JP2007074964A - ウリジン−５’−ジホスホガラクツロン酸またはその塩の製造方法 - Google Patents

ウリジン−５’−ジホスホガラクツロン酸またはその塩の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】酵素反応によりウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸を優れた効率で製造できる方法の提供。
【解決手段】ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質とし、特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は前記のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる酵素により酵素反応を行い、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成させる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩の製造方法に関する。
ペクチンは、植物の細胞壁を構成するポリサッカライドであり、植物の成長や発達に関与する重要な因子であると推測されている。しかしながら、未だその生合成系が解明されておらず、成長制御にどのように関与しているかが不明である。
このペクチン生合成系を研究するための必須の基質として、ペクチンの主成分であるガラクツロン酸の前駆体であるウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸が知られている。このウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸の製造方法としては、例えば、ウリジン-５'-ジホスホグルクロン酸にウリジン-５'-ジホスホグルクロン酸-４-エピメラーゼを含む大根の粗酵素を作用させる方法（非特許文献１〜３）や、ガラクツロン酸-１-リン酸にウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸ピロホスホリラーゼを含む緑豆の粗酵素を作用させる方法（非特許文献４）等が報告されている。
しかしながら、これらの方法で使用する酵素はいずれも粗酵素であって、基質を分解するタンパク質が含まれるため、得られるウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸の収率は、前者の方法で１４〜１６％程度、後者の方法で約１２％と低い値である。また、ウリジン-５'-ジホスホガラクトースの６位を化学的あるいは酵素的に酸化する方法が報告されているが（非特許文献５〜７）、この方法によっても収率は３０〜３１％程度にすぎない。
このように、従来の方法では収率が極めて低いことから、一度の製造で十分量のウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸を得ることが困難である。このため、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸をペクチン生合成系の研究用基質として商業的に提供するには至っておらず、ペクチン生合成系の研究を円滑に進めることが困難な状況である。
Neufeld, E. Y., Feingold, D.S., Hassid, W. S. (1958) J. Am. Chem. Soc. 80, 4430-4431 Mitcham, E. J., Gross, K. C., Wasserman, B. P. (1991) Phytochem. Analysis 2, 112-115 Liljebjelke, K. Adolphson, R., Baker. K., Doong, R. L., Mohnen, D. (1995) Anal. Biochem. 225, 296-304 Feingold, D. S., Neufeld, E. F., Hassid, W. S. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 78, 401-406 Rao, A. K., Mendicino, J. (1976) Anal. Biochem. 72, 400-406 Basu, S. S., Dotson, G. D., Raetz, C. R. (2000) Anal. Biochem. 280, 173-177 Ridley, B. L., O'Neill, M. A., Mohnen, D. (2001) Phytochemistry. 57, 929-967
そこで、本発明は、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸を優れた効率で製造できる方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するため、本発明は、酵素反応によりウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を製造する方法であって、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質とし、以下の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素により酵素反応を行うことを特徴とする。
（Ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ） 配列番号２または配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡにコードされたアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ） 前記（Ｃ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるＤＮＡでコードされるアミノ酸配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質
本発明の製造方法によれば、優れた収率でウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を得ることができる。このため、例えば、今まで研究が遅延しているペクチン研究用の基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を商業的に提供することが可能となり、ペクチン生合成系の研究促進を実現できる。
