DE19942174A1

DE19942174A1 - Methode zum Auffinden von Inhibitoren der Riboflavin Biosynthese

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Publication number: DE19942174A1
Application number: DE19942174A
Authority: DE
Inventors: Adelbert Bacher; Stefan Herz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2000-06-21

Abstract

Es wird eine Methode beschrieben zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung von GTP-Cyclohydrolase II Aktivität, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem Protein mit GTP-Cyclohydrolase II Sequenz und GTP, DOLLAR A b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'-phosphat, DOLLAR A c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Hinzufügen einer vorbestimmten Menge einer chemischen Testprobe zur besagten ersten Mischung, DOLLAR A d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeitdauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließend Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'-phosphat, DOLLAR A e) Bestimmung der Anwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase II durch Feststellung, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration niedriger ist als die in Schritt b) bestimmte Konzentration, DOLLAR A oder zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem Protein mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasesequenz und Ribulose-5-phosphat, DOLLAR A b) Umsetzung der besagten Mischung während einer vorbestimmten...

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet betreffend das Auffinden von In hibitoren der Riboflavinbiosynthese. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Metho den zum Screening von Inhibitoren für GTP-Cyclohydrolase II oder 3,4-Dihydroxy-2-buta non-4-phosphatsynthase, ebenso wie auf Mutanten, welche Resistenz gegen einen Inhibi tor aufweisen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Reagenziensysteme für die besagten Screeningmethoden. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Anwendung dieser Screeningmethoden zum Auffinden von Inhibitoren, die nutzbar sind als Herbizide oder Fungizide oder als antibakterielle Agentien. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf Pflanzenenzyme für die Durchführung der besagten Screeningmethoden.

Die menschliche Bevölkerung ist angesiedelt in einer Ökologie mit einer wechselvollen Auseinandersetzung mit gefährlichen Mikroorganismen, im Agrarbereich mit Unkräutern, Pilzen und dergleichen und im medizinischen oder veterinärmedizinischen Bereich mit pathogenen Bakterien, Pilzen oder dergleichen. Es besteht ein fortdauernder Bedarf nach der Entwicklung jeweils neuer chemischer Inhibitoren gegen solche unerwünschten Or ganismen.

In Zeiten einer wachsenden Weltbevölkerung in Verbindung mit einem wachsenden Be wusstsein für die Notwendigkeit des Umweltschutzes besteht ein großer Bedarf nach Er höhung der Produktivität von landwirtschaftlich genutzten Flächen. Ein Weg zur Verfol gung dieses Ziels ist die Suche nach neuen Herbiziden oder Fungiziden oder dergleichen, welche eine hohe Effektivität gegen alle Schadorganismen, wie z. B. Unkräuter, Pilze und dergleichen besitzen, selbst wenn sie in geringen Mengen angewandt werden. Bei gleichzeitigem Fehlen von Einflüssen auf Nutzpflanzen und bei geringer oder fehlender Toxizität für Menschen oder Säugetiere vorzugsweise auch für alle anderen Tiere in den relevanten Ökosystemen.

Im medizinischen oder veterinärmedizinischen Gebiet besteht eine immer wechselhafte Auseinandersetzung mit Pathogenen, insbesondere mit Pathogenen mit einer signifikan ten Neigung zur Entwicklung von Resistenz gegen Konventionelle Inhibitoren. Inhibitoren in diesem Bereich sollten hocheffektiv gegen ein Pathogen und in kleinen Dosen anwend bar sein. Sie sollten geringe oder keine Toxizität für den zu behandelnden Patienten oder das zu behandelnde Tier zeigen und weiterhin sollten sie so geartet sein, dass das Pro dukt des gehemmten Stoffwechselweges nicht in einfacher Weise vom Wirtsorganismus durch die Zellwand des Pathogens transportiert werden kann. Es ist wiederum offensicht lich, dass die Entdeckung neuer Inhibitoren, welche diese Anforderungen erfüllen eine enorme Aufgabe darstellt.

Ein Weg zum Auffinden neuer Inhibitoren besteht in der Modifikation bekannter Inhibitor typen. Dieser Weg verspricht Effekte, die erwartungsgemäß nicht wesentlich verschieden sind von den Effekten der konventionellen Mitglieder dieser bekannten Inhibitortypen.

Ein vielversprechenderer Weg wäre die Suche nach neuen Typen von Inhibitoren mit neuen Wirkmechanismen. Eine solche Suche kann nicht gelenkt werden durch das Wis sen um die Strukturen konventioneller Inhibitoren. Deshalb werden neue Methoden zum Screenen von Bibliotheken chemischer Verbindungen für diese Suche benötigt.

Es ist deshalb ein Ziel, eine Methode bereitzustellen zum Screening von Bibliotheken chemischer Testproben nach Verbindungen, welche mit hoher Effektivität ein Enzym in einem biochemischen Reaktionsweg hemmen, welches essentiell ist für Unkräuter, Pilze oder bakterielle Pathogene, aber nicht für den Menschen oder Tiere und dessen Inhibito ren nicht kompensiert werden können durch die Aufnahme des Produkts des Reaktions weges aus der Umgebung.

Wir haben gefunden, dass dieser Gegenstand vorteilhaft erreicht werden kann durch eine Methode zum Screening von Inhibitoren der Riboflavinbiosynthese.

Alle zellulären Organismen benötigen Riboflavin als unersätzlichen Bestandteil zahlreicher Redoxenzyme, von denen viele äußerst wichtig für den Stoffwechsel sind. Alle Pflanzen, Pilze und viele Bakterien bilden Riboflavin biosynthetisch, während alle Tiere auf die Zufuhr von Riboflavin (Vitamin B₂) mit der Nahrung angewiesen sind. Deshalb würde ein Inhibitor für ein Enzym in der Biosynthese des Riboflavins in Pflanzen, Pilzen und Bakterien nicht mit dem Stoffwechsel von Tieren interferieren. Weiterhin ist der absolute Bedarf an Riboflavin für die zelluläre Aktivität niedrig. Deshalb werden nur kleine Mengen der Enzyme für die Riboflavinbiosynthese in Zellen angetroffen. Dies bedeutet wiederum, dass nur kleine Inhibitormengen für solche Enzyme erforderlich wären. Dies macht die Enzyme der Riboflavinbiosynthese zu einem idealen Ziel für neue Inhibitoren.

Der Biosyntheseweg von Vitamin B₂ (Riboflavin) (Abb. 1) wurde in Bakterien und Hefen in beträchtlichem Detail untersucht (zur Übersicht siehe Bacher, 1991; Bacher et al., 1996). Die biosynthetische Bildung eines Moleküls Riboflavin (7) benötigt ein Molekül GTP und zwei Moleküle Ribulose-5-phosphat. GTP (1) wird zunächst überführt in das obligate In termediat, 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon 5-phosphat (2) durch das Enzym, GTP-Cyclohydrolase II (Schritt A). Dieses Intermediat wird in 5-Amino-6- ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion (3) durch eine Sequenz von Desaminierung, Seitenkettenreduktion und Dephosphorylierung überführt. Die Verbindung (3) wird überführt in 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (4) durch Kondensation mit 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat (5), welches enzymatisch erzeugt wird aus Ribulose-5-phosphat (6) durch 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase (Schritt B). Die Bildung von (5) beinhaltet eine ungewöhnliche Skelett-Umlagerung mit Verlust von C-4 des Substrats als Formiat.

Das ribA-Gen von Bacillus subtilis spezifiziert ein bifunktionelles Protein, welches die Bil dung des Pyrimidins (2) und des Kohlenhydrats (5) aus GTP bzw. Ribulose-5-phosphat katalysiert. Ähnliche Proteine wurden vorhergesagt auf der Basis von DNA-Sequenz information in verschiedenen anderen Mikroorganismen wie z. B. Bacillus amylolique faciens, Synechocystis sp., Mycobacterium tuberculosis, Acfinobacillus pleuropneumoniae oder Aquifex aeolicus (Gusarov et al., 1997; Kaneko et al., 1996; Cole et al., 1998 und 1996; Fuller et al., 1995; Deckert et al., 1998). Andererseits ist gezeigt worden, dass Escherichia coli und die Hefen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pompe, Candida guilliermondit Azospirillum brasilense jeweils GTP-Cyclohydrolase II und 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasen durch nicht-gekoppelte Gene als separate Proteine spezifizieren (Richter et al., 1992; Oltmans et al., 1972; Liauta-Teglivets et al., 1995; von Bastelaere et al., 1995). Das selbe scheint zuzutreffen in Haemophilus influen zae, Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum, Archaeoblobus fulgidus, Helicobacter pylori, Dehalospirillum multivorans, Methanococcus jannaschit Methano bacterium thermoautotrophicum auf der Grundlage von DNA-Sequenzinformation (Fleischmann et al., 1995; Lee et al., 1994; Klenk et al., 1997; Tomb et al., 1997; Bult et al., 1996).

Wir haben entdeckt, dass GTP-Cyclohydrolase II und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phos phatsynthase in Pflanzen fusioniert sind. Dementsprechend ist zu vermuten, dass das bifunktionelle Enzym strukturelle Einschränkungen aufweist, die es empfindlich machen für hochspezifische Hemmung und die es damit zu einem vielversprechenden Ziel zum Screening von Inhibitoren macht. Ein derartiges Protein, welches sich für Screening zwecke eignet kann beide Funktionen kombiniert aufweisen wie in Pflanzen oder in eini gen Bakterien; oder nur eine dieser Funktionen wie in Pilzen und anderen Bakterien.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die zur Verfügungstellung einer Me thode zum Screening chemischer Testproben nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität zur Auffindung eines Inhibitors.

Dieser erste Gegenstand wird erreicht durch eine Methode zum Screening nach An wesenheit oder Abwesenheit von von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, wel ches die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit GTP-Cyclo hydrolase-II-Sequenz sowie GTP enthält,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Einschluß einer vorherbestimm ten Menge einer chemischen Testprobe in die besagte erste Mischung d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorherbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Kon zentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat,
d) Bestimmung der Anwesenheit einer Hemmung der GTP-Cyclohydrolase II durch Feststellung ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration niedriger ist als die in Schritt b) bestimmte Konzentration.

Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist die Verfügbarmachung einer Methode zum Screening nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Resistenz gegen eine Hemmung einer GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, wobei die Testprobe ein Protein enthält mit einer mutierten, pflanzentypischen GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz zwecks Auffindung eines mutierten Enzyms, welches gegen einen spezifischen Inhibitor resistent ist.

Der zweite Gegenstand wird erreicht durch eine Methode zum Screening nach Anwesen heit oder Abwesenheit einer Hemmung gegen GTP-Cyclohydrolase II, welche die folgen den Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer mutierten, pflanzentypischen GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz sowie GTP enthält,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 2, 5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung, wobei in die besagte erste Mischung eine vorausbestimmt Menge an spezifischem Inhibitor der besagten GTP-Cyclo hydrolase II eingeschlossen wird,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorherbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Kon zentration von 2, 5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit einer Hemmung bzw. der Resistenz gegen Hemmung von GTP-Cyclohydrolase II, indem festgestellt wird, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration ähnlich ist zur in Schritt b) bestimmten Konzentration.

Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die zur Verfügungstellung einer Me thode zum Screening chemischer Testproben nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung einer 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität zwecks Auffindung eines Inhibitors.

Der dritte Gegenstand wird erreicht durch eine Methode zum Screening für Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase aktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase-Sequenz und Ribulose-5-phosphat enthält,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung, wobei in die besagte erste Mischung eine vorausbestimmt Menge an spezifischem Inhibitor der besagten 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase eingeschlossen wird,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorherbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Kon zentration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit einer Hemmung, indem festgestellt wird, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration niedriger ist als die in Schritt b) bestimmte Konzentration.

Ein vierter Gegenstand der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer Methode zum Screening von Testproben nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung einer 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität, dergestalt, dass die Testprobe ein Pro fiein enthält, welches eine mutierte, pflanzentypische 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phos phatsynthasesequenz aufweist um ein mutiertes Enzym aufzufinden, welches resistent ist gegen einen spezifischen Inhibitor.

Der vierte Gegenstand wird erreicht durch eine Methode zum Screening für die Anwesen heit oder Abwesenheit von Hemmung gegen 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat synthaseaktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer mutierten, pflanzentypischen 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase-Sequenz sowie Ribulose-5-phosphat enthält,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung, wobei in die besagte erste Mischung eine vorausbestimmt Menge an spezifischem Inhibitor der besagten 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase eingeschlossen wird,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorherbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Kon zentration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit einer Resistenz gegen Hemmung von 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphat-Synthase, indem festgestellt wird, ob die in Schritt d) be stimmte Konzentration ähnlich ist zur in Schritt b) bestimmten Konzentration.

Die Enzymsequenz kann pflanzentypisch sein für das Auffinden von Herbiziden; sie kann pilztypisch sein für das Auffinden von Fungiziden oder sie kann bakterientypische sein für das Auffinden von Inhibitoren gegen pathogene Bakterien.

Zur Durchführung der Screeningmethoden können Reagenziensysteme benützt werden, dergestalt, dass die benötigten Komponenten so partitioniert werden, dass nach Mischung der Teile die enzymatische Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt gestartet werden kann.

Vorzugsweise werden die Enzyme aktiviert durch ein bivalentes Metallion. In diesem Fall kann die Enzymreaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt beendet werden durch Hinzu fügen eines Chelators für das besagte Metallion.

Die Menge des Reaktionsprodukts der Zielenzyme kann direkt oder durch chemische oder enzymatische Derivatisierung bestimmt werden.

Die Konzentration des Produkts kann entweder bestimmt werden zu einem voraus bestimmten Zeitpunkt oder fortlaufend zu verschiedenen vorausbestimmten Zeitpunkten.

Die Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.

Sequenzbestimmung von Pflanzenenzymen

Die bekannte Aminosäuresequenz des RibA-Proteins von B. subtilis (Richter et al., 1993) wurde benutzt um eine Sequenzanalyse durchzuführen mit dem vom Arabidopsis Re source Center, Ohio State University, USA, verfügbarem Arabidopsis thaliana EST Klon 41G4T7, und eine signifikante Ähnlichkeit wurde gefunden mit EST Klon 41G4T7. Es wurde festgestellt, dass diese Sequenzähnlichkeit die 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthasedomäne des RibA-Proteins von B. subtilis betrifft. Dies war erstaunlich, da EST 41G4T7 vorher als Riboflavinsynthase annotiert worden war (Newman et al., 1994).

Das gesamte Insert von EST Klon 41G4T7 wurde sequenziert mit der automatischen Di deoxynukleotidmethode unter Benutzung einer primer walk Strategie. Das insert (bezeichnet als i41G4T7) hatte eine Länge von 2525 bp. Das Segment, welches bp 109- 1297 umfasst ist ähnlich zum ribA-Gen von B. subtilis; die Segmente, welche bp 563-1485 und 2262-2505 umfasst sind identisch mit der A. thaliana-Sequenz D45165 (Genbank/DDJB/EMBL/GSDB/NCBI Accession Nr.), welche als GTP-Cyclohydrolase II (Kobayashi et al., 1995) eingestuft wurde. Das Transposon IS1 war lokalisiert bei bp 1486- 2261.

Der Sequenzvergleich mit dem B. subtilis-Gen ließ vermuten, dass der EST Klon 41G4T7 nicht den gesamten 5'-Teil des untersuchten Gens enthielt. Wir führten deshalb Northern blots durch mit mRNA aus Arabidopisis thaliana var. Columbia unter Benutzung einer Hy bridisierungsprobe, welche erhalten wurde durch Amplifizierung von bp 39-1484 aus Klon 41G4T7. Diese Probe enthielt Teile der mutmaßlichen 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phos phatsynthasedomäne, ebenso wie die mutmaßliche GTP-Cyclohydolase-II-Domäne. Wir fanden eine einzige Bande bei ungefähr 2300 bp.

Um die bekannte Sequenz in die 5'-Richtung auszudehnen wurde ein RACE-Experiment durchgeführt mit reverser PCR unter Benutzung von mRNA aus A. thaliana als Matrize. Das RACE-Produkt, welches eine Länge von 800 bp aufweist wurde sequenziert und ent hielt 556 pb, die im Klon 41G4T7 nicht enthalten waren. Die kodierende Region der er weiterten cDNA enthält 1629 bp, aus denen ein Protein mit 543 Aminosäuren und einer Masse von 59.055 Da vorausgesagt werden kann. Das zugehörige Gen wird als ribA be zeichnet. Die Sequenz wird in Anhang B gezeigt. Die nichttranslatierte 5'-Region ist 284 bp lang. Die nichttranslatierte 3'-Region hat eine Länge von 372 bp.

Der mutmaßlichen 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasedomäne des Arabidopsis- Gens geht eine Sequenz von ungefähr 120 Aminosäuren voraus, die keine Ähnlichkeit besitzt mit irgendeiner Sequenz in der Datenbank. Die ersten 25 Aminosäuren des Pro teins enthalten 13 Serinreste (einschließlich eines Clusters von 4 fortlaufenden Serin resten). 34 Reste in den N-terminalen 120 Aminosäureresten sind Serin oder Threonin.

Das chromosomale ribA-Gen von Arabidopsis wurde in zwei Teilen durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler DNA als Matrize. Die Amplifikate wurden sequen ziert. Es wurde festgestellt, dass dieses Gen (EMBL Datenbank Accession Nr. AJ000053) sechs Introns mit ingesamt 700 bp einschließt.

Komplementationsexperimente

Die kodierende Region des A. thaliana-Gens wurde in den Expressionsvektor pNCO113 (Stüber et al., 1990) eingesetzt. Das resultierende Plasmid hat die Bezeichnung pAE. Die ses Plasmid wurde elektrotransformiert in ribA- und rib8-Mutantenstämme von E. coli mit einem Defekt der 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase bzw. GTP-Cyclohydrolase II, die auf diesem Grund auf LB-Medium ohne Zusatz von Riboflavin nicht wachsen kön nen (Katzenmeier, 1991). Als Negativkontrolle wurde das Plasmid pNCO113 in die Mutan ten transformiert. Die rekombinanten Mutantenstämme, welche das Plasmid mit dem ribA- Gen von Arabidopisis enthalten wachsen mit normaler Geschwindigkeit in Abwesenheit von externem Riboflavin. Daraus folgt, dass das ribA Gen von Arabidopsis die Synthese eines Proteins steuert, welches in E. coli als GTP-Cyclohydrolase II und als 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphatsynthase wirken kann. Das A. thaliana Gen kodiert demnach eine bifunktionelle GTP-Cyclohydrolase II/3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase.

Klonierung des ribA-Gens von Tomate

Ein Gen mit Ähnlichkeit zum ribA Gen von A. thaliana wurde durch PCR aus einer Toma ten-cDNA-Bank unter Verwendung degenerierter Primer amplifiziert. Das DNA-Segment wurde sequenziert unter Benutzung einer primer walk Strategie. Es enthält einen offenen Leserahmen (EMBL Datenbank Accession Nr. AJ002298) mit annähernd der gleichen Größe wie die A. thaliana Gen (Annex C). Die abgeleitete Proteinsequenz enthält 552 Aminosäuren und hat eine berechnete Masse von 59793 Da. Das abgeleitete Protein ist ähnlich zum RibA Protein von A. thaliana. Insbesondere hat es einen Serin- und Threonin reichen N-Terminus von etwa 120 Aminosäuren, welcher der 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthasedomäne vorausgeht. Abgesehen von dem hohen Serin-/Threoningehalt hat der N-Terminus des Tomatengens wenig Ähnlichkeit mit dem A. thaliana N-Terminus. Die folgenden Domänen für 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase und GTP-Cy clohydrolase II sind sehr ähnlich zum Arabidopsis-Enzym.

Durch die hier beschriebene Methode kann die korrespondierende Gen- und Protein sequenz eines beliebigen anderen Organismus bestimmt werden.

