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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem, das nützlich ist,
um Repertoires von DNA-Bindungsdomänen durchzutesten. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Testsystem, das auf Transkriptionsaktivatoren bakterieller, σ54-abhängiger Promotoren
basiert.
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Die
Mehrzahl der an zellulären
Funktionen beteiligten Proteine tut dies, indem sie mit anderen
Proteinen oder mit Nukleinsäuresequenzen
in der Zelle interagiert. Es sind verschiedene Ansätze beschrieben
worden, die die in vivo-Selektion von Nukleinsäuren erlauben, die Polypeptide
exprimieren, die dazu befähigt
sind, an Proteine oder an DNA in der Zelle zu binden. Unzweifelhaft
sind die Hefe-ein-Hybridsysteme und Hefe-zwei-Hybridsysteme (Fields
S. & Song O.
(1989) Nature 340, 245; siehe US-Patent 5,283,173) die wichtigsten
technischen Ansätze
für das
Durchtesten von Protein-DNA-Interaktionen, bzw. Protein-Protein-Interaktionen. Jedoch
erfordert das Zwei-Hybridsystem einen eukaryotischen Wirt und folglich
ist die Bandbreite, auf die getestet werden kann, begrenzt. Weiterhin
leidet das System wohlbekannter Weise an der Vielzahl falsch positiver
Treffer.
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In
bakteriellen Wirten können
größere molekulare
Repertoires hergestellt werden, und es ist entsprechend auch eine
Anzahl von Bakteriensystemen zum Testen von Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen
beschrieben worden. Es sind zwei Systeme vorgestellt worden, bei
denen die Polypeptidkette eines Enzyms in zwei Teilen exprimiert
wird, die mit zwei Kandidaten-Polypeptiden fusioniert sind und bei
denen die Interaktion zwischen den Kandidaten-Polypeptiden die Funktion
des Enzyms wiederherstellt (Karimova G. et al. (1998) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 95, 5752; Pelletier J.N. et al (1998) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 95, 12141). Die WO 98/25947 beschreibt ein Zwei-Hybrid-System,
das die Interaktion homo- und heterodimerer Proteine in E. coli
und anderen Zellen detektieren kann.
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Es
sind außerdem
mehrere in vivo-Tests für
DNA-bindende Proteine beschrieben worden (siehe Übersichtsartikel von Mossing
M.C., Bowie J.U. & Sauer
R.T. (1991) Methods Enzymol. 208, 604; Elledge S.J. et al. (1989)
Proc. Nat. Acad. Sci USA 86, 3689). An jedem dieser Verfahren ist
die Blockierung eines Hybrid-σ70-Promotors
durch das DNA-bindende Protein beteiligt. Die Repression des Promotors
verhindert entweder die Produktion eines konditionell toxischen
Gens oder mildert die Repression eines Antibiotikum-Gens durch transkriptionelle
Interferenz. Der Test auf transkriptionelle Interferenz (Elledge
et al.) ist in einem Fall erfolgreich verwendet worden, um DNA-Bindungsproteine
mit veränderter
Spezifität
zu selektieren (Sera T. & Schultz
P.G. (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 2920).
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Ein
weiteres, auf σ70-basierendes
System nutzt die Heranziehung der Polymerase an den Promotor über eine
Protein-Protein-Interaktion zwischen einer Protein-Domäne, die
an die RNA-Polymerase α-Untereinheit
fusioniert ist, und einer anderen Domäne, die mit dem Lambda-Repressor
fusioniert ist, der unmittelbar stromaufwärts von der RNA-Polymerase-Bindungsstelle des
Promotors bindet (Dove S.L., Joung J.K., Hochschild A. (1997), Nature
386, 627). Durch Ersetzen der DNA-Bindungsdomäne des Lambda-Repressors durch eine
Bibliothek von Zn-Finger-Domänen
wurden spezifische DNA-bindende Zn-Finger-Domänen selektiert (Joung J.K.,
Ramm E.I., Pabo C.O. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7382).
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Die
alternative Holoenzym-Form der bakteriellen RNA-Polymerase (RNAP)
beinhaltet den σ54-Faktor (σ54-RNAP).
Wie zuvor gezeigt wurde, bildet diese Polymerase in den meisten
Fällen
einen geschlossenen Komplex mit dem Promotor. Anders als bei den σ70-Promotoren,
an die die RNA-Polymerase in einer aktiven Form gebunden ist und
weitgehend durch Repression kontrolliert wird, ist das σ54-RNA-Polymerase-Holoenzym
transkriptionell inkompetent und nicht befähigt, selber die Transkription
zu initiieren. Die Initiation der Transkription erfordert die Anwesenheit
eines Transkriptionsaktivators, der die Isomerisierung des geschlossenen Promotorkomplexes
in einen offenen Komplex katalysiert. Typischerweise binden Aktivatorproteine
an eine spezifische stromaufwärtige
Aktivatorsequenz (UAS), die 80 bis 200 bp stromaufwärts des σ54-Kernpromotors liegt.
Die Funktion der UAS besteht darin, den Aktivator an der richtigen
Position festzuhalten und ihn in die Nähe des Promotors zu bringen,
um die Effizienz der Interaktion zwischen der σ54-RNAP und dem Aktivator zu
steigern. Transkriptionsaktivatoren von σ54-abhängigen Promotoren sind als
bakterielle Enhancer bezeichnet worden, da deren Mechanismus der
Aktivierung bei oberflächlicher
Betrachtung der Transkriptionsaktivierung durch Enhancer-Proteine
in Eukaryoten ähnelt
(Kustu S. et al (1991) Trends Biochem Sci 16, 397).
