド(その構造または機能は改変されていても、されていなく
てもよい)をもたらす。いかなる所与の天然または組換え遺伝子も、対立遺伝子
形態を全くもたないか、1個または多数の対立遺伝子形態をもつことができる。
対立遺伝子を生じさせる通常の突然変異変化は一般に、ヌクレオチドの天然の欠
失、付加または置換のせいであるとされている。こうした種類の変化は、それぞ
れ単独でまたは他との組合せで、所与の配列中に1回以上起こることがある。
【0042】
「改変」ポリヌクレオチド配列には、個々のヌクレオチドの欠失、挿入または
置換を有するが、同一のまたは機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをもたらすものが含まれる。この定義には、特定のオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて、または対立遺伝子との不適切なまたは予期せざるハイブリ
ダイゼーションの欠如により、容易に検出できるまたはできない、対象ポリヌク
レオチド配列の正常な染色体の遺伝子座以外の遺伝子座を有する多形を示す配列
が含まれる。
置換を有するが、同一のまたは機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをもたらすものが含まれる。この定義には、特定のオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて、または対立遺伝子との不適切なまたは予期せざるハイブリ
ダイゼーションの欠如により、容易に検出できるまたはできない、対象ポリヌク
レオチド配列の正常な染色体の遺伝子座以外の遺伝子座を有する多形を示す配列
が含まれる。
【0043】
「改変」ポリペプチドは、サイレント変化を引き起こしかつ機能的に同等のポ
リペプチドをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含みうる。意図的
なアミノ酸置換は、アミノ酸残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、およ
び/または両親媒性の類似性に基づいて、コードされるポリペプチドの生物学的
または免疫学的活性が保持されるかぎり、行なうことができる。例えば、負に荷
電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミ
ノ酸にはリシンとアルギニンが含まれ、同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド
基をもつアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラ
ニン、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニン、およびフェニルアラニ
ンとチロシンが挙げられる。
リペプチドをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含みうる。意図的
なアミノ酸置換は、アミノ酸残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、およ
び/または両親媒性の類似性に基づいて、コードされるポリペプチドの生物学的
または免疫学的活性が保持されるかぎり、行なうことができる。例えば、負に荷
電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミ
ノ酸にはリシンとアルギニンが含まれ、同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド
基をもつアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラ
ニン、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニン、およびフェニルアラニ
ンとチロシンが挙げられる。
【0044】
本明細書中で用いる「アミノ酸」もしくは「ポリペプチド」配列、または「ポ
リペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質
配列、またはその断片を指し、そして天然に存在する分子であっても合成分子で
あってもよい。ポリペプチドまたはアミノ酸断片は、ポリペプチドの少なくとも
1つの構造的および/または機能的特性を保持するポリペプチドの任意の部分で
ある。本発明の少なくとも一つの実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも
1つの(Gly-X-Y)n領域を保持するものである。
リペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質
配列、またはその断片を指し、そして天然に存在する分子であっても合成分子で
あってもよい。ポリペプチドまたはアミノ酸断片は、ポリペプチドの少なくとも
1つの構造的および/または機能的特性を保持するポリペプチドの任意の部分で
ある。本発明の少なくとも一つの実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも
1つの(Gly-X-Y)n領域を保持するものである。
【0045】
用語「動物」は、例えば「動物コラーゲン」に関して用いるとき、天然、合成
、半合成、または組換えの如何に係わりなく、動物源に由来するあらゆるコラー
ゲンを包含する。動物源としては、例えば、ウシ、ブタ、げっ歯類、ウマ、ヒツ
ジを含むがこれらに限らない哺乳動物源、およびニワトリおよび魚ならびに非脊
椎動物を含むがこれらに限らない他の動物源がある。
、半合成、または組換えの如何に係わりなく、動物源に由来するあらゆるコラー
ゲンを包含する。動物源としては、例えば、ウシ、ブタ、げっ歯類、ウマ、ヒツ
ジを含むがこれらに限らない哺乳動物源、およびニワトリおよび魚ならびに非脊
椎動物を含むがこれらに限らない他の動物源がある。
【0046】
「抗原性」は、体内に導入したとき、免疫応答および抗体産生を刺激する物質
の能力に関係する。抗原性を示す物質は抗原性があると称される。抗原性物質と
しては、種々の巨大分子、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸
、細菌とその構成成分、およびウイルスとその構成成分が含まれるが、これらに
限らない。
の能力に関係する。抗原性を示す物質は抗原性があると称される。抗原性物質と
しては、種々の巨大分子、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸
、細菌とその構成成分、およびウイルスとその構成成分が含まれるが、これらに
限らない。
【0047】
本明細書で用いる用語「相補的」または「相補性」とは、塩基対合によるポリ
ヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A
」に結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」(核酸の一部のみが
結合する場合)であっても、完全(一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合
)であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーシ
ョンの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存す
る増幅反応、およびペプチド核酸(PNA)分子などの設計および使用において特に
重要である。
ヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A
」に結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」(核酸の一部のみが
結合する場合)であっても、完全(一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合
)であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーシ
ョンの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存す
る増幅反応、およびペプチド核酸(PNA)分子などの設計および使用において特に
重要である。
【0048】
「欠失」は、1個以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの非存在をもたらす
アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
【0049】
ポリヌクレオチドに適用する用語「誘導体」は、特定のポリペプチドをコード
する、または特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な、ポ
リヌクレオチドの化学的修飾体のことである。そのような修飾には、例えば、水
素のアルキル、アシルまたはアミノ基による置換が含まれる。ポリペプチドに関
して本明細書で用いる用語「誘導体」とは、例えば、ヒドロキシル化、グリコシ
ル化、PEG化(pegylation)、または同様のプロセスにより修飾されたポリペプチ
ドのことである。用語「誘導体」は、それが誘導される分子の構造的および/ま
たは機能的特性を少なくとも1つ含む分子を包含する。
する、または特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な、ポ
リヌクレオチドの化学的修飾体のことである。そのような修飾には、例えば、水
素のアルキル、アシルまたはアミノ基による置換が含まれる。ポリペプチドに関
して本明細書で用いる用語「誘導体」とは、例えば、ヒドロキシル化、グリコシ
ル化、PEG化(pegylation)、または同様のプロセスにより修飾されたポリペプチ
ドのことである。用語「誘導体」は、それが誘導される分子の構造的および/ま
たは機能的特性を少なくとも1つ含む分子を包含する。
【0050】
ある分子が通常はその分子の一部とはなり得ない追加の化学成分を含む場合、
その分子は別の分子の「キメラ誘導体」であるといえる。そのような化学成分は
分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。あるいはま
た、かかる成分はその分子の毒性を低下させたり、その分子の望ましくない副作
用を排除または低下させたり、などすることができる。そのような作用を媒介し
うる成分は一般に当分野で入手可能であり、例えば、Remington's Pharmaceutic
al Science(前掲)に見出すことができる。そのような成分を分子に連結するた
めの方法も当分野で公知である。
その分子は別の分子の「キメラ誘導体」であるといえる。そのような化学成分は
分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。あるいはま
た、かかる成分はその分子の毒性を低下させたり、その分子の望ましくない副作
用を排除または低下させたり、などすることができる。そのような作用を媒介し
うる成分は一般に当分野で入手可能であり、例えば、Remington's Pharmaceutic
al Science(前掲)に見出すことができる。そのような成分を分子に連結するた
めの方法も当分野で公知である。
【0051】
「賦形剤」とは、本明細書中で用いる場合、薬物、ワクチンまたは医薬組成物
に適当なコンシステンシーまたは形状を付与する目的で、薬物、ワクチンまたは
医薬組成物の製剤化の際に希釈剤またはビヒクルとして使用される不活性物質の
ことである。
に適当なコンシステンシーまたは形状を付与する目的で、薬物、ワクチンまたは
医薬組成物の製剤化の際に希釈剤またはビヒクルとして使用される不活性物質の
ことである。
【0052】
本明細書中で用いる「機能的均等物」または「機能的同等物」とは、特定のポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも1つの機能的および/または構
造的特性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。機能的均等物は
特定の機能の実施を可能にする修飾を含んでいてもよい。「機能的均等物」とい
う用語は、ある分子の断片、突然変異体、ハイブリッド、変異体、類似体、また
は化学的誘導体を含むものである。
リペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも1つの機能的および/または構
造的特性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。機能的均等物は
特定の機能の実施を可能にする修飾を含んでいてもよい。「機能的均等物」とい
う用語は、ある分子の断片、突然変異体、ハイブリッド、変異体、類似体、また
は化学的誘導体を含むものである。
【0053】
「融合タンパク質」は、異なるタンパク質に由来するペプチド配列が機能的に
連結されているタンパク質である。
連結されているタンパク質である。
【0054】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸配列が塩基対合によって相補的配列
に結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムア
ミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって規定されてお
り、当分野では周知である。ハイブリダイゼーションは様々なストリンジェンシ
ーの条件下で行なうことができる。
に結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムア
ミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって規定されてお
り、当分野では周知である。ハイブリダイゼーションは様々なストリンジェンシ
ーの条件下で行なうことができる。
【0055】
特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を下げるか、ホルムアミドの濃度を上
げるか、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって高めることが
できる。例えば、本発明の場合、高度のストリンジェンシー条件下でのハイブリ
ダイゼーションは約50%ホルムアミド中、約37〜42℃で行ない、低下したストリ
ンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは約35〜25%ホルムアミド中、
約30〜35℃で行なう。特に、ハイブリダイゼーションは最高のストリンジェンシ
ー条件、すなわち、50% ホルムアミド、5X SSPE、0.3% SDS、および200μg/ml
剪断・変性サケ精子DNA中42℃で行なう。
げるか、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって高めることが
できる。例えば、本発明の場合、高度のストリンジェンシー条件下でのハイブリ
ダイゼーションは約50%ホルムアミド中、約37〜42℃で行ない、低下したストリ
ンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは約35〜25%ホルムアミド中、
約30〜35℃で行なう。特に、ハイブリダイゼーションは最高のストリンジェンシ
ー条件、すなわち、50% ホルムアミド、5X SSPE、0.3% SDS、および200μg/ml
剪断・変性サケ精子DNA中42℃で行なう。
【0056】
特定レベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、当分野で公知の方法
、例えば、対象となる核酸のプリン対ピリミジン比を算出し、それに応じて温度
を調整することにより、さらに狭くすることができる。非特異的シグナルを除く
ために、例えば、0.1X SSCおよび0.5% SDSにまで次第にストリンジェンシーを高
めた条件下で室温にて、ブロットを連続的に洗浄することができる。上記範囲お
よび条件の変更は当分野で周知である。
、例えば、対象となる核酸のプリン対ピリミジン比を算出し、それに応じて温度
を調整することにより、さらに狭くすることができる。非特異的シグナルを除く
ために、例えば、0.1X SSCおよび0.5% SDSにまで次第にストリンジェンシーを高
めた条件下で室温にて、ブロットを連続的に洗浄することができる。上記範囲お
よび条件の変更は当分野で周知である。
【0057】
「免疫原性」は、生物の体内で免疫応答を引き出す能力に関係する。免疫原性
を示す物質は免疫原性があると称される。かかる物質には、限定するものではな
いが、種々の巨大分子、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸、
細菌とその構成成分、およびウイルスとその構成成分が含まれる。免疫原性物質
はかなりの高分子量(通常10kDaより大)であることが多い。
を示す物質は免疫原性があると称される。かかる物質には、限定するものではな
いが、種々の巨大分子、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、核酸、
細菌とその構成成分、およびウイルスとその構成成分が含まれる。免疫原性物質
はかなりの高分子量(通常10kDaより大)であることが多い。
【0058】
「感染力」は感染する能力または感染を生じさせる能力を指し、体内への細菌
やウイルスなどの微生物の侵入および増殖をいう。
やウイルスなどの微生物の侵入および増殖をいう。
【0059】
「挿入」または「付加」という用語は、天然の分子に比較して、1個以上のア
ミノ酸残基またはヌクレオチドが追加される、それぞれポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列の変化を指す。
ミノ酸残基またはヌクレオチドが追加される、それぞれポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列の変化を指す。
【0060】
本明細書中で用いる「単離された」とは、天然のタンパク質源中に存在するタ
ンパク質などからだけでなく、一般には他の成分からも分離されている分子を指
し、好ましくは、もしあるとすれば、溶媒、バッファー、イオン、または該分子
の溶液中に通常存在する他の成分だけが存在する状態の分子を指す。本明細書中
で用いる「単離された」および「精製された」はその天然源中に存在する分子を
含まない。
ンパク質などからだけでなく、一般には他の成分からも分離されている分子を指
し、好ましくは、もしあるとすれば、溶媒、バッファー、イオン、または該分子
の溶液中に通常存在する他の成分だけが存在する状態の分子を指す。本明細書中
で用いる「単離された」および「精製された」はその天然源中に存在する分子を
含まない。
【0061】
用語「マイクロアレイ」は、基体上に核酸、アミノ酸、抗体などを配置したも
のを指す。基体はどのような適当な支持体であってもよく、例えば、ビーズ、ガ
ラス、紙、ニトロセルロース、ナイロン、または任意の適切なメンブランなどで
ある。基体は硬質または半硬質の支持体であり、限定するものではないが、メン
ブラン、フィルター、ウェファー、チップ、スライド、繊維、ビーズ(磁性また
は非磁性ビーズ)、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微粒子、毛細管など
が含まれる。基体はコーティングのための表面を提供し、かつ/または、核酸や
アミノ酸などを結合させうる、例えば、ウェル、ピン、溝、チャンネル、細孔と
いった様々な表面形状をとることができる。
のを指す。基体はどのような適当な支持体であってもよく、例えば、ビーズ、ガ
ラス、紙、ニトロセルロース、ナイロン、または任意の適切なメンブランなどで
ある。基体は硬質または半硬質の支持体であり、限定するものではないが、メン
ブラン、フィルター、ウェファー、チップ、スライド、繊維、ビーズ(磁性また
は非磁性ビーズ)、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微粒子、毛細管など
が含まれる。基体はコーティングのための表面を提供し、かつ/または、核酸や
アミノ酸などを結合させうる、例えば、ウェル、ピン、溝、チャンネル、細孔と
いった様々な表面形状をとることができる。
【0062】
「微生物」という用語は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、クラミ
ジア、リケッチア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、真菌、および寄生体(原
生動物などの伝染性寄生虫を含む)を含むことができる。
ジア、リケッチア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、真菌、および寄生体(原
生動物などの伝染性寄生虫を含む)を含むことができる。
【0063】
用語「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」配列、または「ポリヌクレオチド
」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはそ
の断片、さらに、一本鎖でも二本鎖でもよく、センス鎖でもアンチセンス鎖でも
よい天然または合成起源のDNAまたはRNA、ペプチド核酸(PNA)、または天然また
は合成起源のDNA様もしくはRNA様物質を指す。ポリヌクレオチド断片はそのポリ
ヌクレオチドの少なくとも1つの構造的または機能的特性を保持するポリヌクレ
オチド配列の任意の部分である。本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチ
ド断片は少なくとも1つの(Gly-X-Y)n領域をコードするものである。ポリヌクレ
オチド断片は様々な長さのものであってよく、例えば、少なくとも60ヌクレオチ
ド長、少なくとも100ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド長、または
少なくとも10,000ヌクレオチド長でありうる。
」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはそ
の断片、さらに、一本鎖でも二本鎖でもよく、センス鎖でもアンチセンス鎖でも
よい天然または合成起源のDNAまたはRNA、ペプチド核酸(PNA)、または天然また
は合成起源のDNA様もしくはRNA様物質を指す。ポリヌクレオチド断片はそのポリ
ヌクレオチドの少なくとも1つの構造的または機能的特性を保持するポリヌクレ
オチド配列の任意の部分である。本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチ
ド断片は少なくとも1つの(Gly-X-Y)n領域をコードするものである。ポリヌクレ
オチド断片は様々な長さのものであってよく、例えば、少なくとも60ヌクレオチ
ド長、少なくとも100ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド長、または
少なくとも10,000ヌクレオチド長でありうる。
【0064】
「類似性パーセント」(類似性%)という語句は、2つ以上のポリペプチドま
たはポリヌクレオチド配列を比較したときに見出される配列類似性の百分率を指
す。類似性パーセントは当分野で周知の方法により決定することができる。例え
ば、アミノ酸配列同士の類似性パーセントはクラスター法を使って求められる(
例えば、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1988) Gene 73:237-244 を参照のこ
と)。クラスターアルゴリズムにより全ての対間の距離を調べることで、配列を
クラスターにグループ分けする。クラスターは対ごとに、続いてグループごとに
アライメントする。2つのアミノ酸配列、例えば、配列Aと配列B間の類似性パ
ーセントは、配列Aと配列B間で一致する残基の合計数を、配列Aの長さマイナ
ス(−)配列A中のギャップ残基の数マイナス(−)配列B中のギャップ残基の数で
割った値を100倍することにより算出される。2つのアミノ酸配列間の相同性が
低いかまたは無いギャップは類似性パーセントの決定に含めない。類似性パーセ
ントは当分野で知られた他の方法、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても計算でき、また、MEGALIGNプログラム(DNASTAR Inc., Madison
, Wisconsin)のようなプログラムを使ってコンピュータで計算することもできる
。
たはポリヌクレオチド配列を比較したときに見出される配列類似性の百分率を指
す。類似性パーセントは当分野で周知の方法により決定することができる。例え
ば、アミノ酸配列同士の類似性パーセントはクラスター法を使って求められる(
例えば、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1988) Gene 73:237-244 を参照のこ
と)。クラスターアルゴリズムにより全ての対間の距離を調べることで、配列を
クラスターにグループ分けする。クラスターは対ごとに、続いてグループごとに
アライメントする。2つのアミノ酸配列、例えば、配列Aと配列B間の類似性パ
ーセントは、配列Aと配列B間で一致する残基の合計数を、配列Aの長さマイナ
ス(−)配列A中のギャップ残基の数マイナス(−)配列B中のギャップ残基の数で
割った値を100倍することにより算出される。2つのアミノ酸配列間の相同性が
低いかまたは無いギャップは類似性パーセントの決定に含めない。類似性パーセ
ントは当分野で知られた他の方法、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても計算でき、また、MEGALIGNプログラム(DNASTAR Inc., Madison
, Wisconsin)のようなプログラムを使ってコンピュータで計算することもできる
。
【0065】
本明細書で用いる「植物」という用語は、1つ以上の植物、すなわち、真核独
立栄養生物、例えば、被子植物および裸子植物、単子葉植物および双子葉植物(
ダイズ、ワタ、アルファルファ、アマ、トマト、ビート、ヒマワリ、ジャガイモ
、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イネ、レタス、バナナ、キャッサバ、サフラ
ワー、ナタネ、オイルシード、マスタード、キャノーラ、タイマ、藻類、ケルプ
などを含むが、これらに限らない)などを指すことを含む。用語「植物」はまた
、1つ以上の植物細胞を包含する。「植物細胞」としては、限定するものではな
いが、栄養組織および器官、例えば、種子、懸濁培養物、胚、分裂領域、カルス
組織、葉、根、シュート、配偶体、芽胞体、花粉、塊茎、球茎、球根、花、果実
、球果、胞子などが挙げられる。
立栄養生物、例えば、被子植物および裸子植物、単子葉植物および双子葉植物(
ダイズ、ワタ、アルファルファ、アマ、トマト、ビート、ヒマワリ、ジャガイモ
、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イネ、レタス、バナナ、キャッサバ、サフラ
ワー、ナタネ、オイルシード、マスタード、キャノーラ、タイマ、藻類、ケルプ
などを含むが、これらに限らない)などを指すことを含む。用語「植物」はまた
、1つ以上の植物細胞を包含する。「植物細胞」としては、限定するものではな
いが、栄養組織および器官、例えば、種子、懸濁培養物、胚、分裂領域、カルス
組織、葉、根、シュート、配偶体、芽胞体、花粉、塊茎、球茎、球根、花、果実
、球果、胞子などが挙げられる。
【0066】
用語「翻訳後酵素」は、コラーゲンまたはプロコラーゲンなどの翻訳後修飾を
触媒する酵素を意味する。この用語は、限定するものではないが、例えば、プロ
リルヒドロキシラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、コラーゲンガラクト
シルヒドロキシリシルグルコシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシリシルガラク
トシルトランスフェラーゼ、C-プロテイナーゼ、N-プロテイナーゼ、リシルヒド
ロキシラーゼ、およびリシルオキシダーゼを包含する。
触媒する酵素を意味する。この用語は、限定するものではないが、例えば、プロ
リルヒドロキシラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、コラーゲンガラクト
シルヒドロキシリシルグルコシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシリシルガラク
トシルトランスフェラーゼ、C-プロテイナーゼ、N-プロテイナーゼ、リシルヒド
ロキシラーゼ、およびリシルオキシダーゼを包含する。
【0067】
本明細書で用いる「プロモーター」は、一般に、ポリヌクレオチド配列の転写
を開始させ、指令し、媒介することができる核酸配列の調節領域を指す。プロモ
ーターはさらに、転写速度に影響しうる上流または下流のプロモーターエレメン
トなどの認識配列を含むことができる。
を開始させ、指令し、媒介することができる核酸配列の調節領域を指す。プロモ
ーターはさらに、転写速度に影響しうる上流または下流のプロモーターエレメン
トなどの認識配列を含むことができる。
【0068】
「非構成プロモーター」という用語は、特定の組織を経て転写を誘導するか、
あるいは別のやり方で環境または発生制御下にあるプロモーターを指し、組織優
先的、組織特異的、細胞型特異的プロモーターなどの抑制および誘導プロモータ
ーを含む。そのようなプロモーターとしては、限定するものではないが、低酸素
症または寒冷ストレスにより誘導可能なAdH1プロモーター、熱ストレスにより誘
導可能なHsp70プロモーター、および光により誘導可能なPPDKプロモーターが挙
げられる。
あるいは別のやり方で環境または発生制御下にあるプロモーターを指し、組織優
先的、組織特異的、細胞型特異的プロモーターなどの抑制および誘導プロモータ
ーを含む。そのようなプロモーターとしては、限定するものではないが、低酸素
症または寒冷ストレスにより誘導可能なAdH1プロモーター、熱ストレスにより誘
導可能なHsp70プロモーター、および光により誘導可能なPPDKプロモーターが挙
げられる。
【0069】
「組織優先的」であるプロモーターは、特定の組織において優先的に転写を開
始するプロモーターである。「組織特異的」であるプロモーターは特定の組織に
おいてのみ転写を開始するプロモーターである。「細胞型特異的」プロモーター
は少なくとも1つの器官の特定の細胞型(例えば、血管細胞)における発現を主
に駆動するプロモーターである。
始するプロモーターである。「組織特異的」であるプロモーターは特定の組織に
おいてのみ転写を開始するプロモーターである。「細胞型特異的」プロモーター
は少なくとも1つの器官の特定の細胞型(例えば、血管細胞)における発現を主
に駆動するプロモーターである。
【0070】
「誘導」または「抑制」プロモーターは、例えば嫌気的条件、光の存在、生物
ストレスなどの環境条件により、または内部の化学的または生物学的シグナル(
例えば、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、AOX1およびAOX2メ
タノール誘導プロモーター)もしくは物理的損傷に応答して、転写が行なわれる
ように、環境の制御下にあるプロモーターである。
ストレスなどの環境条件により、または内部の化学的または生物学的シグナル(
例えば、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、AOX1およびAOX2メ
タノール誘導プロモーター)もしくは物理的損傷に応答して、転写が行なわれる
ように、環境の制御下にあるプロモーターである。
【0071】
本明細書で用いる「構成プロモーター」という用語は、転写を開始させ、指令
し、媒介するプロモーターを指し、ほとんどの環境条件および発生・細胞分化の
状態において活動性である。構成プロモーターの例は、限定するものではないが
、カリフラワーモザイクウイルス(CaMv)35S、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスのT-DNAから誘導された1'-または2'-プロモーター、ユビキチン1プロモ
ーター、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモータ
ー、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター、およびNosプロモータ
ーなどがある。
し、媒介するプロモーターを指し、ほとんどの環境条件および発生・細胞分化の
状態において活動性である。構成プロモーターの例は、限定するものではないが
、カリフラワーモザイクウイルス(CaMv)35S、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスのT-DNAから誘導された1'-または2'-プロモーター、ユビキチン1プロモ
ーター、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモータ
ー、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター、およびNosプロモータ
ーなどがある。
【0072】
本明細書中で用いる「精製された」という用語は、他の生物学的巨大分子(ポ
リヌクレオチド、タンパク質など)が実質的に存在しない状態で、示された分子
が存在することを意味する。この用語は好ましくは、対象の分子が溶液または組
成物中に少なくとも80重量%、好ましくは85重量%、より好ましくは少なくとも
95重量%、最も好ましくは少なくとも99.8重量%存在することを意図している。
水、バッファー、および他の小分子(特に、分子量が約1kDaより小さい分子)
が存在してもよい。
リヌクレオチド、タンパク質など)が実質的に存在しない状態で、示された分子
が存在することを意味する。この用語は好ましくは、対象の分子が溶液または組
成物中に少なくとも80重量%、好ましくは85重量%、より好ましくは少なくとも
95重量%、最も好ましくは少なくとも99.8重量%存在することを意図している。
水、バッファー、および他の小分子(特に、分子量が約1kDaより小さい分子)
が存在してもよい。
【0073】
「実質的に精製された」という用語は、本明細書中で用いるとき、その天然環
境から取り出され(単離または分離され)、かつそれがもともと結合していた他
の成分を60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上除かれている
核酸またはアミノ酸配列を指す。
境から取り出され(単離または分離され)、かつそれがもともと結合していた他
の成分を60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上除かれている
核酸またはアミノ酸配列を指す。
【0074】
「置換」は、1個以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、それぞれ異なるアミ
ノ酸またはヌクレオチドで置き換えることである。
ノ酸またはヌクレオチドで置き換えることである。
【0075】
本明細書中で用いる「トランスフェクション」という用語は、細胞に発現ベク
ターを導入するプロセスを指す。当分野では各種のトランスフェクション技法が
知られており、例えば、マイクロインジェクション、リポフェクション、または
遺伝子銃の使用がある。
ターを導入するプロセスを指す。当分野では各種のトランスフェクション技法が
知られており、例えば、マイクロインジェクション、リポフェクション、または
遺伝子銃の使用がある。
【0076】
本明細書で定義する「形質転換」は、外因性の核酸配列(例えば、DNA)がレ
シピエント細胞に入って、それを変化させるプロセスをいう。形質転換は当分野
で公知の種々の方法を使って天然のまたは人工的な条件下で行なうことができる
。外来核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入するための、どのような公知方
法で形質転換を行なってもよい。その方法は形質転換すべき宿主細胞の型に基づ
いて選択され、例えば、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、
リポフェクション、粒子ボンバードメントを含むが、これらに限らない。そのよ
うな「形質転換」細胞は、安定に形質転換された細胞(挿入されたDNAが自律複
製プラスミドまたは宿主染色体の一部として複製可能)を含み、さらに、挿入さ
れた核酸を限られた期間だけ一過性に発現する細胞も含む。
シピエント細胞に入って、それを変化させるプロセスをいう。形質転換は当分野
で公知の種々の方法を使って天然のまたは人工的な条件下で行なうことができる
。外来核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入するための、どのような公知方
法で形質転換を行なってもよい。その方法は形質転換すべき宿主細胞の型に基づ
いて選択され、例えば、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、
リポフェクション、粒子ボンバードメントを含むが、これらに限らない。そのよ
うな「形質転換」細胞は、安定に形質転換された細胞(挿入されたDNAが自律複
製プラスミドまたは宿主染色体の一部として複製可能)を含み、さらに、挿入さ
れた核酸を限られた期間だけ一過性に発現する細胞も含む。
【0077】
本明細書で用いる「ワクチン」という用語は、同様の実存物による将来の感染
を防止することを目的にして、特定の病気に対する免疫を生じさせるか、人工的
に増強するために投与される、死滅または改変した微生物、生存しているか弱毒
化された生物、生存していて十分に毒性のある生物、または他の物質(天然、合
成、または半合成のペプチド、タンパク質、生物学的巨大分子、または核酸を含
むが、これらに限らない)の製剤を指す。ワクチンは、生きているまたは不活化
した微生物または病原体(ウイルスや細菌を含む)だけでなく、合成、半合成も
しくは組換えDNAに基づくサブユニットを含むことができる。
を防止することを目的にして、特定の病気に対する免疫を生じさせるか、人工的
に増強するために投与される、死滅または改変した微生物、生存しているか弱毒
化された生物、生存していて十分に毒性のある生物、または他の物質(天然、合
成、または半合成のペプチド、タンパク質、生物学的巨大分子、または核酸を含
むが、これらに限らない)の製剤を指す。ワクチンは、生きているまたは不活化
した微生物または病原体(ウイルスや細菌を含む)だけでなく、合成、半合成も
しくは組換えDNAに基づくサブユニットを含むことができる。
【0078】
ワクチンは、1種の微生物もしくは病原体(例えば、ポリオウイルスワクチン
)または1種の微生物もしくは病原体の抗原から成る1価(単一の株/微生物/
疾患のワクチン)でありうる。また、ワクチンは2種以上の微生物もしくは病原
体(例えば、麻疹−流行性耳下腺炎−風疹(MMR)ワクチン)または2種以上の微
生物もしくは病原体の抗原から成る多価、例えば2価、3価など(混合ワクチン
)であってもよい。
)または1種の微生物もしくは病原体の抗原から成る1価(単一の株/微生物/
疾患のワクチン)でありうる。また、ワクチンは2種以上の微生物もしくは病原
体(例えば、麻疹−流行性耳下腺炎−風疹(MMR)ワクチン)または2種以上の微
生物もしくは病原体の抗原から成る多価、例えば2価、3価など(混合ワクチン
)であってもよい。
【0079】
生ワクチンは生きている微生物から調製される。弱毒化ワクチンは、実験動物
宿主または感染組織/細胞培養物内で物理的改変(放射線、温度条件付けなど)
もしくは連続継代を受けた微生物から調製される生ワクチンであり、そのような
処理は無毒性の株または毒性の低下した株をもたらすが、防御免疫を引き出す能
力は維持する。弱毒化生ワクチンの例として、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、イ
ヌ・ジステンパーがある。不活化ワクチンは、伝染性の微生物成分が、ウイルス
外被または細菌外膜タンパク質の抗原性または免疫原性に影響を及ぼすことなく
、例えば化学的または物理的処理(例えば、ホルマリン、β-プロピオラクトン
、またはγ線)により破壊されているワクチンである。不活化またはサブユニッ
トワクチンの例としては、インフルエンザ、A型肝炎、ポリオ(IPV)ワクチンが
ある。
宿主または感染組織/細胞培養物内で物理的改変(放射線、温度条件付けなど)
もしくは連続継代を受けた微生物から調製される生ワクチンであり、そのような
処理は無毒性の株または毒性の低下した株をもたらすが、防御免疫を引き出す能
力は維持する。弱毒化生ワクチンの例として、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、イ
ヌ・ジステンパーがある。不活化ワクチンは、伝染性の微生物成分が、ウイルス
外被または細菌外膜タンパク質の抗原性または免疫原性に影響を及ぼすことなく
、例えば化学的または物理的処理(例えば、ホルマリン、β-プロピオラクトン
、またはγ線)により破壊されているワクチンである。不活化またはサブユニッ
トワクチンの例としては、インフルエンザ、A型肝炎、ポリオ(IPV)ワクチンが
ある。
【0080】
サブユニットワクチンは、免疫応答の誘導に関与する、例えばウイルス、細菌
または他の病原体由来の重要な巨大分子から構成される。こうした成分はいくつ
かの方法により得ることができ、例えば、微生物からの精製、組換えDNA法によ
る生産などから得られる。サブユニットワクチンはあらゆる病原体の合成擬似物
を含むことができる。サブユニットワクチンは、巨大分子、例えば、細菌のタン
パク質毒素(例えば、破傷風、ジフテリア)、ウイルスのタンパク質(例えば、
インフルエンザウイルス由来)、莢膜をもつ細菌由来の多糖類(例えば、インフ
ルエンザ菌、肺炎球菌)、および組換えDNA法により産生されるウイルス様粒子
(例えば、B型肝炎表面抗原)などを含んでいてもよい。
または他の病原体由来の重要な巨大分子から構成される。こうした成分はいくつ
かの方法により得ることができ、例えば、微生物からの精製、組換えDNA法によ
る生産などから得られる。サブユニットワクチンはあらゆる病原体の合成擬似物
を含むことができる。サブユニットワクチンは、巨大分子、例えば、細菌のタン
パク質毒素(例えば、破傷風、ジフテリア)、ウイルスのタンパク質(例えば、
インフルエンザウイルス由来)、莢膜をもつ細菌由来の多糖類(例えば、インフ
ルエンザ菌、肺炎球菌)、および組換えDNA法により産生されるウイルス様粒子
(例えば、B型肝炎表面抗原)などを含んでいてもよい。
【0081】
合成ワクチンは、病原体の表面抗原を模倣した、免疫原性のある、小さな合成
ペプチドから作られたワクチンであり、また、組換えDNA法の助けをかりて製造
したワクチンであってもよく、全ウイルス(その核酸が改変されたもの)が含ま
れる。
ペプチドから作られたワクチンであり、また、組換えDNA法の助けをかりて製造
したワクチンであってもよく、全ウイルス(その核酸が改変されたもの)が含ま
れる。
【0082】
半合成ワクチンまたはコンジュゲートワクチンは、タンパク質キャリアー分子
に結合させた微生物由来の多糖抗原から成る。
に結合させた微生物由来の多糖抗原から成る。
【0083】
DNAワクチンは抗原をコードする組換えDNAベクターを含有し、コードされた抗
原が該DNAを取り込んだ宿主細胞において発現されると、コードされた抗原に対
する体液性または細胞性の免疫応答が引き出される。
原が該DNAを取り込んだ宿主細胞において発現されると、コードされた抗原に対
する体液性または細胞性の免疫応答が引き出される。
【0084】
様々な感染性物質に対してワクチンが開発されている。本発明は、関与する病
原体の如何にかかわらず、ワクチン製剤において使用することができる組換えゼ
ラチンに関する。したがって、本発明は実施例によって詳しく説明したワクチン
で使用することに限らない。ワクチンには、ワクシニアウイルス(スモールポッ
クス)、ポリオウイルス(ソーク(Salk)およびセービン(Sabin))、麻疹、流行性
耳下腺炎、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘−帯状疱疹(ニワトリポックス/帯
状ヘルペス)、百日咳、カルメット・ゲラン杆菌(BCG、結核)、インフルエン
ザ菌髄膜炎、狂犬病、コレラ、日本脳炎ウイルス、チフス菌、赤痢菌、A型肝炎
、B型肝炎、アデノウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペスウイルス、呼吸
シンシチアルウイルス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイルス、シチメン
チョウ・ヘルペスウイルス(マレク病)、インフルエンザ、および炭疽菌のワク
チンが含まれるが、これらに限らない。本明細書中で用いるワクチンという用語
は、すでに開発されているか、今後開発されるであろう各種感染症、自己免疫疾
患、癌に対するワクチン、例えば、HIV、HCV、マラリアに対するワクチン、およ
び乳癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌に対するワクチンのことも含める
ものとする。
原体の如何にかかわらず、ワクチン製剤において使用することができる組換えゼ
ラチンに関する。したがって、本発明は実施例によって詳しく説明したワクチン
で使用することに限らない。ワクチンには、ワクシニアウイルス(スモールポッ
クス)、ポリオウイルス(ソーク(Salk)およびセービン(Sabin))、麻疹、流行性
耳下腺炎、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘−帯状疱疹(ニワトリポックス/帯
状ヘルペス)、百日咳、カルメット・ゲラン杆菌(BCG、結核)、インフルエン
ザ菌髄膜炎、狂犬病、コレラ、日本脳炎ウイルス、チフス菌、赤痢菌、A型肝炎
、B型肝炎、アデノウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペスウイルス、呼吸
シンシチアルウイルス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイルス、シチメン
チョウ・ヘルペスウイルス(マレク病)、インフルエンザ、および炭疽菌のワク
チンが含まれるが、これらに限らない。本明細書中で用いるワクチンという用語
は、すでに開発されているか、今後開発されるであろう各種感染症、自己免疫疾
患、癌に対するワクチン、例えば、HIV、HCV、マラリアに対するワクチン、およ
び乳癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌に対するワクチンのことも含める
ものとする。
【0085】
ポリペプチドまたはアミノ酸「変異体」は、特定のアミノ酸配列から1個以上
のアミノ酸が変化したアミノ酸配列である。ポリペプチド変異体は保存的変化を
含んでもよく、その場合、置換用アミノ酸は置換されるアミノ酸と類似した構造
または化学的性質を有するもので、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換
である。変異体は非保存的変化を有していてもよく、この場合は、置換用アミノ
酸が置換されるアミノ酸と異なる物理的性質を有するもので、例えば、グリシン
のトリプトファンによる置換である。同様の小さな変化として、アミノ酸の欠失
もしくは挿入、または両方を含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸変異体は