Die abgeleitete Aminosäurensequenz des ribA Gens von A. thaliana zeigt auch Ähnlich keit mit bifunktioneller GTP-Cyclohydrolase II/3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat synthasesequenzen von Acfinobacillus pleuropneumoniae und mit mutmaßlichen, bi funktionellen Enzymen aus Bacillus amyloliquefaciens, M. tuberculosis und Synechocystis sp. Das A. thaliana Gen besitzt auch Ähnlichkeit mit Genen von Photobacterium phos phoreum und Photobacterium leiognathi. Die N-terminale 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthasedomäne des A. thaliana Enzyms zeigt Ähnlichkeit zu monofunktionellen 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasesequenzen und zwar nicht nur von Escheri chia coli, sondern auch von H. influenzae und S. cerevisiae. Die C-terminale GTP-Cyclo hydrolase II Domäne zeigt Ähnlichkeit zu monofunktionellen GTP-Cyclohydrolase II Se quenzen und zwar nicht nur von E. coli sondern auch von H. influenzae, S. cerevisiae, Candida guilliermondii, P. phosphoreum und Azospirillum brasilense.

Expression und Reinigung von GTP-Cyclohydrolase II/3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthase aus Pflanzen

Die Konstruktion eines Expressionsvektors geht aus von cDNA einer Pflanze, vorzugs weise einer dicotylen oder monocotylen Pflanze, z. B. cDNA aus Arabidopsis thaliana oder Lycopersicon esculentum. Das ribA Gen wird durch PCR amplifiziert mit spezifischen Pri mern und cDNA aus der korrespondierenden Pflanze als Matrize. In einem veränderten Verfahren kann das Gen in zwei überlappenden Teilen amplifiziert werden. Die zwei Teile werden mit einem Restriktionsenzym in der überlappenden Region geschnitten und an schließend zusammen ligiert unter Bildung des kompletten Gens. Alternativ kann die cDNA für einen oder beide Teile aus einem existierenden EST-Klon hervorgehen. Wenn nur der GTP-Cyclohydrolase II Teil oder der 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat synthaseteil von ribA exprimiert werden soll wird nur der korrespondierende Teil des Gens mit den oben beschriebenen Methoden amplifiziert.

Das RibA Protein aus verschiedenen Pflanzen, z. B. A. thaliana oder L. esculentum schließt eine Signalsequenz von etwa 120 Aminosäuren ein, von der gezeigt werden konnte, dass sie nicht essentiell ist für die Enzymaktivität. Diese Signalsequenz kann aus dem rekombinanten DNA-Konstrukt ausgeschlossen werden.

Das amplifizierte DNA-Fragment wird durch zwei konsekutive PCR-Amplifikationen mit modifizierenden Primern verändert. In der ersten PCR-Reaktion wird eine ribosomale Bin dungsstelle eingeführt, welche am 5'-Ende dem Startkodon in einer optimalen Distanz vorausgeht. Eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, z. B. Sall, BspMl oder Pvul wird am 3'-Ende eingeführt. Die bevorzugte Erkennungssequenz ist Sall. In der zwei ten PCR-Reaktion wird das Produkt der ersten PCR-Reaktion als Matrize benützt. Am 5'- Ende wird mit modifizierenden Primern eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym EcoRl eingeführt, welche der ribosomen Bindungsstelle vorausgeht. Das amplifizierte DNA-Fragment wird mit den korrespondierenden Restriktionsenzymen, z. B. EcoRl und Sall verdaut. Dieses DNA-Fragment wird in eine Vektor-DNA eingesetzt, welche zur auto nomen Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist und ein rekombinantes Plasmid liefert, welches die besagte DNA enthält (Abb. 2). Dieses rekombinante Plasmid wird benutzt um den Wirtsorganismus, z. B. Escherichia coli oder Bacillus subtilis zu transformieren. Der bevorzugte Wirt ist E. coli. Unter Umständen wird das Pflanzenprotein im Wirtsorganismus nur schwach exprimiert. Um das Expressionsniveau zu erhöhen und/oder um die Reini gung des Proteins zu erleichtern kann das rekombinante Plasmid ein Gen oder ein Teil eines Gens einschließen, welches ohne Stoppkodon dem ribA Gen im gleichen Lese rahmen vorangeht. Ein bevorzugtes Gen für diesen Zweck ist das malE Gen von E. coli Die Expression einer derartigen rekombinanten DNA erzeugt ein Fusionsprotein zwischen dem Maltosebindeprotein (MBP) von E. coli und dem pflanzlichen RibA Protein. Verschie dene Konstrukte werden in Abb. 3 gezeigt. Abb. 3A zeigt ein Konstrukt mit einer Signal sequenz S. Abb. 3B zeigt ein Konstrukt einer maltosebindenden Sequenz malE und einer Signalsequenz S und Abb. 3C zeigt ein Konstrukt mit einer maltosebindenen Sequenz malE.

Die Stämme, welche den Expressionsvektor beinhalten können in gebräuchlichen Kultur medien bei 15 bis 40°C kultiviert werden. Das bevorzugte Medium ist Luria-Bertani Me dium und die bevorzugte Temperatur ist 37°C. Die E. coli-Stämme werden induziert mit 0,2 bis 5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid bei einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,8. Die Zellen werden 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 5 Stunden, inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und mit Saline gewaschen. Die Zellen werden mit Lysozym lysiert und/oder mit Ultraschall aufgebrochen. Das MBP-ribA-Fusionsprotein wird durch Affinitätschromatographie mit einem Amyloseharz aus Rohextrakt gereinigt.

Screening für die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclo hydrolase-II-Aktivität

GTP wird durch die Einwirkung von GTP-Cyclohydrolase II in 2,5-Diamino-6-ribosylamino- 4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat verwandelt. Das Enzym kann aktiviert werden durch zwei wertige Metalle wie z. B. Ba²⁺, Ca²⁺, Sr, Co²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ oder Zn²⁺. Das bevorzug te Ion ist Mg²⁺. Die Reaktionsmischung soll vorzugsweise eine antioxidative Substanz wie z. B. Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), Butylhydroxyanisol (BHA) oder Butyl hydroxytoluol (BHT) enthalten. Der Test kann gestartet werden, indem eine der benötigten Substanzen einer Mischung der anderen hinzugefügt wird. Vorzugsweise wird das Enzym zu einer Lösung von GTP, Mg²⁺, DTT in einem Puffer bei pH 6 bis 9,5, vorzugsweise 8,5, hinzugefügt. Die Reaktionsmischung kann 1 bis 60 Min. bei 10 bis 40°C inkubiert werden, vorzugsweise erfolgt die Inkubation für 20 Min. bei 37°C. Der Test kann gestoppt werden durch Denaturierung des Enzyms mit Trichloressigsäure, Aceton, Natriumdodecylsulfat oder durch Erhitzen auf Temperaturen zwischen 60 und 100°C. Der Test kann auch ge stoppt werden durch Komplexierung des Metallions mit einem Chelatkomplexbildner wie z. B. EDTA, Iminodiessigsäure, 8-Hydroxychinolin, Diphenylcarbazid, Dithizon oder Glyoxyl-bis-(2-hydroxyanil). Das bevorzugte Komplexierungsmittel ist EDTA.

Der Test wird ausgeführt mit Mischungen, die sich nur durch die Anwesenheit oder Ab wesenheit eines möglichen Inhibitors unterscheiden. Das Enzymprodukt, 2,5-Diamino-6- ribosylamino-4(3H)-pyrimidin-5'-phosphat kann ohne Derivatisierung direkt detektiert wer den, vorzugsweise photometrisch, insbesondere nach Reinigung durch HPLC. Das Pyri midinon kann identifiziert werden durch UV-Absorption bei 293 nm. Der Extinktions koeffizient ist 12.100 M^-1 cm^-1. Das Produkt kann auch nachgewiesen werden durch Multi wellenlängendetektion (200-600 nm) mit einem Diodenarray-Photometer. Der Test kann auch in Quarzküvetten ausgeführt werden ohne die Reaktion zu stoppen. Die Reaktions rate kann dann direkt bestimmt werden durch Messung der Absorption von GTP bei 252 nm und von 2,5-diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat bei 293 nm.

Das Pyrimidinon kann auch nachgewiesen werden durch chemische Derivatisierung, vor zugsweise durch Reaktion mit einer vicinalen Dioxoverbindung (Abb. 4). Bevorzugt wer den vicinale Diketoverbindungen der Formel R¹-CO-CO-R², wobei R¹ und R² unabhängig aliphatische, alizyklische, aromatische oder heteroaromatische Reste sind, z. B. Diphenyl diketon, Phenylmethyldiketon, Campherquinon; vorzugsweise C_1-6-Alkylreste. Das bevor zugte Diketon ist Diacetyl (2,3-Butandion) (8). Die Reaktion mit 2,5-Diamino-6-ribosyl amino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat ergibt 6,7-Dimethylpterin (9), welches fluorometrisch bei einer Exzitationswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 435 nm nachgewiesen werden kann.

Die GTP-Cyclohydrolase II Aktivität kann auch nach enzymatischer Derivatisierung nach gewiesen werden, vorzugsweise durch Überführung von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-(3H)- pyrimidinon-5'-phosphat in 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'-phosphat (10) durch die Einwirkung einer 2,5-Diamino-6-ribosylamino-(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat reduktase aus einem Pilz, vorzugsweise aus Hefe (Abb. 4). Für die Sequenz wird auf An nex D hingewiesen. Diese Reduktase kann in E. coli mit gebräuchlichen molekularbiologi schen Techniken mit zusätzlichen N- oder C-terminalen Histidinresten exprimiert werden. Dabei dient DNA aus Saccharomyces cerevisiae als Matrize. Vor der Benutzung im En zymtest muss die Reduktase gereinigt werden, z. B. durch Chromatographie einer Metall chelataffinitätssäule. Die Umwandlung benötigt NADPH oder NADH als Cosubstrat. Die Menge des 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphats kann berechnet werden durch den Verbrauch von NADH, welcher photometrisch bei 340 nm bestimmt wird.