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Die
Umwandlung der σ54-RNAP
in eine aktive Form wird katalysiert durch die Bindung eines Enhancer-Proteins,
die mit der Hydrolyse von ATP verbunden ist. Dieser ungewöhnliche
Mechanismus bedingt das niedrige Niveau von Hintergrund-Transkription
und den enormen Unterschied (104–105) zwischen dem eingeschalteten und abgeschalteten
Zustand der stärksten σ54-Promotoren,
der durch einen einzigen Faktor bewirkt wird. Im Vergleich dazu
steigern Aktivatoren von σ70-Promotoren,
wie etwa CAP oder λcl,
die Transkriptionsniveaus für
gewöhnlich
um weniger als das 10-fache. Transkriptionsaktivatoren von σ54-Promotoren (auch
bekannt als Enhancer-Bindungsproteine oder EBPs) teilen eine gemeinsame
Struktur (siehe Morrett und Segovia (1993), J. Bacteriol. 6067–6074),
die eine nicht-konservierte N-terminate Domäne umfasst, die eine putative
regulatorische Funktion besitzt, eine zentrale Domäne, die
für die
Transkriptionsaktivierung verantwortlich ist, und eine C-terminale
DNA-Bindungsdomäne, die
an die relevante UAS im Zielgen bindet. Die Domänen sind modular: die zentrale
und die N-terminale Domäne
sind zusammen zu einer konstitutiven Aktivierung der σ54-RNAP befähigt, wenn
eine Überexpression
erfolgt. Wenigsten in einigen Fällen
ist die isolierte DNA-Bindungsdomäne dazu befähigt, spezifisch an ihre DNA-Erkennungsstelle
zu binden.
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In
vielen Fällen,
wird die Interaktion zwischen der σ54-RNAP und dem Aktivator durch
einen zellulären Faktor
verstärkt,
der die DNA-Krümmung
zwischen der UAS und dem σ54-Promotor unterstützt (Freundlich
et al., (1992) Mol Microbiol. 6:2557–2563). Dieser Faktor, der
als Integration Host Factor (IHF) bekannt ist, hat die Wirkung,
die von den σ54-Promotoren
ausgehende Transkription zu unterstützen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Wir
stellen hier ein neues Testsystem bereit, das auf Transkriptionsaktivatoren σ54-basierter Promotoren
beruht.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zum Feststellen
einer Protein-Nukleinsäure-Interaktion
zwischen einem Nukleinsäuremolekül und einem
Proteinmolekül
in vitro oder in vivo in Bakterien bereitgestellt, mit den Stufen,
in denen man:
- a) ein oder mehrere Hybrid-σ54-Aktivatorproteine
bereitstellt, welche eine heterologe Nukleinsäurebindungsdomäne und eine
konstitutiv aktive σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfassen,
- b) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle bereitstellt,
welche eine Bindungsstelle für
die Nukleinsäurebindungsdomäne und eine
Bindungsstelle für σ54-RNAP,
welche die Expression eines Reportergens steuert und als Reaktion
auf eine Aktivierung durch die σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne zu einer
Hochregulierung davon führt,
umfassen und
- c) Expression des Reportergens feststellt.
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Die
Erfindung stellt ein Reportersystem bereit, das sich durch sehr
niedrige Niveaus der Hintergrundexpression auszeichnet, da die σ54-Polymerase
in Abwesenheit eines σ54-Transkriptionsaktivators
transkriptionell inkompetent ist. Da bei physiologischen Konzentrationen
die Bindung des Transkriptionsaktivators an die Nukleinsäure erforderlich
ist, um die Transkription durch σ54-RNAP
zu aktivieren, kann das System der Erfindung als Werkzeug zur Untersuchung
und/oder zum Test auf Protein/Nukleinsäure-Interaktionen verwendet
werden, wobei hierfür
die Messung des Reportergens genutzt wird.
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In
einem ersten Aspekt der Erfindung kann entweder das Nukleinsäure-Bindungsprotein
oder das Nukleinsäuremolekül in Form
eines Repertoires von Molekülen
bereitgestellt werden. Die Repertoires der Hybrid-σ54-Aktivatorproteine
weisen bevorzugt einen teilweise oder vollständig zufälligen Charakter wenigstens der
heterologen Nukleinsäurebindungsdomäne auf.
Dies ermöglicht
das Selektieren von Molekülen
aus der Bibliothek, die die gewünschten
Nukleinsäurebindungseigenschaften
besitzen.
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Die
Repertoires der Nukleinsäuremoleküle weisen
vorzugsweise einen teilweise oder vollständig zufälligen Charakter bezüglich der
Bindungsstelle für
die Nukleinsäurebindungsdomäne des σ54-Aktivatorproteins
auf. Dies erlaubt die Selektion von Nukleinsäuremolekülen mit den gewünschten
Bindungsstellen für
die chimären
Aktivatoren.
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Bei
einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein System für die Selektion
von Protein-Protein-Interaktionen
auf Basis der oben beschriebenen, konstitutiv aktiven Hybrid-σ54-Aktivatoren bereitgestellt.
Das System gemäß der Erfindung
ist vom Konzept her dem Hefe-zwei-Hybridsystem ähnlich.
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Dementsprechend
wird ein Verfahren zum Feststellen einer Protein-Protein-Interaktion
in vitro oder in vivo in Bakterien bereitgestellt, mit den Stufen,
in denen man:
- a) ein erstes Hybridprotein bereitstellt,
welches eine Nukleinsäurebindungsdomäne und einen
ersten Polypeptidsequenzköder
umfasst,
- b) ein zweites Hybridprotein bereitstellt, welches eine Beutepolypeptidsequenz
und eine konstitutiv aktive σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst,
- c) ein Nukleinsäuremolekül bereitstellt,
welches eine Bindungsstelle für
die Nukleinsäurebindungsdomäne und eine
Bindungsstelle für σ54-RNAP,
welche die Expression eines Reportergens steuert und als Reaktion auf
eine Aktivierung durch die σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne zu einer
Hochregulierung des Reportergens führt, umfasst,
- d) die ersten und zweiten Hybridproteine zusammen mit dem Nukleinsäuremolekül inkubiert,
so dass die Beute- und Köderpolypeptidsequenzen
binden können,
wobei ein Hybridprotein ausgebildet wird, welches sowohl eine Nukleinsäurebindungsdomäne als auch
eine σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst, und
- e) Expression des Reportergens feststellt.
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Wie
Fachleuten ersichtlich sein wird, beinhaltet der Bezug auf „eine Bindungsstelle" für eine Nukleinsäurebindungsdomäne auch
die Bereitstellung mehrerer geeignet beabstandeter Bindungsstellen
in dem Nukleinsäuremolekül.
