JP2002534094A

JP2002534094A - リボフラビン生合成の阻害剤のためのスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2002534094A
Application number: JP2000592437A
Authority: JP
Inventors: バッハー，アーデルバート; ヘルツ，シュテファン
Original assignee: バッハー，アーデルバート
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2002-10-15
Also published as: EP1141381A1; AU1979500A; WO2000040744A1

Abstract

(57)【要約】リボフラビン生合成に関与する酵素の活性の阻害の存在または非存在についてスクリーニングする方法を記載する。ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性は、ＧＴＰが、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質により触媒されて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトに変換される程度により決定する。３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ活性は、リブロース５−リン酸が、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を有するタンパク質により触媒されて、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトに変換される程度により検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、リボフラビン生合成の阻害剤のためにスクリーニングする分野に関
する。具体的には、本発明は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩまたは３，４−ジ
ヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼの阻害剤のために、並び
に、阻害剤に対して抵抗性を示す変異体のためにスクリーニングする方法に関す
る。本発明は、前記スクリーニング方法用の部分品のキットにも関する。本発明
はさらに、除草剤、または殺真菌剤としてまたは抗細菌剤として有用な阻害剤の
検出のために、これらのスクリーニング方法を適用することに関する。本発明は
さらに、上記スクリーニング方法を実施するための植物酵素にも関する。

【０００２】人類は、農業領域での雑草または真菌など、並びに、医学または獣医学領域で
の病原細菌または真菌などの危険な有機体との直面が絶えず変化している生態系
に置かれている。かかる望ましくない有機体に対するさらに新規な化学的阻害剤
を開発する必要が依然としてある。環境保護の必要性の認識が高まると共に、世界人口が増加している時代におい
ては、農業利用する土地の生産性を向上させる必要性が高まる。この問題を探究
するために、穀物植物に影響を及ぼすことなく、並びに、人間または哺乳動物お
よび好ましくは関連生態系の全ての他の動物にほとんどまたは全く毒性を及ぼす
ことなく、少量で適用した場合にさえ、雑草または真菌などの全ての害毒に対し
て高い効力を示す新規な除草剤または殺真菌剤などの探索にアプローチする。

【０００３】医学または獣医学分野において、病原体、特に、従来の阻害剤に対して抵抗性
を発達させる重要な性質を有す病原体との直面は絶えず変化している。この分野
の阻害剤は、病原体に対して非常に効果的であるとともに、少量で適用可能でな
ければならない。これらは処置されるべき患者または動物に対してほとんどまた
は全く毒性を示してはならない。そしてさらに、これらは阻害された代謝経路の
産物が病原体の細胞壁を通り宿主有機体から容易に輸送されない性質を有してな
ければならない。このように、必要条件を満たす新規阻害剤の検出は大変な仕事
であることが明らかである。

【０００４】新規阻害剤の発見に向けての１つのアプローチは、既知のタイプの阻害剤の修
飾である。このアプローチは、これらの既知のタイプの阻害剤の従来物の効果と
大きく異なることはないであろう効果を約束する。

【０００５】より有望なアプローチは、効力についての新規な機序をもつ新規なタイプの阻
害剤の探索であろう。かかる探索は、従来の阻害剤の構造の知見により誘導でき
ない。それ故、化学化合物のライブラリーをスクリーニングする新規な方法がこ
の探索に必要とされる。

【０００６】それ故、雑草植物、真菌または細菌病原体に必須であるが、人間または動物に
は必須ではなく、その阻害剤は、環境からの経路の産物の取込みにより補うこと
ができないような生化学経路の酵素を、高い効力で阻害する化合物のために、化
学試験サンプルのライブラリーをスクリーニングする方法を提供することが目的
である。

【０００７】この目的は、リボフラビン生合成の阻害剤のためのスクリーニング方法により
有利に解決できることを我々は発見した。

【０００８】全ての細胞有機体は、数多くの酸化還元酵素（その多くは代謝に重要である）
の欠くことのできない必要条件としてリボフラビンを必要とする。全ての植物、
真菌および多くの細菌が、リボフラビンを生合成的に生成し、一方、全ての動物
が、栄養源のリボフラビン（ビタミンＢ₂）を必要とする。それ故、植物、真菌
および細菌におけるリボフラビン生合成酵素の阻害剤は、動物の代謝を妨害しな
い。さらに、細胞活性のためのリボフラビンの絶対量は少ない。それ故、ほんの
少量のリボフラビン生合成酵素が細胞に見出される。このことは、かかる酵素の
ほんの少量の阻害剤が必要であることを意味する。これにより、リボフラビン生
合成酵素は、新規阻害剤の理想的な標的である。

【０００９】ビタミンＢ₂（リボフラビン）の生合成経路（図１）は、細菌および酵母でか
なり詳細に研究されている（論評についてはＢａｃｈｅｒ、１９９１；Ｂａｃｈ
ｅｒら、１９９６）。１分子のリボフラビン（７）の生合成的形成は、１分子の
ＧＴＰおよび２分子のリブロース５−リン酸を必要とする。ＧＴＰ（１）は、最
初に、酵素のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩにより、得られる生成物である２，
５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェ
イト（２）に変換される（工程Ａ）。この中間体は、一連の脱アミノ化、側鎖還
元、および脱リン酸化により、５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ
，３Ｈ）−ピリミジンジオン（３）に変換される。化合物（３）は、３，４−ジ
ヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェイトシンターゼによりリブロース５−
リン酸（６）から酵素的に得られる（工程Ｂ）３，４−ジヒドロキシ−２−ブタ
ノン４−ホスフェイト（５）との縮合により、６，７−ジメチル−８−リビチル
ルマジン（４）に変換される。（５）の形成は、ホルメートとして基質のＣ−４
を欠失する異例な骨格の再編成を含む。

【００１０】枯草菌のｒｉｂＡ遺伝子は、それぞれ、ＧＴＰおよびリブロース５−リン酸か
ら、ピリミジン（２）および炭水化物（５）の形成を触媒する二機能性タンパク
質を特定する。類似のタンパク質が、バチルス・アミロリキュエファシエンス、
シネコシスティス属、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、アクチノバチラ
ス・プルニューモニエまたはアクイフェックス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ
ａｅｏｌｉｃｕｓ）などの数個の他の微生物のＤＮＡ配列情報を基にして予測
されている（Ｇｕｓａｒｏｖら、１９９７；Ｋａｎｅｋｏら、１９９６；Ｃｏｌ
ｅら、１９８８および１９９６、Ｆｕｌｌｅｒら、１９９５；Ｄｅｃｋｅｒｔら
、１９９８）。一方、大腸菌（Escherichia coli）および酵母サッカロミセス・
セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）、スキゾサッカロミセス・ポンペ（
Schizosaccharomyces pompe）、カンジダ・ギリモンディ（Candida guilliermon
dii）、アゾスピリラム・ブラシレンス（Azospirillum brasilense）は、連結し
ていない遺伝子により特定される別々のタンパク質として、ＧＴＰシクロヒドロ
ラーゼＩＩおよび３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンタ
ーゼを特定することが示されている（Ｒｉｃｈｔｅｒら、１９９２；Ｏｌｔｍａ
ｎｓら、１９７２；Ｌｉａｕｔａ−Ｔｅｇｌｉｖｅｔｓら、１９９５；ｖａｎ
Ｂａｓｔｅｌａｅｒｅら、１９９５）。同じことが、ＤＮＡ配列情報に基づき、
ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、フォトバクテリウ
ム・レイオグナシ（Photobacterium leiognathi）、フォトバクテリウム・フォ
スフォリウム（Photobacterium phosphoreum）、アルケオグロブス・フルジダス
（Archaeoglobus fulgidus）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori
）、デハロスピリルム・マルチボランス（Dehaolspirillum multivorans）、メ
タノコッカス・ジャンナシイ（Methanococcus jannashii）、メタノバクテリウ
ム・サーモオウトトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）にも
該当するようである（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎｎら、１９９５；Ｌｅｅら、１９９４
；Ｋｌｅｎｋら、１９９７；Ｔｏｍｂら、１９９７；Ｂｕｌｔら、１９９６）。

【００１１】我々は、植物では、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩおよび３，４−ジヒドロキ
シ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼは融合していることを発見した。
これは、二機能性酵素は、構造的束縛が混ぜ合わせられ、これにより高度に特異
的な阻害に感受性となり、従って、阻害剤をスクリーニングするための有望な標
的のようであることを意味する。スクリーニング目的に有用なかかるタンパク質
は、植物またはいくらかの細菌のように合わせられた両方の機能を有し得るか、
或いは真菌または他の細菌のようにこれらの機能の１つのみを有し得る。

【００１２】本発明の最初の目的は、阻害剤を発見するために、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ
ＩＩ活性の阻害の存在または非存在について、化学試験サンプルをスクリーニン
グする方法を提供する。

【００１３】この最初の目的は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の阻害の存在または非
存在についてスクリーニングする方法により達成され、これは、以下の工程：（ａ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質およびＧＴＰを含
む第一水性混合物を調製し、（ｂ）前記の第一混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミ
ジノン５'−ホスフェイトのレベルを検出し、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の化学的試験サンプルを含めるこ
とにより、第二水性混合物を調製し、（ｄ）前記の第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミ
ジノン５'−ホスフェイトのレベルを検出し、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルよりも低い
かどうかの観察により、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの阻害の存在を決定する
ことを含む。

【００１４】本発明の第二の目的は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の阻害に対する抵
抗性の存在または非存在についてスクリーニングする方法を提供することであり
、ここで、試験サンプルは、特異的阻害剤に対する抵抗性を有す変異酵素を発見
するために、変異植物型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質
を含む。

【００１５】第二の目的は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの阻害の存在または非存在につ
いてスクリーニングする方法により達成され、これは、以下の工程：（ａ）変異植物型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質および
ＧＴＰを含む第一水性混合物を調製し、（ｂ）前記の第一混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミ
ジノン５'−ホスフェイトのレベルを検出し、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の前記ＧＴＰシクロヒドロラーゼ
ＩＩの特異的阻害剤を含めることにより、第二水性混合物を調製し、（ｄ）前記の第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミ
ジノン５'−ホスフェイトのレベルを検出し、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルに類似して
いるかどうかの観察により、それぞれ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの阻害の
存在またはその阻害に対する抵抗性の存在を決定することを含む。