Das Screening kann durchgeführt werden mit einem bifunktionellen Enzym einer mono cotyledonen oder dicotyledonen Pflanze. Es ist auch möglich nur die GTP-Cyclohydrolase II Domäne in einem ersten Screeningschritt und das bifunktionelle Enzym in einem zwei ten Screeningschritt zu verwenden. Auch ein bakterielles oder pilzliches Enzym kann be nutzt werden.

Screening für die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität

Ribulose-5-phosphat wird in 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat überführt durch Ein wirkung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase. Das Enzym benötigt ein zwei wertiges Metallion wie z. B. Ba, Ca²⁺, Sr²⁺, Co²⁺, Fe, Mg, Mn oder Zn²⁺. Das bevor zugte Ion ist Mg²⁺. Der Test kann gestartet werden durch Hinzufügen einer der benötigten Substanzen zu einer Mischung der anderen Substanzen. Vorzugsweise wird das Enzym zu einer Mischung von Ribulose-5-phosphat und Mg²⁺ in Puffer von pH 6 bis 9,5, vor zugsweise 7,5 hinzugefügt. Der Test wird mit im übrigen identischen Mischungen mit und ohne Zusatz einer Testprobe eines möglichen Inhibitors ausgeführt. Die Reaktions mischung kann 1 bis 90 Min. bei 10 bis 40°C inkubiert werden. Vorzugsweise wird sie 60 Min. bei 37°C inkubiert. Das Substrat für 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase, Ribulose-5-phosphat ist kommerziell erhältlich aber zu relativ hohen Kosten. Es wird vor zugsweise in situ erzeugt durch Isomerisierung von Ribose-5-phosphat, welche durch Pentosephosphatisomerase katalysiert wird. In diesem Fall wird eine Mischung, welche Pentosephosphatisomerase, Ribose-5-phosphat und Mg²⁺ in einem Puffer bei pH 6 bis 9,5 enthält vor der Zugabe von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat und optional der Testverbindungen 1 bis 20 Min. inkubiert. Der Test kann gestoppt werden durch Komplexierung des Metallions mit einem Chelatkomplexbildner wie z. B. EDTA, Iminodiessigsäure, 8-Hydroxychinolin, Diphenylcarbazid, Dithizon oder Glyoxal-2-bis-(2- hydroxyanil). Das bevorzugte Komplexierungsmittel ist EDTA. Zum Zweck der Detektion kann eine enzymatische Derivatisierung durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Produkt 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat enzymatisch mit 5-Amino-6-ribitylamino- 2,4(1H,3H)-pyrimidindion zu 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin in Anwesenheit von 6,7-Di methyl-8-ribityllumazinsynthase oder zu Riboflavin in Anwesenheit von 6,7-Dimethyl-8-ribi tyllumazinsynthase und Riboflavinsynthase umgesetzt. 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)- pyrimidindion zersetzt sich schnell in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff und muss deshalb als wässrige Lösung unter Zusatz von antioxidativen Substanzen wie z. B. Dithio threitol (DTT) oder Dithioerythritol (DTE) bei Temperaturen unter 0°C aufbewahrt werden. Der Test kann gestoppt werden und die Detektionsreaktion kann gestartet werden durch Hinzufügen einer Lösung eines Komplexbildners, 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-py rimidindion, einer antioxidativen Substanz, 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase und wahlweise Riboflavinsynthase (Abb. 5). Nach Inkubation bei 20 bis 40°C für 10 bis 60 Min. kann die Detektionsreaktion gestoppt werden durch Denaturierung des Enzyms mit Trichloressigsäure, Aceton, Natriumdodecylsulfat oder durch Erhitzen auf Temperaturen zwischen 60 bis 100°C. 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin kann photometrisch bei 410 nm nachgewiesen werden wenn nur die Lumazinsynthase hinzugefügt wird. Riboflavin kann photometrisch bei 495 nm detektiert werden wenn die Lumazinsynthase und die Ribo flavinsynthase hinzugefügt werden. Der Extinktionskoeffizient für Riboflavin (pH 1, 445 nm) ist 11.500 M^-1cm^-1. Der Extinktionskoeffizient für 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (pH 1, 410 nm) ist 10.300 M^-1cm^-1. Es werden zwei Moleküle 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phos phat benötigt für die Bildung eines Moleküls Riboflavin.

3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat kann auch nach chemischer Derivatisierung vor zugsweise mit einem aromatischen oder heteroaromatischen Orthodiamin nachgewiesen werden (Abb. 5). Der aromatische oder heteroaromatische Ring kann substituiert oder unsubstituiert sein. Er kann 1 bis 3 Substituenten aus der Gruppe Alkyl, Halogen oder Al koxy enthalten.

Es ist möglich das bifunktionelle Enzym aus einer monocotyledonen oder dicotyledonen Pflanze zu benützen. Es ist auch möglich nur die 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat synthasedomäne in einem ersten Screeningschritt und das bifunktionelle Enzym in einem zweiten Reaktionsschritt zu benützen. Es ist außerdem möglich ein bakterielles oder Pil zenzym zu benützen.

Die oben beschriebenen Screeningmethoden können nach entsprechender Modifizierung zum Screening nach Hemmungsresistenz benützt werden. Es ist lediglich erforderlich einen spezifischen Inhibitor hinzuzufügen (der vorher durch Screening ermittelt wurde) und ein biologisches Testmaterial zu verwenden, welches eine Mutante des fraglichen Pflanzentypenzyms enthält.

Im folgenden wird die Erfindung durch spezifische Beispiele beschrieben.

Referenzbeispiel 1 Isolierung des A. thaliana-ribA-Gens

1 g 2 Wochen alte Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stängel und Blätter) wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. 8 ml 50 mM Trinatriumcitrat mit einem Gehalt von 600 g Guanidinthiocyanid, 5 g Natrium-N-lauroylsarcosin und 5 ml 2-Mercaptoethanol pro Liter wurden zugefügt. Die Mischung wurde vorsichtig zu 3 ml einer sterilen Lösung mit einem Gehalt von 959 g CsCI und 37,2 g EDTA pro Liter hinzugefügt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 18°C und 33.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde an der Luft 10 Min. getrocknet. Das Pellet wurde in 360 µl bidestilliertem, sterilem H₂O gelöst. Die Lösung wurde bei 14.000 UpM 10 Min. zen trifugiert. Der Überstand wurde mit 40 µl 3 M Natriumacetat und 1 ml Ethanol gemischt. Die RNA wurde über Nacht bei -20°C gefällt, bei 4°C und 14.000 UpM 15 Min. zentrifu giert und zwei mal mit 500 µl 75% Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in 500 µl bidestilliertem, sterilem H₂O gelöst. mRNA wurde aus dieser RNA-Roh fraktion mit dem Oligotex nRNA-Isolation Kit (Qiagen) isoliert. Die RNA-Lösung (500 µl) wurde mit 500 µl 20 mM Tris Hydrochlorid, pH 7.5 mit einem Gehalt von 1 M NaCl, 2 mM EDTA und 0,2% SDS gemischt. 30 µl Oligotex-Suspension wurde zugefügt und die Mischung wurde 3 Min. bei 65°C und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde 2 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde abgedampft. Das Pellet wurde zwei mal mit 1 ml 10 mM Tris Hydrochlorid, pH 7,5 mit einem Gehalt von 150 mM NaCl und 1 mM EDTA gewaschen. Die mRNA wurde zwei mal mit 50 µl auf 70°C erwärmtem 5 mM Tris Hydrochlorid Puffer, pH 7.5 gewaschen.

A. thaliana mRNA (4 µg) wurde bei 40 V der Elektrophorese auf einem 2, 2 M Form aldehyd 1% Agarosegel unterworfen. 4 µl einer RNA-Leiter (Gibco) wurde als Referenz elektrophoretisiert. Die Referenzspur wurde abgeschnitten und mit einer 0,1% Toluidine blau-Lösung 10 Min. gefärbt. Der andere Teil des Gels wurde 4 mal mit H₂O (DEPC-be handelt) gewaschen und über Nacht auf eine Nytrans Nylon Membran übertragen unter Benutzung von 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0 mit einem Gehalt von 3 M NaCl und unter Benutzung des Turboblottersystems von Schleicher und Schüll.

Die Probe wurde von Plasmid 41G4T7 durch PCR amplifiziert. Das Plasmid wurde aus 5 ml einer frischen Übernachtkultur des EST-Klons 41G4T7 unter Benutzung des Mini plasmid Isolation Kit von Qiagen isoliert. Das Bakterienpellet wurde resuspendiert in 0,3 ml 50 mM Tris Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt von 10 mM EDTA und 100 µg/ml RNase. 0,3 ml 200 mM Natriumhydroxid mit einem Gehalt von 1% SDS wurden hinzu gefügt und die Mischung wurde 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml gekühltes 3,0 M Natriumacetat, pH 5, 5 wurden hinzugefügt und die Mischung wurde 10 Min. auf Eis in kubiert. Die Mischung wurde 15 Min. bei 14.000 UpM in einer Minifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und auf einen Qiagen-Tip 20 aufgebracht, welcher vor äquilibriert war mit 1 ml 50 mM MOPS, pH 7,0 mit einem Gehalt von 750 mM NaCl, 15% Ethanol und 0,15% Triton X-100. Der Qiagen-Tip wurde 4 mal mit 1 ml 50 mM MOPS, pH 7,0 mit einem Gehalt 1000 mM NaCl und 15% Ethanol gewaschen. Die DNA wurde mit 0,8 ml 50 mM Tris Hydrochlorid, pH 8,5 mit einem Gehalt von 1250 mM NaCl und 15% Ethanol eluiert. Die DNA wurde mit 0,7 Volumina Isopropanol gefällt, bei 14.000 UpM 30 Min. zentrifugiert und mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen. Die DNA-Sequenz von 41G4T7 wurde vorher durch eine primer walk Strategie bestimmt. Die Sequenzierung erfolgte mit der automatisierten Didesoxynukleotidmethode unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA Sequenators von Applied Biosystems Inc. mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software. EST-Klon 41G4T7 wurde vom Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, USA erhalten. Die PCR-Mixtur enthielt 25 µmol Primer CTCCTCCTGCACCAGCCAATGG, 25 µmol Primer TCAAGTTTCTCAGACAGATCAAATG, 2 U Taq Polymerase, 10 ml Puffer (Primezyme, Biometra), 1,6 ng Plasmid 41G4T7 und 20 nmol dNTPs in einem Gesamtvolumen von 100 µl H₂O.

