NO864681L - Fremgangsmaate ved direkte genoverfoering i plastider og mitokondrier. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte ved direkte innesluttelse av DNA i plastider og mitokondrier av planteprotoplaster som i det vesentlige er kjennetegnet ved at man ved fravær av et patogen av dette nevnte DNA i et medium forårsaker inntrengelse av DNA i protoplastene i de deri værende plastider og mitokondrier hvor man bringer protoplastene så lenge i kontakt at denne penetrasjon er sikret slik at det til slutt resulterer i planter med forbedrede egenskaper.

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for direkte genoverføring i plastider og mitokondrier, fortrinnsvis i klorplastene av planteprotoplåster.

Innenfor foreliggende oppfinnelse omfatter i begrepet planter alle i en eller flercellede organismer som kan utføre fotosyntese.

Som planteprotoplaster omfattes planteceller hvis cellevegger er fjernet helt eller delvis ved behandling ved celle-lytiske enzymer.

Kloroplåstene danner et angrepspunkt for erstatningsmidler av forskjellige herbisidklasser, så som for eksempel triazin herbisidene. Først for kort tid siden ble det funnet at atrazin et erstatningsmiddel for triasin-herbisid inngikk vekselvirkning med et 32 kd polypeptid som ble kodet av et kloroplastgen, det såkalte psbA-gen (Hirschberg et al., 1984 ) .

Substitusjonen av enkelte nukleotider inne i den kodende del av psbA-genene som har som følge en utskiftning av en enkelt aminosyre i 32 kd polypeptidet fører til en resistens overfør atrazin. Slike mutasjoner finner man hos ugress, så som for eksempel hos Amaranthus hybridus og Solanum nigrum.

Det ville nå væreønskelig i forbindelse med gener å bygge inn direkte i plastid og mitokondriegenomene hos planter, spesielt hos kulturplanter. Dette vil gjøre det mulig å tilføre slike planter nye ogønskelige egenskaper. For å oppnå herbisid-resistente planter er det eksempelvis nød-vendig med gener som gir herbisid resistens i herbisid-sensitive klorplaster.

Tidligere anstrengelser gjaldt i hovedsak en genetisk mani-pulasjon av det nukleære genom i planteceller for å oppnå en resistens eller en toloranse overfor herbisider som var

aktiv i kloroplaster.

Disse fremgangsmåter førte imidlertid lett til marginale toleranseforskjeller i forhold til disse herbisider og ikke til virkelig resistens.

Tidligere ble det holdt for umulig å overføre ekte resistens overfor herbisider som var virksom i kloroplaster med hjelp av direkte genoverføring til kulturplanter idet man tidligere gikk ut fra at en transformasjon av plastider, så som f.eks. kloroplaster ikke var mulig med denne metode.

En ytterligere ulempe ved inneslutning av gener som ga en ønsket egenskap som for eksempel herbisidresistens i det nukleære genom hos en plante lå i muligheten hos enkelte planter til fremmedbestøvning av ugress. Slike krysninger åpnet en mulighet å overføre disse hos kulturplanter ønskede egenskaper fra ugress.

En av de hyppigste anvendte metoder for inneslutning av gener i nukleære genom hos planter består i infeksjon av cellene med patogener, som f.eks. et agrobakterium, som inneholder Ti-plasmid vektor-system. (Barton et al., 1983; Chilton et al., 1985). Disse fremgangsmåter har imidlertid tydelige ulemper som står i forbindelse med infeksjonsfor-løpet. Disse ulemper omfatter for det første en begrenset vertsspesifisitet, og for det andre i nødvendigheten av å befri de transformerte planteceller for de for transformasjonen anvendte patogener.

Det er dessuten betenkninger mot frigjøring av slike patogener i miljøet. (Roberts, 1985).

De Block et al. (1985) omtaler anvendelse av agrobakterium Ti-plasmid Vektor-systemer for innesluttelse av et for antibiotika-resistens kodende gen i kloroplast genomer hos tobakksprotoplaster hvorfra komplette celler og endelig komplette fertile planter kunne bli regenerert. Forfatter- ene fant imidlertid at genet ved fravær av det gjeldene antibiotika var utstabilt og at det etter kort tid gikk tapt. Erholdelsen av planter under antibiotika-seleksjons-press fremskaffet imidlertid ingen praktisk anvendelse.

Fremgangsmåte for den direkte transformasjon av planteprotoplaster med frilagt linjært DNA eller sirkulært plasmid-DNA er i alle tilfelle kjent (Paszkowski et al., 1984, samt Schilperoort et al., 1983). Ved disse fremgangsmåter er ingen patogene for infeksjonsforløpet nødvendig. Opptil idag er imidlertid disse metoder innskrenket til nukleær transformasjon.

Det er således behov for en fremgangsmåte som tillater direkte overføring av nyttige gener i plante og mitokondrie genomer slik at fordelaktige nye egenskaper hos planteceller kan overføres uten at en tidligere infeksjon av cellene med et patogen er nødvendig, og hvor det samtidig ble for-hindret at disse egenskaper blir overført til ugress. Videre finnes et behov for en fremgangsmåte som sikrer stabil genoverføring i plastider og mitrokondrier fra planteceller og hele planter slik at ekspresjonen av nevnte gen ikke blir tapt under utvikling av kulturplantene i margen.

En vesentlig bestanddel av foreliggende oppfinnelse omhand-ler således omtalen av en fremgangsmåte for direkte geninn-føring i genomet hos plastider og mitokondrier, fortrinnsvis kloroplaster uten infeksjon av cellene med et patogen og opprettholdelse av genet i nevnte genom. En videre gjen-stand for foreliggende oppfinnelse omfatter fremstilling av hele planter som inneholder genetisk manipulerte plastider og mitokondrier og også under betingelser under hvilken de i følge rekombinant genteknologi skreddersydde egenskap(er) forblir stabile og gir ekspresjon.

Som det går frem av etterfølgende beskrivelse blir disse og ytterligere mål oppnådd ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for direkte inneslutning av DNA i plastider og mitokondrier hos planteprotoplaster hvorved nevnte DNA omfatter en eller flere gener og aktive promotorer i plastider og mitokondrier og hvor fremgangsmåten er særpreget ved at et patogen for dette DNA bringes i kontakt med protoplastene i et medium så lenge at inntrengningen av genet i protoplastene og de deri værende plastider og mitokondrier blir sikret.

Figurer

Fig. 1 viser et strømningsdiagram av enkelttrinnene for konstruksjonen av plasmid pCAT^ og p32CAT. Fig. 2 viser et strømningsdiagram av enkelttrinnene for konstruksjonen av plasmidene pUCHl. Fig. 3 viser et strømningsdiagram av enkelttrinnene for konstruksjonen av plasmidene pBRCAT.

I de vedlagte figurer blir følgende forkortelser anvendt:

X = Xhol

S = Smal

H = Hindlll

B = BamHI

RI = EcoRi

SI = Sali

LIG. = Ligering med en T4 DNA Ligase

X/Sl betegner et sted hvor det fremskaffes ved sammenbind-ing av en Xhol-sekvens med en Sall-sekvens et hybrid restriksjonskløvningspunkt som ikke kan bli spaltet av noen av enzymene.

CAT betegner den kodende region for kloramfenikol-acetyltransferase. CAT^ betegner den promotofrie form av CAT-genet.

I figurene 1 til 3 blir psbA-genet fremstilt ved en svart bjelke og den tilhørende promotor ved en svart kiste.

I figurene 1 til 3 er den CAT kodende region tegnet med punkter.

I foreliggende beskrivelse av oppfinnelsen og i patentkrav-ene gjelder følgende definisjoner: Et "gen" er en DNA-sekvens som er særpreget ved en promotor og en transkriberende DNA-sekvens.

Promotoren, som i de fleste tilfeller ikke blir transkri-bert, forårsaker transkripsjon av den etterfølgende og i enkelte tilfeller også i de omkringliggende gensekvenser til det tilsvarende RNA. RNA kan imidlertid heller ikke bli translatert til et polypeptid. Dersom RNA blir translatert blir den betegnet som mRNA. DNA-sekvensen som gir mRNA såvel som mRNA i seg selv er satt sammen av en 5' region som ikke blir translatert av en kodende region såvel som en 3' region som heller ikke blir translatert. Kun den kodende region blir translatert til det tilsvarende polypeptid.

De "aktive" deler av en DNA-sekvens danner tilsvarende områder som er nødvendige for funksjonen av DNA-sekvensen. Enkelte eksempler av aktive områder av DNA-sekvenser omfatter RNA-polymerase-bindingsområde, initiatorsignalet (TATA-boksen) til promotoren, ribosombindingsområdet såvel som translasjons initiatorsignalet til den ikke-transl ater-te 5'-regionen, den kodende sekvens, transkripsjons-stopps-signalet såvel som polyadenyleringssignalet til den ikke-translaterte 3'-regionen. De forskjellige spacerdeler hvori DNA-sekvensen ikke har betydning blir ikke ansett som aktive DNA-sekvenser.

En "variant" av en naturlig DNA-sekvens danner en modifisert form av den naturlige sekvens som fyller en tilsvarende funksjon. Derved kan det dreie seg om en mutant eller en syntetisk DNA-sekvens som i det vesentlige er homolog med den tilsvarende naturlige sekvens.

Som i det vesentlige homolog til en annen DNA-sekvens anser man således en DNA-sekvens som er minst 70%, fortrinnsvis minst 80% og spesielt minst 90% homolog med den aktive del av DNA-sekvensen. For å fastslå den vesentlige homologi blir to forskjellige nukleotider innenfor en DNA-sekvens av en kodende region også ansett som homolog når den motstå-ende erstatning av denne nukleotid fører til en stum muta-sjon.

En DNA-sekvens "nedstammer fra" en kilde, som f.eks. plastider eller mitokondrier når denne DNA-sekvens forekommer i denne kilde. Foreliggende oppfinnelse omfatter også varianter av en slik DNA-sekvens.

En DNA-sekvens er "funksjonell" i plastider eller mitokondrier når den oppfyller sin ventede funksjon og forblir i de etterfølgende plastider og mitokondrier.