【００１６】本発明の第三の目的は、阻害剤を発見するために、３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ活性の阻害の存在または非存在について
、化学試験サンプルをスクリーニングする方法を提供することである。

【００１７】第三の目的は、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンタ
ーゼ活性の阻害の存在または非存在についてスクリーニングする方法により達成
され、これは、以下の工程：（ａ）３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を
有するタンパク質およびリブロース５−リン酸を含む第一水性混合物を調製し、
（ｂ）前記混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応させ
、続いて、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトのレベルを検
出し、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の前記３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼの特異的阻害剤を含めることにより、第
二水性混合物を調製し、（ｄ）前記第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応
させ、続いて、再度、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトの
レベルを検出し、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルより低いか
どうかの観察により、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシ
ンターゼの阻害の存在を決定することを含む。

【００１８】本発明の第四の目的は、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイ
トシンターゼ活性の阻害の存在または非存在について試験サンプルをスクリーニ
ングする方法を提供することであり、ここで、試験サンプルは、特異的阻害剤に
対して抵抗性を有す変異酵素を発見するための、変異植物型３，４−ジヒドロキ
シ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を有するタンパク質を含む。

【００１９】第四の目的は、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンタ
ーゼ活性の阻害の存在または非存在についてスクリーニングする方法により達成
され、これは、以下の工程：（ａ）変異植物型３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンタ
ーゼ配列を有するタンパク質およびリブロース５−リン酸を含む第一水性混合物
を調製し、（ｂ）前記混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応させ
、続いて、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトのレベルを検
出し、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の前記３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼの特異的阻害剤を含めることにより、第
二水性混合物を調製し、（ｄ）前記の第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、再度、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェイ
トのレベルを検出し、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルに類似して
いるかどうかの観察により、３，４−ジデオキシ２−ブタノン４−ホスフェイト
シンターゼの阻害に対する抵抗性の存在を決定することを含む。

【００２０】酵素配列は、除草剤を発見するためには植物型であり得、殺真菌剤を発見する
ためには真菌型であり得、または、病原性細菌に対する阻害剤を発見するために
は細菌型であり得る。

【００２１】スクリーニング方法を実施するために、部分品のキットを使用し得、ここで、
必要な構成要素は、部分品の混合時に、酵素反応を特定の時点で開始できるよう
に分配されている。

【００２２】好ましくは、酵素は、二価の金属イオンを用いて促進される。この場合、酵素
反応は、前記金属イオンのキレート剤の添加により、特定の時点で停止し得る。

【００２３】標的酵素の反応の産物のレベルは、直接的に、または化学的もしくは酵素的誘
導体化により実施し得る。

【００２４】産物のレベルは、１つの前以て決定した時点で決定しても、または連続的に数
個の前以て決定した時点で決定してもよい。

【００２５】以下、本発明について、詳細に説明する。植物酵素の配列決定枯草菌のＲｉｂＡタンパク質の既知アミノ酸配列（Ｒｉｃｈｔｅｒら、１９９
３）を使用して、米国、オハイオ州立大学のアラビドプシス生物源センターから
入手できるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＳＴクローン４１Ｇ４Ｔ
７の配列解析を実施し、ＥＳＴクローン４１Ｇ４Ｔ７に有意な類似性が認められ
た。この配列類似性は、枯草菌のＲｉｂＡタンパク質の３，４−ジヒドロキシ−
２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼドメインに関連すると決定された。こ
れは、ＥＳＴ４１Ｇ４Ｔ７は、以前、リボフラビンシンターゼとして注釈されて
いたので驚くべきことであった（Ｎｅｗｍａｎら、１９９４）。

【００２６】ＥＳＴクローン４１Ｇ４Ｔ７の全挿入断片を、プライマー歩行戦略を使用して
、自動ジデオキシヌクレオチド法によりシークエンスした。挿入断片（ｉ４１Ｇ
４Ｔ７と称される）は、２５２５ｂｐの長さであった。ｂｐ１０９〜１２９７を
含むセグメントは、枯草菌のｒｉｂＡ遺伝子に類似し、ｂｐ５６３〜１４８５お
よび２２６２〜２５０５を含むセグメントは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩで
あると考えられていたシロイヌナズナ配列Ｄ４５１６５（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤ
ＪＢ／ＥＭＢＬ／ＧＳＤＢ／ＮＣＢＩ寄託番号）と同一である。トランスポゾン
ＩＳ１は、ＢＰ１４８６〜２２６１に位置していた。

【００２７】枯草菌遺伝子との配列比較により、ＥＳＴクローン４１Ｇ４Ｔ７は、本研究で
遺伝子の５'部分全体を含まないことが示唆された。それ故、我々は、クローン
４１Ｇ４Ｔ７からのｂｐ３９〜１４８４のＰＣＲ増幅により得られたハイブリダ
イゼーションプローブを使用して、シロイヌナズナ（品種コロンビア）からのｍ
ＲＮＡのノーザンブロットを実施した。このプローブは、推定３，４−ジヒドロ
キシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼドメイン、並びに、推定ＧＴＰ
シクロヒドロラーゼＩＩドメインの部分を含んだ。我々は、約２３００ｂｐの一
本のバンドを発見した。

【００２８】５'方向に既知配列を伸長するために、ＲＡＣＥ実験を、鋳型としてシロイヌ
ナズナのｍＲＮＡを使用して逆ＰＣＲにより実施した。８００ｂｐ長のＲＡＣＥ
産物をシークエンスし、クローン４１Ｇ４Ｔ７には存在しない５５６ｂｐを含む
ことが示された。伸長ｃＤＮＡのコード領域は、５４３ａａおよび５９，０５５
Ｄａの質量をもつ予測タンパク質を特定する１６２９ｂｐを含む。同族遺伝子は
、ｒｉｂＡと称される。配列は付録Ｂ（Annex B）に示す。５'非翻訳領域は２８
４ｂｐ長である。３'非翻訳領域は３７２ｂｐ長である。

【００２９】アラビドプシス（Arabidopsis）遺伝子の推定３，４−ジヒドロキシ−２−ブ
タノン４−ホスフェイトシンターゼドメインの前に、データベースのどの配列に
も類似性がない約１２０のアミノ酸の配列がある。タンパク質の最初の２５のア
ミノ酸は、１３のセリン残基（４つ連続したセリン残基のクラスターを含む）を
含む。Ｎ末端の１２０のアミノ酸残基の３４残基は、セリンまたはトレオニンで
ある。

【００３０】アラビドプシスの染色体ｒｉｂＡ遺伝子は、鋳型として染色体ＤＮＡを使用し
て、ＰＣＲにより２部分を増幅した。増幅物をシークエンスした。この遺伝子（
ＥＭＢＬデータベース寄託番号ＡＪ００００５３）は、計７００ｂｐの６つのイ
ントロンを含む。

【００３１】相補性実験シロイヌナズナ遺伝子のコード領域を、発現ベクターｐＮＣＯ１１３（Ｓｔu
ｂｅｒら、１９９０）に挿入しプラスミドｐＡＥを得た。このプラスミドを、そ
れぞれ、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼおよ
びＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩがなく、それ故、リボフラビンを補充しなけれ
ばＬＢ培地上で増殖できない、大腸菌のｒｉｂＡおよびｒｉｂＢ変異株に電子形
質転換した（Ｋａｔｚｅｎｍｅｉｅｒ、１９９１）。変異体に形質転換したプラ
スミドｐＮＣＯ１１３は陰性対照として使用した。アラビドプシスのｒｉｂＡ遺
伝子を含むプラスミドを有する組換え変異株は、外部リボフラビンの非存在下で
も通常の速度で増殖する。アラビドプシスのｒｉｂＡ遺伝子は、大腸菌細胞中で
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩとしておよび３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノ
ン４−ホスフェイトシンターゼとして作用できるタンパク質の合成を指示すると
いうことになる。それ故、シロイヌナズナ遺伝子は、二機能性ＧＴＰシクロヒド
ロラーゼＩＩ／３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンター
ゼをコードする。

【００３２】トマトのｒｉｂＡ遺伝子のクローニングシロイヌナズナのｒｉｂＡ遺伝子に類似した遺伝子を、変性プライマーを使用
して、ＰＣＲによりトマトｃＤＮＡライブラリーから増幅した。ＤＮＡセグメン
トを、プライマー歩行戦略を使用してシークエンスし、シロイヌナズナ遺伝子と
ほぼ同じサイズのオープンリーディングフレーム（ＥＭＢＬデータベース寄託番
号ＡＪ００２２９８）を含むことが示された。予測タンパク質配列は、５５２ア
ミノ酸を含み、計算質量５９７９３Ｄａを有する。予測タンパク質は、シロイヌ
ナズナのＲｉｂＡタンパク質に類似している。最も特筆すべきは、それも、３，
４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼドメインの前に、
約１２０アミノ酸のセリンおよびトレオニンリッチなＮ末端を有する。高いセリ
ン／トレオニン含量とは別に、トマト遺伝子のＮ末端は、シロイヌナズナＮ末端
にほとんど類似していない。以下の３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホ
スフェイトシンターゼおよびシクロヒドロラーゼＩＩドメインは、アラビドプシ
ス酵素に非常に類似している。

【００３３】ここで記載した方法により、任意の他の有機体の対応する遺伝子およびタンパ
ク質配列を決定できる。

【００３４】シロイヌナズナのｒｉｂＡ遺伝子の推論アミノ酸配列は、アクチノバチラス・
プルニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）の二機能性ＧＴＰシク
ロヒドロラーゼＩＩ／３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシ
ンターゼ配列、および、バチルス・アミロリキュエファシエンス（Bacillus amy
loliquefaciens）、Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis）およびシネコシ
スティス属（Synechocystis sp.）の推定二機能性酵素とも類似性を示す。シロ
イヌナズナ遺伝子は、フォトバクテリウム・フォスフォリウムおよびフォトバク
テリウム・レイオグナシ由来の遺伝子とも類似している。シロイヌナズナ酵素の
Ｎ末端３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼドメイ
ンは、大腸菌に由来するものだけでなく、Ｈ．インフルエンザおよびＳ．セレビ
ジアエに由来する単機能性３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイ
トシンターゼ配列にも類似性を示す。Ｃ末端ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩドメ
インは、大腸菌に由来するものだけでなく、Ｈ．インフルエンザ、Ｓ．セレビジ
アエ、カンジダ・ギリモンディ、Ｐ．フォスフォリウムおよびアゾスピリラム・
ブラシレンスに由来する単機能性ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列にも類似性
を示す。