Die Mixtur wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann wurden 25 Zyklen (30 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 90 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach Inkubation bei 72°C für 7 Min. wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde gereinigt mit einem PCR Reini gungskit (Qiagen). 5 Volumina Puffer PB (Qiagen) wurden zu einem Volumen der PCR- Reaktion hinzugefügt, auf eine Qiaquicksäule aufgebracht und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wurden der Säule hinzugefügt. Es wurde zentrifugiert wie oben beschrieben. Das Eluat wurde verworfen und die Säule wurde für eine weitere Minute bei 14.000 UpM zentrifugiert. Die Säule wurde in ein sauberes 1,5 ml Eppendorfröhrchen platziert. 50 µl bidestilliertes, steriles H₂O wurden der Säule zugefügt. Anschließend wurde 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat enthält die gereinigte DNA. 105 ng der gereinigten DNA in 15 µl H₂O wuden bei 100°C 5 Min. erhitzt. Nach Kühlung auf Eis wurden 5 µl Puffer mit Zufalls-Hexamer-Primern, dATP, dGTP, dTTP, 5 µl ³²P-dCTP (50 µCi) und 0,8 µl Klenow Polymerase (4 U) zugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde inkubiert. Die Sonden-DNA (Bp 39-1484 aus EST-Sequenz 41G4T7) wurde zwei mal mit 2 M (NH₄)₂SO₄ gefällt. Das Pellet wurde in 200 µl H₂O aufgelöst.

Die Membran wurde vorhybridisiert in einer Mischung aus 50% Formamid, 50% SSPE/Denhards Lösung/SDS (1,0 g Ficoll, 1,0 g Polyvinylpyrrolidon, 1,0 g BSA, 87,6 g NaCl, 13,8 g NaH₂PO₄, 3,7 g EDTA, 10 g SDS pro Liter). Es wurde 1 Stunde bei 42°C inkubiert. 200 µl Sonde wurden hinzugefügt und die Hybridisierung erfolgte bei 42°C in 50 % Formamid, 50% SSPE/Denhards Lösung/SDS für 12 Stunden. Die Membranen wur den dann zwei mal für 15 Min. mit 2×SSPE mit einem Gehalt von 0,1% SDS bei Raum temperatur gewaschen. Die radioaktiven Banden wurden 3,5 Stunden auf einem Photo imager (Molecular Dynamics) detektiert. Es wurde eine einzige Bande bei 2300 pb gefun den.

Ein 5'-RACE-Experiment wurde mit dem 5'-RACE-System von Gibco BRL ausgeführt. Die cDNA wurde erzeugt mit einem spezifischen Primer aus A. thaliana RNA. Die Mischung enthielt 2,5 pmol des Primers TCAACAGATGCTTCAGTGTGTCC und 990 ng von A. tha liana RNA in einem Gesamtvolumen von 15 µl. Die Mischung wurde 10 Min. bei 70°C denaturiert und dann auf Eis gekühlt. 2,5 µl 10× Reaktionspuffer (Gibco), 3 ml 25 mM MgCl₂, 1 µl 10 mM dNTPs und 2,5 µl 0,1 M Dithiothreitol wurden zugefügt. Die Mischung wurde 2 Min. bei 42°C inkubiert. 1 µl (200 U/µl) reverse Transkriptase SuperscriptII (Gibco) wurden zugefügt. Die Mischung wurde 15 Min. bei 65°C inkubiert. Sie wurde zen trifugiert. Die Temperatur wurde auf 55°C eingestellt und 1 µl RNAseH (2 U/µl) wurde zu gefügt. Nach weiteren 10 Min. Inkubation bei 55°C wurde die Mischung auf Eis gekühlt.

Anschließend wurde die cDNA unter Benutzung eines Ankerprimers (Gibco BRL) und eines spezifischen, verschachtelten Primers (CCTTCATTTTCCCTATCTTCATCATC) amplifiziert. Das Produkt wurde durch Elektrophorese in einem 2% Agarosegel gereingt. Die Bande bei 800 bp wurde unter Benutzung eines Gelextraktionskits (Qiagen) extrahiert und sequenziert. Das DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel mit einem Skalpell exzi tiert. 3 Volumina Puffer QX1 (Qiagen) wurden zu einem Volumen des exzitierten Gels hin zugefügt. Die Mischung wurde 10 Min. bei 50°C inkubiert. Ein Gelvolumen Isopropanol wurde zugefügt. Um DNA zu binden wurde die Probe auf eine Qiaquicksäule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wurden zu der Säule hinzugefügt und es wurde erneut zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und die Säule wurde erneut 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Die Säule wurde in ein sauberes Eppendorfröhrchen platziert. 50 µl bidestilliertes, steriles H₂O wurden der Säule hinzugefügt und es wurde 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat enthielt 4,2 µg der gereinigten DNA.

Referenzbeispiel 2 Konstruktion eines Expressionsklons

Unter Benutzung des EST-Klons 41 G4T7 als Matrize wurde das cDNA-Insert von bp -75 bis 1485 durch PCR amplifiziert. Die Reaktionsmischung enthielt 10 µmol des Primers TCAAGTTTCTCAGACAGATCAAATG, 10 µmol Primer GAAACAGCTATGACCATGATTACG, 4,5 ng Plasmid 41G4T7, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra) und 20 nmol dNTPs in einem Gesamtvolumen von 100 µl.

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 25 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 60 Sec. bei 50°C, 120 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach Inkubation für weitere 7 Min. bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR- Purifikationkit (Qiagen) gereinigt. Das PCR-Produkt und das RACE-Produkt (von Refe renzbeispiel 1) wurde mit Restriktionsenzym Bsgl (New England Biolabs) verdaut. Die Mi schung enthielt 5 µl New England Biolabs Puffer 4, 1 ml S-Adenosylmethionin (4 mM), 5 µl Bsgl (7,5 U), 40 µl PCR-Produkt (1,6 µg) bzw. 40 µl RACE-Produkt (3,2 µg).

Beide Fragmente wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, wie vorher beschrieben ge reinigt und mit T4-Ligase zusammenligiert. Die Reaktionsmischung enthielt 4 µl 5 × Puffer (Gibco), 1 µl T4-Ligase (4 U), 2 µl PCR-Produkt (60 fmol), 0,5 µl RACE-Produkt (65 fmol) und 12,5 µl H₂O.

Die Mischung wurde 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Das vervollständigte Gen wurde durch PCR mit spezifischen terminalen Primern amplifiziert. Am 5'-Ende wurde durch PCR mit modifizierenden Primern eine EcoRl-Stelle eingefügt, welche einer Ribosomenbindungs stelle mit einem optimalen Abstand vom Startkodon vorausgeht. Am 3'-Ende wurde hinter dem Stoppkodon durch PCR mit modifizierenden Primern eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Sall eingefügt.

Erste PCR

Die Reaktionsmischung enthielt 10 µmol Primer GAGGAGAAATTAACTATGTCTTCCATCAATTTATCCTC, 10 µmol Primer ACGCGTGGACGGTTCGTCCTGGTTTTTAAGC, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra), 1 µl Ligationsmixtur und 20 nmol dNTPs in einem Gesamt volumen von 100 µl.

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann wurden 25 Zyklen (60 Sec. bei 94 °C, 60 Sec. bei 50°C, 120 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde auf einem 0,8% Aga rosegel elektrophoretisiert. Die Bande bei 1650 bp wurde mit einem Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt.

Zweite PCR (Es wurden zwei identische PCRs mit je 100 µl ausgeführt um eine größere Ausbeute zu erhalten)

Die Reaktionsmischung enthielt 10 µmol Primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG, 10 µmol Primer ACGCGTCGACGGTTCGTCCTGGTTTTTAAGC, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra), 4 µl gereinigtes PCR1-Produkt und 20 nmol dNTPs in einem Ge samtvolumen von 100 µl.

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann wurden 25 Zyklen (60 Sec. bei 94 °C, 60 Sec. bei 50°C, 120 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Purifi cation Kit (Quiagen) gereinigt. Plasmid pNCO113 (Stüber et al., 1990) wurde isoliert wie für das Plasmid 41G4T7 in Referenzbeispiel 1 beschrieben.

Das PCR-Produkt und das Plasmid pNCO113 wurden mit dem Restriktionsenzym Sall verdaut. Die Reaktionsmischung enthielt 10 µl Sall Puffer (NEB), 1 µl BSA (100 µg/ml), 40 U Sall (NEB), 2,4 µg PCR2-Produkt bzw. 4,2 µg pNCO113 in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei 37°C inkubiert, mit einem PCR Puri fication Kit (Qiagen) gereinigt und verdaut mit dem Restriktionsenzym EcoRl (20 µl OPA Puffer (Pharmacia), 48 µl Sall-verdautes PCR2-Produkt bzw. 48 µl Sall-verdautes pNCO113, 2 µl (20 U/µl) EcoRl (Pharmacia) und 30 Pl H₂O) bei 37°C für weitere 2 Stun den verdaut und anschließend gereinigt mit einem PCR-Reinigungskit. Das verdaute PCR2-Produkt und Plasmid pNCO113 wurden zusammen ligiert mit T4-Ligase unter Bildung des Plasmids pAE: 44 fmol pNCO113, 111 fmol PCR2-Produkt, 4 µl Puffer (Gibco), und 1 µl T4-Ligase (1 U) in einem Gesamtvolumen von 20 µl.

Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert, mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und in elektrokompetente E. coli-XLI Zellen durch Elektroporation transformiert.