Med "transformerbare plante protoplåster" forstår man protoplaster som etter en direkte genoverføring inneholder et plastid eller et mitokondrie genom som har det kovalent-bundede DNA som vanligvis ikke forekommer i disse plastide eller mitokondrier.

Plante protoplaster, som ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er transformerbare, kan stamme fra dyrkede celler såvel som fra celler som foreligger innebygget i plantedelene eller flercellige planter. De transformerbare planteprotoplaster kan imidlertid også stamme fra encellede planter som for eksempel alger. Enkelte eksempler på encellede planter omfatter cyanobakterier (f.eks. Synechococcus spp.) såvel som Chlamydomonas og Euglena. Spesielt foretrukket innenfor foreliggende oppfinnelse er imidlertid planteprotoplaster som stammer fra flercellede planter. Ifølge følgende transformasjon kan protoplastene

eventuelt være regenerert fra hele planter.

Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det således mulig å modifisere plastidene og mitokondriene genetisk fra enhver planteprotoplast.

Enkelte eksempler for slike planteprotoplaster er:

Solanum spp. (potet), Gossypium spp. (bomull), Glycine spp.

(soyabønner), Petunia spp. (petunia), Daucus spp. (gulrot), Citrus spp. (appelsin, sitrun), Lycopersicon spp. (tomat), Brassica spp. (nepe, kål, blomkål osv.), Beta spp. (nepe), Phaseolus spp. (bønne), Helianthus spp. (solsikke), Arachis spp. (jordnøtt), Amaranthus spp. (revehale), Medicago spp.

(alfalfa), Trifolium spp. (kløver), Atropy spp. (søtvie), Hyoscyamus spp, (bulmeert), Digitalis spp. (fingerbøl), Catharanthus spp. (eviggrønn), Pisum spp. (ert) og Pinus spp. (furu).

Transformerbare plastider er f.eks. kromoplaster, amylo-plaster, 1eukoplåster, etioplaster, proplastider og kloroplaster. Spesielt foretrukket for transformasjonen er kloroplåster.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre gener som er funksjonsdyktige i plastidene og mitokondriene. Genene ifølge foreliggende oppfinnelse overfører ved sin innesluttelse til plastidene og mitokondriene en ønsket nyttig egenskap. Enkelte eksempler på slike nyttige egenskaper er: fytotoks-inresistens, som f.eks. herbisid eller antibiotika-resistens, forbedret fotosyntetisk effekt såvel som enzymaktiv-itet i tilfeller hvor et kromogent substrat er kjent for enzymet.

Ved herbisid-resistens forstår man i foreliggende tilfelle en resistens i forhold til alle herbisider som er aktive i plastidene eller mitokondriene. Slik er eksempelvis tallrike herbisider aktive i kloroplaster. Til denne herbisid- klasse hører f.eks. triazin-, urea-, sulfonylurea- såvel som uracilderivater såvel som glyfosat (N-fosformetylgly-cin) .

Enkelte eksempler for triazin-herbisider omfatter atrazin, ametryn, metribuzin såvel som simazin. Enkelte eksempler for urea-herbisider omfatter fenylurea, som f.eks. diuron, kloroksuorn og fluormeturon såvel som DCMU (diklormetyl-urea). Eksempler for sulfonylurea er Oust og Glean, og for uracin-herbisider bromasil og terbasil. Disse og andre herbisider er beskrevet av LeBaron og Gressel (1982).

For å gjøre en celle resistens ovenfor herbisider er det ikke nødvendig at man ved direkte genoverføring i hver av de 50 til 100 kloroplaster i hver celle innebefatter et for herbisid-resistensen kodende gen. En direkte genoverføring i en liten del av de eksisterende kloroplaster er fullstendig tilstrekkelig for å beskytte cellene mot herbisider.

Muligheten for å overføre en herbisid-resistens f. eks. mot atrazin til planter er av forskjellige grunnerønskelig. Dette tillater eksempelvis anvendelse av slike herbisider i større doser til planter som således er tolerante overfor dette herbisid. Med høyere herbisiddoser oppnår man således samtidig en bedre effekt ved ugressbekjempelsen.

I tillegg kan imidlertid herbisid-resistensen også bli anvendt som selektiv markør som blir genetisk koblet med en fysiologisk egenskap som i seg selv er vanskelig å velge ut. For å kunne utnytte denne mulighet blir et donor-plasmid konstruert som inneholder et gen som fremskaffer en herbisid-resitens såvel som et andre gen som tilfører den andreønskede egenskap. Derved kan det dreie eksempelvis om en forhøyet fotosyntetisk effekt. Disse donor-DNA blir innesluttet i plante-proteplåster som kan blir regenerert til en plantecelle kultur eller til hele planter. De resulterende planter besitter således såvel egenskapene for herbisid-resistens og også nevnte andre egenskaper. Lar man disse planter vokse ved nærvær av det aktuelle herbisid er det således mulig å velge ut planter som har denne nevnte andre egenskap.

I tillegg gir innføringen av et donor-DNA som overfører såvel en herbisid-resitens som en andre fra agronomisk syns-punkt nyttig egenskap til plante-protoplaster denne andre egenskap stabilt i kloroplåstene når man dyrker plantene i nærvær av herbisidet.

Angående instabilitet av fremmede gen i kloroplaster har det tidligere blitt vist til De Block et al. (1985) se ovenfor.

Spesielt foretrukket er en herbisid-resistens i forhold til atrazin (2-klor-4-etylamino-6-isopropylamino-l,3,5-triazin).

For in vitro-identifiseringen av celler med transformerte plastider eller mitokondrier kan en antibiotika-resistens anvendes.

En antibiotika-resistens er en egenskap som kan anvendes for in vitro-identifisering av celler som inneholder transformerte plaster eller mitokondrier. Gener som innehar slike utvalgte markører er meget nyttige når de på genetisk måte har blitt koblet til agronomisk nyttige egenskaper. For dette egner seg eksempelvis resistens mot klormafenikol, kanamycin eller også prinsipielt også resistens overfor andre eksisterende antibiotika.

En nyttig egenskap som i første linje er egnet som markør for en utvelgelse (Screening) for identifisering av plante-celler av vev-kulturer som inneholder genetisk manipulerte plastider eller mitokondrier oppnår man for eksempel ved inneslutning av et gen som koder for et enzym som har et fargegivende substrat. Dreier det seg for nevnte enzym eksempelvis om beta-galatosidasae, så blir plantecellene ut- plantet på et vevskultur-medium som inneholder det fargegivende substrat Xgal (5-klor-4-brom-3-indolyl-jSD-galaktosidase). Planteceller som inneholder genetisk manipulerte plastider eller mitokondrier blir derved farget gjennom fargestoffet indigoblått på grunn av spaltningen av Xgal ved fjgalaktosidase blir frigitt.

Genene, som er egnet for foreliggende oppfinnelse, kan bli utvunnet ved i og for seg kjente metoder. Ved disse metoder dreier det seg f.eks. om naturlig isolering vanligvis bare utenfor plastidene eller mitokondriene forekommende gener eller deres varianter som skal innebefattes.

Nevnte gen kan være ethver naturlig forekommende gen eller en av dettes i plastider eller mitokondrier funksjonsdyktige varianter. Foretrukket er naturligvis eksisterende plastid, mitokondrie eller bakterie-genet. Spesielt foretrukket er kloroplast-gen.

For å være sikker på at nevnte gen faktisk befinner seg i plastidene eller mitokondriene og ikke for eksempel i celle kjernen kan man fortrinnsvis men ikke nødvendigvis sette inn et i cellkjernen et ikke eller minst tydelig mindre funksjonsdyktig gen enn i plastidene eller mitokondriene.

Enkelte eksempler på naturlig forekommende bakterie-gen er f.eks. slike som koder for antibiotika-resistens eller for enzymer med et fargegivende substrat. Et bakterielt gen som i posisjon overfører en antibiotika-resistens til plastider eller mitokondrier er f.eks. kloramfenikol-acetyl-transfer-ase-genet. Et bakterielt gen som koder for et enzym med kromogen substrat er f.eks. lacZ, som koder for £galaktosidase. Enkelte eksempler på plastid eller mitokondriegen er gen som koder for herbisid-resistens eller for en forbedret fotosyntetisk effekt. En kloroplastgen som er i posisjon til å overføre herbisid-resistens er f.eks. det muterte psbA-gen, hvilket er beskrevet av Hirschberg et al. (1983) eller en mutant av dsbD-genene (Rochaix et al., 1984). Et kloroplast-gen som er i posisjon til å overføre en forbedret fotosyntetisk effekt er f.eks. representert ved en modifisert form av rbcL koder for en modifisert stor subenhet av Ribulose-1,5-bifosfat-karboksylase/oksygenase (Rubisco). Et gen som gir den store subenhet av Rubisco blir lett innesluttet i kloroplåstene og aktivert ved fotosyntesen. Det er imidlertid også mulig å inneslutte en modifisert (mutert, manipulert eller heterolog) form av dette gen med forbedret fotosyntetisk effekt [Jordan et al.,

(1981)] En videre mulighet for å erholde et gen som er funksjonsdyktig i plastider eller mitokondrier består i å konstruere et kimaert gen. En kimært gen er et gen eller minst en del av et gen, fortrinnsvis en aktiv del av et gen som naturlig ikke er kovalent bundet til de øvrige deler. Det kimære gen kan enten kode for en spesifik RNA-transkripsjon eller for et polypeptid.

Som promotorer for kimære gen kommer innenfor foreliggende oppfinnelse alle promotorer i betraktning som er funksjonsdyktige i plastider eller mitokondrier. Promotorer for kimære gen kan stamme fra et naturlig forekommende plastid eller mitokondrie gen eller fra et gen som ikke forekommer i plastidene eller mitokondriene. Under de naturlige forekommende promotorer fra plastid eller mitokondrie-gen er spesielt slike foretrukket som stammer fra psbA, psbD eller rbcL-gen. Ved nevnte promotorer kan det også dreie seg om varianter av naturlige promotorer. Ved en heterolog promotor til de kimære gen kan det dreie seg ifølge oppfinnelsen om en naturlig promotor som vanligvis ikke forekommer i plastider eller mitokondrier.