特定のポリペプチドのある種の構造的または機能的特性を保持する。どのアミノ
酸が置換、挿入または欠失され得るかを決定する際のガイダンスがあり、例えば
、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR Inc., Madison, WI)のような当分野で公知の
コンピュータプログラムを使用することができる。
のアミノ酸が変化したアミノ酸配列である。ポリペプチド変異体は保存的変化を
含んでもよく、その場合、置換用アミノ酸は置換されるアミノ酸と類似した構造
または化学的性質を有するもので、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換
である。変異体は非保存的変化を有していてもよく、この場合は、置換用アミノ
酸が置換されるアミノ酸と異なる物理的性質を有するもので、例えば、グリシン
のトリプトファンによる置換である。同様の小さな変化として、アミノ酸の欠失
もしくは挿入、または両方を含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸変異体は
特定のポリペプチドのある種の構造的または機能的特性を保持する。どのアミノ
酸が置換、挿入または欠失され得るかを決定する際のガイダンスがあり、例えば
、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR Inc., Madison, WI)のような当分野で公知の
コンピュータプログラムを使用することができる。
【0086】
ポリヌクレオチド変異体は、特定のポリヌクレオチド配列に対して、好ましく
は少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なく
とも約95%のポリヌクレオチド配列類似性を有する、特定のポリヌクレオチド配
列の変異体である。当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、特定の
タンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチド配列を多数(その一部は既知の
天然遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)作製しうる
ことを理解するであろう。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づいて
組合せを選ぶことにより作製できるポリヌクレオチド配列の個々のあらゆる変異
を含むものである。これらの組合せは標準的なコドントリプレット遺伝子コード
に従って行なわれ、そのような変異すべてが具体的に開示されているとみなすべ
きである。
は少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なく
とも約95%のポリヌクレオチド配列類似性を有する、特定のポリヌクレオチド配
列の変異体である。当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、特定の
タンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチド配列を多数(その一部は既知の
天然遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)作製しうる
ことを理解するであろう。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づいて
組合せを選ぶことにより作製できるポリヌクレオチド配列の個々のあらゆる変異
を含むものである。これらの組合せは標準的なコドントリプレット遺伝子コード
に従って行なわれ、そのような変異すべてが具体的に開示されているとみなすべ
きである。
【0087】本発明
本発明は、組換えゼラチン、ならびに、これらのゼラチンの生産方法を提供す
る。本発明の組換えゼラチンは、性能が再現可能でありかつ改善されている、様
々な健康上のおよびその他の懸念事項に対処する。本発明の方法を用いれば、時
間がかかり、しかも苛酷な工程を通じて動物源からゼラチンを抽出するのではな
く、これを直接製造することができる。本発明の組換えゼラチンには、病原体、
例えば、病原菌、伝染性海綿状脳症(TSE)などが存在しない。本発明の方法は
、バラツキを最小限にし、既存の抽出方法で達成できない程度の再現性を可能に
する。
る。本発明の組換えゼラチンは、性能が再現可能でありかつ改善されている、様
々な健康上のおよびその他の懸念事項に対処する。本発明の方法を用いれば、時
間がかかり、しかも苛酷な工程を通じて動物源からゼラチンを抽出するのではな
く、これを直接製造することができる。本発明の組換えゼラチンには、病原体、
例えば、病原菌、伝染性海綿状脳症(TSE)などが存在しない。本発明の方法は
、バラツキを最小限にし、既存の抽出方法で達成できない程度の再現性を可能に
する。
【0088】
生じうる免疫原応答(例えば、抗原およびアレルギー反応)に関する懸念など
の安全性の問題が、動物由来の製品の使用に関して発生している。現在用いられ
ている動物源のゼラチン混合物を完全に特性決定し、精製し、または再現するこ
とは不可能であり、これが、製薬および医療の現場で進行中の課題である。これ
以外にも、抽出および精製工程から起こる細菌汚染や内毒素負荷に関して、安全
性に対する懸念がある。
の安全性の問題が、動物由来の製品の使用に関して発生している。現在用いられ
ている動物源のゼラチン混合物を完全に特性決定し、精製し、または再現するこ
とは不可能であり、これが、製薬および医療の現場で進行中の課題である。これ
以外にも、抽出および精製工程から起こる細菌汚染や内毒素負荷に関して、安全
性に対する懸念がある。
【0089】
本発明の組換えゼラチンは、細菌汚染や内毒素が実質的にないことから、上記
の懸念事項に対処するものである。さらに、天然ヒト配列から誘導したゼラチン
を使用すれば、非ヒト、すなわち、動物由来のタンパク質の使用による免疫応答
の危険性を排除できるため、本発明の組換えヒトゼラチンは、現在使用中の動物
由来のものに比して、明らかに利点を提供する。
の懸念事項に対処するものである。さらに、天然ヒト配列から誘導したゼラチン
を使用すれば、非ヒト、すなわち、動物由来のタンパク質の使用による免疫応答
の危険性を排除できるため、本発明の組換えヒトゼラチンは、現在使用中の動物
由来のものに比して、明らかに利点を提供する。
【0090】
さらに、本発明のゼラチンは、特定の用途のために最適化した特徴を備える多
様な個別の材料として生産することができる。こうして得られる製品は、動物を
供給源とする現在市販されているゼラチンに比べて、内部的にバラツキが少なく
、かつ均一である。
様な個別の材料として生産することができる。こうして得られる製品は、動物を
供給源とする現在市販されているゼラチンに比べて、内部的にバラツキが少なく
、かつ均一である。
【0091】
一実施形態では、本発明は、組換えゼラチンを提供する。このゼラチンは、限
定するものではないが、ヒト、ウシ、ブタ、ウマおよび魚類などの様々な種に由
来する配列、あるいは、非脊椎動物種由来の配列を用いて生産することができる
。本発明のゼラチンは、既存の製造方法によるゼラチン製品と比較して、純度が
高く、しかも、タンパク質負荷、ならびに、内毒素や、核酸、多糖類、プリオン
といった他の汚染物質のレベルが低い。従って、本発明のゼラチンは、既存の方
法により製造されたゼラチンと比較して、使用するのに安全であり、負の副作用
のリスクを最小限に抑えながら、これまでより高い用量で、ヒトや動物に投与し
たり、あるいは、摂取させたりすることができる。
定するものではないが、ヒト、ウシ、ブタ、ウマおよび魚類などの様々な種に由
来する配列、あるいは、非脊椎動物種由来の配列を用いて生産することができる
。本発明のゼラチンは、既存の製造方法によるゼラチン製品と比較して、純度が
高く、しかも、タンパク質負荷、ならびに、内毒素や、核酸、多糖類、プリオン
といった他の汚染物質のレベルが低い。従って、本発明のゼラチンは、既存の方
法により製造されたゼラチンと比較して、使用するのに安全であり、負の副作用
のリスクを最小限に抑えながら、これまでより高い用量で、ヒトや動物に投与し
たり、あるいは、摂取させたりすることができる。
【0092】
本発明のゼラチンは、特定の用途にあわせて最適化した特性を備えて、直接生
産することができ、これによって、ゼラチンを使用しかつ製剤化する能力が改善
されるため、市販のゼラチンと比べて、活性および加工性が高い。現在、動物源
から抽出されているゼラチンは、所与のバッチまたはサンプル全体を通じて、分
子量が広範囲で、不均質な製品であるのに対し、本発明のゼラチンは、バラツキ
が少なく、均質かつ再現可能な製品である。
産することができ、これによって、ゼラチンを使用しかつ製剤化する能力が改善
されるため、市販のゼラチンと比べて、活性および加工性が高い。現在、動物源
から抽出されているゼラチンは、所与のバッチまたはサンプル全体を通じて、分
子量が広範囲で、不均質な製品であるのに対し、本発明のゼラチンは、バラツキ
が少なく、均質かつ再現可能な製品である。
【0093】
本発明の組換えゼラチンは、様々な方法で生産することができる。一方法では
、組換えゼラチンは、組換えコラーゲンのプロセシングにより生産する(例えば
、実施例7、10および11を参照)。別の方法では、組換えゼラチンは、改変した
コラーゲン構築物、すなわち、少なくとも1つのコラーゲン性ドメインをコード
するが、天然のコラーゲンはコードしないポリヌクレオチドを含む構築物の発現
から、直接生産する(例えば、実施例1、4および6を参照)。別の実施形態で
は、組換えゼラチンは、完全長の天然コラーゲンまたはプロコラーゲンではなく
、少なくとも1つのコラーゲン性ドメインを含むポリペプチドから誘導する(例
えば、配列番号15〜25、30、31および33を参照)。また、組換えゼラチンは、さ
らにN末端またはC末端プロペプチドを含んだ配列からなるものでもよい(例えば
、配列番号26〜29を参照)。
、組換えゼラチンは、組換えコラーゲンのプロセシングにより生産する(例えば
、実施例7、10および11を参照)。別の方法では、組換えゼラチンは、改変した
コラーゲン構築物、すなわち、少なくとも1つのコラーゲン性ドメインをコード
するが、天然のコラーゲンはコードしないポリヌクレオチドを含む構築物の発現
から、直接生産する(例えば、実施例1、4および6を参照)。別の実施形態で
は、組換えゼラチンは、完全長の天然コラーゲンまたはプロコラーゲンではなく
、少なくとも1つのコラーゲン性ドメインを含むポリペプチドから誘導する(例
えば、配列番号15〜25、30、31および33を参照)。また、組換えゼラチンは、さ
らにN末端またはC末端プロペプチドを含んだ配列からなるものでもよい(例えば
、配列番号26〜29を参照)。
【0094】
別の実施形態では、本発明の組換えゼラチンは、組換えコラーゲンまたはプロ
コラーゲンから誘導する。コラーゲン分子は、一般に、(Gly-X-Y-)n反復配列
を含むポリペプチド鎖の三量体アセンブリから得られ、該反復配列が通常の生物
学的条件下で、三重らせんドメインの形成を可能にする(例えば、van der Rest
ら(1991), FASEB J. 5:2814-2823を参照)。現在、約20種のコラーゲン型が、
ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヒトなどの脊椎動物コラーゲンで確認され
ている。多種多様な天然コラーゲンの構造および生物学的機能の詳細な説明は、
例えばAyadら、The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press、カリ
フォルニア州サンディエゴ;Burgeson, R. E.およびNimmi(1992)「コラーゲン
型:分子構造と組織分布(Collagen types: Molecular Structure and Tissue Di
stribution)」, Clin. Orthop. 282:250-272;Kielty, C. M.ら(1993)「コラ
ーゲンファミリー:構造、アセンブリおよび細胞外マトリックスにおける構成(T
he Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracel
luar Matrix)」, Connective tissue And Its Heritable Disorder, Molecular
Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M.およびSteinmann, B.編、Wiley-
Liss, ニューヨーク州、pp. 103-147;ならびに、ProckopおよびKivirikko(199
5)「コラーゲン:分子生物学、疾病、および治療への可能性(Collagens: Molec
ular biology, diseases, and potentials for therapy)」, Annu Rev Biochem
64:403-434)にみいだすことができる。
コラーゲンから誘導する。コラーゲン分子は、一般に、(Gly-X-Y-)n反復配列
を含むポリペプチド鎖の三量体アセンブリから得られ、該反復配列が通常の生物
学的条件下で、三重らせんドメインの形成を可能にする(例えば、van der Rest
ら(1991), FASEB J. 5:2814-2823を参照)。現在、約20種のコラーゲン型が、
ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヒトなどの脊椎動物コラーゲンで確認され
ている。多種多様な天然コラーゲンの構造および生物学的機能の詳細な説明は、
例えばAyadら、The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press、カリ
フォルニア州サンディエゴ;Burgeson, R. E.およびNimmi(1992)「コラーゲン
型:分子構造と組織分布(Collagen types: Molecular Structure and Tissue Di
stribution)」, Clin. Orthop. 282:250-272;Kielty, C. M.ら(1993)「コラ
ーゲンファミリー:構造、アセンブリおよび細胞外マトリックスにおける構成(T
he Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracel
luar Matrix)」, Connective tissue And Its Heritable Disorder, Molecular
Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M.およびSteinmann, B.編、Wiley-
Liss, ニューヨーク州、pp. 103-147;ならびに、ProckopおよびKivirikko(199
5)「コラーゲン:分子生物学、疾病、および治療への可能性(Collagens: Molec
ular biology, diseases, and potentials for therapy)」, Annu Rev Biochem
64:403-434)にみいだすことができる。
【0095】
I型コラーゲンは、生物の全コラーゲンの約80〜90%を占める骨および皮膚の
主要な繊維性コラーゲンである。I型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリ
ックスに存在する主要な構造巨大分子であり、全タンパク質量の約20%を占めて
いる。I型コラーゲンは、2本のα1(I)鎖と1本のα2(I)鎖とからなるヘテロ三
量体分子であり、これらの鎖は、それぞれ、COL1A1およびCOL1A2遺伝子によりコ
ードされる。その他の型のコラーゲンは、I型コラーゲンほど豊富ではなく、様
々な分布パターンを示す。例えば、II型コラーゲンは、軟骨およびガラス体液中
の主要コラーゲンであるのに対し、III型コラーゲンは、血管に高レベルで存在
するが、皮膚にはそれより低いレベルで存在する。
主要な繊維性コラーゲンである。I型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリ
ックスに存在する主要な構造巨大分子であり、全タンパク質量の約20%を占めて
いる。I型コラーゲンは、2本のα1(I)鎖と1本のα2(I)鎖とからなるヘテロ三
量体分子であり、これらの鎖は、それぞれ、COL1A1およびCOL1A2遺伝子によりコ
ードされる。その他の型のコラーゲンは、I型コラーゲンほど豊富ではなく、様
々な分布パターンを示す。例えば、II型コラーゲンは、軟骨およびガラス体液中
の主要コラーゲンであるのに対し、III型コラーゲンは、血管に高レベルで存在
するが、皮膚にはそれより低いレベルで存在する。
【0096】
III型コラーゲンは、皮膚および血管組織に存在する主要な繊維性コラーゲン
である。III型コラーゲンは、COL3A1遺伝子によりコードされる3本の同じα1(I
II)鎖からなるホモ三量体である。組織から各種コラーゲンを精製する方法は、
例えば、Byersら(1974)Biochemistry 13:5243-5248;およびMillerおよびPhod
es(1982)Methods in Enzymology 82:33-64にみいだすことができる。
である。III型コラーゲンは、COL3A1遺伝子によりコードされる3本の同じα1(I
II)鎖からなるホモ三量体である。組織から各種コラーゲンを精製する方法は、
例えば、Byersら(1974)Biochemistry 13:5243-5248;およびMillerおよびPhod
es(1982)Methods in Enzymology 82:33-64にみいだすことができる。
【0097】
翻訳後酵素は、プロコラーゲンおよびコラーゲンの生合成に重要である。例え
ば、プロリル4-ヒドロキシラーゼは、細胞によるプロコラーゲンまたはコラーゲ
ンの合成に必要な翻訳後酵素である。この酵素は、反復Gly-X-Y配列のY-位置に
おけるプロリル残基を4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化する(例えば、Pr
ockopら(1984)N.Engl. J. Med. 311:376-386)。適切な数のY-位置プロリル残
基が、プロリル4-ヒドロキシラーゼにより4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル
化されない限り、新しく合成された鎖は、安定した三重らせんコンホメーション
を維持することができない。さらに、ヒドロキシル化がまったく起こらないか、
不十分なヒドロキシル化が起こった場合には、そのポリペプチドが適正に分泌さ
れず、変性する恐れがある。
ば、プロリル4-ヒドロキシラーゼは、細胞によるプロコラーゲンまたはコラーゲ
ンの合成に必要な翻訳後酵素である。この酵素は、反復Gly-X-Y配列のY-位置に
おけるプロリル残基を4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化する(例えば、Pr
ockopら(1984)N.Engl. J. Med. 311:376-386)。適切な数のY-位置プロリル残
基が、プロリル4-ヒドロキシラーゼにより4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル
化されない限り、新しく合成された鎖は、安定した三重らせんコンホメーション
を維持することができない。さらに、ヒドロキシル化がまったく起こらないか、
不十分なヒドロキシル化が起こった場合には、そのポリペプチドが適正に分泌さ
れず、変性する恐れがある。
【0098】
脊椎動物のプロリル4-ヒドロキシラーゼはα2β2四量体である(例えば、Berg
およびProckop(1973)J. Biol. Chem. 248:1175-1192;およびTudermanら(197
5)Eur. J. Biochem. 52:9-16を参照)。αサブユニットは、プロリル残基のヒ
ドロキシル化に関与する触媒部位を含むが、βサブユニットの不在下では不溶性
である。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼであるβサブユニットは、チオー
ル/ジスルフィドの相互交換を触媒し、これによって、安定したタンパク質を確
立するのに必須のジスルフィド結合が形成される。βサブユニットは、プロリル
4-ヒドロキシラーゼ四量体の一部を成す場合には、タンパク質ジスルフィドイソ
メラーゼ活性の50%を保持する(例えば、Pihlajaniemiら(1987)Embo J. 6:64
3-649;Parkkonenら(1988)Biochem. J. 256:1005-1011;およびKoivuら(1987
)J. Biol. Chem. 262:6447-6449を参照)。
およびProckop(1973)J. Biol. Chem. 248:1175-1192;およびTudermanら(197
5)Eur. J. Biochem. 52:9-16を参照)。αサブユニットは、プロリル残基のヒ
ドロキシル化に関与する触媒部位を含むが、βサブユニットの不在下では不溶性
である。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼであるβサブユニットは、チオー
ル/ジスルフィドの相互交換を触媒し、これによって、安定したタンパク質を確
立するのに必須のジスルフィド結合が形成される。βサブユニットは、プロリル
4-ヒドロキシラーゼ四量体の一部を成す場合には、タンパク質ジスルフィドイソ
メラーゼ活性の50%を保持する(例えば、Pihlajaniemiら(1987)Embo J. 6:64
3-649;Parkkonenら(1988)Biochem. J. 256:1005-1011;およびKoivuら(1987
)J. Biol. Chem. 262:6447-6449を参照)。
【0099】
活性組換えヒトプロリル4-ヒドロキシラーゼは、αおよびβサブユニットを同
時に発現させることにより、例えば、Sf9昆虫細胞および酵母細胞で生産されて
きた(例えば、Vuoriら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7467-7470;米
国特許第5,593,859号を参照)。プロリル4-ヒドロキシラーゼ以外にも、他のコ
ラーゲン翻訳後酵素が同定されて、文献に報告されており、このような酵素とし
て、Cプロテイナーゼ、Nプロテイナーゼ、リシルオキシダーゼ、リシルヒドロキ
シラーゼなどが挙げられる(例えば、Olsenら(1991)Cell Biology of Extrace
llular Matrix、第2版、Hay編、Plenum Press、ニューヨーク州を参照)。
時に発現させることにより、例えば、Sf9昆虫細胞および酵母細胞で生産されて
きた(例えば、Vuoriら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7467-7470;米
国特許第5,593,859号を参照)。プロリル4-ヒドロキシラーゼ以外にも、他のコ
ラーゲン翻訳後酵素が同定されて、文献に報告されており、このような酵素とし
て、Cプロテイナーゼ、Nプロテイナーゼ、リシルオキシダーゼ、リシルヒドロキ
シラーゼなどが挙げられる(例えば、Olsenら(1991)Cell Biology of Extrace
llular Matrix、第2版、Hay編、Plenum Press、ニューヨーク州を参照)。
【0100】
本発明は、特に、本発明の組換えゼラチンに、必要に応じて、ヒドロキシル化
(例えば、プロリンヒドロキシル化および/またはリシルヒドロキシル化)を付
与する、あらゆる生物学的または化学的化合物の使用を包含する。これらには、
例えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの各種イソ型、ならびに、天然、合成、も
しくは半合成に拘わらず、所望の活性を有するプロリル4-ヒドロキシラーゼの変
異体または断片もしくはサブユニットを含む、内因的または外因的に供給される
、あらゆる種由来のプロリル4-ヒドロキシラーゼ、ならびに、プロリル3-ヒドロ
キシラーゼなどの他のヒドロキシラーゼが挙げられる(例えば、本明細書に参照
によりその全文が組み込まれる米国特許第5,928,922号を参照)。一実施形態で
は、プロリルヒドロキシラーゼ活性は、組換えゼラチンをコードするか、あるい
は、組換えゼラチンを誘導することができるポリペプチドをコードする、ポリヌ
クレオチドと同じ種に由来するプロリルヒドロキシラーゼにより付与される。さ
らに別の実施形態では、プロリル4-ヒドロキシラーゼはヒト由来のものであり、
コードポリヌクレオチドがヒト配列から誘導される。
(例えば、プロリンヒドロキシル化および/またはリシルヒドロキシル化)を付
与する、あらゆる生物学的または化学的化合物の使用を包含する。これらには、
例えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの各種イソ型、ならびに、天然、合成、も
しくは半合成に拘わらず、所望の活性を有するプロリル4-ヒドロキシラーゼの変
異体または断片もしくはサブユニットを含む、内因的または外因的に供給される
、あらゆる種由来のプロリル4-ヒドロキシラーゼ、ならびに、プロリル3-ヒドロ
キシラーゼなどの他のヒドロキシラーゼが挙げられる(例えば、本明細書に参照
によりその全文が組み込まれる米国特許第5,928,922号を参照)。一実施形態で
は、プロリルヒドロキシラーゼ活性は、組換えゼラチンをコードするか、あるい
は、組換えゼラチンを誘導することができるポリペプチドをコードする、ポリヌ
クレオチドと同じ種に由来するプロリルヒドロキシラーゼにより付与される。さ
らに別の実施形態では、プロリル4-ヒドロキシラーゼはヒト由来のものであり、
コードポリヌクレオチドがヒト配列から誘導される。
【0101】
本発明は、ゼラチンの熱可塑性を操作することにより、所望の物理的特性を備
えた材料を生産する方法を提供する。一方法では、特定の哺乳動物または昆虫細
胞、もしくはトランスジェニック動物、あるいは植物または植物細胞などの、内
在性プロリルヒドロキシラーゼまたはそれ以外のヒドロキシラーゼを有する宿主
系において、コードポリヌクレオチドを発現させる。このような系で、本発明は
、広範な比率のヒドロキシル化を有する組換えゼラチンの混合物(すなわち、非
ヒドロキシル化、部分的ヒドロキシル化、および完全ヒドロキシル化部分)を生
産する方法を提供する。
えた材料を生産する方法を提供する。一方法では、特定の哺乳動物または昆虫細
胞、もしくはトランスジェニック動物、あるいは植物または植物細胞などの、内
在性プロリルヒドロキシラーゼまたはそれ以外のヒドロキシラーゼを有する宿主
系において、コードポリヌクレオチドを発現させる。このような系で、本発明は
、広範な比率のヒドロキシル化を有する組換えゼラチンの混合物(すなわち、非
ヒドロキシル化、部分的ヒドロキシル化、および完全ヒドロキシル化部分)を生
産する方法を提供する。
【0102】
例えば、ヒドロキシル化率が広範な組換えゼラチンを生産する一方法では、例
えば、トランスジェニック動物における内在性プロリルヒドロキシラーゼにより
ヒドロキシル化が付与され、ヒドロキシル化率の分布は、非ヒドロキシル化から
、完全ヒドロキシル化までの範囲にあり、生産された材料の融解温度は、28℃〜
36℃であり、中央値Tmは約30℃〜32℃である。所望であれば、上記材料の様々な
画分を温度勾配に従って単離することができ、これは、下流での使用で、例えば
体温(37℃)で三重らせん構造を保持するため十分にヒドロキシル化されたもの
など、より十分にヒドロキシル化された材料を選択しなければならない場合に必
要となるであろう。
えば、トランスジェニック動物における内在性プロリルヒドロキシラーゼにより
ヒドロキシル化が付与され、ヒドロキシル化率の分布は、非ヒドロキシル化から
、完全ヒドロキシル化までの範囲にあり、生産された材料の融解温度は、28℃〜
36℃であり、中央値Tmは約30℃〜32℃である。所望であれば、上記材料の様々な
画分を温度勾配に従って単離することができ、これは、下流での使用で、例えば
体温(37℃)で三重らせん構造を保持するため十分にヒドロキシル化されたもの
など、より十分にヒドロキシル化された材料を選択しなければならない場合に必
要となるであろう。
【0103】
別の実施形態では、例えば、トランスジェニック動物などの系で組換えゼラチ
ンを生産するが、その際、ヒドロキシル化を外因性プロリルヒドロキシラーゼで
補う。一実施形態では、組換えゼラチンを生産する方法により、非ヒドロキシル
化から完全ヒドロキシル化までの範囲の組換えゼラチンが得られる。内在性プロ
リルヒドロキシラーゼの存在下だけで生産された組換え材料よりも、外因性プロ
リルヒドロキシラーゼの存在下で生産された組換え材料の方が、十分にヒドロキ
シル化された組換えゼラチンの画分の比率が大きくなる。従って、生産された材
料の融点は、例えば、28〜40℃の範囲であり、中央値Tmは約34℃〜36℃である。
このようなゼラチン混合物は、様々なヒドロキシル化度を有する部分の分画化や
単離の必要がなく、ゲルカプセル製造などの各種用途で使用するのに適している
。
ンを生産するが、その際、ヒドロキシル化を外因性プロリルヒドロキシラーゼで
補う。一実施形態では、組換えゼラチンを生産する方法により、非ヒドロキシル
化から完全ヒドロキシル化までの範囲の組換えゼラチンが得られる。内在性プロ
リルヒドロキシラーゼの存在下だけで生産された組換え材料よりも、外因性プロ
リルヒドロキシラーゼの存在下で生産された組換え材料の方が、十分にヒドロキ
シル化された組換えゼラチンの画分の比率が大きくなる。従って、生産された材
料の融点は、例えば、28〜40℃の範囲であり、中央値Tmは約34℃〜36℃である。
このようなゼラチン混合物は、様々なヒドロキシル化度を有する部分の分画化や
単離の必要がなく、ゲルカプセル製造などの各種用途で使用するのに適している
。
【0104】
前記方法により、ある範囲の融解温度をもつ組換え材料の生産が可能になり、
これらの材料は、例えば温度勾配を用いて、特定の温度(例えば、36℃)で固体
の材料を、特定の温度で液体の材料から分離することにより、容易に分割するこ
とができる。さらに、本発明は、分離することなく、大量用途での使用に適した
材料を生産する経済的な方法を提供する。例えば、ゲルカプセルの製造に、前記
方法により生産された組換えゼラチンを使用するが、ある範囲の融解温度を有す
る組換え材料は33℃付近の所望の融解温度を有し、このようなゼラチンは体温で
融解するため嚥下および消化に好適である。本発明の方法では、組換えゼラチン
は、所望の系、例えば、トランスジェニック動物で直接生産する、あるいは、所
望の系で生産された組換えコラーゲンから、例えば、酸、熱もしくは酵素を用い
た加水分解により、誘導することができる。
これらの材料は、例えば温度勾配を用いて、特定の温度(例えば、36℃)で固体
の材料を、特定の温度で液体の材料から分離することにより、容易に分割するこ
とができる。さらに、本発明は、分離することなく、大量用途での使用に適した
材料を生産する経済的な方法を提供する。例えば、ゲルカプセルの製造に、前記
方法により生産された組換えゼラチンを使用するが、ある範囲の融解温度を有す
る組換え材料は33℃付近の所望の融解温度を有し、このようなゼラチンは体温で
融解するため嚥下および消化に好適である。本発明の方法では、組換えゼラチン
は、所望の系、例えば、トランスジェニック動物で直接生産する、あるいは、所
望の系で生産された組換えコラーゲンから、例えば、酸、熱もしくは酵素を用い
た加水分解により、誘導することができる。
【0105】
一実施形態では、本発明は、組換えコラーゲンを生産し、該組換えコラーゲン
から組換えゼラチンを誘導することを含んでなる、組換えゼラチンの生産方法を
提供する。一態様では、この方法は、コラーゲンまたはプロコラーゲンまたはそ
の断片もしくは変異体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列と、
コラーゲン翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする少なくとも1つのポ
リヌクレオチドの発現を含む(例えば、本明細書に参照によりその全文が組み込
まれる米国特許第5,593,859号を参照)。本発明の組換えゼラチンは、当業者に
は公知の方法を用いて、組換えコラーゲンから誘導することができる(例えば、
Veis(1965)Int Rev Connect Tissue Res, 3:113-200を参照)。例えば、コラ
ーゲンからゼラチンへの抽出方法すべてに共通する特徴は、コラーゲンタンパク
質の二次構造の消失であり、ほとんどの場合、コラーゲン構造の改変である。本
発明のゼラチンを生産するのに用いられるコラーゲンは、所望するゼラチンの型
に応じて、様々な方法を用いて処理加工することができる。
から組換えゼラチンを誘導することを含んでなる、組換えゼラチンの生産方法を
提供する。一態様では、この方法は、コラーゲンまたはプロコラーゲンまたはそ
の断片もしくは変異体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列と、
コラーゲン翻訳後酵素またはそのサブユニットをコードする少なくとも1つのポ
リヌクレオチドの発現を含む(例えば、本明細書に参照によりその全文が組み込
まれる米国特許第5,593,859号を参照)。本発明の組換えゼラチンは、当業者に
は公知の方法を用いて、組換えコラーゲンから誘導することができる(例えば、
Veis(1965)Int Rev Connect Tissue Res, 3:113-200を参照)。例えば、コラ
ーゲンからゼラチンへの抽出方法すべてに共通する特徴は、コラーゲンタンパク
質の二次構造の消失であり、ほとんどの場合、コラーゲン構造の改変である。本
発明のゼラチンを生産するのに用いられるコラーゲンは、所望するゼラチンの型
に応じて、様々な方法を用いて処理加工することができる。
【0106】
本発明のゼラチンは、組換えにより生産されたコラーゲンまたはプロコラーゲ
ンまたはその他のコラーゲン性ポリペプチドから、あるいは、細胞培養物、例え
ば脊椎動物細胞培養物から、当業者には公知の多様な方法により誘導することが
できる。例えば、高温での溶解性、ならびに、低または高pH、低または高塩濃度
、および高温の条件下での安定性といったゼラチンの利点を利用して、細胞塊ま
たは培養基から直接誘導することもできる。コラーゲンからゼラチン組成物を生
産する方法、工程および技法としては、高温にてタンパク質加水分解酵素で消化
する、界面活性剤、熱またはその他の当業者には公知の変性剤を用いてコラーゲ
ンの三重らせん構造を変性する、などがある。さらに、石灰または酸による処理
、水溶液中での熱抽出、イオン交換クロマトグラフィー、クロスフローろ過、な
らびに、各種乾燥法を含む、動物または屠畜場供給源からゼラチンを抽出するた
めの様々な工程を用いて、組換えコラーゲンから本発明のゼラチンを誘導するこ
とができる。
ンまたはその他のコラーゲン性ポリペプチドから、あるいは、細胞培養物、例え
ば脊椎動物細胞培養物から、当業者には公知の多様な方法により誘導することが
できる。例えば、高温での溶解性、ならびに、低または高pH、低または高塩濃度
、および高温の条件下での安定性といったゼラチンの利点を利用して、細胞塊ま
たは培養基から直接誘導することもできる。コラーゲンからゼラチン組成物を生
産する方法、工程および技法としては、高温にてタンパク質加水分解酵素で消化
する、界面活性剤、熱またはその他の当業者には公知の変性剤を用いてコラーゲ
ンの三重らせん構造を変性する、などがある。さらに、石灰または酸による処理
、水溶液中での熱抽出、イオン交換クロマトグラフィー、クロスフローろ過、な
らびに、各種乾燥法を含む、動物または屠畜場供給源からゼラチンを抽出するた
めの様々な工程を用いて、組換えコラーゲンから本発明のゼラチンを誘導するこ
とができる。
【0107】
一態様では、本発明のゼラチンは変性された三重らせんからなり、少なくとも
1つのコラーゲンサブユニット、コラーゲン鎖、またはその断片を含む。特定の
コラーゲン鎖、サブユニット、またはその断片内のGly-X-Y単位は、同じでも違
っていてもよい。好ましくは、XおよびYは、プロリンまたはヒドロキシプロリ
ンのいずれかであり、構成鎖のほぼ第3残基位置ごとにグリシンが現れる。Xお
よびYのアミノ酸はプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、各Gly-X-Y単位
は同じでも異なっていてもよい。別の実施形態では、本発明の組換えゼラチンは
、(Gly-X-Y)nのアミノ酸配列を含み、ここでXおよびYは任意のアミノ酸であ
る。
1つのコラーゲンサブユニット、コラーゲン鎖、またはその断片を含む。特定の
コラーゲン鎖、サブユニット、またはその断片内のGly-X-Y単位は、同じでも違
っていてもよい。好ましくは、XおよびYは、プロリンまたはヒドロキシプロリ
ンのいずれかであり、構成鎖のほぼ第3残基位置ごとにグリシンが現れる。Xお
よびYのアミノ酸はプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、各Gly-X-Y単位
は同じでも異なっていてもよい。別の実施形態では、本発明の組換えゼラチンは
、(Gly-X-Y)nのアミノ酸配列を含み、ここでXおよびYは任意のアミノ酸であ
る。
【0108】
一実施形態では、本発明のゼラチンは、他の型のコラーゲンを実質的に一切含
まない1つの型の組換えコラーゲンから誘導される。一態様では、組換えコラー
ゲンはI型コラーゲンである。別の態様では、組換えコラーゲンはIII型コラーゲ
ンである。本発明の別の実施形態では、組換えコラーゲンはヒト組換えコラーゲ
ンである。組換えコラーゲンがいずれか1つの型のコラーゲン、例えば、I型〜X
X型コラーゲンのいずれか1つ、またはその他の天然、合成もしくは半合成コラ
ーゲンのいずれかである本発明のさらに別の実施形態が特に考えられる。組換え
ゼラチンがI型〜XX型コラーゲン、またはその他の天然、合成もしくは半合成コ
ラーゲンのいずれか1種以上からなる特定の混合物から誘導される実施形態が特
に考えられる。
まない1つの型の組換えコラーゲンから誘導される。一態様では、組換えコラー
ゲンはI型コラーゲンである。別の態様では、組換えコラーゲンはIII型コラーゲ
ンである。本発明の別の実施形態では、組換えコラーゲンはヒト組換えコラーゲ
ンである。組換えコラーゲンがいずれか1つの型のコラーゲン、例えば、I型〜X
X型コラーゲンのいずれか1つ、またはその他の天然、合成もしくは半合成コラ
ーゲンのいずれかである本発明のさらに別の実施形態が特に考えられる。組換え
ゼラチンがI型〜XX型コラーゲン、またはその他の天然、合成もしくは半合成コ
ラーゲンのいずれか1種以上からなる特定の混合物から誘導される実施形態が特
に考えられる。
【0109】
組換えゼラチンを生産する本発明の方法には、ゼラチン抽出の伝統的方法と比
べて、いくつかの利点がある。最も重要なことは、本発明が、天然のコラーゲン
配列を含む、信頼性の高い、非組織のゼラチン供給源を提供することである。さ
らに、既存の抽出方法では、様々な医療用途での使用に有利なヒトゼラチンの天
然供給源を獲得することができない。本発明は、特に、ヒト配列から誘導された
組換えゼラチン、組換えヒトゼラチンを含む組成物、ならびに、これらのゼラチ
ンの生産方法を提供する。組換えヒトゼラチンは、製薬および医療のプロセスで
用いられるように非免疫原性であるため、その多様な用途が考えられる。
べて、いくつかの利点がある。最も重要なことは、本発明が、天然のコラーゲン
配列を含む、信頼性の高い、非組織のゼラチン供給源を提供することである。さ
らに、既存の抽出方法では、様々な医療用途での使用に有利なヒトゼラチンの天
然供給源を獲得することができない。本発明は、特に、ヒト配列から誘導された
組換えゼラチン、組換えヒトゼラチンを含む組成物、ならびに、これらのゼラチ
ンの生産方法を提供する。組換えヒトゼラチンは、製薬および医療のプロセスで
用いられるように非免疫原性であるため、その多様な用途が考えられる。
【0110】
別の態様では、本発明は、様々な形態のゼラチンを発現することができる、遺
伝子工学的に作製された構築物からの上記ゼラチンの生産を提供する。この発明
は、特に、組換えプロリルヒドロキシラーゼと、非天然コラーゲン構築物などの
各種合成構築物を用いて、ゼラチンを生産する方法に関する。さらに、本発明は
、特定の用途に必要とされる特定の性質を備えるように設計することができる組
換えゼラチンを提供する。また、これらのゼラチンの生産方法も提供する。既存
の方法を用いて、所望のゲル強度、粘度、融解特性、等電点プロファイル、pH、
ヒドロキシル化度、アミノ酸組成、臭い、色などを備えたゼラチンを生産するこ
とができる。本発明に従う一方法では、非ヒドロキシル化ゼラチンを生産し、必
要に応じて、その後に完全または部分的にヒドロキシル化することが可能である
。
伝子工学的に作製された構築物からの上記ゼラチンの生産を提供する。この発明
は、特に、組換えプロリルヒドロキシラーゼと、非天然コラーゲン構築物などの
各種合成構築物を用いて、ゼラチンを生産する方法に関する。さらに、本発明は
、特定の用途に必要とされる特定の性質を備えるように設計することができる組
換えゼラチンを提供する。また、これらのゼラチンの生産方法も提供する。既存
の方法を用いて、所望のゲル強度、粘度、融解特性、等電点プロファイル、pH、
ヒドロキシル化度、アミノ酸組成、臭い、色などを備えたゼラチンを生産するこ
とができる。本発明に従う一方法では、非ヒドロキシル化ゼラチンを生産し、必
要に応じて、その後に完全または部分的にヒドロキシル化することが可能である
。
【0111】ゼラチンの特性
ゼラチンの様々な物理的特性が、特定の用途におけるその有用性を決定する。
ゼラチンは、例えば、その両性の性質、熱可逆ゲルを形成する能力、保護コロイ
ドおよび界面活性特性、粘性および安定性への寄与に基づく固有の性能を提供す
る。様々な用途において、ゼラチンは、例えば、乳化剤、増粘剤、もしくは安定
剤;フィルムまたはコーティング形成剤;結合剤;接着剤またはグルー;あるい
は、凝集剤として使用されている。
ゼラチンは、例えば、その両性の性質、熱可逆ゲルを形成する能力、保護コロイ
ドおよび界面活性特性、粘性および安定性への寄与に基づく固有の性能を提供す
る。様々な用途において、ゼラチンは、例えば、乳化剤、増粘剤、もしくは安定
剤;フィルムまたはコーティング形成剤;結合剤;接着剤またはグルー;あるい
は、凝集剤として使用されている。
【0112】
原料、予備処理の種類、および抽出工程のすべてが、従来の製造で得られるゼ
ラチンポリペプチドの組成に影響を与える。従って、現在入手可能な動物由来の
製品は、ポリペプチド鎖の不均質タンパク質混合物である。ゼラチン分子はかな
り大きく、特定のサンプル内の分子量は2,3kDaから数百kDaまでの範囲である。
特定ロットのゼラチンの分子量分布は、例えば、ゼラチンサンプルの粘度および
/またはゲル強度に影響を与える可能性があるため、非常に重要になることがあ
る。
ラチンポリペプチドの組成に影響を与える。従って、現在入手可能な動物由来の
製品は、ポリペプチド鎖の不均質タンパク質混合物である。ゼラチン分子はかな
り大きく、特定のサンプル内の分子量は2,3kDaから数百kDaまでの範囲である。
特定ロットのゼラチンの分子量分布は、例えば、ゼラチンサンプルの粘度および
/またはゲル強度に影響を与える可能性があるため、非常に重要になることがあ
る。
【0113】
一般に、ゼラチン溶液の粘度は、濃度が増加し、温度が低下するにつれ、高く
なる。例えば、ゼラチンを安定剤または増粘剤として用いる場合には、粘土が高
い溶液の方が好ましい。用途によっては、例えば、各種乳化液などに含まれるよ
うな、液体ゼラチンが好ましい。ゼラチン溶液の粘度は、ゼラチン成分の分子量
が増加するほど高くなる。従って、高粘度ゼラチン溶液は、高濃度の低分子量ゼ
ラチンか、あるいは、低濃度の高分子量ゼラチンから構成されることになる。粘
度はまた、硬化および融点などのゲル特性に影響を与える。高粘度ゼラチン溶液
は、低粘度ゼラチン溶液に比べて、融解および硬化速度が高いゲルをもたらす。
なる。例えば、ゼラチンを安定剤または増粘剤として用いる場合には、粘土が高
い溶液の方が好ましい。用途によっては、例えば、各種乳化液などに含まれるよ
うな、液体ゼラチンが好ましい。ゼラチン溶液の粘度は、ゼラチン成分の分子量
が増加するほど高くなる。従って、高粘度ゼラチン溶液は、高濃度の低分子量ゼ
ラチンか、あるいは、低濃度の高分子量ゼラチンから構成されることになる。粘
度はまた、硬化および融点などのゲル特性に影響を与える。高粘度ゼラチン溶液
は、低粘度ゼラチン溶液に比べて、融解および硬化速度が高いゲルをもたらす。
【0114】
ゼラチンの熱可逆性および熱可塑性は、多くの用途(例えば、ゲルカプセルお
よび錠剤の製造)において利用される特性である。ゼラチンを加熱し、必要に応
じて成形または造形した後、冷却することにより、ホメオスタティック温度で固
有の特性を有するカプセルまたは錠剤コーティングを形成することができる。こ
のようなゼラチンは、口内温度で溶解し始め、嚥下がしやすく、体温で液体とな
る。
よび錠剤の製造)において利用される特性である。ゼラチンを加熱し、必要に応
じて成形または造形した後、冷却することにより、ホメオスタティック温度で固
有の特性を有するカプセルまたは錠剤コーティングを形成することができる。こ
のようなゼラチンは、口内温度で溶解し始め、嚥下がしやすく、体温で液体とな
る。
【0115】
様々なゲル強度のゼラチンが、各種用途での使用に適している。硬化したゲル
の堅さまたは強度は、典型的には、国際的基準および方法を用いて決定しうるブ
ルーム(Bloom)値を計算することにより測定する。手短に言えば、ブルーム強
度は、一定温度浴中に18時間浸漬した6.67%ゼラチン溶液により形成されたゲル
の強度の測定値である。標準的テクスチャー分析装置を用いて、標準AOAC(Asso
ciation of Official Agricultural Chemists)プランジャー4mmをゲル中に降
下させるのに要する重量(グラム)を測定する。プランジャーの降下に要した重
量(グラム)が200グラムであったとすると、その特定ゼラチンのブルーム値は2
00であることになる(例えば、米国薬局方およびOfficial Methods of Analysis
of AOAC International、第17版、第II巻を参照)。
の堅さまたは強度は、典型的には、国際的基準および方法を用いて決定しうるブ
ルーム(Bloom)値を計算することにより測定する。手短に言えば、ブルーム強
度は、一定温度浴中に18時間浸漬した6.67%ゼラチン溶液により形成されたゲル
の強度の測定値である。標準的テクスチャー分析装置を用いて、標準AOAC(Asso
ciation of Official Agricultural Chemists)プランジャー4mmをゲル中に降
下させるのに要する重量(グラム)を測定する。プランジャーの降下に要した重
量(グラム)が200グラムであったとすると、その特定ゼラチンのブルーム値は2
00であることになる(例えば、米国薬局方およびOfficial Methods of Analysis
of AOAC International、第17版、第II巻を参照)。
【0116】
このように、市販のゼラチンはブルーム強度に基づいて格付けされ、販売され
る。ゼラチンの各種用途に応じて、様々な範囲のブルーム値が適している。例え
ば、各種工業用途、例えば、コンクリート安定化、砂型鋳物、鋳型、グルー、コ
ーティングなどに使用するゼラチンは、所望の性能特性に応じて、広範なブルー
ム強度のゼラチンから選択する。広範なブルーム強度を有するゼラチンは、各種
医薬品の製造においても望ましい。例えば、ソフトゲルカプセルは、ブルーム値
が約150〜175の骨質(ossein)または皮膚ゼラチンおよび/またはブルーム値が約
190〜210のブタ由来のゼラチン、もしくはそれらのブレンドを用いて製造される
