JPS62155093A - プラスチドまたはミトコンドリアへのｄｎａの移入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は植物細胞プロトプラスト中のプラスチドまたは
ミトコンドリア、及び特にクロロプラストへの遺伝子の
直接的な移入方法に、　　関する。

植物は、本発明の目的においては、光合成を行なう単細
胞または多細胞の有機体である。

植物細胞のプロトプラストは、セルロース外分解酵素に
より、部分的または完全に細胞壁物質が除去された植物
細胞である。

クロロプラストは、ある種の除草剤、例えばトリアジン
系除草剤の標的となる。最近になってトリアジン系除草
剤の一種であるアトラジンがｐｓｂ＾と呼ばれるクロロ
プラスト遺伝子によりコード化された３２ｋｄポリペプ
チドに作用することが見出された〔ヒルシュベルブ（Ｉ
Ｉ　ｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）等、１９８４　）　、　３２
ｋｄポリペプチドにおける１個のアミノ酸の置換を導＜
　ｐｓｂＡのコード領域（ｃｏｄｉＢ　ｒｅｇｉｏｎ）
の１個のヌクレオチド置換は、アトラジンに対する抵抗
性を付与する。そのような突然変異は雑草、例えばアマ
ラントウス　バイブリドウス （八ｍａｒａｎｔｈｕｓ　Ｈｙｂｒｉｄｕｓ）及びソラ
ヌム　ニグルム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｎｉｇｒｕｍ）に生
じる。

植物、特に栽培植物のプラスチドまたはミトコンドリア
のゲノムに遺伝子を直接移入できるようになることが望
まれている。これにより、上記のような植物に新しく、
そして望ましい性質を導入することが可能になる。例え
ば除草剤抵抗性の植物を生産するためには除草剤感受性
のクロロプラストに除草剤抵抗性を付与する遺伝子が必
要とされる。

今までに、クロロプラスト中で活性な除草剤に対する抵
抗性または許容性を達成するために、植物細胞の核ゲノ
ムを操作することが試みられてきた。しかしながら、そ
のような方法は、これらの除草剤に対する許容性を付与
するだけであって、本当の意味の抵抗性を付与するもの
ではない。この方法によってクロロプラストのようなプ
ラスチドの形質転換を行なうのは不可能であると考えら
れてきたので、直接的な遺伝子の移入により栽培植物の
クロロプラストに活性な除草剤に対する真の抵抗性を付
与することは不可能であると考えられてきた。

除草剤抵抗性のような望ましい性質を付与する遺伝子を
植物の核ゲノムに導入することによる別の欠点は、いく
つかの植物の雑草に受粉させる能力により生ずる。その
ような交配は導入された所望の性質の機構を雑草に供与
する。

遺伝子を植物細胞の核染色体に移入するために使用され
る最も一般的な方法は、Ｔｉ−プラスミドベクター系を
含むアグロバクテリウム（八８ｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）のような病原体による細胞の感染である。〔バートン
（Ｂａｒｔｏｎ）等、１９８３；キルトン（Ｃｈ　ｉ　
ｌ　ｔｏｎ）等、１９８５　］　、そのような方法は感
染に起因する欠点を有する。欠点としては、限られた宿
主特異性、形質転換された植物の細胞から、形質転換方
法に使用された病原体を除去する必要性が含まれる。そ
のような病原体が環境中に放出されることに関する懸念
も挙げられている。〔ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、
　１９８５）。

デ　ブ０７り（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ）等（１９８５）は、
完全な細胞及び完全に繁殖力のある植物が再生しうるタ
バコプロトプラストのクロロプラストゲノムに抗生物質
抵抗性がコード化された遺伝子を移入するためのアグロ
バクテリウムＴｉ−プラスミドベクター系の使用方法を
報告している。しかしながら、この研究は、抗生物質の
不存在下では、遺伝子は不安定であり、短期間に死滅す
ることを見出した。抗生物質の選択のもとての植物の保
存は実用性がない。

むき出しの線状または環状プラスミドＤＮＡで直接植物
細胞プロトプラストを形質転換する方法もまた公知であ
る〔パスコヴスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋ　ｉ）等、１
９８４；シルベルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒ　ｔ）
等、１９８３　）。そのような方法は病原体による植物
細胞の感染の必要がない。しかしながら、今までは、そ
の様な方法は核の形質転換に限られていた。

病原体を細胞に感染させることなく、また取り込んだ性
質が雑草に移ることがないように、植物細胞に新しい有
利な性質を付与することができるようにするために、プ
ラスチドまたはミトコンドリアのゲノムにを用な遺伝子
を直接移入することを可能にする方法が必要とされてい
る。さらに、遺伝子を植物細胞のプラスチドまたはミト
コンドリア並びに植物全体に、畑で作物が生長する間に
遺伝子の発現が失われることのないように安定に、直接
移゛入する方法が必要とされている。

従って、本発明の主要な目的は、細胞に病原体を感染さ
せずに、遺伝子を直接プラスチドまたはミトコンドリア
、特にクロロプラストのゲノムに導入し、且つ保持する
方法を提供することである。さらに、本発明の他の目的
は、遺伝子操作による一つもしくはそれ以上の特徴が安
定に維持され、且つ表現されるような条件下で遺伝子操
作されたプラスチドまたはミトコンドリアを含有する植
物体を製造することにある。

これらの目的及び他の目的は下記の記載により明らかに
なるように、プラスチドまたはミトコンドリア中で機能
性であるプロモーターを有する一種もしくはそれ以上の
遺伝子を含有するＤＮＡを、植物細胞プロトプラスト中
のプラスチドまたはミトコンドリア中に直接導入する方
法を提供することにより達成され、該方法は、プロトプ
ラストを病原体にさらすことなく、その中でＤＮＡがプ
ロトプラスト及びプロトプラストのプラスチドまたはミ
トコンドリア中に侵入するような媒体中で、そのような
侵入が行われるのに充分な時間、ＤＮＡをプロトプラス
トにさらすことからなる。

画Ａゾυ１号 第１図ないし第３図中の略号は下記の意味を示す。

Ｘ＝ＸｈｏＩ Ｓ＝Ｓｍａｌ Ｈ＝ＨｉｎｄＩ［［ Ｂ＝ＢａｍｌｌＩ ＲＩ＝εｃｏＲＩ Ｓ　１　＝Ｓａｌ　Ｉ Ｌ　ＩＧ＝Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの結合Ｘ／Ｓ　Ｉは、
Ｘｈｏ１部位（７）ＳａｌＩ部位への結合がいずれの酵
素によっても開裂されないハイブリッド部位を製造した
部位を示している。

ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼのコード領域を表わす。ＣＡＴｏはＣＡＴ遺伝子の
プロモーターのない型を表わす。

第１図ないし第３図において、ｐｓｂＡ遺伝子は黒（塗
られた部分で示され、プロモーターは白抜きの部分で示
される。

第１図ないし第３図において、ＣＡＴコード領域は点画
により示される。

本発明の明細書においては、下記の定義を用いる。

「遺伝子」は、プロモーター配列及び転写配列を含むＤ
ＮＡ配列を示す。プロモーターは大抵の場合は転写され
ず、それに続く遺伝子配列を形成し、いくつかの場合に
はそれらを避けてＲＮＡに転写される。ＲＮＡはポリペ
プチド中に翻訳されることも翻訳されないこともある。

ＲＮＡが翻訳される場合、ＲＮＡはｍ　ＲＮ　Ａと呼ば
れる。ｍＲＮＡに相当する遺伝子のＤＮＡ配列並びにｍ
ＲＮＡそれ自体は、５′未翻訳領域、コード領域及び３
′未翻訳領域を含む。コード領域だけがポリペプチドに
翻訳される。

ＤＮＡ配列の［活性部分（ａｃｔｉｖｅ　ｐｏｒｔｉｏ
ｎ）　ＪはＤＮＡ配列の機能に寄与する部位である。

ＤＮＡ配列の活性部分のいくつかの例としては、プロモ
ーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始シグ
ナル（ＴＡＴＡボックス）、５′未翻訳領域のリポソー
ム結合部位及び翻訳開始シグナル、並びに３′未翻訳領
域のコーディング配列及び転写停止シグナル及びポリア
デニル化シグナルが挙げられる。

種々の空白領域においては、ＤＮＡ配列は重要でなく、
そのような領域は活性なりＮＡ配列であるとは考えられ
ない。

天然ＤＮＡ配列の「変種（ｖａｒｉａｎｔ）　Ｊは、同
じ機能を働かせる天然配列の変化した型を表わす。変形
は突然変異であってもよく、また合成りＮＡ配列であっ
てもよく、実質的には相当する天然ＤＮＡ配列と同等の
ものである。ＤＮＡ配列は、少なくとも７０％、好まし
くは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくと
も９０％のＤＮＡ配列の活性部分が同じである場合に第
２のＤＮＡ配列と実質的に同等といえる。しかしながら
、一方を他方で置き換えてサイレント（Ｓｉｌｅｎｔ）
突然変異を構成する場合の実質的な同等性を決定する目
的のために、コード領域のＤＮＡ配列における２つの異
なるヌクレオチドは同等あると考えられる。

ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がプラスチドまたはミトコ
ンドリアのような出所に存在する場合にはそのような出
所から「誘導される」という。本発明はそのようなりＮ
Ａ配列の変種も包含する。

ＤＮＡ配列は、プラスチドまたはミトコンドリア内で期
待される機能を発現し、プラスチドまたはミトコンドリ
アの前駆体内に維持されているとき、プラスチドまたは
ミトコンドリア内で「機能性がある」という。

「形質転換されうる植物細胞プロトプラスト」とは、直
接的な遺伝子の移入をした後、通常はプラスチドまたは
ミトコンドリア内に見出されない共有結合したＤＮＡか
らなるプラスチドまたはミトコンドリアのゲノムを含む
プロトプラストを意味する。

本発明の方法により形質転換されうる植物細胞のプロト
プラストは、培養細胞、植物の部分に付いた細胞、また
は多細胞植物に付いた細胞から誘導されうる。形質転換
されうる植物細胞のプロトプラストは、藻類のような単
細胞植物から誘導されてもよい。単細胞植物の例として
は、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）
　　（例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃ。

ｃｃｕｓ）種〕、タラミードモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏ
ｍｏｎａｓ）　、及びユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）が
挙げられる。本発明の目的において好ましい植物細胞プ
ロトプラストは、多細胞植物から誘導される。形質転換
の後、プロトプラストは植物細胞に再生されうる。

全ての植物細胞プロトプラストは本発明により遺伝子操
作されたプラスチドまたはミトコンドリアを有すること
ができる。適する植物細胞プロトプラストの例としては
、茄属（ジャガイモ）、綿属（綿）、ダイズ属（ダイズ
）、ペチュニア属（ペチュニア）、ニンジン属にンジン
）、種属（オレンジ、レモン）、サンゴジュナスビ属（
トマト）、アブラナ属（チューリップ、キャベツ、カリ
フラワー等）、テンサイ属（ビート）、インゲンマメ属
（豆）、ヒマワリ属（ヒマワ１月、ナンキンマメ属（ビ
ーナツツ）、ヒエ属（グレインアマランス（ｇｒａｉｎ
　Ａｍａｒａｎｔｈ））　、ウマゴヤシ属（アルファル
ファ）、ツメフサ属（クローバ−）、ロウトウ属（ナイ
トシェード（ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ）、ヒヨス属（ヒヨ
ス）、ジギタリス属（ジギタリス）、カタランサス属（
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｓｐｐ、）（ツルニチソウ
）、エントウマメ属（エントウマメ）、及びマツ属（松
）が含まれる。