Da funksjonene av plastid- eller mitokondriegen ofte er lik eller identisk med funksjonen av bakterielle gen kan også bakterielle promotorer være funksjonsdyktige i plastider eller mitokondrier. Hver bakteriell promotor som er funksjonsdyktig i plastidene eller mitokondriene kan således også ifølge oppfinnelsen bli satt inn som promotor for de kimære gen. Enkelte brukbare bakterielle promotorer er f.eks. slike som neomycin-fosfortransferase-II-gen og T-DNA-genene som f.eks. nopalin-syntase-genet til Ti-plasmidet.

Som heterolog promotor kommer også hver delvis eller fullstendig syntetisk fremstilt promotor i betraktning som er funksjonsdyktig i plastider eller mitokondrier.

Delvis eller fullstendig syntetisk fremstilte promotorer som ligner sine naturlige modeller ved at de inneholder 10 nucleotider under transkripsjons-forsterkningen en TATAAT-lignende sekvens er også en bestanddel av foreliggende oppfinnelse .

Ved den ikke-translaterte 5'-region til det kimære gen av foreliggende oppfinnelse kan det dreie seg om enhver passende ikke-translatert 5'-regionen som er funksjonsdyktig i plastidene eller mitokondriene. Den ikke-translaterte 5'-regionen kan eksempelvis stamme fra plastid eller mitokondrie gen eller fra gen av annen opprinnelse. En foretrukket homolog ikke-translatert 5'-region stammer fra psbA, psbD eller rbcL-gen. En foretrukket heterolog ikke-translatert 5'-region stammer fra bakterielle gen. Syntetiske ikke-translaterte 5'-regioner som på grunn av et effektivt ribo-sonbindende sete som ligner sine naturlige modeller er i alle tilfelle en bestanddel av foreliggende oppfinnelse.

I prinsipp egner enhver passende kodende region seg som er i posisjon til å overføre en ønsket egenskap til en plantecelle for anvendelse ifølge oppfinnelsen som kodende region. Såvel de kodende regioner av ovennevnte naturlig forekommende gen såvel som kodende regioner fra andre kild-er kan innenfor foreliggende oppfinnelse for fremstilling av kimært gen bli anvendt.

Følgelig kan de kodende regioner innenfor foreliggende oppfinnelsen stamme fra naturlig forekommende plastid- eller mitokondriegen eller fra en annen kilde og de kan også være fullstendig eller delvis syntetisk fremstilt eller ved fusjon av to eller fler slike kodende regioner under opprettholdelse av leserrammen.

Enhver av disse kodende sekvenser koder for et polypeptid som overfører en eller fler nye egenskaper til cellene og plantene.

Et eksempel på et polypeptid som blir kodet via et i kloro-plastene av bestemte planter naturlig forekommende gen er den muterte form av 32 kd polypeptidet, som er beskrevet av Hirschberg et al. (1983). Det kunne blitt vist at dette polypeptid overfører en atrazin-resistens til bestemte ugress. psbA-genene, hvilket koder for nevnte polypeptid kan imidlertid også overførers til nytteplanter som f.eks. kulturplanter under anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Et eksempel på en kodende region som ikke stammer fra plastider eller mitokondrier er den kodende region for plante, dyre eller bakterielle gshA og gshB-gen eller de fra glutation-reduktase-genet (gor) hvorved alle dettes nyttige egenskaper kan overføres når de blir innesluttet i plante-plastider eller mitokondrier. gshA og gshB koder for enzym-re som kan katalyserer syntesen av tripeptide glutation hvilket i sin tur sørger for den konjugative detoksifiser-ing av tallrike herbisider (Meister et al., 1983, samt Rennenberg 1982).

Et ytterligere eksempel på en kodende region som ikke stammer fra plastider eller mitokondrier er den kodende sekvens for et glutation-S-tranferase-gen fra planter, dyr, insekter eller bakterier. I mange planter [Shimabukuroy et al.

(1971)], som er kjent for å være tolerante overfor herbiside atrazin danner tilstedeværelsen av glutation-S-trans-ferase grunnlaget for denne tolerans. Glutation-S-transfer-ase detoksifiserer fytotoksinet ved at det katalyserer dan-nelsen av et atrazin-glutation-konjugat. En annen kodende region som er anvendbar for det kimære gen ifølge foreliggende oppfinnelse koder for -en effektiv form av Rubisco. Slike kodende sekvenser kan eventuelt stamme fra naturlig forekommende gen.

Den kodende region ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt omfatte også to eller fler forskjellig kodende regioner. Polypeptider, som via slike kodende regioner blir spesifisert, betegner man som fusjons-polypeptider.

Et eksempel på et fusjons-polypeptid fremstiller en effektiv form av Rubisco. Rubisco har to funksjoner for det første som karboksylase og for det andre som oksygenase. Karboksylase-funksjonen er virksom under fotosyntesen, oksygenase-funksjonen er derimot uønsket. Et brukbart fusjonspolypeptid har derimot en del hvor karboksylasefunk-sjonen er maksimal og en annen del hvor oksygenasefunksjon-en er minimal.

Den ikke-translaterte 3'-regionen av det kimære gen kan enten foreligge naturlig i et plastid- eller mitokondriegen eller den kan være av heterolog opprinnelse. Foretrukket er en ikke translatert 3'-region som stammer fra et plastid eller mitokondriegen. Den foretrukkede ikke-translaterte 3'-sekvens er tilsvarende psbA, psbD eller rbcL-genet.

De transkriberte regioner av genet ifølge foreliggende oppfinnelse kan spesifisere RNA-transkripter og er i enkelte tilfeller også anvendelige som sådann.

Ved disse transkripter kan det dreie seg om tRNA eller rRNA. Transkriptet kan også være et RNA som har en sekvens som minst er komplementær til en del av en sekvens av et annet RNA-transkript. Slike komplementære transkripter er kjent under betegnelsen anti-sens sekvenser, og kan dersom de er lange nok forstyrre funksjonen til RNA-sekvensene til hvilke de er komplementære eller de kan blokkere transkrip-sjonen av disse RNA av det tilsvarende gen, [Gjevnfør Pestka et al., (1984), Melton (1985), Izant et al., (1984), Simons et al. (1984) og Coleman (1984)].

Transkriberte regioner, som innenfor foreliggende oppfinnelse er anvendbare, kan eventuelt stamme fra naturlig transkriberte sekvenser eller de kan være fullstendige eller delvis fremstilt syntetisk. Antisens sekvenser kan likevel stamme fra minst en del av et naturlig forekommende gen idet man vender orienteringen til nevnte del av det naturlig forekommende gen i forhold til sin promotor.

Genene, som er regnet for anvendelse innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, er innført eller innebygget i en plastidkloningsvektor på i og for seg kjent måte [Maniatis et al. , (1982) ].

For integrasjonen av fremmedgener i det genomet DNA fra plante-celler er det fordelaktig om genet er plakert av nøytrale DNA-sekvenser, såkalte Carrier-DNA. Carrier-DNA kan bestå av to linjære DNA-kjeder slik at den fullstendige konstruksjon som skal innesluttes i plantecellene fremstiller et linjært DNA-molekyl. Nevnte konstruksjon kan imidlertid for gentransformasjonen også oppvise en sirkulær struktur - plasmidstruktur. Carrier-DNA kan være såvel av syntetisk opprinnelse som å stamme fra naturlig forekommende DNA-sekvenser som kan behandles med egnede restrik-sjons endonukleaser. For dette er eksempelvis også naturlig forekommende plasmider som kan åpnes med en eller fler res-triksjons-endonukleaser egnet for anvendelse som Carrier-DNA. Som eksempel på et slikt plasmid er det lett tilgjeng-elige plasmid pUC8 [beskrevet av Messing et al., (1982)]. Fragmenter av naturlig forekommende plasmider kan også ifølge oppfinnelsen bli anvendt som Carrier-DNA. Den for transformasjonen egnede konstruksjon kan eventuelt inne-holde et Ti-plasmid eller et fra modifisert Ti-plasmid stammende DNA. Et plasmid blir bestraktet som modifisert Ti-plasmid når det minst har en T-DNA grenseregion. En T-DNA grenseregion er en DNA-sekevens innefor agrobakteri um genomet hvilket forårsaker kontakt mellom innføringen av en annen sekvens innenfor genomet (T-DNA) i plantecellene med det til agrobakteriumet. Ved DNA-grenseregionen kan det eksempelvis dreie seg om en sekvens av en vektor som for eksempel et Ti- eller Ri-plasmid eller et modifisert Ti-eller Ri-plasmid. Ved T-DNA kan det også dreie seg om en sekvens som ligger på samme vektor på grenseregionen eller også på en annen vektor.

Sannsynligheten for den genetiske transformasjon (transfor-mas jonsgraden ) av en plantecelle kanøkes ved forskjellige faktorer. Som er kjent fra eksperimenter med gjær øker således antallet lykkede stabile gen-transformasjoner:

1) medøkningen av antall kopier av nye gener pr. celle,

2) når replikasjonssignalet er kombinert med et nytt gen, og 3) når et integrasjonssignal er kombinert med et nytt gen hvorved det under integrasjonssignalet forstås et signal som krever integrasjonen av en DNA-kjede i en annen DNA-kjede.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen finner således en spesielt fordelaktig anvendelse når det overførte gen er koblet med et replikasjonssignal som er virksomt i planteceller eller med et integrasjonssignal som er virksomt i plante-celler eller med en kombinasjon av begge signaler.

Protoplaster, cellekultur-celler, celler i plantevev, pollen, pollenblærer, eggceller, embryonalsekker eller zygoter såvel som enbrymer i forskjellige utviklingsstadier er representative eksempler på planteceller som er egnet som utgangsmateriale for en transformasjon. Foretrukket er protoplaster i det disse direkte og uten videre forbehand-ling kan bli anvendt. Isolerte planteprotoplaster, celler eller vev kan ved hjelp av i og for seg kjente metoder eller ved hjelp av metoder, som er analoge til kjente metoder bli fremstilt.

Isolerte plante protoplaster, som egner som utgangsmateriale for fremstilling av isolerte celler og vev, lar seg også isolere fra alle deler av planten, f.eks. fra bladene, embryerne, stilkene, blomstene, røtter eller pollen. Foretrukket er protoplaster fra blader. Isolerte protoplaster kan imidlertid også erholdes fra cellekultur. Metoder for isolering av protoplaster er eksempelvis beskrevet i Gamberg et al. (1975).