本発明は、前述のように、酵素反応によりウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を製造する方法であって、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質とし、前述の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素により酵素反応を行うことを特徴とする。なお、本発明において、前述の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素をウリジン-５’-ジホスホ糖ピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ）という。
前記（Ａ）における配列番号１のアミノ酸配列は、例えば、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．由来のＵＳＰの配列である。Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．由来のＵＳＰについては、Kotake, T., Yamaguchi, D., Ohzono, H., Hojo, S., Kaneko, S., Ishida, H. K., Tsumuraya, Y. (2004) J. Biol. Chem. 279, 45728-45736に報告がなされているが、このＵＳＰがウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸を生成することは、本発明者らが初めて見出したことである。
前記（Ｃ）における配列番号２の塩基配列は、例えば、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．由来ＵＳＰ、すなわち、前記配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列（コーディング配列）である。これらのアミノ酸配列および塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベースにＡＢ１７８６４２の登録番号で登録されている。配列番号３は、配列番号２の塩基配列の情報をもとにアミノ酸配列におきかえたものである。なお、配列番号４は、配列番号２の塩基配列の周辺領域を含む塩基配列である。
前記（Ｂ）に示すように、前記タンパク質は、前述の化合物を基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するものであれば、前記（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。ここで、欠失、置換もしくは付加が可能なアミノ酸残基数としては、例えば、アミノ酸残基数５０個に対して、０〜１４個である。また、アミノ酸配列の相同性が、例えば、７２％以上のもの、好ましくは７７％以上のものもあげられる。
前記（Ｄ）においても、前述の化合物を基質とし、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質であれば、前記（Ｃ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるＤＮＡでコードされるアミノ酸配列のタンパク質であってもよい。ここで、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、塩基数５０個に対して、０〜１４個である。
また、前述のような酵素活性を有する限りにおいて、タンパク質をコードするＤＮＡが、例えば、前記（Ｃ）における配列番号２または配列番号４に示すＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡや、前記（Ｃ）のＤＮＡとの相同性が、例えば、９０％以上であるもの、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上であるものもあげられる。特に配列番号２に示すＤＮＡと上述のようにハイブリダイズしたり、相同性を示すものが好ましい。
前記ハイブリダイズは、従来公知の方法で行うことができ、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、温度条件は、配列番号２または配列番号４（好ましくは配列番号２）で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃が好ましく、より好ましくは±２℃、さらに好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）、続いて、０．２×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）があげられる。
本発明におけるＵＳＰの調製方法は特に制限されない。例えば、前述のＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．の培養物から抽出精製してもよいが、一度の培養で大量のＵＳＰを発現させ、容易に単一精製を行えることから、ＵＳＰをコードする遺伝子（例えば、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ）を導入した形質転換体の培養物から組換えタンパク質として調製することが好ましい。ＵＳＰの精製度としては、特に制限されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した際に、目視で単一バンドを示すことが好ましい。
以下に、組換え技術を用いたＵＳＰの調製方法の一例を示すが、これには制限されない。
まず、目的の遺伝子（ＵＳＰ遺伝子）を宿主に導入して形質転換体を調製する。この導入方法は、特に制限されず、例えば、前記遺伝子をベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を作製する方法等、従来公知の方法が採用できる。
ＵＳＰをコードする遺伝子としては、例えば、前述のように以下のＤＮＡからなる遺伝子があげられる。
（Ｅ） 配列番号２または配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｆ） 前記（Ｅ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
これらのＤＮＡは、例えば、配列番号２の塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．等のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型としてＰＣＲを行うことによって得ることができるが、これには制限されない。また、前述のようにＵＳＰの酵素活性を有する限りにおいて、前記（Ｅ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡや、前記（Ｅ）のＤＮＡとの相同性が、例えば、９０％以上である遺伝子があげられる。