形質転換されうるプラスチドには、例えばクロモプラス
ト（ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ）　、アミロプラスト（ａ
ｍｙｌｏｐｌａｓｔ）、ロイコプラスト（ｌｅｕｃｏｐ
ｌａｓｔｓ）　、エチオプラスト（ｅｔｉｏｐｌａｓ　
ｔｓ）、プロプラスチド（ｐｒｏｐｌａｓ　ｔｉｄｓ）
及びクロロプラスト（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）が含
まれる。クロロプラストが形質転換のための好ましいプ
ラスチドである。

本発明はまた、プラスチドまたはミトコンドリア中で機
能性の遺伝子をも含む。本発明の遺伝子は、それらが導
入されたプラスチドまたはミトコンドリアに所望且つを
用な性質を付与する。有用な性質の幾つかの例としては
、植物毒素抵抗性、例えば除草剤または抗生物質抵抗性
、改良された光合成能力、及び酵素のための色素体基剤
が知られている酵素活性が挙げられる。

除草剤抵抗性は、プラスチドまたはミトコンドリアにお
いて活性なあらゆる除草剤に対するものでありうる。例
えば、多くの除草剤はクロロプラスト内で有効である。

そのような除草剤としては、トリアジン、尿素、スルホ
ニル尿素、及びウラシル類の除草剤、並びにグリホセー
ト（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）が挙げられる。

トリアジン系除草剤のいくつかの例として、アトラジン
、アメトリン、メトリブチン、及びシマジンが挙げられ
る。尿素系除草剤のいくつかの例としては、フェニル尿
素除草剤、例えばデユーロン（ｄｉｕｒｏｎ）、クロロ
キシュロン（ｃｈｌｏｒｏｘｕｒｏｎ）及びフルオロメ
ツロン　（ｆｌｕｏｒｍｅｔｕｒｏｎ）及びＤＣＭＵ　
（ジクロロメチル尿素）が挙げられる。スルホニル尿素
のいくつかの例として、オウスト（Ｏｕｓｔ）及びグリ
ーン（Ｇｌｅａｎ）が挙げられる。ウラシル除草剤のい
くつかの例としては、プロマシル（ｂｒｏｍａｃｉｌ）
及びテルバシル（ｔｅｒｂａｃｉＬ）が挙げられる。

これらの及び他の除草剤はレバロン（ＬｅＢａｒｏｎ）
及びブレラセル（Ｇｒｅｓｓｅｌ）　（１９８２）に記
載されている。

一つの細胞中、約５０ないし１００のクロロプラスト全
てに、細胞に除草剤抵抗性を付与するために除草剤抵抗
性を組み込んだ遺伝子により直接的な遺伝子移入を起こ
す必要はない。

細胞の保護のためには、クロロプラストの少量の画分へ
の直接的な遺伝子移入で充分である。

除草剤抵抗性、例えばアトラジン抵抗性を植物に付与す
る能力は幾つかの理由から望ましい。例えば除草剤に対
して許容性の植物に除草剤を増加したレベルで使用する
ことを可能にすることである。除草剤のレベルの増加は
雑草防除の効果を増加する。

さらに、除草剤抵抗性は選択するのがより難しい植物学
的特徴に遺伝子的に結合させた選択性のある標識として
使用しうる。この可能性の利点を得るために、除草剤抵
抗性を付与する遺伝子及びもう一つの所望の特徴を得る
ための第２の遺伝子を含むＤＮＡ供与体のプラスミドが
製造される。第２の遺伝子は、例えば改良された光合成
能を付与しうる。このＤ’ＮＡ供与体は植物細胞のプロ
トプラストに導入され、これは植物細胞培地中に再生さ
れ、結果として全植物に再生される。完全な植物は除草
剤抵抗性及び第２の特徴の両方を有する。除草剤の存在
下で植物を成長させることにより、第２の特徴を有する
植物を選択することができる。

さらに、植物のクロロプラストに除草剤抵抗性及び第２
の農業的に有用な特徴の両方を付与しうるＤＮＡ供与体
の導入は、除草剤の存在下での植物の生長により、第２
の特徴がクロロプラスト中で安定に維持されることを可
能にする。クロロプラスト中での外来遺伝子の不安定性
は、すでにデ　ブロック等（ＤｅＢｌｏｃｋ　ｅｔ　ａ
ｔ）、１９８５により記載されている。

（上記参照）。

好ましくは除草剤抵抗性は２−クロロ−４−エチルアミ
ノ−６−イツプロビルアミノー１．３．５−１−リアジ
ンであるアトラジンに対するものである。

抗生物質抵抗性は形質転換されたプラスチドまたはミト
コンドリアを含む細胞を生体外で確認するために利用さ
れうる特徴である。

この選択性標識を付与する遺伝子は特にそれらが農業的
に有用な特徴に遺伝子的に結合されている場合に有用で
ある。例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、
または原則として他のいずれの抗生物質に対する耐性も
この方法に有用である。

主に、組織培養において遺伝子操作されたプラスチドま
たはミトコンドリアを含む植物細胞を確認するためのス
クリーニングしうる標識として有用な特徴は、色原体の
基質を有する酵素を組み込んだ遺伝子の導入により得ら
れる。例えば、酵素がベーターガラクトシダーゼである
場合、植物細胞は、色原体基質Ｘガル（５−クロロ−４
−プロモー３−インドリル−ベーターＤ−ガラクトシド
）を含む組織培養培地上に置かれ、そして遺伝子操作さ
れたプラスチドまたはミトコンドリアを含む植物細胞は
ベーターガラクトシダーゼによるＸガルの開裂により放
出されるインジゴ染料により青く着色される。

本発明において有用な遺伝子は従来技術において公知の
方法により得られる。該方法は、天然の遺伝子、及び天
然の遺伝子が挿入されるプラスチドまたはミトコンドリ
アに外部から天然に生じた変種の遺伝子を単離すること
を含む。遺伝子は天然遺伝子またはプラスチドまたはミ
トコンドリア中で機能する天然遺伝子のいかなる変種で
もよい。好ましくは、遺伝子は天然のプラスチド、ミト
コンドリア、またはバクテリアの遺伝子であり、最も好
ましくはクロロプラスト遺伝子である。遺伝子が（亥内
にではなくプラスチドまたはミトコンドリア内に実際に
存在することを確認するために、遺伝子は、核内では機
能しないか、または少なくともプラスチドまたはミトコ
ンドリア内に比べて核内での機能性が実質的に低いこと
が必須ではないが、望ましい。

天然バクテリアの遺伝子の幾つかの例としては、抗生物
質抵抗性または色原体の基質を有する酵素を組み込んだ
ものが含まれる。プラスチドまたはミトコンドリアに抗
生物質抵抗性を付与しうるバクテリアの遺伝子は、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子で
ある。色原体の基質を有する酵素を組み込んだバクテリ
アの遺伝子はベータガラクトシダーゼを組み込んだ１ａ
ｃＺである。プラスチドまたはミトコンドリアの遺伝子
のいくつかの例としては、除草剤抵抗性または改良され
た光合成能がコード化されたものを含む。除草剤抵抗性
を付与しうるクロロプラスト遺伝子は、ヒルシュベルブ
（Ｉｌｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）等（１９８３）により記載
された突然変異性ｐｓｂＡ遺伝子、または突然変異性ｐ
ｓｂＤ遺伝子〔ロシ＋　ソバ（Ｒｏｃｈａｉｘ）等（１
９８４）　）である。改良された光合成能を付与しうる
クロロプラスト遺伝子は、ｒｂｃＬ変異型であり、それ
は、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシ
ラーゼ／オキシゲナーゼ）（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の変異し
た大きなサブユニットをコード化している。Ｒｕｂｉｓ
ｃｏの大きなサブユニットを表わす遺伝子はすでにクロ
ロプラスト中に存在し、光合成能に影響する。しかしな
がら、この遺伝子の改良された光合成能を有する変異型
（突然変異体、遺伝子操作または異種）を導入すること
も可能である。〔ジヨルダン（Ｊｏｒｄａｎ）等、１９
８１　）キメラ遺伝子を形成することにより、プラスチ
ドまたはミトコンドリア内で機能性の遺伝子を得ること
もできる。キメラ遺伝子は少なくとも一部、好ましくは
活性部位が、天然には他の部位と共有結合していない遺
伝子である。キメラ遺伝子はＲＮＡの転写を特定しても
よく、またはポリペプチドを記号化してもよい。

本発明によるキメラ遺伝子のプロモーターはプラスチド
またはミトコンドリア中で機能性であるいずれのプロモ
ーターでもよい。キメラ遺伝子のプロモーターは天然の
プラスチドまたはミトコンドリアの遺伝子から誘導しう
るか、またはプラスチドまたはミトコンドリアに対する
異種遺伝子から誘導しうる。好ましい天然のプラスチド
またはミトコンドリアの遺伝子のプロモーターとしては
、ｐｓｂＡ、ｐｓｂＤ及びｒｂｃＬ遺伝子から誘導され
るものが含まれる。プロモーターは天然のプロモーター
の変種であってもよく、本発明のキメラ遺伝子の異種の
プロモーターは、天然にはプラスチドまたはミトコンド
リア中に存在しない天然のプロモーターであってもよい
、プラスチドまたはミトコンドリアの遺伝子の機能はし
ばしばバクテリアの遺伝子と類似しているかまたは同一
であるため、バクティアのプロモーターもプラスチドま
たはミトコンドリア中で機能しうる。プラスチドまたは
ミＩ・コンドリアで機能性のいずれのバクテリアのプロ
モーターも本発明のキメラ遺伝子のプロモーターとして
使用しうる。いくつかの適するバクテリアのプロモータ
ーの例としては、ネオマイシンホスホロトランスフェラ
ーゼ■から得られるもの及びＴｉプラスミドツバリンシ
ンターゼ遺伝子のようなＴ−ＤＮＡ遺伝子から得られる
ものが含まれる。

異種のプロモーターは、プラスチドまたはミトコンドリ
ア中で機能性の部分的にまたは完全に合成されたいずれ
のプロモーターでもよい。転写開始位置から約ｌＯヌク
レオチド単位の位置にＴＡＴＡＡＴのような配列を有す
るという点でそれらの天然の対応物（Ｃｏｕｎｔｅｒｐ
ａｒｔ）と類似する部分的にまたは完全に合成されたプ
ロモーターもまた、本発明の範囲に含まれる。

本発明のキメラ遺伝子の５′非翻訳領域はプラスチドま
たはミトコンドリア中で機能性のいずれの５′非翻訳領
域でもよい。例えば、５′非翻訳領域はプラスチドまた
はミトコンドリアから誘導されてもよく、またプラスチ
ドまたはミトコンドリアと異種の遺伝子から誘導されて
もよい。好ましい同族の５′非翻訳領域は、ｐｓｂＡ、
ｐｓｂＤ、またはｒｂｃＬ遺伝子から誘導されるもので
ある。好ましい異種の５′非翻訳領域はバクテリアから
誘導されるものである。有効なリポソーム結合部位を有
するという点でそれらの天然の対応物と類似している合
成５′非翻訳領域も本発明の範囲に含まれる。

原則として、植物細胞に望ましい特徴を付与しうる全て
のコード領域が本発明の暗号領域として適している。上
記で論じた全ての天然遺伝子並びに他の起源から誘導さ
れるコード領域を本発明のキメラ遺伝子の製造に使用し
うる。

従って、本発明のコード領域は、天然のプラスチドまた
はミトコンドリアの遺伝子から誘導することができ、異
種の起原のものからＢｚＢすることができ、完全にまた
は部分的に合成されたものでもよく、またはそのような
コード頒域二つもしくはそれ以上のイン−フレーム（ｉ
ｎ−ｆｒａｍｅ）融合体であってもよい。各コード領域
は一個もしくはそれ以上の新規な性質を植物の細胞に付
与するポリペプチドをコード化している。