【００３５】植物由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ／３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノ
ン４−ホスフェイトシンターゼの発現および精製発現ベクターの構築の始めは、植物、好ましくは双子葉または単子葉植物由来
のｃＤＮＡ、例えば、シロイヌナズナまたはリコペルシコン・エスカレンタム（
Lycopersicon esculenum）由来のｃＤＮＡである。ｒｉｂＡ遺伝子を、特異的プ
ライマーおよび鋳型として対応する植物由来のｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより増
幅する。変形プロセスにおいて、遺伝子を、２つの重複部分で増幅し得る。２つ
の部分を、重複領域において制限酵素で消化し、後に共にライゲートし、完全な
遺伝子を生成する。別に、一方または両方の部分のｃＤＮＡは、既存のＥＳＴク
ローンを起源とし得る。ｒｉｂＡのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ部分または３
，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ部分のみを発現
したい場合、遺伝子の対応する部分のみを、上記の方法を用いて増幅する。

【００３６】例えばシロイヌナズナまたはＬ．エスカレンタムなどの様々な植物由来のＲｉ
ｂＡタンパク質は、酵素活性に必須ではないことが判明した約１２０アミノ酸の
シグナル配列を含む。組換えＤＮＡ構築物においてこのシグナル配列は排除し得
る。

【００３７】増幅ＤＮＡ断片を、修飾プライマーを用いて２回の連続ＰＣＲ増幅により修飾
する。最初のＰＣＲ反応では、最適の距離で開始コドンに先行するリボソーム結
合部位を、５'末端に導入する。制限酵素の認識部位、例えばＳａｌＩ、Ｂｓｐ
ＭＩまたはＰｖｕ１を、３'末端に導入する。好ましい認識部位はＳａｌＩであ
る。第二のＰＣＲ反応で、最初のＰＣＲ反応の産物を鋳型として使用する。５'
末端で、リボソーム結合部位に先行する制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を、修飾
プライマーと共に導入する。増幅ＤＮＡ断片を、対応する消化酵素、例えばＥｃ
ｏＲＩおよびＳａｌＩで消化する。このＤＮＡ断片を、宿主微生物中で自己複製
できるベクターＤＮＡに挿入すると、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドが得ら
れる（図２）。この組換えプラスミドを使用して、宿主微生物、例えば大腸菌ま
たは枯草菌を形質転換する。好ましい宿主は大腸菌である。植物タンパク質の発
現は、宿主有機体では低いことがある。発現レベルを増強および／またはタンパ
ク質の精製を簡素化するために、組換えプラスミドは、同じリーディングフレー
ムにｒｉｂＡ遺伝子またはその一部に先行する終止コドンを有さない、遺伝子ま
たは遺伝子の一部を含み得る。この目的に好ましい遺伝子は、大腸菌からのｍａ
ｌＥ遺伝子である。かかる組換えＤＮＡの発現は、大腸菌からのマルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）と植物ＲｉｂＡタンパク質の間の融合タンパク質を産生す
る。様々な構築物を図３に示す。シグナル配列Ｓを有する構築物を図３ａに、マ
ルトース結合配列ｍａｌＥおよびシグナル配列Ｓを有するものを図３ｂに、マル
トース結合配列ｍａｌＥを有するものを図３ｃに示す。

【００３８】発現ベクターを有する株を、１５〜４０℃で慣用的な培養培地中で培養できる
。好ましい培養培地は、ルリア・ベルタニ培地であり、好ましい温度は３７℃で
ある。大腸菌株を、０．２〜５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
で、０．５〜０．８の光学密度で誘導する。細胞を２ないし１２時間、好ましく
は５時間インキュベートする。細胞を、遠心分離により収集し、生理食塩水で洗
浄する。細胞をリゾチームで溶解および／または超音波破砕機で破砕する。ＭＢ
Ｐ−ｒｉｂＡ融合タンパク質を、アミロースレジンを用いるアフィニティークロ
マトグラフィーにより粗抽出物から精製する。

【００３９】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の阻害の存在または非存在のスクリーニングＧＴＰを、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの作用により、２，５−ジアミノ−
６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトに変換する
。酵素は、Ｂａ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺またはＺ
ｎ²⁺などの二価の金属イオンにより促進できる。好ましいイオンはＭｇ²⁺である
。反応混合物は、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリ
トール（ＤＴＥ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）またはブチルヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）などの抗酸化物質を含むべきである。アッセイは、必要
な物質の１つを他の混合物に加えることにより開始できる。好ましくは、酵素を
、ｐＨ６〜９．５、好ましくは８．５の、ＧＴＰ、Ｍｇ²⁺、ＤＴＴの緩衝液中溶
液に加える。反応液を１〜６０分間、１０〜４０℃でインキュベートする。好ま
しくは、２０分間３７℃でインキュベートする。アッセイは、酵素を、トリクロ
ロ酢酸、アセトン、ドデシル硫酸ナトリウムで変性、または６０〜１００℃の温
度で加熱することにより停止できる。アッセイはまた、金属イオンを、ＥＤＴＡ
、イミノ二酢酸、８−ヒドロキシキノリン、ジフェニルカルバジド、ジチゾンま
たはグリオキサール−ビス（２−ヒドロキシアニル）などの錯化剤とキレートを
形成させることにより停止できる。好ましい錯化剤はＥＤＴＡである。

【００４０】アッセイは、可能性ある阻害剤の試験サンプルを含むおよび含まない、他の点
では同一の混合物を用いて実施する。酵素産物の２，５−ジアミノ−６−リボシ
ルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトを、誘導体化すること
なく直接的に、好ましくは吸光光度定量的に、優先的にはＨＰＬＣによる精製後
に検出できる。ピリミジノンを、２９３ｎｍでのＵＶ吸光度により同定できる。
吸光係数は１２，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1である。産物はまた、ダイオードアレイ多波
長検出（２００〜６００ｎｍ）によりモニタリングできる。アッセイはまた、反
応を停止することなく、石英キュベットで実施できる。次いで、反応速度を、２
５２ｎｍでのＧＴＰ、および２９３ｎｍでの２，５−ジアミノ−６−リボシルア
ミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトの吸光度をモニタリングす
ることにより直接決定できる。

【００４１】ピリミジノンはまた、化学的誘導体化により、好ましくはビシナルジオキソ化
合物と反応により検出できる（図４）。好ましいのは、式Ｒ¹−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ² （式中、Ｒ¹およびＲ²は、独立的に、脂肪族、脂環式、芳香族またはヘテロ芳香
族残基、例えば、ジフェニルジケトン、フェニル−メチル−ジケトン、ショウノ
ウキノンで好ましくはＣ₁〜₆のアルキル基を有す）のビシナルジケト化合物であ
る。最も好ましいジケトンは、ジアセチル（２，３−ブタンジオン）（８）であ
る。２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−
ホスフェイトとの反応により、６，７−ジメチルプテリン（９）が得られ、これ
は、３６５ｎｍの吸光波長および４３５ｎｍの発光波長で蛍光定量的に検出でき
る。

【００４２】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの酵素活性はまた、酵素的誘導体化後に、好ま
しくは２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'
−ホスフェイトを５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピ
リミジンジオン５'−ホスフェイト（１０）に、真菌、好ましくは酵母の２，５
−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイ
トレダクターゼの作用により変換することによりモニタリングでき（図４）、配
列については付録Ｄ（Annex D）に指摘する。このレダクターゼは、大腸菌で、
付加ＮまたはＣ末端ヒスチジンと共に、鋳型としてのサッカロミセス・セレビジ
アエ由来のＤＮＡを用いた標準的な分子生物学的技法により発現できる。アッセ
イに使用する前に、レダクターゼを、例えば、金属キレートアフィニティーカラ
ム上で精製しなければならない。変換は、共基質としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ
Ｈを必要とする。２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミ
ジノン５'−ホスフェイトの量を、３４０ｎｍで吸光光度定量的にモニタリング
できるＮＡＤＨの消費により計算できる。

【００４３】スクリーニングは、単子葉または双子葉植物の二機能性酵素を用いて実施でき
る。また、第一段階のスクリーニングでＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩドメイン
のみおよび第二段階のスクリーニングで二機能性酵素を使用することができる。
また、細菌または真菌酵素を使用することもできる。