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Wie
im Fall des Hefe-zwei-Hybridsystems, bei dem ein modularer Transkriptionsfaktor über die
Bildung von Hybriden durch Bindung zwischen einer DNA-bindenden
Domäne/Köder und
einer Transkriptionsaktivierungsdomäne/Beute zusammengesetzt wird,
erlaubt die Assoziation der Nukleinsäurebindungsdomäne und der σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne durch
die Köder/Beute-Interaktion
die Detektion von und das Testen auf Protein-Protein-Bindungs-Interaktionen
in vivo und in vitro. Vorteilhafter Weise werden die Köder- und/oder
Beute-Polypeptidsequenzen in Form von Repertoires bereitgestellt,
die (hinsichtlich ihrer Sequenzen) teilweise oder vollständig zufällig sein
können.
Dies erlaubt die Selektion von Beute-Polypeptiden auf Basis ihrer
Befähigung,
Interaktionen mit einem gewünschten
Köder auszuführen (oder
umgekehrt). Da der Test in vivo, d.h. in einem Bakterium, durchgeführt werden
kann, erlaubt die Erfindung die Detektion von in vivo-Bindungswechselwirkungen
zwischen Polypeptiden in Bakterien.
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Es
wird erkennbar sein, dass die Hybridproteine, die für die Verfahren
der Erfindung nutzbar sind, vorteilhafter Weise in Form von Nukleinsäurevektoren
oder Bibliotheken davon bereitgestellt werden, die dazu befähigt sind,
diese Proteine in einem Wirtsbakterium zu exprimieren. Vorteilhafter
Weise beinhaltet der Vektor bzw. beinhalten die Vektoren erste und
zweite chimäre
Gene, die die Hybridproteine der Erfindung codieren. Vorzugsweise
beinhalten die Vektoren auch Mittel für die Replikation in Bakterien.
Ebenfalls können
ein oder mehrere Markergene einbezogen sein, deren Expression im
Bakterium die Selektion der Zellen, die den Vektor/die Vektoren
enthalten, gegenüber
denjenigen Zellen erlaubt, die keine(n) Vektoren) enthalten. Vorzugsweise
handelt es sich bei dem/den Vektoren) um (ein) Plasmid(e).
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In
einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchtesten
eines Repertoires von Kandidaten für DNA-krümmende Polypeptide in vivo
in Bakterien bereit, mit den Stufen, in denen man:
- a) ein Repertoire von Kandidatenpolypeptidfaktoren mit dem Potential,
ein Krümmen
von DNA zu induzieren, bereitstellt,
- b) ein σ54-Aktivatorprotein
bereitstellt, welches eine Nukleinsäurebindungsdomäne und eine σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst,
- c) ein Nukleinsäuremolekül bereitstellt,
welches eine Bindungsstelle für
die Nukleinsäurebindungsdomäne und eine
Bindungsstelle für σ54-RNAP,
welche die Expression eines Reportergens steuert und als Reaktion
auf eine Aktivierung durch die σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne zu einer
Hochregulierung des Reportergens führt, umfasst,
- d) das Repertoire und den σ54-Aktivator
zusammen mit dem Nukleinsäuremolekül in einer
Integration Host Factor- (IHF-)-Wirtszelle inkubiert, so dass σ54-Aktivator
und das Nukleinsäuremolekül miteinander
wechselwirken können,
und Transkription, die von der σ54-RNAP-Bindungsstelle
in einer Art und Weise aktiviert wird, die von DNA-Krümmung durch
die Polypeptidfaktoren abhängig
ist, erfolgt, und
- e) Expression des Reportergens feststellt.
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Es
ist bekannt, dass die Aktivierung durch σ54-Aktivatoren durch Faktoren
reguliert werden kann, die eine DNA-Krümmung im Zielgen induzieren.
Beispielsweise ist der Integration Host Factor IHF dafür bekannt, dass
er die σ54-Aktivierung
potenziert; darüber
hinaus kann er durch alternative DNA-krümmende Polypeptide oder durch
intrinsisch gekrümmte
DNA ersetzt werden.
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Die
Erfindung stellt darüber
hinaus Verfahren zur Entwicklung verbesserter, auf σ54-Aktivator basierender
Werkzeuge bereit.
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Das
erste chimäre
Gen beinhaltet eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Nukleinsäurebindungsdomäne und ein
erstes (Köder-)Testprotein
oder -Proteinfragment in einer solchen Weise codiert, dass das erste
Testprotein als Teil eines Hybridproteins mit der Nukleinsäurebindungsdomäne exprimiert
wird.
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Das
zweite chimäre
Gen beinhaltet auch einen Promotor und ein Transkriptionsterminationssignal
zur Steuerung der Transkription. Das zweite chimäre Gen umfasst außerdem eine
Nukleinsäuresequenz,
die eine σ54-Transkriptionsaktivierungsdomäne und ein
zweites (Beute-)Testprotein oder -Proteinfragment in einer solchen
Weise in dem Vektor codiert, dass das zweite Testprotein als Teil
eines Hybridproteins mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne exprimiert
werden kann.
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Die
Offenbarung stellt weiterhin Kits bereit, um die Erfindung, wie
sie durch die angefügten
Ansprüche definiert
wird, umzusetzen, wobei die Kits vorteilhafter Weise einen Behälter, zwei
Vektoren und eine Wirtszelle umfassen. Der erste Vektor enthält einen
Promotor und kann ein Transkriptionsterminationssignal beinhalten, das
funktionell mit dem ersten chimären
Gen verbunden ist, um die Transkription des ersten chimären Gens zu
steuern. Das chimäre
Gen umfasst vorteilhafter Weise eine oder mehrere singuläre Restriktionsstelle(n), um
eine Nukleinsäuresequenz
zu inserieren, die ein Test-Köderpolypeptid
codiert. Das Kit kann auch einen zweiten Vektor beinhalten, der
ein zweites chimäres
Gen enthält,
optional mit einer oder mehreren singulären Restriktionsstelle(n),
um eine Nukleinsäuresequenz
zu inserieren, die das Beute-Polypeptid codiert; alternativ kann
das zweite chimäre
Gen im selben Vektor enthalten sein wie das erste chimäre Gen.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1A ist
eine schematische Darstellung der σ54-RNAP-Aktivierung durch den σ54-Aktivator NifA.