ある種の植物のクロロプラストに天然に生じる遺伝子に
より発現するポリペプチドの例の一つは、ヒルシュベル
ブ等（１９８３）により記載されている３２ｋｄポリペ
プチドから得られる突然変異体である。このポリペプチ
ドは、ある種の雑草にアトラジン抵抗性を与えることが
発見されている。このポリペプチドをコード化している
ｐｓｂＡ遺伝子は、本発明の方法により栽培植物のよう
な有用な植物に挿入しうる。

プラスチドまたはミトコンドリアと異種の起原から誘導
されるコード領域の例の一つは、植物、動物またはバク
テリアのｇｓｈＡ及びｇｓｈＢ遺伝子から誘導されるコ
ード領域並びにグルタチオンリダクターゼ（ｇｏｒ）遺
伝子から誘導されるコード領域であり、これはプラスチ
ドまたはミトコンドリア内に導入されたときに有用な特
徴を付与しうる。ｇｓｈＡ及びｇｓｈＢはトリペプチド
グルタチオンの合成を触媒し、多くの除草剤の結合的な
解毒の作用の原因となる。〔マイスター（Ｍｅｉｓｔｅ
ｒ）等、１９８３　：　レンネンベルグ（Ｒｅｎｎｅｎ
ｂｅｒｇ）等、１９８２　）プラスチドまたはミトコン
ドリアと異種の起原から誘導されるコード領域のもう一
つの例は、植物、動物、昆虫またはバクテリアのグルタ
チオン−８−トランスフェラーゼ遺伝子から誘導される
コード領域である。除草剤アトラジンに許容性のあるこ
とが知られているいくつかの植物〔シマブクロ（Ｓｈｉ
ｍａｂｕｋｕｒＯ）等、１９７１　）において、この許
容性はグルタチオン−３−）ランスフェラーゼの存在の
ためであることが公知である。グルタチオン−８−トラ
ンスフェラーゼはアトラジン−グルタチオン結合の形成
を触媒することにより植物毒素を解毒化する。

本発明のキメラ遺伝子に有用なもう一つのコ゛−ド領域
は、さらに有効なＲｕｂｉｓｃｏの型をコード化してい
る。そのようなコード領域は天然遺伝子から誘導されう
る。

本発明のコード領域は、２つもしくはそれ以上の異なる
コード領域からも誘導されうる。

そのような暗号領域からコード化されうるポリペプチド
は融合ポリペプチドと呼ばれる。

融合ポリペプチドの例は、さらに有効なＲｕｂｉｓｃｏ
型である。Ｒｕｂｉｓｃｏは二つの機能、すなわちカル
ボキシラーゼ及びオキシゲナーゼとしての機能を有する
。カルボキシラーゼ機能は光合成において生産性がある
が、オキシゲナーゼ機能は望ましくない。従って、適す
る融合ポリペプチドはカルボキシラーゼ機能を最大限に
する部分とオキシゲナーゼ機能を最小限にする第２の部
分とを有する。

キメラ遺伝子の３′非翻訳領域は、プラスチドまたはミ
トコンドリアに天然に生じてもよく、またはプラスチド
またはミトコンドリアのゲノムとは異種であってもよい
。好ましい３′非翻訳領域はプラスチドまたはミトコン
ドリア起源の遺伝子から誘導される。好ましい３′非翻
訳領域はｐＳｂＡ、ｐＳｂＤまたはｒｂｃＬのものであ
る。

本発明の遺伝子の転写された領域は、いくつかの場合に
それ自体が有用であるＲＮＡ転写物等を特定することが
できる。これらの転写物はｔＲＮＡまたはｒＲＮＡを構
成しうる。

転写物はもう一つのＲＮＡ転写物の配列の少なくとも一
部と相補的な配列を有するＲＮＡであってもよい。その
ような相補的な配列は、アンチセンス配列（ａｎｔｉ−
ｓｅｎｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）として知られており
、充分に長い場合にはアンチセンス配列と相補的である
部分のＲＮＡ配列の機能を破壊しうるか、または該ＲＮ
Ａの遺伝子からの転写を妨害しうる。参照：ぺスツカ（
Ｐｅｓ　ｔｋａ）等、１９８４；メルトン（Ｍｅｌｔｏ
ｎ）等。

１９８５；イザント（Ｉｚａｎｔ）等１９８４；　シモ
ンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）等、１９８３；コールマン（Ｃｏ
ｌｅｍａｎ）　、　１９８４゜本発明に有用な転写され
た領域は、天然の転写領域から誘導されつるか、または
完全にもしくは部分的に合成しうる。抗センス配列は天
然遺伝子の少なくとも一部から、その部分の天然遺伝子
の向きをそのプロモーターに関して逆にすることにより
誘導されうる。

本発明に使用するのに適する遺伝子は従来より知られて
いる方法〔マニアチス（ＭａｎｉａｔｉＳ）等、１９８
２）により製造されるか、またはプラスミドクローニン
グベクターに挿入される。

外来遺伝子の植物細胞のゲノムのＤＮＡへの挿入は、遺
伝子が天然のＤＮＡ配列（キャリアーＤＮＡ）により支
持されている場合に有利である。キャリアーＤＮＡは植
物細胞に挿入される構成が線状ＤＮＡ分子であるように
、２本の線状ＤＮＡ鎖からなっていてもよい。しかしな
がら、遺伝子の形質転換のための構成は、環状構造（プ
ラスミド構造）を有していてもよい。キャリアーＤＮＡ
は合成起源でもよく、または天然に生じるＤＮＡ配列か
ら適当な制限エンドヌクレアーゼで処理することにより
得ることもできる。従って、例えば一種もしくはそれ以
上の制限エンドヌクレアーゼで開環した天然に生じるプ
ラスミドがキャリアーＤＮＡとして適している。そのよ
うなプラスミドの例としては、容易に得られるｐｕｃａ
プラスミド〔メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）等、　１９
８２に記載〕がある。天然に生じるプラスミドの断片も
またキャリアーＤＮＡとして使用しうる。

形質転換のための構成はＴｉプラスミドまたは変種のＴ
ｉプラスミド由来のＤＮＡを含有していても含有してい
な（でもよい。プラスミドはそれが少なくとも一個°の
Ｔ−Ｄ　Ｎ　Ａ境界領域を有する場合に変種のＴｉプラ
スミドであると考えられる。Ｔ−ＤＮＡ境界領域は植物
細胞に挿入されるゲノム（Ｔ−ＤＮＡ）にアゲロアＮＪ
クテリウムが接触しうるような異なる配列を引き起こす
アグロバクテリウムのゲノムのＤＮＡの配列である。Ｔ
−Ｄ　Ｎ　Ａ境界領域は、例えばＴｉもしくはＲｉプラ
スミドのようなベクターの配列、または変種のＴｉもし
くはＲｉプラスミドの配列であってもよい。Ｔ−Ｄ　Ｎ
　Ａは境界領域と同じベクターの配列であっても、異な
るベクターの配列であってもよい。

植物細胞の遺伝子の形質転換の確率は種々の要因により
強化されうる。従ってイーストの実験により知られてい
るように、成功する安定な遺伝子形質転換の数は下記の
要因により増加する： １、細胞あたりの新しい遺伝子の複製物の数を増加させ
ること ２、複製シグナルが新しい遺伝子と結合していること ３、　挿入シグナルが新しい遺伝子と結合していること
。挿入シグナルはＤ　Ｎ　Ａ　ＩＫの他のＤ　Ｎ　Ａ　
鎖への挿入を促進するシグナルである。

従って、本発明の方法は形質転換された遺伝子が植物細
胞内で有効な複製シグナルと結合されているとき、また
は植物細胞内で有効な挿入シグナルと結合されていると
き、または両方のシグナルと結合されているときに特に
有効であると思われる。

プロトプラスト、細胞培養中の細胞、植物組織中の細胞
、花粉、花粉管、卵細胞、胚嚢または受精卵、並びに異
なる発達段階にある胚が形質転換の出発材料として適す
る植物材料の代表例である。プロトプラストは他の前処
理なしに直接それを使用することができるため好ましい
。

単離した植物のプロトプラスト、細胞または組織はそれ
自体公知の方法により、または公知方法と類似の方法に
より得られる。

単離した植物のプロトプラストを得るための出発材料と
して適する単離した植物の細胞及び組織は、植物のあら
ゆる部分から、例えば葉、胚、茎、花、根、または花粉
から得られる。葉のプロトプラストを使用するのが好ま
しい。単離したプロトプラストは細胞培養からも得られ
る。プロトプラストの単離方法は、例えばガンボルグ（
Ｇａｍｂｏｒｇ）　、　（１９７５）等に記載されてい
る。

新しい遺伝子の植物細胞への移入は、植物を植物病原性
バクテリア、ウィルスまたは菌のような病原体に感染さ
せることなく、及びＤＮＡ移入性病原体を植物に感染す
ることのできる昆虫または菌によりＤＮＡを移入するこ
となく、直接行なうことができる。この直接的な移入は
、遺伝子を含むＤＮＡを、遺伝子がプロトプラストまた
はプロトプラストのプラスチドまたはミトコンドリア中
に侵入するような媒体中で、そのような侵入が行われる
のに充分な時間、プロトプラストにさらすことにより達
成される。形質転換の頻度は、遺伝子の移入のための種
々の技術とこの方法を合わせることにより増加させうる
。そのような技術の例には、ポリーＬ−オルニチン、ポ
リーＬ−リジン、リポゾーム融合体、ＤＮＡ−タンパク
質複合体による処理、プロトプラストの膜における電価
の変更、微生物のプロトプラストとの融合、またはリン
酸カルシウム共沈、並びに特にある種の多価アルコール
、例えばポリエチレングリコールによる処理、熱衝撃、
及び電気泳動、並びにこれら３つの方法の組み合わせが
挙げられる。

本発明で使用するのに適する媒体は、遺伝子を含むＤＮ
Ａがプロトプラストまたはプロトプラストのプラスチド
またはミトコンドリア中に侵入するようないずれの媒体
であってもよい。

外来遺伝子及びレセプタープロトプラストを導入するの
に適する溶液は、好ましくはプロトプラストの培養に使
用される浸透圧的に安定な培地である。

個々の成分または成分の種類の異なる多種の培地がすで
に使用できるようになっている。

しかしながら、全ての培地はそれらが、約１０■／１な
いし数百ｔｔｘｒ／（ｌの範囲の濃度の無機イオンのグ
ループ（いわゆるマクロニレメン）　（ｍａｃｒｏｅｌ
ｅｍｅｎｔｓ）　、例えば硝酸イオン、燐酸イオン、硫
酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イ
オン）；最大数■／ｌの濃度の他のグループの無機イオ
ン（いわゆる微量元素、例えば、コバルト、亜鉛、銅、
マンガン）；多数のビタミン類（例えばイノシトール、
葉酸、チアミン）；エネルギー源及び炭素源、例えばス
クロースまたはグルコース；及び０．０１ないし１０■
／β　の範囲の濃度のオーキシン及びシトキニン類の天
然または合成の植物ホルモンの形態の植物生長調節剤を
含有するという原則に従っている。培地はさらに、糖ア
ルコール（例えばマンニトール）または糖（例えばグル
コース）または塩イオン（例えばＣａＣ１□）により浸
透圧的に安定化されており、ｐＨが５．６ないし６．５
の範囲に合わせられている。