【００４４】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ活性の阻害の
存在または非存在についてのスクリーニングリブロース５−リン酸を、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェ
イトシンターゼの作用により、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフ
ェイトに変換する。酵素は、Ｂａ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｍｇ²⁺ 、Ｍｎ²⁺またはＺｎ²⁺などの二価の金属イオンを必要とする。好ましいイオンは
Ｍｇ²⁺である。アッセイは、必要な基質の１つを他の混合物に加えることにより
開始できる。好ましくは、酵素を、ｐＨ６〜９．５、好ましくは７．５のリブロ
ース５−リン酸およびＭｇ²⁺の緩衝液中溶液に加える。アッセイは、可能性ある
阻害剤の試験サンプルを含むか含まないか以外の点では同一の混合物を用いて実
施する。反応液は１〜９０分間１０〜４０℃でインキュベートできる。好ましく
は６０分間３７℃でインキュベートする。３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
４−ホスフェイトシンターゼの基質のリブロース５−リン酸は、市販で入手可能
であるが、かなりコストがかかる。ペントース−リン酸イソメラーゼにより触媒
されるリブロース５−リン酸の異性体化によりin situで好ましくは生成する。
この場合、好ましくはｐＨ６．０〜９．５の緩衝液中のペントース−リン酸イソ
メラーゼ、リボース５−リン酸およびＭｇ²⁺を含む混合物を、１〜２０分間、３
，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼおよび所望によ
り試験サンプルを加える前にインキュベートした。アッセイは、金属イオンを、
ＥＤＴＡ、イミノ二酢酸、８−ヒドロキシキノリン、ジフェニルカルバジド、ジ
チゾンまたはグリオキサール−２−ビス（２−ヒドロキシアニル）などの錯化剤
とキレートを形成させることにより停止できる。好ましい錯化剤は、ＥＤＴＡで
ある。検出のために、酵素的誘導体化が可能である。好ましくは、産物３，４−
ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェイトを、酵素的に、５−アミノ−６
−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンを用いて、６，７
−ジメチル−８−リビチルルマジンに、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジ
ンシンターゼの存在下で、またはリボフラビンに６，７−ジメチル−８−リビチ
ル−ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼの存在下で変換できる。
５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンは
、分子状酸素の存在下で速やかに分解し、それ故、ジチオトレイトール（ＤＴＴ
）またはジチオエリトロール（ＤＴＥ）などの抗酸化物質を含む水溶液として、
０℃以下の温度で保存しなければならない。アッセイを停止でき、検出反応を、
錯化剤の５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン
ジオン、抗酸化物質の６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンシンターゼおよ
び所望によりリボフラビンシンターゼ溶液の添加により開始できる（図５）。１
０〜６０分間２０〜４０℃でインキュベートした後、検出反応を、酵素を、トリ
クロロ酢酸、アセトン、ドデシル硫酸ナトリウムで変性、または６０〜１００℃
の温度で加熱することにより停止できる。６，７−ジメチル−８−リビチルルマ
ジンは、ルマジンシンターゼを加えさえすれば、４１０ｎｍで吸光光度定量的に
検出できる。リボフラビンは、ルマジンシンターゼおよびリボフラビンを加えれ
ば、４４５ｎｍで吸光光度定量的に検出できる。リボフラビン（ｐＨ１、４４５
ｎｍ）の吸光係数は１１，５００Ｍ^-1ｃｍ^-1である。６，７−ジメチル−８−リ
ビチルルマジン（ｐＨ１，４１０ｎｍ）の吸光係数は、１０，３００Ｍ^-1ｃｍ^-1 である。１分子のリボフラビンの形成には、２分子の３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン４−ホスフェイトが必要である。

【００４５】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトはまた、化学的誘導体
化後に、好ましくは芳香族またはヘテロ芳香族オルト−ジアミンを用いて検出で
きる（図５）。芳香族またはへテロ芳香族環は、置換されていても置換されてい
なくてもよい。それは、アルキル、ハロゲン、アルコキシの群から選択された１
〜３つの置換基を含み得る。

【００４６】単子葉または双子葉植物の二機能性酵素を使用することが可能である。また、
第一段階のスクリーニングで３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェ
イトシンターゼドメインのみ、および第二段階のスクリーニングで二機能性酵素
を使用することが可能である。また、細菌または真菌酵素を使用することも可能
である。

【００４７】上記のスクリーニング方法は、対応する修飾後に阻害抵抗性についてスクリー
ニングするために容易に使用し得る。単に、特異的阻害剤（以前にスクリーニン
グにより決定）を加え、問題の植物型酵素の変異体を含む生物学的試験サンプル
を使用することが必要である。

【００４８】以下、本発明について、具体的な実施例により説明する。

【００４９】基準例１シロイヌナズナｒｉｂＡ遺伝子の単離１ｇの２週目のシロイヌナズナ（品種コロンビア）植物（茎および葉）を、液
体窒素中で凍結およびホモジナイズした。１リットルあたり、６００ｇのグアニ
ジンチオシアネート、５ｇのＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム、および５ｍ
ｌの２−メルカプトエタノールを含む、８ｍｌの５０ｍＭのクエン酸三ナトリウ
ムを加えた。この混合物を、注意して、１リットルあたり、９５９ｇのＣｓＣｌ
および３７．２ｇのＥＤＴＡを含む、３ｍｌの無菌溶液に加えた。混合物を３３
，０００ｒｐｍで１８℃で２４時間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１
０分間風乾させた。ペレットを３６０μｌのＨ₂Ｏ（２回蒸留、無菌）に溶かし
た。溶液を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を、４０μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１ｍｌのエタノールと混合した。ＲＮＡを一晩−２０
℃で沈降させ、１４，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離し、５００μｌの
７５％エタノールで２回洗浄した。ペレットを風乾させ、５００μｌのＨ₂Ｏ（
２回蒸留、無菌）に溶かした。この粗ＲＮＡ画分からのｍＲＮＡを、オリゴテッ
クスｍＲＮＡ単離キット（キアゲン）を用いて単離した。ＲＮＡ溶液（５００μ
ｌ）を、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％ＳＤＳを含む、５０
０μｌの２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）と混合した。３０μｌのオリゴテ
ックス懸濁液を加え、混合物を３分間６５℃で、１０分間室温でインキュベート
した。懸濁液を２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を吸引した。ペレ
ットを、２回、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む、１ｍｌの
１０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）で洗浄した。ｍＲＮＡを、２回、５０μｌ
の前以て加熱した（７０℃）５ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出
した。

【００５０】シロイヌナズナｍＲＮＡ（４μｇ）を、４０Ｖで２．２Ｍホルムアルデヒド１
％アガロースゲル上で電気泳動した。４μｌのＲＮＡラダー（ギブコ）を、基準
として電気泳動した。基準レーンを切り出し、０．１％トルイジンブルー溶液で
１０分間染色した。ゲルの他の部分を、４回、Ｈ₂Ｏ（ＤＥＰＣ処理）で洗浄し
、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌのターボブロッターシステム
を使用して、３ＭのＮａＣｌを含む、０．３クエン酸三ナトリウム（ｐＨ７．０
）でＮｙｔｒａｎｓナイロン膜に一晩転写した。

【００５１】プローブを、ＰＣＲにより、プラスミド４１Ｇ４Ｔ７から増幅した。プラスミ
ドを、キアゲンのミニプラスミド単離キットを使用して、ＥＳＴ−クローン４１
Ｇ４Ｔ７の新鮮な一晩培養液５ｍｌから単離した。細菌ペレットを、１０ｍＭの
ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む、０．３ｍｌの５０ｍＭト
リス塩酸塩（ｐＨ８．０）に再懸濁した。１％ＳＤＳを含む、０．３ｍｌの２０
０ｍＭ水酸化ナトリウムを加え、５分間室温でインキュベートした。０．３ｍｌ
の冷凍３．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を加え、氷上で１０分間インキュ
ベートした。混合物を１５分間１４，０００ｒｐｍでミニ遠心管中で遠心分離し
た。上清を取り出し、７５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％エタノールおよび０．１５
％トリトンＸ−１００を含む、１ｍｌの５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で前
以て平衡化した、キアゲン−チップ２０に適用した。キアゲン−チップを、４回
、１０００ｍＭのＮａＣｌおよび１５％エタノールを含む、１ｍｌの５０ｍＭの
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で洗浄した。ＤＮＡを、１２５０ｍＭのＮａＣｌおよび
１５％エタノールを含む、０．８ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）で
溶出した。ＤＮＡを、０．７容量のイソプロパノールで沈降させ、１４，０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離し、１ｍｌの冷７０％エタノールで洗浄した。４１Ｇ
４Ｔ７のＤＮＡ配列を、プライマー歩行戦略を用いて前以て決定した。シークエ
ンスは、ＡＢＩプリズムシークエンス解析ソフトウェアと共に、アプライド・バ
イオシステムズ社のＡＢＩプリズム３７７ＤＮＡシークエンサーを使用して、自
動ジデオキシヌクレオチド法により実施した。ＥＳＴ−クローン４１Ｇ４Ｔ７は
、米国のオハイオ州立大学のアラビドプシス生物源センターから得た。ＰＣＲ混
合物は、２５ｐｍｏｌのプライマーＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＴ
ＧＧ、２５ｐｍｏｌのプライマーＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＡ
ＡＡＴＧ、２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ
、Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、１．６ｎｇのプラスミド４１Ｇ４Ｔ７、および２０ｎｍ
ｏｌのｄＮＴＰを、全容量１００μｌのＨ₂Ｏに含んだ。

【００５２】混合物を９４℃で５分間変性させた。次いで、２５サイクル（９４℃で３０秒
、５０℃で４５秒、７２℃で９０秒）を実施した。７２℃で７分間インキュベー
トした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡを、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）で
精製した。５容量の緩衝液ＰＢ（キアゲン）を、１容量のＰＣＲ反応液に加え、
キアクイックカラムに適用し、１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。フロ
ースルーは廃棄した。０．７５ｍｌの緩衝液ＰＥ（キアゲン）をカラムに加え、
前のように遠心分離した。フロースルーを廃棄し、カラムをさらに１分間１４，
０００ｒｐｍで遠心分離した。カラムを、清浄な１．５ｍｌエッペンドルフチュ
ーブに入れた。５０μｌのＨ₂Ｏ（２回蒸留、無菌）をカラムに加え、それを１
分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。フロースルーは、精製ＤＮＡを含む。
１５μｌのＨ₂Ｏ中の１０５ｎｇの精製ＤＮＡを、１００℃で５分間加熱した。
氷上で冷却した後、ランダムヘキサマープライマー、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、５μｌの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（５０μＣｉ）および０．８μｌのクレノウポリ
メラーゼ（４Ｕ）を含む５μｌ緩衝液を加えた。混合物を１時間インキュベート
した。プローブＤＮＡ（ＥＳＴ配列４１Ｇ４Ｔ７からのｂｐ３９〜１４８４）を
、２回、２ＭのＮＨ₄ＳＯ₄を用いて沈降させた。ペレットを２００μｌのＨ₂Ｏ
に溶かした。

【００５３】膜を、５０％ホルムアミド、５０％ＳＳＰＥ／デンハード溶液／ＳＤＳ（１リ
ットルあたり、１．０ｇフィコール、１．０ｇのポリビニルピロリドン、１．０
ｇのＢＳＡ、８７．６ｇのＮａＣｌ、１３．８ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、３．７ｇのＥ
ＤＴＡ、１０ｇのＳＤＳ）の混合物中で、１時間４２℃でプレハイブリダイズさ
せた。２００μｌのプローブを加え、ハイブリダイゼーションを、４２℃で、５
０％ホルムアルデヒド、５０％ＳＳＰＥ／デンハード溶液／ＳＤＳ中で１２時間
実施した。次いで、膜を、２回、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥ中で、室温
で１５分間洗浄した。放射活性バンドを、３．５時間、フォトイメージャー（モ
レキュラー・ダイナミクス）上で検出した。約２３００ｂｐの一本バンドが認め
られた。