のに対し、ハードゲルカプセルには、ブルーム値が約220〜260のゼラチンが用い
られるであろう。食品用途では、マシュマロまたはその他の菓子製品に用いられ
る増粘剤としてのゼラチンは約250のブルーム強度をもつ。写真用途における特
定の乳化液や、各種工業用コーティングなどの様々な用途では、非ゲル化ゼラチ
ンの使用が必要とされる。
る。ゼラチンの各種用途に応じて、様々な範囲のブルーム値が適している。例え
ば、各種工業用途、例えば、コンクリート安定化、砂型鋳物、鋳型、グルー、コ
ーティングなどに使用するゼラチンは、所望の性能特性に応じて、広範なブルー
ム強度のゼラチンから選択する。広範なブルーム強度を有するゼラチンは、各種
医薬品の製造においても望ましい。例えば、ソフトゲルカプセルは、ブルーム値
が約150〜175の骨質(ossein)または皮膚ゼラチンおよび/またはブルーム値が約
190〜210のブタ由来のゼラチン、もしくはそれらのブレンドを用いて製造される
のに対し、ハードゲルカプセルには、ブルーム値が約220〜260のゼラチンが用い
られるであろう。食品用途では、マシュマロまたはその他の菓子製品に用いられ
る増粘剤としてのゼラチンは約250のブルーム強度をもつ。写真用途における特
定の乳化液や、各種工業用コーティングなどの様々な用途では、非ゲル化ゼラチ
ンの使用が必要とされる。
【0117】
本発明は、様々なブルーム強度を有する組換えゼラチンの生産を可能にする。
一態様では、本発明は、例えば、ブルーム強度が約50、100、150、200、250およ
び300のゼラチンの製造を可能にする。一実施形態では、本発明は、ブルーム強
度が約400の組換えゼラチンの生産を可能にする。このようなゼラチンは、例え
ば、ゲルカプセルの製造に用いることができ、十分な強度のゲルを提供するのに
必要な材料が少なくてすむことから、これまでより軽くかつ薄いカプセルの製造
が可能になる。また、ブルーム強度が100より低い、および0〜100の組換えゼラ
チンも考えられる。
一態様では、本発明は、例えば、ブルーム強度が約50、100、150、200、250およ
び300のゼラチンの製造を可能にする。一実施形態では、本発明は、ブルーム強
度が約400の組換えゼラチンの生産を可能にする。このようなゼラチンは、例え
ば、ゲルカプセルの製造に用いることができ、十分な強度のゲルを提供するのに
必要な材料が少なくてすむことから、これまでより軽くかつ薄いカプセルの製造
が可能になる。また、ブルーム強度が100より低い、および0〜100の組換えゼラ
チンも考えられる。
【0118】
本発明は、特定の用途に所望される物理的特性を備えた組換えゼラチンを設計
する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、特定の分子量または分子量範
囲を有する均質な分子からなる組換えゼラチン、ならびに、これらの組換えゼラ
チンの生産方法を提供する。このような均質かつ均一材料は、予想可能な性能を
備えた製品の信頼性の高い供給源を提供し、製品性能および製造パラメーターの
バラツキを最小限にする点で、有利である。現在、特定の分子量または分子量範
囲によってもたらされる粘度またはゲル強度など、所望の物理的特性を備えた混
合物を生産するためには、様々なロットからのゼラチンをブレンドしなければな
らない場合がある。
する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、特定の分子量または分子量範
囲を有する均質な分子からなる組換えゼラチン、ならびに、これらの組換えゼラ
チンの生産方法を提供する。このような均質かつ均一材料は、予想可能な性能を
備えた製品の信頼性の高い供給源を提供し、製品性能および製造パラメーターの
バラツキを最小限にする点で、有利である。現在、特定の分子量または分子量範
囲によってもたらされる粘度またはゲル強度など、所望の物理的特性を備えた混
合物を生産するためには、様々なロットからのゼラチンをブレンドしなければな
らない場合がある。
【0119】
特定の分子量の組換えゼラチンよりも、特定の分子量範囲の組換えゼラチンの
方が好ましい用途において、本発明は、このような材料を提供する。本発明の組
換えゼラチンを用いて、製造者は、例えば、指定された分子量のロットからの組
換えゼラチンを特定の比率で混合して、所望の分子量範囲を有する混合物を得る
ことができる。さらに、本発明の組換えゼラチンは、現在市販されている製品と
比較して、本質的に均質性が高く、バラツキが少ない。本発明の一方法では、酸
または熱加水分解などで組換えコラーゲンを処理加工することにより、現在入手
可能なゼラチン製品より分子量範囲が狭い組換えゼラチンが得られる。適切かつ
制御可能な加水分解条件を用いたところ、本発明の方法により、市販のゼラチン
と分子量分布が類似した組換えヒトゼラチン、ならびに、市販の製品より分子量
範囲が狭い組換えゼラチンが得られた(実施例9および10参照)。
方が好ましい用途において、本発明は、このような材料を提供する。本発明の組
換えゼラチンを用いて、製造者は、例えば、指定された分子量のロットからの組
換えゼラチンを特定の比率で混合して、所望の分子量範囲を有する混合物を得る
ことができる。さらに、本発明の組換えゼラチンは、現在市販されている製品と
比較して、本質的に均質性が高く、バラツキが少ない。本発明の一方法では、酸
または熱加水分解などで組換えコラーゲンを処理加工することにより、現在入手
可能なゼラチン製品より分子量範囲が狭い組換えゼラチンが得られる。適切かつ
制御可能な加水分解条件を用いたところ、本発明の方法により、市販のゼラチン
と分子量分布が類似した組換えヒトゼラチン、ならびに、市販の製品より分子量
範囲が狭い組換えゼラチンが得られた(実施例9および10参照)。
【0120】
本発明は、均一の分子量、もしくは指定された範囲の分子量の組換えゼラチン
を提供し、バラツキや予測不能性を排除することにより、工程の微細な調節を可
能にすると同時に、予測可能な挙動を得ることができる。本発明の方法により、
あらゆる所望の分子量または所望範囲の分子量の組換えゼラチンを生産すること
ができる。例えば、一実施形態では、組換えゼラチンは分子量が300 kDaを超え
る。別の実施形態では、組換えゼラチンの分子量範囲は約150〜250 kDaまたは約
250〜350 kDaである。上記以外の分子量範囲が特に考えられており、限定するも
のではないが、下記の分子量範囲がある:約0〜50 kDa、約50〜100 kDa、約100
〜150 kDa、約150〜200 kDa、約200〜250 kDa、約250〜300 kDa、約300〜350 kD
a。
を提供し、バラツキや予測不能性を排除することにより、工程の微細な調節を可
能にすると同時に、予測可能な挙動を得ることができる。本発明の方法により、
あらゆる所望の分子量または所望範囲の分子量の組換えゼラチンを生産すること
ができる。例えば、一実施形態では、組換えゼラチンは分子量が300 kDaを超え
る。別の実施形態では、組換えゼラチンの分子量範囲は約150〜250 kDaまたは約
250〜350 kDaである。上記以外の分子量範囲が特に考えられており、限定するも
のではないが、下記の分子量範囲がある:約0〜50 kDa、約50〜100 kDa、約100
〜150 kDa、約150〜200 kDa、約200〜250 kDa、約250〜300 kDa、約300〜350 kD
a。
【0121】
別の態様では、いくつかの市販のゼラチンと類似した分子量(約10〜70 kDa)
の組換えゼラチンを生産することができる。好ましい実施形態では、本発明は、
市販の製品では現在入手できない、分子量範囲が狭い、例えば、約10〜30 kDa、
約30〜50 kDa、約50〜70 kDaの組換えゼラチンを提供する。具体的実施形態では
、意図する用途に適した特定の性質を付与する鎖長の組換えゼラチンが提供され
る。本発明の様々な実施形態では、約1kDa、5kDa、8kDa、9kDa、14 kDa、16
kDa、22 kDa、23 kDaおよび44 kDaの均一な分子量を有する組換えゼラチンが考
慮される(例えば、表2参照)。
の組換えゼラチンを生産することができる。好ましい実施形態では、本発明は、
市販の製品では現在入手できない、分子量範囲が狭い、例えば、約10〜30 kDa、
約30〜50 kDa、約50〜70 kDaの組換えゼラチンを提供する。具体的実施形態では
、意図する用途に適した特定の性質を付与する鎖長の組換えゼラチンが提供され
る。本発明の様々な実施形態では、約1kDa、5kDa、8kDa、9kDa、14 kDa、16
kDa、22 kDa、23 kDaおよび44 kDaの均一な分子量を有する組換えゼラチンが考
慮される(例えば、表2参照)。
【0122】
特に、本発明の一方法では、短縮されたコラーゲン配列、例えば、表2に示し
た配列からゼラチンを生産する。これらの配列は特定のコラーゲン性ドメインを
表示し、短い形態のゼラチンをコードする。
た配列からゼラチンを生産する。これらの配列は特定のコラーゲン性ドメインを
表示し、短い形態のゼラチンをコードする。
【0123】
本発明のゼラチンは、通常誘導される動物ゼラチンと比べて、低いまたは高い
平均分子量をもちながら、ゼラチンの有用な物理的特性、例えば、皮膜形成能を
保持することができる。例えば、コラーゲン、コラーゲン鎖、サブユニットもし
くはその断片の変性、あるいは、ヒドロキシル化度の変更など、コラーゲン配列
の様々な修飾を実施することにより、特定の物理的特性、すなわち、従来のゼラ
チンより高いまたは低い融点、多様なアミノ酸組成、特定の分子量または分子量
範囲などを有するゼラチンを生産することができ、本明細書では、特に、このよ
うな変異体が意図される。
平均分子量をもちながら、ゼラチンの有用な物理的特性、例えば、皮膜形成能を
保持することができる。例えば、コラーゲン、コラーゲン鎖、サブユニットもし
くはその断片の変性、あるいは、ヒドロキシル化度の変更など、コラーゲン配列
の様々な修飾を実施することにより、特定の物理的特性、すなわち、従来のゼラ
チンより高いまたは低い融点、多様なアミノ酸組成、特定の分子量または分子量
範囲などを有するゼラチンを生産することができ、本明細書では、特に、このよ
うな変異体が意図される。
【0124】
I型コラーゲンのような典型的繊維形成コラーゲン分子の分子量は300 kDaであ
る。高分子量ゼラチンを用いる用途では、現在入手可能な抽出ゼラチンより高い
分子量のゼラチンを生産するのが望ましい場合がある。従って、本発明の一実施
形態では、コラーゲン(現在、市販のゼラチンはコラーゲンから抽出する)より
も大きな分子を含むゼラチンを生産することができる。こうして得られる分子量
の高いゼラチン製品は、その物理的特性が望ましい様々な用途で直接使用するこ
とができ、あるいは、分割した後処理することにより、さらに小さなサイズの分
子の生産も可能である。
る。高分子量ゼラチンを用いる用途では、現在入手可能な抽出ゼラチンより高い
分子量のゼラチンを生産するのが望ましい場合がある。従って、本発明の一実施
形態では、コラーゲン(現在、市販のゼラチンはコラーゲンから抽出する)より
も大きな分子を含むゼラチンを生産することができる。こうして得られる分子量
の高いゼラチン製品は、その物理的特性が望ましい様々な用途で直接使用するこ
とができ、あるいは、分割した後処理することにより、さらに小さなサイズの分
子の生産も可能である。
【0125】
一実施形態では、通常の動物源で得られるものより大きなコラーゲンを用いて
、ゼラチンを生産することができる。例えば、本発明の生産方法を改変して、ベ
スチメンチフェラン(vestimentiferan)棲管虫Riftia pachyptila(分子量約26
00 kDa)および環形動物Alvinella pompejana(分子量約1700 kDa)の体壁から
得た酸可溶性小皮コラーゲンを生産することができる。これらのコラーゲンを本
発明の生産方法に合わせて改変することにより、現在入手可能なゼラチンが抽出
されるものより大きな分子を生産することができ、得られた生産物を処理して、
所望のゼラチンを生産することも可能である。
、ゼラチンを生産することができる。例えば、本発明の生産方法を改変して、ベ
スチメンチフェラン(vestimentiferan)棲管虫Riftia pachyptila(分子量約26
00 kDa)および環形動物Alvinella pompejana(分子量約1700 kDa)の体壁から
得た酸可溶性小皮コラーゲンを生産することができる。これらのコラーゲンを本
発明の生産方法に合わせて改変することにより、現在入手可能なゼラチンが抽出
されるものより大きな分子を生産することができ、得られた生産物を処理して、
所望のゼラチンを生産することも可能である。
【0126】
本発明に従う多様な方法により、様々な分子量のゼラチンを生産することが特
に意図される。例えば、本発明の組換えゼラチンの特徴、例えば、ヒドロキシル
化率、架橋度などを変えることにより、所望の分子量の組換えゼラチンを生産す
ることができる。一態様では、例えば、本発明は、当業者には公知の架橋剤を用
いて、ゼラチンポリペプチドを架橋させることにより、大きな分子量の組換えゼ
ラチンを生産する方法を提供する(例えば、「考察」(後掲)参照)。
に意図される。例えば、本発明の組換えゼラチンの特徴、例えば、ヒドロキシル
化率、架橋度などを変えることにより、所望の分子量の組換えゼラチンを生産す
ることができる。一態様では、例えば、本発明は、当業者には公知の架橋剤を用
いて、ゼラチンポリペプチドを架橋させることにより、大きな分子量の組換えゼ
ラチンを生産する方法を提供する(例えば、「考察」(後掲)参照)。
【0127】
本発明の別の態様では、ゼラチンを誘導することのできるポリペプチドを、天
然コラーゲン配列の全部または断片の多数のコピーを含む遺伝子工学的に作製し
た構築物から発現させる。例えば、一実施形態では、本発明は、I型コラーゲン
のコラーゲン性ドメインの多数のコピーを含む改変コラーゲン構築物を提供する
。別の実施形態では、上記構築物は、III型コラーゲンのコラーゲン性ドメイン
の多数のコピーを含む。さらに別の実施形態では、上記構築物は、I型およびIII
型コラーゲン性ドメインのコピーを含む。本発明は、I型〜XX型までのコラーゲ
ンを含む、あらゆるコラーゲンをコードする配列の全部または一部の単一または
多数のコピーの使用を可能にする。特に、本発明の方法により、2つ以上の型の
コラーゲンから誘導されるゼラチンの生産を可能にすることが考えられる。一実
施形態では、2つ以上の型のコラーゲンから誘導される組換えゼラチンを、1つ
の発現系、例えば、宿主細胞、トランスジェニック動物などにおいて共発現させ
て、ゼラチンの混合物を生産する。
然コラーゲン配列の全部または断片の多数のコピーを含む遺伝子工学的に作製し
た構築物から発現させる。例えば、一実施形態では、本発明は、I型コラーゲン
のコラーゲン性ドメインの多数のコピーを含む改変コラーゲン構築物を提供する
。別の実施形態では、上記構築物は、III型コラーゲンのコラーゲン性ドメイン
の多数のコピーを含む。さらに別の実施形態では、上記構築物は、I型およびIII
型コラーゲン性ドメインのコピーを含む。本発明は、I型〜XX型までのコラーゲ
ンを含む、あらゆるコラーゲンをコードする配列の全部または一部の単一または
多数のコピーの使用を可能にする。特に、本発明の方法により、2つ以上の型の
コラーゲンから誘導されるゼラチンの生産を可能にすることが考えられる。一実
施形態では、2つ以上の型のコラーゲンから誘導される組換えゼラチンを、1つ
の発現系、例えば、宿主細胞、トランスジェニック動物などにおいて共発現させ
て、ゼラチンの混合物を生産する。
【0128】
別の実施形態では、本発明は、コラーゲンまたはプロコラーゲン三重らせん段
階からの誘導なしに、ゼラチンを生産する方法を提供する。一態様では、この方
法は、三重らせん構造は形成させないが、プロリルヒドロキシラーゼの活性は許
容する高温発現系(例えば、好熱性生物に依存するものなど)における様々な構
築物の発現により、組換えゼラチンを生産することを含んでなる。本発明のゼラ
チンは、三重らせんの形成を妨げる突然変異、付加、もしくは欠失を含むコラー
ゲン構築物から誘導することも可能である。別の態様では、該方法は、標準温度
(すなわち、37℃)では三重らせんの形成を可能にしない短縮された構築物から
ゼラチンを生産することを含んでなる。あるいは、三重らせん形成の阻害剤、例
えば、ポリアニオンの存在下でゼラチンを生産することができ、その際、該阻害
剤を生合成コラーゲン構築物と共発現させる。さらに、本発明の生合成ゼラチン
は、三重らせんを形成しない、組換えにより生産されたコラーゲン鎖から誘導す
ることもできる。
階からの誘導なしに、ゼラチンを生産する方法を提供する。一態様では、この方
法は、三重らせん構造は形成させないが、プロリルヒドロキシラーゼの活性は許
容する高温発現系(例えば、好熱性生物に依存するものなど)における様々な構
築物の発現により、組換えゼラチンを生産することを含んでなる。本発明のゼラ
チンは、三重らせんの形成を妨げる突然変異、付加、もしくは欠失を含むコラー
ゲン構築物から誘導することも可能である。別の態様では、該方法は、標準温度
(すなわち、37℃)では三重らせんの形成を可能にしない短縮された構築物から
ゼラチンを生産することを含んでなる。あるいは、三重らせん形成の阻害剤、例
えば、ポリアニオンの存在下でゼラチンを生産することができ、その際、該阻害
剤を生合成コラーゲン構築物と共発現させる。さらに、本発明の生合成ゼラチン
は、三重らせんを形成しない、組換えにより生産されたコラーゲン鎖から誘導す
ることもできる。
【0129】
別の実施形態では、本発明は、非ヒドロキシル化コラーゲン、またはプロリン
残基の完全なヒドロキシル化ではなく、部分的ヒドロキシル化を行ったコラーゲ
ンからゼラチンを誘導する方法を提供する。一態様では、この方法は、例えば、
プロリルヒドロキシラーゼをもたない昆虫発現系において、プロリルヒドロキシ
ラーゼの非存在下で発現させたコラーゲンからゼラチンを誘導することを含む(
例えば、Myllyharjuら(1997)J. Biol. Chem. 272, 21824-21830を参照)。本
発明に従う一方法では、部分的にヒドロキシル化した、または非ヒドロキシル化
コラーゲンからゼラチンを誘導する。ヒドロキシル化は、例えば、ヒドロキシラ
ーゼのin vitro投与により付与することができる。一方法では、例えば、細菌ま
たは酵母宿主細胞にヒドロキシプロリンを与えることにより、プロリンに代わる
ヒドロキシプロリンの低度の置換を強制的に行なうことも可能である。
残基の完全なヒドロキシル化ではなく、部分的ヒドロキシル化を行ったコラーゲ
ンからゼラチンを誘導する方法を提供する。一態様では、この方法は、例えば、
プロリルヒドロキシラーゼをもたない昆虫発現系において、プロリルヒドロキシ
ラーゼの非存在下で発現させたコラーゲンからゼラチンを誘導することを含む(
例えば、Myllyharjuら(1997)J. Biol. Chem. 272, 21824-21830を参照)。本
発明に従う一方法では、部分的にヒドロキシル化した、または非ヒドロキシル化
コラーゲンからゼラチンを誘導する。ヒドロキシル化は、例えば、ヒドロキシラ
ーゼのin vitro投与により付与することができる。一方法では、例えば、細菌ま
たは酵母宿主細胞にヒドロキシプロリンを与えることにより、プロリンに代わる
ヒドロキシプロリンの低度の置換を強制的に行なうことも可能である。
【0130】
本発明は、完全ヒドロキシル化、部分的ヒドロキシル化、および非ヒドロキシ
ル化組換えゼラチンからなる。別の実施形態では、本発明の方法は、特定のヒド
ロキシル化度を有するゼラチンまたはゼラチン前駆体の生産を含んでなる。さら
に別の態様では、本発明は、20〜80%ヒドロキシル化、好ましくは、約30〜60%
ヒドロキシル化、最も好ましくは、約40%のヒドロキシル化率を有するゼラチン
の生産方法に関する(実施例4および5を参照)。本発明の部分的ヒドロキシル
化組換えゼラチンは、様々なヒドロキシル化度の組換えゼラチンを指定比率で混
合することにより、あるいは、直接得ることができる(実施例4および5を参照
)。さらに、本発明は、プロリルヒドロキシラーゼを非ヒドロキシル化組換えゼ
ラチンにin vitroで投与し、反応の長さを制御することにより、組換えゼラチン
の部分的ヒドロキシル化を達成する方法を提供する。
ル化組換えゼラチンからなる。別の実施形態では、本発明の方法は、特定のヒド
ロキシル化度を有するゼラチンまたはゼラチン前駆体の生産を含んでなる。さら
に別の態様では、本発明は、20〜80%ヒドロキシル化、好ましくは、約30〜60%
ヒドロキシル化、最も好ましくは、約40%のヒドロキシル化率を有するゼラチン
の生産方法に関する(実施例4および5を参照)。本発明の部分的ヒドロキシル
化組換えゼラチンは、様々なヒドロキシル化度の組換えゼラチンを指定比率で混
合することにより、あるいは、直接得ることができる(実施例4および5を参照
)。さらに、本発明は、プロリルヒドロキシラーゼを非ヒドロキシル化組換えゼ
ラチンにin vitroで投与し、反応の長さを制御することにより、組換えゼラチン
の部分的ヒドロキシル化を達成する方法を提供する。
【0131】
現在入手可能な動物源ゼラチンの熱特性を改変できる範囲には制限がある。本
発明は、特に、組換えゼラチンが、特定用途に所望される特定の熱特性を有する
、組換えゼラチンの生産方法を提供する。本発明の方法を用いて、例えば、組換
えゼラチンの融点および/またはゲル強度を多様な方法で操作することができる
。組換えゼラチンの熱安定性および/またはゲル強度は、当業者には公知の様々
な技法により測定が可能である。
発明は、特に、組換えゼラチンが、特定用途に所望される特定の熱特性を有する
、組換えゼラチンの生産方法を提供する。本発明の方法を用いて、例えば、組換
えゼラチンの融点および/またはゲル強度を多様な方法で操作することができる
。組換えゼラチンの熱安定性および/またはゲル強度は、当業者には公知の様々
な技法により測定が可能である。
【0132】
一般に、ゼラチンの融点は、ヒドロキシル化度が増加するにつれ、高くなる。
本発明の方法を用いて、ヒドロキシル化および/または架橋などの操作により、
現在入手可能な動物源ゼラチンよりゲル強度および/または融点が低い高分子量
ゼラチンを生産することが可能である。従って、本発明は、高いフィルム強度な
どを得るため高分子量ゼラチンが所望されるが、非ゲル化または低強度ゲル製品
が求められる用途での使用に適した、市販の製品では達成できない特性を有する
組換えゼラチンを提供する。一実施形態では、本発明は、プロリン残基の不完全
なヒドロキシル化により、温度安定性が低い組換えゼラチンを提供する。
本発明の方法を用いて、ヒドロキシル化および/または架橋などの操作により、
現在入手可能な動物源ゼラチンよりゲル強度および/または融点が低い高分子量
ゼラチンを生産することが可能である。従って、本発明は、高いフィルム強度な
どを得るため高分子量ゼラチンが所望されるが、非ゲル化または低強度ゲル製品
が求められる用途での使用に適した、市販の製品では達成できない特性を有する
組換えゼラチンを提供する。一実施形態では、本発明は、プロリン残基の不完全
なヒドロキシル化により、温度安定性が低い組換えゼラチンを提供する。
【0133】
このような組換えゼラチンは各種用途で有用である。既存の抽出方法により生
産されたゼラチンでは、魚ゼラチンだけが、ゲル化しない、高い平均分子量の皮
膜形成タンパク質を提供する。非ゲル化魚ゼラチンによって提供される非ゲル化
および冷水溶解の特性には、現在入手可能なヒドロキシル化ウシおよびブタゼラ
チンが匹敵し得るが、ヒドロキシル化したゼラチンは、平均分子量が低いため、
相応して皮膜強度およびフレキシビリティーが低下する。従って、一実施形態で
は、本発明は、現在入手可能な動物源材料により提供されるものよりゲル強度が
低くかつ分子量が高い部分的ヒドロキシル化組換えゼラチンを提供する。
産されたゼラチンでは、魚ゼラチンだけが、ゲル化しない、高い平均分子量の皮
膜形成タンパク質を提供する。非ゲル化魚ゼラチンによって提供される非ゲル化
および冷水溶解の特性には、現在入手可能なヒドロキシル化ウシおよびブタゼラ
チンが匹敵し得るが、ヒドロキシル化したゼラチンは、平均分子量が低いため、
相応して皮膜強度およびフレキシビリティーが低下する。従って、一実施形態で
は、本発明は、現在入手可能な動物源材料により提供されるものよりゲル強度が
低くかつ分子量が高い部分的ヒドロキシル化組換えゼラチンを提供する。
【0134】
分子量が高くゲル強度が低い組換えゼラチンは、安定性が所望されるが、医薬
品の展性および一体性を維持するために非または低ゲル化性が求められる、各種
医薬用途でも有用である。このような組換えゼラチンは、その分子量が安定性を
もたらし、循環系中での滞留時間を増加すること、また、改変された硬化点によ
って、室温で材料がゲル化するのを防止し、増量剤を温めずに投与できることか
ら、例えば、血漿増量剤として用いることができる。一実施形態では、本発明は
、医薬用途、例えば、血漿増量剤における使用に適した部分的ヒドロキシル化組
換えゼラチンを提供する。
品の展性および一体性を維持するために非または低ゲル化性が求められる、各種
医薬用途でも有用である。このような組換えゼラチンは、その分子量が安定性を
もたらし、循環系中での滞留時間を増加すること、また、改変された硬化点によ
って、室温で材料がゲル化するのを防止し、増量剤を温めずに投与できることか
ら、例えば、血漿増量剤として用いることができる。一実施形態では、本発明は
、医薬用途、例えば、血漿増量剤における使用に適した部分的ヒドロキシル化組
換えゼラチンを提供する。
【0135】
別の態様では、部分的ヒドロキシル化組換えゼラチンは、プロリルヒドロキシ
ラーゼの非存在下で、例えば、プロリルヒドロキシラーゼをもたない昆虫発現系
において、組換えゼラチンの発現、あるいは、本発明の組換えゼラチンを誘導す
ることができるポリペプチドの発現を実施することにより、得られる(例えば、
Myllyharjuら(1997)J. Biol. Chem. 272, 21824-21830参照)。ヒドロキシル
化は、生産時に行うか、もしくはin vitroでの生物学的または化学的修飾により
、後に実施することができる。本発明の一方法では、組換えゼラチンは、部分的
にヒドロキシル化した、または完全にヒドロキシル化したコラーゲンから誘導す
る。
ラーゼの非存在下で、例えば、プロリルヒドロキシラーゼをもたない昆虫発現系
において、組換えゼラチンの発現、あるいは、本発明の組換えゼラチンを誘導す
ることができるポリペプチドの発現を実施することにより、得られる(例えば、
Myllyharjuら(1997)J. Biol. Chem. 272, 21824-21830参照)。ヒドロキシル
化は、生産時に行うか、もしくはin vitroでの生物学的または化学的修飾により
、後に実施することができる。本発明の一方法では、組換えゼラチンは、部分的
にヒドロキシル化した、または完全にヒドロキシル化したコラーゲンから誘導す
る。
【0136】
現在利用可能な方法により天然の供給源から得たゼラチンは、構成コラーゲン
分子のリシン残基間に共有架橋結合が存在することにより、大幅に強化される。
特定のリシン残基は、分泌前に、酵素リシルヒドロキシラーゼによりヒドロキシ
ル化されるため、架橋は、コラーゲン分泌および繊維形成の後に、細胞外空間中
に自然に起こる。次に、細胞外酵素リシルオキシダーゼが、コラーゲン分子中の
特定のリシンおよびヒドロキシリシン残基を脱アミノ化し、高度に反応性のアル
デヒド基を生成し、該アルデヒド基が、自発的に反応して共有結合を形成する。
こうして得られた架橋コラーゲンは、ゲル強度および粘度が増加したゼラチンを
もたらす。特に、架橋度が高いほど、ゼラチンの融解温度およびゲル強度も高く
なる。
分子のリシン残基間に共有架橋結合が存在することにより、大幅に強化される。
特定のリシン残基は、分泌前に、酵素リシルヒドロキシラーゼによりヒドロキシ
ル化されるため、架橋は、コラーゲン分泌および繊維形成の後に、細胞外空間中
に自然に起こる。次に、細胞外酵素リシルオキシダーゼが、コラーゲン分子中の
特定のリシンおよびヒドロキシリシン残基を脱アミノ化し、高度に反応性のアル
デヒド基を生成し、該アルデヒド基が、自発的に反応して共有結合を形成する。
こうして得られた架橋コラーゲンは、ゲル強度および粘度が増加したゼラチンを
もたらす。特に、架橋度が高いほど、ゼラチンの融解温度およびゲル強度も高く
なる。
【0137】
一態様では、本発明は、架橋された組換えゼラチンを提供し、これによって分
子量がより高いゼラチンが得られる(実施例7参照)。架橋は、生物学的または
化学的修飾によるものなど、各種方法によって実施することができる。例えば、
一実施形態では、組換えゼラチン、またはゼラチンを誘導することができるポリ
ペプチドをリシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの存在下で発現さ
せる。別の態様では、発現後のポリペプチドを架橋により修飾する。さらに別の
態様では、本発明は、反応性化学架橋剤、例えば、1-エチル-3-(ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)のような化学的手段により、架橋を実施
する(実施例7参照)。上記以外に、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート
(BS3)、3,3’-ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP)
、およびトリス-スルホスクシンイミジルアミノトリアセテート(Sulfo-TSAT)
などの化学的架橋剤、また、当業者には公知の各種薬剤を用いてもよい。さらに
、本発明は、様々な架橋度を有する組換えゼラチンの生産方法を提供し、これは
、所望の融点、ゲル強度および粘度を有する組換えゼラチンを得る上で有用であ
る。
子量がより高いゼラチンが得られる(実施例7参照)。架橋は、生物学的または
化学的修飾によるものなど、各種方法によって実施することができる。例えば、
一実施形態では、組換えゼラチン、またはゼラチンを誘導することができるポリ
ペプチドをリシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの存在下で発現さ
せる。別の態様では、発現後のポリペプチドを架橋により修飾する。さらに別の
態様では、本発明は、反応性化学架橋剤、例えば、1-エチル-3-(ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)のような化学的手段により、架橋を実施
する(実施例7参照)。上記以外に、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート
(BS3)、3,3’-ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP)
、およびトリス-スルホスクシンイミジルアミノトリアセテート(Sulfo-TSAT)
などの化学的架橋剤、また、当業者には公知の各種薬剤を用いてもよい。さらに
、本発明は、様々な架橋度を有する組換えゼラチンの生産方法を提供し、これは
、所望の融点、ゲル強度および粘度を有する組換えゼラチンを得る上で有用であ
る。
【0138】
本発明は、組換えゼラチンの分子量、ヒドロキシル化度、および架橋度を操作
することにより、様々なブルーム強度を有する組換えゼラチン、ならびに、様々
な粘度を有する組換えゼラチンの生産を可能にする方法を提供する。
することにより、様々なブルーム強度を有する組換えゼラチン、ならびに、様々
な粘度を有する組換えゼラチンの生産を可能にする方法を提供する。
【0139】
プロリンヒドロキシル化は、天然コラーゲンの形成に中心的な役割を果たして
いる。また、配列X-Lys-Glyにおける特定のリシル残基のヒドロキシル化も、コ
ラーゲン合成および繊維形成に重要な機能を果たす。修飾されたリシン残基上の
ヒドロキシル基は、炭水化物の結合部位としての機能と、安定した分子間架橋形
成の必須部位としての機能を果たす。これらの修飾には、特定の酵素、すなわち
、リシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの発現が必要である。
いる。また、配列X-Lys-Glyにおける特定のリシル残基のヒドロキシル化も、コ
ラーゲン合成および繊維形成に重要な機能を果たす。修飾されたリシン残基上の
ヒドロキシル基は、炭水化物の結合部位としての機能と、安定した分子間架橋形
成の必須部位としての機能を果たす。これらの修飾には、特定の酵素、すなわち
、リシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの発現が必要である。
【0140】
従って、本発明の一態様では、本発明のポリペプチドとこれら酵素との共発現
が考えられる。本明細書に記載したように、リシルヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子(Hautalaら(1992)Genomics 13:62-69)を宿主細胞中で発現させ、そ
の後、ゼラチンまたはゼラチンを誘導することのできるポリペプチドをコードす
る配列の導入によりさらに修飾する。本発明の組換えゼラチンは、従って、内在
的に発現させたリシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの活性により
、翻訳後修飾することができる。本発明の組換えゼラチンはまた、外因性リシル
ヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの発現により修飾することもできる
。一実施形態では、生産された組換えゼラチンは非ヒドロキシル化されており、
続いて、これをリシルヒドロキシラーゼの酵素活性によるリシン残基の所望され
る程度のヒドロキシル化の実施によって改変する。リシルヒドロキシル化度を改
変できることは、所望のゲル強度および粘度をもたらす様々な架橋度を有するゼ
ラチン、ならびに、ゼラチンを誘導することができるポリペプチドを生産する上
で望ましいことである。
が考えられる。本明細書に記載したように、リシルヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子(Hautalaら(1992)Genomics 13:62-69)を宿主細胞中で発現させ、そ
の後、ゼラチンまたはゼラチンを誘導することのできるポリペプチドをコードす
る配列の導入によりさらに修飾する。本発明の組換えゼラチンは、従って、内在
的に発現させたリシルヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの活性により
、翻訳後修飾することができる。本発明の組換えゼラチンはまた、外因性リシル
ヒドロキシラーゼおよびリシルオキシダーゼの発現により修飾することもできる
。一実施形態では、生産された組換えゼラチンは非ヒドロキシル化されており、
続いて、これをリシルヒドロキシラーゼの酵素活性によるリシン残基の所望され
る程度のヒドロキシル化の実施によって改変する。リシルヒドロキシル化度を改
変できることは、所望のゲル強度および粘度をもたらす様々な架橋度を有するゼ
ラチン、ならびに、ゼラチンを誘導することができるポリペプチドを生産する上
で望ましいことである。
【0141】
別の実施形態では、ヒドロキシリシン残基を含むポリペプチドを、例えば、酵
母細胞中に発現させ、そこでは、ヒドロキシプロリンがプロリルヒドロキシラー
ゼの活性により生産される(実施例1および4を参照)。いくつかの実施形態で
は、修飾した組換えゼラチンまたはゼラチンを誘導することのできるポリペプチ
ドを製剤化し、これを動物またはヒトに投与して、リシルオキシダーゼのような
内在性酵素の基質として作用させ、これによって、コラーゲン性ポリペプチドが
安定化した架橋形態で組織に組み込まれるようにする。従って、本発明の一態様
は、リシルヒドロキシラーゼまたはリシルオキシダーゼの活性を必要とせずに、
商業用途のための所望のゲル強度および粘度を有する組換えゼラチンの生産を可
能にする。
母細胞中に発現させ、そこでは、ヒドロキシプロリンがプロリルヒドロキシラー
ゼの活性により生産される(実施例1および4を参照)。いくつかの実施形態で
は、修飾した組換えゼラチンまたはゼラチンを誘導することのできるポリペプチ
ドを製剤化し、これを動物またはヒトに投与して、リシルオキシダーゼのような
内在性酵素の基質として作用させ、これによって、コラーゲン性ポリペプチドが
安定化した架橋形態で組織に組み込まれるようにする。従って、本発明の一態様
は、リシルヒドロキシラーゼまたはリシルオキシダーゼの活性を必要とせずに、
商業用途のための所望のゲル強度および粘度を有する組換えゼラチンの生産を可
能にする。
【0142】
本発明はまた、特定のゲル化点を有するゼラチンの生産も可能にする。一実施
形態では、本発明は、15〜35℃の硬化またはゲル化点を有するゼラチンの生産を
可能にする。別の実施形態では、組換えゼラチンは、15〜25℃、25〜35℃および
20〜30℃の硬化点を有する。
形態では、本発明は、15〜35℃の硬化またはゲル化点を有するゼラチンの生産を
可能にする。別の実施形態では、組換えゼラチンは、15〜25℃、25〜35℃および
20〜30℃の硬化点を有する。
【0143】
様々な態様において、本発明は、非ヒドロキシル化組換えゼラチン、完全ヒド
ロキシル化組換えゼラチン、または、様々な程度にまでヒドロキシル化された組
換えゼラチン、例えば、ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化製品の混合物で
あるゼラチンを提供する。さらに、本発明は、様々な加水分解度を有する組換え
ゼラチンの生産方法を提供する(実施例9および10参照)。ゼラチンヒドロキシ
ル化物は典型的に、冷水溶解性であり、多様な用途で用いられ、特に、製薬およ
び食品産業で用いられるが、これらの分野では、非ゲル化特性を有するゼラチン
が求められる。ゼラチンヒドロキシル化物は、製薬産業において、皮膜形成剤、
マイクロカプセル化工程、関節炎および関節鎮痛剤、錠剤、および各種栄養剤に
用いられる。化粧品産業では、ゼラチンヒドロキシル化物はシャンプーおよびコ
ンディショナー、ローション、および口紅やマニキュアなどその他の製品に用い
られる。ゼラチンヒドロキシル化物は、タンパク質および活力飲料および食品の
栄養補助剤として;ワイン、ビールおよびジュース透明化のための清澄剤として
:また、食品香味料および着色料などの添加剤のマイクロカプセル化に使用され
ている。ゼラチンヒドロキシル化物は、その皮膜形成性のために、工業用途、例
えば、半導体製造における素子のコーティングなどにも使用されている。
ロキシル化組換えゼラチン、または、様々な程度にまでヒドロキシル化された組
換えゼラチン、例えば、ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化製品の混合物で
あるゼラチンを提供する。さらに、本発明は、様々な加水分解度を有する組換え
ゼラチンの生産方法を提供する(実施例9および10参照)。ゼラチンヒドロキシ
ル化物は典型的に、冷水溶解性であり、多様な用途で用いられ、特に、製薬およ
び食品産業で用いられるが、これらの分野では、非ゲル化特性を有するゼラチン
が求められる。ゼラチンヒドロキシル化物は、製薬産業において、皮膜形成剤、
マイクロカプセル化工程、関節炎および関節鎮痛剤、錠剤、および各種栄養剤に
用いられる。化粧品産業では、ゼラチンヒドロキシル化物はシャンプーおよびコ
ンディショナー、ローション、および口紅やマニキュアなどその他の製品に用い
られる。ゼラチンヒドロキシル化物は、タンパク質および活力飲料および食品の
栄養補助剤として;ワイン、ビールおよびジュース透明化のための清澄剤として
:また、食品香味料および着色料などの添加剤のマイクロカプセル化に使用され
ている。ゼラチンヒドロキシル化物は、その皮膜形成性のために、工業用途、例
えば、半導体製造における素子のコーティングなどにも使用されている。
【0144】
本発明の一実施形態では、コラーゲン配列からゼラチンを生産するが、該配列
では、発現産物の挙動を改変するために、特定の天然ドメインが欠失または付加
されている。本発明はさらに、インタクトな三重らせんコラーゲンを生産するこ
となく、改変されたコラーゲン構築物から直接ゼラチンを生産する、組換えゼラ
チンの生産方法を包含する。特に、本発明は、標準的な三重らせんコラーゲンを
コードしない様々な構築物の発現を含む組換えゼラチンの生産方法を包含する。
例えば、特異的欠失により、コラゲナーゼ応答性領域、ならびに、免疫原性、例
えば、抗原性およびアレルギー性の応答を誘発する各種領域を排除することがで
きる。
では、発現産物の挙動を改変するために、特定の天然ドメインが欠失または付加
されている。本発明はさらに、インタクトな三重らせんコラーゲンを生産するこ
となく、改変されたコラーゲン構築物から直接ゼラチンを生産する、組換えゼラ
チンの生産方法を包含する。特に、本発明は、標準的な三重らせんコラーゲンを
コードしない様々な構築物の発現を含む組換えゼラチンの生産方法を包含する。
例えば、特異的欠失により、コラゲナーゼ応答性領域、ならびに、免疫原性、例
えば、抗原性およびアレルギー性の応答を誘発する各種領域を排除することがで
きる。
【0145】
種々のコラーゲンの特定ドメインは、特定の活性と関連している(例えば、Sh
ahanら(1999)Con. Tiss. Res. 40:221-232;Raffら(2000)Human Genet 106:
19-28を参照:尚、両文献とも、本明細書に参照によりその全体を組み入れる)
。特に、本発明は、特定の活性に関連するコラーゲン遺伝子の特定の領域を排除
もしくは低減または増加するように改変されたコラーゲン構築物から誘導された
組換えゼラチンを産生する方法を提供する。特に、このような領域を全部または
一部欠失させることにより、特定の活性が欠如または低下したゼラチンを産生す
ることができた。あるいは、特定領域の付加的コピーを付加することにより、活
性が増強したゼラチンを産生することもできた。例えば、血小板細胞表面上のα
2β1インテグリン受容体により認識されるIおよびIII型コラーゲンにおける配列
が同定されている(Knightら(1998)J. Biol. Chem. 273:33287-33294;および
Mortonら(1997)J. Biol. Chem. 272:11044-11048:これらの文献はすべて、本
明細書に参照によりその全体を組み入れる)。
ahanら(1999)Con. Tiss. Res. 40:221-232;Raffら(2000)Human Genet 106:
19-28を参照:尚、両文献とも、本明細書に参照によりその全体を組み入れる)
。特に、本発明は、特定の活性に関連するコラーゲン遺伝子の特定の領域を排除
もしくは低減または増加するように改変されたコラーゲン構築物から誘導された
組換えゼラチンを産生する方法を提供する。特に、このような領域を全部または
一部欠失させることにより、特定の活性が欠如または低下したゼラチンを産生す
ることができた。あるいは、特定領域の付加的コピーを付加することにより、活
性が増強したゼラチンを産生することもできた。例えば、血小板細胞表面上のα
2β1インテグリン受容体により認識されるIおよびIII型コラーゲンにおける配列
が同定されている(Knightら(1998)J. Biol. Chem. 273:33287-33294;および
Mortonら(1997)J. Biol. Chem. 272:11044-11048:これらの文献はすべて、本
明細書に参照によりその全体を組み入れる)。
【0146】
本発明の一態様では、血小板活性化領域を欠いたコラーゲン構築物から合成さ
れる断片からなる均質のゼラチンを産生することが望ましい。このようなゼラチ
ンは、例えば、吻合術および血管移植などに関連する製品(例えば、ステントお
よび移植装置用のコーティングを含む)に含まれうる。このような製品は、有害
な副作用、例えば、血栓症に関連する可能性があり、これは、このような製品の
使用に伴ない、コラーゲン性製品に存在する血小板凝集領域の結果として発病し
得る。一態様では、本発明は、ステントまたは類似装置に用いる場合、細胞結合
の支持体を提供することができるが、血小板反応領域を含まないため、血小板凝
集の危険性を最小限に抑える組換えゼラチンの産生方法を提供する(実施例2参
照)。従って、本発明は、一実施形態で、組換えゼラチンを含むステントコーテ
ィングを提供する。好ましい実施形態では、組換えゼラチンは、組換えヒトゼラ
チンである。様々な創傷の手当ての用途などの場合には、特定の凝集活性を誘導
することができるドメインを含む組換えゼラチンを提供するのが望ましいだろう
。
れる断片からなる均質のゼラチンを産生することが望ましい。このようなゼラチ
ンは、例えば、吻合術および血管移植などに関連する製品(例えば、ステントお
よび移植装置用のコーティングを含む)に含まれうる。このような製品は、有害
な副作用、例えば、血栓症に関連する可能性があり、これは、このような製品の
使用に伴ない、コラーゲン性製品に存在する血小板凝集領域の結果として発病し
得る。一態様では、本発明は、ステントまたは類似装置に用いる場合、細胞結合
の支持体を提供することができるが、血小板反応領域を含まないため、血小板凝
集の危険性を最小限に抑える組換えゼラチンの産生方法を提供する(実施例2参
照)。従って、本発明は、一実施形態で、組換えゼラチンを含むステントコーテ
ィングを提供する。好ましい実施形態では、組換えゼラチンは、組換えヒトゼラ
チンである。様々な創傷の手当ての用途などの場合には、特定の凝集活性を誘導
することができるドメインを含む組換えゼラチンを提供するのが望ましいだろう
。
【0147】
本発明のゼラチンは、α2β1インテグリン受容体により認識される領域をコー
ドしないコラーゲン構築物から、もしくは、このような領域の1または複数のコ
ピーを有する構築物から発現させることができ、これにより、血小板凝集および
活性化を低減しないまたは低減する、均質でバラツキのないゼラチン製品が得ら
れる。一態様では、本発明は、ゼラチンの直接発現、またはコラーゲン性ポリペ
プチドからのゼラチンのプロセッシングのいずれかにより、高度に効率的な組換
え発現を用いて、組換えゼラチンの産生を提供する。本発明の産生方法は、多数
の発現系のいずれか1つを用いることができることから、既存の抽出方法とは反
対に、極めて高いフレキシビリティーを提供する。産生材料は、例えば、酵母ま
たは植物バイオマスから入手することができる。例えば、本発明の方法に従い、
均一サイズの特定のゼラチン分子が産生されるように命令することにより、特定
の産生系での分泌を最適化することができる。様々な実施形態において、本発明
のゼラチン、またはこれらのゼラチンが誘導されるポリペプチドは、発現系で産
生される。このような発現系としては、限定するものではないが、細菌発現系の
ような原核生物発現系、ならびに酵母、動物、植物および昆虫発現系を含む真核
生物発現系が挙げられる。トランスジェニック動物およびトランスジェニック植
物などの発現系も考えられる。
ドしないコラーゲン構築物から、もしくは、このような領域の1または複数のコ
ピーを有する構築物から発現させることができ、これにより、血小板凝集および
活性化を低減しないまたは低減する、均質でバラツキのないゼラチン製品が得ら
れる。一態様では、本発明は、ゼラチンの直接発現、またはコラーゲン性ポリペ
プチドからのゼラチンのプロセッシングのいずれかにより、高度に効率的な組換
え発現を用いて、組換えゼラチンの産生を提供する。本発明の産生方法は、多数
の発現系のいずれか1つを用いることができることから、既存の抽出方法とは反
対に、極めて高いフレキシビリティーを提供する。産生材料は、例えば、酵母ま
たは植物バイオマスから入手することができる。例えば、本発明の方法に従い、
均一サイズの特定のゼラチン分子が産生されるように命令することにより、特定
の産生系での分泌を最適化することができる。様々な実施形態において、本発明
のゼラチン、またはこれらのゼラチンが誘導されるポリペプチドは、発現系で産
生される。このような発現系としては、限定するものではないが、細菌発現系の
ような原核生物発現系、ならびに酵母、動物、植物および昆虫発現系を含む真核