慣用の培地に関するさらに詳細な説明は、例えばコブリ
ッツ（Ｋｏｂｌｉｔｚ）等、　（１９７４）に記載され
ている。

直接的なプロトプラストの形質転換に特に適する媒体に
は、プロトプラストの膜を変性することができ、細胞融
合を促進するのに有用な多価アルコールが含まれる。好
ましい多価アルコールはポリエチレングリコールである
。長鎖の多価アルコール、例えばポリプロピレングリコ
ール（４２５ないし４０００ｇ／ｍｏ　ｌｅ）、ポリビ
ニルアルコールまたは水酸基が部分的にまたは完全にア
ルキル化された多価アルコールもまた使用しうる。農業
に一般的に使用されており、植物に許容性の多価の分散
剤もまた適する多価アルコールである。そのような分散
剤は下記の文献に記載されている。

“マクカッチャンズ　デタージェンツ　アンド　エマル
ジフィアーズ　アニュアル（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ
　　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　　ａｎｄ　　Ｅｍｕｌｓｉ
ｆｉｅｒｓ　　Ａｎｎｕａｌ）”、エムシー　パブリッ
シング　コーボレーション（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
　Ｃｏｒｐ−）＋リッジウッド（Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ）
　、　ニューシャーシー、　１９８１；バー　シュタラ
へ（Ｓｔａｃｈｅ、Ｈ，）、“テンジッドタッシエンブ
ッフ（Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ）　’　
＋カール　ハンザ−フェルラーク（Ｃａｒｌ　１ｌａｎ
ｓｅ、ｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、　　ミュンヘン／ウィーン
、　１９８１゜好ましい多価アルコールは１０００ない
し１００００ｇ／ｍｏ１ｅ、好ましくは３０００ないし
８０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲の分子量を有するポリエチ
レングリコールである。

直接的な形質転換の頻度は下記にさらに詳細に記載した
技術により大きく改良しうる。

ポリエチレングリコール処理においては、プロトプラス
トの懸濁液を培地に添加する。

その後、遺伝子を含み、線状でも環状プラスミドの形態
でもよいＤＮＡをポリエチレングリコールと培地との混
合物に添加する。または、プロトプラスト及び遺伝子を
含むＤＮＡを最初に培地に添加し、その後ポリエチレン
グリコールを添加する。

本発明の方法において、電気泳動及び熱衝撃処理もまた
、特に有利な技術であることが証明された。

電気泳動において、ニューマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）等、
　（１９８２）はプロトプラストを等張溶液、例えばマ
ンニトール／マグネシウム溶液に移し、そしてプロトプ
ラスト懸濁液を電気泳動装置のチェンバーの二つの電掻
の間に注入することを報告している。Ｑ’（Ｑ液の上の
コンデンサーを放電させることにより、プロトプラスト
は高電圧且つ短期間の電気的衝撃を受け、これによりプ
ロ（・プラスト膜の分極及び膜の開孔が起こる。

熱処理においては、プロトプラストを等張溶液、例えば
マンニトール／塩化カルシウム溶液に懸濁し、そして該
懸濁液を小さな容器、例えば遠心分離管中で、好ましく
は水浴中で加熱する。加熱時間は選択した温度による。

通常、温度は４０ないし８０℃の範囲で、１秒ないし１
時間である。４０ないし５０℃で４ないし６分間、とり
わけ、４５℃で５分間で良好な結果が得られる。続いて
、懸濁液を室温またはそれ以下に冷却する。

また、形質転換の頻度が細胞外の核酸により不活性化す
ることが見出された。不活性化は、植物に許容性の２価
の陽イオン、例えばマグネシウムまたはカルシウムによ
って行われる。好ましくは高いｐＨ１最も好ましくは９
ないし１０．５のｐＨで形質転換を行なうことにより不
活性化を行なうのが有効である。

驚（べきことに、これらの異なった方法の選択的な使用
により、遺伝子操作の分野において長い間目標とされて
いた形質転換の頻度の実質的な増加が達成される。

遺伝子の形質転換において形質転換頻度が低いほど、形
質転換細胞から得られる少量のクローン化された細胞を
大量の形質転換されていないクローンから探し出さなけ
ればならず、より困難で時間がかかる結果となる。形質
転換頻度が低い場合、使用した遺伝子が選択性標識機能
（例えば特定の物質に対する抵抗性）を有するものでな
い限り、慣用のスクリーニング技術の使用が実質的に不
可能である。従って、低い形質転換頻度は、標識機能を
持たない遺伝子を使用する際、非常に実質的な投資及び
努力を要求する。

外来遺伝子とレセプターのプロトプラストをポリエチレ
ングリコール処理、電気泳動及び熱衝撃のような他の技
術を使用する以前に結合させることにより、使用した一
連の工程の順序が異なる方法と比較して、形質転換頻度
の実質的な改良をもたらすことができる。

２もしくは３種の下記の技術：ポリエチレングリコール
処理、熱衝撃処理及び電気泳動を組み合わせることが有
利であり、そして外来遺伝子及びプロトプラストが溶液
中に導入された後にこれらの技術を使用することにより
特に良い結果が得られることが証明された。

好ましい技術は、ポリエチレングリコール処理の前に熱
衝撃を加え、続いて所望により電気泳動を加える方法で
ある。通常、付加的な電気泳動は更に形質転換頻度を増
加させるという効果をもたらす。しかしながら、いくつ
かの場合には熱衝撃及びポリエチレングリコール処理に
より得られる結果は付加的な電気泳動により実質的にそ
れ以上改良されることはない。

植物に許容性の２価の陽イオンの使用及び／またはｐＨ
９ないし１０．５における形質転換を、上記のような個
々の形質転ＦｆＡＲ度の改良技術、即ちポリエチレング
リコール処理、熱衝撃処理及び電気泳動と組み合わせる
こともまた可能である。

従って本発明の方法はウィルス及びアグロバクテリウム
のような病原体または形質転換のための天然もしくは変
形Ｔｉプラスミドを使用することなく達成される高い形
質転換濃度を可能にする。

有利な方法は、例えばプロトプラストをマンニトール溶
液に移し、そのようにして得られたプロトプラスト懸濁
液を遺伝子を含むＤＮＡの水溶液と混合することからな
る。プロトプラストはその後、該混合物中で４５℃で５
分間培養され、続いて０℃で１０秒間冷却される。培養
後、ポリエチレングリコール（分子量３０００ないし８
０００）を該混合物中に濃度が１ないし２５％の範囲、
好ましくは約８％になるまで添加する。注意深く、完全
に混合した後、エレクトロボレーター中で処理を実施す
る。その後、プロトプラストの懸濁液を培地で希釈し、
細胞壁の再生を起こさせるように該培地中で培養する。

本発明の方法は、全ての植物細胞の形質転換に適してい
るが、特そこ被子植物飛開及び裸子植物西門の浸透性グ
ループの形質転換に適している。

裸子植物西門の中では、球果植物網が特に好ましい。

被子植物飛開の中では、上記の樹木及び潅木に加えて、
下記の科の植物が特に好ましい：ナス科、ジュウシバナ
科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカザ科、マツカゼソ
ウ科、アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バシシウ科及
びホモノ科、並びにマメ科、特に胡蝶孔亜科。特に好ま
しい植物は、ナス科、ジュウジバナ科及びホモノ科の植
物である。

特に興味深いのは、煙草属、ペチュニア属、ヒヨス属、
アブラナ属及び禾本属の植物、例えばタバコ（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　、ニコチアナ　プルン
バジニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａＢ
ｉｎｉｆｏｌｉａ）　、ペチュニア　ハイブリダ（Ｐｅ
ｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）　、ヒヨスチアムス　ム
チクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｍｕｔｉｃｕｓ）、プ
ランシカ　ナブス（ｌｌｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）
、プランシカ　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ）　
、及ヒロリウム　マルチフロルム（Ｌｏｌｉｕｍ　ｍｕ
ｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）である。

本発明によれば、プロトプラストから再生により生産し
うる全での植物から得られるプラスチドまたはミトコン
ドリアを有用に形質転換することもできる。今日までに
、例えばトウモロコシ、小麦、稲、大麦、オート麦、キ
ビ、ライ麦及びモロコシのような穀物をも含むホモノ科
の植物（芝）の代表例のプラスチドまたはミトコンドリ
アを遺伝子的に操作することは可能ではなかった。本発
明は、穀物の細胞を含むホモノ科植物の細胞のプラスチ
ドまたはミトコンドリアを直接的な遺伝子の形質転換に
より遺伝子的に形質転換することができる。同じ方法に
おいて、下記の属の植物のような栽培植物のプラスチド
またはミトコンドリアの形質転換を起こすことができる
：茄属、煙草属、アブラナ属、テンサイ属、エントウマ
メ属、インゲンマメ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ネギ属
、コムギ属、オオムギ属、カラスムギ属、セタリア属、
イネ属、カリン属、ナシ属、リンゴ属、イチゴ属、オラ
ンダイチゴ属、ウメ属、ナンキンマメ属、ライムギ属、
ウマノアシガタ属（Ｐａｎｉｃｕａ＋）　、サトウキビ
属、コーヒー樹属、ツバキ属、バショウ属、アナナス属
、ブドウ属、モロコシ属、ヒマワリ属またはダイダイ属
。

形質転換された遺伝子のプラスヂドまたはミトコンドリ
ア中への挿入は、従来技術において公知の方法、例えば
遺伝的交差及び分子微生物学的分析、特にプラスチドま
たはミトコンドリアのＤＮＡのサザン法（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）及び酵素活性試験
により調べることができる。

サザーン法は、例えば下記のように実施できる。形質転
換された細胞またはプロトプラストのプラスチドまたは
ミトコンドリアから単離されたＤＮＡを制限酵素で処理
した後、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ニトロセ
ルロース膜に移し〔サザン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ等。

（１９７５）　］　、生体外で標識した存在することが
望まれているＤＮＡとハイブリッド化する。

ＤＮＡは、ニックトランスレーション（ｎｉｃｋｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ）により、５Ｘ１０”ないし１０　Ｘ
　１０’ｃ、ｐ、ｍ７８ｇの比活性に生体外で標識する
ことができる（Ｒｉｇｂｙ等、（１９７７）　３゜フィ
ルターを０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム及び０．３Ｍ
の塩化すトリウム溶液で、６５℃で１時間かけて３回洗
浄する。ハイブリッド化ＤＮＡをオートラジオグラフィ
ーにより１ないし数日間かけてＸ線フィルム上で可視化
する。

所望の遺伝子により形質転換された細胞を従来技術にお
いて公知の方法により単離する。

これらの方法は選別及びスクリーニングを含む。核遺伝
子の選択はフラゾー（Ｆｒａ　１ｅｙ）等。

（１９８３）；ヘレラーエストレラ（Ｉｌｅｒｒｅｒａ
−Ｅｓ　ｔｒｅｌ　１ａ）等、　（１９８３）　；ベヴ
アン（Ｂ６ｖａｎ）等、　（１９８３）に記載されてい
る。スクリーニングはベータガラクトシダーゼ〔ヘルマ
ー（Ｈｅｌｍｅｒ）等、（１９８４）　）　、ツバリン
シンターゼまたはオクトピンシンターゼ〔ウォストメイ
ヤー（Ｗｏｓ　ｔｍｅｙｅｒ）等、　（１９８４）デグ
リーブ（ＤｅＧｒｅｖｅ）等、　（１９８４）〕または
アトラジン抵抗性にも適用しうる。

本発明より以前には、プラスチドまたはミトコンドリア
が直接的な遺伝子の形質転換により形質転換しうろこと
は知られていなかった。従って、以前には単離されたＤ
ＮＡのような所望の遺伝子をこれらの小器官に挿入する
ことは機能上不可能であった。遺伝子は、それらが再生
し且つ発現しうる場合に、機能的にプラスチドまたはミ
トコンドリアのゲノムに挿入されたとみなされる。