Herstellung der elektrokompetenten Zellen: Ein Liter Luria-Bertani-Medium wurde mit 1/100 Volumen frischer Übernachtkultur beimpft. Die Zellen wurden bei 37°C unter kräfti gem Schütteln bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,7 wachsen gelassen. Die Zellen wurden 20 Min. auf Eis gekühlt und in einem kalten Rotor 15 Min. bei 4.000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und der Niederschlag wurde in 1 Liter eiskaltem, sterilem 10% Glycerol suspendiert. Die Zellen wurden zwei mal wie vorher beschrieben zentrifugiert und beim ersten mal in 0,5 Liter und beim zweiten mal in 20 ml eiskaltem, sterilem 10% Glycerol suspendiert. Die Zeilen wurden nochmals zentrifugiert und der Niederschlag wurde zu einem Endvolumen von 2 bis 3 ml in eiskaltem 10% Glycerol suspendiert. Die Suspension wurde in Aliquots von 80 µl eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.

Elektrotransformation unter Benutzung des Gene Pulser Apparats von Biorad: Die elek trokompetenten Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und auf Eis gestellt. 40 µl der Zellsuspension wurden mit 1 µl der Ligationsmischung gemischt und in eine sterile 0,2 cm Küvette (Biorad) übertragen. Die Suspension wurde auf den Küvettenboden geschüt telt und die Küvette wurde in den Küvettenschlitten platziert. Der Küvettenschlitten wurde in die Kammer geschoben und ein Puls (2,50 kV, 25 µF, Pulse Controller 200 Q) wurde appliziert. Die Küvette wurde aus dem Schlitten entnommen und die Zellen wurden suspendiert in 1 ml SOC-Medium (2% Caseinhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glukose). Die Suspension wurde 1 Stunde bei 37°C geschüttelt und auf LB-Medium mit einem Zusatz von 150 mg Ampicillin pro Liter ausplattiert. Plasmide aus verschiedenen Klonen wurden isoliert (pAE1-pAE11) wie beschrieben in Referenzbeispiel 1 für 41G4T7.

Referenzbeispiel 3 Konstruktion eines malE-ribA-Fusionsklons

Das ribA Gen wurde durch PCR amplifiziert unter Benutzung von Plasmid pAE11 (aus A. thaliana ribA Expressionsklon) als Matrize. Plasmid pAE11 wurde isoliert wie für Plasmid 41G4T7 (in Referenzbeispiel 1) beschrieben. Eine Erkennungsstelle für das Restriktions enzym EcoRl wurde am 5'-Ende vor dem Startkodon durch einen modifizierenden Primer eingeführt.

PCR Mischung: 10 µmol Primer GTTCAGAATTCATGTCTTCCATCAATTTATCCTC, 10 pmol Primer ACGCGTCGACGGTTCGTCCTGGTTTTTAAGC, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra), 1,7 ng Plasmid pAE11, und 20 nmol dNTPs in einem Ge samtvolumen von 100 µl.

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann wurden 25 Zyklen (60 Sec. bei 94 °C, 60 Sec. bei 50°C, 120 Sec. bei 72°C) durchgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung bei 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Reini gungskit (Qiagen) gereinigt.

Das PCR-Produkt und das Plasmid pMal-c2 (New England Biolabs) wurde 2 Stunden bei 37°C verdaut mit dem Restriktionsenzym Sall (10 µl Sall Puffer (NEB), 1 µl BSA 100 µg/ml, 60 U Sall (NEB), 2,0 µg PCR-Produkt bzw. 0,4 µg pMal-c2 in einem Gesamt volumen von 100 µl), mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt und weitere 2 Stunden bei 37°C verdaut mit dem Restriktionsenzym EcoRl (20 µl OPA Puffer (Pharmacia), 48 µl Sall-verdautes PCR-Produkt bzw. 48 µl Sall-verdautes pMal-c2, 3 µl EcoRl (20 U/µI) (Pharmacia) und 30 µl H₂O) und mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt. Das verdaute PCR-Produkt und Plasmid pMal-c2 wurden zusammen ligiert mit T4-Ligase unter Bildung von Plasmid pMal_ribA: 9 fmol pMal-c2, 30 fmol PCR-Produkt, 4 µl Puffer (Gibco) und 1 µl T4-Ligase (1 U) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Die Mischung wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Dieses Plasmid enthält das A. thaliana ribA Gen im gleichen Leserahmen wie das MaIE Gen, woraus sich die Expression eines MBP-RibA Fusions proteins nach Induktion mit IPTG ergibt. Das Plasmid pMal ribA wurde in E. coli XLI Zel len durch Elektroporation transformiert wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben.

Referenzbeispiel 4 Konstruktion eines malE-ribA-Fusionsklons ohne Transit-Peptid-Sequenz

Das ribA Gen unter Ausschluss der ersten 384 bp, welche für eine vermutete Signal sequenz kodieren wurde durch PCR amplifiziert unter Benutzung von Plasmid pAE11 (aus A. thaliana ribA Expressionsklon) als Matrize. Am 5'-Ende wurde vor Serin128 mit einem modifizierenden Primer eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym EcoRl ein geführt.

PCR-Mischung: 10 µmol Primer GTTCAGAATTCTCTTCTATCCCCGAGGC, 10 µmol Pri mer ACGCGTCGACGGTTCGTCCTGGTTTTTAAGC, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra), 1,7 ng Plasmid pAE11 und 20 nmol dNTPs in einem Gesamt volumen von 100 µl.

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann wurden 25 Zyklen (60 Sec bei 94 °C, 60 Sec. bei 50°C, 120 Sec. bei 72°C) durchgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Reini gungskit (Qiagen) gereingt.

Die weiteren Schritte waren analog zur Konstruktion von pMal_ribA in Referenzbeispiel 3. Das Plasmid, welches ein MBP-RibA Fusionsprotein ohne die mutmaßliche Transit Peptid Sequenz von RibA kodiert wurde als pMal_ribAS bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 1 Herstellung und Reinigung des MBP-RibA-Fusionsproteins

0,5 l Luria-Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt an 75 mg Ampicillin wurden beimpft mit einer 20 ml Übernachtkultur von E. coli Stamm XLI, welcher das Plasmid pMal_ribA bzw. pMal_RibAS enthielt. Die Kultur wurde in Schüttelkolben bei 37°C inkubiert. Bei einer op tischen Dichte (600 nm) von 0,8 wurde die Kultur mit 1 mM IPTG induziert. Die Kultur wurde für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet durch 20-minütige Zen trifugation bei 5000 UpM und 4°C. Die Zellen wurden mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen, wie oben beschrieben zentrifugiert und zur Lagerung bei -20°C eingefroren.

Die Zellen wurden in 10 ml 20 mM Tris Hydrochlorid, pH 7,4 mit einem Gehalt von 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Dithiothreitol und 1 mg Lysozym (Puffer A) aufgetaut. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sec. mit Ultraschall behandelt (Branson Sonifier Stufe 4). Die Suspen sion wurde 20 Min. bei 4°C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 : 5 mit Puffer A verdünnt und auf eine 1 ml Säule aus Amyloseharz (New England Biolabs) auf getragen, welche voräquilibriert war mit 8 ml Puffer A. Die Säule wurde mit 12 ml Puffer A ohne Lysozym gewaschen. Das Fusionsprotein wurde von der Säule mit 4 ml 20 mM Tris Hydrochlorid, pH 7,4 mit einem Gehalt von 200 mM NaCl, 1 mM EDTA und 10 mM Maltose eluiert, Es wurden 9,8 mg MBP-ribAS und 5,6 mg MBP ribA Protein erhalten. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE identifiziert. MBP-ribAS zeigte eine Bande bei 89 kDa und MBP ribA zeigte eine Bande bei 102 kDa.

Herstellungsbeispiel 2 "Reduktase" Konstruktion und Reinigung eines 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5-phos phatreduktase Expressionsklons

Eine PCR-Reaktion wurde ausgeführt mit 10 pmol Primer CATGCCATGGGTTCTTTGACACCACTGTGTGAAG, 10 pmol Primer TATTATGGATCCTTAGTCATCGGCCAGTCTCGC, 2 U Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Primezyme, Biometra), 20 nmol dNTPs und 30 ng Saccharomyces cerevisiae DNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischung wurde bei 94°C 5 Min. denaturiert. Dann wurden 30 Zyklen ausgeführt (30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 50°C, 90 Sek. bei 72 °C). Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Das PCR-Produkt und das Plasmid pNCO-H6 wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und BamHl 3 Stunden bei 37°C verdaut (20 µl OPA Puffer (Pharmacia), 40 U BamHl, 40 U Ncol und 2,5 µg PCR-Produkt bzw. 1 µg pNCO-H6 in einem Gesamtvolumen von 100 µl). Die verdaute DNA wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt und zusammen ligiert mit T4- Ligase (40 fmol pNCO-H6, 80 fmol PCR-Produkt, 4 µl Puffer (Gibco), 1 U T4-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µl). Die Mischung wurde über Nacht inkubiert, mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt und in elektrokompetente E. coli XL1 Zellen trans formiert wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben.

Plasmid pNCO-H6 ist im wesentlichen identisch mit Plasmid pNCO113 (siehe Referenz beispiel 2), wobei die DNA-Sequenz zwischen der Ncol und BamHl Erkennungsstelle er setzt ist durch die DNA Sequenz: CATGCACCACCACCACCACCACGCGTCCATGGCCGCGGATCC.

0,5 l Luria-Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt an 75 mg Ampicillin wurden beimpft mit 20 ml einer Übernachtkultur von E. coli Zellen, welche das Plasmid pNCO-H6 mit dem Gen für 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5-phosphatreduktase enthielten. Die Kultur wurde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,8 wurde die Kultur mit 1 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 5000 UpM geerntet. Die Zellen wurden mit 0,9% Saline gewaschen und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Zellen wurden in 10 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5 mit einem Gehalt von 0,6 mM Phenylsulfonylfluorid suspendiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit Ultraschall behandelt (Branson Sonifier Stufe 4). Die Suspension wurde 4 Min. bei 15.000 UpM und 4°C zentrifugiert. Der Überstand enthielt ungefähr 80 mg Pro tein und wurde auf eine HiTrap (Pharmacia) Metalchelataffinitätssäule (Volumen 5 ml) aufgebracht, welche mit Ni²⁺-Ionen beladen war. Die Säule wurde mit 50 ml 50 mM Phos phatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidin-5-phos phatreduktase wurde mit 10 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5 mit einem Gehalt von 500 mM Imidazol eluiert. Das Eluat wurde durch SDS-PAGE analysiert. Die gewünschte 2,5- Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidin-5-phosphatreduktase hat ein Molekulargewicht von 27 kDa.