生物発現系が挙げられる。トランスジェニック動物およびトランスジェニック植
物などの発現系も考えられる。
【0148】
本発明は、ゼラチンまたは細胞中でゼラチンを誘導することができるポリペプ
チドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの発現を提供する。一実施
形態では、本発明はゼラチンまたは細胞中でゼラチンを誘導することができるポ
リペプチドをコードする少なくとも2以上のポリヌクレオチドの発現を提供する
ことで、均質または不均質ポリペプチドである組換えゼラチンを産生する。本発
明はさらに、コラーゲンプロセッシングまたは翻訳後酵素もしくは細胞中のそれ
らのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。様々な翻訳
後修飾および様々な翻訳後酵素(例えば、プロリルヒドロキシラーゼ、リシルヒ
ドロキシラーゼなど)は、本発明のゼラチンの例えば、ブルーム強度およびその
他の物理的特性に影響を与えることができる。
チドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの発現を提供する。一実施
形態では、本発明はゼラチンまたは細胞中でゼラチンを誘導することができるポ
リペプチドをコードする少なくとも2以上のポリヌクレオチドの発現を提供する
ことで、均質または不均質ポリペプチドである組換えゼラチンを産生する。本発
明はさらに、コラーゲンプロセッシングまたは翻訳後酵素もしくは細胞中のそれ
らのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。様々な翻訳
後修飾および様々な翻訳後酵素(例えば、プロリルヒドロキシラーゼ、リシルヒ
ドロキシラーゼなど)は、本発明のゼラチンの例えば、ブルーム強度およびその
他の物理的特性に影響を与えることができる。
【0149】
本発明の組換えゼラチンは、コラーゲン性配列から誘導する。本発明のコード
ポリヌクレオチドが誘導される配列は、最終的ゼラチン産物の意図する用途に所
望する特性に応じて、ヒトまたは非ヒト配列から選択することができる。製薬お
よび医療用途では、組換えヒトゼラチンが好ましい。非ヒト供給源としては、ウ
シ、ブタおよびウマなどの非ヒト哺乳動物源、ならびに、その他、ニワトリおよ
び魚類などの動物源が挙げられる。特に、非天然配列が考えられる。
ポリヌクレオチドが誘導される配列は、最終的ゼラチン産物の意図する用途に所
望する特性に応じて、ヒトまたは非ヒト配列から選択することができる。製薬お
よび医療用途では、組換えヒトゼラチンが好ましい。非ヒト供給源としては、ウ
シ、ブタおよびウマなどの非ヒト哺乳動物源、ならびに、その他、ニワトリおよ
び魚類などの動物源が挙げられる。特に、非天然配列が考えられる。
【0150】
コラーゲンをコードする核酸配列については、当業界では広く記載されている
(例えば、FullerおよびBoedtker(1981)Biochemistry 20:996-1006;Sandell
ら(1984)J. Biol Chem 259:7826-34;Kohnoら(1984)J. Biol Chem 259:1366
8-13673;Frenchら(1985)Gene 39:311-312;Metsarantaら(1991)J. Biol Ch
em 266:16862-16869;Metsarantaら(1991)Biochim Biophys Acta 1089:241-24
3;Woodら(1987)Gene 61:225-230;Glumoffら(1994)Biochim Biophys Acta
1217:41-48;Shiraiら(1998)Matrix Biology 17:85-88;Trompら(1988)Bioc
hem J 253:919-912;Kuivaniemiら(1988)Biochem J 252:633-640;およびAla-
Kokkoら(1989)Biochem J 260:509-516を参照。また、2000年11月10日付けで出
願された「動物コラーゲンおよびゼラチン」と題する同時係属の同一所有である
米国特許出願第 号も参照されたい)。
(例えば、FullerおよびBoedtker(1981)Biochemistry 20:996-1006;Sandell
ら(1984)J. Biol Chem 259:7826-34;Kohnoら(1984)J. Biol Chem 259:1366
8-13673;Frenchら(1985)Gene 39:311-312;Metsarantaら(1991)J. Biol Ch
em 266:16862-16869;Metsarantaら(1991)Biochim Biophys Acta 1089:241-24
3;Woodら(1987)Gene 61:225-230;Glumoffら(1994)Biochim Biophys Acta
1217:41-48;Shiraiら(1998)Matrix Biology 17:85-88;Trompら(1988)Bioc
hem J 253:919-912;Kuivaniemiら(1988)Biochem J 252:633-640;およびAla-
Kokkoら(1989)Biochem J 260:509-516を参照。また、2000年11月10日付けで出
願された「動物コラーゲンおよびゼラチン」と題する同時係属の同一所有である
米国特許出願第 号も参照されたい)。
【0151】
本発明の核酸配列を操作することにより、該コード配列を改変し、これを用い
て、組換えゼラチン、または、組換えゼラチンを誘導することができるポリペプ
チドを産生することができる。これは、限定するものではないが、遺伝子産物の
プロセッシングおよび発現を修飾する改変などの多様な目的のために行う。例え
ば、選択的分泌シグナルは、あらゆる天然分泌シグナルで置換してもよい。下記
のような当業界において公知の技法を用いて、突然変異を導入することもできる
:例えば、指定部位突然変異誘発、PCR指定突然変異誘発、カセット突然変異誘
発、ならびに、新しい制限部位を挿入する、あるいは、グリコシル化パターン、
リン酸化、タンパク質分解ターンオーバー/分解などを改変する当業界において
公知のその他の技法。さらに、特定の宿主細胞を用いて、発現系においてゼラチ
ンを産生する場合、任意のトリプレットアミノ酸コドンのサイレント位置で、本
発明のポリヌクレオチドを改変することにより、特定の宿主生物のコドン優先事
項にさらに適合させることができる。
て、組換えゼラチン、または、組換えゼラチンを誘導することができるポリペプ
チドを産生することができる。これは、限定するものではないが、遺伝子産物の
プロセッシングおよび発現を修飾する改変などの多様な目的のために行う。例え
ば、選択的分泌シグナルは、あらゆる天然分泌シグナルで置換してもよい。下記
のような当業界において公知の技法を用いて、突然変異を導入することもできる
:例えば、指定部位突然変異誘発、PCR指定突然変異誘発、カセット突然変異誘
発、ならびに、新しい制限部位を挿入する、あるいは、グリコシル化パターン、
リン酸化、タンパク質分解ターンオーバー/分解などを改変する当業界において
公知のその他の技法。さらに、特定の宿主細胞を用いて、発現系においてゼラチ
ンを産生する場合、任意のトリプレットアミノ酸コドンのサイレント位置で、本
発明のポリヌクレオチドを改変することにより、特定の宿主生物のコドン優先事
項にさらに適合させることができる。
【0152】
本発明に従い用いることのできる改変ポリヌクレオチド配列としては、天然コ
ラーゲン配列内にヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む配列が挙げら
れる。このようなポリヌクレオチドは、同じまたは機能的に同等の遺伝子産物を
コードすることができる。遺伝子産物自体も、コラーゲン配列内にアミノ酸残基
の欠失、付加または置換を含んでいてよい。
ラーゲン配列内にヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む配列が挙げら
れる。このようなポリヌクレオチドは、同じまたは機能的に同等の遺伝子産物を
コードすることができる。遺伝子産物自体も、コラーゲン配列内にアミノ酸残基
の欠失、付加または置換を含んでいてよい。
【0153】
本発明のポリヌクレオチド配列をさらにコードされたポリペプチドの変異体を
コードする配列に指令する。コードされたアミノ酸変異体は、変異体ポリペプチ
ドをコードするための適したヌクレオチド変化を導入するための当業界において
公知の種々の方法によって調製することができる。アミノ酸配列変異体の構築で
重要な2つの変数は、突然変異の位置と、突然変異の種類である。本発明のゼラ
チンまたは本発明のゼラチンを誘導するポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、
ポリヌクレオチドを突然変異させて、天然には存在しないアミノ酸配列を得るこ
とにより、構築するのが好ましい。これらのアミノ酸改変は、例えば、様々な種
由来のコラーゲン(可変位置)、または高度に保存された領域(定常領域)で異
なる部位で実施することができる。このような位置での部位は、例えば、第1を
保存的選択(例えば、疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸に)で、次により
遠位の選択で(例えば、疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸に)で置換することで典
型的には連続的に改変し、次いで標的部位において欠失または挿入を行うことが
できる。
コードする配列に指令する。コードされたアミノ酸変異体は、変異体ポリペプチ
ドをコードするための適したヌクレオチド変化を導入するための当業界において
公知の種々の方法によって調製することができる。アミノ酸配列変異体の構築で
重要な2つの変数は、突然変異の位置と、突然変異の種類である。本発明のゼラ
チンまたは本発明のゼラチンを誘導するポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、
ポリヌクレオチドを突然変異させて、天然には存在しないアミノ酸配列を得るこ
とにより、構築するのが好ましい。これらのアミノ酸改変は、例えば、様々な種
由来のコラーゲン(可変位置)、または高度に保存された領域(定常領域)で異
なる部位で実施することができる。このような位置での部位は、例えば、第1を
保存的選択(例えば、疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸に)で、次により
遠位の選択で(例えば、疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸に)で置換することで典
型的には連続的に改変し、次いで標的部位において欠失または挿入を行うことが
できる。
【0154】
固有の遺伝子コードの縮重により、起原が、天然、合成、半合成、あるいは、
組換えのいずれにかかわらず、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列
もしくはポリペプチドをコードする他の核酸配列を、請求した本発明の実施に用
いることができる。特に、コドン最適化配列などの縮重変異体が、本発明では考
えられる。さらに、本発明は、特にストリンジェントな条件下で特定の配列にハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
組換えのいずれにかかわらず、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列
もしくはポリペプチドをコードする他の核酸配列を、請求した本発明の実施に用
いることができる。特に、コドン最適化配列などの縮重変異体が、本発明では考
えられる。さらに、本発明は、特にストリンジェントな条件下で特定の配列にハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
【0155】発現
本発明は、当業者が利用可能な発現系の範囲において好適に適用される。多数
のこれらの発現系について以下に説明するが、本発明の用途は下記の具体的な実
施形態に制限されないことを理解すべきである。
のこれらの発現系について以下に説明するが、本発明の用途は下記の具体的な実
施形態に制限されないことを理解すべきである。
【0156】
様々な発現系を用いて、本発明の組換えゼラチン、または、これらのゼラチン
を誘導することができるポリペプチドをコードする配列を含有および発現させる
ことができる。このような系としては、限定するものではないが、組換えバクテ
リオファージ、プラスミド、またはコスミド核酸発現ベクターで形質転換した細
菌などの微生物;酵母発現ベクターで形質転換した酵母;ウイルス発現ベクター
(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系;真菌ベクターで形質転
換した糸状菌;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス
、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)もしくは細菌発現ベクター(例えば、p
ETまたはpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系;あるいは、動物細胞系
が挙げられる。
を誘導することができるポリペプチドをコードする配列を含有および発現させる
ことができる。このような系としては、限定するものではないが、組換えバクテ
リオファージ、プラスミド、またはコスミド核酸発現ベクターで形質転換した細
菌などの微生物;酵母発現ベクターで形質転換した酵母;ウイルス発現ベクター
(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系;真菌ベクターで形質転
換した糸状菌;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス
、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)もしくは細菌発現ベクター(例えば、p
ETまたはpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系;あるいは、動物細胞系
が挙げられる。
【0157】
本発明のポリヌクレオチドの発現に使用するのに適した対照エレメントまたは
調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を実施する、
エンハンサー、プロモーター、ならびに5’および3’非翻訳領域などのベクター
の非翻訳領域である。このようなエレメントは、強度および特異性において様々
であってよい。使用するベクター系および宿主に応じて、任意の数の好適な転写
および翻訳エレメントを用いることができる。
調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を実施する、
エンハンサー、プロモーター、ならびに5’および3’非翻訳領域などのベクター
の非翻訳領域である。このようなエレメントは、強度および特異性において様々
であってよい。使用するベクター系および宿主に応じて、任意の数の好適な転写
および翻訳エレメントを用いることができる。
【0158】
プロモーターは、その制御下で核酸の転写を制御する構造遺伝子の開始コドン
から上流に位置する非翻訳配列である。誘導性プロモーターは、培地条件の変化
、例えば、栄養素の存在または不在に応答して、その転写開始レベルを改変する
プロモーターである。当業者であれば、本発明の方法での使用に適した宿主細胞
で認識される多数のプロモーターを知っているであろう。
から上流に位置する非翻訳配列である。誘導性プロモーターは、培地条件の変化
、例えば、栄養素の存在または不在に応答して、その転写開始レベルを改変する
プロモーターである。当業者であれば、本発明の方法での使用に適した宿主細胞
で認識される多数のプロモーターを知っているであろう。
【0159】
プロモーター、エンハンサー、およびその他の制御エレメントは、当業者が適
宜選択することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合には、BLUESC
RIPTファージミド(Stratagene, La Jolla、カリフォルニア州)またはpSPORT1
プラスミド(GIBCO BRL)などのハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性
プロモーターを用いることができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスポリヘド
リンプロモーターを用いることができる。植物系では、植物細胞のゲノムに由来
するプロモーターまたはエンハンサー(例えば、熱ショックプロモーター、RUBI
SCOの小サブユニット用のプロモーター;クロロフィルa/b結合タンパク質用のプ
ロモーター;種々の貯蔵タンパク質遺伝子用のプロモーターなど)、もしくは植
物ウイルスに由来するプロモーターまたはエンハンサー(例えば、ウイルスプロ
モーターまたはリーダー配列、CaMVの35S RNAプロモーター、TMVのコートタンパ
ク質プロモーターなど)をベクターにクローニングすることができる。哺乳動物
細胞系では、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーター(例えば、メタロチオネイ
ンプロモーター、-アクチンプロモーターなど)または哺乳動物ウイルスに由来
するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、CMV、SV40、LTR
、TKおよびワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなど)が好ましい。所望のポリ
ペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を生成する必要がある場
合には、適当な選択マーカーと一緒に、SV40またはEBVに基づくベクターを用い
ることができる。
宜選択することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合には、BLUESC
RIPTファージミド(Stratagene, La Jolla、カリフォルニア州)またはpSPORT1
プラスミド(GIBCO BRL)などのハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性
プロモーターを用いることができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスポリヘド
リンプロモーターを用いることができる。植物系では、植物細胞のゲノムに由来
するプロモーターまたはエンハンサー(例えば、熱ショックプロモーター、RUBI
SCOの小サブユニット用のプロモーター;クロロフィルa/b結合タンパク質用のプ
ロモーター;種々の貯蔵タンパク質遺伝子用のプロモーターなど)、もしくは植
物ウイルスに由来するプロモーターまたはエンハンサー(例えば、ウイルスプロ
モーターまたはリーダー配列、CaMVの35S RNAプロモーター、TMVのコートタンパ
ク質プロモーターなど)をベクターにクローニングすることができる。哺乳動物
細胞系では、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーター(例えば、メタロチオネイ
ンプロモーター、-アクチンプロモーターなど)または哺乳動物ウイルスに由来
するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、CMV、SV40、LTR
、TKおよびワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなど)が好ましい。所望のポリ
ペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を生成する必要がある場
合には、適当な選択マーカーと一緒に、SV40またはEBVに基づくベクターを用い
ることができる。
【0160】
このようなプロモーターは、例えば、天然遺伝子からプロモーターを除去し、
プロモーター配列の3’末端にコードポリヌクレオチドを配置するなどにより、 本発明のゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードするポリヌクレオチドに機能的
に連結することができる。本発明で有用なプロモーターとしては、限定するもの
ではないが、例えば、ラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、ア
ルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、およびtac
プロモーターのようなハイブリッドプロモーターなどを含めた原核生物プロモー
ター;例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、その他の解糖酵
素プロモーター(ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホホフルク
トースキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼなど)、アルコールデヒド
ロゲナーゼのプロモーター、アルコールオキシダーゼ(AOX)1もしくは2プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、マルトースプロモーター、およびガ
ラクトースプロモーターを含めた酵母プロモーター;例えば、ポリオーマウイル
ス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サ
イトメガロウイルス、レトロウイルス、SV40由来のプロモーターを含めた真核生
物プロモーター、ならびに、標的真核生物由来のプロモーター、例えば、アスペ
ルギルス(Aspergillus)由来のグルコアミラーゼプロモーター、アクチンもしく
はユビキチンプロモーター、哺乳動物由来の免疫グロビンプロモーター、および
天然コラーゲンプロモーターが挙げられる(例えば、de Boerら(1983)Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 80:21-25;Hitzemanら(1980)J. Biol. Chem. 255:2073
);Fiersら(1978)Nature 273:113;MulliganおよびBerg(1980)Science 209
:1422-1427;Pavlakisら(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402;
Greenwayら(1982)Gene 18:355-360;Grayら(1982)Nature 295:503-508;Rey
esら(1982)Nature 297:598-601;CanaaniおよびBerg(1982)Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 79:5166-5170;Gormanら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:
6777-6781;およびNunbergら(1984)Mol. and Cell. Biol. 11(4):2306-2315)
。
プロモーター配列の3’末端にコードポリヌクレオチドを配置するなどにより、 本発明のゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードするポリヌクレオチドに機能的
に連結することができる。本発明で有用なプロモーターとしては、限定するもの
ではないが、例えば、ラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、ア
ルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、およびtac
プロモーターのようなハイブリッドプロモーターなどを含めた原核生物プロモー
ター;例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、その他の解糖酵
素プロモーター(ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホホフルク
トースキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼなど)、アルコールデヒド
ロゲナーゼのプロモーター、アルコールオキシダーゼ(AOX)1もしくは2プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、マルトースプロモーター、およびガ
ラクトースプロモーターを含めた酵母プロモーター;例えば、ポリオーマウイル
ス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サ
イトメガロウイルス、レトロウイルス、SV40由来のプロモーターを含めた真核生
物プロモーター、ならびに、標的真核生物由来のプロモーター、例えば、アスペ
ルギルス(Aspergillus)由来のグルコアミラーゼプロモーター、アクチンもしく
はユビキチンプロモーター、哺乳動物由来の免疫グロビンプロモーター、および
天然コラーゲンプロモーターが挙げられる(例えば、de Boerら(1983)Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 80:21-25;Hitzemanら(1980)J. Biol. Chem. 255:2073
);Fiersら(1978)Nature 273:113;MulliganおよびBerg(1980)Science 209
:1422-1427;Pavlakisら(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402;
Greenwayら(1982)Gene 18:355-360;Grayら(1982)Nature 295:503-508;Rey
esら(1982)Nature 297:598-601;CanaaniおよびBerg(1982)Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 79:5166-5170;Gormanら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:
6777-6781;およびNunbergら(1984)Mol. and Cell. Biol. 11(4):2306-2315)
。
【0161】
本発明の方法のゼラチンおよびゼラチン前駆体をコードするポリヌクレオチド
配列は、一般的な発現を指令する構成的プロモーターの転写制御下で実施するこ
とができる。あるいは、本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドを特定の組
織または細胞型に発現させるか、またはさらに精密な環境条件もしくは成長制御
下で発現させる。これらの例において発現を指令するプロモーターは、誘導性プ
ロモーターとして知られている。組織特異的プロモーターを用いる場合には、タ
ンパク質発現は、タンパク質の抽出をしようとする組織で特に高い。例えば、植
物では、所望の組織に応じて、内乳、アリューロン層、胚(または胚盤および子
葉としての胚部分)、果皮、茎、葉、塊茎、根などに発現をターゲッティングす
ることができる。植物における公知の組織特異的プロモーターの例としては、塊
茎指向性I型パタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ADPGPP遺伝子に関連するプ
ロモーター、種子指向性転写を駆動するβコングリシニン(7Sタンパク質)のダ
イズプロモーター、ならびに、トウモロコシ内乳のゼイン遺伝子由来の種子指向
性プロモーターが挙げられる(例えば、Bevanら(1986)Nucleic Acids Res. 14
:4625-4638;Mullerら(1990)Mol. Gen. Genet. 224:136-146;Bray(1987)Pl
anta 172:364-370;およびPedersenら(1982)Cell 29:1015-1026を参照)。
配列は、一般的な発現を指令する構成的プロモーターの転写制御下で実施するこ
とができる。あるいは、本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドを特定の組
織または細胞型に発現させるか、またはさらに精密な環境条件もしくは成長制御
下で発現させる。これらの例において発現を指令するプロモーターは、誘導性プ
ロモーターとして知られている。組織特異的プロモーターを用いる場合には、タ
ンパク質発現は、タンパク質の抽出をしようとする組織で特に高い。例えば、植
物では、所望の組織に応じて、内乳、アリューロン層、胚(または胚盤および子
葉としての胚部分)、果皮、茎、葉、塊茎、根などに発現をターゲッティングす
ることができる。植物における公知の組織特異的プロモーターの例としては、塊
茎指向性I型パタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ADPGPP遺伝子に関連するプ
ロモーター、種子指向性転写を駆動するβコングリシニン(7Sタンパク質)のダ
イズプロモーター、ならびに、トウモロコシ内乳のゼイン遺伝子由来の種子指向
性プロモーターが挙げられる(例えば、Bevanら(1986)Nucleic Acids Res. 14
:4625-4638;Mullerら(1990)Mol. Gen. Genet. 224:136-146;Bray(1987)Pl
anta 172:364-370;およびPedersenら(1982)Cell 29:1015-1026を参照)。
【0162】
多くの場合、プロモーターからの本発明のゼラチンまたはゼラチン前駆体をコ
ードする配列の転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大
される。エンハンサーは、通常、約10〜300 bpのシス作用エレメントであり、こ
れが作用して、プロモーターでの転写開始の速度を増大する。真核および原核生
物の両者において、多くのエンハンサーが知られており、当業者であれば、目的
とする宿主細胞に適したエンハンサーを選択することができるだろう(例えば、
Yaniv(1982)Nature 297:17-18を参照)。
ードする配列の転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大
される。エンハンサーは、通常、約10〜300 bpのシス作用エレメントであり、こ
れが作用して、プロモーターでの転写開始の速度を増大する。真核および原核生
物の両者において、多くのエンハンサーが知られており、当業者であれば、目的
とする宿主細胞に適したエンハンサーを選択することができるだろう(例えば、
Yaniv(1982)Nature 297:17-18を参照)。
【0163】
本発明のゼラチンおよびゼラチン前駆体は、分泌タンパク質として発現させて
もよい。タンパク質の発現に用いられる操作された細胞が、非ヒト宿主細胞であ
る場合、コラーゲンタンパク質の分泌シグナルペプチドに代わって、宿主細胞の
分泌標的機構によりさらに効率的に認識される別の分泌シグナルペプチドを用い
るのが有利であることが多い。適した分泌シグナル配列は、哺乳動物遺伝子の最
適真菌発現を得る上で特に重要である(例えば、Brakeら(1984)Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 81:4642を参照)。その他の原核生物、酵母、真菌、昆虫または
哺乳動物細胞のシグナル配列も当業界において公知であり、当業者であれば、選
択した宿主細胞に適したシグナル配列を容易に選択することができるだろう。
もよい。タンパク質の発現に用いられる操作された細胞が、非ヒト宿主細胞であ
る場合、コラーゲンタンパク質の分泌シグナルペプチドに代わって、宿主細胞の
分泌標的機構によりさらに効率的に認識される別の分泌シグナルペプチドを用い
るのが有利であることが多い。適した分泌シグナル配列は、哺乳動物遺伝子の最
適真菌発現を得る上で特に重要である(例えば、Brakeら(1984)Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 81:4642を参照)。その他の原核生物、酵母、真菌、昆虫または
哺乳動物細胞のシグナル配列も当業界において公知であり、当業者であれば、選
択した宿主細胞に適したシグナル配列を容易に選択することができるだろう。
【0164】
発現効率は、文献に記載されているように、使用する特定の細胞系に適したエ
ンハンサーの導入により増強することができる(例えば、Scharf, D.ら(1994)
Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照)。さらに、宿主細胞株は、挿
入された配列の発現をモジュレートする、あるいは、所望の様式で発現タンパク
質をプロセッシングする能力について選択することができる。ポリペプチドのこ
のような修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボシキル化
、グリコシル化、リン酸化、脂質化、プレニル化およびアシル化が挙げられる。
また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて
、正しい挿入、フォールディング、および/または機能を促進することも可能で
ある。特定の細胞機構を備えると共に、このような翻訳後活性に特有の作用機構
を有するCHO、HeLa、MDCK、HEK293およびWI38などの様々な宿主細胞を選択する
ことにより、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするこ
とができる。
ンハンサーの導入により増強することができる(例えば、Scharf, D.ら(1994)
Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照)。さらに、宿主細胞株は、挿
入された配列の発現をモジュレートする、あるいは、所望の様式で発現タンパク
質をプロセッシングする能力について選択することができる。ポリペプチドのこ
のような修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボシキル化
、グリコシル化、リン酸化、脂質化、プレニル化およびアシル化が挙げられる。
また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて
、正しい挿入、フォールディング、および/または機能を促進することも可能で
ある。特定の細胞機構を備えると共に、このような翻訳後活性に特有の作用機構
を有するCHO、HeLa、MDCK、HEK293およびWI38などの様々な宿主細胞を選択する
ことにより、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするこ
とができる。
【0165】
本発明に従い、組換えゼラチンまたはゼラチンを誘導できるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列を、適した宿主細胞中に発現させることができる
。本発明の好ましい実施形態では、組換えゼラチンはヒトゼラチンである。本発
明の別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、他の型のコラーゲン
のコード配列を含まないI型コラーゲン配列、または他の型のコラーゲンのコー
ド配列を含まないII型コラーゲン配列、または他の型のコラーゲンのコード配列
を含まないIII型コラーゲン配列から誘導する。別の実施形態では、コードポリ
ヌクレオチドは、指定量のI型およびIII型コラーゲンから誘導することにより、
コードされたポリペプチドにより産生された、または該ポリペプチドから誘導さ
れたゼラチンが、規定量のI型およびIII型コラーゲンの混合物を含むようにする
。
ードするポリヌクレオチド配列を、適した宿主細胞中に発現させることができる
。本発明の好ましい実施形態では、組換えゼラチンはヒトゼラチンである。本発
明の別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、他の型のコラーゲン
のコード配列を含まないI型コラーゲン配列、または他の型のコラーゲンのコー
ド配列を含まないII型コラーゲン配列、または他の型のコラーゲンのコード配列
を含まないIII型コラーゲン配列から誘導する。別の実施形態では、コードポリ
ヌクレオチドは、指定量のI型およびIII型コラーゲンから誘導することにより、
コードされたポリペプチドにより産生された、または該ポリペプチドから誘導さ
れたゼラチンが、規定量のI型およびIII型コラーゲンの混合物を含むようにする
。
【0166】
本発明のゼラチンが誘導されるコラーゲンを発現させるために、または本発明
のゼラチンの産生をもたらす、天然コラーゲン配列以外の配列を発現させるため
に、コラーゲンをコードするヌクレオチド配列、もしくは機能的同等物、あるい
は、その他の配列、例えば、表2に示すような短縮コラーゲン配列を、適した発
現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必須のエレメ
ントを含むベクター、あるいは、RNAウイルスベクターの場合には、複製および
翻訳に必須のエレメントを含むベクターに挿入する。
のゼラチンの産生をもたらす、天然コラーゲン配列以外の配列を発現させるため
に、コラーゲンをコードするヌクレオチド配列、もしくは機能的同等物、あるい
は、その他の配列、例えば、表2に示すような短縮コラーゲン配列を、適した発
現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必須のエレメ
ントを含むベクター、あるいは、RNAウイルスベクターの場合には、複製および
翻訳に必須のエレメントを含むベクターに挿入する。
【0167】
当業者には周知の方法を用いて、所望のコード配列および適した転写/翻訳制
御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては
、標準的DNAクローニング法、例えば、in vitro組換え法、合成法、およびin vi
vo組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら(前掲);およびAusubel, F. M.(
1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(ニュー
ヨーク州ニューヨーク)に記載されている技法を参照されたい。
御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては
、標準的DNAクローニング法、例えば、in vitro組換え法、合成法、およびin vi
vo組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら(前掲);およびAusubel, F. M.(
1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(ニュー
ヨーク州ニューヨーク)に記載されている技法を参照されたい。
【0168】
種々の発現系を用いて、本発明のポリペプチドを発現させることができる。例
えば、典型的発現ベクターは、複製起点をコードするエレメント;外因性ヌクレ
オチド配列挿入のためのクローニング部位;外因性遺伝子の転写開始を制御する
エレメント(プロモーターなど);ならびに、転写産物のプロセッシングを制御
するエレメント(転写/終結/ポリアデニル化配列など)を含む。また、本発明
で使用する発現ベクターは、染色体へのベクターの起こりうる組込みに必要な配
列を含んでいてもよい。さらに、転写開始を制御するプロモーターに機能的に連
結された選択マーカーをコードする遺伝子が発現ベクターに含まれていてもよく
、例えば宿主内での発現ベクターの成長および選択を提供する抗生物質耐性遺伝
子がある。
えば、典型的発現ベクターは、複製起点をコードするエレメント;外因性ヌクレ
オチド配列挿入のためのクローニング部位;外因性遺伝子の転写開始を制御する
エレメント(プロモーターなど);ならびに、転写産物のプロセッシングを制御
するエレメント(転写/終結/ポリアデニル化配列など)を含む。また、本発明
で使用する発現ベクターは、染色体へのベクターの起こりうる組込みに必要な配
列を含んでいてもよい。さらに、転写開始を制御するプロモーターに機能的に連
結された選択マーカーをコードする遺伝子が発現ベクターに含まれていてもよく
、例えば宿主内での発現ベクターの成長および選択を提供する抗生物質耐性遺伝
子がある。
【0169】
本発明のベクターは、宿主細胞内で自律的に複製しても、または宿主染色体に
組み込まれてもよい。自律的に複製する配列を有する好適なベクターは、種々の
細菌、酵母ならびに原核および真核生物の両方における様々なウイルス複製配列
について周知である。ベクターが、宿主細胞ゲノムDNAに存在する配列に相同的
なDNA配列を有する場合、該ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
組み込まれてもよい。自律的に複製する配列を有する好適なベクターは、種々の
細菌、酵母ならびに原核および真核生物の両方における様々なウイルス複製配列
について周知である。ベクターが、宿主細胞ゲノムDNAに存在する配列に相同的
なDNA配列を有する場合、該ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【0170】
組換えタンパク質の長期かつ高収率産生のためには、安定した発現が好ましい
。例えば、安定して本発明のポリペプチドを発現させる細胞系は、ウイルス複製
起点または適当な発現エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、転写
ターミネーター、ポリアデニル化部位など)と、同じまたは個別のベクター上に
選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、形質転換することができる。
ベクターの導入後、補強した培地で1〜2日間細胞を成長させ、次に、選択培地
に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーが、選択に対する耐性を賦与するた
め、導入された配列をうまく発現する細胞を成長および回収することができる。
安定して形質転換させた細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養法を用
いて増殖させることができる。所望のポリペプチドを発現する細胞系を産生する
のにこの方法を用いることは有利でありうる。
。例えば、安定して本発明のポリペプチドを発現させる細胞系は、ウイルス複製
起点または適当な発現エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、転写
ターミネーター、ポリアデニル化部位など)と、同じまたは個別のベクター上に
選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、形質転換することができる。
ベクターの導入後、補強した培地で1〜2日間細胞を成長させ、次に、選択培地
に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーが、選択に対する耐性を賦与するた
め、導入された配列をうまく発現する細胞を成長および回収することができる。
安定して形質転換させた細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養法を用
いて増殖させることができる。所望のポリペプチドを発現する細胞系を産生する
のにこの方法を用いることは有利でありうる。
【0171】
例えば、ガラクトースプロモーターにより駆動される、本発明の方法に用いら
れる様々な配列の発現は、下記のようにして誘導することができる:非抑制、非
誘導糖で培養物を成長させて、ガラクトースの添加後、急速な誘導が起こるよう
にする;グルコース培地で培養物を成長させ、次に、遠心分離によりグルコース
を除去し、細胞を洗浄した後、ガラクトース培地中に再懸濁させる;ならびに、
グルコースとガラクトースの両方を含む培地で細胞を成長させることで、ガラク
トース誘導が起こる前に、グルコースが優先的に代謝されるようにする。
れる様々な配列の発現は、下記のようにして誘導することができる:非抑制、非
誘導糖で培養物を成長させて、ガラクトースの添加後、急速な誘導が起こるよう
にする;グルコース培地で培養物を成長させ、次に、遠心分離によりグルコース
を除去し、細胞を洗浄した後、ガラクトース培地中に再懸濁させる;ならびに、
グルコースとガラクトースの両方を含む培地で細胞を成長させることで、ガラク
トース誘導が起こる前に、グルコースが優先的に代謝されるようにする。
【0172】
多数の選択系を用いて形質転換した細胞系を回収することができる。これらの
系としては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
およびアデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ遺伝子が挙げられ、ぞれぞ
れ、tkまたはaprf細胞で用いることができる(例えば、Wigler, M.ら(1977)Ce
ll 11:223-32;Lowy, I.ら(1980)Cell 22:817-23を参照)。また、代謝拮抗物
質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基準として用いてもよい。従って、本発
明では、このような選択マーカー、例えば:メトトレキセートに耐性を賦与する
dhfr;アミノグリコシドネオマイシンおよびG-418に耐性を賦与するnpt;ならび
に、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに
それぞれ耐性を賦与するalsまたはpatの使用が考えられる(例えば、Wigler, M.
ら(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570;およびColbere-Garapin, F.
ら(1981)J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。
系としては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
およびアデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ遺伝子が挙げられ、ぞれぞ
れ、tkまたはaprf細胞で用いることができる(例えば、Wigler, M.ら(1977)Ce
ll 11:223-32;Lowy, I.ら(1980)Cell 22:817-23を参照)。また、代謝拮抗物
質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基準として用いてもよい。従って、本発
明では、このような選択マーカー、例えば:メトトレキセートに耐性を賦与する
dhfr;アミノグリコシドネオマイシンおよびG-418に耐性を賦与するnpt;ならび
に、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに
それぞれ耐性を賦与するalsまたはpatの使用が考えられる(例えば、Wigler, M.
ら(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570;およびColbere-Garapin, F.