直接的な遺伝子の形質転換によりプラスチドまたはミト
コンドリア内に遺伝子を挿入することの利点は、既にプ
ラスチドまたはミトコンドリアゲノム中にある望ましく
ない遺伝子を同時に不活性化できることにある。これは
、直接的な遺伝子の移入方法においては、相同的な組み
換えによりプラスチドまたはミトコンドリアのゲノムに
外来遺伝子を挿入する必要がないために可能となるもの
である。

例えば、アトラジン抵抗型ｐｓｂＡを有するＤＮＡ分子
供与体を、相当するアトラジン感受性のｐｓｂＡ遺伝子
内に挿入する必要はない。他方、プラスチドまたはミト
コンドリアのゲノムは比較的小さいため、形質転換され
た植物の細胞の中からスクリーニングして、ＤＮＡ供与
体の挿入が所望の機能をゲノム受容体に無作為に挿入し
たものを見つけるのは実行しうろことである。従って、
プラスチドまたはミトコンドリアのゲノムへの直接的な
遺伝子の移入は、これまでは可能でなかった残留遺伝子
の不活性化方法を与える。スクリーニングにより、例え
ばアトラジン抵抗型ｐｓｂＡ遺伝子を存するＤＮＡ分子
供与体の挿入によりアトラジン感受性のｐｓｂＡ遺伝子
が不活性化された形質転換された植物細胞を見つけるこ
とができる。

さらに、プラスチドまたはミトコンドリアのゲノムへの
直接的な遺伝子の移入の利点は、それらのゲノムが核ゲ
ノムとは違って細胞質を通して母性遺伝し、且つ通常は
花粉からそれらの交配による子孫へは移入されないこと
にある。従って、移入された遺伝子が所望の性質を栽焙
作物から雑草へと付与する可能性は最小限に抑えられる
。

本発明の方法により形質転換された培地中の植物細胞は
、挿入された遺伝子に暗月化されたポリペプチドの生産
に使用しうる。そのような生産物には、例えばｐｓｂＡ
で表わされる３２ｋｄのポリペプチド、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ、グルタチオン５−
ｔ−ランスフェラーゼ、及びＲｕｂｉｓｃｏの大型サブ
ユニットが含まれる。

挿入された遺伝子を含む植物細胞は、ある場合には遺伝
子を発現し、従って新しい所望の性質を有する多細胞植
物に再生されうる。

プロトプラストから誘導された植物細胞から再生しうる
いずれの完全な植物体も、本発明の方法により作ること
ができる。いくつかの適する完全な植物体としては、例
えば、茄科（ジャガイモ）、ペチュニア屈（ペチュニア
）、ニンジン属にンンン）、サンゴジュナスビ属（トマ
ト）、アブラナ属（チューリップ、キャベツ、カリフラ
ワー等）、ウマゴヤシ属（アルファルファ）、ツメフサ
属（クローバ−）、種属、ロウトウ属、ヒヨス属、サル
ピグロシス属（ＳａｌｐｉｇＩｏｓｓｉｓ）、アラビド
プシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）　、ジギタリス属、
チコリラム属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）　、線圧　、ダイ
ズ属、フウロソウ屈、ゴマノハグサ属、及びアスパラガ
ス属が挙げられる。植物は従来技術において公知の方法
により再生されうる；参照：工ヴアンス及びブラヴオ（
Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｂｒａｖｏ）　、　１９８３：ブ
ール（Ｄａｌｅ）、１９８３　、例えば、植物は適当な
プロパグル（ｐｒｏｐａｇｕｌｅ）　、例えば細胞、カ
ルス、組織、微小器官、芽、切り技、苗条、細根、苗木
、体節朋胚子等から再生しうる。

本発明はさらに、本発明により生産された種子が挿入さ
れた遺伝子及びそれにより得られた所望の性質を含む限
り、該種子を含む。

本発明により生産された、有性生殖による子孫及び栄養
生殖による子孫を含む植物の子孫は、別の実施態様を構
成する。有性生殖の子孫は自家生殖または交配により得
られる。そのような種子及び不安定な除草剤抵抗性また
は許容性を有する除草剤抵抗性または許容性の両親によ
る子孫は、それらが除草剤の存在下で生長するかぎり、
それらの除草剤抵抗性または許容性を保持している。好
ましい除草剤はアトラジンである。従って、本発明は、
怒受性の植物が枯死するに充分な債のアトラジンのよう
な除草剤の処理下においても、生き残ることのできる植
物を遺伝子操作により生産することを可能にするもので
ある。

本発明はまた、本発明に記載された方法により形質転換
された全ての植物のプロトプラスト、植物細胞、植物の
組織培養繁殖材料または植物体、並びに本発明に記載さ
れた方法により形成された材料から誘導された該形質転
換により得られた１つもしくはそれ以上の性質を保持し
ているあらゆる植物を含む。

実施例 以下に示す実施例の方法は、−Ｃ的にマニアチス（Ｍａ
ｎ　ｉａ　ｔ　ｉｓ）等、　１９８３に見られる。酵素
は特記しない限り、ニュー　イングランドバイオラボラ
トリ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）か
ら得ることができ、製造者の説明書に従って使用される
。

スノ　ｌｌ：　　ＣＡＴ’（１ズ参■υ」λ豚戊１　、
　Ｔｎ　９０３から得られるＫｍ’遺伝子を保持してい
るベクタープラスミドｐＭＯＮ　１８７をｌ１ｉｎｄ■
及びＢａｍ　ＩＩＩで切断する。

２、プロモーターを含まないＣＡＴ遺伝子を、ｐｓＶｏ
プラスミドからゲル精製したｔｌｉｎｄｌＩＩ／Ｂａｍ
ｔｌＩ断片として単離する。（Ｇｏｒｍａｎ等、１３、
工程２から得られた断片とを工程１から得られた断片に
連結することにより、静・。

八Ｋｍ　’コロニーに対して選択性のＨＢＩＯＩ　Ｅ。

Ｃｏ１１に形質転換された、第１図にｐＣＡＴ　’とし
て示した構造を有するプラスミドを得る。

−乍１２：　　ＣＡＴの旧創蝉狡椹遣 実施例２をｐＭＯＮ　１８７以外のプラスミドで繰り返
す。

Ｔｎ　９０３から得られるＫｍ’遺伝子を含有する適当
なプラスミドを下記のように製造する。

Ｔｎ　９０３から得られるＫｍ’遺伝子を有する１、２
ｋｂＡｖａＩ［断片をプラスミドｐＡＯ２から単離する
〔才力（Ｏｋａ）等、（１９８１）　）　。Ａｖａ　Ｉ
ｆ断片の末端をフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼ
で満たし、そしてＢａｍ旧リンカ−を末端断片に結合す
る。

このＤＮＡを制限酵素Ｔａｑ　　Ｉ及びＢａｍ　ＩＩＩ
で切断し、これを前もってＣ１ａｌ及び［ｌａｍ旧で切
断したプラスミドｐＢＲ３２７に結合する。Ｔｎ　９０
３断片を含む組み換え体はＥ　ｃｏｌｉにＫｍ’を与え
る。

−ｊ　　１３：　　　３２　　　ＣＡＴの）Ｊ゛（・　
１ズ余伎）下記工程を、ｐｓｂＡプロモーターを、プロ
モーターを含まないＣＡＴ　’遺伝子に添加するために
行なう。

４、ｐＣＡＴ’をＳｍａ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［［で切断す
る。

５、ｐｓｂＡプロモーターを含有するゲル精製した１６
１　ｈｐ　Ｓｍａ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ｍ断片をプラスミド
ｐ＾１１４８４から単離する。組み換え体プラスミドｐ
Ａ１１４８４は、ｐＢＲ３２２にクローン化された除草
剤（アトラジン）抵抗性アマランサスバイブリドウス（
Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｈｙｂｒｉｄｕｓ）からのクロ
ロプラストＤＮＡの３．６８ｋｂ　Ｅ　ｃｏＲＩ断片を
含む。〔ヒルシュヘルグ（ｔｌｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）及
びマソキントソシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｃｈ）　＋　（１
９８３）　）。

６、工程５で単離された断片を工程４で得られたより大
きい断片に添加する。連結は、形質転換されたＥＣｏｌ
ｉにＣｍ’を与えるｐ３２Ｃ八Ｔに導く。

５工程（）ないし１１）において、プラスミドｐＵｃ旧
をｐＵｃ８ベクター中で形成する。

７、（第１図）完全なρｓｂＡ遺伝子を含む３．６ｋｂ
　Ｅ　ＣｏＲＩ断片（ゲル精製）をｐＡＩ＋４８４から
上記のように単離する。

８、ｐＵＣ８（第２図）はその特徴的なＥ　ＣｏＲＩ部
位で線状化される。

９、工程８により得られる線状化されたｐＵｃ８断片を
工程７に記載した断片に連結する。

Ｅ　Ｃｏ１ｔの形質転換により、一つはｐＵｃ８−３２
である所望の挿入断片を有するＡｐゝコロニーが得られ
る。

１０、ゲル精製により得られる１、８ｋｂ（７）Ｘｈｏ
　Ｉ／Ｂａｍ　ＩＩＩ断片をｐ３２ＣＡＴから単離する
。

１１、工程９で得られるプラスミドｐＵｃ８−３２をＳ
ａｌ　ｌで部分的に切断し、ＢａｌｗＩＩＩで完了する
。Ｅ　Ｃｏ１１の形質転換後の工程１０で得られる断片
との連結及びＣｍ’の選択により、９口Ｃ１（１を含む
Ｅ　Ｃｏ１１のコロニーが導かれる。

ｐＢＲＣＡＴの形成は、下記の３つのＤＮＡ断片を連結
することにより行われる。

ａ、プラスミドｐＡＩ＋４８４中のｐｓｂＡ遺伝子から
得られたＥ　ＣｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ｍ　（プロモーター
）断片（Ｃａ、６６０ｂｐ）　（工程１２）ｂ、プロモ
ーターを含まないＣＡＴ遺伝子を含有するｐｓＶｏのｆ
ｌｉｎｄＩ［［／Ｂａｍ　Ｈ１断片（工程２）Ｃ，ベク
ターとしてのｐＢＲ３２２により切断されたＥ　ＣｏＲ
Ｉ／Ｂａｍ　Ｈｌ。

１４、プラスミドに、形質転換により導入される宿主細
胞Ｅ　Ｃｏ１１上にＣｍ’を付与するｐＢＲＣＡＴを結
合する。

２Ｘ１０６／ｍｌの生息密度のタバコ　プロトプラスト
を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０゜１　＜／Ｌ　Ｌ
−ナフチル酢酸１．０　ｍｇ／ｌ及び６−ヘンシルアミ
ノプリン０．２■／１を含有するに、培地〔プランツエ
ンフィジオロジー（Ｐｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｉｅ）　　７８．４５３−４５５　（１９７６）；　　
ミューチージョン　リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）８１１６５−１７５　（１９８１）参照
）１ｍｆに懸濁させる。