Overføringen av de nye gen i plantecellene er direkte, dvs. uten tidligere infeksjon av cellene med et patogen som eksempelvis et plantepatogen bakterium, virus eller sopp og uten overføring av DNA via insekter eller sopp som er i posisjon til å infesere planter med DNA-overførende patogener. Denne direkte genoverføring oppnås ved at det geninneholdene DNA bringes i kontakt med planteprotoplastene og de deri inneholdte plastider og mitokondrier i et medium i et slikt tidsrom at innføringen av genet i protoplastene og i de deri værende plastider og mitokondrier oppnås.

Transformasjonsfrekvensen kan derved økes ved at man kombi-nerer dette trinn med forskjellige gen-overførings teknikker. Eksempler på slike teknikker omfatter behandlingen med poly-L-ornitin eller poly-L-lysin, Liposomenfusjonen, DNA-protein-kompleksdannelse, endring av 1adningsforhold i protoplast membranen, fusjon med mikrobielle protoplaster eller kalsiumfosfat-utfellelse såvel som spesielt ved behandling med bestemte polyhydriske alkoholer, f.eks. polyetylenglykol, videre ved varmesjokkbehandling og elektroporasjon såvel som ved en kombinasjon av de tre sistnevnte teknikker.

Som anvendbare medier ifølge oppfinnelsen kommer alle medier i betraktning som tillater penetrasjonen av det DNA som bærer genet i protoplaster såvel som i plastider eller

mitokondrier innenfor disse protoplaster.

Egnede medier for felles inkubasjon av fremmedgenet med reseptor-protoplastene er fortrinnsvis osmotisk stabiliser-te kulturmedier som er utviklet for protoplast-kulturer.

Mange, senere erholdte kulurmedier er forskjellige ved enkelte komponenter eller grupper av komponenter. Sammen-setningen av alle disse medier er imidlertid i samsvar med prinsippet at de alle har en gruppe av organiske ioner en konsentrasjon på ca. 10 mg/liter til ca. 100 mg/liter (såkalte makroelementer så som nitrat, fosfat, sulfat, kalsium, magnesium, jern osv.), og en ytterligere gruppe organiske ioner med en maksimal konsentrasjon på noen mg/liter (såkalte sporelementer som kobolt, sink, kobber, mangan, osv.) et antall vitaminer (f.eks. inositol, folsyre, tiamin), en energi og karbonkilde, eksempelvis sucrose eller glucose og vekstregulatorer i form av naturlig eller syntetiske fytohormoner av auxin- og cytokinin-klassen i en konsentrasjon på 0,01 til 10 mg/liter.

Disse kulturmedier er dessuten også osmotisk stabilisert ved tilsetning av sukkeralkholer (f.eks. mannitol), sukker (f.eks. glucose) eller salt-ioner (f.eks. CaCl^) såvel som at de er innstilt på en pH-verdi i området fra 5,6 til 6,5.

En mer utførlig beskrivelse av konvensjonelle kulturmedier finner man f.eks. hos Kobliz et al., (1974).

Et spesielt egnet medium for direkte transformasjon av protoplaster inneholder en flerverdig alkohol som er i posisjon til å forandre protoplastmembranen og som viser seg nyttig ved fremstilling av cellefusjonen. Den foretrukkede flerverdige alkohol er polyetylenglycol. Flerverdige alkoholer med lengre kjeder, eksempelvis polypropylenglycol (425 til 4000 g/mol), polyvinylalkohol eller flerverdige alkoholer hvis hydroksylgrupper er delvis eller fullstendig alkylert kan også anvendes. Polyhydroksylerte detergenter, som er vanlige ved landbruksanvendelse og som tolereres av planter fremstilles i alle tilfeller av egnede flerverdige alkoholer: slike detergenter er f.eks. beskrevet i følgende publikasjon: "Mc Cutcheons's Detergents and Emulsifisers Annual"

MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, (1981);

Stache, H., "Tensid-Taschenbuch",

Carl Hanser Verlag, Munchen/Wien, (1981).

De til dette foretrukkede flerverdige alkoholer er poly-etylenglykoler med en molekylvekt mellom 1000 og 10000 g/mol, fortrinnsvis mellom 3000 og 8000 g/mol.

Transformasjonsfrekvensen for den direkte genoverføring kan økes ved følgende i detalj beskrevende fremgangsmåte.

Ved polyetylenglykol behandlingen blir deretter en proto-plastsuspensjon av kulturmediet tilsatt. DNA, som inneholder genet og som kan foreligge som linjært DNA eller i form av et sirkulært plasmid, blir til slutt tilsatt foreliggende blanding av polyetylenglykol og kul turmedium. Alterna-tivt til denne fremgangsmåte kan også først protoplastene såvel som det geninneholdene DNA foreligge i kulturmediet og så først kan polyetylenglykol blir tilført.

Innenfor foreliggende oppfinnelse viser elektroporasjon såvel som varmesjokkbehandling seg som spesielt fordelaktige fremgangsmåter.

Neumann et al. (1982) omtaler at det elektorporasjon blir protoplastene etterfølgende overført i et osmotikum, f.eks. i en mannitol/magnesium-suspensjon og denne protoplastsus-pensjon blir til slutt brakt inn i et elektroporator-kammer mellom to elektroder. Ved utladning av en kondensator over suspensjonen blir protoplastene i et kort øyeblikk tilført en kort elektrisk impuls av høy spenning hvilket fører til en polarisasjon av protoplastmembranen og en åpning av por-ene i membranen.

Ved varmebehandlingen blir protoplastene suspendert i et osmotikum, f.eks. en løsning av mannitol/kalsiumklorid. Til slutt blir suspensjonen varmet opp i små beholdere, f.eks. i sentrifugerør fortrinnsvis på vannbad. Varigheten av opp-varmingen avhenger av tidligere valg temperatur. Vanligvis dreier det seg om temperaturer i området fra 40°C til 80°C og blir opprettholdt i en varighet på 1 sekund til en time. De beste'resultater oppnår man ved en temperatur i området fra 40°C til 50°C i 4 til 6 minutter, spesielt ved 45°C og 5 minutter. Suspensjonen blir til slutt av-kjølt til romtemperatur eller under. Det kan også bli vist at transformasjonsfrekvensen blir øket ved innaktivering av ekstracellulær nuklease. Innaktiveringen kan oppnås ved anvendelse av divalente kationer som tolereres av planter, så som eksempelvis magnesium eller kalsium. Innaktiveringen av mer effektiv når transformasjonen blir gjennomført ved høy pH-verdi hvorved det optimale pH-området ligger mellom 9 og 10,5.

Overraskende fører den selektive benyttelse av disse forskjellige metoder til en betydeligøkning av transformasjonsfrekvensen, noe som lenger har vært et mål innenfor genetisk teknikk.

Jo mindre transformasjons-frekvensen er ved gen-transforma-sjonseksperimenter desto vanskeligere og mere tidskrevende er det å finne de små klonede celler som stammer fra de transformerte celler i forhold til det store antall av ikke-tranformerte kloner. Ved kun liten transformasjon-frekvens er det praktisk talt umulig å benytte konvensjonelle screening-metoder og således har det anvendte gen en selektiv markør (f.eks. resistens overfor en bestemt sub-stans). Små transformasjons-frekvenser krever således et meget omhyggelig arbeid og tid når man anvender gener uten markør-funksjonen.

Ved sammenbringelsen av fremmedgen og reseptor-protoplåster ved anvendelsen av andre foranstaltninger som f.eks. poly-etylenglykolbehandling, elektorporasjon og varmesjokkbehandling lar det seg i forbindelse med en fremgangsmåte gjennomføre ved et enkelt fremgangsmåtetrinn i en annen rekkefølge å oppnå en signifikant forbedring av tranforma-sjonsfrekvensen.

En kombinasjon av to eller tre av nedenforstående utvalgte teknikker har vist seg fordelaktige: polyetylenglykolbe-handling, varmesjokkbehandling og elektorporasjon hvorved det oppnås spesielt gode resultater når disse teknikker blir anvendt i en væske ved innbringelse av fremmedgenet og protoplastene. Den foretrukkede fremgangsmåte består i en varmesjokkbehandling før polyetylenglykol-behandling og en evetuelt etterfølgende elektroporasjon. Generelt fører den ekstra elektorporasjon til en ytterligere økning av tran-formasjonsfrekvensen og i mange tilfeller kan resultatene som oppnås ved varmesjokkbehandling og polyetylenglykol-behandling ikke bli vesentlig forbedret ved enda en ytterligere elektroporasjon.

Man kan videre også tilsette divalente kationer som blir tolerert av planter og/eller kombinere en tranformasjon ved pH-verdi mellom pH 9 og 10,5 med de enkelte ovenfor beskrevne tiltak som forandrer transformasjonsfrekvensen, nemlig polyetylenglykol-behandling, varmesjokkbehandling og elektorporasjon.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen gjør det således mulig å oppnå høye transformasjonfrekvenser uten å måtte anvende patogener, som f.eks virus og agrobakterier eller naturlige eller modifiserte Ti-plasmider for transformasjonen.

En foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er eksempelvis særpreget ved at protoplastene blir overført i mannitol-løsning og til slutt at den således erholdte protoplast suspensjon blir blandet med en van dig DNA-løsning som inneholder genet. Protoplastene blir så inkubert i denne blanding i 5 minutter ved 45°C og derpå avkjølt i 10 sekunder til 0°C. Ved avslutning av inkuba-sjonen blir denne blanding tilsatt så meget polyetylenglykol (MG 3000 til 8000) at det oppnås en PEG-konsentrasjon på en til 25%, fortrinnsvis ca. 8%. Etter forsiktig og omhyggelig blanding følger behandlingen i elektroporatoren. Protoplastsuspensjonen blir derpå fortynnet med kulturmedium og kan til slutt oppbevares for regenerasjon av deres cellevegger i kulturmedium.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnet for transformasjon av alle planteceller, spesielt for celler av den sys-tematiske gruppe angiosperma og gymnosperma.

Under gymnosperma er i første linje planter av klassen Coniferae av interesse.