【００５４】５'ＲＡＣＥを、ギブコＢＲＬの５'ＲＡＣＥシステムを用いて実施した。ｃＤ
ＮＡを、シロイヌナズナＲＮＡからの特異的プライマーを用いて作成した。混合
物は、２．５ｐｍｏｌのプライマーＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧ
ＴＣＣおよび９９０ｎｇのシロイヌナズナＲＮＡを、全容量１５μｌ中に含んだ
。混合物を７０℃で１０分間変性させ、氷上で冷却した。２．５μｌの１０×反
応緩衝液（ギブコ）、３μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１μｌの１０ｍＭのｄＮ
ＴＰおよび２．５μｌの０．１Ｍジチオトレイトールを加えた。混合物を４２℃
で２分間インキュベートし、１μｌ（２００Ｕ／μｌ）の逆転写酵素スーパース
クリプトＩＩ（ギブコ）を加えた。混合物を６５℃でさらに１５分間インキュベ
ートした。次いで、遠心分離し、温度を５５℃に調整し、１μｌのＲＮＡｓｅＨ
（２Ｕ／μｌ）を加えた。さらに１０分間５５℃でインキュベートした後、混合
物を氷上で冷却した。

【００５５】続いて、ｃＤＮＡを、アンカープライマー（ギブコＢＲＬ）および特異的な入
れ子状態のプライマー（ＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ
Ｃ）を使用して実施した。産物を、２％アガロースゲル中での電気泳動により精
製した。８００ｂｐのバンドを、ゲル抽出キット（キアゲン）を使用して抽出し
、シークエンスした。ＤＮＡ断片を、小刀を用いてアガロースゲルから切出した
。３容量の緩衝液ＱＸ１（キアゲン）を、１容量の切出したゲルに加え、５０℃
で１０分間インキュベートした。１ゲル容量のイソプロパノールを加えた。ＤＮ
Ａに結合させるために、サンプルを、キアクイックカラムに適用し、１分間１４
，０００ｒｐｍで遠心分離した。フロースルーを廃棄した。０．７５ｍｌの緩衝
液ＰＥ（キアゲン）をカラムに加え、前のように遠心分離した。フロースルーを
廃棄し、カラムをさらに１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。カラムを清
浄な１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。５０μｌのＨ₂Ｏ（２回蒸留
、無菌）を、カラムに加え、１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。フロー
スルーは、４．２μｇの精製ＤＮＡを含んだ。

【００５６】基準例２発現クローンの構築鋳型としてＥＳＴクローン４１Ｇ４Ｔ７からのプラスミドを使用して、ｃＤＮ
Ａ挿入断片を、ＰＣＲにより、ｂｐ−７５〜１４８５まで増幅した。反応混合物
は、１０ｐｍｏｌのプライマーＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＡＡ
ＡＴＧ、１０ｐｍｏｌのプライマーＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴ
ＴＡＣＧ、４．５ｎｇのプラスミド４１Ｇ４Ｔ７、２ＵのＴａｑポリメラーゼ、
１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、および２０ｎｍ
ｏｌのｄＮＴＰを、全容量１００μｌに含んだ。

【００５７】混合物を、９４℃で５分間変性させた。２５ＰＣＲサイクル（９４℃で６０秒
、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒）を実施した。さらに７分間７２℃でイン
キュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡをＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン）を用いて精製した。（基準例１）からのＰＣＲ産物およびＲＡＣＥ産物を、
制限酵素ＢｓｇＩ（ニューイングランドバイオラブズ）、５μｌのニューイング
ランドバイオラブズ緩衝液４、１μｌのＳ−アデノシルメチオニン（４ｍＭ）、
５μｌのＢｓｇｌ（７．５Ｕ）、４０μｌのＰＣＲ産物（１．６μｇ）または４
０μｌのＲＡＣＥ産物（３．２μｇ）で消化した。

【００５８】両方の断片を、３７℃で２時間インキュベートし、前のように精製し、共にＴ
４リガーゼ、４μｌの５×緩衝液（ギブコ）、１μｌのＴ４−リガーゼ（４Ｕ）
、２μｌのＰＣＲ産物（６０ｆｍｏｌ）、０．５μｌのＲＡＣＥ産物（６５ｆｍ
ｏｌ）、および１２．５μｌのＨ₂Ｏを用いて共にライゲートした。

【００５９】混合物を４℃で１２時間インキュベートした。完全な遺伝子を、特異的な末端
プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。５'末端に、開始コドンの最適な距
離のリボソーム結合部位の前に、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を、修飾プライ
マーを用いてＰＣＲにより導入した。３'末端では、制限酵素ＳａｌＩの認識部
位を、修飾プライマーを用いて、ＰＣＲにより終止コドン後に導入した。

【００６０】第一ＰＣＲ全容量１００μｌ中の、１０ｐｍｏｌのプライマーＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡ
ＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＣＴＣ、１０ｐｍｏｌのプラ
イマーＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣ、
２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏｍ
ｅｔｒａ）、１μｌのライゲーション混合物、および２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ。

【００６１】混合物を９４℃で５分間変性させた。次いで、２５サイクル（９４℃で６０秒
、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒）を実施した。さらに７分間７２℃でイン
キュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上
で電気泳動した。１６５０ｂｐのバンドを、ゲル抽出キット（キアゲン）を用い
て精製した。

【００６２】第二ＰＣＲ（各１００μｌを用いた２つの同一ＰＣＲを実施して、より高い収率
を得た）全容量１００μｌ中の、１０ｐｍｏｌのプライマーＣＡＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣ
ＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧ、１０ｐｍｏｌのプライマ
ーＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＣ、２Ｕの
Ｔａｑポリメラーゼ、１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏｍｅｔｒ
ａ）、４μｌの精製ＰＣＲ１産物、および２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ。

【００６３】混合物を９４℃で５分間変性させた。次いで、２５サイクル（９４℃で６０秒
、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒）を実施した。さらに７分間７２℃でイン
キュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡをＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン）を用いて精製した。プラスミドｐＮＣＯ１１３（Ｓｔｕｂｅｒら、１９９０
）を、（基準例１）にプラスミド４１Ｇ４Ｔ７に記載したように単離した。

【００６４】ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＮＣＯ１１３を、制限酵素ＳａｌＩ（全１００
μｌ中、１０μｌのＳａｌＩ緩衝液（ＮＥＢ）、１μｌのＢＳＡ１００μｇ／ｍ
ｌ、４０ＵのＳａｌＩ（ＮＥＢ）、２．４μｇのＰＣＲ２産物または４．２μｇ
のｐＮＣＯ１１３）で３７℃で３時間消化し、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）で
精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（２０μｌのＯＰＡ緩衝液（ファルマシア）、４８
μｌのＳａｌＩ消化したＰＣＲ２産物または４８μｌのＳａｌＩ消化ｐＮＣＯ１
１３、２μｌ（２０Ｕ／μｌ）のＥｃｏＲＩ（ファルマシア）および３０μｌの
Ｈ₂Ｏ）で３７℃でさらに２時間消化し、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
消化ＰＣＲ２産物およびプラスミドｐＮＣＯ１１３を、Ｔ４リガーゼを用いて共
にライゲートすると、プラスミドｐＡＥ：全２０μｌ中、４４ｆｍｏｌのｐＮＣ
Ｏ１１３、１１１ｆｍｏｌのＰＣＲ２産物、４μｌの緩衝液（ギブコ）、および
１μｌのＴ４リガーゼ（１Ｕ）が得られた。

【００６５】混合物を、一晩、４℃でインキュベートし、ＰＣＲ精製キットで精製し、電気
穿孔法によりエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬＩ細胞に形質転換した。

【００６６】エレクトロコンピテント細胞の調製：１リットルのルリア−ブルタニ培地に、
１／１００容量の新鮮な一晩培養液を接種した。細胞を３７℃で激しく振盪しな
がら、光学密度０．５〜０．７まで増殖させた。細胞を、２０分間氷上で冷凍し
、冷ローターで４，０００ｇで１５分間４℃で遠心分離した。上清を取り出し、
ペレットを１リットルの氷冷無菌１０％グリセロールに再懸濁した。細胞を、２
回、前に記載したように遠心分離し、第一回目に０．５リットルに、第二回目は
２０ｍｌの氷冷無菌１０％グリセロールに再懸濁した。細胞をさらに長い時間遠
心分離し、ペレットを、氷冷１０％グリセロール中、最終容量２〜３ｍｌに再懸
濁した。この懸濁液を、８０μｌの等量で冷凍し、液体窒素中保存した。

【００６７】バイオラッドのジーン・パルサー装置を使用した電子形質転換：エレクトロコ
ンピテント細胞を、室温で解凍し、氷上に置いた。４０μｌの細胞懸濁液を、１
μｌのライゲーション混合物と混合し、無菌０．２ｃｍキュベット（バイオラッ
ド）に移した。懸濁液を、底まで振盪し、キュベットをチャンバースライドに入
れた。チャンバースライドを、チャンバーに押し入れ、電圧を印加した（２．５
０ｋＶ、２５μＦ、パルスコントローラー２００Ω）。キュベットをチャンバー
から取り出し、細胞を１ｍｌのＳＯＣ培地（２％カゼイン加水分解物、０．５％
酵母抽出液、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂
、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄、２０ｍＭグルコース）に懸濁した。懸濁液を１時間３
７℃で振盪し、１リットルあたり１５０ｍｇアンピシリンで補充したＬＢ培地上
に播いた。異なるクローンからのプラスミドを、４１Ｇ４Ｔ７について基準例１
に記載したように単離した（ｐＡＥ１−ｐＡＥ１１）。

【００６８】基準例３ｍａｌＥ−ｒｉｂＡ融合クローンの構築ｒｉｂＡ遺伝子を、鋳型として、プラスミドｐＡＥ１１（シロイヌナズナｒｉ
ｂＡ発現クローン由来）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。プラスミドｐＡＥ
１１を、（基準例１）のプラスミド４１Ｇ４Ｔ７に記載したように単離した。開
始コドンの前の制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を、修飾プライマーと共に、５'
末端に導入した。

【００６９】ＰＣＲ混合物：全容量１００μｌ中、１０ｐｍｏｌのプライマーＧＴＴＣＡＧ
ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＣＴＣ、１０ｐｍｏｌの
プライマーＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＣ
、２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏ
ｍｅｔｒａ）、１．７ｎｇのプラスミドｐＡＥ１１、および２０ｎｍｏｌのｄＮ
ＴＰ。