０．６モル濃度の蔗糖にｐＨ５，８で浮遊させ、続いて
０．１７Ｍの塩化カルシウム中にｐｌ＋　５．８で（５
分間で１００ｇ）沈降させることによりプロトプラスト
を酵素）懸濁液から得る。続いて、上記の懸濁液に変性
した（高圧にかけた後、再びｐＨ５，８に調整したＦ−
培地〔ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２９６．７２−７４
（１９８２）　）中の分子ｆｆ１６０００の４０％ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）０．５減を及びＤＮＡ供
与体（ｐ３２ＣＡＴ、　ｐＵｃＩ＋１　、またはｐＢＲ
ｃ八Ｔ）へ５Ｍｇ及びウシ胸腺のＤＮＡ供与体ｇを含有
する水溶液６５ｍ１！を加える。ごの混合物をときどき
攪拌しながら２６℃で３０分間培養し、続いてＦ培地で
段階的に希釈する。プロトプラストを遠心分離（１００
ｇで５分間）により単離し、新たに精製したに３培地３
Ｑｍｌに懸濁しなおす。さらに直径ＩＱｃｍのペトリ皿
にｌＱｍｌを一区部として、２４°Ｃで暗所で培養を行
なう。

生息密度は１ｒｎｌあたり６．３　ＸＩＯ’のプロトプ
ラス］・を含む。３日後、各皿中の培養培地を新たに精
製したに３培地０．３容量部で希釈し、２４℃で３００
０ルクスでさらに４日間培養する。

合わせて７日後、プロトプラストから発達したクローン
を、１％アガロースゲルで固化した１０ｍｇ／Ｉのクロ
ラムフェニコールを含有する培地に植えつけ、暗くして
２４℃でビーズタイプ培養法〔プラント　セル　レポー
ト（ｒ’１ａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）　、　　
２　、２４４−２４７　（１９８３）　）により培養す
る。培養培地を５日ごとに同じ種類の新鮮な栄養溶液で
取り替える。

クロラムフェニコール含有培養培地内で継続して３ない
し４週間培養した後、抵抗性の直径２ないし３龍のカリ
（ｃａｌｌｉ）を寒天で固化した、２．４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸０．０５ｍｇ／Ｉ、１−ナフチル酢酸２ｎ
＋ｇ／ｌ　、６−ベンジルアミノプリン０．１　ｍｇ／
ｌ、キ矛チン０．１ｍｇ／ｌ及びクロラムフェニコール
１０ｍｇ／　ｌを含有するＬＳ培地〔フィシオル、プラ
ント（ｐｈｙｓｉｏｌ　ｐｌａｎｔ）　ＩＥｊ。

１００−２７（１９６５）に移す。クロラムフェニコー
ル抵抗性ニコチアナ　タバクム　ブチ　ハヴアナ（Ｎｉ
ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　Ｐｅｔｉｔ　ｌ１ａ
ｖａｎａ）ｓＲｒ　植？＋が、クロラムフェニコール１
０ｍｇ／ｌ及び６−ベンジルアミノプリン０．２ｍｇ／
ｌを含有するＬＳ培地に吸技を尋人し、その後続いてＴ
培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１６３．８５−
８７（１９６９）〕に根づかせることにより得られる。

クロラムフェニコール抵抗性カリ及び植物の選択は本質
的にデ　ブロック（Ｄｅ　１ｌＬｏｃｋ）等。

（１９８４）に記載されたように実施される。

ａ、カルス ｌないし１０ＭＭの範囲のアトラジン濃度で光強度を変
化させて形質転換していないカルスのアトラジンの毒性
曲線を調べた。推定のクロロプラストの形質転換体から
単離されたカルス及び対象用のカルスを栄養寒天板に置
いて、アトラジン濃度及び光強度を対象用の組織からク
ロロフィルが完全に脱色される程度に調整した。アトラ
ジン抵抗性は、抵抗組織の継続的な緑化によって目視で
評価する。

ｂ、完全な植物 クロロプラストの形質転換体から誘導された植物のアト
ラジン抵抗性を下記の方法により３周べた。

葉中へのクロロフィル螢光の誘導。フォトシステム■の
減少側の電子移動が７トラジンにより抑制されたとき、
クロロフェニルに吸収された放射エネルギーが螢光とし
て再放出される。この螢光は葉の表面で検出しうる。

螢光は、マルキン（Ｍａｌｋｉｎ）等、　（１９８１）
に記載されているように、透明なルーサイト窓の上に水
平に積まれた円板状の葉から検出される。

励起光はｄｃ−オペレイチット　プロジェクタ−（Ｏｐ
ｅｒａｔｅｄ　ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ）から供給され、濾
過され、結果として、強度が約１０ｎＥ　ｘｃｍ−２ｘ
ｓ−１である５００ないし６００ｎｍの周波帯の化学線
が得られる。励起光照射時間は３ｍｓである。

励起光は葉の表面に垂直に照射され、同じ表面からの螢
光１．′、、柔軟性のある光ガイドにより集積され、力
・ノド−オフ　フィルター（６６０ｎｍ）を通して赤色
感受性の光倍増管に受けられる。螢光移動はオシロスコ
ープに記録され、直接写真にされる。

Ｃ９光変調浮遊法（Ｌｉｇｈｔ　ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　
ｆｌｏａｔａｔｉｏｎ） 葉から切り抜いた円板を界面活性剤を含む燐酸緩衝液に
浮かべると、それらは細胞内の空気スペース中でＣｅ２
に対する０□の高い比率が維持されることにより光合成
が起きるかぎり浮き続ける。葉の円板を暗室中で浮かべ
た場合、または光合成を抑制する除草剤を培地に加えた
場合、それらは急速に浮力を失い、沈む。アトラジン抵
抗性の測定方法は、ヘンスレー（Ｈｅｎｓｌｅｙ）　、
　（１９８１）に記載されている。葉の円板はアトラジ
ン溶液を含有する管に移され、減圧下に置かれる。葉の
円板は該溶液により急速に浸潤され、溶液の底に沈む。

その後、減圧を解き、炭酸水素塩溶液を加え、管を光の
下に置く。光合成がアトラジンにより阻害されない場合
、光合成的に酸素が組織内に発生し、浮力が保持され、
その結果円板が表面に浮く。アトラジン感受性の円板は
底に残る。

ブラソシカ　ラバのプロトプラストを適当な等張溶液で
洗浄し、ｌ　ｍｌ当たり５×１０６の生息密度で、プロ
トプラスト（Ｐｒｏｔｐｌａｓｔ）８３゜プロシーディ
ング　エクスペリエンチア　サブルメンツム（ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ＩＥｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　５ｕｐｐ
　Ｉｅｍｅｎ　Ｌｕｍ）　ｌ　ビルクホイザー　フェル
ラーク（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、バー
ゼル、Ｖｏ１．４５（１９８３）、４４−４５に従って
製造された培養培地に懸濁させる。分子１６０００の４
０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を変性Ｆ培地（
ｐＨ５，８）に溶解しく実施例１ｂ参照）、これをプロ
トプラスト懸濁液に混合し、最終濃度を１３％ＰＥＧと
する。

この混合物に直ちに、エンドヌクレアーゼ５ａ１１テ切
断したプラスミドｐＢＲｃＡＴまたはｐ３２ＣＡＴ５０
μｇ、水６０μｇの溶液を添加する。ときおり攪拌しな
がら、該混合物を２０ないし２５℃で３０分間培養する
。その後変性させたＦ培地３Ｘ２ｍｊ！（全量で６ｒｎ
ｉ）及び培養培地２×２ｍｌ　（全量で４ｄ）を５分間
の間隔で添加する。

プロトプラスト懸濁液を１０ｃｍのベトリ皿に移し、培
地を添加して全量を２０−とする。

これらのプロトプラストの懸濁液を暗室中、２６℃で４
５分間培養する。プロトプラストを１００ｇで５分間沈
澱させることにより単離し、最初に液状、続いて固化し
たアガロースゲル培地内で処理し、その後ビーズタイプ
の培養方法〔プラント　セル　レポート（ｒ’１ａｎｔ
　Ｃｅ１Ｉ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２，２４４−２４７（
１９８３））により培養する。４週間後、最初の細胞画
分の生長段階で、クロラムフェニコールを１０ｍｇ／ｌ
のｔａ　度で培地に添加する。アガロース部分の回りの
液体培地は４日ごとに新たに調整ξ７た栄養溶液を含有
するクロラムフェニコールと取り替える。

４日後、クロラムフェニコール抵抗性のクローンを単離
し、さらにクロラムフェニコール含有栄養溶液（１０ｍ
ｇ／ｌ）を週ごとに供給することにより培養する。

ロリウム　マルチフロラム（イタリアンリグラス）のプ
ロトプラストをｐＨ５，８で、０゜４モル濃度のマンニ
トールｌ　ｍｌ当たりで２×１０”の濃度で処理する。

続いてこの懸濁液に、変性Ｆ培地（ｐ１１５．８）中の
分子量６０００の４０％のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）０．５ｍｆを加え〔ネイチ＋　　（Ｎｅｔｕｒｅ
）　２９６．７２−７４．（１９８２）　）、プラスミ
ドｐ３２ＣＡＴまたはｐＢＲＣＡＴ　５０　μｇを含有
する水溶液６５μｌを添加する。この混合物を、〔ネイ
チャ（Ｎｅｔｕｒｅ）　２９６．７２−７４．（１９８
２）〕に記載されたように、ときどき攪拌しながら２６
℃で３０分間培養し、続いてＦ培地で希釈する。プロト
プラストを遠心分離（１００ｇで５分間）により単離し
、ＣＣ培地〔ポトリクス（１’ｏ　ｔｒｙｋｕｓ）、ハ
ームス（Ｈａｒｍｓ）及びロルツ（Ｌｏｒｚ）　＋“ト
ウモロコシ（トウモロコシ属、トウモロコシ）のプロト
プラストの細胞培養からのカルスの形成方法（Ｃａｌｌ
ｕｓ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｉｎ　　Ｃｅ１ｌ　　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｐｒｏむｏｐｌａｓｔｓ　　ｏｆ　
　Ｃｏｒｎ）”＋Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、
　５４，２０９−２１４（１９７９））　　４ｍｌ中で
処理し、そして２４℃で暗室中で培養する。

１４日後、発達した細胞培養物を、クロラムフェニコー
ル（１０ｍｇ／ｌ）を含むこと以外は上記と同じである
培地に移す。抵抗性の細胞コロニーを寒天培地（上記と
同じ、１０１■／１．クロラムフェニコール、等張板な
し）に移し、そしてコロニーあたり新しい重量が数グラ
ムの大きさに達したら、バクテリアの遺伝子の存在及び
遺伝子の生物学的活性を分析する。

ＡＴ、ＵＣＩ■１　　たはＢＲＣＡＴによるノ五１ｄ灸 プロトプラストを、ニコチアナ　タバクムのニトレート
　リダクターゼ欠乏種、細胞種ｎ１ａ−１１５（ミュラ
ー（Ｍｕ　Ｉ　１ｅｒ）　＋　Ａ　、　Ｊ、及びＲ，グ
レーフ（Ｇｒａｆｅ）　、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、１６１．６フー７６（１９７８）〕の懸懸濁培養地の
ログ相（ｌｏｇ　ｐｈａｓｅ）５Ｑ＋＋＋ｊから沈澱に
より製造し、これを酵素溶液〔２％セルラーゼ　オノズ
力Ｉ＋−１０．Ｌ％マセロザイム（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍ
ｅ）　ＲＯ１９及び０．３Ｍのマンニトール洗浄液中の
０．５％ドリセラーゼ（ヘミソシュ　ファブリック　シ
ュヴアイツアーハーレ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｆａｂｒ
ｉｃ　Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌｅ）、バーゼル（Ｂ
ａｓｅｌ）により得られる）、０．０４Ｍの塩化カルシ
ウム及び０．５％の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸からなり。

これをＫＯＨでｐＨ５，６に調整する〕に再懸濁させ、
シラトリーシェーカー（ｇｙｒａｔｏｒｙ　５ｈａｋｅ
ｒ）上、２４℃で３時間培養する。その後、プロトプラ
ストを１００μｍのメツシュ篩を通して濾過することに
より未分解の組織から分離する。等量の０．６　Ｍ蔗糖
溶液を加え、この懸濁液を１００ｇで１０分間遠心分離
にかける。表面に浮いたプロトプラストを集め、洗浄溶
液中で沈澱させることにより３回洗浄する。