Under angiosperma er under løvtrær og busker plantene av følgende familier av spesielle interesser: Solanaceae, Cruciferae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae, Chenopodiaceae, Rutaceae, Bromeliaceae, Rubiaceae, Theaceae, Musaceae eller Gramineae og innenfor ordningen Leguminosae familien av Papilionaceae.

Spesielt foretrukket er medlemmer av familien Solanaceae, Cruciferae og Gramineae.

Av spesiell interesse er planter av familien Nicotiana, Petunia, Hyoscyamus, Brassica og Lolium, og f.eks. Nicotiana tabacum, Nicotiana plumbaginifoli a, Petunia hybrida, Hyoscymaus muticus, Brassica napus, Brassica rapa og Lolium mulitiflurum.

Plastider og mitokondrier fra hver plante som er regenererbare fra protoplaster kan iallefall lett ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bli transformert. Opptil idag var det ikke mulig å manipulere plastider og mitokon drier fra medlemmer av familien Graminae (gress) og også plantearter, f.eks. mais, hvete, ris, bygg, havre, hirse, rug og mohrenhirse (Sorghum) genetisk. Foreliggende oppfinnelse tillater nå genetisk transformasjon av plastider og mitokondrier fra graminaceller og endelig kornceller under anvendelse av direkte gentransformasjon. På ligende måte er det mulig å gjennomføre transformasjonen av plastider og mitokondrier hos enhver egnet annen kulturplante som f.eks. planter fra familien Solanum, Nicotiana, Brassica, Beta, Pisum, Phaseolus, Glycine, Helianthus, Allium, Triticum, Hordeum, Avena, Setaria, Oryza, Cydonia, Pyrus, Malus, Rubus, Fragaria, Prunus, Arachis, Secale, Panicum Saccharum, Coffea, Camellia, Musa, Ananas, Vitis, Sorghum, Helianthus eller Citrus.

Innebyggingen av transformerte gen i plastider eller mitokondrier lar seg påvise ved hjelp av vanlige metoder f.eks. ved genetiske kryssningseksperiment eller med molekylær biologiske påvisningsforsøk, spesielt påvisningsforsøket etter Southern for plastid og mitokondrier DNA såvel som enzymaktivitet-forsøk.

Påvisningsfremgangsmåten ifølge Southern kan eksempelvis gjennomføres som følgende: DNA som er isolert fra plastider eller mitokondrier fra transformerte celler eller protoplaster blir etterbehandling med restriksjonsenzym underkastet elektroforese i 1% agarose-gel og derpå overført en til en nitrocellulose-membran [Southern et al., (1975)] og hybridisert med et in vitro merket DNA hvis eksistens skal fastslås. DNA kan in vitro merkes med spesifik aktivitet

8 8

mellom 5 x 10 og 10 x 10 c.p.m./mikrogram ved hjelp av "nick translation" [Rigby et al., (1977)]. Filteret blir til slutt vasket tre ganger i en time med en vandig oppløs-ning av en 0,03 molar natriumsitratoppløsning og en 0,3 molar natriumkloridoppløsning ved en temperatur på 65°C. Det hybridiserte DNA blir påvist ved flere dagers auto-radiografi på en røntgenfilm.

Cellene, som er transformert med detønskede gen, blir isolert ved hjelp av i og for seg kjente metoder. Disse metod-ene beholder seleksjonen og screening. Seleksjonen av nukleære gen er beskrevet av Fraley et al., (1983), Herrera-Estrella et al., (1983), og Bevan et al., (1983). En screening kan ifølge £galaktosidase [Helmer et al.,

(1984)], Nopalin-syntase eller Octopin-syntase [Wostmeyer et al., (1984), DeGreve et al., (1982)] eller atrazin-resistens.

Før foreliggende oppfinnelse viste man ikke at plastidet eller mitokondriene kunne bli transformert ved direkte gen-overføring. Følgelig var det tidligere ikke mulig å innføre brukbare gen i form av isolert DNA funksjonsmessig i disse organeller. Gen blir betraktet som funksjonsdyktige i genomet av plastider eller mitokondrier når de er innebygget for replikasjon og ekspressjon. Plasmider og mitokondrier av enhver plante som er regenererbare fra protoplaster kan likevel følgelig ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir transformert. Opptil idag var det tidligere ikke mulig å manipulere plastider og mitokondrier fra medlemmer hos familien Gramina (gress) og heller ikke kornart-er, f.eks. mais, hvete, ris, bygg, havre, hirse, rug og morenhirse. Foreliggende oppfinnelse tillater nå genetisk transformasjon av plastider og mitokondrier fra graminaceller og til slutt nevnte kornceller under anvendelse av direkte gentransformasjon. På lignende måte er det mulig er det mulig å gjennomføre transformasjon av plastider og mitokondrier fra andre tilsvarende kulturplanter som f.eks. planter fra familienSolanum, Nicotiana, Brassica, Beta, Pisum, Phaseolus, Glycine, Helianthus, Allium, Triticum, Hordeum, Avena, Setaria, Oryza, Cydonia, Pyrus, Malus, Rubus, Fragaria, Prunus, Arachis, Secale, Panicum, Saccharum, Coffea, Camellia, Musa, Ananas, Vitis, Sorghum, Helianthus eller Citrus.

Inneslutningen av transformerte gen i plastider eller mitokondrier lar seg påvise ved hjelp av kjente metoder, f.eks. ved genetisk kryssningseksperiment eller med molekylær biologiske påvisningsforsøk, spesielt påvisningsforsøkene ifølge Southern for plastid og mitokondrier DNA såvel som enzymaktivitets forsøk.

En fordel ved innføring av gener i plastider eller mitokondrier ved direkte genoverføring ligger i muligheten til en samtidig inaktivering av uønskede gen som lett er tilstede i plastid eller mitokondriegenomet. Dette er således mulig fordi innesluttelsen av fremmede gen i plastid eller mitokondriegenomet ved anvendelse av direkte genoverføring ikke nødvendigvis forløper over en homolog rekombinasjon. Således blir eksempelvis et donor-DNA-molkyl som har en atrazin-resistent form av psbA ikke nødvendigvis integrert på det sted hvor det tilsvarende atrazin-sensitive gen befinner seg. Idet på den annen side plastid og mitokondriegenomet imidlertid er relativt lite er det således mulig å velge ut de transformerte plantecellene og således finne hos disse det donor-DNA som tilfeldigvis blir innebygd i en eller annen ønsket funksjon av mottakergenomet. Den direkte genoverføring i plastid og 'mitokondriegenomet åpnes således også en måte for inaktivering av gener som tidligere ikke var gjennomførbar. Ved hjelp av en tilsvarende screening er det således eksempelvis mulig å finne transformerte plante-celler hvori det atrazinsensitive psbA-gen er inaktivert av et donor-DNA som har et atrazin-resistens gen.

En ytterligere fordel av direkte genoverføring i genomet fra plastider og mitokondrier ligger i at dette genom i motsetning til nukleære genom blir arvet maternalt gjennom cytoplasma og således vanligvis ikke blir overført gjennom pollen på seksuell måte. Derved blir muligheten for over-føring av gener som formidlerønskelige egenskaper til kulturplanter sterkt nedsatt fra kulturplanter til ugress.

Planteceller i cellekulturer som blir transformert ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan eventuelt blir anvendt for produksjon av polypeptider som kodes for av det innesluttede gen. Slike synteseprodukter omfatter eksempelvis 32 kd polypeptidet som er uttrykt fra psbA og videre kloramfenikol-acetyltransferase, glutation-S-trans-ferase og den store subenhet av Rubisco.

Plantecellene, som inneholder de innesluttede gener, kan i mange tilfeller også bli regenerert til til multicellulære planter som utvikler genet og således har denønskede nye egenskap. Enhver passende plante som er regenererbar fra planteceller og som i sin tur er avledet fra protoplaster kan bli fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempler på tilsvarende hele planter er: Solanum spp.

(potet), Petunia spp. (petunia), Daucus spp. (gulrot), Lycopersicon spp. (tomat), Brassica spp. (nepe, kål, blomkål, osv.), Medicago spp. (alfalfa), Trifolium spp.

(kløver), Zitruns, Atropa, Hyosxyamus, Salpiglossis, Arabidopsis, Digitalis, Cichorium, Gossipium, Glycine, Geranium, Anthirrhinum og Aspargus. Plantene blir regenerert på i og for seg kjente metoder, se Evans og Bravo,

(1983), Dale (1983); og planter kan eksempelvis blir regenerert fra enhver egnet avlegger som celler, kalli, vev, organer, knopper, stiklinger, skudd, røtter, småplanter, somatiske embryner og andre.

Foreliggende oppfinnelse angår videre protoplaster, plante-celler, celleagregater, planter og spesielt kornene fra planter som har blitt fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og i tillegg så lenge som de dannede frø inneholder de innebyggede gen og derved de fra dette resulterendeønskede egenskaper. Den omfatter også alle etterkommende planter som har blitt fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen såvel seksuelt som vege-tativt avkom.

Seksuelt avkom kan erholdes ved selv- eller fremmedbestøv-ning hvorved avkom innehar også alle kryssnings- og fusjonsprodukter som definert i foregående avsnitt og transformert plantemateriale såfremt dette avkom oppviser den via transformasjon innførte egenskap. Frø og avkom med herbisid-resistens eller tolerante foreldre som har en ustabil herbisid-resistens eller tolerans kan opprettholde sin herbisid-resistens eller tolerans så lengde de vokser ved nærvær av herbiside. Foretrukket herbisid er atrazin. Foreliggende oppfinnelse tillater således fremstilling av genetisk manipulerte planter som er i posisjon til å over-leve en behandling med herbisider som f.eks. med atrazin i konsentrasjoner som er dødelige for sensitive planter.

EKSEMPLER:

Enkelte fremgangsmåtetiltak av de følgende eksempler kan i allmenn form leses fra Maniatis et al., (1983). Enzymene kan skaffes fra New England Biolabs og er med unntak av de i teksten spesielle fravikelser anvendt ifølge fremstillers retningslinjer.