【００７０】混合物を、９４℃で５分間変性させた。次いで、２５サイクル（９４℃で６０
秒、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒）を実施した。さらに７分間７２℃でイ
ンキュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡをＰＣＲ精製キット（キア
ゲン）を用いて精製した。

【００７１】ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＭａｌ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ
ズ）を、制限酵素ＳａｌＩ（全容量１００μｌ中、１０μｌのＳａｌＩ緩衝液（
ＮＥＢ）、１μｌのＢＳＡの１００μｇ／ｍｌ、６０ＵのＳａｌＩ（ＮＥＢ）、
それぞれ２．０μｇのＰＣＲ産物または０．４μｇのｐＭａｌ−ｃ２）で３７℃
で２時間消化し、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（２０μｌのＯＰＡ緩衝液（ファルマシア）、それぞれ４８μｌのＳａｌ
Ｉ消化したＰＣＲ産物または４８μｌのＳａｌＩ消化したｐＭａｌ−ｃ２、３μ
ｌのＥｃｏＲＩ（２０Ｕ／μｌ）（ファルマシア）および３０μｌのＨ₂Ｏ）で
３７℃でさらに２時間消化し、ＰＣＲ精製キットで精製した。消化ＰＣＲ産物お
よびプラスミドｐＭａｌ−ｃ２を、Ｔ４−リガーゼを用いて共にライゲートする
と、プラスミドｐＭａｌ＿ｒｉｂＡ：全容量１０μｌ中、９ｆｍｏｌのｐＭａｌ
−ｃ２、３０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物、４μｌの緩衝液（ギブコ）、および１μｌ
のＴ４−リガーゼ（１Ｕ）が得られた。混合物を一晩４℃でインキュベートした
。このプラスミドは、ｍａｌＥ遺伝子と同じリーディングフレームにシロイヌナ
ズナｒｉｂＡ遺伝子を含み、その結果、ＩＰＴＧでの誘導後にＭＢＰ−ＲｉｂＡ
融合タンパク質が発現する。プラスミドｐＭａｌ＿ｒｉｂＡを、（基準例２）に
記載のような電気穿孔法により大腸菌ＸＬＩ細胞に形質転換した。

【００７２】基準例４トランジットペプチド配列を含まないｍａｌＥ−ｒｉｂＡ融合クローンの構築推定シグナル配列をコードする最初の３８４ｂｐを含まないｒｉｂＡ遺伝子を
、鋳型としてプラスミドｐＡＥ１１（シロイヌナズナｒｉｂＡ発現クローン由来
）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。セリン１２８の前の制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識部位を、修飾プライマーと共に５'末端に導入した。

【００７３】ＰＣＲ混合物：全容量１００μｌ中、１０ｐｍｏｌのプライマーＧＴＴＣＡＧ
ＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＣ、１０ｐｍｏｌのプライマーＡ
ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＣ、２ＵのＴａ
ｑポリメラーゼ、１０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ）
、１．７ｎｇのプラスミドｐＡＥ１１、および２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ。

【００７４】混合物を９４℃で５分間変性させた。次いで、９５サイクル（９４℃で６０秒
、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒）を実施した。さらに７分間７２℃でイン
キュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡをＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン）を用いて精製した。

【００７５】さらなる工程は、基準例３のｐＭａｌ＿ｒｉｂＡの構築に類似している。Ｒｉ
ｂＡの推定トランジットペプチド配列を含まない、ＭＢＰ−ＲｉｂＡ融合タンパ
ク質をコードするプラスミドを、ｐＭａｌ＿ｒｉｂＡＳと名付けた。

【００７６】調製例１ＭＢＰ−ＲｉｂＡ融合タンパク質の調製および精製７５ｍｇのアンピシリンを含む０．５リットルのルリアブルタニ（ＬＢ）培地
に、プラスミドｐＭａｌ＿ｒｉｂＡまたはｐＭａｌ＿ＲｉｂＡＳを有する、２０
ｍｌの大腸菌株ＸＬＩの一晩培養液を接種した。この培養液を、３７℃で振盪培
養液中で増殖させた。０．８の光学密度（６００ｎｍ）で、培養液を、１ｍＭｏ
ｌのＩＴＰＧで誘導した。培養液をさらに５時間増殖させた。細胞を遠心分離に
より２０分間５０００ｒｐｍで４℃で収集した。細胞を、０．９％ＮａＣｌ溶液
で洗浄し、上記のように遠心分離し、保存のために−２０℃で凍結した。

【００７７】細胞を、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、１ｍＭジチオトレイトールおよび１ｍｇのリゾチーム（緩
衝液Ａ）を含む１０ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）中で解凍した。
混合物を３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、６×１０秒（Ｂｒａ
ｎｓｏｎ超音波破砕機レベル４）で超音波破砕した。懸濁液を１５，０００ｒｐ
ｍで４℃で２０分間遠心分離した。上清を緩衝液Ａを用いて１：５に希釈し、８
ｍｌの緩衝液Ａで前以て平衡化した１ｍｌのアミロースレジンのカラム（ニュー
イングランドバイオラブズ）に適用した。カラムを、リゾチームを含まない１２
ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。融合タンパク質を、カラムから、２００ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭマルトースを含む、４ｍｌの２０ｍＭの
トリス塩酸塩（ｐＨ７．４）で溶出した。９．８ｍｇのＭＢＰ−ｒｉｂＡＳおよ
び５．６ｍｇのＭＢＰ−ｒｉｂＡタンパク質が得られた。タンパク質を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより同定した。ＭＢＰ−ｒｉｂＡＳは、８９ｋＤａのバンドを示し
、ＭＢＰ−ｒｉｂＡは、１０２ｋＤａのバンドを示した。

【００７８】調製例２「レダクターゼ」２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−ホス
フェイトレダクターゼ発現クローンの構築および精製１０ｐｍｏｌのプライマーＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣ
ＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧ、１０ｐｍｏｌのプライマーＴＡＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣ
ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＧＣ、２Ｕのｔａｑポリメラーゼ、１
０μｌの緩衝液（Ｐｒｉｍｅｚｙｍｅ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、２０ｎｍｏｌのｄ
ＮＴＰおよび３０ｎｇのサッカロミセス・セレビジアエＤＮＡを全１００μｌ中
に含む、ＰＣＲを実施した。混合物を９４℃で５分間変性させた。次いで、３０
サイクル（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で９０秒）を実施した。さ
らに７分間７２℃でインキュベートした後、混合物を４℃で冷却し、ＤＮＡをＰ
ＣＲ精製キット（キアゲン）で精製した。ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＮＣＯ
−Ｈ６を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ（全１００μｌ中、２０μｌのＯ
ＰＡ緩衝液（ファルマシア）、４０ＵのＢａｍＨＩ、４０ＵのＮｃｏＩおよび２
．５μｇのＰＣＲ産物または１μｇのｐＮＣＯ−Ｈ６）を用いて３７℃で３時間
消化した。消化ＤＮＡを、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）で精製し、Ｔ４−リガ
ーゼ（全２０μｌ中、４０ｆｍｏｌのｐＮＣＯ−Ｈ６、８０ｆｍｏｌのＰＣＲ産
物、４μｌの緩衝液（ギブコ）、１ＵのＴ４−リガーゼ）を用いて共にライゲー
トした。混合物を一晩インキュベートし、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用い
て精製し、基準例１に記載したようにエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１細胞
に形質転換した。

【００７９】プラスミドｐＮＣＯ−Ｈ６は、プラスミドｐＮＣＯ１１３（基準例２参照）に
本質的に同一であるが、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ認識部位間のＤＮＡ配列は、ＤＮ
Ａ配列：ＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＧ
ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣにより置換される。

【００８０】７５ｍｇのアンピシリンを含む０．５リットルのルリアブルタニ（ＬＢ）培地
に、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−
ホスフェイトレダクターゼの遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＯ−Ｈ６を有する大
腸菌細胞の２０ｍｌの一晩培養液を接種した。培養液を、振盪培養液中で３７℃
で増殖させた。０．８の光学密度（６００ｎｍ）で、培養液を、１ｍＭｏｌのＩ
ＴＰＧで誘導した。細胞を、２０分間、５０００ｒｐｍでの遠心分離により収集
した。細胞を０．９％生理食塩水で洗浄し、上記のように遠心分離した。細胞を
、０．６ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１０ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上で冷却し、６×１０秒間（Ｂｒａｎｓ
ｏｎ超音波破砕機レベル４）超音波破砕した。懸濁液を１５０００ｒｐｍで４℃
で２０分間遠心分離した。上清は約８０ｍｇのタンパク質を含み、Ｎｉ²⁺イオン
で荷電したハイトラップ（ファルマシア）金属キレートアフィニティーカラム（
容量５ｍｌ）にのせた。カラムを５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で洗浄した。２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジ
ノン−５−ホスフェイトレダクターゼを、５００ｍＭイミダゾールを含む１０ｍ
ｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで解析した。所望の２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−
ピリミジノン−５−ホスフェイトレダクターゼは２７ｋＤａの分子量を有する。

【００８１】スクリーニング例１ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性のスクリーニングアッセイ混合物は、表１に示したように、全容量８０μｌ中に、１００ｍＭト
リス塩酸塩（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール、
１ｍＭＧＴＰおよび２０μｌの酵素（８０μｇ）サンプルを含んだ。別々に、
これらの混合物に、０．５および５．０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５お
よび５．０ｍＭメチレン−ビスホスホネートを加えた。それらを３７℃で３０分
間インキュベートした。５％ジアセチルおよび２５０ｍＭのＥＤＴＡの誘導体化
溶液（２０μｌ）を加え、各混合物を９０℃で１時間インキュベートした。ジア
セチルは、酵素産物と反応し、６，７−ジメチルプテリンが得られ、これを続い
て、ヌクレオシルＲＰ１８のカラム上で逆相ＨＰＬＣにより測定した。溶出液は
、１００ｍＭギ酸アンモニウムおよび２５％のメタノールを含んだ。流出液を蛍
光定量的にモニタリングした（励起３６５ｎｍ；発光４３５ｎｍ）。１単位の酵
素活性は、３７℃で、１時間あたり、１ｎｍｏｌの２，５−ジアミノ−５−リボ
シルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトの形成を触媒する。