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1B ist
eine schematische Darstellung der Erfindung, wobei die σ54-DNA-Bindungsdomäne durch eine
heterologe GCN4-DNA-Bindungsdomäne
ersetzt ist.
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2 ist
eine schematische Darstellung des ersten Aspekts der vorliegenden
Erfindung, wobei eine Bibliothek von DNA-Bindungsdomänen zusammen
mit einer Bibliothek von DNA-Bindungsdomänen-Bindungsstellen
durchgetestet wird, um Protein:DNA-Bindungspartner zu identifizieren.
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3 zeigt
die Aktivierung der Transkription durch NifA-Chimären, ausgedrückt als
Prozentsatz der wildtypischen (WT)-Aktivität (NifA/UAS). Nif-GCN4 (in
Gegenwart des Coaktivators NifAΔC
(NifADC)) zeigt dabei nahezu WT-Aktivität. Es wird dabei eine gleichwertige
Aktivität
für die
beiden verschiedenen GCN4-DNA-Erkennungsstellen (ATF/Creb und AP-1)
beobachtet. Weniger als 1 % der WT-Aktivität wird dagegen bei einem nicht
zugehörigen
Reporter, wie etwa einem, der die wildtypische nifH-UAS trägt, beobachtet.
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4 zeigt
die Aktivierung der Transkription durch NifA-Chimären, ausgedrückt als
Prozentanteil der WT-Aktivität
(NifA/UAS). Nif-ERDBD (in Gegenwart des Coaktivators NifAΔC (NifADC))
zeigt etwa 80% der WT-Aktivität.
Sehr geringe Aktivierung wird bei einem nicht zugehörigen Reporter
beobachtet, der die DNA-Erkennungsstelle (GRE) für den nahe verwandten Glucocorticoid-Rezeptor
trägt.
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5 zeigt
die Coaktivierung durch verschiedene NifA-Varianten, ausgedrückt als
Prozentanteil im Vergleich zur Aktivität des WT (NifAwt). NifA aus
Klebsiella pneumoniae (NifAKp) ist dabei allen anderen überlegen
und übersteigt
sogar die WT-Aktivität
(bis zu 160%). NifAKp mit einer Deletion seiner DNA-Bindungsdomäne (NifAΔCKp (NifADCKp))
ist nahezu genauso aktiv.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Solange
nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie gemeinhin
vom Durchschnittsfachmann verstanden würden (z.B. vom Durchschnittsfachmann
in bakterieller Zellkultur, Molekulargenetik, Nukleinsäurechemie,
Proteinchemie und Biochemie). Es werden Standardtechniken für die molekularen,
genetischen und biochemischen Verfahren (siehe allgemein Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. und
Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4.
Auflage, John Wiley & Sons,
Inc., und ebenso für
die chemischen Verfahren, pharmazeutischen Formulierungen und die
Verabreichung und Behandlung bei dem Patienten verwendet.
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A: Nukleinsäuren und
Proteine
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Wie
hier verwendet, bezieht sich „Nukleinsäure" auf jedwede natürliche Nukleinsäure, einschließlich RNA
und DNA, und ebenso auf synthetische Nukleinsäuren, umfassend modifizierte
oder synthetische Basen bzw. Gemische modifizierter oder synthetischer
Basen mit natürlichen
Basen. Solche modifizierten und/oder synthetischen Basen können als
Derivate von DNA oder RNA bezeichnet werden. Vorzugsweise bezieht
sich „Nukleinsäure" auf DNA.
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Die
Erfindung beinhaltet die Verwendung modifizierter und/oder künstlicher „Nukleinsäuren". Es ist eine Anzahl
von Modifikationen beschrieben worden, die die Chemie des Phosphodiester-Rückgrates,
der Zucker- oder der heterozyklischen Basenbestandteile der Nukleinsäuren verändern.
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Unter
den nützlichen
Veränderungen
der Chemie des Rückgrates
sind Phosphorothioate; Phosphorodithioate, bei denen beide der nicht
an der Brückenbildung
beteiligten Sauerstoffe durch Schwefel ersetzt sind; Phosphoroamidite;
Alkylphosphotriester und Boranophosphate. Achirale Phosphat-Derivate
beinhalten 3'-O-5'-S-Phosphorothioat,
3'-S-5'-O-Phosphorothioat,
3'-CH2-5'-O-Phosphonat und
3'-NH-5'-O-Phosphoroamidat.
Peptid-Nukleinsäuren
ersetzen das gesamte Phosphodiester-Rückgrat durch eine Peptid-Verknüpfung.
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Zuckermodifikationen
sind ebenfalls bekannt. Es kann das α-Anomer der Desoxyribose verwendet werden,
bei dem die Base im Bezug auf das natürliche β-Anomer invertiert ist. Das
2'-OH des Ribosezuckers kann
verändert
werden, um 2'-O-Methyl-
oder 2'-O-Allyl-Zucker
zu bilden, was Widerstandsfähigkeit
gegen Abbau verleiht, ohne Affinität mit sich zu bringen.
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Die
Modifikation der heterozyklischen Basen muss die korrekte Basenpaarung
erhalten. Einige nützliche
Austausche beinhalten Desoxyuridin für Desoxythymidin; 5-Methyl-2'-desoxycytidin und 5-Brom-2'-desoxycytidin für Desoxycytidin.
Es ist für
5-Propynyl-2'-desoxyuridin und
5-Propynyl-2'-desoxycytidin
gezeigt worden, dass sie die biologische Aktivität beibehalten, wenn sie anstelle
von Desoxythymidin bzw. Desoxycytidin eingesetzt werden.