Eksempel 1: Konstruksjon av pCAT^ ( se fig. 1)

1) Vektor plasmidet pMON 187 osm har et Km<r>gen av Tn 903 blir spaltet med Hindlll og BamHI. 2) Et promotor-fritt CAT gen blir isolert som gelrent Hindlll/BamHI fragment av plasmidet pSOV [Gorman et al.,

(1982) ] . 3) Sammenføyningen av fragmentene fra trinn 2) med fragmentet fra trinn 1) gir et plasmid som blir transformert i E. coli HB101. Utvelgelsen følger på o Ap IT . En Km<S>koloni har plasmidet med den i fig. 1 angitte struktur for pCAT°.

Eksempel 2: Alternativ konstruksjon av pCAT°

Eksempel 2 kan gjentas med et annet plasmid enn pMON 187.

Et egnet plasmid som har Km<r>genet av Tn 903 kan bli konstruert på følgende måte:

Et 1,2 kb Avall fragment, hvilket inneholder Km -genet

fra Tn 903, blir isolert fra plasmidet pA02 [Oca et al.

(1982)]. Endene fra Avall fragmentene blir ved hjelp av Klenow-polymerase fylt ut og blir spleiset sammen med BamHI linker med den glatte ende av fragmentet. DNA blir til slutt behandlet med restriksjonsenzymene Taql og BamHI og skutt inn i plasmidet pBR327 hvilket tidligere ble behandlet med Clal og BamHI. Det rekombinante materialet som

TC

inneholder Tn903 fragmentet overfører Km til E.coli.

Eksempel 3: Konstruksjon av p32CAT ( se fig. 1)

De følgende arbeidstrinn er gjennomført for å spleise psbA promotoren med det promotorfrie CAT^ gen.

4) pCAT° blir fordøyet med Smal og Hindlll.

5) Et gel-rent 161 bp Smal/Hindlll fragment som inneholder psbA promotoren blir isolert fra plasmid pAH484. Det rekombinante plasmid pAH484 inneholder det 3.68 kb EcoRI fragment av kloroplast DNA av (atrazin-) herbisid-resistente Amaranthus hydrider som var klonet i pBR322.

[Hirschberg og Mclntosch, (1983)].

6) Det i trinn 5 isolerte fragment blir bundet med det store fragment som det fremgår av trinn 4. Sammenkob-

la

lingen fører til p32CAT, som overfører Cm til transformerte E.coli celler.

Eksempel 4: Konstruksjon av plasmid pUCHl, en vektor med et psbA gen og en kimær psbA/ CAT gen- konstruksjon ( se fig. 2).

Plasmidet pUCHl blir konstruert i 5 trinn i pUC8-vektoren.

(Trinn 7 til 11):

7) (Fig. 1) Et 3,6 kb EcoRI fragment (gel-renset) hvilket inneholder det fullstendige psbA gen blir isolert fra det ovenfor beskrevne plasmid pAH484. 8) pUC8 (fig. 2) blir linjeerisert ved sitt eneste EcoRI-sete. 9) Det linjeeriserte pUC8 fragment fra trinn 8) blir for-bundet med det fra trinn 7) beskrevne fragment. Transformasjonen av E.coli gi Ap r-kolonier som har det ønskede innebyggede fragment hvorved en av disse koloni-ene blir angitt med pUC8-32. 10) Et gel-rent 1,8 kb XhoI/BamHI fragment ble isolert fra p32CAT. 11) Det fra trinn 9) resulterende plasmid, pUC8-32 ble delvis fordøyet med Sali og fullstendig med BamHI. Spleisingen med det fra trinn 10) resulterende fragment og seleksjon for Cm av etterfølgende transformasjon av E.coli fører til en E.coli koloni som inneholder pUCHl.

Eksempel 5 Konstruksjon av pBRCAT som inneholder et

kimært psbA/ CAT gen.

Konstruksjonen av pBRCAT blir oppnådd ved spleising av følgende tre DNA-fragmenter. a) EcoRI/Hindlll (promotor) fragmentet (ca. 660 bp) fra psbA genene i plasmid pAH484 (trinn 12); b) Hindlll/BamHI fragmentet av pSVO med et promotorfritt CAT gen (trinn 2); og c) det ved EcoRI/BamHI fordøyede pBR322 som vektor (trinn 13 ) .

14) Spleisingen fører til et plasmid pBRCAT som overfører

Cm r til E.coli vertsceller hvori dette plasmid blir innesluttet ved transformasjon.

Eksempel 6: Inneslutning av donor- DNA i planteprotoplaster

Tobakk-protoplaster med en populasjonkonsentrasjon på 2x10 pr. ml ble suspendert i 1 ml av et K^-medium [se Z.Pflanzenphysiologie 78, 453-455 (1976), Mutation Research 81, 165-175 (1981)] som inneholdt 0,1 mg/liter 2,4 diklorfenoksyeddiksyre, 1,0 mg/liter 1-naftyleddiksyre og 0,2 mg/ liter 6-benzylaminopurin. Protoplastene ble erholdt fra en enzymsuspensjon gjennom flotasjon i 0,6 M sucorose med en pH på 5,8 og deretter sedimentasjon i 5 minutter ved 100 g i 0,17 M kalsiumklorid ved pH 5,8. Til denne suspensjonen ble etter hverandre 0,5 ml 40% polyetylenglycol (PEG) med en molekylvekt på 6000 i modifisert (etter autoklavering i en innstilt pH-verdi på 5,8) F-medium [Nature 296, 72-74,

(1982)], og også tilsatt 65 (aml av en vandig løsning med 15 |umg donor-DNA (p32CAT, pUCHl eller pBRCAT) og 50 umg kalve-timers DNA. Denne blanding ble dyrket i 30 minutter ved 26°C hvorved løsningen forsiktig ble omrørt og til slutt trinnvis fortynnet med F-medium. Protoplastene ble isolert ved sentrifugering (5 minutter ved 100 g) og til slutt resuspendert i 30 ml ferskt K^-medium. Videre inkubasjon fulgte ved 24°C i mørke i 10 ml porsjoner i Petri-skåler med et tverrsnitt på 10 cm.

Etter tre dager ble kulturmediet fortynnet i hver Petriskål med 0,3 volumenheter av ferskt K^-medium og i ytterligere 4 dager inkubert ved 24°C og 3000 lux. Etter tilsammen 7 dager ble klonene som hadde utviklet seg til protoplaster innesluttet i et med 1% agarose fastkulturmed-ium som inneholdt 10 mg/liter kloramfenikol og dyrket ved 34°C i mørket ifølge "bead type culture method" [Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983)]. Kulturmediet ble alle 5 dager på tilsvarende måte erstattet av et ferskt medium. Etter 3 til 4 uker med uavbrutt dyrking i kloramfenikol inneholdene kulturmedium ble de resistente planter på 2-3 mm i tverrsnitt overført til et med agar fastgjort LS kultur-medium [Physiol. Plant. 18, 100-127 (1965)] som inneholdt 0,05 mg/liter 2,4-diklorfenoksyeddiksyre, 2 mg/liter 1-naftyleddiksyre, 0,1 mg/liter 6-benzylaminopurin, 0,1 mg/ liter kinetin og 10 mg/liter klormafenikol. Kloramfenikol resistente Nicotiana tobakk Petit Havana SRI planter ble erholdt ved spireinduksjon på LS-medium med 10 ml/liter kloramfenikol og 0,2 mg/liter 6-benzylaminopurin og til slutt rotinduksjon på T-medium [Science 163, 85-87, (1969)]

Utvelgelsen av kloramfenikol resistente skudd og planter fulgte i det vesentlige ifølge den av De Block et al.,

(1984) angitte fremgangsmåte.

Eksempel 7: Screening av atrazin- resistente kloroplast-transformanter

a) spirer

En atrazin toksisitet-kurve ble fremstilt for ikke-transformerte spirer i et konsentrasjonsområde på 1 til 10 (ummol atrazin og forskjellig lysintensitet. Tilsvarende ble fra kloroplast-transformanter stammende spirer og kontrollspir-er sådd ut på næringsagar-plater med atrazinkonsentrasjonen og lysintensitet som fullstendig bleket ut klorofyllet fra kontrollvevet. Motstandsdyktigheten overfor atrazin ble visuelt prøvet ut fra den erholdte grønnfarging av det resistente vev.

b) Hele planter

Planter, som ble erholdt fra kloroplast-transformanter, ble

etter følgende metode undersøkt for atrazin-resistens: Klorofyll-fluoressens-induksjon i blader. Ble elektrontran-sporten ved det reduserende sete av fotosystem II hemmet, som eksempelvis ved atrazin, så blir strålingsenergien ab-sorbert av klorofyll reemitert som fluoressens. Denne fluor

essens kan bli målt på bladoverflaten. Fluoressens-målingen ble foretatt på små blad som var spent horisontalt over et gjennomsiktig Lucite-vindu som beskrevet i Nalkin et al.,

(1981). [Lucite står for polymerisert harpiks av metylmet-akrylat.] Det eksiterende lys stammer fra en projektor drevet av likestrøm som ved passasje gjennom et filter resulterer i bånd av aktinisk lys på 500 til 600 nm med inten-sitet ca. 10 nE x cm s . Varigheten av det eksiterende lys er ca. 3 ms. Det eksiterende lys er rettet vinkel-rett på bladoverflaten og fluoressensen fra denne overflate blir ved hjelp av et fleksibelt lysføringssystem samlet og derpå etter passasje av et Cut-off filter (660 nm) overført til en rødømtfintlig fotomultiplikator. Fluoressensgjennom-gangen ble nedtegnet på et Oszilloskop og direkte avfilmet.

c) Lysmodulert flotasjon

Lar man utskårede bladstykker flyte på en fosfat-buffer

holdig detergent forblir dette på overflaten så lenge fotosyntesen pågår idet denne sørger for et høyt O^/ CO^ forhold i intercellulærrommene.

Lar man bladbitene derimot flyte i mørket eller tilfører man mediet fotosyntesehemmende herbisider så taper de meget raskt sin oppdrift og synker ned. En Assay-metode for atrazin-resistens er beskrevet av Hensley (1981). Bladstykker blir tilsatt i små rør med atrazin-inneholdene løsning og satt under våkum. Bladstykkene blir raskt gjennomtrukket av løsningen og synker til bunnen av løsningen. Vakumet blir til slutt fjernet og en bikarbonat-løsning blir tilsatt og rørene satt i lys. Blir fotosyntesen ikke hemmet av atrazin så fremstiller fotosyntesen i en flytedyktighet ved fremstilt oksygen innenfor vevet og bladstykkene flyter mot overflaten. Atrazin-sensitive stykker forblir derimot på bunnen.