形質転換は電気泳動により実施される。ダイアログ（Ｄ
ｉａｌｏｇ　”　）“ボレーター（Ｐｏｒａ　ｔｏｒ）
　”（ダイアログ　ゲーエムベーハ−（Ｄｉａｌｏｇ、
　ＧｍｂＨ）　、　Ａ−フスター（Ｈａｒｆｆｓｔｒ）
、３４．４０００　　デュッセルドルフ、西ドイツによ
り得られる。

）のチャンバーを７０％エタノールで、その後１００％
エタノール溶液で洗浄し、その後ラミナー　フロー　フ
ード（ｌａｍｉｎａｒ　ｆｌｏｗ　ｈｏｏｄ）からの無
菌の空気流により乾燥することにより消毒する。プロト
プラストを０．４　Ｍマンニトール溶液中にＩＸＩＯ６
７ｍｆの濃度で懸濁し、塩化マグネシウム溶液により抵
抗値を１．４キロオームに合わせ、そしてｐＢＲｃＡＴ
、　ｐＵｃＨｌ、またはＰ３２ＣＡＴのＤＮＡを１０Ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で添加する。このプロトプラストＱ　ｆ
ＦＢ液のサンプル０．３８ｍ＃に１０秒間の間隔を置い
て３回、１０００ボルトまたは２０００ボルトの電圧を
かける。プロトプラストはＡｌ−ＣＨ培地〔グリメツウ
ス（Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ）　、　Ｋ、等、フィシオール
　プラン）（Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、）４４，２
７３−２７７（１９７８））　　３ｒｎＩｌ中、Ｉ　Ｘ
ＩＯ’／Ｗｄｌの濃度で培養され、イノシトール濃度を
１００■／ｌまで増加させ、蔗ｔＪ！　？）ａ度を３４
ｇ／ｌまで増加させ、並びに２−（３−メチル−２−ブ
テニル）アデニン０．０５ｍ１／ｌを添加することによ
り変性する。そしてこれをアガロース含有■０．６％の
アガロースにより固化する〔シー　プラーク（Ｓｅａ　
Ｐｌａｑｕｅ）、ＦＭＣコーポレーション、マリン　コ
ロイド　ディヴイジョン（Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉ
ｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ３０８、ロッ
クランド、マイン０４８４１．アメリカ合衆国〕。−週
間後、プロトプラストを含むアガロース層を、１０ｍｇ
／ｌのクロラムフェニコールを含有する液体ＡＡ−ＣＨ
培地３Ｑｍｌに移す。３週間後、その間液体培地は１週
間ごとに同じ組成の新しい培地に取り替えられているが
、形質転換された細胞コロニーは目に見えるようになる
。クロラムフェニコール含有培地に移されてから４Ｉ５
間後に、これらの細胞のコロニーを面培地〔グリメツウ
ス（Ｇｌｉｍｅｌ　１ｕｓ）　＋　Ｋ、等、フィシオー
ル　プラント（Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、）４４，
２７３−２７７（１９７８）　）に移し、さらに培養し
研究する。

ブラソソ力　ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ）及び
ロリウム　マルチフロラム（１，ｏｌｉｕｍ　ｍｕｌｉ
ｔｆｌｏｒｕｍ）のプロトプラストについての同様の分
析についても形質転換が成功した。

電気泳動装置の製造は、実施例１０に記載されており、
プロトプラストの製造については実施例６に記載されて
いる。

形質転換のために、ニコチアナ　タハクムのプロトプラ
ストを１．６　ＸＩＯ’／ｍｌの濃度でマンニトール （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸で緩衝されている
；ｐＨ５．６）中に再懸濁する。プロトプラスト懸濁液
の抵抗値をボレーター　チェンバー（ｐｏｒａｔｏｒ　
ｃｈａｍｂｅｒ）　（０．３８＋＋１）内で測定し、塩
化マグネシウム溶液（０．３）１）により抵抗値を１な
いし１．２キロオームに調整する。サンプルＱ，５ｍｌ
をキャップされたプラスチック管（容ｆｆｌ　：　５　
ｎｒｌ）　　中に入れ、それぞれに先ず、ＤＮＡ供与体
８Ｉｔｇ及び子牛の胸腺ＤＮＡ２０μｇぐらむを含有す
る水４０μβ、続いてポリエチレングリコールン容ン夜
（０．４Ｍマンニトール中、２４％ｉｙ／ｖ）を添加す
る。ＤＮＡ添加９分後に０。

３８ｍｌをパルスチェンバー（Ｐｕｌｓｅ　ｃｈａｍｂ
ｅｒ）に入れ、そせいて、ＤＮＡ添加１０分後にチェン
バー中に存在するプロトプラスト懸濁液に１０秒間の間
隔をおいて３回の衝撃（１０００−２０００ボルト）を
加える。処理された部分は直径５　ｃｍのベトリ皿に入
れ、２０℃で１０分間保持する。

その後、シー　プラーク（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ）アガ
ロース０．７％ｗ／ｖを含有するに３培地３　ｍｌを各
ペトリ皿に添加し、皿の含有物を完全に混合する。皿の
含有物を固化した後、培養物を２４℃で１時間、暗いと
ころに保持し、その後６日間、明るい所に保持する。そ
の後、寒天を含有するプロトプラストを含有するアガロ
ースを１７４に切り、その後液体培地に移す。

そして、プロトプラストをビーズタイプの培養方法によ
り培養する。カルス組織は、クロラムフェニコールで形
質転換される材料の選択により得られるが、そこから再
生される植物は、ＣＡＴ　Ｊ転子の生産物としてのＣＡ
Ｔ酵素（クロラムフェニコール　アセチルトランスフェ
ラーゼ）を含有する。

電気泳動は、電気泳動を用いない方法に比べて５ないし
１０倍の形質転換頻度の増加を誘導する。ブラソシカ　
ラバｃ．ｖ．　　ジャストライト及びロリウム　マルチ
フロラムについての同様の分析もまた、同じような規模
での形質転換頻度の増加をもたらした。

−り乍１１２：り九′蚤゛ｉ法を　いたＣＡＴ゛　云の
り　によるニコチアナ　タハ゛クムの囲包の壓ｆｉ艮 ニコチアナ　タバクムの葉または細胞培養物から単離さ
れたプロトプラストを実施例６ないしｌＯに記載された
ように単離し、そして前記の実施例に記載したように等
張の培地に移す。プロトプラスト懸濁物を４５℃で５分
間保持し、１０秒間氷冷し、その後実施例６及びｌＯに
記載したようにプラスミドｐＢＲＣＡＴ，　ｐυＣｌ１
１またはｐ３２ＣＡＴを添加する。熱衝撃処理は、該処
理を用いないで実施した形質転換に比べて１０倍または
それ以上の形質転換頻度の増加をもたらす。

下記の植物のプロトプラスト： ニコチアナ　タバクムＣ．Ｖ．ブチ　ハバナＳｔ　　　
（／’．ｊ ブラッシカ　ラバＣ０ν、ジャスト　ライト（Ｂ）及び ロリウム　マルチフロラム　（旦） を単離し、実施例１１で記載した等張培地に移す。プロ
トプラスト懸濁液をｐＵｃＨｌ　、　ｐ３２ＣＡＴまた
はｐＢｌ？ｃＡＴプラスミドと実施例６ないし９に記載
したように混合するがポリエチレングリコールによる同
時処理は行なわない。その後、プロトプラスト懸濁液を
実施例１２に記載したように熱衝撃処理し、その後、実
施例６ないし９に記載したようにポリエチレングリコー
ル処理を行なう。そして最後に実施例１１に記載したよ
うに電気泳動を行なう。この方法による形質転換頻度は
１０−３ないし１０−２の範囲であるが、条件によって
は、工ないし２％にもなりうる。

蓑曳文献 パルトン（Ｂａｒｔｏｎ）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、　
３２．１０３３゜パルトン（Ｂａｒｔｏｎ）及びキルト
ン（Ｃｈ　ｉ　１　ｔｏｎ）　、メソ・７ド　イン　エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、１０１，５２７（１９８４）へヴアン（Ｂｅ
ｖａｎ）等、ネイチャー　（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　、　３
０４．１８４（１９８３） ベヴアン（Ｂｅｖａｎ）等、ヌクレイツク　アシドリサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、　１２
．８７１１．　（１９８ボリヴア−（Ｂｏｌｉｖａｒ）
等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２．７キルトン（Ｃｈｉｌｔ
ｏｎ）等、ジエネティソクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、
８３，６０９（１９７６）キルトン（Ｃｈｉｌｔｏｎ）
等、′植物遺伝子のヘクター（Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅ　
Ｖｅｃｔｏｒ）”、１９８４年のプラント　ブリーディ
ング　レサーチ　フォルム（Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉ
ｎｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｒｍ）の報告、８月、２
１−２３　（１９８４）　、第１７７ないし１９２頁（
１９８５）コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）等、セル（Ｃ
ｅｌｌ）　、３７，４２９（１９８４）。

コマイ（Ｃｏｍａｉ）等、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ
）　、　１０゜ディル（Ｄａｌｅ）、“プロトプラスト
培養及び穀類及び他の不適応性作物の植物の再生（Ｐｒ
ｏｔｏｐｌａｓｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｒ’１ａ
ｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌ
ｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｃａｌｃｔｔｒａｎｔ　
Ｃｒｏｐ）”　プロトプラスト１９８３　レフチャープ
ロシーディング（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　１９８３　
Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）。

ボトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）等、　（ｅｄｓ）　＋
　エクスペリエンチア　サブルメント（Ｅｘｐｅｒｉｅ
ｎｔｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｄ）、Ｖｏｌｕｍｅ　４
６＋ デ　ブロック（Ｄｅ　ＢＬｏｃｋ）等、ＥＭＢＯＪ、土
、　１３６７デ　ブロック（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ）等、Ｅ
ＭＢＯＪ、　３．１６８１デ　グレヴ工（Ｄ６　Ｇｒｅ
ｖｅ）等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３００
．７５２（１９８２）デ　フラモンド（Ｄｅ　Ｆｒａｍ
ｏｎｄ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）　ｒ上、　２６Ｇ（１９８３）ジッタ（Ｄｉ
ｔｔａ）等＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　
ＵＳＡヱヱ、７３４７　（１９８０） 工ヴアンス（Ｅｖａｎｓ）及びブラヴオ（Ｂｒａｖｏ）
　、“プロトプラストの単離及び培養（Ｐｒｏｔｏｐｌ
ａｓｔｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）
’、Ａンドブック　オブ　プラント　セル　カルチャー
（Ｉｌａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ）第１巻、工ヴアンス等＋　（Ｅｄｓ）　
ｌマクミラン　パプリソシングコーポレイション（Ｍｃ
Ｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）＋ニュ
ーヨーク、　（１９８３） フラワー（Ｆｒａｌｙ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　。

靭、　４８０３　（１９８３） フラワー（Ｆｒａｌｙ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　３．６２９（１９８５）
フラワー（Ｆｒａ　Ｉｙ）等、プラント　モレキュラー
　バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｎ。

ｇｙ）、　３．３７１（１９８４） ギャンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）　、プラント　フィシ
オール（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ）、４５，３７２
（１９７０）ギャンボルグ（ＧａｍｂｏｒＢ）　＋プラ
ント　ティノスー　カルチャー　メソッド（Ｐｌａｎｔ
　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｙｏｄｓ）、１
１（１９７５）ガーファンクル（Ｇａ１ｆ　ｊｎｋｅｌ
）等、セル（Ｃｅｌｌ）。