ら(1981)J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。
【0173】
上記以外の選択遺伝子も記載されており、例えば、細胞がトリプトファンの代
わりにインドールを使用できるようにするtrpB、あるいは、細胞がヒスチジンの
代わりにヒスチノールを使用できるようにするhisDがある(例えば、Hartman, S
.C.およびR.C. Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照)
。近年、可視マーカーの使用が人気を集めており、現在、アントシアニン、βグ
ルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびに、ルシフェラーゼおよびその基質
ルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するだけではなく、特定のベ
クター系によって起こり得る一過性のまたは安定したタンパク質発現の定量化に
、広く用いられている(例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Methods Mol. Biol. 5
5:121-131参照)。
わりにインドールを使用できるようにするtrpB、あるいは、細胞がヒスチジンの
代わりにヒスチノールを使用できるようにするhisDがある(例えば、Hartman, S
.C.およびR.C. Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照)
。近年、可視マーカーの使用が人気を集めており、現在、アントシアニン、βグ
ルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびに、ルシフェラーゼおよびその基質
ルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するだけではなく、特定のベ
クター系によって起こり得る一過性のまたは安定したタンパク質発現の定量化に
、広く用いられている(例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Methods Mol. Biol. 5
5:121-131参照)。
【0174】
以上述べてきたように、本発明の産生方法で用いる発現ベクターは、典型的に
、細胞に選択可能な表現型を賦与するマーカー遺伝子を含むことができる。通常
、この選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードし、好適な遺伝子は、少なく
とも1セットの抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子、
ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホホトランスフェラー
ゼ(SPT)遺伝子、カナマイシンまたはジェネティシン耐性をコードするネオマ
イシンホホトランスフェラーゼ(NPTH)遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、
アセトラクテートシンターゼ(ALS)の作用を阻害するように作用する除草剤、
特に、スルホニル尿素型の除草剤(例えば、S4および/またはHra突然変異)に
対する耐性をコードする遺伝子、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように
作用する除草剤(例えばホフィノトリシンまたはバスタ(basta))に対する耐
性をコードする遺伝子(例えば、バー(bar)遺伝子)、あるいは、当業界にお
いて公知のその他類似遺伝子を含む。バー遺伝子は、除草剤バスタに対する耐性
をコードし、またnptII遺伝子は、抗生物質カナマイシンおよびジェネティシン
に対する耐性をコードし、ALS遺伝子は、除草剤クロルスルフロンに対する耐性
をコードする。
、細胞に選択可能な表現型を賦与するマーカー遺伝子を含むことができる。通常
、この選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードし、好適な遺伝子は、少なく
とも1セットの抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子、
ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホホトランスフェラー
ゼ(SPT)遺伝子、カナマイシンまたはジェネティシン耐性をコードするネオマ
イシンホホトランスフェラーゼ(NPTH)遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、
アセトラクテートシンターゼ(ALS)の作用を阻害するように作用する除草剤、
特に、スルホニル尿素型の除草剤(例えば、S4および/またはHra突然変異)に
対する耐性をコードする遺伝子、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように
作用する除草剤(例えばホフィノトリシンまたはバスタ(basta))に対する耐
性をコードする遺伝子(例えば、バー(bar)遺伝子)、あるいは、当業界にお
いて公知のその他類似遺伝子を含む。バー遺伝子は、除草剤バスタに対する耐性
をコードし、またnptII遺伝子は、抗生物質カナマイシンおよびジェネティシン
に対する耐性をコードし、ALS遺伝子は、除草剤クロルスルフロンに対する耐性
をコードする。
【0175】
どの宿主細胞が、形質転換の後、目的とするポリヌクレオチドを含むかを決定
するその他の方法には、当業者に公知の様々な方法が含まれる。これらの方法と
しては、限定するものではないが、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーショ
ンを含む核酸ハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
検出および/または定量化のための膜、溶液もしくはチップに基づく技法などの
種々のタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイが挙げられる。
するその他の方法には、当業者に公知の様々な方法が含まれる。これらの方法と
しては、限定するものではないが、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーショ
ンを含む核酸ハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
検出および/または定量化のための膜、溶液もしくはチップに基づく技法などの
種々のタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイが挙げられる。
【0176】
さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、遺伝子産物を所望の特定形式で修
飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産
物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、
切断)は、タンパク質の機能に重要であると考えられる。様々な宿主細胞が、タ
ンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特有な特定の作用機構を備えてい
る。適した細胞系または宿主系を選択することにより、発現させた外来タンパク
質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にすることができる。このため、一
次転写産物の正しいプロセッシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を用
いることができる。ここで、上記のプロセッシングには、遺伝子産物のタンパク
質フォールディング、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ならびに、リン酸
化などの様々な修飾が含まれる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定す
るものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138などが挙げら
れる。
飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産
物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、
切断)は、タンパク質の機能に重要であると考えられる。様々な宿主細胞が、タ
ンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特有な特定の作用機構を備えてい
る。適した細胞系または宿主系を選択することにより、発現させた外来タンパク
質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にすることができる。このため、一
次転写産物の正しいプロセッシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を用
いることができる。ここで、上記のプロセッシングには、遺伝子産物のタンパク
質フォールディング、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ならびに、リン酸
化などの様々な修飾が含まれる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定す
るものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138などが挙げら
れる。
【0177】
また特定の開始シグナルを用いて、本発明のポリヌクレオチドのより効率的な
翻訳を達成することもできる。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンお
よび隣接配列が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする配列を、翻訳な
どに必要な任意の開始または上流配列と一緒に、適当な発現ベクターに挿入する
場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは何も必要としない場合がある。しか
し、コード配列、もしくはその一部だけを挿入する場合には、ATG開始コドンを
含む外因性翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、開始コドンは、
正しいリーディングフレーム内に配置することにより、全挿入体の翻訳を確実に
しなければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンについては、天然
および合成の様々な起源のものでよい(例えば、Bittnerら(1987)Meth. In En
zymol. 153:516-544)。
翻訳を達成することもできる。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンお
よび隣接配列が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする配列を、翻訳な
どに必要な任意の開始または上流配列と一緒に、適当な発現ベクターに挿入する
場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは何も必要としない場合がある。しか
し、コード配列、もしくはその一部だけを挿入する場合には、ATG開始コドンを
含む外因性翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、開始コドンは、
正しいリーディングフレーム内に配置することにより、全挿入体の翻訳を確実に
しなければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンについては、天然
および合成の様々な起源のものでよい(例えば、Bittnerら(1987)Meth. In En
zymol. 153:516-544)。
【0178】
本発明の宿主細胞は、本発明のゼラチン、または該ゼラチンを誘導できるポ
リペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド以外に、翻訳後酵素
をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで感染、トランスフェクト、あ
るいは、形質転換することができる。このようなポリヌクレオチドとしては、プ
ロリル4-ヒドロキシラーゼ、コラーゲングリコシルトランスフェラーゼ、C-プロ
テイナーゼ、N-プロテイナーゼ、リシルオキシダーゼ、もしくはリシルヒドロキ
シラーゼなどのコラーゲン翻訳後酵素をコードするものが挙げられ、該ポリヌク
レオチドを、天然に翻訳後酵素を産生しない細胞、例えば、酵母細胞、または十
分な量の翻訳後酵素を天然に産生することのできない細胞、例えば、種々の昆虫
および哺乳動物細胞に挿入し、外因性酵素に特定の翻訳後作用を生じさせること
ができる。本発明の一実施形態では、翻訳後酵素は、プロリル4-ヒドロキシラー
ゼであり、ポリヌクレオチドは、プロリルヒドロキシラーゼのαまたはβサブユ
ニットをコードする。好ましい実施形態では、プロリル4-ヒドロキシラーゼのα
およびβサブユニットをコードするポリヌクレオチドを細胞に挿入することによ
り、生物学的に活性のプロリル4-ヒドロキシラーゼ酵素を産生させ、これをゼラ
チンまたはゼラチンを誘導できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
共発現させる。
リペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド以外に、翻訳後酵素
をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで感染、トランスフェクト、あ
るいは、形質転換することができる。このようなポリヌクレオチドとしては、プ
ロリル4-ヒドロキシラーゼ、コラーゲングリコシルトランスフェラーゼ、C-プロ
テイナーゼ、N-プロテイナーゼ、リシルオキシダーゼ、もしくはリシルヒドロキ
シラーゼなどのコラーゲン翻訳後酵素をコードするものが挙げられ、該ポリヌク
レオチドを、天然に翻訳後酵素を産生しない細胞、例えば、酵母細胞、または十
分な量の翻訳後酵素を天然に産生することのできない細胞、例えば、種々の昆虫
および哺乳動物細胞に挿入し、外因性酵素に特定の翻訳後作用を生じさせること
ができる。本発明の一実施形態では、翻訳後酵素は、プロリル4-ヒドロキシラー
ゼであり、ポリヌクレオチドは、プロリルヒドロキシラーゼのαまたはβサブユ
ニットをコードする。好ましい実施形態では、プロリル4-ヒドロキシラーゼのα
およびβサブユニットをコードするポリヌクレオチドを細胞に挿入することによ
り、生物学的に活性のプロリル4-ヒドロキシラーゼ酵素を産生させ、これをゼラ
チンまたはゼラチンを誘導できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
共発現させる。
【0179】
翻訳後酵素をコードするポリヌクレオチドは、天然、合成、または組換えのい
ずれに拘わらず、任意の供給源に由来するものでよい。好ましい実施形態では、
翻訳後酵素は、産生しようとする組換えゼラチンと同じ種から誘導する。一実施
形態では、産生しようとする組換えゼラチンは、ヒト組換えゼラチンであり、翻
訳後酵素は、ヒトプロリル4-ヒドロキシラーゼである。
ずれに拘わらず、任意の供給源に由来するものでよい。好ましい実施形態では、
翻訳後酵素は、産生しようとする組換えゼラチンと同じ種から誘導する。一実施
形態では、産生しようとする組換えゼラチンは、ヒト組換えゼラチンであり、翻
訳後酵素は、ヒトプロリル4-ヒドロキシラーゼである。
【0180】
本発明の発現ゼラチンまたはゼラチン前駆体は、好ましくは、培地に分泌させ
、当業界において公知の方法、例えば、クロマトグラフィーにより、均一になる
まで精製することができる。一実施形態では、組換えゼラチンまたはゼラチン前
駆体は、サイズ排除クロマトグラフィーで精製する。しかし、当業界において公
知の他の方法を用いてもよく、これらの方法としては、限定するものではないが
、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
、ならびに逆相クロマトグラフィーが挙げられる(例えば、Maniatisら(前掲)
;Ausubelら(前掲);およびScopes(1994)Protein Purification: Principle
s and Practice, Springer-Verlag New York ,Inc. N.Y.を参照)。
、当業界において公知の方法、例えば、クロマトグラフィーにより、均一になる
まで精製することができる。一実施形態では、組換えゼラチンまたはゼラチン前
駆体は、サイズ排除クロマトグラフィーで精製する。しかし、当業界において公
知の他の方法を用いてもよく、これらの方法としては、限定するものではないが
、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
、ならびに逆相クロマトグラフィーが挙げられる(例えば、Maniatisら(前掲)
;Ausubelら(前掲);およびScopes(1994)Protein Purification: Principle
s and Practice, Springer-Verlag New York ,Inc. N.Y.を参照)。
【0181】原核生物
細菌系のような原核生物系では、発現させようとするポリペプチドの意図する
用途に応じて、多数の発現ベクターのいずれか1つを選択することができる。例
えば、本発明の組換えゼラチンまたはこれら組換えゼラチンを誘導できるポリペ
プチドが多量に必要な場合、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を
指令するベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、限定す
るものではないが、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能大腸菌クローニン
グおよび発現ベクター(ここでは、コード配列を、アミノ末端Metの配列と、こ
れに続くβガラクトシダーゼの7つの残基を含むフレーム内でベクターに連結す
ることにより、ハイブリッドタンパク質を産生することができる);pINベクタ
ー(Van Heeke, G.およびS.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509
)などが挙げられる。またpGEX(Promega, Madison, Wis.)およびpET(Invitro
gen)ベクターを用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融
合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることができる。一般に、この
ような融合タンパク質は可溶性であり、当業界において公知の様々な方法、例え
ば、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着後、遊離グルタチオンの存在下で
の溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製
されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Xa因子プロテアーゼ切断
部位を含むように設計し、目的とするクローニングされたポリペプチドをGST成
分から放出させることが可能である。
用途に応じて、多数の発現ベクターのいずれか1つを選択することができる。例
えば、本発明の組換えゼラチンまたはこれら組換えゼラチンを誘導できるポリペ
プチドが多量に必要な場合、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を
指令するベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、限定す
るものではないが、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能大腸菌クローニン
グおよび発現ベクター(ここでは、コード配列を、アミノ末端Metの配列と、こ
れに続くβガラクトシダーゼの7つの残基を含むフレーム内でベクターに連結す
ることにより、ハイブリッドタンパク質を産生することができる);pINベクタ
ー(Van Heeke, G.およびS.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509
)などが挙げられる。またpGEX(Promega, Madison, Wis.)およびpET(Invitro
gen)ベクターを用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融
合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることができる。一般に、この
ような融合タンパク質は可溶性であり、当業界において公知の様々な方法、例え
ば、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着後、遊離グルタチオンの存在下で
の溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製
されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Xa因子プロテアーゼ切断
部位を含むように設計し、目的とするクローニングされたポリペプチドをGST成
分から放出させることが可能である。
【0182】酵母
好ましい実施形態では、本発明は酵素発現系を用いて組換えゼラチンを産生す
る方法を提供する。好ましい実施形態では、ゼラチンは、改変されたコラーゲン
構築物から直接産生されるか、あるいはコラーゲン性ポリペプチドのプロセッシ
ングから誘導される。構成的、非構成的、または誘導性プロモーターを含む多数
のベクターを酵母系に用いることができる(例えば、Ausubelら(前掲)、第13
章を参照)。いくつかの態様では、サッカロミセス・セレビシアエ(S. cerevis
iae)での発現において、染色体へのDNA組込みを指令する配列を含むベクターを
用いる。
る方法を提供する。好ましい実施形態では、ゼラチンは、改変されたコラーゲン
構築物から直接産生されるか、あるいはコラーゲン性ポリペプチドのプロセッシ
ングから誘導される。構成的、非構成的、または誘導性プロモーターを含む多数
のベクターを酵母系に用いることができる(例えば、Ausubelら(前掲)、第13
章を参照)。いくつかの態様では、サッカロミセス・セレビシアエ(S. cerevis
iae)での発現において、染色体へのDNA組込みを指令する配列を含むベクターを
用いる。
【0183】
一実施形態では、本発明の組換えゼラチンまたはこれらのゼラチンを誘導でき
るポリペプチドは、酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevis
iae)からの宿主細胞を用いて発現させる。当業界で入手可能な多数の発現ベク
ター(α因子、AOX、GAL1-10およびPGHのような構成的または誘導性プロモーター
を含む多数のベクターを含む)と一緒にサッカロミセス・セレビシアエを用いる
ことができる(例えば、Ausubelら(前掲)およびGrantら(1987)Methods Enzy
mol. 153:516-544を参照)。一般に用いられる発現ベクターは、酵母および大腸
菌のColE1起点両方での増殖のための2μ複製起点を含むシャトルベクターであり
、外来遺伝子の効率的転写のための酵母プロモーターおよびターミネーターを含
む。2μプラスミドを組み込むベクターとしては、限定するものではないが、2μ
ORI-STBエレメント、GAL1-10を有するpWYG4およびpYES2などが挙げられる。ヒド
ロキシル化産物が求められる本発明の一方法においては、コラーゲン翻訳後酵素
、例えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの共発現を含む。このような方法の1つ
では、pWYG4ベクターを用いて、Nco1クローニング部位を用いて、プロリル4-ヒ
ドロキシラーゼのαまたはβサブユニットいずれかの遺伝子を挿入し、αまたは
βサブユニットいずれかのためのATG開始コドンを提供する。一方法では、宿主
の染色体への直接組込みを指令する発現プラスミドを用いる。
るポリペプチドは、酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevis
iae)からの宿主細胞を用いて発現させる。当業界で入手可能な多数の発現ベク
ター(α因子、AOX、GAL1-10およびPGHのような構成的または誘導性プロモーター
を含む多数のベクターを含む)と一緒にサッカロミセス・セレビシアエを用いる
ことができる(例えば、Ausubelら(前掲)およびGrantら(1987)Methods Enzy
mol. 153:516-544を参照)。一般に用いられる発現ベクターは、酵母および大腸
菌のColE1起点両方での増殖のための2μ複製起点を含むシャトルベクターであり
、外来遺伝子の効率的転写のための酵母プロモーターおよびターミネーターを含
む。2μプラスミドを組み込むベクターとしては、限定するものではないが、2μ
ORI-STBエレメント、GAL1-10を有するpWYG4およびpYES2などが挙げられる。ヒド
ロキシル化産物が求められる本発明の一方法においては、コラーゲン翻訳後酵素
、例えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの共発現を含む。このような方法の1つ
では、pWYG4ベクターを用いて、Nco1クローニング部位を用いて、プロリル4-ヒ
ドロキシラーゼのαまたはβサブユニットいずれかの遺伝子を挿入し、αまたは
βサブユニットいずれかのためのATG開始コドンを提供する。一方法では、宿主
の染色体への直接組込みを指令する発現プラスミドを用いる。
【0184】
また、完全な2αORI、STB、REP1およびREP2、GAL7プロモーターおよびFLPター
ミネーターを有する発現ベクターpWYG7Lも用いることができる。翻訳後酵素、例
えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの共発現が望ましい場合には、プロリル4-ヒ
ドロキシラーゼのαまたはβサブユニットいずれかの遺伝子を、BamHIまたはNco
1部位にその5'末端を有するポリリンカーに挿入する。細胞壁の除去の前または
後に、プロリル4-ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクターをサッカロミセス・セ
レビシアエに形質転換することで、スフェロプラストを産生するが、該スフェロ
プラストは、カルシウムおよびポリエチレングリコールによる処理の際、または
リチウムイオンによる完全な細胞の処理によりDNAを取り込む。あるいは、エレ
クトロポレーションによりDNAを導入してもよい。LEU2、TRP1、URA3、HIS3また
はLEU2-Dのような選択マーカーと一緒に、ロイシン、トリプトファン、ウラシル
またはヒスチジンに対する栄養要求性の宿主酵母細胞を用いて、形質転換体を選
択することができる。
ミネーターを有する発現ベクターpWYG7Lも用いることができる。翻訳後酵素、例
えば、プロリル4-ヒドロキシラーゼの共発現が望ましい場合には、プロリル4-ヒ
ドロキシラーゼのαまたはβサブユニットいずれかの遺伝子を、BamHIまたはNco
1部位にその5'末端を有するポリリンカーに挿入する。細胞壁の除去の前または
後に、プロリル4-ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクターをサッカロミセス・セ
レビシアエに形質転換することで、スフェロプラストを産生するが、該スフェロ
プラストは、カルシウムおよびポリエチレングリコールによる処理の際、または
リチウムイオンによる完全な細胞の処理によりDNAを取り込む。あるいは、エレ
クトロポレーションによりDNAを導入してもよい。LEU2、TRP1、URA3、HIS3また
はLEU2-Dのような選択マーカーと一緒に、ロイシン、トリプトファン、ウラシル
またはヒスチジンに対する栄養要求性の宿主酵母細胞を用いて、形質転換体を選
択することができる。
【0185】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換えゼラチンを産生する方法は、酵母
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、またはその他の種の非サッカロミセ
ス酵母由来の宿主細胞を用いるが、これらは増産工程で、高収率の組換えタンパ
ク質を産生する上で利点を有する。ピキア属発現系は、原核生物(例えば、大腸
菌)発現系(高レベル発現、容易な増産、かつ安価な成長)および真核生物発現
系(タンパク質プロセッシング、フォールディング、および翻訳後修飾)の両方
の利点を含む。このような発現系を、当業者には入手可能な様々な方法およびキ
ット、例えばInvitrogen Corporation(San Diego, CA)から入手可能なピキア
発現(PICHIA EXPRESSION)キットを用いて構築することができる。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、またはその他の種の非サッカロミセ
ス酵母由来の宿主細胞を用いるが、これらは増産工程で、高収率の組換えタンパ
ク質を産生する上で利点を有する。ピキア属発現系は、原核生物(例えば、大腸
菌)発現系(高レベル発現、容易な増産、かつ安価な成長)および真核生物発現
系(タンパク質プロセッシング、フォールディング、および翻訳後修飾)の両方
の利点を含む。このような発現系を、当業者には入手可能な様々な方法およびキ
ット、例えばInvitrogen Corporation(San Diego, CA)から入手可能なピキア
発現(PICHIA EXPRESSION)キットを用いて構築することができる。
【0186】
ピキア・パストリス、またはピキア・メタノリカ(Phichia methanolica)な
どのメタノール酵母(methylotrophic yeast)には、多数のメタノール応答性遺伝
子があり、各々の発現は、メタノール応答性調節領域(プロモーターとも呼ばれ
る)により制御される。このようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、
本発明の実施での使用に適している。具体的な調節領域の例としては、ピキア・
パストリスAOX1由来の一次アルコールオキシダーゼ遺伝子用のプロモーター、ピ
キア・パストリスAOX2由来の二次アルコールオキシダーゼ遺伝子用のプロモータ
ー、FLD1プロモーター、ピキア・パストリス由来のジヒドロキシアセトンシンタ
ーゼ(DAS)遺伝子用のプロモーター、P40遺伝子用のプロモーターなどが挙げら
れる。典型的には、ピキア・パストリスでの発現は、厳密に調節されたAOX1遺伝
子由来のプロモーターによって得られる(例えば、Ellisら(1985)Mol. Cell.
Biol. 5:1111;および米国特許第4,855,231号)。また構成的発現は、例えば、G
PHプロモーターを用いて達成することができる。
どのメタノール酵母(methylotrophic yeast)には、多数のメタノール応答性遺伝
子があり、各々の発現は、メタノール応答性調節領域(プロモーターとも呼ばれ
る)により制御される。このようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、
本発明の実施での使用に適している。具体的な調節領域の例としては、ピキア・
パストリスAOX1由来の一次アルコールオキシダーゼ遺伝子用のプロモーター、ピ
キア・パストリスAOX2由来の二次アルコールオキシダーゼ遺伝子用のプロモータ
ー、FLD1プロモーター、ピキア・パストリス由来のジヒドロキシアセトンシンタ
ーゼ(DAS)遺伝子用のプロモーター、P40遺伝子用のプロモーターなどが挙げら
れる。典型的には、ピキア・パストリスでの発現は、厳密に調節されたAOX1遺伝
子由来のプロモーターによって得られる(例えば、Ellisら(1985)Mol. Cell.
Biol. 5:1111;および米国特許第4,855,231号)。また構成的発現は、例えば、G
PHプロモーターを用いて達成することができる。
【0187】
本発明の方法で使用するのに好ましい別の酵母発現系は、メタノール酵母、ハ
ンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を利用する。この系は、例え
ば、高収率が求められる本発明の産生方法で用いることができる。メタノール上
での成長により、MOX(メタノールオキシダーゼ)、DAS(ジヒドロキシアセトン
シンターゼ)、ならびに、FMHD(ギ酸脱水素酵素)のようなキー酵素(enzymes
key)の誘導が起こる。これらの酵素は、全細胞タンパク質の30〜40%までを占
めることができる。MOX、DASおよびFMDH産生をコードする遺伝子は、メタノール
上での成長により誘導され、かつグルコース上の成長により抑制される強力なプ
ロモーターによって制御される。これら3つのプロモーターのいずれかまたはす
べてを用いて、当業界において公知の方法に従い、ハンセヌラ・ポリモルファに
おける異種配列の高レベル発現を達成することができる。
ンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を利用する。この系は、例え
ば、高収率が求められる本発明の産生方法で用いることができる。メタノール上
での成長により、MOX(メタノールオキシダーゼ)、DAS(ジヒドロキシアセトン
シンターゼ)、ならびに、FMHD(ギ酸脱水素酵素)のようなキー酵素(enzymes
key)の誘導が起こる。これらの酵素は、全細胞タンパク質の30〜40%までを占
めることができる。MOX、DASおよびFMDH産生をコードする遺伝子は、メタノール
上での成長により誘導され、かつグルコース上の成長により抑制される強力なプ
ロモーターによって制御される。これら3つのプロモーターのいずれかまたはす
べてを用いて、当業界において公知の方法に従い、ハンセヌラ・ポリモルファに
おける異種配列の高レベル発現を達成することができる。
【0188】
本発明の一方法では、誘導性ハンセヌラ・ポリモルファプロモーターの制御下
で、コードポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする。産物の分泌が
求められる場合には、MFα1のような酵母中での分泌用シグナル配列をコードす
るポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドのコード配列とともにフレーム内
に融合させる。発現ベクターは、好ましくはURA3またはLEU2のような栄養要求性
マーカー遺伝子、もしくは、栄養要求性宿主の欠失を補うのに用いることができ
る当業界において公知のその他のマーカーを含有する。あるいは、ゼオシンまた
はブラスタチンのような優性選択マーカーを用いてもよい。
で、コードポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする。産物の分泌が
求められる場合には、MFα1のような酵母中での分泌用シグナル配列をコードす
るポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドのコード配列とともにフレーム内
に融合させる。発現ベクターは、好ましくはURA3またはLEU2のような栄養要求性
マーカー遺伝子、もしくは、栄養要求性宿主の欠失を補うのに用いることができ
る当業界において公知のその他のマーカーを含有する。あるいは、ゼオシンまた
はブラスタチンのような優性選択マーカーを用いてもよい。
【0189】
次に発現ベクターを用いて、当業者に公知の技法により、ハンセヌラ・ポリモ
ルファ宿主細胞を形質転換する。ハンセヌラ・ポリモルファ形質転換の有用で、
かつ興味をひく特徴は、発現ベクターの100コピーまでのゲノムへの自発的組込
みである。ほとんどの場合、組み込まれた配列は、頭−尾構成を呈する多量体を
形成する。組み込まれた外来DNAは、非選択的条件下でも、数種の組換え株にお
いて、有糸分裂が安定していることが明らかにされている。この高コピー組込み
の現象は、当該系の産生性をさらに高めることになる。
ルファ宿主細胞を形質転換する。ハンセヌラ・ポリモルファ形質転換の有用で、
かつ興味をひく特徴は、発現ベクターの100コピーまでのゲノムへの自発的組込
みである。ほとんどの場合、組み込まれた配列は、頭−尾構成を呈する多量体を
形成する。組み込まれた外来DNAは、非選択的条件下でも、数種の組換え株にお
いて、有糸分裂が安定していることが明らかにされている。この高コピー組込み
の現象は、当該系の産生性をさらに高めることになる。
【0190】植物
本発明はまた、植物宿主細胞およびトランスジェニック植物を含めた植物発現
系において、本発明の組換えゼラチンまたは該組換えゼラチンを誘導することが
できるポリペプチドの産生を意図する(例えば、Transgenic Plants: A Product
ion System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, OwenおよびPen編、
John Wiley & Sons, 1996;Transgenic Plants, GalunおよびBreiman編、Imperi
al College Press, 1997;およびApplied Plant Biotechnology, Chopraら編、S
cience Publishers, Inc., 1997を参照)。植物発現ベクターを用いる場合、配
列の発現を多数のプロモーターのいずれかにより駆動することができる。例えば
、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターを単独、また
はTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる(例えば、B
rissonら(1984)Nature 310:511-514;およびTakamatsu, N.(1987)EMBO J. 6
:307-311を参照)。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子は、一般に当業界
において公知である(例えば、Gruberら(1993)Methods of Plant Molecular B
iology and Biotechnology, CRC Pressを参照)。
系において、本発明の組換えゼラチンまたは該組換えゼラチンを誘導することが
できるポリペプチドの産生を意図する(例えば、Transgenic Plants: A Product
ion System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, OwenおよびPen編、
John Wiley & Sons, 1996;Transgenic Plants, GalunおよびBreiman編、Imperi
al College Press, 1997;およびApplied Plant Biotechnology, Chopraら編、S
cience Publishers, Inc., 1997を参照)。植物発現ベクターを用いる場合、配
列の発現を多数のプロモーターのいずれかにより駆動することができる。例えば
、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターを単独、また
はTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる(例えば、B
rissonら(1984)Nature 310:511-514;およびTakamatsu, N.(1987)EMBO J. 6
:307-311を参照)。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子は、一般に当業界
において公知である(例えば、Gruberら(1993)Methods of Plant Molecular B
iology and Biotechnology, CRC Pressを参照)。
【0191】
あるいは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター(例えば、
ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B)などの植物プロモーターを用いてもよい(例
えば、Coruzzi, G.ら(1984)EMBO J. 3:1617-1680;Broglie, R.ら(1984)Sci
ence 224:838-843;Winter, J.ら(1991)Results Probl. Cell Differ. 17:85-
105;およびGurleyら(1986)Mol. Cell. Biol. 6:559-565を参照)。これらの
構築物を植物細胞に、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直
接DNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、病原体
媒介感染、粒子ボンバードメント、あるいは一般に入手可能な多数の文献に記載
されているような当業界において公知のその他の手段を用いて導入することがで
きる(例えば、Hobbs, S.またはMurry, L. E., McGraw Hill Yearbook of Scien
ce and Technology(1992)McGraw Hill、New York, N.Y.、pp. 191-196;Weiss
bachおよびWeissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology, Academic
Press, NY, 第VIII節、pp. 421-463;およびGriersonおよびCorey, Plant Mole
cular Biology, 第2版, Blackie, London, 第7〜9章を参照)。
ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B)などの植物プロモーターを用いてもよい(例
えば、Coruzzi, G.ら(1984)EMBO J. 3:1617-1680;Broglie, R.ら(1984)Sci
ence 224:838-843;Winter, J.ら(1991)Results Probl. Cell Differ. 17:85-
105;およびGurleyら(1986)Mol. Cell. Biol. 6:559-565を参照)。これらの
構築物を植物細胞に、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直
接DNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、病原体
媒介感染、粒子ボンバードメント、あるいは一般に入手可能な多数の文献に記載
されているような当業界において公知のその他の手段を用いて導入することがで
きる(例えば、Hobbs, S.またはMurry, L. E., McGraw Hill Yearbook of Scien
ce and Technology(1992)McGraw Hill、New York, N.Y.、pp. 191-196;Weiss
bachおよびWeissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology, Academic
Press, NY, 第VIII節、pp. 421-463;およびGriersonおよびCorey, Plant Mole
cular Biology, 第2版, Blackie, London, 第7〜9章を参照)。
【0192】
様々な実施形態において、本発明の組換えゼラチンまたは該組換えゼラチンを
誘導することができるポリペプチドは、例えば、キャノーラ、トウモロコシ、ダ
イズ、イネおよびオオムギの種子を用いた、利用可能な種子に基づく産生法によ
り、種子から産生される。このような実施形態では、タンパク質を種子発芽/脱
皮中に回収する。別の実施形態では、タンパク質を内乳または植物の他の部分に
直接発現させ、これによって、ゼラチンが抽出されず、植物自体が例えばタンパ
ク質源のような栄養補給源として働くことができる。
誘導することができるポリペプチドは、例えば、キャノーラ、トウモロコシ、ダ
イズ、イネおよびオオムギの種子を用いた、利用可能な種子に基づく産生法によ
り、種子から産生される。このような実施形態では、タンパク質を種子発芽/脱
皮中に回収する。別の実施形態では、タンパク質を内乳または植物の他の部分に
直接発現させ、これによって、ゼラチンが抽出されず、植物自体が例えばタンパ
ク質源のような栄養補給源として働くことができる。
【0193】
ポリヌクレオチドの発現を指令するのに用いることができるプロモーターは、
異種または非異種のいずれでもよい。またこれらプロモーターを用いて、アンチ
センス核酸の発現を駆動することにより、所望する通りに、発現を低減、増大ま
たは改変することができる。植物または植物細胞における配列の転写を増大およ
び/または最大化するのに実施できるその他の改変は標準的であり、当業界にお
いて公知である。例えば、プロモーターに機能的に連結したポリヌクレオチド配
列は、例えば、ペプチド輸出シグナル配列、コドン使用、イントロン、ポリアデ
ニル化シグナルおよび転写終結部位など、コードされたポリペプチドの転写率を
改変する少なくとも1つの因子をさらに含んでよい。植物での発現レベルを増大
するための核酸構築物の改変方法は、一般に当業界において公知である(例えば
、Rogersら(1985)J. Biol. Chem. 260:3731;Comejoら(1993)Plant Mol Bio
l 23:567-568を参照)。ポリヌクレオチドの転写率に影響を与える植物系の操作
においては、正または負の作用配列、エンハンサーおよびサイレンサー、クロマ
チン構造などのような調節配列を含む、当業界において公知の種々の因子を用い
ることができる。
異種または非異種のいずれでもよい。またこれらプロモーターを用いて、アンチ
センス核酸の発現を駆動することにより、所望する通りに、発現を低減、増大ま
たは改変することができる。植物または植物細胞における配列の転写を増大およ
び/または最大化するのに実施できるその他の改変は標準的であり、当業界にお
いて公知である。例えば、プロモーターに機能的に連結したポリヌクレオチド配
列は、例えば、ペプチド輸出シグナル配列、コドン使用、イントロン、ポリアデ
ニル化シグナルおよび転写終結部位など、コードされたポリペプチドの転写率を
改変する少なくとも1つの因子をさらに含んでよい。植物での発現レベルを増大
するための核酸構築物の改変方法は、一般に当業界において公知である(例えば
、Rogersら(1985)J. Biol. Chem. 260:3731;Comejoら(1993)Plant Mol Bio
l 23:567-568を参照)。ポリヌクレオチドの転写率に影響を与える植物系の操作
においては、正または負の作用配列、エンハンサーおよびサイレンサー、クロマ
チン構造などのような調節配列を含む、当業界において公知の種々の因子を用い
ることができる。
【0194】
植物における外来遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは、当業界において
周知であり、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導(Ti)プラスミドから誘導されたベ
クターが挙げられる。これらのベクターは植物組込みベクターであり、形質転換
されると、宿主植物のゲノム中にDNAの一部を組み込む(例えば、Rogersら(198
7)Meth. In Enzymol. 153:253-277;Schardlら(1987)Gene 61:1-11;およびB
ergerら(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8402-8406を参照)。
周知であり、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導(Ti)プラスミドから誘導されたベ
クターが挙げられる。これらのベクターは植物組込みベクターであり、形質転換
されると、宿主植物のゲノム中にDNAの一部を組み込む(例えば、Rogersら(198
7)Meth. In Enzymol. 153:253-277;Schardlら(1987)Gene 61:1-11;およびB
ergerら(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8402-8406を参照)。
【0195】
植物細胞を形質転換する方法は、当業界において利用可能であり、例えば、直
接遺伝子導入、in vitro原形質体形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、リポソ