Eksempel 8: Transformasjon av celler av Brassica rapa

( sammenlign Just Right)

Brassica rapa protoplaster blir dyrket med et egnet osmotikum og suspendert i en populasjonstetthet på 5x10^ pr. ml i et kulturmedium som er fremstilt i henhold til beskrivel-sen i [Protoplast 83, Proceedings Experientia Supplementum, Birkhauser Verlag, Basel, Vol 45 (1983), 44-45]. 40% polyetylenglycol (PEG) med en molekylvekt på 6000 løst i modifisert F-medium (pH 5,8) (sammenlign eksempel lb) blir blandet med protoplastsuspensjonen til en sluttkonsentra-sjon på 13% PEG. Til denne blanding blir til slutt raskt en løsning bestående av 50 mikrogram med endonuklease Sal I fordøyet plasmid til pBRCAT eller p32CAT og 60 um vann tilsatt. Under forsiktig omrøring blir denne blandingen inkubert i 30 minutter ved 20° til 25°C. Derpå blir 3x2

mm modifisert F-medium (tilsammen 6 ml) og 2 x 2 mm kultur-medium (tilsammen 4 ml) tilsatt i 5 minuuters-intervaller. Protoplastsuspensjonen blir overført til Petri-skåler med 10 cm tverrsnitt og tilsatt ytterligere kultur-medie til et totalt volum på 20 ml. Denne protoplastsuspensjonen blir inkubert 45 minutter ved 26°C i mørke.

Protoplastene blir isolert ved 5-minutters sedimentasjon og tatt opp i et etterfølgende flytende og senere ved agarose gel fastgjort kultur-medium og dyrket etter "bead type culture method" [Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983)]. Etter fire dager i utviklingsstadiet til første celledeling blir kloramfenikol tilsatt i en konsentrasjon på 10 mg/ liter til kulturen. Det flytende kultur-medium, som omgir agarose-segmentene blir tilsatt alle fire dager fersk klor-amf enikolholdig næringsløsning. Etter fire uker blir de kloramfenikol-resistente kloner isolert og til slutt videre dyrket idet de ukentlig blir tilsatt kloramfenikol-holdig næringsløsning (10 mg/liter).

Eksempel 9: Transformasjon av protoplaster

Man går ut fra lolium multiflorum-protoplåster med en konsentrasjon på 2x10 pr. ml i en 0,4 molar mannitol-1øs-ning med pH 5,8. Til denne suspensjon blir tilsatt etter hverandre 0,5 ml 40% polyetylenglycol (PEG) med en molekylvekt på 6000 i modifisert (pH 5,8) F-medium [Nature 296, 72-74, (1982)] og 65 pl av en vandig løsning med 50 ug av plasmidene p32CAT eller pBRCAT. Denne blanding blir inkubert i 30 minutter ved 26°C og forsiktig omrøring og til slutt fortynnet med F-medium. Dette skjer ifølge beskrivel-sen i [Nature 296, (1982)]. Protoplastene blir isolert ved sentrifugering (5 minutter ved 100 g) og tatt opp i 4 ml CC-kulturmedium [Potrykus, Harms og Lorz, Callus Formation from Cell Culture Protoplasts of Corn (Zea Mays L.), Theor. Appl. Genet. 54, 209-214 (1979)] og inkubert ved 24°C i mørke. Etter 14 dager blir de utviklede cellekulturer over-ført i tilsvarende medium som imidlertid nå inneholder kloramfenikol (10 mg/liter). Resistens-kolonier blir over-ført til et agar-medium - det samme medium som ovenfor 10 mg/liter kloramfenikol uten osmotikum, og tilslutt etter at de har oppnådd en størrelse på flere gram fersk vekt pr. koloni analysert med hensyn på opprettholdelsen av de bakterielle gen og den biologiske aktivitet av genene.

Eksempel 10: Transformasjon av kultiverte celler fra Nicotiana tabakum ved overføring av p32CAT, pBRCAT eller pUCHl med hjelp av elektropora-s jon

Protoplaster blir erholdt ved sedimentasjon av 50 ml av en 10 g-fase suspensjonskultur av en nitrat reduktase defekt variant fra Nicotiana tabcum, celle-stamme nia-115 [Muller, A.J. og R. Grafe, Mol. Gen. Genet. 161, 67-76 (1978)] og resuspendert i 20 ml av en enzym-løsning [2% Cellulase Onozuka R-10, 1% Macerozume R019 og 0,5% Driselase (fra der Chemischen Fabrik Schweizerhalle, Basel) i en vaskeløsning (0,3 M mannitol, 0,04 M kalsiumklorid og 0,5% 2-(N-morfo-lin)etansulfonsyre) innstilt på pH 5,6 med KOH] og inkubert i 3 timer på en rundristemaskin ved 24°C. Protoplastene ble til slutt skillet ved filtrering gjennom en sikt med en maskebredde på 100 um av ufortynnet vev. Det tilsvarende volum ble tilsatt en 0,6 M sucrose-løsning og den erholdte suspensjon sentrifugert i 10 minutter ved 100 g. Protoplastene som flyter på overflaten blir samlet og vasket 3 ganger ved sedimentasjon i vaskeløsningen.

Transformasjonen blir gjennomført ved hjelp av elektorporasjon. Kammeret til en Dialog "Porator" (fra Dialog Gmbh Harffstr. 32, 4000 Diisseldorf, Tyskland) blir ved vasking med 70% alkohol og derpå med 100% alkohol sterilisert og tørket ved en strøm av steril luft ved en blåsing med lami-nær luftstrømning. Protoplastene blir suspendert i en konsentrasjon på 1x10^ pr. ml i en 0,4 M mannitol-løsning og innstilt på en motstand på 1,4 KOhm med magnesiumklorid. Til slutt blir pBRCAT, pUCHl eller p32CAT tilsatt i en konsentrasjon på 10 ug/ml. 0,38 ml prøver av denne protoplast suspensjon blir tilført 3 ganger med intervaller på 10 sekunder med en spenning på 1000 eller 2000 Volt. Protoplastene blir tilslutt dyrket i en konsentrasjon på 1x10^ pr.

ml i 3 ml av AA-CH medium [AA Medium fra Glimelium, K. et al., Physiol. Plant. 44, 273-277 (1978)] hvilket ble modifisert såvel ved økning av inositol-konsentrasjonen til 100 mg/liter og sucrose-konsentrasjonen til 34 g/liter som ved tilsetning av 0,05 ml/liter 2-(3-metyl-2-butenyl)adenin og på grunn av sitt innehold på 0,6% agarose [Sea Plaque, FMC Corp., Marine Colloids Division, P.O. Box 308, Rockland, Maine 04841, USA], Etter en uke blir agarose-skjiktet som inneholder protoplastene overført i 30 ml av et flytende AA-CH medium som inneholder 10 mg/liter kloramfenikol. Etter tre uker, iløpet av hvilke tilsvarende halvdelen av mediet ukentlig blir erstattet av ferskt medium med samme sammensetning, kan de transformerte celle-kolonier bli undersøkt visuelt. 4 uker etter overføringen i det kloramfenikol-holdige medium blir disse kolonier overført til et AA-medium [Glimelium, K. et al., Physiol. Plant. 44, 273-277 (1978)] med 0,8% agar som inneholder 10 mg/liter kloramfenikol for videre kultivering og undersøking.

Analoge undersøkelser med protoplaster fra Brassica rapa og Lolium multiflorum fører likeledes til tilsvarende trans-

formasjon.

Eksempel 11: Transformasjon av kloroplaster av Nicotiana tabacum celler ved overføring av donor- DNA ved hjelp av elektorporasjon

Fremstilling av elektroporatoren og protoplastene følger i henhold til eksempel 10 eller eksempel 6.

For transformasjonen blir protoplaster av Nicotiana tabacum resuspendert i en konsentrasjon på 1,6x10^ pr. ml i en mannitol-løsning [0,4 M, bufferet med 0,5% w/v 2-(N-morfo-lin)etansulfonsyre, pH 5,6]. Motstanden av protoplastsuspensjonen blir målt i porator-kammeret (0,38 ml) og innstilt med en magnesiumklorid-løsning på en verdi mellom 1 og 1,2 KOhm. 0,5 ml prøver blir tatt ut og kommer i med et deksel lukkbare plastrør (5 ml volum) hvori på forhånd 40 pl vann med 8 ug donor-DNA og 20 jug kalvetymus-DNA ble tilsatt såvel som 0,25 ml av en polyetylenglykol-løsning (24% w/v i 0,4 M mannitol). 9 minutter etter tilsetning av DNA blir 0,38 ml prøver tilsatt i elektroporator-kammeret. 10 minutter etter tilsetning av DNA blir protoplastsuspensjonen tilført i kammeret tre impulser (1000-2000 Volt) i et intervall på 10 sekunder. De behandlede prøver blir tilsatt Petriskåler med 6 cm tverrsnitt og holdt i 10 minutter ved 20°C. Til slutt blir 3 ml K^-medium ved 0,7% w/v "Sea Plaque Agarose" tilsatt hver Petriskål og innholdet av skålene blir omhyggelig blandet. Etter stivning ble inneholdet av hver skål av kulturene holdt en dag ved 24°C i mørke og 6 dager i lys. Den protoplast-inneholdene agarose blir så skåret opp i 4 deler og tilført i et flytende medium. Protoplastene blir til slutt dyrket ifølge"bead type culturing method". Nydannet plantevev, som blir erholdt ved seleksjon av det transformerte materiale med kloramfenikol og planter som derfra blir regenerert, inneholder CAT-enzymet (kloramfenikol-acetyl-transferase) som produkt av CAT-genet. Elektroporasjonen fører til 5 til 10-ganger økning av transformasjons-frekvensen i forhold til metoden uten elektorporasjon. Analoge undersøkelser med Brassica rapa cv. Just Right og Lolium multifluroum ga likeledes en økning av transformasjons-frekvensen i tilsvarende størrelsesorden.