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Wie
hier verwendet, schließt
der Begriff „Protein" einzelkettige Polypeptidmoleküle ebenso
ein wie Komplexe aus mehreren Polypeptiden, bei denen die einzelnen,
darin enthaltenen Polypeptide auf kovalentem oder nicht-kovalentem
Wege verbunden sind. Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Polypeptid" und „Peptid" auf ein Polymer,
bei dem die Monomere Aminosäuren
sind und durch Peptidbindungen oder Disulfid-Bindungen miteinander
verbunden sind. Der Begriff Domäne
bezieht sich auch auf Polypeptide und Peptide mit biologischer Funktion.
Ein für
die Erfindung nützliches
Peptid wird eine Bindungsfähigkeit
oder eine Fähigkeit
zur Transkriptionsaktivierung besitzen, d.h. im Hinblick auf die
Bindung an Nukleinsäuren,
andere Proteine oder Polypeptide und die Aktivierung der σ54-RNAP-Transkription. Es
kann auch eine andere biologische Funktion besitzen, die eine biologische
Funktion eines Proteins oder einer Domäne ist, aus der die Peptidsequenz
abgeleitet ist.
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Ein
Hybridprotein ist ein Protein oder Polypeptid, das Bestandteile
umfasst, die aus wenigstens zwei natürlich vorkommenden oder künstlichen
Proteinen abgeleitet sind. Insbesondere kann es die DNA-Bindungsdomäne eines
Proteins und die Proteinbindungs- oder Transkriptionsaktivierungsdomäne eines
zweiten Proteins umfassen.
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B: σ54-Aktivatoren
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Aktivatoren
der σ54-Transkription
sind wohlbekannt und sind z.B. von Buck et al., J. Bacteriol. 2000 Aug;
182(15): 4129-36; Studholme und Buck, FEMS Microbiol. Lett. 2000,
Mai 1; 186(1): 1–9;
Shingler, Mol. Microbiol. 1996 Feb; 19(3): 409-16; Goosen und van
der Putte, Mol Microbiol. 1995 Apr; 16(1): 1–7; Merrick, Mol Microbiol.
1993 Dec; 10(5): 903-9; und anderen in Übersichtsartikeln beschrieben
worden. Es ist eine Familie derartiger Aktivatorproteine definiert
worden, wobei man für
deren Mitglieder gemeinsame Homologie in der zentralen (katalytischen)
Domäne
gefunden hat, die für
die σ54-RNAP-Aktivierung
verantwortlich ist.
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Die
Mitglieder der Familie beinhalten die Folgenden (die Nummern sind
GenBank-Zugangsnummern):
- dbj|BAA16379.1|(D90877) FORMIATHYDROGENLYASE-TRANSKRIPTIONSAKTIVATOR;
- emb|CAA26472.1|(X02616) pot. NifA-Genprodukt (AS 1-484) [Klebsiella
pneumoniae];
- emb|CAA53584.1|(X75972) anfA [Rhodobacter capsulatus];
- emb|CAA92413.1|(Z68203) NifA-Homologes [Rhizobium sp.];
- emb|CAA93242.1|(Z69251) MopR [Acinetobacter calcoaceticus];
- emb|CAB53157.1|(X07567) NifA1 [Rhodobacter capsulatus];
- emb|CAB56537.1|(AJ249642) Antwortregulator [Pseudomonas stutzeri];
- gb|AAA58220.1|(U18997) ORF_o532 [Escherichia coli];
- gb|AAA99303.1|(L43064) Regulatorprotein [Pseudomonas aeruginosa];
- gb|AAB91397.1|(AF033203) NifAll-Protein [Rhodobacter cappulatus];
- gb|AAC05586.1|(AF006075) Regulatorprotein [Bacillus subtilis];
- gb|AAC37124.1|(L81176) FleQ [Pseudomonas aeruginosa];
- gb|AAC45640.1|(AF010585) mutmaßlicher Sigma 54-Aktivator
[Caulobacter crescentus];
- gb|AAC46367.1|(AF014113) Zwei-Komponenten-Antwortregulator [Vibrio
cholerae];
- gb|AAD34591.1|AF145956_1 (AF145956) Transkriptionsaktivator
NifA [Rhodospirillum rubrum];
- gb|AAD38416.1|(AF155934) NifA [Alcaligenes faecalis];
- gb|AAF28395.1|(AF069392) FflaM [Vibrio parahaemolyticus];
- gb|AAF33506.1|(AF170176) Salmonella typhimurium Transkriptionsregulatorprotein;
- gb|AAF61932.1|(AF230804) Sigma-54-Aktivatorprotein Actl [Myxococcus
xanthus];
- gb|AAF85342.1|AE004061_7 (AE004061) Zwei-Komponenten-System,
Regulatorprotein [Xylella fastidiosa];
- gb|AAF94676.1|(AE004230) von Sigma-54 abhängiger Antwortregulator [Vibrio
cholerae];
- gb|AAF95280.1|(AE004286) von Sigma-54 abhängiger Antwortregulator [Vibrio
cholerae];
- gb|AAF96095.1|(AE004358) von Sigma-54 abhängiger Transkriptionsregulator
[Vibrio cholerae];
- gb|AAG01527.1|AF288483_1 (AF288483) nifa [Azospirillum brasilense];
- pir||A48291 Ornithindecarboxylaseinhibitor – Escherichia coli;
- pir||B49940 Stickstoffregulator I-Homologes – Escherichia coli;
- pir||C70320 Transkriptionsregulator NifA-Familie – Aquifex
aeolicus;
- pir||C70396 Transkriptionsregulator NtrC-Familie – Aquifex
aeolicus;
- pir||C70454 Transkriptionsregulator NtrC -Familie – Aquifex
aeolicus;
- pir||D70315 Transkriptionsregulator NtrC -Familie – Aquifex
aeolicus;
- pir||H69581 Transkriptionsaktivator von Acetoin-Dehydrogenase-Operon
acor – Bacillus
subtilis;
- pir||139719 Stickstoffregulatorprotein – Agrobacterium tumefaciens;
- pir||JC5471 Regulatorprotein NifA – Azospirillum lipoferum;
- pir||T08624 wahrscheinlicher Antwortregulator vom NtrC -Typ – Eubacterium
acidaminophilum;
- sp|P03027|NIFA_KLEPN NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P09570|NIFA_AZOVI NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P12627|VNFA_AZOVI STICKSTOFFIXIERUNGSPROTEIN VNFA;
- sp|P14375|HYDG_ECOLI TRANSKRIPTIONSREGULATORPROTEIN HYDG;
- sp|P21712|YFHA_ECOLI HYPOTHETISCHES 49,1 KD PROTEIN IN GLNB-PURL-INTERGENREGION (ORFXB);
- sp|P24426|NIFA_RHILT NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P25852|HYDG_SALTY TRANSKRIPTIONSREGULATORPROTEIN HYDG;
- sp|P27713|NIFA_HERSE NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P30667|NIFA_AZOBR NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P38035|RTCR_ECOLI TRANSKRIPTIONSREGULATORPROTEIN RTCR;
- sp|P54929|NIFA_AZOLI NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|P56266|NIFA_KLEOX NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN;
- sp|Q06065|ATOC_ECOLI ACETOACETAT-METABOLISMUSREGULATORPROTEIN
ATOC (ORNITHIN/ARGININ);
- sp|Q46802|YGEV_ECOLI HYPOTHETISCHER, VON SIGMA-54 ABHÄNGIGER TRANSKRIPTIONSREGULATOR
IN;
- sp|Q53206|NIFA_RHISN NIF-SPEZIFISCHES REGULATORPROTEIN; und
- sp|Q9ZIB7|TYRR_ERWHE TRANSKRIPTIONSREGULATORPROTEIN TYRR.