２７、１４３（１９８１） ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）等、モレキュラー　アンドセ
ルラー　バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　
Ｃｅ１Ｉｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　　２．１０４
４（１９８２）ヘルマー（ｔｌｅｌｍｅｒ）等、バイオ
テクノロジー（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＶ）＋　２．
５２０（１９８４）ヘンスレー（Ｉｌｅｎｓｌｅｙ）等
、ウィード　サイエ２　　ンス（Ｗｅｅｄ　５ｃｉ）、
　２９，７０．（１９８１）ヘノプハーン（Ｉｌｅｐｂ
ｕｒｎ）　＄、Ｊ、Ｍｏ１．八ｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、
　！、２１Ｈ１９８３） ヘーナルスチーン（）ｌｅｒｎａｌｓＬｅｅｎ）　＋ネ
イチャー。

２８７、６５４　（１９８０） ヘレラーエストウレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ）等。

ネイチャー」斡、　２０９　（１９８３）ヒルシュベル
ブ（Ｈ４ｒｓｃｈｂｅｒｇ）及びマツキントノシュ（Ｍ
ｃＴｎｔｏｓｃｈ）　＋サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　。

匡１３４Ｇ　（１９８３） ヒルシュベルブ（Ｉｌｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）等、ゼント
ナチュアフォーシ、：Ｌ　（Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃ
ｈ）　、３９６，４１２ヘケマ（Ｉｌｏｅｋｅｍａ）等
、ネイチャー　、　３０３．１７９ホルスタ−（ｌｌｏ
　ｌ　ｓ　ｔｅｒ）等、　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、　＋　
１６３＋　１８ホルシュ（ｌｌｏｒｓｃｈ）等、ナイエ
ンスニ、１２２９イザート（Ｉｚａｒむ）等、セル（Ｃ
ｅｌｌ）、　３６．１００７ジヨルダン（Ｊｏｒｄａｎ
）及びオグレン（Ｏｇｒｅｎ）　、ネイチャー基、５１
３（１９８１） ジョルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）等、Ｍｏｌ　Ｇ
ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１７７．６５（１９７９） クリ−（ｋｌｅｅ）等、バイオテクノロジー、！。

コブリッツ（Ｋｏｂ　１　ｉ　ｔｚ）　、クルツールプ
ランツ（Ｋｕｌｔｕｒｐｆｌａｎｚｅ）、ＸχＴＩ、９
３（１９７４）し　バロン（１Ｂ　［１ａｒｏｎ）及び
グレノセル（ＧｒｅｓｓｅｌＬバービサイド　レジスタ
ンス　イン　プラン７（ｌｌｅｒｂｉｃｉｄｅ　Ｒｅ５
ｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ）。

ジョン　ウィリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ（１９８２）マリガ　ゼット
（Ｍａ　１　ｉｇａ　＋　Ｚ）　＋　プランツエンフィ
シオール（Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ）、７８，
４５３（１９７６）。

マルキン（Ｍａｌｋｉｎ）等、プラントフィシオール。

虹、　５７０　（１９８１） マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モレキュラー　ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＬコ
ールトスプリンゲス　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃａｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇｓ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）（１９８２）マツグ（Ｍａｔｚｋｅ）及びキルト
ン（Ｃｈ　ｉ　ｌ　ｔｏｎ）　＋　Ｊ、　Ｍ。

ｌ　　Ａｐｐｌ、　　Ｇｅｎｅｔ、、　　土、３９（１
９８１）メノシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）等、ジーン、　
１９，２６９（１マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ）等、Ａ
ｎｎ　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

弗、７１Ｈ１９８３） メルトン（ＭｅｌＬｏｎ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、。

浜、　１４４　（１９８５） ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）等、フィシオール　プ
ラント長、　４７３　（１９６２） ニューマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）等、ＥＭＢＯＪ、　７．
８４１（１９８フラング−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）等、
ジーン、　２６，１０１才力（Ｏｋａ）等、ネイチ＋　
−、２７６、８４５（１９７８）才力（Ｏｋａ）等、　
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１４７．２１７　（１９８
１）パスコツスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）等、ＥＭ
ＢＯＪ、、　　３゜ペスツカ（Ｐｅｓｔｋａ）等、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋８１．７５２
５　（１９８４） レンネンベルグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）　＋　　フィ
トケミストリー（Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍ　ｉｓ　ｔｒｙ）
　、　２１　、２７７１　（１９８２）リグビー（Ｒｉ
ｇｂｙ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、ユ旦、　２３７　
（１ロハーツ（Ｉｌｏｂｅｒｔｓ）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、、　３　＋３６３シルベロールト（Ｓｃ
ｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）等、ヨーロピアン　パテント　
アプリケーション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）劃６．５３７（１９８３）シ
マブクロ（Ｓｂ　ｉｍａｂｕｋｕｒｏ）等、プラントフ
ィシオール（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏり、４７．１０
（１９７１）シモンス（Ｓｉｍｏｎｓ）等、セル、　３
４，６８３（１９８３）サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）
等、Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８，５０３ワン（Ｗ
ａｎｇ）等、セル、　、３８，４５５（１９８４）ウォ
ストマイヤ−（Ｗｏｓ　ｔｍｅｙｅｒ）等、Ｍｏ１．Ｇ
ｅｎ、。

謀り１５２０　（１９８４） ヤダフ（Ｙａｄａｖ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ。

副、　６３２２　（１９８２） ツァンブリスキー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）等、ＩＪＢＯ
Ｊ、。

２．２１４３（１９８３）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＣＡＴ　’及びｐ３２ＣＡＴ　（Ｄ製造工
程を要約するフローチャート、第２図は、ｐ［Ｉｃ１１
１の製造工程を要約するフローチャート、第３図は、ρ
ｒｌＲｃＡＴの製造工程を要約するフローチャートであ
る。 特許出願人　チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフ
ト第１図 第２図 牙３図

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロトプラストを病原体にさらすことなく、その
   中でＤＮＡがプロトプラスト及びプロトプラストのプラ
   スチドまたはミトコンドリア中に侵入するような媒体中
   で、そのような侵入が行われるのに充分な時間、ＤＮＡ
   をプロトプラストにさらすことを特徴とする、プラスチ
   ドまたはミトコンドリア中で機能性のあるプロモーター
   を有する１個またはそれ以上の遺伝子を含むＤＮＡを植
   物細胞のプロトプラストのプラスチドまたはミトコンド
   リア中に直接移入する方法。
2. （２）さらに、形質転換されたプロトプラストから植物
   細胞を再生する工程を含むことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
3. （３）さらに、植物細胞から植物を再生する工程を含む
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）ＤＮＡが線状であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
5. （５）ＤＮＡがプラスミドであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）プラスミドが１個もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ
   境界領域を含むかまたは含まないことを特徴とする特許
   請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）ＤＮＡがプラスチドまたはミトコンドリアで除草
   剤抵抗性を付与する遺伝子を含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）除草剤がアトラジンであることを特徴とする特許
   請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）ＤＮＡが除草剤抵抗性及び第２の農業的に有用な
   性質を付与することを特徴とする特許請求の範囲第７項
   記載の方法。
10. （１０）ＤＮＡが選択性のある標識遺伝子及び農業的に
    有用な性質を付与する遺伝子を含むことを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）選択性のある標識遺伝子が抗生物質抵抗性を付
    与することを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の
    方法。
12. （１２）抗生物質がクロラムフェニコールまたはカナマ
    イシンであることを特徴とする特許請求の範囲第１１項
    記載の方法。
13. （１３）農業的に有用な性質が除草剤抵抗性であること
    を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の方法。
14. （１４）除草剤がアトラジンであることを特徴とする特
    許請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）遺伝子がキメラ遺伝子であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
16. （１６）ＤＮＡが複製シグナルを含むことを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
17. （１７）ＤＮＡが挿入シグナルを含むことを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
18. （１８）植物細胞のプロトプラストが葉細胞のプロトプ
    ラストであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
19. （１９）媒体が浸透圧的に安定化されたプロトプラスト
    の培地であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
20. （２０）媒体が植物に許容性の２価の陽イオンを含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
21. （２１）２価の陽イオンがマグネシウムまたはカルシウ
    ム陽イオンであることを特徴とする特許請求の範囲第２
    ０項記載の方法。
22. （２２）媒体がプロトプラスト膜を変性し、細胞融合を
    促進することのできる多価アルコールを含むことを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
23. （２３）多価アルコールがポリエチレングリコール、ポ
    リプロピレングリコールまたはポリビニルアルコールで
    あることを特徴とする特許請求の範囲第２２項記載の方
    法。
24. （２４）多価アルコールがポリエチレングリコールであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載の方法
    。
25. （２５）ポリエチレングリコールが１０００ないし１０
    ０００の分子量を有することを特徴とする特許請求の範
    囲第２４項記載の方法。
26. （２６）ＤＮＡ及びプロトプラストが熱衝撃を受けるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
27. （２７）ＤＮＡ及びプロトプラストが電気泳動を受ける
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
28. （２８）ＤＮＡが、ポリエチレングリコールの配合物に
    よる処理、熱衝撃及び電気泳動の少なくとも２種の組み
    合わせによりプロトプラスト中に挿入されることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
29. （２９）遺伝子の移入が、外来遺伝子及びプロトプラス
    トを溶液に導入し、続いて得られた懸濁液をまず熱衝撃
    処理し、次にポリエチレングリコールで処理することに
    より行われることを特徴とする特許請求の範囲第２８項
    記載の方法。
30. （３０）遺伝子の移入が、外来遺伝子及びプロトプラス
    トを溶液に導入し、続いて得られた懸濁液をまず熱衝撃
    処理し、次にポリエチレングリコールで処理し、そして
    最後に電気泳動にかけることにより行なわれることを特
    徴とする特許請求の範囲第２８項記載の方法。
31. （３１）媒体が、プロトプラスト膜を変性し、細胞融合
    を促進することのできる多価アルコールを含み、ＤＮＡ
    及びプロトプラストが電気泳動または熱衝撃の少なくと
    も一方を受けることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
32. （３２）さらに細胞外ヌクレアーゼの不活性化工程を含
    むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
33. （３３）プロトプラストがホモノ科、ナス科、またはジ
    ュウジバナ科の植物の細胞から得られるものであること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
34. （３４）プロトプラストがホモノ科の植物の細胞から得
    られるものであることを特徴とする特許請求の範囲第３
    ３項記載の方法。
35. （３５）ホモノ科の植物の細胞が穀物を生産する細胞で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載の方
    法。
36. （３６）穀物がトウモロコシ、小麦、稲、大麦、オート
    麦、キビ、ライ麦またはモロコシであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第３５項記載の方法。
37. （３７）プロトプラストを病原体にさらすことなく、そ
    の中でＤＮＡがプロトプラスト及びプロトプラストのプ
    ラスチドまたはミトコンドリア中に侵入するような媒体
    中で、そのような侵入が行われるのに充分な時間、ＤＮ
    Ａをプロトプラストにさらすことを特徴とする、プラス
    チドまたはミトコンドリア中で機能性のあるプロモータ
    ーを有する１個またはそれ以上の遺伝子を含むＤＮＡを
    植物細胞のプロトプラストのプラスチドまたはミトコン
    ドリア中に直接移入する方法により形質転換された植物
    のプロトプラスト、植物細胞、植物組織の培養物、増殖
    性の植物物質または植物。
38. （３８）上記の形質転換により得られた一つもしくはそ
    れ以上の性質を示す特許請求の範囲第３７項記載の形質
    転換された植物。