なお、ＰＣＲでＵＳＰ遺伝子を増幅させる場合には、例えば、Ｎ末端にチオレドキシンドメインやＨｉｓタグを付加するようなプライマーを使用することが好ましい。このようにチオレドキシンドメインの付加によって、例えば、目的タンパク質の発現量の増大、発現タンパク質の溶解性の向上というメリットがあり、また、Ｈｉｓタグの付加によって後述する精製が容易になるというメリットがある。
前記宿主の種類は、特に制限されないが、宿主-ベクター系が確立されているものが好ましく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物等があげられる。
前記ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ等のプラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等があげられ、組換えベクターを導入する宿主の種類等に応じて適宜決定できる。また、組換えベクターの導入法も、特に制限されず、導入する宿主の種類に応じて、塩化カルシウム処理法やエレクトロポレーション法等、従来公知の方法が採用できる。
つぎに、得られた形質転換体を培養する。この培養条件は、特に制限されず、使用した宿主の種類やベクターの種類に応じて適宜決定できる。具体例として宿主が大腸菌の場合には、一般に、液体培地中で、８〜１６℃の範囲、１週間〜２週間、培養を行う。また、使用するベクターの種類に応じて、ＩＰＴＧ等の誘導物質を培地に添加し、目的遺伝子（ＵＳＰ遺伝子）の発現を誘導してもよい。
続いて、形質転換体の培養液から目的のＵＳＰを精製する。精製方法は特に制限されないが、例えば、培養液から形質転換体を回収し、タンパク質を抽出した後、各種カラムに供する方法があげられる。
前記タンパク質の抽出方法としては、特に制限されないが、例えば、酵素で形質転換体を溶解する方法、形質転換体の超音波破砕等、従来公知の方法があげられる。また、溶解用の酵素としては、リゾチーム等や、市販の試薬キット（例えば、商品名Lyzonase Bioprocessing Reagent：Novegen社製）も使用できる。
カラムの種類は特に制限されないが、例えば、ＵＳＰを前述のようにＨｉｓタグ（Ｈｉｓ6タグ）を付加した融合タンパク質として発現させた場合には、ニッケルを結合させたアフィニティーカラム（商品名HiTrap Chelating HPカラム：Amersham社製）等が使用できる。前記アフィニティーカラムにおける溶出条件は特に制限されず、従来公知の条件が適用できるが、例えば、緩衝液中のイミダゾール濃度を上げることによって、前記融合タンパク質を溶出することができる。
そして、このように精製したタンパク質を精製ＵＳＰとして、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩の製造に使用することが好ましい。また、前述のようにＵＳＰをチオレドキシンドメインの融合タンパク質として発現させた場合には、精製画分を、例えば、トロンビン、エンテロキナーゼ等で処理し、チオレドキシンドメインを除去したものを精製ＵＳＰとして使用すればよい。
前述のような組換え技術によりＵＳＰを調製すれば、極めて優れた効率で目的のＵＳＰを発現でき、さらに、精製工程が容易になることから、精度の高いＵＳＰ（例えば、単一精製ＵＳＰ）を得ることができる。このため、このような方法により得られたＵＳＰをウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸の製造に使用すれば、例えば、ガラクツロン酸-１-リン酸、ウリジン-５'-三リン酸、および、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸等の基質を分解する不要なタンパク質が酵素溶液に混雑することを防止できるため、後述するウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸の合成をより一層優れた効率で行うことができる。なお、従来の酵素化学的手法において使用されていた酵素は、例えば、大根や緑豆より抽出した粗酵素であって、単一精製は実現されていない。
本発明において、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡにコードされたアミノ酸配列を示すＵＳＰ（配列番号１に示すタンパク質）の性質は、以下の通りである。
分子量 ：約６７，０００
サブユニット：モノマー
至適ｐＨ ：６．０
至適温度 ：４５℃
Ｋｍ値 ：ウリジン‐５'‐三リン酸 ０.５７ｍＭ
ガラクツロン酸-１-リン酸 １.１１ｍＭ
ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸 ０.５１ｍＭ
ピロリン酸 １.６１ｍＭ
本発明におけるＵＳＰの触媒反応ならびに活性測定方法を以下に示す。ＵＳＰの触媒反応は、下記式に示すように可逆反応であり、正反応によってウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸が生成される。
Figure 2007074964
ＵＳＰの活性測定方法
本発明において、酵素（ＵＳＰ）１ユニットは、下記条件で、１μｍｏｌのウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素量とする。以下に、ＵＳＰ酵素活性を測定するための酵素反応条件の一例を示す。
５０ｍＭ ３−モルホリノスルホン酸（ＭＯＰＳ）-ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭウリジン‐５'‐三リン酸、１ｍＭガラクツロン酸-１-リン酸およびＵＳＰからなる反応溶液１００μｌを３５℃で１時間インキュベートする。反応終了後、前記反応溶液をＨＰＬＣに供し、以下の条件で反応生成物の分析を行う。
（ＨＰＬＣ条件）
ＨＰＬＣカラム ：商品名ＤＥＡＥ-５ＰＷ（東ソー社製）
カラムサイズ ：７．５×７５ｍｍ
溶離液Ａ ：１０ｍＭ硫酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）
溶離液Ｂ ：８００ｍＭ硫酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．８）
直線グラジェント：開始から５分間 Ａ：Ｂ＝８０：２０（ｖ／ｖ）
１５分間 Ａ：Ｂ＝５５：４５（ｖ／ｖ）
５分間 Ａ：Ｂ＝４５：５５（ｖ／ｖ）
５分間 Ａ：Ｂ＝０：１００（ｖ／ｖ）
流速 ：１ｍｌ／分
検出波長*1 ：２６２ｎｍ
＊１ ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸およびウリジン
‐５'‐三リン酸を検出