ーム媒介形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、アグ
ロバクテリウム媒介形質転換、および弾道粒子加速(ballistic particle accele
ration)が挙げられる(例えば、Paszkowskiら(1984)EMBO J. 3:2717-2722;米
国特許第4,684,611号;欧州特許出願第0 67 533号;米国特許第4,407,956号;米
国特許第4,536,475号;Crosswayら(1986)Biotechniques 4:320-334;Riggsら
(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606;Hincheeら(1988)Biotec
hnology 6:915-921;および米国特許第4,945,050号を参照)。イネ、コムギ、ト
ウモロコシ、モロコシ、およびオオムギの形質転換のための標準的方法は、当業
界ですでに記載されている(例えば、Christouら(1992)Trends in Biotechnol
ogy 10:239;Casasら(1993)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11212;Wanら(19
94)Plant Physiol. 104:37;およびLeeら(1991)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
88:6389を参照)。コムギは、トウモロコシまたはイネを形質転換するのに用い
られる方法と同様の技法で形質転換することができる(例えば、Frommら(1990
)Bio/Technology 8:833;およびGordon-Kammら、前掲を参照)。
接遺伝子導入、in vitro原形質体形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、リポソ
ーム媒介形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、アグ
ロバクテリウム媒介形質転換、および弾道粒子加速(ballistic particle accele
ration)が挙げられる(例えば、Paszkowskiら(1984)EMBO J. 3:2717-2722;米
国特許第4,684,611号;欧州特許出願第0 67 533号;米国特許第4,407,956号;米
国特許第4,536,475号;Crosswayら(1986)Biotechniques 4:320-334;Riggsら
(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606;Hincheeら(1988)Biotec
hnology 6:915-921;および米国特許第4,945,050号を参照)。イネ、コムギ、ト
ウモロコシ、モロコシ、およびオオムギの形質転換のための標準的方法は、当業
界ですでに記載されている(例えば、Christouら(1992)Trends in Biotechnol
ogy 10:239;Casasら(1993)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11212;Wanら(19
94)Plant Physiol. 104:37;およびLeeら(1991)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
88:6389を参照)。コムギは、トウモロコシまたはイネを形質転換するのに用い
られる方法と同様の技法で形質転換することができる(例えば、Frommら(1990
)Bio/Technology 8:833;およびGordon-Kammら、前掲を参照)。
【0196】
本発明の組換えゼラチンまたはこれらの組換えゼラチンを誘導できるポリペプ
チドを発現することができる植物または植物細胞を生成するのに用いることので
きる付加的な方法は、当業界で十分に確立されている(例えば、米国特許第5,95
9,091号;米国特許第5,859,347号;米国特許第5,763,241号;米国特許第5,659,1
22号;米国特許第5,593,874号;米国特許第5,495,071号;米国特許第5,424,412
号;米国特許第5,362,865号;および米国特許第5,229,112号を参照)。
チドを発現することができる植物または植物細胞を生成するのに用いることので
きる付加的な方法は、当業界で十分に確立されている(例えば、米国特許第5,95
9,091号;米国特許第5,859,347号;米国特許第5,763,241号;米国特許第5,659,1
22号;米国特許第5,593,874号;米国特許第5,495,071号;米国特許第5,424,412
号;米国特許第5,362,865号;および米国特許第5,229,112号を参照)。
【0197】
本発明は、さらに組換えゼラチンまたは該組換えゼラチンを誘導することがで
きるポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列からなる
植物または植物細胞由来のバイオマスを提供することによってポリペプチドを産
生する方法であって、その際、このようなポリヌクレオチド配列をプロモーター
に機能的に連結してポリペプチドの発現に影響を与える方法を提供する。さらな
る実施形態では、本発明の方法はさらに、翻訳後修飾を触媒する酵素をコードす
る少なくとも1つのポリヌクレオチド配列またはそのサブユニットの共発現を含
み、その際、このようなポリヌクレオチド配列をプロモーターに機能的に連結す
る。これらの方法では、組換えゼラチンまたはコラーゲン性ポリペプチドは、バ
イオマスから抽出される。
きるポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列からなる
植物または植物細胞由来のバイオマスを提供することによってポリペプチドを産
生する方法であって、その際、このようなポリヌクレオチド配列をプロモーター
に機能的に連結してポリペプチドの発現に影響を与える方法を提供する。さらな
る実施形態では、本発明の方法はさらに、翻訳後修飾を触媒する酵素をコードす
る少なくとも1つのポリヌクレオチド配列またはそのサブユニットの共発現を含
み、その際、このようなポリヌクレオチド配列をプロモーターに機能的に連結す
る。これらの方法では、組換えゼラチンまたはコラーゲン性ポリペプチドは、バ
イオマスから抽出される。
【0198】真菌
また糸状菌を用いて、本発明のポリペプチドを産生することもできる。糸状菌
において組換えタンパク質を発現および/または分泌するためのベクターは、当
業界で周知であり、当業者であれば、当業界において入手可能な方法および製品
を用いて、本明細書に引用した方法でこれらのベクターを使用することができよ
う(例えば、米国特許第5,834,191号参照)。
において組換えタンパク質を発現および/または分泌するためのベクターは、当
業界で周知であり、当業者であれば、当業界において入手可能な方法および製品
を用いて、本明細書に引用した方法でこれらのベクターを使用することができよ
う(例えば、米国特許第5,834,191号参照)。
【0199】昆虫
昆虫細胞系により、本発明のポリペプチドを大量に産生することが可能である
。このような系の1つでは、 Autographa californica核多角体病ウイルス(AcN
PV)をベクターとして用いて、例えば、Spodoptera frugiperda細胞またはTrich
oplusia幼虫において外来遺伝子を発現させる。本発明のゼラチンまたはゼラチ
ン前駆体をコードする配列をウイルス、例えば、多角体遺伝子の非必須領域にク
ローニングし、AcNPVプロモーター、例えば、多角体プロモーターの制御下に配
置する。コード配列の挿入がうまくいけば、多角体遺伝子の不活性化が起こり、
非閉鎖組換えウイルス(すなわち、多角体遺伝子によりコードされるタンパク質
性コートを欠いたウイルス)が産生されるだろう。次に、これらの組換えウイル
スを用いて、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させ、
そこで、ゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードするポリヌクレオチドを発現さ
せる(例えば、Engelhard, E. K.ら(1994)Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-32
27;Smithら(1983)J. Virol. 46:584;および米国特許第4,215,051号を参照)
。この発現系のさらなる例を、例えば、Ausubelら(1995)(前掲)にみいだす
ことができる。
。このような系の1つでは、 Autographa californica核多角体病ウイルス(AcN
PV)をベクターとして用いて、例えば、Spodoptera frugiperda細胞またはTrich
oplusia幼虫において外来遺伝子を発現させる。本発明のゼラチンまたはゼラチ
ン前駆体をコードする配列をウイルス、例えば、多角体遺伝子の非必須領域にク
ローニングし、AcNPVプロモーター、例えば、多角体プロモーターの制御下に配
置する。コード配列の挿入がうまくいけば、多角体遺伝子の不活性化が起こり、
非閉鎖組換えウイルス(すなわち、多角体遺伝子によりコードされるタンパク質
性コートを欠いたウイルス)が産生されるだろう。次に、これらの組換えウイル
スを用いて、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させ、
そこで、ゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードするポリヌクレオチドを発現さ
せる(例えば、Engelhard, E. K.ら(1994)Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-32
27;Smithら(1983)J. Virol. 46:584;および米国特許第4,215,051号を参照)
。この発現系のさらなる例を、例えば、Ausubelら(1995)(前掲)にみいだす
ことができる。
【0200】
本発明のポリペプチドの組換え産生は、昆虫細胞において、例えば、必要であ
ると思われる任意の翻訳後酵素をコードするものを含めて、適したポリヌクレオ
チド配列を含むバキュロウイルスベクターの感染により達成することができる。
バキュロウイルスは、昆虫細胞において様々な組換えタンパク質を大量産生する
上で、極めて効率的な発現ベクターである。当業界において公知の種々の方法を
用いて、本発明のゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードする配列と、適した転
写/翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる(例えば、
Luckowら(1989)Virology 170:31-39;およびGruenwald, S.およびJ. Heitz(1
993)Baculovirus Expression Vector System:Procedure & Methods Manual, P
hamingen、San Diego, CAを参照)。
ると思われる任意の翻訳後酵素をコードするものを含めて、適したポリヌクレオ
チド配列を含むバキュロウイルスベクターの感染により達成することができる。
バキュロウイルスは、昆虫細胞において様々な組換えタンパク質を大量産生する
上で、極めて効率的な発現ベクターである。当業界において公知の種々の方法を
用いて、本発明のゼラチンまたはゼラチン前駆体をコードする配列と、適した転
写/翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる(例えば、
Luckowら(1989)Virology 170:31-39;およびGruenwald, S.およびJ. Heitz(1
993)Baculovirus Expression Vector System:Procedure & Methods Manual, P
hamingen、San Diego, CAを参照)。
【0201】動物
本発明は、本発明の組換えゼラチンまたは本発明の組換えゼラチンを誘導する
ことができるポリペプチドを動物系において発現させる方法を提供する。このよ
うな系としては、哺乳動物および非脊椎動物宿主細胞、ならびにトランスジェニ
ック動物が挙げられる。哺乳動物宿主細胞では、多数の発現系を使用することが
できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、本発明のポリペ
プチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分(tripartite)リーダ
ー配列から成るアデノウイルス転写/翻訳複合体に連結することができる。次に
、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えにより、アデノウイルスゲ
ノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入
を用いて、本発明のポリペプチドを感染した宿主細胞中に発現することができる
生存可能なウイルスを取得することができる(例えば、Logan, J.およびShenk,
T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照)。あるいは、ワクシ
ニア7.5Kプロモーターを用いてもよい(例えば、Mackettら(1982)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79:7415-7419(1982);Mackettら(1984), J. Virol. 49:85
7-864;およびPanicaliら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931を
参照)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RVS)エンハンサーのような当業界にお
いて公知の種々の転写エンハンサーを用いて、例えば、哺乳動物宿主細胞におけ
る発現を増大することも可能である。
ことができるポリペプチドを動物系において発現させる方法を提供する。このよ
うな系としては、哺乳動物および非脊椎動物宿主細胞、ならびにトランスジェニ
ック動物が挙げられる。哺乳動物宿主細胞では、多数の発現系を使用することが
できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、本発明のポリペ
プチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分(tripartite)リーダ
ー配列から成るアデノウイルス転写/翻訳複合体に連結することができる。次に
、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えにより、アデノウイルスゲ
ノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入
を用いて、本発明のポリペプチドを感染した宿主細胞中に発現することができる
生存可能なウイルスを取得することができる(例えば、Logan, J.およびShenk,
T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照)。あるいは、ワクシ
ニア7.5Kプロモーターを用いてもよい(例えば、Mackettら(1982)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79:7415-7419(1982);Mackettら(1984), J. Virol. 49:85
7-864;およびPanicaliら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931を
参照)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RVS)エンハンサーのような当業界にお
いて公知の種々の転写エンハンサーを用いて、例えば、哺乳動物宿主細胞におけ
る発現を増大することも可能である。
【0202】
セムリキ森林ウイルスは、哺乳動物細胞系の感染を可能にするような広い宿主
範囲を有することから、好ましい発現系である。このようなウイルスベクターを
用いた、哺乳動物宿主細胞、例えば、乳児ハムスター腎(BHK)細胞およびチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の感染によって、極めて高い組換え発現レ
ベルを達成することができる。さらに詳細には、セムリキ森林ウイルスは、発現
系が染色体組込みに基づくものではないため、該ウイルスを広範囲の宿主に用い
ることが考えられ、従って、構造−機能関係を同定し、種々のハイブリッド分子
の作用を試験することを目的とする研究において、組換えゼラチンの修飾を迅速
に獲得する手段となるであろう。哺乳動物宿主細胞における外因性タンパク質の
発現に用いられるセムリキ森林ウイルスベクターの構築方法は、当業界において
公知であり、例えば、Olkkonenら(1994)Methods Cell Biol 43:43-53に記載さ
れている。
範囲を有することから、好ましい発現系である。このようなウイルスベクターを
用いた、哺乳動物宿主細胞、例えば、乳児ハムスター腎(BHK)細胞およびチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の感染によって、極めて高い組換え発現レ
ベルを達成することができる。さらに詳細には、セムリキ森林ウイルスは、発現
系が染色体組込みに基づくものではないため、該ウイルスを広範囲の宿主に用い
ることが考えられ、従って、構造−機能関係を同定し、種々のハイブリッド分子
の作用を試験することを目的とする研究において、組換えゼラチンの修飾を迅速
に獲得する手段となるであろう。哺乳動物宿主細胞における外因性タンパク質の
発現に用いられるセムリキ森林ウイルスベクターの構築方法は、当業界において
公知であり、例えば、Olkkonenら(1994)Methods Cell Biol 43:43-53に記載さ
れている。
【0203】
さらに、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)が欠失したCHO細胞は、dhfr遺伝
子および所望のポリヌクレオチドを含む発現プラスミドでトランスフェクトする
ことができる。当業界で知られているように、メトトレキセートの濃度の増大に
耐性を有するCHO細胞の選択は、遺伝子増幅を経るため、所望の組換えタンパク
質のより高い発現レベルを提供する。
子および所望のポリヌクレオチドを含む発現プラスミドでトランスフェクトする
ことができる。当業界で知られているように、メトトレキセートの濃度の増大に
耐性を有するCHO細胞の選択は、遺伝子増幅を経るため、所望の組換えタンパク
質のより高い発現レベルを提供する。
【0204】
またトランスジェニック動物系を用いて、本発明の組換えゼラチンまたはこれ
らのゼラチンを誘導することができるポリペプチドを発現することもできる。こ
のような系を、例えば哺乳動物においてプロモーターおよび哺乳動物腺で発現を
もたらすことができるその他の必要なまたは任意の調節配列にコードポリペプチ
ドを機能的に連結することにより構築することができる。同様に、翻訳後修飾を
もたらす必要または任意の翻訳後酵素を、好適な発現系を用いる標的細胞中に同
時に産生することができる。トランスジェニック動物を用いてタンパク質を組換
えにより産生する方法は、当業界において公知である(例えば、米国特許第4,73
6,866号;米国特許第5,824,838号;米国特許第5,487,992号;および米国特許第5
,614,396号;ならびに同時係属米国特許出願第08/987,292号を参照)。
らのゼラチンを誘導することができるポリペプチドを発現することもできる。こ
のような系を、例えば哺乳動物においてプロモーターおよび哺乳動物腺で発現を
もたらすことができるその他の必要なまたは任意の調節配列にコードポリペプチ
ドを機能的に連結することにより構築することができる。同様に、翻訳後修飾を
もたらす必要または任意の翻訳後酵素を、好適な発現系を用いる標的細胞中に同
時に産生することができる。トランスジェニック動物を用いてタンパク質を組換
えにより産生する方法は、当業界において公知である(例えば、米国特許第4,73
6,866号;米国特許第5,824,838号;米国特許第5,487,992号;および米国特許第5
,614,396号;ならびに同時係属米国特許出願第08/987,292号を参照)。
【0205】ワクチン製剤
本発明は、ワクチンを含む様々な医薬品の成分として本発明の組換えゼラチン
を使用することを特に意図する(例、「組換えゼラチン」という名称の、200
0年11月10日に出願された、共有の同時継続出願、米国出願番号 を参照のこと、参照によりここに完全に組み込まれる)。ゆえに、1つの態様に
おいて、本発明は組換えゼラチンを含むワクチン製剤を提供する。好ましい実施
形態において、組換えゼラチンはヒト由来である。本組換えゼラチンは、当技術
分野においてこれまで無理であった利点を提供する。つまり、天然のヒトコラー
ゲン配列由来のゼラチンを用いることで、ゼラチン自身の免疫原性および/また
は抗原性の危険性が減少する。本発明の特定の実施形態において、非免疫原性組
換えゼラチンを含むワクチンを提供する(実施例12参照。)。さらなる実施形
態において、非免疫原性組換えゼラチンはヒト配列由来である。他の実施形態に
おいて、非免疫原性組換えゼラチンは、例えばウシまたはブタ配列などの動物源
に由来する。さらなる実施形態において、非免疫原性組換えゼラチンは非天然配
列を含む。
を使用することを特に意図する(例、「組換えゼラチン」という名称の、200
0年11月10日に出願された、共有の同時継続出願、米国出願番号 を参照のこと、参照によりここに完全に組み込まれる)。ゆえに、1つの態様に
おいて、本発明は組換えゼラチンを含むワクチン製剤を提供する。好ましい実施
形態において、組換えゼラチンはヒト由来である。本組換えゼラチンは、当技術
分野においてこれまで無理であった利点を提供する。つまり、天然のヒトコラー
ゲン配列由来のゼラチンを用いることで、ゼラチン自身の免疫原性および/また
は抗原性の危険性が減少する。本発明の特定の実施形態において、非免疫原性組
換えゼラチンを含むワクチンを提供する(実施例12参照。)。さらなる実施形
態において、非免疫原性組換えゼラチンはヒト配列由来である。他の実施形態に
おいて、非免疫原性組換えゼラチンは、例えばウシまたはブタ配列などの動物源
に由来する。さらなる実施形態において、非免疫原性組換えゼラチンは非天然配
列を含む。
【0206】
さらに、本発明のゼラチンは制御された環境で組換えによって生産されるため
、TSEs、病原性細菌またはウイルスなどの感染性物質による感染の危険性、ある
いは加工の際に取り込まれたかあるいは残存する内毒素および病原体にさらされ
る危険性が実質上排除される。組換えゼラチンおよびその誘導体、断片、または
それぞれが特定の用途に対して物理的および化学的な性質が最適化されているそ
の機能的等価物を含む、改良された安定剤を提供することは本発明の別の目的で
ある。
、TSEs、病原性細菌またはウイルスなどの感染性物質による感染の危険性、ある
いは加工の際に取り込まれたかあるいは残存する内毒素および病原体にさらされ
る危険性が実質上排除される。組換えゼラチンおよびその誘導体、断片、または
それぞれが特定の用途に対して物理的および化学的な性質が最適化されているそ
の機能的等価物を含む、改良された安定剤を提供することは本発明の別の目的で
ある。
【0207】
ワクチンの開発において安定化は重大な問題であり、ほとんどの存在するウイ
ルスの相対的な不安定性を解決しなければならない。ワクチンは時間の経過にし
たがって分解して、効能および有効性を失う可能性がある。さらに、ワクチンは
世界中の環境および条件が多様な範囲に分配されている。例えば、発展途上国に
おけるワクチンの普及は、例えば高い周囲温度などの不完全な保存条件のために
以前は問題となっていた。正しい保存および/または輸送条件下で、ワクチン製
剤の安定性が解決され得る(例、Chang, A. C.ら(1996) J. Pharm. Sci. 85:129
-132、Koyama, K.ら(1996)、Osame, J., ヨーロッパ特許第0 568 726 B1号、お
よび米国特許第4,337,242号を参照。)。
ルスの相対的な不安定性を解決しなければならない。ワクチンは時間の経過にし
たがって分解して、効能および有効性を失う可能性がある。さらに、ワクチンは
世界中の環境および条件が多様な範囲に分配されている。例えば、発展途上国に
おけるワクチンの普及は、例えば高い周囲温度などの不完全な保存条件のために
以前は問題となっていた。正しい保存および/または輸送条件下で、ワクチン製
剤の安定性が解決され得る(例、Chang, A. C.ら(1996) J. Pharm. Sci. 85:129
-132、Koyama, K.ら(1996)、Osame, J., ヨーロッパ特許第0 568 726 B1号、お
よび米国特許第4,337,242号を参照。)。
【0208】
ワクチンの安定化は、ワクチンの安全性および有効性の維持に関与する。従っ
て、安定剤は異なる対象の種類において機能する化合物である。例えば、麻疹、
流行性耳下腺炎、風疹、およびイヌジステンパーに対するワクチンなどの生ワク
チンにおいて、安定性はワクチンの感染力価/非感染性、および適切な免疫応答
を引き起こす能力の維持に関与している。インフルエンザ、A型肝炎、ポリオ(I
PV)、および狂犬病に対するワクチンなどの不活化ワクチンと同様に、コレラお
よび百日咳などの細菌タンパク毒素から精製したワクチンにおいて、その所望さ
れる抗体反応を誘導するための能力には、適切なエピトープの抗原性構造と正し
い立体構造を保持するために、ワクチンの構造的な完全性の維持が必要である。
従って、予想される、保存期間の変更、および保存、輸送、および使用条件の変
化において、ワクチン調剤の効果的な安定性が必要である。
て、安定剤は異なる対象の種類において機能する化合物である。例えば、麻疹、
流行性耳下腺炎、風疹、およびイヌジステンパーに対するワクチンなどの生ワク
チンにおいて、安定性はワクチンの感染力価/非感染性、および適切な免疫応答
を引き起こす能力の維持に関与している。インフルエンザ、A型肝炎、ポリオ(I
PV)、および狂犬病に対するワクチンなどの不活化ワクチンと同様に、コレラお
よび百日咳などの細菌タンパク毒素から精製したワクチンにおいて、その所望さ
れる抗体反応を誘導するための能力には、適切なエピトープの抗原性構造と正し
い立体構造を保持するために、ワクチンの構造的な完全性の維持が必要である。
従って、予想される、保存期間の変更、および保存、輸送、および使用条件の変
化において、ワクチン調剤の効果的な安定性が必要である。
【0209】
現在の安定化法は、保存性および熱安定性の改良を探求し、適切なin vivo送
達を確実にすることによって感染性薬剤に対する免疫学的応答を刺激し、そして
防御効果に必要な免疫化の数を減らす可能性を有する製剤を提供するものである
。低温での使用、凍結乾燥処理、および化学安定剤の使用などのいくつかの安定
化方法が過去に用いられてきた。例えば、約-10℃〜-70℃の保存条件を提供する
低温保存設備は、ワクチン製剤の安定性の維持のための1つの方法を提供するこ
とができる。しかしながら、そのような設備がワクチンの輸送中あるいは配布中
にいつも使用できるというわけではない。適切な保存設備の「コールドチェーン
」を維持することは、必要な装置の監視および維持、および開発から投与までの
ワクチン製剤の保護に必要な適切な基幹設備の観点から困難な場合がある。
達を確実にすることによって感染性薬剤に対する免疫学的応答を刺激し、そして
防御効果に必要な免疫化の数を減らす可能性を有する製剤を提供するものである
。低温での使用、凍結乾燥処理、および化学安定剤の使用などのいくつかの安定
化方法が過去に用いられてきた。例えば、約-10℃〜-70℃の保存条件を提供する
低温保存設備は、ワクチン製剤の安定性の維持のための1つの方法を提供するこ
とができる。しかしながら、そのような設備がワクチンの輸送中あるいは配布中
にいつも使用できるというわけではない。適切な保存設備の「コールドチェーン
」を維持することは、必要な装置の監視および維持、および開発から投与までの
ワクチン製剤の保護に必要な適切な基幹設備の観点から困難な場合がある。
【0210】
別の安定化技術は、多様な凍結乾燥あるいはフリーズドライ処理の使用を含む
。凍結乾燥は理論的に効果的ではあるが、しかし経費の高い処理法である。凍結
乾燥過程では、3つの異なる手順(凍結、一次乾燥、および二次乾燥)が必要で
あり、それら各々は天然の構造および生体高分子や微生物の活性の維持に対して
難題を与える。(Burkeら(1999) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16:1-8
3、および本文の参照を参照。)凍結乾燥ワクチンは、約4℃から8℃においてか
なり安定を保つが、しかし保存期間中に劣化する。凍結乾燥ワクチンは、保存中
の12から24ヶ月あたりまでにゆっくりと劣化し、ワクチン製剤は免疫を与えるの
に十分な力価が欠乏する。さらに、凍結乾燥ワクチン製剤は、使用する前に液体
を加えて元に戻さなくてはならない。その上、液体で戻した製剤は、室温にある
間に効力を失う。このことは結果として不完全な免疫応答を生じさせ、そして防
御効果に必要な免疫化の回数の増加をもたらし得る。
。凍結乾燥は理論的に効果的ではあるが、しかし経費の高い処理法である。凍結
乾燥過程では、3つの異なる手順(凍結、一次乾燥、および二次乾燥)が必要で
あり、それら各々は天然の構造および生体高分子や微生物の活性の維持に対して
難題を与える。(Burkeら(1999) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16:1-8
3、および本文の参照を参照。)凍結乾燥ワクチンは、約4℃から8℃においてか
なり安定を保つが、しかし保存期間中に劣化する。凍結乾燥ワクチンは、保存中
の12から24ヶ月あたりまでにゆっくりと劣化し、ワクチン製剤は免疫を与えるの
に十分な力価が欠乏する。さらに、凍結乾燥ワクチン製剤は、使用する前に液体
を加えて元に戻さなくてはならない。その上、液体で戻した製剤は、室温にある
間に効力を失う。このことは結果として不完全な免疫応答を生じさせ、そして防
御効果に必要な免疫化の回数の増加をもたらし得る。
【0211】
安定性を付与するための別の研究方法において、安定剤をワクチン製剤に加え
、そして低温保存あるいは凍結乾燥法のどちらかと組み合わせて用いる。これら
の安定剤は安定性の維持に関して多様な機能を果たすことができ、例えば、製剤
のpHの維持、粘性および/または張性への寄与、制御された解離の補助、製剤の
成分の凝集と沈降を最小限にし、かつ、乾燥および/あるいはその後の長期保存
中の脱水によって起こる損傷を防ぐために定められた成分を水和することを含み
、これには天然のタンパク質構造を維持するための要件であるタンパク質の好ま
しい水和を含み得る。これらの材料の安定化効果を最大限にするために、安定剤
はしばしば組み合わせて使用され安定化効果を相乗的あるいは付加的に増加させ
ることができる。
、そして低温保存あるいは凍結乾燥法のどちらかと組み合わせて用いる。これら
の安定剤は安定性の維持に関して多様な機能を果たすことができ、例えば、製剤
のpHの維持、粘性および/または張性への寄与、制御された解離の補助、製剤の
成分の凝集と沈降を最小限にし、かつ、乾燥および/あるいはその後の長期保存
中の脱水によって起こる損傷を防ぐために定められた成分を水和することを含み
、これには天然のタンパク質構造を維持するための要件であるタンパク質の好ま
しい水和を含み得る。これらの材料の安定化効果を最大限にするために、安定剤
はしばしば組み合わせて使用され安定化効果を相乗的あるいは付加的に増加させ
ることができる。
【0212】
このようにワクチン製剤において使用される安定剤は、特に限定はされないが
、例えばバッファー、塩化ナトリウムあるいは塩化マグネシウムなどの塩、グル
タミン酸ナトリウム、アルギニン、リジンおよびシステインなどのアミノ酸、グ
ルコース、ガラクトース、フルクトース、およびマンノースなどの単糖類、スク
ロース、マルトース、およびラクトースなどの二糖類、ソルビトール、およびマ
ンニトールなどの糖アルコール、オリゴ糖、デンプン、セルロースなどの多糖類
およびそれらの誘導体、ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン、アスコ
ルビン酸などの多様な抗酸化剤、および加水分解化ゼラチンなどのゼラチンを含
む。
、例えばバッファー、塩化ナトリウムあるいは塩化マグネシウムなどの塩、グル
タミン酸ナトリウム、アルギニン、リジンおよびシステインなどのアミノ酸、グ
ルコース、ガラクトース、フルクトース、およびマンノースなどの単糖類、スク
ロース、マルトース、およびラクトースなどの二糖類、ソルビトール、およびマ
ンニトールなどの糖アルコール、オリゴ糖、デンプン、セルロースなどの多糖類
およびそれらの誘導体、ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン、アスコ
ルビン酸などの多様な抗酸化剤、および加水分解化ゼラチンなどのゼラチンを含
む。
【0213】
加水分解化ゼラチンは、ワクチンの成分、例えば、液体および凍結乾燥ワクチ
ン製剤のための安定剤として使用されてきた(例えば、米国特許第4,985,244号
、米国特許第4,147,772号、米国特許第4,338,335号、およびMakino, Sらの欧州
特許番号第0 295 043 B1号を参照)。現在入手可能な部分的加水分解化ゼラチン
は、従来からの抽出方法によって生きた動物源から生産されたゼラチンに由来す
る(例えば、Asghar, A.(1982) Adv. Food Res. 28:231-372、およびMiller, E.
J.ら(1982) Methods in Enzymology 82:33-64を参照)。
ン製剤のための安定剤として使用されてきた(例えば、米国特許第4,985,244号
、米国特許第4,147,772号、米国特許第4,338,335号、およびMakino, Sらの欧州
特許番号第0 295 043 B1号を参照)。現在入手可能な部分的加水分解化ゼラチン
は、従来からの抽出方法によって生きた動物源から生産されたゼラチンに由来す
る(例えば、Asghar, A.(1982) Adv. Food Res. 28:231-372、およびMiller, E.
J.ら(1982) Methods in Enzymology 82:33-64を参照)。
【0214】
ゼラチンは、例えば凍結乾燥ワクチンの様々な段階においてワクチンに安定性
を付与することができる。凍結乾燥には、極端な温度、pH、塩濃度などを含む多
様な極端な手順を伴う。溶媒の除去および溶質の濃縮および乾燥により、酸化還
元反応が起こる可能性がある。表面活性、接着性、乳化作用、および粘性向上特
性を含むゼラチンの多様な性質は、その様な環境で使用すれば、その安定化効果
に寄与することができる。
を付与することができる。凍結乾燥には、極端な温度、pH、塩濃度などを含む多
様な極端な手順を伴う。溶媒の除去および溶質の濃縮および乾燥により、酸化還
元反応が起こる可能性がある。表面活性、接着性、乳化作用、および粘性向上特
性を含むゼラチンの多様な性質は、その様な環境で使用すれば、その安定化効果
に寄与することができる。
【0215】
凍結乾燥動物源ゼラチンが用いられて多少の成功が得られてきたが、それらは
本来ヒトの組織にとって異質なタンパク質であり、したがって望ましくない抗原
性および/あるいは免疫原性応答を引き起こす可能性がある。さらに、現在入手
可能な材料は、多様性と純度の問題を抱えている。動物由来タンパク質中のTSEs
などの感染性物質の存在に関しては、かかる材料の回収と使用に関する政府およ
び監督局の制限がもたらされた。例えば、市販材料のゼラチン内の内毒素濃度は
一般的に約1.0から1.5EU/mgの範囲である(例、Schaegger, H.およびG. von Jag
ow(1987) Anal. Biochem. 166:368-379、およびFriberger, P.ら(1987) in Dete
ction of Bacterial Endotoxins with the Limulus Ameobocyte Lysate Test, P
rog. Clin. Biol. Res. 231:149-169を参照)。
本来ヒトの組織にとって異質なタンパク質であり、したがって望ましくない抗原
性および/あるいは免疫原性応答を引き起こす可能性がある。さらに、現在入手
可能な材料は、多様性と純度の問題を抱えている。動物由来タンパク質中のTSEs
などの感染性物質の存在に関しては、かかる材料の回収と使用に関する政府およ
び監督局の制限がもたらされた。例えば、市販材料のゼラチン内の内毒素濃度は
一般的に約1.0から1.5EU/mgの範囲である(例、Schaegger, H.およびG. von Jag
ow(1987) Anal. Biochem. 166:368-379、およびFriberger, P.ら(1987) in Dete
ction of Bacterial Endotoxins with the Limulus Ameobocyte Lysate Test, P
rog. Clin. Biol. Res. 231:149-169を参照)。
【0216】
本発明は、ワクチンの成分として用いる組換えゼラチン、およびかかる組換え
ゼラチンを生産する方法を提供する。1つの態様において、組換えゼラチンはヒ
ト組換えゼラチンである。本発明の方法において、動物源由来の市販のゼラチン
より2桁から3桁での内毒素濃度の低減が可能である(実施例8参照)。従って
、本発明は、1つの実施形態において実質的に内毒素を含まない組換えゼラチン
を提供する。
ゼラチンを生産する方法を提供する。1つの態様において、組換えゼラチンはヒ
ト組換えゼラチンである。本発明の方法において、動物源由来の市販のゼラチン
より2桁から3桁での内毒素濃度の低減が可能である(実施例8参照)。従って
、本発明は、1つの実施形態において実質的に内毒素を含まない組換えゼラチン
を提供する。
【0217】
さらに、本発明は特に、非免疫原性ゼラチンを提供する。1つの実施形態にお
いて、本発明は組換えゼラチンを含むワクチンを提供し、該組換えゼラチンはヒ
トゼラチンである。かかる材料をワクチン製剤の成分として使用することで、動
物由来ゼラチン成分を用いることにより現在存在する免疫原性の危険性を減らす
ことができる(例えば、SakaguchiおよびInouye, 前述、Sakaguchiら, 前述、Na
kayamaら, 前述、Asher, 前述、およびVerdrager, 前述を参照)。天然のヒト配
列由来のゼラチンを用いることで、ゼラチン産物に対する投与後の免疫原性応答
の可能性が減少するであろう。1つの実施形態において、本発明は改変したコラ
ーゲン構築物によりコードされる組換えゼラチンの使用を提供する。この場合の
、コードされているゼラチンは非免疫原性である(実施例12を参照)。このよ
うな組換えゼラチンは、免疫原性および抗原性応答を引き起こす原因となる領域
を同定するために設計されたアッセイを利用して構築することができ、本発明の
組換えゼラチンはこれらの領域を避けるように特別に作製することができる。
いて、本発明は組換えゼラチンを含むワクチンを提供し、該組換えゼラチンはヒ
トゼラチンである。かかる材料をワクチン製剤の成分として使用することで、動
物由来ゼラチン成分を用いることにより現在存在する免疫原性の危険性を減らす
ことができる(例えば、SakaguchiおよびInouye, 前述、Sakaguchiら, 前述、Na
kayamaら, 前述、Asher, 前述、およびVerdrager, 前述を参照)。天然のヒト配
列由来のゼラチンを用いることで、ゼラチン産物に対する投与後の免疫原性応答
の可能性が減少するであろう。1つの実施形態において、本発明は改変したコラ
ーゲン構築物によりコードされる組換えゼラチンの使用を提供する。この場合の
、コードされているゼラチンは非免疫原性である(実施例12を参照)。このよ
うな組換えゼラチンは、免疫原性および抗原性応答を引き起こす原因となる領域
を同定するために設計されたアッセイを利用して構築することができ、本発明の
組換えゼラチンはこれらの領域を避けるように特別に作製することができる。
【0218】
抗原性、免疫原性および動物由来の材料を用いることに関連する感染の危険性
のないゼラチン材料を提供することに加え、本発明は一貫性のある産物の再生可
能な資源とする事ができる。特に、本ゼラチンは、同一分子の同種混合物として
提供することができる。特定の医療用途において所望の物理的性質を、特に確実
性のある送達および達成することができる。本発明はこのように信頼性、および
確実性を有する産物を提供し、これは、現在のゼラチン産物の利用性と使用に関
連した多様性を最小限にするであろう。
のないゼラチン材料を提供することに加え、本発明は一貫性のある産物の再生可
能な資源とする事ができる。特に、本ゼラチンは、同一分子の同種混合物として
提供することができる。特定の医療用途において所望の物理的性質を、特に確実
性のある送達および達成することができる。本発明はこのように信頼性、および
確実性を有する産物を提供し、これは、現在のゼラチン産物の利用性と使用に関
連した多様性を最小限にするであろう。
【0219】
本発明の組換えゼラチンは、個々の適用に適した特定の物理特性を有するよう
に設計することができる。本発明は、最終的なゼラチン製剤の分子量、ゲル強度
、およびpHなどの性質を変化させて、所望の特定の特性を有するゼラチンを生産
し、そして現在入手可能な材料ではとても達成できない摂取する者の特異性に会
わせるための方法を提供する。さらに、このような製剤は、摂取する者に本組換
えゼラチンに対する既存の工程および製剤の改良を探求すること、ならびに新し
い用途を開発することができる。
に設計することができる。本発明は、最終的なゼラチン製剤の分子量、ゲル強度
、およびpHなどの性質を変化させて、所望の特定の特性を有するゼラチンを生産
し、そして現在入手可能な材料ではとても達成できない摂取する者の特異性に会
わせるための方法を提供する。さらに、このような製剤は、摂取する者に本組換
えゼラチンに対する既存の工程および製剤の改良を探求すること、ならびに新し
い用途を開発することができる。
【0220】
純度の問題に関して、本発明は実質的に内毒素を含まない組換えゼラチンを提
供する(実施例8)。さらに、多様性に関連する危険性ならびに再現性および性
質の予測に関連した問題は、本発明の組換えゼラチンは十分に明確にされた特性
および性質を有するゼラチンポリペプチドを含み得るので、実質的に除去される
。1つの実施形態において、本発明は組換えゼラチンポリペプチドの均一な混合
物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、本発明は組換えゼラチ
ンポリペプチドの異種混合物を提供する。
供する(実施例8)。さらに、多様性に関連する危険性ならびに再現性および性
質の予測に関連した問題は、本発明の組換えゼラチンは十分に明確にされた特性
および性質を有するゼラチンポリペプチドを含み得るので、実質的に除去される
。1つの実施形態において、本発明は組換えゼラチンポリペプチドの均一な混合
物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、本発明は組換えゼラチ
ンポリペプチドの異種混合物を提供する。
【0221】
1つの実施形態において、本発明は特定の分子量を有する組換えゼラチンを包
含する。別の実施形態において、本発明は特定の分子量範囲を有する組換えゼラ
チンを提供する(実施例1を参照)。例えば、本発明は、安定剤としてワクチン
製剤に使用される現在入手可能な動物由来の可溶性ゼラチンに類似した分子量分
布を有する組換えヒト可溶性ゼラチンを生産することができる(実施例1、7、
および9を参照)。
含する。別の実施形態において、本発明は特定の分子量範囲を有する組換えゼラ
チンを提供する(実施例1を参照)。例えば、本発明は、安定剤としてワクチン
製剤に使用される現在入手可能な動物由来の可溶性ゼラチンに類似した分子量分
布を有する組換えヒト可溶性ゼラチンを生産することができる(実施例1、7、
および9を参照)。
【0222】
特定の分子量である均一なポリペプチドを含む組換えゼラチンを特に提供する
。現在ワクチンに使用されるゼラチンは、一般的にはおよそ60kDa以下の水和さ
れた断片である。このような断片は、例えばゼラチンの免疫原性反応の危険を減
少させるのに好ましい。本発明のゼラチンは低分子量ポリペプチドとして提供さ
れることができる。さらに、本発明の方法を用いて、免疫原性応答を引き起こす
原因となるコラーゲンおよびコラーゲン配列中の領域の同定、およびその領域を
含まない組換えゼラチンの生産によって、特定の非免疫原性組換えゼラチンを構
築することができる(実施例12を参照)。
。現在ワクチンに使用されるゼラチンは、一般的にはおよそ60kDa以下の水和さ
れた断片である。このような断片は、例えばゼラチンの免疫原性反応の危険を減
少させるのに好ましい。本発明のゼラチンは低分子量ポリペプチドとして提供さ
れることができる。さらに、本発明の方法を用いて、免疫原性応答を引き起こす
原因となるコラーゲンおよびコラーゲン配列中の領域の同定、およびその領域を
含まない組換えゼラチンの生産によって、特定の非免疫原性組換えゼラチンを構
築することができる(実施例12を参照)。
【0223】
ゼラチンはワクチンの加工および調製に使用され、ならびにワクチン製剤の成
分でもあることは注目すべきである。本発明の組換えゼラチンは、調製および加
工段階において用いることができ、そして現在利用されている動物由来の産物に
ない特有の利点を提供することができる。例えば、本発明のゼラチンは、規定お
よび解析された特性を有する均一な分子として生産することができ、性能の多様
性を制限し、製造手順の微調整および再現性を可能とする。
分でもあることは注目すべきである。本発明の組換えゼラチンは、調製および加
工段階において用いることができ、そして現在利用されている動物由来の産物に
ない特有の利点を提供することができる。例えば、本発明のゼラチンは、規定お
よび解析された特性を有する均一な分子として生産することができ、性能の多様
性を制限し、製造手順の微調整および再現性を可能とする。
【0224】
ワクチン製剤に使用されているような、市販の動物由来の可溶性ゼラチンの分
子量分布は、約0〜30kDaおよび約0〜60kDaの範囲である(実施例9を参照)。本
発明は、市販のゼラチンと同じ分子量分布を持ち、それと同じ目的に使用できる
組換えヒトゼラチンを生産する方法を提供する。さらに、本発明は、市販の材料
からは入手不可能な、例えば約10から30kDa、あるいは約30から50kDaの狭い分子
量分布を有するゼラチンを生産する方法を提供する。
子量分布は、約0〜30kDaおよび約0〜60kDaの範囲である(実施例9を参照)。本
発明は、市販のゼラチンと同じ分子量分布を持ち、それと同じ目的に使用できる
組換えヒトゼラチンを生産する方法を提供する。さらに、本発明は、市販の材料
からは入手不可能な、例えば約10から30kDa、あるいは約30から50kDaの狭い分子
量分布を有するゼラチンを生産する方法を提供する。
【0225】
本発明は、一定の適用に使用する適切な分子量を有する組換えゼラチンの生産
のための複数の方法を提供する。例えば、組換えゼラチンは、酸、熱、あるいは
酵素的加水分解を含む加水分解技術といった組換えコラーゲンの加工を通して得
ることができる(実施例9および10を参照)。別の態様において、組換えゼラ
チンは非加水分解物であり、そして適切なサイズの組換えゼラチンは、改良され
たコラーゲン構築物からの組換えゼラチンの発現を通して得る(実施例1を参照
)。
のための複数の方法を提供する。例えば、組換えゼラチンは、酸、熱、あるいは
酵素的加水分解を含む加水分解技術といった組換えコラーゲンの加工を通して得
ることができる(実施例9および10を参照)。別の態様において、組換えゼラ
チンは非加水分解物であり、そして適切なサイズの組換えゼラチンは、改良され
たコラーゲン構築物からの組換えゼラチンの発現を通して得る(実施例1を参照
)。
【0226】
本発明は、個々の適用に適した明確な温度特性を獲得するために、架橋、ヒド
ロキシル化、分子量、またはそのあらゆる組み合わせた操作により特別に作製さ
れた組換えゼラチンの生産を提供する。1つの態様において、本発明は、これら
のワクチンが長期間高温に曝される場合であっても、熱安定性を改良し得る安定
剤または賦形剤としての使用に適した組換えゼラチンを提供する。別の態様にお
いて、本発明は、例えば黄熱病などのウイルスワクチンを含み、活性成分が熱感
受性である特定のワクチンに関連した使用に適切な安定剤を提供する。1つの実
施形態において、本発明は、零下以上の温度においてワクチンを安定化する組換
えゼラチンを提供する。
ロキシル化、分子量、またはそのあらゆる組み合わせた操作により特別に作製さ
れた組換えゼラチンの生産を提供する。1つの態様において、本発明は、これら
のワクチンが長期間高温に曝される場合であっても、熱安定性を改良し得る安定
剤または賦形剤としての使用に適した組換えゼラチンを提供する。別の態様にお
いて、本発明は、例えば黄熱病などのウイルスワクチンを含み、活性成分が熱感
受性である特定のワクチンに関連した使用に適切な安定剤を提供する。1つの実