Eksempel 12: Transformasjon av celler av Nicotiana tabacum ved overføring av CAT- genet ved hjelp av varmes jokk-behandling

Protoplaster som ble isolert fra blader eller fra Nicotiana tabacum celle-kulturer blir som beskrevet i eksempel 6 og 10 utvunnet og tilsvarende tidligere eksempler overført til en osmotisk stabilisert medium.

Protoplast-suspensjonene blir holdt i 5 minutter ved 45°C og så avkjølt i 10 sekunder med is ved 0°C og til slutt blir plasmidene pBRCAT, pUCHl eller p32CAT tilsatt som beskrevet i eksemplene 6 og 10.

Varmesjokk-behandlingenøker transformasjonsfrekvensen med en faktor på 10 eller mer, sammenlignet med en transformasjon som ble gjennomført uten denne behandling.

Eksempel 13: Transformasjon av planteceller av forskjellig

opprinnelse ved overføring av CAT- genene,

idet man i første trinn bringer sammen protoplaster og gener og til slutt gjennomfører en kombinert behandling

Plante-protoplåster: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI (A); Brassica rapa cv. Just Right (B) og Lolium multiflorum (C) ble isolert og overført ifølge eksempel 11 til et osmotisk stabilisert medium. Protoplast-suspensjonene blir blandet med plasmidene pUCHl, p32CAT eller pBRCAT ifølge eksemplene 6 til 9, men uten samtidig behandling med polyetylenglykol. Protoplastsuspensjonene blir så ifølge eksempel 12 utsatt for en varmesjokk-behandling og til slutt en polyetylenglykol ifølge eksemplene 6 til 9 og til slutt underkastet en elektroporasjon ifølge eksempel 11. Transformasjonsfrekvensen ved denne fremgangsmåte ligger mellom 10 og 10 og kan hvert ifølge valgte betingelser imidlertidøkes til 1% til 2%.

Litteraturlisten

Barton, et al, Cell. 32, 1033 (1983).

Barton and Chilton, Methods in Enzymology, 101, 527 (1984).

Bevan, et al, Nature, 304, 184 (1983).

Bevan, et al, Nucleic Acid Res., 12, 8711 (1984).

Bolivar, et al, Gene 2, 75 (1977).

Chilton, et al, Genetics, 83, 609 (1976).

Chilton, "Plant Gene Vectors", in "The Role of Plant Biotechnology in Plant Breeding", Report des 1984 Plant Breeding Research Forums, 21. bis 23. August (1984), Seiten 177 bis 192

(1985) .

Coleman, et al, Cell, 3_7, 429 (1984).

Comai, et al, Plasmid, 10, 21 (1983).

Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrants Crops" in Protoplasts 1983 Lecture Proceedings, Potrykus et al, (eds), Experientia Supplement, Band 46, Birkhaeuser, Basel, (1983).

De Block, et al, EMBO J., 4, 1367 (1985).

De Block, et al, EMBO J., 3, 1681 (1984).

De Greve, et al, Nature, 300, 752 (1982).

de Framond, et al, Biotechnology, 1_, 266 (1983).

Ditta, et al, Proe. Nati. Acad. Sei USA 7J7 , 7347 ( 1980).

Evans and Bravo, "Protoplast Isolation and Culture" im Handbook of Plant Cell Culture, Band 1, Evans et al (Eds), McMillian Publishing Co., New York, (1983).

Fraley, et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 80, 4803 (1983).

Fraley, et al, Biotechnology, 3, 629 (1985).

Fraley, et al, Plant Molecular Biology, 3, 371 (1984).

Gamborg, Plant Physiol., 45, 372 (1970).

Gamborg, et al, Plant Tissue Culture Methods, 11 (1975).

Garfinkel et al, Cell, 27, 143 (1981).

Gorman, et al, Molecular and Cellular Biology, 2, 1044 (1982).

Helmer, et al, Biotechnology, 2, 520 (1984).

A,rHensley, Weed Sei., 29 70 (1981).

Hepburn, et al, J. Mol Appl. Genet., 2, 211, (1983). Hernalsteens, et al, Nature, 282, 654 (1980). Herrera-Estrella, et al, Nature, 303, 209 (1983). Hirschberg and Mclntosch, Science, 222, 1346 (1983). Hirschberg, et al, Z. Naturforsch., 396, 412 (1984). Hoekema, et al, Nature, 303, 179 (1983).

Holsters et al, Mol. Genet., 163, 181 (1978).

Horsch, et al, Science, 2_27 , 1229 (1985).

Izart, et al, Cell, 36, 1007 (1984).

Jordan and Ogren, Nature, 291, 513 (1981).

Jorgensen, et al, Mol Gen. Genet, 177, 65 (1979).

Klee, et al, Biotechnology, 3, 637 (1985).

Koblitz, Kulturpflanze, XXII, 93 (1974).

Le Baron and Gressel, Herbicide Resistance in Plants, John Wiley and

Sons, (1982).

Maliga, Z. , Pflanzenphysiol. , T8, 453 (1976).

Malkin, et al, Plant Physiol., 67, 570 (1981).

Maniatis, et al, Molecular Cloning, Cold Springs Harbor

Laboratory, (1982).

Matzke and Chilton, J. Mol Appl. Genet., 1_, 39 (1981). Messing, et al, Gene, 19, 269 (1982).

Meister, et al, Ann Rev. Biochem., 52, 711, (1983). Melton, Proe. Nati. Acad. Sei., 82, 144 (1985). Murashige, et al, Physiol. Plant, 15, 473 (1962). Neumann, "et al, EMBO J., 7, 841 (1982). Norrander, et al, Gene 26, 101 (1983).

Oka, et al, Nature, 2^6, 845 (1978).

Oka, et al, J. Mol. Biol., 142, 217 (1981).

Paszkowski, et al, EMBO J., 3, 2717 (1984).

Pestka, et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 81, 7525 (1984). Rennenberg, Phytochemistry 21_, 2771 ( 1982).

Rigby et al, J. Mol. Biol., 113, 237 (1977).

Roberts, Plant Molecular Biology Reporter, 3, 107 (1985). Rochaix, et al, Plant Mol. Biol., 3, 363 (1984). Schilperoort et al, Europaische Patentanmeldung Nr. 86,537 (1983). Shimabukuro, et al, Plant Physiol., 42, 10 (1971). Simons, et al, Cell, 34, 683 (1983).

Southern, et al, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).

Wang, et al, Cell, 38, 455 (1984).

Wostemeyer, et al, Mol. Gen., 194, 520 (1984).

Yadav, et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 6322 (1982). Zambryski, et al, EMBO J., 2, 2143, (1983).

Claims (36)

1. Fremgangsmåte for direkte innesluttelse av DNA i plastider og mitokondrier av planteprotoplaster hvorved nevnte DNA omfatter et eller fler gener og i plastidene og mitokondriene aktive promotorer, karakterisert ved at man ved fravær av en patogen av nevnte DNA i et medium hvori dette DNA klarer å trekke inn i protoplastene og de deri værende plastider og mitokondrier og bringer dette i kontakt så lenge med protoplastene at denne penetrasjon er sikret.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man lar dette fortsette inntil regenerasjon av transformerte planteceller av de transformerte protoplaster .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man lar fremgangsmåten forlø pe videre til regenerasjon av transformerte planter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ve d at det dreier seg om linjær DNA ved det innsluttede DNA.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det dreier seg om sirkulær DNA ved det innesluttede DNA.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det sirkulære DNA inneholder 1 eller fler T-DNA-grenseregioner.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det dreier seg om et DNA av det innsluttede DNA som overfører en herbisid-resistens til plastidene eller mitokondriene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at herbisidet er atrazin.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det innesluttede DNA ved siden av herbisid-resistensen overfører en andre for landbruket nyttig egenskap.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det innesluttede DNA inneholder en selekterbar markør og et gen hvilket overfører en for landbruket betyd-ningsfull egenskap.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at markørgenet gir en antibiotika-resistens .

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at antibiotika-resistensen er kloramfenikol eller kanamycin-resistens.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den landbruksmessige betydningsfulle egenskap er en herbisid-resistens.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at herbisid-resistensen er atrazin-resistens.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det innesluttede gen er et kimaert gen.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det innesluttede DNA inneholder et replikasjonssignal .

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det innesluttede DNA inneholder et integrasjonssignal .

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man gjennomfører fremgangsmåten med protoplaster fra blader.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man tilsetter et osmotisk stabilisert for protoplaster egnet kulturmedium.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et medium som inneholder et plante-fordragelig divalent kation.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved aktionet er magnesium eller kalsium.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet inneholder en flerverdig alkohol som forandrer cellemembranen og forårsaker cellefusjonen.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at den flerverdige alkohol er polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyvinylglykol.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den flerverdige alkohol er polyetylenglykol (PEG).

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karkteri-sert ved at polyetylenglykolet har en molkylvekt mellom 100 og 10000.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA og protoplastene blir underkastet en varmesjokk- behandling.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA og protoplastene blir underkastet en elektro-poras jon .

28. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at innføringen av DNA i protoplastene kommer istand ved kombinasjon av to tiltak valgt fra polyetylenglykol-behandling, varmesjokk-behandling og elektroporasjon.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at genoverføringen blir gjennomført på en slik måte at man for innesluttelse av fremmedgenet tilfører nevnte gen og protoplastene i en løsning og underkaster den resulterende suspensjon, først en varmesjokk-behandling og derpå en polyetylenglykol-behandling.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at genoverføringen blir gjennomført på en slik måte at man for innesluttelse av fremmedgenet tilfø rer nevnte gen og protoplastene i en løsning og underkaster den resulterende suspensjon, først en varmesjokk-behandling og derpå en polyetylenglykol-behandling og til slutt en elektropora-s jon.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendte medium inneholder en flerverdig alkohol som forandrer protoplasmembranen og forårsaker cellefusjonen og hvor man det i dette medium suspenderte DNA sammen med protoplastene underkaster en elektroporasjon og/eller en varmesjokk-behandling.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man i tillegg innaktiverer ekstra cellulære nuk-leaser.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man setter inn protoplaster fra planter av familien av Gramineae, Solamaceae eller Gruciferae.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at man setter inn protoplaster av plante-celler fra plantene av familien Gramineae.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at det ved Gramineae dreier seg om korn.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert ved at kornet er mais, hvete, ris, bygg, havre, hirse, rug eller morenhirse.