ＨＰＬＣの分析結果から、反応溶液中のウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸およびウリジン‐５'‐三リン酸の量を算出して、酵素量（１Ｕ）に換算する。
つぎに、ＵＳＰを用いたウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸の合成方法の一例を以下に示す。なお、所定の基質を用いて前述の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素（ＵＳＰ）により酵素反応を行う以外は、特に制限されない。
基質としては、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを使用する。ガラクツロン酸-１-リン酸の塩としては、特に制限されないが、ガラクツロン酸-１-リン酸のカルボキシル基またはリン酸基の水素の少なくとも１つが、例えば、Ｎａ、Ｋに置換されてもよい。また、ウリジン-５'-三リン酸の塩としては、特に制限されないが、ガラクツロン酸-１-リン酸のカルボキシル基またはリン酸基の水素が、Ｎａ、Ｋに置換されてもよい。なお、これらの基質は、それぞれ、いずれか一種類でもよいし、異なる塩を含む２種類以上を併用してもよい。
反応溶液中におけるガラクツロン酸-１-リン酸（または塩）とウリジン-５'-三リン酸（または塩）の濃度は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、０．１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０．２〜５ｍＭの範囲であり、より好ましくは０．５〜１ｍＭの範囲である。また、反応溶液中におけるＵＳＰの濃度は、例えば、基質の濃度によって適宜決定できるが、ガラクツロン酸-１-リン酸（または塩）とウリジン-５'-三リン酸（または塩）の濃度がそれぞれ１ｍＭの場合、例えば、０．００１Ｕ／ｍｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜０．５Ｕ／ｍｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜０．５Ｕ／ｍｌの範囲である。
反応は、通常、緩衝液中で行うことが好ましく、例えば、ＭＯＰＳ-ＫＯＨ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ（2-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］エタンスホン酸）緩衝液等があげられ、好ましくは、ＭＯＰＳ-ＫＯＨ緩衝液である。緩衝液のｐＨは、通常、使用するＵＳＰの至適ｐＨに応じて決定でき、例えば、ｐＨ５〜９の範囲であり、好ましくはｐＨ６〜７の範囲である。反応溶液中における緩衝液の濃度は、例えば、１０〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２０〜５０ｍＭの範囲である。
本発明におけるＵＳＰは、前述のように逆反応の触媒反応を示す場合がある。したがって、正反応によって効率良くウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸を合成するため、反応溶液に逆反応の基質となるピロリン酸の分解酵素を添加することが好ましい。このような酵素としては、例えば、ピロホスファターゼ等があげられる。反応溶液におけるピロホスファターゼの濃度は、例えば、ＵＳＰの濃度に応じて適宜決定できるが、ガラクツロン酸-１-リン酸（または塩）とウリジン-５'-三リン酸（または塩）の濃度がそれぞれ１ｍＭの場合、例えば、０．００５〜０．５Ｕ／ｍｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌの範囲であり、より好ましくは０．０５〜０．１Ｕ／ｍｌの範囲である。
また、反応溶液は、適宜添加剤を含んでもよく、例えば、ウシ血清アルブミン、グリセロール等があげられる。
反応条件は特に制限されないが、温度は、例えば、１０〜５５℃の範囲であり、好ましくは３０〜４５℃の範囲、より好ましくは３５〜４０℃の範囲、反応時間は、例えば、１分〜２４時間、好ましくは５分〜１２時間、より好ましくは１０分〜１時間である。
このような酵素反応によって、優れた収率でウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸（または塩）を得ることができる。具体的な収率としては、前述のような反応条件下で、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９０〜９５％（９５％程度）の範囲である。なお、得られたウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸（または塩）は、例えば、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ等）やゲルろ過カラムを用いて精製できる。また、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸塩は、例えば、ゲルろ過カラム等に供することによって、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸とすることもできる。
ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸（または塩）は、前述のようにペクチン研究用基質として極めて有用であるため、本発明の製造方法は、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸（または塩）の商業的な提供に有用である。
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。
ウリジン-５’-ジホスホピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ）の調製
文献（Kotake, T., Yamaguchi, D., Ohzono, H., Hojo, S., Kaneko,S., Ishida, H. K., Tsumuraya, Y. (2004)J. Biol. Chem. 279, 45728-45736）に基づいて、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来ＵＳＰ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号２）を大腸菌内で発現させ、ＵＳＰを調製した。
Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍのｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号５のＳ-１プライマー（forward primer）および配列番号６のＲ-１プライマー（reverse primer）を用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を付加したＵＳＰコード領域を増幅させた。このＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し、これをプラスミドベクターｐＥＴ３２ａ(Novagen)のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩのサイトに挿入して組換えプラスミドを作製した。なお、このベクターへの挿入によって、ＵＳＰのＮ末端にチオレドキシンドメインとＨｉｓ6タグとが結合した融合タンパク質を発現することができる。
配列番号５ Ｓ-１プライマー
5'- GGATCCATGGCTTCCTCCCTCGG -3'
配列番号６ Ｒ-１プライマー
5'- GAGCTCTATATTCTTTGCGCAC -3’
この組換えプラスミドを常法によりEscherichia coliのRosetta２株に導入した。そして、得られた形質転換体をＬＢ培地中、１０℃で培養し、ＯＤ600が０．６に達した時点で終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２４時間培養して目的遺伝子の発現を誘導した。培養菌体を集菌した後、菌体を、発現タンパク質抽出試薬（商品名Bugbuster：Novagen社製）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）、０．０１％リゾチームおよび２５ｋＵ／ｍｌエンドヌクレアーゼ（商品名Benzonase：Novagen社製）中、室温で１５分間、溶菌処理し、タンパク質を抽出した。処理後のタンパク質抽出液を遠心分離して上清（サンプル１）を回収した。
ニッケルを結合させたアフィニティーカラム（商品名HiTrap Chelating HPカラム：Amersham社製）５ｍｌを５０ｍＭイミダゾール含有２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化し、前述の上清を添加してから、前記リン酸カリウム緩衝液で未吸着タンパク質を洗浄した（サンプル２）。洗浄後、２５０ｍＭイミダゾール含有２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）により、目的のチオレドキシン−ＵＳＰ融合タンパク質を溶出させた（サンプル３）。得られた融合タンパク質を０．１Ｕ／ｍｇタンパク質のトロンビンで酵素処理してチオレドキシン部分を切断したものを、精製酵素（サンプル４）とした。
なお、タンパク質抽出液の上清（サンプル１）、未吸着タンパク質画分（サンプル２）、精製チオレドキシン−ＵＳＰ融合タンパク質（サンプル３）および精製ＵＳＰ（サンプル４）をポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動に供し、精製度を確認した。この結果を図１のＰＡＧＥ電気泳動写真に示す。同図において、レーンＭが分子量マーカー、レーン１がサンプル１、レーン２がサンプル２、レーン３がサンプル３、レーン４がサンプル４の結果である。図示のように、アフィニティーカラムでの一段階の精製により、融合タンパク質サンプル（レーン３）、および、融合タンパク質からチオレドキシンを切断した目的のＵＳＰ酵素（レーン４）が、単一バンドの精製度を示した。
ＵＳＰの酵素化学的特性
得られたＵＳＰについて、至適ｐＨ、平衡常数、各基質のＫｍ値を測定した。
（１）至適ｐＨ
緩衝液として、５０ｍＭ酢酸-ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ４、ｐＨ５）、５０ｍＭ ＭＥＳ-ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５）、５０ｍＭ ＭＯＰＳ-ＫＯＨ（ｐＨ６．５、ｐＨ７．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）をそれぞれ使用する以外は、前述の活性測定方法に従って、ＵＳＰの酵素活性を測定した。そして、ＭＥＳ-ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した際の活性を「１」として、それぞれの相対活性を算出した。この結果を図２のグラフに示す。図示のように、ウリジン‐５'‐三リン酸とガラクツロン酸-１-リン酸を基質とした場合のＵＳＰの至適ｐＨは、６．０であった。
（２） 平衡常数
正反応および逆反応のそれぞれについて、以下の基質を使用する以外は、前述の活性測定方法測定に従って酵素反応を行い、反応溶液中のウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸含量をＨＰＬＣによって測定した。この可逆反応の平衡の結果を図３のグラフに示す。同図において、縦軸は、反応溶液中のウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸（ＵＤＰ-ＧａｌＵＡ）含量、横軸は反応時間を示し、●は正反応、○は逆反応の結果である。
正反応基質：１ｍＭウリジン‐５'‐三リン酸、
および、１ｍＭガラクツロン酸-１-リン酸
逆反応基質：１ｍＭウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸
および、１ｍＭピロリン酸
その結果、ウリジン‐５'‐三リン酸およびガラクツロン酸-１-リン酸が６８％、ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸およびピロリン酸が３２％の状態で平衡に達し、平衡常数は０．２４であった。
（３） Ｋｍ値
ウリジン‐５'‐三リン酸とガラクツロン酸-１-リン酸、ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸とピロリン酸を、それぞれ基質の組み合わせとし、各基質濃度を変化させて活性測定を行い、各基質についてのＫｍ値を測定した。なお、酵素反応は、基質濃度を変化させた以外は、前述の方法で行った。その結果、Ｋｍ値は、ウリジン‐５'‐三リン酸に対して０.５７ｍＭ、ガラクツロン酸-１-リン酸に対して１.１１ｍＭ、ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸に対して０.５１ｍＭ、ピロリン酸に対して１.６１ｍＭであった。
ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸の大量合成
下記組成の反応溶液（３２ｍｌ）を３５℃で１２時間処理し、ウリジン‐５'‐ガラクツロン酸の大量調製を行った。
（反応溶液組成）
５０ｍＭ ＭＯＰＳ-ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