施形態において、本発明は、零下以上の温度においてワクチンを安定化する組換
えゼラチンを提供する。
【0227】
本発明の組換えゼラチンが、例えば、ウシまたはブタなどの起源のような特定
の動物資源由来の材料の使用を排除する、宗教的またはそれ以外の信念を持つ特
定の人々による使用に適した材料の資源を提供することができることを、本発明
が特別に意図することは注目すべきである。
の動物資源由来の材料の使用を排除する、宗教的またはそれ以外の信念を持つ特
定の人々による使用に適した材料の資源を提供することができることを、本発明
が特別に意図することは注目すべきである。
【0228】
1つの実施形態において、本発明のワクチンは、注射器に充填済みのもの、あ
るいはマイクロカプセルに入った形などのすぐに使える形に製造することができ
、使用前の二次的な工程の必要性を排除する。
るいはマイクロカプセルに入った形などのすぐに使える形に製造することができ
、使用前の二次的な工程の必要性を排除する。
【0229】
加水分解ゼラチンは、一般的なワクチン製剤における安定剤として使用される
。本発明は、1つの実施形態において、例えば類似した分子量、融解温度など、
加水分解された動物源のゼラチンと類似した性質を有する組換えゼラチンを提供
する。これらの組換えゼラチンは、組換えコラーゲンの加水分解を通して生産可
能であり、または改変したコラーゲン構築物から直接生産することもできる。本
発明は、再現性があり、そして十分に性質が解析され規定された特性を有するタ
ンパク質であるゼラチンを提供する。従って、ワクチンおよび/またはワクチン
の安定剤および成分の調製と製造に使用される組換えゼラチンは、本方法に従っ
て生産して制御された特定の性質を付与することができる。このように、本ゼラ
チンを使用することは、ワクチンの製造業者にとって、その生産工程において、
微調整により多様性を最小限にすると共に、現在入手可能である動物源の産物を
使用するより大きな効果および経費効率がより優れた方法で組換えゼラチンを使
用することを可能とする。
。本発明は、1つの実施形態において、例えば類似した分子量、融解温度など、
加水分解された動物源のゼラチンと類似した性質を有する組換えゼラチンを提供
する。これらの組換えゼラチンは、組換えコラーゲンの加水分解を通して生産可
能であり、または改変したコラーゲン構築物から直接生産することもできる。本
発明は、再現性があり、そして十分に性質が解析され規定された特性を有するタ
ンパク質であるゼラチンを提供する。従って、ワクチンおよび/またはワクチン
の安定剤および成分の調製と製造に使用される組換えゼラチンは、本方法に従っ
て生産して制御された特定の性質を付与することができる。このように、本ゼラ
チンを使用することは、ワクチンの製造業者にとって、その生産工程において、
微調整により多様性を最小限にすると共に、現在入手可能である動物源の産物を
使用するより大きな効果および経費効率がより優れた方法で組換えゼラチンを使
用することを可能とする。
【0230】
本発明の組換えゼラチンがいかなるタイプのワクチンにも使用可能であること
は、特に意図される。例えば、本組換えゼラチンは、生きた弱毒化、不活性化、
およびサブユニットワクチン、1回用量および混合ワクチン、ウイルス、細菌お
よび寄生体に基づくワクチン、および合成および半合成ワクチンを含む核酸ワク
チンに使用することができる。
は、特に意図される。例えば、本組換えゼラチンは、生きた弱毒化、不活性化、
およびサブユニットワクチン、1回用量および混合ワクチン、ウイルス、細菌お
よび寄生体に基づくワクチン、および合成および半合成ワクチンを含む核酸ワク
チンに使用することができる。
【0231】
本発明のワクチンは、例えば液体、または凍結乾燥された製剤である一般的な
ワクチンに適した任意の形態で製剤されうる。さらに特に、本発明は液体および
凍結乾燥ウイルスワクチン、およびタンパク質に基づく医薬品を安定化する成分
に関する。ウイルス、細菌、および寄生体などを含む多様な微生物を標的とした
ワクチンの多様な形態が意図される。例えば、本発明の組換えゼラチンは、例と
して生ワクチン、不活化ワクチン、およびサブユニットワクチンの製剤に使用す
ることができる。
ワクチンに適した任意の形態で製剤されうる。さらに特に、本発明は液体および
凍結乾燥ウイルスワクチン、およびタンパク質に基づく医薬品を安定化する成分
に関する。ウイルス、細菌、および寄生体などを含む多様な微生物を標的とした
ワクチンの多様な形態が意図される。例えば、本発明の組換えゼラチンは、例と
して生ワクチン、不活化ワクチン、およびサブユニットワクチンの製剤に使用す
ることができる。
【0232】
1つの態様において、本発明は組換えゼラチンを含むサブユニットワクチンを
提供する。さらなる実施形態において、該サブユニットワクチンは、非免疫原性
組換えゼラチンを含む。1つの実施形態において、該組換えゼラチンはヒト組換
えゼラチンであってよい。様々な実施形態において、組換えゼラチンは組換えコ
ラーゲンの加水分解物に由来するものであり、改変されたコラーゲン構築物から
直接生産され、分子量の均一な同種混合物であり、ワクチンの一般的な製剤およ
び送達方法に最も適した融解温度を有する。別の実施形態において、組換えヒト
ゼラチンは、配列番号15〜25、配列番号30、配列番号31、および配列番
号33からなる群より選択される配列を含む。
提供する。さらなる実施形態において、該サブユニットワクチンは、非免疫原性
組換えゼラチンを含む。1つの実施形態において、該組換えゼラチンはヒト組換
えゼラチンであってよい。様々な実施形態において、組換えゼラチンは組換えコ
ラーゲンの加水分解物に由来するものであり、改変されたコラーゲン構築物から
直接生産され、分子量の均一な同種混合物であり、ワクチンの一般的な製剤およ
び送達方法に最も適した融解温度を有する。別の実施形態において、組換えヒト
ゼラチンは、配列番号15〜25、配列番号30、配列番号31、および配列番
号33からなる群より選択される配列を含む。
【0233】
本発明の組換えゼラチンは、いかなる感染性因子も標的としたあらゆるワクチ
ン中の安定剤として使用することができる。そのようなワクチンは特に限定はさ
れないが、例えばワクシニアウイルス(天然痘)、ポリオウイルス(ソークおよ
びセービン)、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘-帯状
疱疹(ニワトリポックス/帯状疱疹)、百日咳(whopping cough)、カルメット・
ゲラン杆菌(BCG、結核)、インフルエンザ菌性髄膜炎、狂犬病、コレラ、ペス
ト、日本脳炎、チフス菌、赤痢菌、A型肝炎、B型肝炎、ロタウイルス、アデノ
ウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペスウイルス、呼吸シンシチアルウイル
ス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイルス、シチメンチョウ・ヘルペスウ
イルス(マレク病)、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイ
ルス(RSV)、チフス、肺炎、ライム病、および炭疽症を含む。本明細書で用い
られるワクチンという用語は、多様な感染性および自己免疫性疾患および癌に対
するワクチンの意味を含み、例えば、例としてヒト免疫不全症ウイルス(HIV)
、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびマラリアなどに対するワクチンならびに胸部
、肺、結腸、腎臓、膀胱、および卵巣癌に対するワクチンのような、多様な感染
性および自己免疫性疾患および癌に対するワクチンが開発されてきており、また
将来開発されるであろう。
ン中の安定剤として使用することができる。そのようなワクチンは特に限定はさ
れないが、例えばワクシニアウイルス(天然痘)、ポリオウイルス(ソークおよ
びセービン)、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、水痘-帯状
疱疹(ニワトリポックス/帯状疱疹)、百日咳(whopping cough)、カルメット・
ゲラン杆菌(BCG、結核)、インフルエンザ菌性髄膜炎、狂犬病、コレラ、ペス
ト、日本脳炎、チフス菌、赤痢菌、A型肝炎、B型肝炎、ロタウイルス、アデノ
ウイルス、黄熱病、口蹄疫病、単純ヘルペスウイルス、呼吸シンシチアルウイル
ス、ロタウイルス、デング熱、西ナイルウイルス、シチメンチョウ・ヘルペスウ
イルス(マレク病)、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイ
ルス(RSV)、チフス、肺炎、ライム病、および炭疽症を含む。本明細書で用い
られるワクチンという用語は、多様な感染性および自己免疫性疾患および癌に対
するワクチンの意味を含み、例えば、例としてヒト免疫不全症ウイルス(HIV)
、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびマラリアなどに対するワクチンならびに胸部
、肺、結腸、腎臓、膀胱、および卵巣癌に対するワクチンのような、多様な感染
性および自己免疫性疾患および癌に対するワクチンが開発されてきており、また
将来開発されるであろう。
【0234】
本発明は多様な形態の送達を意図する製剤を包含する。ワクチンは、注射(例
えば皮下注射、筋肉注射および静脈注射などの非経口投与を含む注入用の製剤と
することができる。1つの実施形態において、ワクチンは噴霧剤、液体または他
の形態で、経口あるいは鼻腔送達などの粘膜表面への送達用の製剤とされる。さ
らなる態様において、このような製剤は適切な粘膜吸収増進作用を含む。例えば
、肺深部送達用などの吸入剤として製剤されるワクチンが、特に意図される。そ
のようなワクチンは、例えば細かい粉末形態に製剤され得る。本発明のワクチン
はまた、経皮あるいはリポソーム送達のために製剤することもできる。例えば、
腸内放出に適した多様な製剤が特に意図される。
えば皮下注射、筋肉注射および静脈注射などの非経口投与を含む注入用の製剤と
することができる。1つの実施形態において、ワクチンは噴霧剤、液体または他
の形態で、経口あるいは鼻腔送達などの粘膜表面への送達用の製剤とされる。さ
らなる態様において、このような製剤は適切な粘膜吸収増進作用を含む。例えば
、肺深部送達用などの吸入剤として製剤されるワクチンが、特に意図される。そ
のようなワクチンは、例えば細かい粉末形態に製剤され得る。本発明のワクチン
はまた、経皮あるいはリポソーム送達のために製剤することもできる。例えば、
腸内放出に適した多様な製剤が特に意図される。
【0235】
本発明のワクチン製剤は、食用ワクチンなどの可食性ワクチンを意図するワク
チンを含むことができ、その中の抗原は、例えばジャガイモなどのトランスジェ
ニック植物などの中に食用可能な形態で送達され、適切な防御反応を誘導するこ
とができる(例えば、Tacket, C. O.ら(2000) J. Infect. Dis. 182:302-305、
およびRichter, L. J.ら(2000) Nat. Biotech. 18:1167-1171を参照)。本発明
のワクチンは、例えばバナナやイチゴなどの可食性果実のトランスジェニック植
物の形態で提供することができる。
チンを含むことができ、その中の抗原は、例えばジャガイモなどのトランスジェ
ニック植物などの中に食用可能な形態で送達され、適切な防御反応を誘導するこ
とができる(例えば、Tacket, C. O.ら(2000) J. Infect. Dis. 182:302-305、
およびRichter, L. J.ら(2000) Nat. Biotech. 18:1167-1171を参照)。本発明
のワクチンは、例えばバナナやイチゴなどの可食性果実のトランスジェニック植
物の形態で提供することができる。
【0236】
例えば、ミクロスフィア中への本発明のカプセル化が特に意図される(例、Mo
ldoveanu, Z.ら(1993) J. Inf. Dis. 167:85-90を参照)。当業者にとって利用
可能な制御放出技術は、例えば、多様な放出様式(例えば、経皮、経肺(pulmonar
y)、および多因子放出(polymeric release)など)に適した製剤を得るために適用
することができ、これは特に意図される。
ldoveanu, Z.ら(1993) J. Inf. Dis. 167:85-90を参照)。当業者にとって利用
可能な制御放出技術は、例えば、多様な放出様式(例えば、経皮、経肺(pulmonar
y)、および多因子放出(polymeric release)など)に適した製剤を得るために適用
することができ、これは特に意図される。
【0237】
適した投与方法は、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、または腸管投
与および非経口導入を含み得る。これらは、筋肉内、皮下、髄室内注射、ならび
に、くも膜下、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内注射または眼球内注射が
含まれる。
与および非経口導入を含み得る。これらは、筋肉内、皮下、髄室内注射、ならび
に、くも膜下、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内注射または眼球内注射が
含まれる。
【0238】
多様な製剤および薬の送達系における技術は、当技術分野において利用可能で
あり、そして多数の資料に記載されている(例えば、Remingtons Pharmaceutica
l Aciences, 前述を参照)。最も効果的で便利な投与方法、および特定の状況に
最も適した製剤は、当技術分野において周知の方法により、容易に決定すること
ができる。
あり、そして多数の資料に記載されている(例えば、Remingtons Pharmaceutica
l Aciences, 前述を参照)。最も効果的で便利な投与方法、および特定の状況に
最も適した製剤は、当技術分野において周知の方法により、容易に決定すること
ができる。
【0239】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。以下の調製物および実
施例は、当業者が本発明をより明確に理解し実施できるようにするためのもので
ある。しかし、本発明は、例示する実施形態によりその範囲を限定されるもので
はなく、それら実施形態は、単に本発明の個々の態様を説明しようとするもので
あり、機能的に等価である方法は本発明の範囲内である。事実、本明細書中に記
載されているもの以外の本発明の種々の変更は、上記の記載および添付の図面か
ら当業者には明らかであろう。そのような変更は特許請求の範囲内にあるものと
する。
施例は、当業者が本発明をより明確に理解し実施できるようにするためのもので
ある。しかし、本発明は、例示する実施形態によりその範囲を限定されるもので
はなく、それら実施形態は、単に本発明の個々の態様を説明しようとするもので
あり、機能的に等価である方法は本発明の範囲内である。事実、本明細書中に記
載されているもの以外の本発明の種々の変更は、上記の記載および添付の図面か
ら当業者には明らかであろう。そのような変更は特許請求の範囲内にあるものと
する。
【0240】実施例
特に断らない限り、以下の材料および方法を本発明の実施例において用いた。
【0241】実施例1:組換えゼラチンの直接的発現
ヒトI型コラーゲンからのα1(I)cDNAの特定の断片を、PCRにより増幅し、プ
ラスミドpPICZαAまたはpPIC9K(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)にクローニ
ングした。クローニングに用いた特異的PCR用プライマーは下記の表1に示す。 特定の組換えゼラチンは、表2において、配列番号15〜25、30、31および33とし
て特定される。これらの組換えゼラチンは、ヒトプレプロα1(I)コラーゲン(Ge
nbank登録番号:CAA98968)を参照することにより更に特定される。用いた発現
用プラスミドは、酵母接合因子αプレプロ分泌配列に融合した各種の大きさのα
1(I)cDNA配列を含むものであった。当業界で公知の他のシグナル配列も使用可能
であり、例えば、酵母のインベルターゼ(SUC2)、酵母の酸フォスファターゼ(
PHO)配列、天然のプロコラーゲンシグナル配列、およびヒト血清アルブミンの
シグナル配列が挙げられる。特定の発現系において特定のゼラチン断片の発現レ
ベルを最適化するシグナル配列を選ぶべきである。
ラスミドpPICZαAまたはpPIC9K(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)にクローニ
ングした。クローニングに用いた特異的PCR用プライマーは下記の表1に示す。 特定の組換えゼラチンは、表2において、配列番号15〜25、30、31および33とし
て特定される。これらの組換えゼラチンは、ヒトプレプロα1(I)コラーゲン(Ge
nbank登録番号:CAA98968)を参照することにより更に特定される。用いた発現
用プラスミドは、酵母接合因子αプレプロ分泌配列に融合した各種の大きさのα
1(I)cDNA配列を含むものであった。当業界で公知の他のシグナル配列も使用可能
であり、例えば、酵母のインベルターゼ(SUC2)、酵母の酸フォスファターゼ(
PHO)配列、天然のプロコラーゲンシグナル配列、およびヒト血清アルブミンの
シグナル配列が挙げられる。特定の発現系において特定のゼラチン断片の発現レ
ベルを最適化するシグナル配列を選ぶべきである。
【0242】
【表1】
【0243】
【表2】
【0244】
発現用プラスミドを、エレクトロポレーションによりピキア・パストリス(Pi
chia pastoris)細胞に導入し、his4要求性の補完性(pPIC9Kベクターの場合)
またはゼオシンに対する耐性(pPICZαAベクターの場合)により形質転換体を選
択した。組換えタンパク質の発現は、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ
プロモーター(PAOX1)により調節した。ピキア・パストリス宿主細胞は、ヒト
プロピル4-ヒドロキシラーゼ(P4H)(コラーゲンにおけるヒドロキシプロリン
の翻訳後合成に関与する酵素)のαおよびβサブユニットの組込み型コピーを含
んでいた。上記酵素に関しては既に記載されている[例えば、Vuorela, M.ら, (
1997) EMBO J 16:6702-6712を参照されたい]。
chia pastoris)細胞に導入し、his4要求性の補完性(pPIC9Kベクターの場合)
またはゼオシンに対する耐性(pPICZαAベクターの場合)により形質転換体を選
択した。組換えタンパク質の発現は、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ
プロモーター(PAOX1)により調節した。ピキア・パストリス宿主細胞は、ヒト
プロピル4-ヒドロキシラーゼ(P4H)(コラーゲンにおけるヒドロキシプロリン
の翻訳後合成に関与する酵素)のαおよびβサブユニットの組込み型コピーを含
んでいた。上記酵素に関しては既に記載されている[例えば、Vuorela, M.ら, (
1997) EMBO J 16:6702-6712を参照されたい]。
【0245】
この酵母の株を緩衝化最少グリセロール培地で増殖させ、Invitrogen社のピキ
ア発現マニュアルに記載されているように炭素源としてグリセロールに代えてメ
タノール(0.5%)を含有する同じ培地を用いて組換えタンパク質の発現を誘導
した。ゼラチン産生株は、調整培地の10〜20%トリシンSDS-PAGE分析および振盪
フラスコ培養物からの抽出物のプロリル4-ヒドロキシラーゼの活性により同定し
た。プロピル4-ヒドロキシラーゼとコラーゲン断片との共発現により、天然のヒ
ト配列を持つ組換えゼラチンの発現がもたらされた。
ア発現マニュアルに記載されているように炭素源としてグリセロールに代えてメ
タノール(0.5%)を含有する同じ培地を用いて組換えタンパク質の発現を誘導
した。ゼラチン産生株は、調整培地の10〜20%トリシンSDS-PAGE分析および振盪
フラスコ培養物からの抽出物のプロリル4-ヒドロキシラーゼの活性により同定し
た。プロピル4-ヒドロキシラーゼとコラーゲン断片との共発現により、天然のヒ
ト配列を持つ組換えゼラチンの発現がもたらされた。
【0246】
その断片を発現させ、培地に分泌させた。組換えゼラチンを回収し、培地から
アセトン沈殿、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィーまたはそれら
の任意の組合せにより精製した。アセトン沈殿は、アセトンを無細胞培養上清に
最終濃度40%まで添加することにより、4℃で行った。こうして得られた沈殿は
、主に内因性の酵母タンパク質からなるものであり、それを遠心分離により回収
した。次に、この上清にアセトンを最終濃度80%まで添加して、ゼラチンを沈殿
させ、次にこれを遠心分離により回収し、水で一夜透析し、凍結乾燥した。アニ
オンおよびカチオン交換クロマトグラフィーを組み合せることにより、高純度の
ゼラチンが得られた。クロマトグラフィーによる精製は、室温で行った。
アセトン沈殿、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィーまたはそれら
の任意の組合せにより精製した。アセトン沈殿は、アセトンを無細胞培養上清に
最終濃度40%まで添加することにより、4℃で行った。こうして得られた沈殿は
、主に内因性の酵母タンパク質からなるものであり、それを遠心分離により回収
した。次に、この上清にアセトンを最終濃度80%まで添加して、ゼラチンを沈殿
させ、次にこれを遠心分離により回収し、水で一夜透析し、凍結乾燥した。アニ
オンおよびカチオン交換クロマトグラフィーを組み合せることにより、高純度の
ゼラチンが得られた。クロマトグラフィーによる精製は、室温で行った。
【0247】
コラーゲンタンパク質の大きさを、電気泳動により、アミノ酸組成に基づく分
子量の理論値と比較して推定することは、当業界では公知である[Butkowskiら,
(1982) Methods Enzymol 82:410-423]。この組換えゼラチンのN末端配列を分
析したところ、酵母分泌経路に該タンパク質を誘導するためにゼラチン断片に融
合させたプレプロ配列が正確にプロセッシングされたことが実証された。この系
において産生されたゼラチンは、ヒトコラーゲンに由来する配列だけを含むもの
であった。さらに、ピキア・パストリス細胞は非常にわずかなタンパク質しか分
泌しないので、この組換えゼラチンは調整培地の主成分となった。
子量の理論値と比較して推定することは、当業界では公知である[Butkowskiら,
(1982) Methods Enzymol 82:410-423]。この組換えゼラチンのN末端配列を分
析したところ、酵母分泌経路に該タンパク質を誘導するためにゼラチン断片に融
合させたプレプロ配列が正確にプロセッシングされたことが実証された。この系
において産生されたゼラチンは、ヒトコラーゲンに由来する配列だけを含むもの
であった。さらに、ピキア・パストリス細胞は非常にわずかなタンパク質しか分
泌しないので、この組換えゼラチンは調整培地の主成分となった。
【0248】
発現された組換えゼラチンは、異なる大きさのものであり、SDS-PAGEで測定し
た場合に約5kDa〜約65kDaの範囲であり、これは、例えば、図1に示すように、
約5kDa(レーン2、配列番号18)、約10kDa(レーン3、配列番号19)、約16kD
a(レーン4、配列番号24)、約18kDa(レーン5、配列番号20)、約20kDa(レ
ーン6、配列番号28)(これは理論上の分子量が17,914Daでもある、表1には示
さず)、約33kDa(レーン7、配列番号27)(これは理論上の分子量が29,625Da
でもある、表1には示さず)、約41kDa(レーン8、配列番号25)、および約50k
Da(レーン9、配列番号22)のゼラチンに該当している(レーン10は加水分解し
た組換えヒトI型コラーゲンに該当する。実施例10に記載のようにして調製した
もの)。
た場合に約5kDa〜約65kDaの範囲であり、これは、例えば、図1に示すように、
約5kDa(レーン2、配列番号18)、約10kDa(レーン3、配列番号19)、約16kD
a(レーン4、配列番号24)、約18kDa(レーン5、配列番号20)、約20kDa(レ
ーン6、配列番号28)(これは理論上の分子量が17,914Daでもある、表1には示
さず)、約33kDa(レーン7、配列番号27)(これは理論上の分子量が29,625Da
でもある、表1には示さず)、約41kDa(レーン8、配列番号25)、および約50k
Da(レーン9、配列番号22)のゼラチンに該当している(レーン10は加水分解し
た組換えヒトI型コラーゲンに該当する。実施例10に記載のようにして調製した
もの)。
【0249】実施例2:ヒト組換えゼラチンは細胞接着活性を促進する
本発明の組換えヒトゼラチン断片は、in vitroで細胞接着活性を示した。以下
のアッセイでは、96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)を、実施例1で記載され、
かつ表2に示されているように、ヒトI型コラーゲンのα1鎖からの以下の組換
えヒトゼラチンドメインで被覆した:配列番号19、配列番号20、配列番号21、お
よび配列番号22。VITROGENウシコラーゲン(Cohesion Technologies; Palo Alto
CA)およびウシ血清アルブミンを、それぞれ陽性対照および陰性対照として使
用した。それらタンパク質の各々を、0.1M NaHCO3(pH 10.0)で0.1mg/mlに希
釈し、プレートを4℃で一夜被覆した。ヒト包皮線維芽細胞(HFF)またはヒト
臍静脈内皮細胞(HUVEC、Clonetics製、第5継代)を被覆プレートに接種し、37
℃で60分間インキュベートした。実験はそれぞれ3回ずつ行った。
のアッセイでは、96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)を、実施例1で記載され、
かつ表2に示されているように、ヒトI型コラーゲンのα1鎖からの以下の組換
えヒトゼラチンドメインで被覆した:配列番号19、配列番号20、配列番号21、お
よび配列番号22。VITROGENウシコラーゲン(Cohesion Technologies; Palo Alto
CA)およびウシ血清アルブミンを、それぞれ陽性対照および陰性対照として使
用した。それらタンパク質の各々を、0.1M NaHCO3(pH 10.0)で0.1mg/mlに希
釈し、プレートを4℃で一夜被覆した。ヒト包皮線維芽細胞(HFF)またはヒト
臍静脈内皮細胞(HUVEC、Clonetics製、第5継代)を被覆プレートに接種し、37
℃で60分間インキュベートした。実験はそれぞれ3回ずつ行った。
【0250】
次に、細胞接着の程度を試薬WST-1を用いて測定し、その吸光度をELISA読取り
装置で450mMにて読み取った。図2Aでは、組換えヒトゼラチンがMaxisorpプレー
トへのHFFの接着を促進し、これらの細胞の場合、接着は、各ウェルに被覆した
組換えヒトゼラチンの分子量に正比例することを示している。具体的に述べると
、配列番号19、配列番号20および配列番号21の組換えゼラチンは、BSAを用いて
見られる場合よりも非常に高度にHFFの接着を促進した。図2Bでは、各種の組換
えヒトゼラチンが、内皮細胞の接着を促進することを示している。細胞接着活性
はまた、組換えヒトコラーゲンの熱加水分解により調製した組換えヒトゼラチン
(実施例9で後記する)を用いて、分子量が0〜30kDaおよび0〜50kDaの範囲で
ある組換えゼラチンを用いた場合にも実証された。
装置で450mMにて読み取った。図2Aでは、組換えヒトゼラチンがMaxisorpプレー
トへのHFFの接着を促進し、これらの細胞の場合、接着は、各ウェルに被覆した
組換えヒトゼラチンの分子量に正比例することを示している。具体的に述べると
、配列番号19、配列番号20および配列番号21の組換えゼラチンは、BSAを用いて
見られる場合よりも非常に高度にHFFの接着を促進した。図2Bでは、各種の組換
えヒトゼラチンが、内皮細胞の接着を促進することを示している。細胞接着活性
はまた、組換えヒトコラーゲンの熱加水分解により調製した組換えヒトゼラチン
(実施例9で後記する)を用いて、分子量が0〜30kDaおよび0〜50kDaの範囲で
ある組換えゼラチンを用いた場合にも実証された。
【0251】実施例3:タンパク質加水分解に対して安定なゼラチン断片の同定
組換えゼラチン断片は、組換えピキア・パストリス細胞の培地中でのそれらの
発現および蓄積の間にタンパク質加水分解により改変されていることが判明した
。I型コラーゲンのα1鎖のらせん状ドメインの数種の異なる部分を発現させる
ことにより、タンパク質加水分解に関して安定性に優れる組換えゼラチンを特定
できる。3種の異なるゼラチン断片をプラスミドpPICZαAにクローニングし、ピ
キア・パストリス細胞における組換えタンパク質発現時にそれらの相対的な安定
性を評価した。
発現および蓄積の間にタンパク質加水分解により改変されていることが判明した
。I型コラーゲンのα1鎖のらせん状ドメインの数種の異なる部分を発現させる
ことにより、タンパク質加水分解に関して安定性に優れる組換えゼラチンを特定
できる。3種の異なるゼラチン断片をプラスミドpPICZαAにクローニングし、ピ
キア・パストリス細胞における組換えタンパク質発現時にそれらの相対的な安定
性を評価した。
【0252】
用いた第1の株は、上記の実施例2に記載されており、これは配列番号19に対
応する。それ以外の株は、ヒトα1(I)らせん状ドメインのアミノ酸残基179〜2
80(配列番号15)および615〜715(配列番号23)をコードするプラスミドを用い
て作製した。これらの組換えゼラチンは、実施例1に記載されているようにして
、配列番号5と配列番号6および配列番号3と配列番号7のプライマーを用いて
構築した。PCR産物をXhoIおよびXbaIで消化し、クローニングし、上記のように
してエレクトロポレーション用に調製した。これらの株を増殖させ、タンパク質
発現を誘導し、発現されたゼラチン断片をDSD-PAGEにより比較した。図3では、
配列番号15の組換えゼラチン(レーン2)および配列番号19の組換えゼラチン(
レーン3)はタンパク質加水分解を受けたが、配列番号23の組換えゼラチン(レ
ーン4)は全く完全なままであることが示されている。この結果から、安定性に
優れる本発明の組換えゼラチン断片が作製できることが実証された。
応する。それ以外の株は、ヒトα1(I)らせん状ドメインのアミノ酸残基179〜2
80(配列番号15)および615〜715(配列番号23)をコードするプラスミドを用い
て作製した。これらの組換えゼラチンは、実施例1に記載されているようにして
、配列番号5と配列番号6および配列番号3と配列番号7のプライマーを用いて
構築した。PCR産物をXhoIおよびXbaIで消化し、クローニングし、上記のように
してエレクトロポレーション用に調製した。これらの株を増殖させ、タンパク質
発現を誘導し、発現されたゼラチン断片をDSD-PAGEにより比較した。図3では、
配列番号15の組換えゼラチン(レーン2)および配列番号19の組換えゼラチン(
レーン3)はタンパク質加水分解を受けたが、配列番号23の組換えゼラチン(レ
ーン4)は全く完全なままであることが示されている。この結果から、安定性に
優れる本発明の組換えゼラチン断片が作製できることが実証された。
【0253】実施例4:ヒドロキシル化組換えヒトゼラチンの発現
プロリル4-ヒドロキシラーゼ活性は、酵母においては検出されていない。ピキ
ア・パストリス株は、活性なプロリル4-ヒドロキシラーゼを発現するように操作
されており、従来ヒドロキシル化コラーゲンを産生させるために用いられている
(米国特許第5,593,859号を参照)。ヒドロキシル化組換えヒトゼラチンを発現
させるために、この株を、配列番号1と配列番号2のプライマーを用いたPCRに
より作製したヒトα1(I)コラーゲンの組換え体の100アミノ酸(表2の配列番号1
9)をコードするゼラチン発現カセットで形質転換した。このPCR DNA産物(約33
0bp)をXhoI−XbaIで消化し、pPICZαA(Invitrogen)のXhoI−XbaI部位に連結
して、プラスミドpDO7を作製した。
ア・パストリス株は、活性なプロリル4-ヒドロキシラーゼを発現するように操作
されており、従来ヒドロキシル化コラーゲンを産生させるために用いられている
(米国特許第5,593,859号を参照)。ヒドロキシル化組換えヒトゼラチンを発現
させるために、この株を、配列番号1と配列番号2のプライマーを用いたPCRに
より作製したヒトα1(I)コラーゲンの組換え体の100アミノ酸(表2の配列番号1
9)をコードするゼラチン発現カセットで形質転換した。このPCR DNA産物(約33
0bp)をXhoI−XbaIで消化し、pPICZαA(Invitrogen)のXhoI−XbaI部位に連結
して、プラスミドpDO7を作製した。
【0254】
PDO7から1048bpのCel II-AgeI断片を単離した。これは、AOX1プロモーター領
域の3’部分、接合因子α分泌シグナル、配列番号19の組換えゼラチン、pPICZα
A由来のポリリンカー配列、および56塩基対のAOX1転写ターミネーターを含んで
いた。この断片を、pPIC9K(Invitrogen)のCel II-AgeI部位に連結して、pDO41
を作製した。ピキア・パストリスのαβ8株(his4)を、エレクトロポレーショ
ンにより、StuIで線状化したプラスミドpDO41で形質転換し、最少デキストロー
スプレートに播種し、his4要求性を補完する形質転換体を選択した。約20のhis
+形質転換体が増殖し、実施例1に記載されているようにしてメタノールで誘導
した。配列番号19を発現する株を、調整培地のSDS-PAGE分析により同定した(図
4)。
域の3’部分、接合因子α分泌シグナル、配列番号19の組換えゼラチン、pPICZα
A由来のポリリンカー配列、および56塩基対のAOX1転写ターミネーターを含んで
いた。この断片を、pPIC9K(Invitrogen)のCel II-AgeI部位に連結して、pDO41
を作製した。ピキア・パストリスのαβ8株(his4)を、エレクトロポレーショ
ンにより、StuIで線状化したプラスミドpDO41で形質転換し、最少デキストロー
スプレートに播種し、his4要求性を補完する形質転換体を選択した。約20のhis
+形質転換体が増殖し、実施例1に記載されているようにしてメタノールで誘導
した。配列番号19を発現する株を、調整培地のSDS-PAGE分析により同定した(図
4)。
【0255】
陽性の株からの組換えゼラチン断片を、アセトン沈殿により培地から精製し、
例えばHare, PE (1977) Methods in Enzymology 47:3-18に記載されているよう
にして、さらにアミノ酸分析により分析した。それらの株のうち1つからのゼラ
チン産物をアミノ酸分析したところ、分泌された組換えゼラチン中にヒドロキシ
プロリンが存在することが示された。図4に示す株から単離されたゼラチン(単
離物#2)において、プロリンに対するヒドロキシプロリンの比率は0.29である
ことが示され、これはゼラチンとプロリル4-ヒドロキシラーゼとが共発現された
ことを示している。
例えばHare, PE (1977) Methods in Enzymology 47:3-18に記載されているよう
にして、さらにアミノ酸分析により分析した。それらの株のうち1つからのゼラ
チン産物をアミノ酸分析したところ、分泌された組換えゼラチン中にヒドロキシ
プロリンが存在することが示された。図4に示す株から単離されたゼラチン(単
離物#2)において、プロリンに対するヒドロキシプロリンの比率は0.29である
ことが示され、これはゼラチンとプロリル4-ヒドロキシラーゼとが共発現された
ことを示している。
【0256】
プロリル4-ヒドロキシラーゼを発現しないピキア・パストリス株からヒドロキ
シル化されていない組換えゼラチンが発現され、それを精製した。続いて、この
組換えゼラチン中のプロリン残基を、プロリル4-ヒドロキシラーゼ酵素活性を用
いてin vitroにてヒドロキシプロリン残基に変換した。ゼラチン発現用プラスミ
ドを、PCRにより配列番号3と配列番号4のプライマーを用いて作製したところ
、配列番号24の組換えゼラチンが発現された。この525bpのPCR産物を精製し、Xh
oI-XbaIで消化し、XhoI-XbaIで消化しておいたpPICZαAに連結した。このプラス
ミドをPmeIで線状化し、ピキア・パストリス X-33株(Invitrogen)にエレクト
ロポレーションした。500μg/mlのゼオシンを含有するYPDプレートで増殖させる
ことにより、形質転換体を選択した。株は上記のようにしてゼラチン発現につい
て試験し、ヒドロキシル化されていない組換えゼラチンを陽性の単離体の培地か
ら精製した。調整培地は、10kDa分子量カットオフ膜を用いた圧透析により10倍
に濃縮し、サンプルを緩衝液A(50mM Tris-HCl、pH 9.0、50mM NaCl)で透析し
た。透析された物質は、緩衝液Aで平衡化したQセファロース(Q-sepharose)
カラムでクロマトグラフィーにかけた。ゼラチンは、これらの条件下ではこのカ
ラムに結合しないので、通り抜け画分中に存在していた。混入している酵母タン
パク質の大部分が該カラムに結合し、これを緩衝液B(緩衝液A+0.5M NaCl)
で溶出させた。
シル化されていない組換えゼラチンが発現され、それを精製した。続いて、この
組換えゼラチン中のプロリン残基を、プロリル4-ヒドロキシラーゼ酵素活性を用
いてin vitroにてヒドロキシプロリン残基に変換した。ゼラチン発現用プラスミ
ドを、PCRにより配列番号3と配列番号4のプライマーを用いて作製したところ
、配列番号24の組換えゼラチンが発現された。この525bpのPCR産物を精製し、Xh
oI-XbaIで消化し、XhoI-XbaIで消化しておいたpPICZαAに連結した。このプラス
ミドをPmeIで線状化し、ピキア・パストリス X-33株(Invitrogen)にエレクト
ロポレーションした。500μg/mlのゼオシンを含有するYPDプレートで増殖させる
ことにより、形質転換体を選択した。株は上記のようにしてゼラチン発現につい
て試験し、ヒドロキシル化されていない組換えゼラチンを陽性の単離体の培地か
ら精製した。調整培地は、10kDa分子量カットオフ膜を用いた圧透析により10倍
に濃縮し、サンプルを緩衝液A(50mM Tris-HCl、pH 9.0、50mM NaCl)で透析し
た。透析された物質は、緩衝液Aで平衡化したQセファロース(Q-sepharose)
カラムでクロマトグラフィーにかけた。ゼラチンは、これらの条件下ではこのカ
ラムに結合しないので、通り抜け画分中に存在していた。混入している酵母タン
パク質の大部分が該カラムに結合し、これを緩衝液B(緩衝液A+0.5M NaCl)
で溶出させた。
【0257】
通り抜け画分を50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で透析し、組換えゼラチンを、
同じ緩衝液で平衡化したSP-セファロースカラムでさらに精製した。組換えゼラ
チンはこのカラムに結合し、0.2M NaClで段階的に溶出させた。精製したゼラチ
ン(1mg/ml)を熱変性させ(100℃で10分間)、以下の成分の存在下で、精製し
たP4Hと1:30の酵素:基質比で混合した:50mM Tris-HCl、pH 7.8、2mM アス
コルビン酸、2mM α-ケトグルタル酸、0.1mM FeSO4、10μM DTT、10mg/mlウシ
血清アルブミン、および100単位カタラーゼ(Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO)[例えば、Kivirikko, K.I.およびMyllyla, R. (1982) Methods in Enzymol
ogy 82:245-304;ならびにVouri, K.ら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:746
7-7470を参照]。反応は37℃で16時間行った。
同じ緩衝液で平衡化したSP-セファロースカラムでさらに精製した。組換えゼラ
チンはこのカラムに結合し、0.2M NaClで段階的に溶出させた。精製したゼラチ
ン(1mg/ml)を熱変性させ(100℃で10分間)、以下の成分の存在下で、精製し
たP4Hと1:30の酵素:基質比で混合した:50mM Tris-HCl、pH 7.8、2mM アス
コルビン酸、2mM α-ケトグルタル酸、0.1mM FeSO4、10μM DTT、10mg/mlウシ
血清アルブミン、および100単位カタラーゼ(Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO)[例えば、Kivirikko, K.I.およびMyllyla, R. (1982) Methods in Enzymol
ogy 82:245-304;ならびにVouri, K.ら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:746
7-7470を参照]。反応は37℃で16時間行った。
【0258】
次に、その組換えゼラチンを、上記のようにしてQ-セファロースでのクロマト
グラフィーにより精製した。結合しているタンパク質を該カラムから0.5M NaCl
で溶出させ、回収した(図5、レーン7、8および9)。通り抜け画分および溶
出画分をSDS-PAGEにより分析したところ、回収したゼラチンの純度が判った(図
5)。このゼラチンのアミノ酸分析は、通り抜け画分の透析の後で行った(図5
、レーン3〜6)。アミノ酸分析から、このゼラチンの87%がヒドロキシ化され
ていることが示された。100%のヒドロキシル化が達成されるのは、ゼラチン中
のヒドロキシプロリンのモル数/(プロリンのモル数+ヒドロキシプロリンのモ
ル数)=0.5である場合である。
グラフィーにより精製した。結合しているタンパク質を該カラムから0.5M NaCl
で溶出させ、回収した(図5、レーン7、8および9)。通り抜け画分および溶
出画分をSDS-PAGEにより分析したところ、回収したゼラチンの純度が判った(図
5)。このゼラチンのアミノ酸分析は、通り抜け画分の透析の後で行った(図5
、レーン3〜6)。アミノ酸分析から、このゼラチンの87%がヒドロキシ化され
ていることが示された。100%のヒドロキシル化が達成されるのは、ゼラチン中
のヒドロキシプロリンのモル数/(プロリンのモル数+ヒドロキシプロリンのモ
ル数)=0.5である場合である。
【0259】実施例5:プロリル4-ヒドロキシラーゼの存在下または不在下でのゼラチンの安 定性
18kDaの組換えゼラチン(配列番号20)を、上記の方法に従って発現させた。
発現された断片を、ゲル電気泳動により分析した。プロリル4-ヒドロキシラーゼ
の存在下で発現された組換えゼラチンは、プロリル4-ヒドロキシラーゼの不在下
で発現されたゼラチンよりも著しく高い安定性を示した(図6を参照)。
発現された断片を、ゲル電気泳動により分析した。プロリル4-ヒドロキシラーゼ
の存在下で発現された組換えゼラチンは、プロリル4-ヒドロキシラーゼの不在下
で発現されたゼラチンよりも著しく高い安定性を示した(図6を参照)。
【0260】
組換えヒトゼラチンの安定性および安定性の増大に及ぼすプロリンのヒドロキ
シル化の役割は、プロリル4-ヒドロキシラーゼを発現するピキア・パストリス株
において見出された。配列番号1と配列番号7のプライマーを用いたPCRにより
、配列番号20をコードするプラスミド(pDO32)を構築した。このPCR産物を、上
記のようにして精製し、消化し、クローニングした。プロリルヒドロキシラーゼ
を欠く宿主細胞とαおよびβプロリル4-ヒドロキシラーゼサブユニットを含む宿
主細胞において、同じα1(I)c DNA断片が発現された。3種のピキア・パアストリ
ス株:X-33株(野生型のピキア・パストリス);2種のプロリル4-ヒドロキシラ
ーゼ発現株であるP4H-2株およびαβ8株を、米国特許第5,593,859号およびVoure
laら(1997) EMBO J 16:6702-6712に記載されているようにして、PmeIで線状化し
ておいたpDO32でエレクトロポレーションした。
シル化の役割は、プロリル4-ヒドロキシラーゼを発現するピキア・パストリス株
において見出された。配列番号1と配列番号7のプライマーを用いたPCRにより
、配列番号20をコードするプラスミド(pDO32)を構築した。このPCR産物を、上
記のようにして精製し、消化し、クローニングした。プロリルヒドロキシラーゼ
を欠く宿主細胞とαおよびβプロリル4-ヒドロキシラーゼサブユニットを含む宿
主細胞において、同じα1(I)c DNA断片が発現された。3種のピキア・パアストリ
ス株:X-33株(野生型のピキア・パストリス);2種のプロリル4-ヒドロキシラ
ーゼ発現株であるP4H-2株およびαβ8株を、米国特許第5,593,859号およびVoure
laら(1997) EMBO J 16:6702-6712に記載されているようにして、PmeIで線状化し
ておいたpDO32でエレクトロポレーションした。
【0261】
形質転換体は、500μg/mlのゼオシンに対する耐性により選択した。各形質転
換体からの8つの単離体を増殖させ、上記のようにして誘導し、発現された組換
えヒトゼラチンの安定性をSDS-PAGEにより分析した(図6を参照)。野生型ピキ
ア・パストリスX-33株では、ほぼ同量の完全な状態のままの組換えゼラチンとタ
ンパク質加水分解による断片(これはゲル上で該組換えゼラチンの直ぐ下に移動
した。図の右の矢印で示す)とが見られた(図6、X-33株)。プロリル4-ヒドロ
キシラーゼを共発現する二者の株では、タンパク質加水分解による断片の量は有
意に少なく、このことは、プロリル4-ヒドロキシラーゼが組換えヒトゼラチンと
共発現されると、該ゼラチンのタンパク質加水分解を実質的に低下させることに
よって、ゼラチンの安定性が増大することが実証された(図6、P4H-2株および
αβ8株)。
換体からの8つの単離体を増殖させ、上記のようにして誘導し、発現された組換
えヒトゼラチンの安定性をSDS-PAGEにより分析した(図6を参照)。野生型ピキ
ア・パストリスX-33株では、ほぼ同量の完全な状態のままの組換えゼラチンとタ
ンパク質加水分解による断片(これはゲル上で該組換えゼラチンの直ぐ下に移動
した。図の右の矢印で示す)とが見られた(図6、X-33株)。プロリル4-ヒドロ
キシラーゼを共発現する二者の株では、タンパク質加水分解による断片の量は有
意に少なく、このことは、プロリル4-ヒドロキシラーゼが組換えヒトゼラチンと
共発現されると、該ゼラチンのタンパク質加水分解を実質的に低下させることに
よって、ゼラチンの安定性が増大することが実証された(図6、P4H-2株および
αβ8株)。
【0262】実施例6:発現用培地の補給による組換えヒトゼラチン発現の増大化
先の報告から、カザミノ酸を補給した培地が、ピキア・パストリスにおける特
定のタンパク質の発現の際に見られるタンパク質加水分解の量を低下させること
が示されている[Clare, J.J.ら, (1991) Gene 105:202-215]。ピキア・パスト
リスにおいて発現される本発明の組換えヒトゼラチンの分解を、発現用培地を各
種の補給成分で富化した後で測定した。この特定の研究において、実施例5に記
載されているピキア・パストリスαβ8株(配列番号20の組換えヒトゼラチン断
片を発現するもの)を用いた(実施例5および表2)。組換えゼラチンは、カザ
ミノ酸、カジトン、酵母抽出物、ペプトン、ペプタミン、トリプトン、ゲラトン
(Gelatone)、ラクトアルブミンおよびソイトンを含む各種補給成分をある範囲
の濃度(0〜2%)で加えた培地中で誘導された。ラクトアルブミン加水分解物
、ソイトン、カジトンおよびペプタミン(Difco Laboratories, Detroit, MI)
を含む数種の配合物は、組換えゼラチンの発現レベルを増大させた(図7、ラク
トアルブミンおよびソイトン)。
定のタンパク質の発現の際に見られるタンパク質加水分解の量を低下させること
が示されている[Clare, J.J.ら, (1991) Gene 105:202-215]。ピキア・パスト
リスにおいて発現される本発明の組換えヒトゼラチンの分解を、発現用培地を各
種の補給成分で富化した後で測定した。この特定の研究において、実施例5に記
載されているピキア・パストリスαβ8株(配列番号20の組換えヒトゼラチン断
片を発現するもの)を用いた(実施例5および表2)。組換えゼラチンは、カザ
ミノ酸、カジトン、酵母抽出物、ペプトン、ペプタミン、トリプトン、ゲラトン
(Gelatone)、ラクトアルブミンおよびソイトンを含む各種補給成分をある範囲
の濃度(0〜2%)で加えた培地中で誘導された。ラクトアルブミン加水分解物
、ソイトン、カジトンおよびペプタミン(Difco Laboratories, Detroit, MI)
を含む数種の配合物は、組換えゼラチンの発現レベルを増大させた(図7、ラク
トアルブミンおよびソイトン)。
【0263】
これらの結果から、組換えゼラチンの発現の際に用いた特定の培地補給成分に
よってタンパク質産生が増大することが示される。1つの態様において、培地補
給成分としてソイトンを使用する場合には、組換えゼラチンの発現を増大させる
(動物由来ではなく)植物由来の培地成分が供給された。これにより、種々の用
途で使用可能な組換えゼラチンの産生のための、動物性物質を含まない環境がも
たらされる。
よってタンパク質産生が増大することが示される。1つの態様において、培地補
給成分としてソイトンを使用する場合には、組換えゼラチンの発現を増大させる
(動物由来ではなく)植物由来の培地成分が供給された。これにより、種々の用
途で使用可能な組換えゼラチンの産生のための、動物性物質を含まない環境がも
たらされる。
【0264】実施例7:組換えヒトゼラチンの架橋