【００８２】スクリーニング例２アッセイ混合物は、１００ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭのＧＴＰおよび２０μｌの酵素
サンプルを含んだ。これらの混合物に別々に、０．２５および２．５ｍＭの２，
６−ジアミノ−５−ホルムアミド−ピリミジノンまたは０．２５および２．５ｍ
Ｍの１−ヒドロキシ−エチリデン−１，１−ビス−ホスフェイトを加え、混合物
を３７℃で３０分間インキュベートした。さらなる工程は、スクリーニング例１
と同一であった。

【００８３】

【表１】

【００８４】スクリーニング例３スクリーニング例１を、誘導体化溶液を添加しないことを除いて反復する。そ
の代わりに、アッセイ混合物は、さらに、１００μｇの２，５−ジアミノ−６−
リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジン５'−ホスフェイトレダクターゼおよ
び０．１ｍＭのＮＡＤＨを含み、全容量は５００μｌである。アッセイ混合物を
３７℃でキュベット中でインキュベートし、３４０ｎｍでの吸光度をモニタリン
グする。これにより、形成された２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（
３Ｈ）−ピリミジン５'ホスフェイトの速度に等しいＮＡＤＨの消費速度が得ら
れる。

【００８５】スクリーニング例４アッセイ混合物は、１００ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭのＧＴＰおよび２０μｌの酵素（８
０μｇのＭＢＰ−ｒｉｂＡ）サンプルを、全容量８０μｌ中に含む。類似混合物
は、さらに、０．５および５．０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含む。３０分間３
７℃でインキュベートした後、反応を、２０μｌの５０ｍＭのＥＤＴＡの添加に
より停止する。酵素産物の２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）
−ピリミジンジオン５'−ホスフェイトを、逆相ヌクレオシルＲＰ１８カラムを
用いてＨＰＬＣにより決定する。溶出液は、０．６％のイソプロパノールおよび
１％のホスフェイトトリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）を含む。産物は、２
９３ｎｍでのＵＶ吸光度により同定し、積分により定量する。吸光係数は、１２
，１００Ｍ^-1ｃｍ^-1である。

【００８６】スクリーニング例５アッセイ混合物は、１００ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＭｇＣ
ｌ₂、０．１ｍＭのＧＴＰおよび２０μｌの酵素（８０μｇのＭＢＰ−ｒｉｂＡ
）サンプルを、全容量５００μｌ中に含む。類似混合物は、さらに、０．５およ
び５．０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含む。アッセイは、酸素の排除下で３７℃
で石英キュベット中で実施する。反応速度は、２５２ｎｍでのＧＴＰの吸光度お
よび２９３ｎｍでの２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリ
ミジンジオン５'−ホスフェイトの吸光度により直接的にモニタリングする。

【００８７】スクリーニング例６２０μｌのＨ₂Ｏ中に、０または２．０または２０ｍＭのピロリン酸ナトリウ
ムを含む部分品Ｃを、全２０μｌ中に４００ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）、
３０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０ｍＭのＤＴＴおよび５０μｇのＭＢＰ＿ｒｉｂＡ酵
素を含む混合物Ａに加える。２０μｌのＨ₂Ｏ中に４ｍＭのＧＴＰを含む第三溶
液Ｂを加えて、反応を開始する。混合物を３５℃で３０分間インキュベートする
。５％ジアセチルおよび２５０ｍＭのＥＤＴＡを含む２０μｌの混合物Ｅを加え
、１時間９０℃で加熱する。６，７−ジメチルプテリンの量を、３μＭの６，７
−ジメチルプテリン標準物質との比較により、蛍光定量的に（励起３６５ｎｍ；
発光４３５ｎｍ）決定した。

【００８８】スクリーニング例７３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ活性のスクリ
ーニングアッセイ混合物は、全容量３０μｌ中に、３００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ
７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭリボース５−リン酸および０．１Ｕ
のペントース−リン酸イソメラーゼを含む。それらを３７℃で１５分間インキュ
ベートし、表２に示したように、１０μｌの酵素サンプルおよび１０μｌのＨ₂
Ｏまたは１０μｌの１００ｍＭピルブアルデヒドキシムを加えた。混合物（５０
μｌ）を１時間インキュベートした。２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）
、４０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭの５−アミノ−６
−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンおよび１０Ｕの枯
草菌由来のルマジンシンターゼ／リボフラビンシンターゼ複合体を含む溶液（５
０μｌ）を加えた。ルマジンシンターゼ／リボフラビンシンターゼは、Ｓｃｈｏ
ｔｔら、１９９０に記載のように調製する。混合物を１時間３７℃でインキュベ
ートし、次いで、９５℃で５分間変性させた。リボフラビンを、ヌクレオシルＲ
Ｐ１８のカラムで逆相ＨＰＬＣにより決定した。溶出液は、１００ｍＭギ酸アン
モニウムおよび４０％メタノールを含んだ。流出液を、蛍光定量的に（励起４４
５ｎｍ；発光５１６ｎｍ）モニタリングした。１単位の酵素活性は、１時間あた
り３７℃で１ｎｍｏｌの３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイト
の形成を触媒する。

【００８９】

【表２】

【００９０】スクリーニング例８アッセイは、スクリーニング例７に記載のように実施する。ルマジンシンター
ゼ／リボフラビンシンターゼ複合体の代わりに、６，７−ジメチル−８−リビチ
ル−ルマジンシンターゼのみを加える。６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマ
ジンは、ヌクレオシルＲＰ１８のカラムで逆相ＨＰＬＣにより決定する。溶出液
は、１０％メタノールおよび３０ｍＭのギ酸を含む。流出液を蛍光定量的（励起
４０８ｎｍ；発光４８７ｎｍ）でモニタリングする。

【００９１】スクリーニング例９アッセイ混合物は、全容量３０μｌ中に、３００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ
７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのリボース５−リン酸および０．１
Ｕのペントース−リン酸イソメラーゼを含む。それらを３７℃で１５分間インキ
ュベートする。１０μｌの酵素サンプル（ＭＢＰ−ｒｉｂＡＳ）および１０μｌ
のＨ₂Ｏまたは１０μｌの１００ｍＭピルブアルデヒドヒドキシムを加える。混
合物を１時間インキュベートする。２％のｏ−フェニレンジアミン、２０ｍＭの
ＤＴＴおよび１００ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液（５０μｌ）を加え、混合物を９
０℃で１時間インキュベートする。ｏ−フェニレンジアミンは、３，４−ジヒド
ロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトと反応して、ジメチルキノキサリンを生
成し、これを続いて、ヌクレオシルＲＰ１８のカラムで逆相ＨＰＬＣにより測定
する。溶出液は、１００ｍＭギ酸アンモニウムおよび２５％メタノールを含む。
流出液を蛍光定量的にモニタリングする。

【００９２】スクリーニング例１０２０μｌのＨ₂Ｏ中に、それぞれ０または６０ｍＭのピルブアルデヒドキシム
を含む部分品Ｍを、全２０μｌ中に４００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）
、５０ｍＭのＭｇＣｌ₂および５０μｇのＭＢＰ＿ｒｉｂＡ酵素を含む混合物Ｈ
に加える。２０μｌのＨ₂Ｏ中に５ｍＭリブロース５−リン酸を含む第三溶液Ｊ
を加えて反応を開始する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。全２
０μｌ中に、５０ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭの５−ア
ミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンを含む混
合物Ｐおよび２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１０Ｕの６，７−
ジメチル−８−リビチル−ルマジンシンターゼを含む混合物Ｒ（２０μｌ）を加
える。混合物を１時間３７℃でインキュベートし、次いで、１５％トリクロロ酢
酸を含む１００μｌの溶液Ｔの添加により変性させる。６，７−ジメチル−８−
リビチル−ルマジンの量は蛍光定量的（励起４０８ｎｍ；発光４８７ｎｍ）で、
１６μＭの６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン標準物質との比較により
決定する。

【００９３】ＡｎｎｅｘＡ＜参考文献＞ Bacher, A. (1991) Biosynthesis of flavins. In: Chemistry and Biochem
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【００９４】ＡｎｎｅｘＢ記載 GTPシクロヒドロラーゼII/3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-フォスフェー
トシンターゼ生物名 Arabidopsis thaliana

【化１】

【００９５】

【化１−つづき】

【００９６】

【化１−つづき】

【００９７】

【化１−つづき】

【００９８】

【化１−つづき】

【００９９】ＡｎｎｅｘＣ記載 GTPシクロヒドロラーゼII/3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-フォスフェー
トシンターゼ生物名 Lycopersicon esculentum

【化２】

【０１００】

【化２−つづき】

【０１０１】

【化２−つづき】

【０１０２】

【化２−つづき】

【０１０３】

【化２−つづき】

【０１０４】ＡｎｎｅｘＤ記載 2,5-ジアミノ-6-リボシルアミノ-4(3H)−ピリミジノン-リダクターゼ生物名 Saccharomyces cerevisiae