-
Es
ist weiterhin eine Anzahl von Polypeptiden beschrieben worden, die
zu der σ54-Aktivatorfamilie
gehören
und deren 3D-Strukturen bekannt sind. Diese beinhalten: 113161 Acetoinkatabolismus-Regulatorprotein;
113629 Alginatbiosynthese-Transkriptionsregulatorprotein ALGB; 266789
Typ 4 Fimbrien-Expressionsregulatorprotein PILR; 113833 Stickstoff-Fixierungsprotein
ANFA; 138884 Stickstoff-Fixierungsprotein VNFA; 128219 Nif-spezifisches
Regulatorprotein; 3024194 Nif-spezifisches Regulatorprotein; Acetoacetatmetabolismus-Regulatorprotein
ATOC 1168553 (Ornithin/Arginin-Decarboxylase-Inhibitor) (Ornithin-Decarboxylase-Antizym);
417166 Transkriptionsregulatorprotein HYGD; 266622 Nifspezifisches
Regulatorprotein; 1352500 Nif-spezifisches Regulatorprotein; 128224
Nifspezifisches Regulatorprotein; 128225 Nif-spezifisches Regulatorprotein;
128221 Nifspezifisches Regulatorprotein; 128226 Nif-spezifisches
Regulatorprotein; 1346014 Transkriptionsregulatorprotein FLBD; 549560
Hypothetischer Sigma54-abhängiger
Transkriptionsregulator in der GUTQ-HYPF Intergenregion; 139857
Transkriptionsregulatorprotein XYLR (67 kd-Protein); 120053 Formiathydrogenlyase-Transkriptionsaktivator;
2507375 hypothetisches 49,1 kd-Protein in der GLNB-PUR1 Intergenregion
(ORFXB) (orf-2); 134961 Signaltransduktions- und Transkriptions-Kontrollprotein; 1171795
Regulatorprotein der Stickstoff-Assimilierung; 417388 Stickstoff- Regulatorprotein
nr(i); 123466 Hydrogenase-Transkriptionsregulator-Protein HOXA;
399925 Hydrogenase-Transkriptionsregulator-Protein HOXA; 585586
Regulatorprotein der Stickstoff-Assimilierung
NTRX; 118399 c4-Dicarboxylattransport-Transkriptionsregulatorprotein
DCTD; 585267 wahrscheinliches Pathogenizitätslokus-Regulatorprotein HRPR;
1346313 wahrscheinliches Pathogenizitätslokus-Regulatorprotein HRPS;
549447 wahrscheinliches Pathogenizitätslokus-Regulatorprotein WTSA;
585909 Regulatorprotein der Arginin-Verwertung ROCR; 136600 Transkriptionsregulatorprotein
TYRR; 1174836 Transkriptionsregulatorprotein TYRR-Homologes; 123748
Hydrogenase-Transkriptionsregulatorprotein HUPR1; 128604 Stickstoff-Regulatorprotein
NTRC; 1169293 Regulatorprotein des Glycerolmetabolismus-Operons; und 129957
Transkriptionsregulatorprotein des Phosphoglycerat-Transportsystems,
PGTA. Die Nummern sind GenBank gi-Nummern.
-
Vorzugsweise
basiert der Hybrid-σ54-Aktivator
auf dem NifA-Aktivator. Die NifA-Familie der bakteriellen Enhancerproteine
reguliert die Expression von Komponenten der Nitrogenase an σ54-Promotoren
in Stickstoff-fixierenden Bakterien; sie werden durch NifL inhibiert
(Austin S. et al., (1994) J. Bacteriol. 176, 3460). In Bakterien,
denen NifL fehlt, ist NifA konstitutiv aktiv. NifA ist in seiner
Architektur modular, und es wird hier gezeigt, dass dies den Austausch
der natürlichen
DNA-Bindungsdomäne
(DBD) durch heterologe DBDs erlaubt. Solche NifA-DBD-Chimären sind
bei dem Wildtyp-Promotor inaktiv, aktivieren jedoch die Transkription
von Hybrid-Promotoren,
die die zugehörigen
Zielsequenzen aufweisen.
-
Vorteilhafter
Weise kann der Hybrid-σ54-Aktivator
auf E. coli PspF basieren (siehe Jovanovic et al., (1996) J. Bacteriol.
178: 1936–1945).
PspF fehlt die N-terminale regulatorische Domäne, die für σ54-Aktivatoren typisch ist,
und ist konstitutiv aktiv, wird jedoch von PspA negativ reguliert.
Folglich ist PspF in Bakterien, denen PspA fehlt, konstitutiv aktiv.
-
Andere σ54-Aktivatoren
können
durch die Entfernung der N-terminalen regulatorischen Domäne oder durch
geeignete Mutation konstitutiv aktiv gemacht werden.