組換えヒトコラーゲン(米国特許第5,593,859号に記載されているようにして
得たもの)のスラリーは、10.8mgの組換えヒトI型コラーゲンを5mlの水に溶解
させ、続いて20mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)で透析ることにより調製した。こ
のスラリーの最終組換えヒトコラーゲン濃度は約2mg/mlであった。架橋型の組
換えヒトゼラチンの調製は、10μlまたは5μl の1-エチル-3-(3-ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、Pierce Chemical Co.)の20%溶液を
1mlの上記組換えヒトコラーゲンスラリーに添加することにより行った。架橋反
応は、室温で一夜行った。未反応のEDCは、水で透析することにより除去した。
得たもの)のスラリーは、10.8mgの組換えヒトI型コラーゲンを5mlの水に溶解
させ、続いて20mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)で透析ることにより調製した。こ
のスラリーの最終組換えヒトコラーゲン濃度は約2mg/mlであった。架橋型の組
換えヒトゼラチンの調製は、10μlまたは5μl の1-エチル-3-(3-ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、Pierce Chemical Co.)の20%溶液を
1mlの上記組換えヒトコラーゲンスラリーに添加することにより行った。架橋反
応は、室温で一夜行った。未反応のEDCは、水で透析することにより除去した。
【0265】
こうして得られた架橋型の組換えヒトゼラチンを、6%グリシンSDS-PAGE分析
により分析した。図8には、組換えヒトゼラチン(レーン6、標識化UNL-5-4)
、架橋型組換えヒトゼラチン(レーン5、標識化UNL-5-4、0.1%EDC;レーン4
、標識化UNL5-4、0.2%EDC)、市販のハードカプセル用ゼラチン(レーン3)お
よびSigma Chemical Co.から入手した市販ゼラチン(タイプA、ブタ皮からのも
の、約300ブルーム、レーン2)のSDS-PAGEによる比較を示してある。図8のSDS
-PAGE分析で示されているように、市販のカプセル用ゼラチンおよびSigma製のゼ
ラチンは、主成分としてα鎖(分子量が約110kDa)ならびにそれより高い分子量
のゼラチン成分(約200〜250kDaの範囲の分子量を持つ)のスメアを含んでいた
。組換えヒトコラーゲンは、α鎖だけから構成されるものであった。しかし、架
橋の後では、架橋型組換えゼラチンは、市販ゼラチンおよび市販のカプセル用ゼ
ラチンにおいて見られる場合と同様に、α鎖だけでなく、それより高い分子量の
ゼラチンのスメアからも構成されていた。このことは、組換えヒトゼラチンを架
橋することにより、市販のカプセル用ゼラチンとほぼ同様の分子量分布を示す組
換えヒトゼラチンを得ることができることを示している。架橋型の組換えゼラチ
ンは、高いゲル強度および高い粘度が望ましい用途に使用される。
により分析した。図8には、組換えヒトゼラチン(レーン6、標識化UNL-5-4)
、架橋型組換えヒトゼラチン(レーン5、標識化UNL-5-4、0.1%EDC;レーン4
、標識化UNL5-4、0.2%EDC)、市販のハードカプセル用ゼラチン(レーン3)お
よびSigma Chemical Co.から入手した市販ゼラチン(タイプA、ブタ皮からのも
の、約300ブルーム、レーン2)のSDS-PAGEによる比較を示してある。図8のSDS
-PAGE分析で示されているように、市販のカプセル用ゼラチンおよびSigma製のゼ
ラチンは、主成分としてα鎖(分子量が約110kDa)ならびにそれより高い分子量
のゼラチン成分(約200〜250kDaの範囲の分子量を持つ)のスメアを含んでいた
。組換えヒトコラーゲンは、α鎖だけから構成されるものであった。しかし、架
橋の後では、架橋型組換えゼラチンは、市販ゼラチンおよび市販のカプセル用ゼ
ラチンにおいて見られる場合と同様に、α鎖だけでなく、それより高い分子量の
ゼラチンのスメアからも構成されていた。このことは、組換えヒトゼラチンを架
橋することにより、市販のカプセル用ゼラチンとほぼ同様の分子量分布を示す組
換えヒトゼラチンを得ることができることを示している。架橋型の組換えゼラチ
ンは、高いゲル強度および高い粘度が望ましい用途に使用される。
【0266】実施例8:市販ゼラチンおよび可溶性組換えヒトゼラチンの内毒素レベル
Kind & Knox(K&K)から購入した可溶性ゼラチンおよび本発明の組換えヒトゼ
ラチン(実施例9に記載されているようにして作製したもの)の内毒素レベルは
、当業界で公知であるようにLimulus Ameobocyte Lysate試験[例えばFriberger
, P.ら, (1987) Prog. Clin. Biol. Res. 231:149-169 を参照]を用いて測定し
た。3種の異なるゼラチン濃度について調べた。表3に示すように、本発明の組
換えヒトI型コラーゲン(rhcI)の熱加水分解により作製した組換えヒトゼラチ
ンは、実質的に内毒素を含んでいなかった。市販物質の内毒素レベルは、タンパ
ク質mg当たり約1〜1.5EUであった。本発明において記載されているようなゼラ
チンの製造方法により、内毒素レベルが市販の調製物のものよりも実質的に2〜
3桁ほど低いゼラチンが得られた。そのような低い内毒素レベルのために、本発
明の組換えゼラチンは、特定の用途における使用(例えば製剤の安定化における
使用)の上で特に魅力あるものである。
ラチン(実施例9に記載されているようにして作製したもの)の内毒素レベルは
、当業界で公知であるようにLimulus Ameobocyte Lysate試験[例えばFriberger
, P.ら, (1987) Prog. Clin. Biol. Res. 231:149-169 を参照]を用いて測定し
た。3種の異なるゼラチン濃度について調べた。表3に示すように、本発明の組
換えヒトI型コラーゲン(rhcI)の熱加水分解により作製した組換えヒトゼラチ
ンは、実質的に内毒素を含んでいなかった。市販物質の内毒素レベルは、タンパ
ク質mg当たり約1〜1.5EUであった。本発明において記載されているようなゼラ
チンの製造方法により、内毒素レベルが市販の調製物のものよりも実質的に2〜
3桁ほど低いゼラチンが得られた。そのような低い内毒素レベルのために、本発
明の組換えゼラチンは、特定の用途における使用(例えば製剤の安定化における
使用)の上で特に魅力あるものである。
【0267】
【表3】
【0268】実施例9:熱および酸加水分解によるゼラチンの誘導体化
加水分解手順(酸、熱および酵素によるもの)を工夫して、現在利用可能な可
溶性動物由来ゼラチンとほぼ同様の分子量分布を持つ可溶性の組換えヒトゼラチ
ンを作製し、これを例えばワクチン製剤における安定剤として使用した。これら
の実験のために、完全な状態のままの組換えヒトI型およびIII型コラーゲンを
出発物質として用いた。加水分解の条件をいろいろ変えることにより、最終物質
の分子量を変えることができ、特定の分子量の物質を得た。
溶性動物由来ゼラチンとほぼ同様の分子量分布を持つ可溶性の組換えヒトゼラチ
ンを作製し、これを例えばワクチン製剤における安定剤として使用した。これら
の実験のために、完全な状態のままの組換えヒトI型およびIII型コラーゲンを
出発物質として用いた。加水分解の条件をいろいろ変えることにより、最終物質
の分子量を変えることができ、特定の分子量の物質を得た。
【0269】市販ゼラチンの分子量分布:
これらの組換えヒトゼラチンを、市販ゼラチンと比較した。特性決定するため
に、Leiner Davis, Great Lake, Kind & KnoxおよびDynagelにより製造された4
種の低分子量ゼラチンのサンプルを入手した。調べた全てのゼラチンは、室温で
可溶性であった。トリシンSDS-PAGEゲル上でのこれらゼラチンの分子量分布は図
9に示し、表4に列記してある。ゲルのプロファイルから、市販ゼラチンの分子
量分布が約0〜55kDaであり、但しDynagel-1サンプルだけは分子量分布が0〜30
kDaであることが示された。また、ゲルのプロファイルからは、2種の分子量分
布のパターンが判明した。1つの例において、Leiner DavisおよびGreat Lakes
からのサンプルから誘導したものでは、SDS-PAGEにより数本の不連続な分子のバ
ンドが見られた。第2の例におけるパターンは、DynagalおよびKind & Knoxのサ
ンプルから誘導したものであるが、それらは、ゲル上に連続した物質の分布を示
し、不連続なバンドはなかった。Dynagel-1およびDynagel-2の分子量分布は、そ
れらが同じ製造元によって同じ用途に向けて製造されているにもかかわらず、全
く異なっていた。この結果から、現在入手可能なゼラチンでは、バッチ別のバラ
ツキが極めて有意なものであることが示された。
に、Leiner Davis, Great Lake, Kind & KnoxおよびDynagelにより製造された4
種の低分子量ゼラチンのサンプルを入手した。調べた全てのゼラチンは、室温で
可溶性であった。トリシンSDS-PAGEゲル上でのこれらゼラチンの分子量分布は図
9に示し、表4に列記してある。ゲルのプロファイルから、市販ゼラチンの分子
量分布が約0〜55kDaであり、但しDynagel-1サンプルだけは分子量分布が0〜30
kDaであることが示された。また、ゲルのプロファイルからは、2種の分子量分
布のパターンが判明した。1つの例において、Leiner DavisおよびGreat Lakes
からのサンプルから誘導したものでは、SDS-PAGEにより数本の不連続な分子のバ
ンドが見られた。第2の例におけるパターンは、DynagalおよびKind & Knoxのサ
ンプルから誘導したものであるが、それらは、ゲル上に連続した物質の分布を示
し、不連続なバンドはなかった。Dynagel-1およびDynagel-2の分子量分布は、そ
れらが同じ製造元によって同じ用途に向けて製造されているにもかかわらず、全
く異なっていた。この結果から、現在入手可能なゼラチンでは、バッチ別のバラ
ツキが極めて有意なものであることが示された。
【0270】
【表4】
【0271】
ゼラチンの熱加水分解は、次のようにして行った。市販の乾燥ゼラチンを40〜
50℃の水に溶解して、5%のゼラチン溶液にした。熱加水分解に備えて、この溶
液のpHを0.1N NaOHまたは0.1N HClのいずれかで調整した。I型およびIII型の組
換えヒトコラーゲンを、米国特許第5,593,859号に記載されているようにしてピ
キア・パストリスで発現させ、精製した。最終的に得られる組換えヒトコラーゲ
ンを10mM HClに溶解し、水で透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥した組換えヒトコ
ラーゲンを40〜50℃の水に溶解して、3%溶液にした。熱加水分解の前に、この
溶液のpHを下記に示すように調整した。
50℃の水に溶解して、5%のゼラチン溶液にした。熱加水分解に備えて、この溶
液のpHを0.1N NaOHまたは0.1N HClのいずれかで調整した。I型およびIII型の組
換えヒトコラーゲンを、米国特許第5,593,859号に記載されているようにしてピ
キア・パストリスで発現させ、精製した。最終的に得られる組換えヒトコラーゲ
ンを10mM HClに溶解し、水で透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥した組換えヒトコ
ラーゲンを40〜50℃の水に溶解して、3%溶液にした。熱加水分解の前に、この
溶液のpHを下記に示すように調整した。
【0272】
熱加水分解は、1ml Reacti-Vials(Pierce)内で行った。加水分解温度は、
実験に応じて100℃から150℃まで変えた。加水分解溶液のpHは、指示されるよう
に、pH2からpH7まで変えた。加水分解時間もまた、溶液の温度およびpHに応じ
て、1時間から32時間まで変えた。ゼラチンの加水分解物は、さまざまな時間間
隔でサンプリングし、SDS-PAGEにより分析した。
実験に応じて100℃から150℃まで変えた。加水分解溶液のpHは、指示されるよう
に、pH2からpH7まで変えた。加水分解時間もまた、溶液の温度およびpHに応じ
て、1時間から32時間まで変えた。ゼラチンの加水分解物は、さまざまな時間間
隔でサンプリングし、SDS-PAGEにより分析した。
【0273】市販ゼラチンの120℃における加水分解:
Sigma製の高分子量ゼラチンのサンプル(ブタ皮由来のタイプA、250kDa)を
6種のpHが異なる溶液(5%ゼラチン)に溶解し、120℃で加水分解した。pH2
およびpH3の溶液は、2時間半にわたり加水分解し、30分毎にサンプリングした
。pH4の溶液は、5時間にわたり加水分解し、1時間毎にサンプリングした。pH
5、pH6およびpH7の溶液は、24時間にわたり加水分解し、14時間加水分解した
後、2時間毎にサンプリングした。
6種のpHが異なる溶液(5%ゼラチン)に溶解し、120℃で加水分解した。pH2
およびpH3の溶液は、2時間半にわたり加水分解し、30分毎にサンプリングした
。pH4の溶液は、5時間にわたり加水分解し、1時間毎にサンプリングした。pH
5、pH6およびpH7の溶液は、24時間にわたり加水分解し、14時間加水分解した
後、2時間毎にサンプリングした。
【0274】
加水分解パターンをトリシン10〜20%SDSゲルで分析したところ、図10A、10B
、10C、10D、10Eおよび10Fに示すようになった。ゲルのプロファイルから、溶液
のpHが低くなるほど、ゼラチンの加水分解は迅速に起こることが示される。また
、ゲルのプロファイルからは、加水分解物の間に2種の加水分解パターンがある
ことも判明した。一方のパターンは、ゲル上に数本の不連続な分子バンドを示し
たが(pH2およびpH3の溶液の酸加水分解の結果である図10Aおよび10Bを参照さ
れたい)、他方のパターンは、ゲル上で連続した物質分布を示した(pH4、pH5
、pH6およびpH7の溶液の加水分解の結果である図10C、10D、10Eおよび10Fを参
照されたい)。
、10C、10D、10Eおよび10Fに示すようになった。ゲルのプロファイルから、溶液
のpHが低くなるほど、ゼラチンの加水分解は迅速に起こることが示される。また
、ゲルのプロファイルからは、加水分解物の間に2種の加水分解パターンがある
ことも判明した。一方のパターンは、ゲル上に数本の不連続な分子バンドを示し
たが(pH2およびpH3の溶液の酸加水分解の結果である図10Aおよび10Bを参照さ
れたい)、他方のパターンは、ゲル上で連続した物質分布を示した(pH4、pH5
、pH6およびpH7の溶液の加水分解の結果である図10C、10D、10Eおよび10Fを参
照されたい)。
【0275】
これらの結果から、市販ゼラチンの分析において見られるように(SDS-PAGEに
おける不連続なバンドvs連続した物質分布)、上記で概説した方法またはその変
法によって2種の異なるタイプの物質を生じることが示された。また、これらの
実験結果は、高分子量のゼラチンを熱分解することにより、種々の大きさの可溶
性ゼラチンが生じることも示していた。表5には、Sigma製のゼラチンを用いて
、pH6.0の溶液中で120℃で加水分解した後で得られる分子量分布を示してある。
おける不連続なバンドvs連続した物質分布)、上記で概説した方法またはその変
法によって2種の異なるタイプの物質を生じることが示された。また、これらの
実験結果は、高分子量のゼラチンを熱分解することにより、種々の大きさの可溶
性ゼラチンが生じることも示していた。表5には、Sigma製のゼラチンを用いて
、pH6.0の溶液中で120℃で加水分解した後で得られる分子量分布を示してある。
【0276】
【表5】
【0277】市販ゼラチンの150℃における加水分解:
Sigma製の高分子量のゼラチンのサンプル(ブタ皮由来のA型、250kDa)を4
種のpHが異なる溶液(5%ゼラチン)に溶解し、150℃で最長10時間にわたり加
水分解した。加水分解物は、分析用として、2時間毎にサンプリングした。加水
分解パターンをトリシン10〜20%SDS-PAGEゲルで分析したところ、図11A、11B、
11Cおよび11Dに示すようになった。ゲルのプロファイルから、ゼラチンの分解は
120℃におけるよりも150℃における方がはるかに迅速に起こることが示される。
さらに、ゼラチンの加水分解を150℃で行った場合、より低い分子量のゼラチン
断片が生じた。表6には、pH6.0の溶液中で150℃で加水分解した後のSigma製の
ゼラチンの分子量分布を示してある。
種のpHが異なる溶液(5%ゼラチン)に溶解し、150℃で最長10時間にわたり加
水分解した。加水分解物は、分析用として、2時間毎にサンプリングした。加水
分解パターンをトリシン10〜20%SDS-PAGEゲルで分析したところ、図11A、11B、
11Cおよび11Dに示すようになった。ゲルのプロファイルから、ゼラチンの分解は
120℃におけるよりも150℃における方がはるかに迅速に起こることが示される。
さらに、ゼラチンの加水分解を150℃で行った場合、より低い分子量のゼラチン
断片が生じた。表6には、pH6.0の溶液中で150℃で加水分解した後のSigma製の
ゼラチンの分子量分布を示してある。
【0278】
【表6】
【0279】実施例10:組換えI型およびIII型ヒトコラーゲンの酸および熱加水分解
組換えヒトI型コラーゲンを、中性pH条件下(pH7)で最長8時間まで、また
は酸性pH条件下(pH2)で最長3時間まで、120℃で加水分解した。組換えヒトI
II型コラーゲンは、中性および酸性の条件下で最長6時間まで120℃で加水分解
した。加水分解は実施例9で記載したようにして行った。ヒト組換えI型および
III型の加水分解物を、トリシン10〜20% SDS-PAGEゲルにより分析し、それを図
12Aおよび12Bに示す。SDS-PAGEゲルパターンから、組換えヒトコラーゲンの熱加
水分解が、天然供給源由来の高分子量ゼラチンの加水分解パターンと同一である
ことが示される(図9、図10A〜10F、および図11A〜11D 対 図12Aおよび12B)
。天然ゼラチンの加水分解(pH7)の場合と同様に、組換えヒトコラーゲンを酸
加水分解すると、数本の不連続な分子量バンドが示されたが、中性での加水分解
物はより連続な分子量分布を示した。組換えヒトゼラチンの中性での加水分解物
の分子量分布は、6〜8時間熱分解した後では、ほぼ0〜70kDaであった。酸性
条件下での加水分解は、ずっと迅速に起こった。組換えヒトゼラチンの酸性での
加水分解物の分子量分布はずっと狭く、2〜3時間熱処理した後ではほぼ0〜10k
Daであった。
は酸性pH条件下(pH2)で最長3時間まで、120℃で加水分解した。組換えヒトI
II型コラーゲンは、中性および酸性の条件下で最長6時間まで120℃で加水分解
した。加水分解は実施例9で記載したようにして行った。ヒト組換えI型および
III型の加水分解物を、トリシン10〜20% SDS-PAGEゲルにより分析し、それを図
12Aおよび12Bに示す。SDS-PAGEゲルパターンから、組換えヒトコラーゲンの熱加
水分解が、天然供給源由来の高分子量ゼラチンの加水分解パターンと同一である
ことが示される(図9、図10A〜10F、および図11A〜11D 対 図12Aおよび12B)
。天然ゼラチンの加水分解(pH7)の場合と同様に、組換えヒトコラーゲンを酸
加水分解すると、数本の不連続な分子量バンドが示されたが、中性での加水分解
物はより連続な分子量分布を示した。組換えヒトゼラチンの中性での加水分解物
の分子量分布は、6〜8時間熱分解した後では、ほぼ0〜70kDaであった。酸性
条件下での加水分解は、ずっと迅速に起こった。組換えヒトゼラチンの酸性での
加水分解物の分子量分布はずっと狭く、2〜3時間熱処理した後ではほぼ0〜10k
Daであった。
【0280】
検討した熱加水分解組換えヒトゼラチンの更なる改良として、本発明者らは、
ヒトI型コラーゲンのα1(I)鎖の不連続断片を持つヒトゼラチンを生産するため
の酵母多重遺伝子の組換え発現方法論の有用性を実証している。この技法によれ
ば、大きさが6〜65kDaの範囲で、精製され、高度に均一であるゼラチン断片を
生産することが可能になる。このことは、特定の用途に使用可能なゼラチンの大
きさおよび生物物理学的特性に関して抜群の融通性をもたらす。
ヒトI型コラーゲンのα1(I)鎖の不連続断片を持つヒトゼラチンを生産するため
の酵母多重遺伝子の組換え発現方法論の有用性を実証している。この技法によれ
ば、大きさが6〜65kDaの範囲で、精製され、高度に均一であるゼラチン断片を
生産することが可能になる。このことは、特定の用途に使用可能なゼラチンの大
きさおよび生物物理学的特性に関して抜群の融通性をもたらす。
【0281】実施例11:組換えヒトI型コラーゲンの酵素的加水分解
組換えヒトI型コラーゲンは、表7に示すプロテアーゼ類を用いて酵素により
加水分解した。組換えヒトI型コラーゲンは、各酵素と共に、表7に示す基質:
酵素の比率(w/w)を用いて、37℃でインキュベートした。処理により得られた
ヒト組換えI型加水分解物を、トリシン10〜20% SDS-PAGEゲルにより分析した
。パパインおよびプロテアーゼXでの処理により得られた結果を図13に示す。SD
S-PAGEゲルパターンから、組換えヒトコラーゲンの酵素的加水分解により、該ゼ
ラチンの異なる分子量分布が得られることが示された。パパインを用いた酵素的
加水分解を行うと、図13および表7に示すような連続した加水分解パターンが得
られるが、プロテアーゼXを用いた加水分解では、数本の不連続な分子量バンド
が生じた。表7に示すように、本方法により作製された組換えゼラチンは、特定
の酵素的加水分解処理により、異なる加水分解パターンを示した。このことは、
特定の用途に使用可能なゼラチンの大きさおよび生物物理学的特性をもたらす上
で、抜群の融通性をもたらす。
加水分解した。組換えヒトI型コラーゲンは、各酵素と共に、表7に示す基質:
酵素の比率(w/w)を用いて、37℃でインキュベートした。処理により得られた
ヒト組換えI型加水分解物を、トリシン10〜20% SDS-PAGEゲルにより分析した
。パパインおよびプロテアーゼXでの処理により得られた結果を図13に示す。SD
S-PAGEゲルパターンから、組換えヒトコラーゲンの酵素的加水分解により、該ゼ
ラチンの異なる分子量分布が得られることが示された。パパインを用いた酵素的
加水分解を行うと、図13および表7に示すような連続した加水分解パターンが得
られるが、プロテアーゼXを用いた加水分解では、数本の不連続な分子量バンド
が生じた。表7に示すように、本方法により作製された組換えゼラチンは、特定
の酵素的加水分解処理により、異なる加水分解パターンを示した。このことは、
特定の用途に使用可能なゼラチンの大きさおよび生物物理学的特性をもたらす上
で、抜群の融通性をもたらす。
【0282】
【表7】
【0283】実施例12:異なる組換えゼラチンに対して誘導された組換えヒトI型コラーゲン に対する抗体
酵母ピキア・パストリスで産生させたヒト組換えI型コラーゲンを、その可能
性のあるアレルギー反応について、モルモットに対する接触感作物質として試験
した(Maximization法として知られている)。この試験期間の後、血清を採取し
て、モルモットにおける組換えヒトI型コラーゲンの免疫原性を調べた。1gの
rhCIを10mlの0.9%塩化ナトリウム注射液(SCI)またはゴマ油に浸漬し、37℃
で72時間インキュベートした。次に、抽出物を3000rpmで15分間遠心分離し、上
清を投与用として回収した。
性のあるアレルギー反応について、モルモットに対する接触感作物質として試験
した(Maximization法として知られている)。この試験期間の後、血清を採取し
て、モルモットにおける組換えヒトI型コラーゲンの免疫原性を調べた。1gの
rhCIを10mlの0.9%塩化ナトリウム注射液(SCI)またはゴマ油に浸漬し、37℃
で72時間インキュベートした。次に、抽出物を3000rpmで15分間遠心分離し、上
清を投与用として回収した。
【0284】
ハートレー種(Hartley)モルモットを誘導期の間、試験物質および対照溶液
に曝露した。この時期の間に、被毛を刈り込んだ領域における3組ずつの皮内(
ID)注射を行った。第1の組のID注射剤(頭部用)は、同量のSCIに溶解したフロ
イント完全アジュバント(FCA)のエマルジョンからなるものであった。第2の
組のID注射剤(胴部用)は、試験抽出物(組換えヒトI型コラーゲン)からなる
ものであった。第3の組(尾部用)は、試験抽出物と同量のFCAとのエマルジョ
ンからなるものであった。陽性対照および陰性対照の動物は、第2および第3の
組の注射剤に試験抽出物を含めなかった以外は、試験動物と同様にして処置した
。
に曝露した。この時期の間に、被毛を刈り込んだ領域における3組ずつの皮内(
ID)注射を行った。第1の組のID注射剤(頭部用)は、同量のSCIに溶解したフロ
イント完全アジュバント(FCA)のエマルジョンからなるものであった。第2の
組のID注射剤(胴部用)は、試験抽出物(組換えヒトI型コラーゲン)からなる
ものであった。第3の組(尾部用)は、試験抽出物と同量のFCAとのエマルジョ
ンからなるものであった。陽性対照および陰性対照の動物は、第2および第3の
組の注射剤に試験抽出物を含めなかった以外は、試験動物と同様にして処置した
。
【0285】
ID注射後6日目に、試験部位を、刺激の形跡について評価した。次に、試験部
位を、SLSの10%石油溶液で前処理し、ガラスロッドを用いて皮膚にすり込み、
次に24時間にわたり露出したままにした。7日目に、0.4mlの試験物質抽出物に
浸漬したWhatman #3濾紙の直径4.25cmのディスクを用いて、各試験動物の被毛除
去領域に局所投与を行った。局所的誘導投与後13日目に、該動物をチャンレジし
た。各動物の右半身の一領域の被毛を刈った。翌日、0.3mlの試験抽出物、ヒビ
クル対照抽出物、または陽性対照溶液を含むHill Topチャンバーを被毛除去した
領域にのせ、該動物の上で24時間放置した。該チャンバーを取り除いた24時間後
、48時間後および72時間後に、投与部位を紅斑および水腫について評点した。
位を、SLSの10%石油溶液で前処理し、ガラスロッドを用いて皮膚にすり込み、
次に24時間にわたり露出したままにした。7日目に、0.4mlの試験物質抽出物に
浸漬したWhatman #3濾紙の直径4.25cmのディスクを用いて、各試験動物の被毛除
去領域に局所投与を行った。局所的誘導投与後13日目に、該動物をチャンレジし
た。各動物の右半身の一領域の被毛を刈った。翌日、0.3mlの試験抽出物、ヒビ
クル対照抽出物、または陽性対照溶液を含むHill Topチャンバーを被毛除去した
領域にのせ、該動物の上で24時間放置した。該チャンバーを取り除いた24時間後
、48時間後および72時間後に、投与部位を紅斑および水腫について評点した。
【0286】
72時間後、血液を採取し、凝固させ、次に2800rpmで15分間遠心分離した。各
試験管から血清を取り出し、血清サンプルを使用するまで−70℃で保存した。
試験管から血清を取り出し、血清サンプルを使用するまで−70℃で保存した。
【0287】
次に、免疫したモルモットからの血清を、組換えヒトI型コラーゲン(rhcI)
、組換えヒトIII型コラーゲン(rhcIII)、vitrogen(vtr)ならびに6kDa(配
列番号18)、10kDa(配列番号19)、18kDa(配列番号20)、33kDa(配列番号27
)、50kDa(配列番号22)および65kDa(配列番号33)の断片を含む本発明の組換
えヒトゼラチンの種々の断片(表2および実施例1を参照)に対して誘導した抗
体の存在について分析した。組換えコラーゲンおよび組換えゼラチンを、8%Tr
is-グリシンまたは10〜20%トリシンSDS-PAGEゲルで電気泳動した。ウエスタン
ブロット分析は、この研究で用いたモルモットの各々からの抗血清を用いて行っ
た。図14では、組換えヒトI型コラーゲンで免疫したモルモットからの血清中に
組換えヒトI型コラーゲン特異的抗体が存在することが示されている。ウエスタ
ンブロット分析により分析した組換えゼラチンに対する抗体反応性は、調べた血
清のいずれにおいても見られなかった。図14は、この研究における1匹のモルモ
ットからの抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示している。少なく
とも4匹の異なるモルモットからの血清を分析したところ、それらの各々は、図
14で示した結果と同一の結果を示した。
、組換えヒトIII型コラーゲン(rhcIII)、vitrogen(vtr)ならびに6kDa(配
列番号18)、10kDa(配列番号19)、18kDa(配列番号20)、33kDa(配列番号27
)、50kDa(配列番号22)および65kDa(配列番号33)の断片を含む本発明の組換
えヒトゼラチンの種々の断片(表2および実施例1を参照)に対して誘導した抗
体の存在について分析した。組換えコラーゲンおよび組換えゼラチンを、8%Tr
is-グリシンまたは10〜20%トリシンSDS-PAGEゲルで電気泳動した。ウエスタン
ブロット分析は、この研究で用いたモルモットの各々からの抗血清を用いて行っ
た。図14では、組換えヒトI型コラーゲンで免疫したモルモットからの血清中に
組換えヒトI型コラーゲン特異的抗体が存在することが示されている。ウエスタ
ンブロット分析により分析した組換えゼラチンに対する抗体反応性は、調べた血
清のいずれにおいても見られなかった。図14は、この研究における1匹のモルモ
ットからの抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示している。少なく
とも4匹の異なるモルモットからの血清を分析したところ、それらの各々は、図
14で示した結果と同一の結果を示した。
【0288】
モルモットへのrhcIの注射後に見られる抗原応答に関与すると考えられるI型
コラーゲンのエピトープを解明することが望ましかった。組換えヒトI型コラー
ゲンを、変性およびカラムクロマトグラフィーの後で、そのα1(I)成分とα2(I)
成分とに分けた。組換えI型コラーゲンのα1(I)鎖および組換えI型コラーゲン
のα2(I)鎖の臭化シアン(CNBr)分解は、BornsteinおよびPiez (1966) Biochem
istry 5:3460に記載されているようにして行った。完全な状態のままのα鎖およ
び結果として生じるペプチド断片はSDS-PAGEにより分離し、上記のモルモット血
清に対する反応性についてウエスタンブロット分析により分析した。図15Aには
、組換えヒトI型コラーゲンの完全な状態のままのα1(I)鎖およびα2(I)鎖なら
びにCNBr分解したα1(I)鎖およびα2(I)鎖のクーマシー染色したSDS-PAGEが示し
てある。ウエスタンブロット分析から、rhcIに対して反応性であるモルモットの
抗血清が、I型コラーゲンのα2鎖およびその特定のCNBr断片に対して誘導され
たことが示された。I型コラーゲンのα1鎖に対する反応性は全く検出されなか
った(図15B)。
コラーゲンのエピトープを解明することが望ましかった。組換えヒトI型コラー
ゲンを、変性およびカラムクロマトグラフィーの後で、そのα1(I)成分とα2(I)
成分とに分けた。組換えI型コラーゲンのα1(I)鎖および組換えI型コラーゲン
のα2(I)鎖の臭化シアン(CNBr)分解は、BornsteinおよびPiez (1966) Biochem
istry 5:3460に記載されているようにして行った。完全な状態のままのα鎖およ
び結果として生じるペプチド断片はSDS-PAGEにより分離し、上記のモルモット血
清に対する反応性についてウエスタンブロット分析により分析した。図15Aには
、組換えヒトI型コラーゲンの完全な状態のままのα1(I)鎖およびα2(I)鎖なら
びにCNBr分解したα1(I)鎖およびα2(I)鎖のクーマシー染色したSDS-PAGEが示し
てある。ウエスタンブロット分析から、rhcIに対して反応性であるモルモットの
抗血清が、I型コラーゲンのα2鎖およびその特定のCNBr断片に対して誘導され
たことが示された。I型コラーゲンのα1鎖に対する反応性は全く検出されなか
った(図15B)。
【0289】
上記のウエスタンブロット分析は、SDS-PAGEでの電気泳動分離によって、組換
えヒトI型コラーゲン、CNBr断片、および組換えヒトゼラチンに対するモルモッ
ト血清の反応性を調べるものであった。非変性条件下でのこれらのポリペプチド
に対するモルモットの抗血清の反応性を調べるために、直接的ELISA分析を行っ
た(図16)。データから、モルモットの抗血清が、rhcIの生来のコンフォメーシ
ョンを認識することが示された。本発明の組換えゼラチンのいずれもが、該ゼラ
チンの断片が熱変性の前に存在するのか後で存在するかに関係なく、ELISAによ
りモルモット抗血清と反応しなかった。rhcIは、分析前に熱変性された場合、EL
ISAにおいてさらに一層反応性が高かった(データは示さず)。このことから、
血清中のポリクローナル抗体が、らせん構造ではなく、主に並列したエピトープ
を認識することが示される。総合すると、これらの結果から、本実施例で示すよ
うに、ヒトI型コラーゲン上(特にα2鎖上)に抗原性部位が存在することに付
随する問題は本発明の方法により回避できることが示された。したがって、本発
明は、抗原性部位を欠く組換えゼラチンの製造方法を提供するものであり、かか
る組換えゼラチンは、抗原性が低いゼラチンが望まれる特定の用途に有用である
。
えヒトI型コラーゲン、CNBr断片、および組換えヒトゼラチンに対するモルモッ
ト血清の反応性を調べるものであった。非変性条件下でのこれらのポリペプチド
に対するモルモットの抗血清の反応性を調べるために、直接的ELISA分析を行っ
た(図16)。データから、モルモットの抗血清が、rhcIの生来のコンフォメーシ
ョンを認識することが示された。本発明の組換えゼラチンのいずれもが、該ゼラ
チンの断片が熱変性の前に存在するのか後で存在するかに関係なく、ELISAによ
りモルモット抗血清と反応しなかった。rhcIは、分析前に熱変性された場合、EL
ISAにおいてさらに一層反応性が高かった(データは示さず)。このことから、
血清中のポリクローナル抗体が、らせん構造ではなく、主に並列したエピトープ
を認識することが示される。総合すると、これらの結果から、本実施例で示すよ
うに、ヒトI型コラーゲン上(特にα2鎖上)に抗原性部位が存在することに付
随する問題は本発明の方法により回避できることが示された。したがって、本発
明は、抗原性部位を欠く組換えゼラチンの製造方法を提供するものであり、かか
る組換えゼラチンは、抗原性が低いゼラチンが望まれる特定の用途に有用である
。
【0290】
本発明の記載されている方法および系の種々の変更および改変は、本発明の精
神および範囲から逸脱することなしに、当業者には明らかであろう。本発明は特
定の好ましい実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載され
れているような本発明は、不当にもそのような特定の実施形態に限定されるべき
ではないことを理解すべきである。本発明を実施するための記載されている態様
の種々の変更は、当技術分野および関連する分野に習熟する者にとっては明らか
であり、それらは本明細書の特許請求の範囲内にあるとする。本明細書中で引用
されている全ての参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み入れられる
ものとする。
神および範囲から逸脱することなしに、当業者には明らかであろう。本発明は特
定の好ましい実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載され
れているような本発明は、不当にもそのような特定の実施形態に限定されるべき
ではないことを理解すべきである。本発明を実施するための記載されている態様
の種々の変更は、当技術分野および関連する分野に習熟する者にとっては明らか
であり、それらは本明細書の特許請求の範囲内にあるとする。本明細書中で引用
されている全ての参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み入れられる
ものとする。
【配列表】
【図1】
図1は、組換えゼラチンの発現の結果を示した図である。
【図2】
図2Aおよび2Bは、組換えゼラチンが細胞付着を支持することを実証する図であ
る。
る。
【図3】
図3は、タンパク質加水分解的に安定な組換えゼラチンの製造を実証する図で
ある。
ある。
【図4】
図4は、ヒドロキシル化された組換えゼラチンの製造を実証する図である。
【図5】
図5は、in vitroヒドロキシル化後の組換えゼラチンの精製の結果を示した図
である。
である。
【図6】
図6は、プロリル 4-ヒドロキシラーゼの存在下または非存在下で発現させた
組換えゼラチンの安定性を示した図である。
組換えゼラチンの安定性を示した図である。
【図7】
図7は、発現媒体の補給により増加した組換えゼラチン発現の結果を示した図
である。
である。
【図8】
図8は、市販のゼラチンと架橋組換えゼラチンとの比較を示した図である。
【図9】
図9は、市販のゼラチンの分子量分布の比較を示した図である。
【図10】
図10A、10B、10C、10D、10E、および10Fは、120℃で行なった市販のゼラチン
の加水分解の結果を示した図である。
の加水分解の結果を示した図である。
【図11】
図11A、11B、11C、および11Dは、150℃で行なった市販のゼラチンの加水分解
の結果を示した図である。
の結果を示した図である。
【図12】
図12Aおよび12Bは、組換えヒトコラーゲンI型およびIII型の酸および熱によ
る加水分解の結果を示した図である。
る加水分解の結果を示した図である。
【図13】
図13は、組換えヒトコラーゲンI型の酵素による加水分解の結果を示した図で
ある。
ある。
【図14】
図14は、組換えヒトコラーゲンI型で免疫したモルモットから得られた抗血清
を用いた、組換えヒトコラーゲンおよび組換えヒトゼラチンのウェスタンブロッ
ト分析を示した図である。
を用いた、組換えヒトコラーゲンおよび組換えヒトゼラチンのウェスタンブロッ
ト分析を示した図である。
【図15】
図15Aおよび15Bは、組換えヒトコラーゲンI型で免疫したモルモットから得ら
れた抗血清が、コラーゲンI型の特定の臭化シアン断片に対して反応性であるこ
とを示した図である。
れた抗血清が、コラーゲンI型の特定の臭化シアン断片に対して反応性であるこ
とを示した図である。
【図16】
図16は、組換えヒトコラーゲンI型で免疫したモルモットから得られた抗血清
が組換えヒトゼラチンに対して反応性でないことを示した図である。
が組換えヒトゼラチンに対して反応性でないことを示した図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 9/72 A61K 9/72
47/42 47/42
48/00 48/00
A61P 31/04 A61P 31/04
31/12 31/12
31/14 31/14
31/16 31/16
31/20 31/20
31/22 31/22
// C07K 14/78 C07K 14/78
C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK
,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,
GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J
P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ
,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,
VN,YU,ZA,ZW
(72)発明者 ネッフ,トーマス,ビイ.
アメリカ合衆国 94027 カリフォルニア
州 アサートン,グレンウッド アヴェニ
ュー 190
(72)発明者 オルセン,デビット,アール.
アメリカ合衆国 94025 カリフォルニア
州 メンロ パーク,ヘッジ ロード
276
(72)発明者 ポラレック,ジェームス,ダブリュ.
アメリカ合衆国 94965 カリフォルニア
州 サンサリト,ワルド ポイント ハー
バー,エイ ドック,3番地
Fターム(参考) 4B024 AA01 BA80 CA04 DA12 EA04
GA14 HA08
4C076 AA11 AA24 AA29 AA93 BB01
BB25 BB27 BB31 EE42 FF63
4C084 AA13 MA13 MA16 MA34 MA43
MA52 MA56 MA59 MA63 MA66
NA03 ZB33 ZB35
4C085 AA03 EE01 GG01 GG04 GG06
GG10
4H045 AA20 AA30 BA09 CA40 EA31
FA73 FA74
Claims (45)
- 【請求項1】 組換えゼラチンを含むワクチン製剤。
- 【請求項2】 組換えヒトゼラチンを含むワクチン製剤。
- 【請求項3】 組換えゼラチンが非免疫原性である、請求項1記載のワクチ
ン製剤。 - 【請求項4】 組換えゼラチンが周辺温度における安定性を付与する、請求
項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項5】 組換えゼラチンが非天然のコラーゲンの配列に由来するもの
である、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項6】 組換えゼラチンが約0〜50kDa、約10〜30kDa、約30〜50kDa、
約10〜70kDa、約50〜70kDa、約50〜100kDa、約100〜150kDa、約150〜200kDa、約
200〜250kDa、約250〜300kDaおよび約300〜350kDaからなる群より選択される分
子量範囲を有する、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項7】 組換えゼラチンが約1kDa、約5kDa、約8kDa、約9kDa、約14kD
a、約16kDa、約22kDa、約23kDa、約44kDaおよび約65kDaからなる群より選択され
る分子量を有する、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項8】 組換えゼラチンが1種のコラーゲンに由来し、いかなる他の
型のコラーゲンも含まないものである、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項9】 組換えゼラチンが組換えコラーゲンを加工することにより生
産されるものである、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項10】 組換えゼラチンが改変されたコラーゲン構築物から直接生
産されるものである、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項11】 組換えゼラチンが配列番号15〜25、および配列番号30、31
および33に記載の配列からなる群より選択される配列を含有するものである、請
求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項12】 注入による送達に適している請求項1記載のワクチン製剤
。 - 【請求項13】 鼻腔内送達に適している請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項14】 経口送達に適している請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項15】 経皮送達に適している請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項16】 肺深部への送達に適している請求項1記載のワクチン製剤
。 - 【請求項17】 液体である請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項18】 乾燥物である請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項19】 粉末である請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項20】 噴霧剤である請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項21】 吸入剤である請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項22】 生ワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項23】 不活化ワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項24】 サブユニットワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製
剤。 - 【請求項25】 1回用量を含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項26】 複数回用量を含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項27】 コンジュゲートワクチンを含む、請求項1記載のワクチン
製剤。 - 【請求項28】 核酸ワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項29】 核酸ワクチンがDNAワクチンである、請求項28記載のワ
クチン製剤。 - 【請求項30】 複合ワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項31】 無細胞性ワクチンを含む、請求項1記載のワクチン製剤。
- 【請求項32】 ワクシニアウイルス(スモールポックス)、ポリオウイルス
(ソークおよびセービン)、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、
水痘-帯状疱疹(ニワトリポックス/帯状疱疹)、百日咳、カルメット・ゲラン杆菌
(BCG、結核)、インフルエンザ菌性髄膜炎、狂犬病、コレラ、日本脳炎ウイルス
、チフス菌、赤痢菌、A型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、黄熱病、口蹄疫病、
単純ヘルペスウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、ロタウイルス、デング熱、
西ナイルウイルス、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス(マレク病)、インフルエ
ンザおよび炭疽症からなる群より選択される疾患の予防のためのワクチン製剤を
含む、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項33】 組換えゼラチンの内毒素レベルが1.000 EU/mg未満である
、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項34】 組換えゼラチンの内毒素レベルが0.500 EU/mg未満である
、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項35】 組換えゼラチンの内毒素レベルが0.050 EU/mg未満である
、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項36】 組換えゼラチンの内毒素レベルが0.005 EU/mg未満である
、請求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項37】 組換えゼラチンがタンパク質分解に対して安定である、請
求項1記載のワクチン製剤。 - 【請求項38】 組換えゼラチンを含むワクチン安定剤。
- 【請求項39】 組換えゼラチンを含むワクチンを生産する方法であって、 ワクチンを用意し; 組換えゼラチンを用意し;そして、 ワクチンと組換えゼラチンを混合すること; を含む、上記方法。
- 【請求項40】 組換えゼラチンを用いて被検体内における免疫応答を誘発
する方法であって、 組換えゼラチンを含むワクチンを被検体に投与することを含む、上記方法。 - 【請求項41】 以下の(i)および(ii); (i) 組換えゼラチンを含むワクチン;および (ii) ワクチンを送達するための送達デバイス; を含んでなるキット。
- 【請求項42】 送達デバイスが注射による送達用のデバイスである、請求
項41記載のワクチン接種用のキット。 - 【請求項43】 送達デバイスが鼻腔内送達用のデバイスである、請求項4
1記載のワクチン接種用のキット。 - 【請求項44】 送達デバイスが粘膜送達用のデバイスである、請求項41
記載のワクチン接種用のキット。 - 【請求項45】 送達デバイスがエアロゾル送達用のデバイスである、請求
項41記載のワクチン接種用のキット。
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US60/204,437 | 2000-05-15 | ||
PCT/US2000/030843 WO2001034801A2 (en) | 1999-11-12 | 2000-11-10 | Recombinant gelatin in vaccines |
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WO (2) | WO2001034801A2 (ja) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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