Screeningbeispiel 1 Screening von GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität

Testmischungen enthielten 100 mM Tris Hydrochlorid pH 8,5, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithio threitol, 1 mM GTP und 20 µl (80 µg) Enzymprobe in einem Volumen von 80 µl wie in Ta belle 1 angegeben. Separat wurde zu diesen Mischungen 0,5 und 5,0 mM Natriumpyrophosphat, 0,5 und 5,0 mM Methylenbisphosphonat zugefügt. Sie wurden 30 Min. bei 37°C inkubiert. Eine Derivatisierungslösung (20 µl) von 5% Diacetyl und 250 mM EDTA wurde zugefügt und jede Mischung wurde 1 Stunde bei 90°C inkubiert. Das Diacetyl reagiert mit dem Enzymprodukt unter Bildung von 6,7-Dimethylpterin, welches anschließend durch Reverse-Phase-HPLC auf einer Säule von Nucleosil RP18 gemessen wurde. Der Eluent enthielt 100 mM Ammoniumformiat und 25% Methanol. Das Eluat wurde fluorometriert (Excitation 365 nm; Emission 435 nm). Eine Einheit Enzymaktivität katalysiert die Bindung von 1 nmol 2, 5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'- phosphat pro Stunde bei 37°C.

Screeningbeispiel 2

Testmischungen enthielten 100 mM Tris Hydrochlorid pH 8,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithio threitol, 0,5 mM GTP und 20 µl Enzymprobe. Zu diesen Mischungen wurden 0,25 und 2,5 mM 2,6-Diamino-5-formamidopyrimidinon oder 0,25 und 2,5 mM 1-Hydroxyethyliden-1,1- bisphosphorsäure separat hinzugefügt und die Mischungen wurden bei 37°C 30 Min. in kubiert. Die weiteren Schritte waren identisch mit dem Screeningbeispiel 1.

Tabelle 1

Screeningbeispiel 3

Das Screeningbeispiel 1 wird wiederholt mit dem Unterschied, dass die Derivatisierungs lösung nicht zugefügt wird. Stattdessen enthält die Reaktionsmischung zusätzlich 100 µg 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidin-5'-phosphatreduktase und 0,1 mM NADH und das Gesamtvolumen ist 500 µl. Die Testmischung wird in einer Küvette bei 37°C inkubiert und die Absorption bei 340 nm wird gemessen. Dies gibt die Rate des verbrauchten NADH, welche äquivalent ist zur Rate des gebildeten 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)- pyrimidin-5'-phosphats.

Screeningbeispiel 4

Testmischungen enthalten 100 mM Tris Hydrochlorid pH 8,5, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithio threitol, 1 mM GTP und 20 µl Enzymprobe (80 µg MBP-ribA) in einem Gesamtvolumen von 80 µl. Analoge Mischungen enthalten zusätzlich 0,5 und 5,0 mM Natriumpyro phosphat. Nach Inkubation für 30 Min. bei 37°C wird die Reaktion gestoppt durch Hinzu fügen von 20 µl 50 mM EDTA. Das Enzymprodukt, 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-py rimidindion-5'-phosphat wird bestimmt durch HPLC mit einer reversen Phase Nucleosil RP18 Säule. Der Eluent enthält 0,6% Isopropanol und 1% Triethylammoniumdiphosphat, pH 7,0. Das Produkt wird identifiziert durch UV-Absorption bei 293 nm und durch Integra tion quantifiziert. Der Extinktionskoeffizient ist 12.100 M^-1cm^-1.

Screeningbeispiel 5

Die Testmischung enthält 100 mM Tris Hydrochlorid pH 8,5, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM GTP und 20 µl Enzymprobe (80 µg MBP-ribA) in einem Gesamtvolumen von 500 µl. Analoge Mischungen enthalten zusätzlich 0,5 und 5,0 mM Natriumpyrophosphat. Der Test wird durchgeführt in einer Quarzküvette bei 37°C unter Ausschluß von Sauerstoff. Die Reak tionsrate wird direkt bestimmt durch Messung der Absorption von GTP bei 252 nm und von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidindion-5'-phosphat bei 293 nm.

Screeningbeispiel 6

Ein Teil C mit einem Gehalt von 0 bzw. 2,0 bzw. 20 mM Natriumpyrophosphat in 20 ml H₂O wird zugefügt zu einer Mischung A mit einem Gehalt von 400 mM Tris Hydrochlorid pH 8,5, 30 mM MgCl₂, 20 mM DTT und 50 µg MBP_ribA Enzym in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Eine dritte Lösung B mit einem Gehalt von 4 mM GTP in 20 µl H₂O wird zum Start der Reaktion zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. 20 µl Mi schung E mit einem Gehalt von 5% Diacetyl und 250 mM EDTA wird zugefügt und 1 Stunde bei 90°C erhitzt. Die Menge an 6,7-Dimethylpterin wurde fluorometrisch bestimmt (Excitation 365 nm; Emission 435 nm) durch Vergleich mit einem 3 µM 6,7-Dimethyl pterinstandard.

Screeningbeispiel 7 Screening von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität

Testmischungen enthalten 300 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 10 mM Ribo se-5-phosphat und 0,1 U Pentosephosphatisomerase in einem Gesamtvolumen von 30 µl.

Sie wurden für 15 Min. bei 37°G inkubiert und 10 µl der Enzymprobe und 10 µl H₂O bzw. 10 µl 100 mM Pyruvaldehydoxim wie in Tabelle 2 angegeben wurden zugefügt. Die Mi schung (50 µl) wurde 1 Stunde inkubiert. Eine Lösung (50 µl) mit einem Gehalt von 200 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 40 mM Dithiothreitol, 50 mM EDTA, 4 mM 5-Amino-6-ribityl amino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 10 E Lumazinsynthase/Riboflavinsynthase-Komplex aus Bacillus subtilis wurden zugefügt. Die Lumazinsynthase/Riboflavinsynthase wird her gestellt wie von Schott et al., 1990 beschrieben. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann 5 Min. bei 95°C denaturiert. Riboflavin wurde durch reverse Phase HPLC auf einer Säule aus Nucleosil RP18 bestimmt. Der Eluent enthielt 100 mM Ammoniumformiat und 40% Methanol. Das Eluat wurde fluorometrisch untersucht (Excitation 445 nm; Emission 516 nm). Eine Einheit der Enzymaktivität katalysiert die Bil dung von 1 nmol 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat pro Stunde bei 37°C.

Tabelle 2

Screeningbeispiel 8

Der Test wird durchgeführt wie im Screeningbeispiel 7 beschrieben. Anstelle des Luma zinsynthase/Riboflavinsynthase-Komplexes wird nur 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase zugefügt. 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin wird durch reverse Phase HPLC auf einer Säule aus Nucleosil RP18 bestimmt. Der Eluent enthält 10% Methanol und 30 mM Ameisen säure. Das Eluat wird fluorometrisch untersucht (Excitation 408 nm; Emission 487 nm).

Screeningbeispiel 9

Die Reaktionsmischung enthält 300 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 10 mM Ribose-5-phosphat und 0,1 U Pentosephosphatisomerase in einem Gesamtvolumen von 30 ml. Sie wird 15 Min. bei 37°C inkubiert. 10 µl Enzymprobe (MBP-ribAS) und 10 µl H₂O bzw. 10 ml 100 mM Pyruvaldehydoxim werden zugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde inkubiert. Eine Lösung (50 µl) mit einem Gehalt von 2% o-Phenylendiamin, 20 mM DTT und 100 mM EDTA wird zugefügt und die Mischung wird 1 Stunde bei 90°C inkubiert. Das o-Phenylendiamin reagiert mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat unter Bildung von Di methylquinoxalin, welches anschließend gemessen wird durch reverse Phase HPLC auf einer Säule aus Nukleosil RP18. Der Eluent enthält 100 mM Ammoniumformiat und 25% Methanol. Das Eluat wird fluorometrisch bestimmt.

Screeningbeispiel 10

Ein Teil M mit einem Gehalt von 0 bzw. 60 mM Pyruvaldehydoxim in 20 µl H₂O wird zu gefügt zu einer Mischung H mit einem Gehalt von 400 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 50 mM MgCl₂ und 50 µg MBP_ribA Enzym in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Eine dritte Lösung J mit 5 mM Ribulose-5-phosphat in 20 µl H₂O wird zugefügt um die Reaktion zu starten. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. Eine Mischung P mit einem Gehalt von 50 mM DTT, 100 mM EDTA und 10 mM 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimi dindion in einem Gesamtvolumen von 20 µl und eine Mischung R (20 µl) mit einem Gehalt von 200 mM Kaliumphosphat pH 7,5 und 10 U 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase wer den zugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann durch Zufügen von 100 µl Lösung T mit einem Gehalt von 15% Trichloressigsäure denaturiert. Die Menge an 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin wird fluorometrisch bestimmt (Excitation 408 nm; Emission 487 nm) durch Vergleich mit einem 16 µM 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinstandard.

Anhang A Referenzen

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Anhang B

Beschreibung GTP cyclohydrolase II/3,4-Dihydroxy-2-butanone- 4-phosphat-Synthase

Organismus Arabidopsis thaliana

Anhang C

Organismus Lycopersicon esculentum

Anhang D

Beschreibung 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinone Reductase

Organismus Saccharomyces cerevisiae

Claims

1. Eine Methode zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem Pro tein mit GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz und GTP,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeit dauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'- phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Hinzufügen einer vor bestimmten Menge einer chemischen Testprobe zur besagten ersten Mi schung,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließend Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'- phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase II durch Feststellung, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration niedriger ist als die in Schritt b) bestimmte Konzentration.