-
Nukleinsäurebindungs-Sequenzen
oder -Domänen
sind in der Technik bekannt und können von σ54-Aktivatorproteinen oder beliebigen
anderen DNA-bindenden Proteinen abgeleitet werden, egal, ob diese natürlich vorkommen
oder synthetisch sind. Weiterhin können DNA-bindende Domänen als
partielle oder vollständige
Zufallssequenzen synthetisiert werden. Viele natürlich vorkommende DNA-bindende
Proteine enthalten unabhängig
gefaltete Domänen
für die
Erkennung von DNA, und diese Domänen
wiederum gehören
zu einer großen
Anzahl von Strukturfamilien, wie etwa dem Leucin-Zipper, der Homöodomäne, dem
Helix-turn-Helix-Motiv,
dem Zink-Finger und verschiedenen anderen Transkriptionsfaktor-Familien.
-
C: Bibliotheken
-
Der
Begriff Bibliothek bezieht sich auf ein Gemisch heterogener Polypeptide
oder Nukleinsäuren.
Die Bibliothek ist aus Mitgliedern zusammengesetzt, die eine singulär vorkommende
Polypeptid- oder Nukleinsäuresequenz
besitzen. In diesem Sinne ist „Bibliothek" synonym mit „Repertoire", obwohl der Begriff „Bibliothek" hier in allgemeiner
Weise verwendet wird, um die Quelle des Repertoires zu bezeichnen,
z.B. eine Bibliothek von Nukleinsäuremolekülen, die ein Repertoire von
Polypeptiden codieren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Mitgliedern
der Bibliothek sind verantwortlich für die in der Bibliothek vorliegende
Diversität.
Die Bibliothek kann die Form eines einfachen Gemisches von Polypeptiden
oder Nukleinsäuren
besitzen, oder sie kann in Form von Organismen oder Zellen, z.B.
Bakterien, Viren, Tier- oder Pflanzenzellen und dergleichen, die
mit einer Bibliothek von Nukleinsäuren transformiert sind, vorliegen.
Vorteilhafter Weise sind die Nukleinsäuren in Expressionsvektoren
eingebaut, um die Expression der von den Nukleinsäuren codierten
Polypeptide zu erlauben. In einem bevorzugten Aspekt kann die Bibliothek
daher die Form einer Population von Wirtsorganismen annehmen, wobei
jeder Organismus ein oder mehrere Kopien eines Expressionsvektors
besitzt, der ein einzelnes Mitglied der Bibliothek in Nukleinsäureform
enthält,
das exprimiert werden kann, um sein zugehöriges Polypeptid-Mitglied zu
produzieren. Somit besitzt die Population von Wirtsorganismen das
Potential, ein großes
Repertoire an genetisch unterschiedlichen Polypeptid-Varianten zu
codieren.
-
Bibliotheken
von Hybridproteinen können
zusammen mit Bibliotheken von Hybridnukleinsäuren hergestellt und der Selektion
unterworfen werden. Das „Kreuzen" von Hybrid-Bibliotheken
erfolgt durch kombinatorische Infektion, die erfolgreich verwendet
worden ist, um sehr große
Antikörper-Bibliotheken
zu erzeugen (Griffith et al., (1994) EMBO J. 13, 3245).
-
Obwohl
Bibliotheken zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung Phagen-Bibliotheken sein
können,
wie in der Technik bekannt ist, ist es möglich, alternative Bibliotheken
zu benutzen, die unter Verwendung anderer Vektoren, wie etwa Plasmiden,
konstruiert werden. In jedem Fall erfordert die vorliegende Erfindung nicht,
dass die Bibliothek zum „Vorzeigen" des Genprodukts
an der Bakterienoberfläche
befähigt
sein muss, wie es bei Phagen-Bibliotheken der Fall ist; vielmehr
wird das Genprodukt bevorzugt intrazellulär exprimiert, wobei es vorteilhafter
Weise nicht als Fusion mit einem Vektor-Genprodukt exprimiert wird.
-
Bibliotheken
von DNA-Bindungsdomänen
basieren bevorzugt auf bekannten Architekturen von DNA-Bindungsdomänen (z.B.
basische Leucin-Zipper, bZIP) und können unter Verwendung von PCR-Amplifikation
mit „familienspezifischen
Primern" abgeleitet
werden. Solche Bibliotheken können
mit Hybrid-Promotoren gekreuzt werden, die definierte Zielsequenzen
oder Bibliotheken von Zielsequenzen tragen. Zusätzlich zur Bereitstellung von
Informationen über
die Verteilung von Mitgliedern der Familie in einem gegebenen Genom,
können
solche Bibliotheken dazu verwendet werden, um Proteine oder molekulare
Verbindungen zu identifizieren und zu studieren, die die DNA-Interaktion
für eine
Familie von DNA-Bindungsdomänen
modifizieren, z.B. Tax (aus HTLV-1) im Falle der bZIP-Proteine.
-
Bei
einer alternativen Ausführungsform
können
sie auch dafür
verwendet werden, um DNA-Bindungsdomänen zu selektieren, die nur
in Gegenwart anderer Faktoren, wie etwa Protein-Cofaktoren oder
niedermolekularer Verbindungen konditional an ihre Zielsequenzen
binden. Beispiele für
solche Protein-Cofaktoren oder niedermolekularen Verbindungen sind
Wirkstoffe, die in die DNA interkalieren oder das Ausmaß der übergeordneten
Windungen (Supercoiling) verändern
oder DNA-Sequenzen erkennen, die chemisch modifiziert (z.B. methyliert)
wurden. Das System kann auch in umgekehrter Weise verwendet werden,
d.h. um Proteine oder molekulare Verbindungen zu selektieren, die
eine bestimmte DNA-Protein-Interaktion
aufbrechen, oder um DNA-Bindungsdomänen zu selektieren, die nicht
an eine bestimmte Zielsequenz oder an eine Bibliothek von Zielsequenzen
binden.