【化３】

【０１０５】

【化３−つづき】

【０１０６】

【化３−つづき】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１２月１４日（２０００．１２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＣＧ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA28 AA31 AA40 CB20 CB21 DA20 DA80 FB01 4B024 AA01 AA07 BA07 BA11 CA04 CA07 DA05 EA04 GA11 HA01 HA03 4B050 CC03 CC05 DD13 LL01 LL10 4B063 QA01 QQ01 QQ30 QQ40 QR08 QR19 QR33 QR42 QR44 QR50 QR57 QR59 QR62 QR66 QR67 QR80 QS05 QS17 QS25 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の阻害の存在または非存
在についてスクリーニングする方法であって、（ａ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質およびＧＴＰを含
む第一水性混合物を調製する工程と、（ｂ）前記第一混合物を、前以て決定した期間及び前以て決定した温度で反応さ
せ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノ
ン５'−ホスフェイトのレベルを検出する工程と、（ｃ）前記第一混合物に、前以て決定した量の化学的試験サンプルを含めること
により、第二水性混合物を調製する工程と、（ｄ）前記第二混合物を、前以て決定した期間及び前以て決定した温度で反応さ
せ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノ
ン５'−ホスフェイトのレベルを検出する工程と、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルよりも低い
かどうかの観察により、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの阻害の存在を決定する
工程とを含んでなる方法。
【請求項２】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の阻害の存在または非存
在についてスクリーニングする方法であって、（ａ）変異植物型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質および
ＧＴＰを含む第一水性混合物を調製する工程と、（ｂ）前記第一混合物を、前以て決定した期間及び前以て決定した温度で反応さ
せ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノ
ン５'−ホスフェイトのレベルを検出する工程と、（ｃ）前記第一混合物に、前以て決定した量の前記ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ
Ｉの特異的阻害剤を含めることにより、第二水性混合物を調製する工程と、（ｄ）前記第二混合物を、前以て決定した期間及び前以て決定した温度で反応さ
せ、続いて、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノ
ン５'−ホスフェイトのレベルを検出する工程と、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルに類似して
いるかどうかの観察により、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの阻害に対する抵抗
性の存在を決定する工程とを含んでなる方法。
【請求項３】前記水性混合物は二価の金属イオンを含む請求項１または２
に記載の方法。
【請求項４】前記二価の金属イオンはマグネシウムイオンである請求項３
に記載の方法。
【請求項５】前記混合物は抗酸化物質を含む請求項１または２に記載の方
法。
【請求項６】前記混合物は６〜９．５の範囲のｐＨを有する請求項１また
は２に記載の方法。
【請求項７】１つの必須成分を欠失した予混合物を調製し、反応を前記成
分の添加により開始させる請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリ
ミジノン５'−ホスフェイトのレベルは、直接的に、または化学的もしくは酵素
的誘導体化後に検出することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】前記直接的検出は、前記二価の金属イオンのキレート剤の添
加により反応を終結させた後に実施する請求項１および８または２および８に記
載の方法。
【請求項１０】化学的誘導体化は、ビシナルジオキソ化合物の添加により
実施する請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】前記ジオキソ化合物はジアセチルである請求項１０に記載
の方法。
【請求項１２】酵素的検出は、２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−
４（３Ｈ）−ピリミジノン５'−ホスフェイトレダクターゼおよびＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを添加し、ＮＡＤ（Ｐ）の形成を検出することにより実施する請求項１または
２に記載の方法。
【請求項１３】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシ
ンターゼ活性の阻害の存在または非存在についてスクリーニングする方法であっ
て、（ａ）３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を
有するタンパク質およびリブロース５−リン酸を含む第一水性混合物を調製する
工程と、（ｂ）前記混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応させ
、続いて、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトのレベルを検
出する工程と、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の前記３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン−４−ホスフェイトシンターゼの特異的阻害剤を含めることにより、
第二水性混合物を調製する工程と、（ｄ）前記第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応
させ、続いて、再度、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトの
レベルを検出する工程と、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルより低いか
どうかの観察により、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェイト
シンターゼの阻害の存在を決定する工程とを含んでなる方法。
【請求項１４】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシ
ンターゼ活性の存在または非存在についてスクリーニングする方法であって、（ａ）変異植物型３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンタ
ーゼ配列を有するタンパク質およびリブロース５−リン酸を含む第一水性混合物
を調製する工程と、（ｂ）前記混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反応させ
、続いて、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトのレベルを検
出する工程と、（ｃ）前記の第一混合物に、前以て決定した量の前記３，４−ジヒドロキシ−２
−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼの特異的阻害剤を含めることにより、第
二水性混合物を調製する工程と、（ｄ）前記の第二混合物を、前以て決定した期間および前以て決定した温度で反
応させ、続いて、再度、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェイ
トのレベルを検出する工程と、（ｅ）工程（ｄ）で検出したレベルが、工程（ｂ）で検出したレベルに類似して
いるかどうかの観察により、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェ
イトシンターゼの阻害に対する抵抗性の存在を決定する工程とを含んでなる方法。
【請求項１５】前記水性混合物は二価の金属イオンを含む請求項１３また
は１４に記載の方法。
【請求項１６】前記の二価の金属イオンはマグネシウムイオンである請求
項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記混合物は６〜９．５の範囲のｐＨを有する請求項１３
または１４に記載の方法。
【請求項１８】１つの必須成分を欠失した予混合物を調製し、反応を前記
成分の添加により開始させる請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１９】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトの
存在は、直接的に、または化学的もしくは酵素的誘導体化後に検出する請求項１
３または１４に記載の方法。
【請求項２０】前記検出は、前記二価の金属イオンのキレート剤の添加に
より反応を終結させた後に実施する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記の化学的誘導体化は、芳香族またはヘテロ芳香族オル
ト−ジアミンの添加により実施する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】酵素的誘導体化のために、６，７−ジメチル−８−リビチ
ルルマジンシンターゼおよび５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，
３Ｈ）−ピリミジンジオンを加え、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン
のレベルを検出する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】酵素的誘導体化のために、６，７−ジメチル−８−リビチ
ルルマジンシンターゼ、リボフラビンシンターゼおよび５−アミノ−６−リビチ
ルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンを加え、リボフラビンのレ
ベルを検出する請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】前記第一水性混合物は、ペントース−リン酸イソメラーゼ
およびリボース５−リン酸を含む第一予混合物を前以て反応させ、そして、前記
前以て反応させた第一予混合物を、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホ
スフェイトシンターゼ配列を有する前記タンパク質または前記変異３，４−ジヒ
ドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を有する前記タンパク
質を含む第二予混合物と混合することにより調製することを特徴とする請求項１
３または１４に記載の方法。
【請求項２５】化学的試験サンプルにおけるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ
Ｉ活性の阻害の存在または非存在についてスクリーニングするための部分品のキ
ットであって、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質を含む部
分品Ａと、ＧＴＰを含む部分品Ｂとを含んでなるキット。
【請求項２６】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の特異的阻害剤に対す
る、変異ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列を有するタンパク質の抵抗性の存在
または非存在についてスクリーニングするための部分品のキットであって、前記
特異的阻害剤を含む部分品Ｃと、ＧＴＰを含む部分品Ｂとを含んでなるキット。
【請求項２７】部分品Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つまたは別個の部分
品Ｄに二価の金属イオンをさらに含んでなる請求項２５または２６に記載の部分
品のキット。
【請求項２８】前記二価の金属イオンのキレート剤は、別個の部分品Ｅに
含まれる請求項２７に記載の部分品のキット。
【請求項２９】部分品Ｅまたは別個の部分品Ｆにビシナルジオキソ化合物
をさらに含んでなる請求項２５〜２８の１つに記載の部分品のキット。
【請求項３０】部分品Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの少なくとも１つおよび／また
は別個の部分品Ｇに２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリ
ミジノン５'−ホスフェイトレダクターゼをさらに含み、部分品Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ
、Ｅ、Ｇの少なくとも１つにＮＡＤ（Ｐ）Ｈをさらに含んでなる請求項２５〜２
８の１つに記載の部分品のキット。
【請求項３１】化学的試験サンプルにおける３，４−ジヒドロキシ−２−
ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ活性の阻害の存在または非存在についてス
クリーニングするための部分品のキットであって、３，４−ジヒドロキシ−２−
ブタノン４−ホスフェイトシンターゼ配列を有するタンパク質を含む部分品Ｈと
、リボース５−リン酸を含む部分品Ｌと共にリブロース５−リン酸を含む部分品
Ｊまたはペントース−リン酸イソメラーゼを含む部分品Ｋとを含んでなるキット
。
【請求項３２】３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシ
ンターゼ活性の特異的阻害剤に対する変異３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
４−ホスフェイトシンターゼ配列を有するタンパク質の抵抗性の存在または非存
在についてスクリーニングするための部分品のキットであって、前記特異的阻害
剤を含む部分品Ｍと、リボース５−リン酸を含む部分品Ｌと共にリブロース５−
リン酸を含む部分品Ｊまたはペントース−リン酸イソメラーゼを含む部分品Ｋと
を含んでなるキット。
【請求項３３】部分品Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍの少なくとも１つまたは別個の
部分品Ｎに二価の金属イオンをさらに含んでなる請求項３１〜３２の１つに記載
の部分品のキット。
【請求項３４】前記二価の金属イオンのキレート剤は、別個の部分品Ｐに
含まれる請求項３３に記載の部分品のキット。
【請求項３５】部分品Ｐまたは別個の部分品Ｑに芳香族またはヘテロ芳香
族オルト−ジアミンをさらに含んでなる請求項３１〜３４の１つに記載の部分品
のキット。
【請求項３６】部分品Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐの少なくとも１つまた
は別個の部分品Ｒに６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンシンターゼをさら
に含み、部分品Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒの少なくとも１つに５−アミノ
−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンをさらに含ん
でなる請求項３１〜３４の１つに記載の部分品のキット。
【請求項３７】部分品Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒの少なくとも１つ
または別個の部分品Ｓにリボフラビンシンターゼをさらに含んでなる請求項３６
に記載の部分品のキット。
【請求項３８】ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩおよび／または３，４−ジ
ヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイトシンターゼの植物酵素配列を有し、
ＧＴＰシクロヒドロラーゼおよび／または３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
−４−ホスフェイトシンターゼの機能を有する単離タンパク質。
【請求項３９】補助タンパク質配列をさらに有する請求項３８に記載のタ
ンパク質。
【請求項４０】植物は、単子葉または双子葉植物である請求項３８に記載
のタンパク質。
【請求項４１】請求項３８に記載のタンパク質および所望によりフラビン
生合成経路の少なくとも１つの他の酵素を専らコードする単離ＤＮＡ。
【請求項４２】請求項４１に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列を含んでな
るベクター。
【請求項４３】請求項１または１３の方法で阻害を示す化学化合物の群か
ら選択した化合物での処理により、植物のまたは植物におけるＧＴＰシクロヒド
ロラーゼＩＩ活性および３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−ホスフェイト
シンターゼ活性を有する酵素を阻害する方法。
【請求項４４】請求項１の方法で阻害を示す化学化合物の群から選択した
化合物での処理により、微生物のまたは微生物におけるＧＴＰシクロヒドロラー
ゼＩＩ活性を有する酵素を阻害する方法。
【請求項４５】請求項１３の方法で阻害を示す化学化合物の群から選択し
た化合物での処理により、微生物のまたは微生物における３，４−ジヒドロキシ
−２−ブタノン−４−ホスフェイトシンターゼ活性を有する酵素を阻害する方法
。