０.０１％ウシ血清アルブミン
１ｍＭウリジン‐５'‐三リン酸
１ｍＭガラクツロン酸-１-リン酸
０.１Ｕ／ｍｌピロホスファターゼ
０．５ｕｎｉｔ／ｍｌ 精製酵素（ＵＳＰ）
反応溶液をカラムに供してウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸の精製を行った。まず、前述の溶離液（Ａ：Ｂ＝７５：２５（ｖ／ｖ））で平衡化した陰イオン交換カラム（商品名ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｃｅｌ：アマシャム社製、１.２×２０ｃｍ）に前記反応溶液を供し、５０ｍｌの溶離液（Ａ：Ｂ＝７５:２５（ｖ／ｖ））を流した後、終了時にＡ：Ｂ＝４５:５５（ｖ／ｖ）となるように直線グラジエントで２００ｍｌの溶離液をさらに流した。そして、ウリジン‐５'‐ガラクツロン酸含有画分を回収し、この回収液を水で平衡化したゲルろ過カラム（商品名ＨＷ４０Ｆゲルろ過：東ソー社製、３.０×５０ｃｍ）に供し、さらに水を流してウリジン‐５'‐ガラクツロン酸含有画分を回収した。このガラクツロン酸含有画分について、前述の方法によりＨＰＬＣ分析を行いウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸の生成を確認した。
以上の結果から、ＵＳＰによってウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸を生成することが確認された。また、生成されたウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸は約１６．９ｍｇであり、約９１％という優れた収率を実現することができた。
図４に、コントロール、反応前（０時間）の反応溶液、ならびに反応１時間後の反応溶液についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。なお、反応溶液の組成ならびにＨＰＬＣの条件は、前述の通りである。同図は、ＨＰＬＣのカラムクロマトグラムであり、１は、ウリジン‐５'‐三リン酸のコントロール、２は、ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸のコントロール、３は、反応前の反応溶液（０時間）、４は、反応１時間後の反応溶液の結果を示す。同図に示すように、反応前の反応溶液は、基質であるウリジン‐５'‐三リン酸と同じリテンションタイムのみにピークが確認されたが、反応１時間後には、ウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸と同じリテンションタイムでピークが確認された。
以上のように、本発明によれば、優れた収率でウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を得ることができる。このため、今まで研究が遅延しているペクチン研究用の基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を商業的に提供することが可能となり、ペクチン生合成系の研究促進を実現できる。
本発明の一実施例におけるＵＳＰのＰＡＧＥ電気泳動写真。 本発明の他の実施例におけるＵＳＰの至適ｐＨを示すグラフ。 本発明の他の実施例における反応溶液中のウリジン‐５'‐ジホスホガラクツロン酸（ＵＤＰ-ＧａｌＵＡ）含量を示すグラフ。 本発明の他の実施例における反応溶液のＨＰＬＣクロマトグラム。

Claims (7)

  1. 酵素反応によりウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を製造する方法であって、
    ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質とし、以下の（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素により酵素反応を行うことを特徴とする、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩の製造方法。
    （Ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質
    （Ｃ） 配列番号２または配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡにコードされたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ） 前記（Ｃ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるＤＮＡでコードされるアミノ酸配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質
  2. 前記酵素が、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．由来のタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
  3. 前記酵素が組換えタンパク質である、請求項１または２記載の製造方法。
  4. 前記酵素が、以下のＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターを有する形質転換体由来の組換えタンパク質である、請求項３記載の製造方法。
    （Ｅ） 配列番号２または配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ
    （Ｆ） 前記（Ｅ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ガラクツロン酸-１-リン酸またはその塩と、ウリジン-５'-三リン酸またはその塩とを基質として、ウリジン-５'-ジホスホガラクツロン酸またはその塩を生成する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
  5. 酵素が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した際に、目視で単一バンドを示す精製酵素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 前記酵素反応を、ピロホスファターゼの共存下で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 前記（Ａ）〜（Ｄ）に示すタンパク質からなる酵素と、さらに共存させる酵素との添加割合（酵素量比）が、１：１〜１０：１の範囲である、請求項６記載の製造方法。

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