2. Eine Methode zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem mu tierten, pflanzentypischen Protein mit GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz und GTP,
b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeit dauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'- phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Hinzufügen einer vor bestimmten Menge eines spezifischen Inhibitors für besagte GTP- Cyclohydrolase II zur besagten ersten Mischung,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließend Bestimmung der Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion-5'- phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit von Resistenz der Hemmung der GTP- Cyclohydrolase II durch Feststellung, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration ähnlich ist zu der in Schritt b) bestimmte Konzentration.

3. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei besagte wässrige Mischung ein zweiwertiges Metallion enthält.

4. Die Methode entsprechend Anspruch 3, wobei besagtes zweiwertiges Metallion ein Magnesiumion ist.

5. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei besagte Mischung eine anti oxidative Substanz enthält.

6. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei besagte Mischung einen pH im Bereich von 6 bis 9,5 hat.

7. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei eine Vormischung hergestellt wird, in der ein essentielles Ingredienz fehlt und die Reaktion gestartet wird durch die Zugabe des besagten Ingredienz.

8. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2 charakterisiert dadurch, dass die Konzentration von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphat direkt bestimmt wird oder nach chemischer oder enzymatischer Derivatisierung.

9. Die Methode entsprechend Anspruch 1 und 8 oder 2 und 8, wobei die besagte di rekte Bestimmung ausgeführt wird nachdem die Reaktion beendet wurde durch Hin zufügen eines chelatisierenden Agents für das besagte zweiwertige Metallion.

10. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei die chemische Derivatisierung ausgeführt wird durch Hinzufügen einer vicinalen Dioxoverbindung.

11. Die Methode entsprechend Anspruch 10, wobei besagte Dioxoverbindung Diacetyl ist.

12. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei die enzymatische Bestimmung ausgeführt wird durch Hinzufügen von 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidi non-5'-phosphatreduktase und NAD(P)H und Bestimmung der Bildung von NAD(P).

13. Eine Methode zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibition von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem Pro tein mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasesequenz und Ribulose-5- phosphat,
b) Umsetzung der besagten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon = 4-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Einschluß einer vor bestimmten Menge eines spezifischen Inhibitors für die besagte 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphatsynthase in die besagte erste Mischung,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende erneute Bestim mung der Konzentration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit von Hemmung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthase durch Feststellung, ob die in Schritt d) bestimmte Konzen tration niedriger ist als die in Schritt b) bestimmte Konzentration.

14. Eine Methode zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibition von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung mit einem Gehalt an einem Pro tein mit mutierter pflanzentypischer 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthasesequenz und Ribulose-5-phosphat,
b) Umsetzung der besagten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen tration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Einschluß einer vor bestimmten Menge eines spezifischen Inhibitors für die besagte 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphatsynthase in die besagte erste Mischung,
d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende erneute Bestim mung der Konzentration von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,
e) Bestimmung der Anwesenheit von Resistenz der Hemmung von 3,4-Dihydroxy- 2-butanon-4-phosphatsynthase durch Feststellung, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration ähnlich ist zu der in Schritt b) bestimmten Konzentration.

15. Die Methode entsprechend Anspruch 13 oder 14, worin besagte wässrige Mischung ein zweiwertiges Metallion enthält.

16. Die Methode entsprechend Anspruch 15, worin besagtes zweiwertiges Metallion ein Magnesiumion ist.

17. Die Methode entsprechend Anspruch 13 oder 14, worin besagte Mischung einen pH im Bereich von 6 bis 9, 5 hat.

18. Die Methode entsprechend Anspruch 13 oder 14, wobei eine Vormischung her gestellt wird in der ein essentielles Ingredienz fehlt und die Reaktion gestartet wird durch Hinzufügen des besagten Ingredienz.

19. Die Methode entsprechend Anspruch 13 oder 14, wobei die Anwesenheit von 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat direkt oder nach chemischer oder enzymatischer Derivatisierung nachgewiesen wird.

20. Die Methode entsprechend Anspruch 19, wobei die besagte Bestimmung ausgeführt wird nachdem die Reaktion beendet wurde durch Hinzufügen eines chelatisierenden Agents für besagtes zweiwertiges Metallion.

21. Die Methode entsprechend Anspruch 19, wobei die besagte chemische Derivatisie rung ausgeführt wird mit einem aromatischen oder heteroaromatischen ortho-Di amin.

22. Die Methode entsprechend Anspruch 20, wobei für die enzymatische Derivatisierung 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase und 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyri midindion zugefügt und die Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase bestimmt wird.

23. Die Methode entsprechend Anspruch 20, wobei für die enzymatische Derivatisierung 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase, Riboflavinsynthase und 5-Amino-6-ribityl amino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion zugefügt und die Konzentration von Riboflavin be stimmt wird.

24. Die Methode entsprechend Anspruch 13 oder 14 charakterisiert dadurch, dass die besagte erste Mischung hergestellt wird durch
Vorreaktion einer ersten Vormischung mit einem Gehalt an Pentosphosphatisomera se und Ribose-5-phosphat und
Mischung der besagten vorreagierten Vormischung mit einer zweiten Vormischung mit einem Gehalt an
besagtem Protein mit einer 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthasesequenz oder
besagtem Protein mit der besagten mutierten 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat synthasesequenz.

25. Reagenziensysteme zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität in einer chemischen Testmischung enthaltend einen Teil A mit einem Protein mit einer GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz und einem Teil B mit GTP.

26. Reagenziensysteme zum Screening für Anwesenheit oder Abwesenheit von Resistenz eines Proteins mit einer mutierten GTP-Cyclohydrolase-II-Sequenz gegen einen spezifischen Inhibitor für GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, welches einen Teil C enthält mit dem besagten spezifischen Inhibitor und einen Teil B mit GTP.

27. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 25 oder 26, welches zusätzlich ein zweiwertiges Metallion in mindestens einem der Teile A, B oder C oder in einem separaten Teil D enthält.

28. Reagenziensysteme entsprechend Anspruch 27, wobei ein chelatisierendes Agents für das bivalente Metallion enthalten ist in einem separaten Teil E.

29. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 25 bis 28, welches zusätzlich eine vicinale Dioxoverbindung entweder in Teil E oder in einem separaten Teil F enthält.

30. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 25 bis 28, welches zusätzlich 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinon-5'-phosphatreduktase in mindestens einem der Teile A, B, C, D, E und/oder einem separaten Teil G enthält; und NAD(P)H in mindestens einem der Teile A, B, C, D, E, G.

31. Reagenziensysteme zum Screening auf Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität in einer chemischen Testprobe enthaltend:
einen Teil H mit einem Protein mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase sequenz und entweder
einem Teil J mit Ribulose-5-phosphat oder
einem Teil K mit Pentosephosphatisomerase in Verbindung mit einem Teil L mit Ri bose-5-phosphat.

32. Reagenziensysteme zum Screening für die Anwesenheit oder Abwesenheit von Resistenz eines Proteins mit einer mutierten 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphatsynthasesequenz gegen einen spezifischen Inhibitor von 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphatsynthaseaktivität umfassend:
einen Teil M mit besagtem spezifischem Inhibitor und entweder
einen Teil J mit Ribulose-5-phosphat oder einen Teil K mit Pentosephosphatisome rase in Verbindung mit einem Teil L mit Ribose-5-phosphat.

33. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 31 bis 32 mit zusätzlichem Gehalt an einem zweiwertigen Metallion in mindestens einem der Teile H, J, K, L, M oder in einem separaten Teil N.

34. Reagenziensysteme entsprechend Anspruch 33, wobei ein chelatisierendes Agents für das besagte zweiwertige Metallion enthalten ist in einem separaten Teil P.

35. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 31 bis 34 mit einem zusätzlichen Gehalt an einem aromatischen oder heteroaromatischen ortho-Diamin entweder in Teil P oder in einem separaten Teil Q.

36. Reagenziensysteme entsprechend einem der Ansprüche 31 bis 34 mit einem zusätzlichen Gehalt an 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase in mindestens einem der Teile H, J, K, L, M, N, P oder in einem separaten Teil R und 5-Amino-6- ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion in mindestens einem der Teile H, J, K, L, M, N, P, R.

37. Reagenziensysteme entsprechend Anspruch 36 mit einem zusätzlichen Gehalt an Riboflavinsynthase in mindestens einem der Teile H, J, K, L, M, N, P, R oder in einem separaten Teil S.

38. Isoliertes Protein mit einer Pflanzenenzymsequenz der GTP-Cyclohydrolase II und/oder 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase und mit der Funktion von GTP-Cyclohydrolase II und/oder 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase.

39. Protein entsprechend Anspruch 38 mit einer zusätzlichen auxiliaren Proteinsequenz.

40. Protein entsprechend Anspruch 38, wobei die Pflanze eine monocotyledone oder dicotyledone Pflanze ist.

41. Isolierte DNA, welche ausschließlich für ein Protein in Übereinstimmung mit An spruch 38 kodiert und optional mindestens ein weiteres Enzym des Riboflavin biosyntheseweges.

42. Ein Vektor umfassend die Nukleotidsequenz für die DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 41.

43. Eine Methode zur Hemmung eines Enzyms mit GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthaseaktivität aus oder in einer Pflanze durch Behandlung mit einer Verbindung, welche ausgewählt wird aus der Gruppe chemischer Verbindungen, welche Hemmung in den Methoden nach Anspruch 1 oder 13 zeigen.

44. Eine Methode zur Hemmung eines Enzyms mit GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität aus oder in einem Mikroorganismus durch Behandlung mit einer Verbindung, welche aus der Gruppe der chemischen Verbindungen mit Hemmwirkung entsprechend der Me thode in Anspruch 1 ausgewählt wird.

45. Eine Methode zur Hemmung eines Enzyms mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phos phatsynthaseaktivität aus oder in einem Mikroorganismus durch Behandlung mit einer Verbindung, welche aus der Gruppe der chemischen Verbindungen mit Hemmwirkung entsprechend der Methode in Anspruch 13 ausgewählt wird.