-
Fortgeschrittenere
Bibliotheken sind vorzugsweise direkt von Bibliotheken mit genomischer
DNA oder cDNA abgeleitet und werden an Hybrid-Promotoren selektiert,
die ein Repertoire von Zielsequenzen tragen, die entweder einen
Abschnitt einer Zufallssequenz oder eine Bibliothek von Inserts
umfassen, die von fragmentierter genomischer DNA abgeleitet sind.
Auf diese Weise erhaltene Daten erlauben die Erstellung eines genomischen
Verzeichnisses DNA-bindender Domänen
und den Aufbau einer Interaktionskarte für Promotoren/DNA-Bindungsdomänen.
-
D: Hybrid-Polypeptide
-
Die
Erzeugung von Hybrid-Polypeptiden durch Domänenfusion ist in der Technik
wohlbekannt und kann durch Fusionierung von Polypeptiden oder, bevorzugt,
durch Fusionierung von Nukleinsäuren,
die die Polypeptide codieren, erfolgen. Es ist seit 1976 bekannt,
dass die DNA-Bindungsdomäne
und die Transkriptionsaktivierungsdomäne voneinander getrennt und
zwischen Proteinen ausgetauscht werden können; siehe Ma und Ptashne,
die berichteten (Cell (1987) 51, 113–119; Cell (1988) 55, 443–446) dass
dann, wenn sowohl die GAL4 N-terminale Domäne als auch die C-terminale
Domäne
im selben Protein zusammenfusioniert werden, Transkriptionsaktivität induziert
wird. Von anderen Proteinen ist ebenfalls bekannt, dass sie über denselben
Mechanismus als Transkriptionsaktivatoren wirken. So enthalten beispielsweise
das GCN4-Protein von Saccharomyces cerevisiae (siehe Hope und Struhl,
Cell, 46, 885–894
(1986)), das ADR1-Protein von Saccharomyces cerevisiae (siehe Thukral
et al., Molecular and Cellular Biology, 9, 2360–2369, (1989)) und der humane Östrogenrezeptor
(siehe Kumar et al., Cell, 51, 941–951 (1987)) trennbare Domänen sowohl
für die DNA-Bindung
als auch für
eine maximale Transkriptionsaktivierung.
-
Entsprechendes
ist in spezifischer Weise für
die bakteriellen σ54-Transkriptionsaktivatoren
bekannt, obwohl ein darauf basierender genetischer Screen nicht
vorgeschlagen worden ist. Daher kann die vorliegende Erfindung unter
Verwendung von Techniken durchgeführt werden, die Fachleuten
bekannt sind, insbesondere im Bezug auf Zwei-Hybrid-Techniken bei
eukaryotischen Zellen.
-
Die
Synthese chimärer
Gene für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann mittels eines beliebigen gewünschten
Verfahrens, einschließlich
Polynukleotid-Synthese und Mutagenese-Ansätzen, durchgeführt werden.
Beispielsweise ist eine Anzahl an Verfahren für die zielgerichtete Mutagenese
in der Technik bekannt, von Verfahren, die einzelsträngige Phagen,
wie etwa M13, verwenden, bis hin zu Techniken auf PCR-Basis (siehe „PCR Protocols:
A guide to methods and applications", M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky,
T.J. White (Herausgeber), Academic Press, New York, 1990). Vorzugsweise
kann das kommerziell erhältliche „Altered Site
II Mutagenesis System" (Promega)
gemäß den Herstelleranweisungen
verwendet werden.
-
E. Wirtszellen
-
Wirtszellen,
die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, sind
prokaryotische Zellen, vorteilhafter Weise Bakterienzellen. E. coli
ist der bevorzugte Wirt; jedoch können die Wirtszellen zu jeder
Art oder Gattung gehören,
bei der eine σ54-RNAP-gesteuerte Transkription
möglich
ist, wie etwa Klebsiella, Rhodobacter, Rhizobium, Acinetobacter,
Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Caulobacter, Vibrio, Rhodospirillum,
Alcaligenes, Salmonella, Myxococcus, Xylella, Azospirillum, Aquifex,
Agrobacterium und andere Organismen. Bei E. coli ist die bevorzugte
Anordnung ein modifizierter Stamm, in dem eine trunkierte Form von
Nif (oder ein anderer Aktivator) coexprimiert werden, um die spezifische
Aktivierung zu verstärken
(siehe Verfahren).
-
Vorzugsweise
fehlen der Wirtszelle die Repressoren des verwendeten σ54-Aktivators,
sodass die Transkriptionsaktivierungsdomäne konstitutiv aktiv ist. Die
Repressoren können
durch genetische Mutation und/oder Selektion deletiert oder durch
die Expression von Antisense-Konstrukten inhibiert werden oder dergleichen.
Im allgemeinen, aufgrund der guten Zugänglichkeit bakterieller Genetik,
insbesondere bei E. coli, ist die Deletion der Repressorgene für Fachleute
unkompliziert.
-
F: Reportergene
-
In
der Technik sind Reportergene verschiedener Art bekannt und können in
Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein „Reportergen", wie hier angesprochen,
kann die codierende Sequenz sein, die ein detektierbares Genprodukt
codiert, oder, so wie es passend ist, die codierende Sequenz einschließlich der
notwendigen Kontrollsequenzen für
dessen Expression in Übereinstimmung
mit der Erfindung beinhalten.
-
Vorteilhafter
Weise wird das Reportergen ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus metabolischen Markern, wie etwa dem lac-Operon (lacZ, lacY und
lacA); Proteinen, die einen Fluoreszenzphänotyp verleihen, wie etwa GFP;
und Proteinen, die Antibiotikaresistenz verleihen, wie etwa Zeo.
-
Bestimmte
Reporter, wie etwa das LacZ-Gen, werden in breitem Umfang in der
Bakteriengenetik verwendet und sind nützlich für die Durchführung der
Erfindung. Jedoch können
auch andere Gene, einschließlich derer
für Fluoreszenzproteine,
verwendet werden. Beispielsweise können die grünen Fluoreszenzproteine (green
fluorescent proteins, GFPs) aus Cnidariern, die als deren Energietransfer-Akzeptoren
bei der Biolumineszenz fungieren, für die Erfindung verwendet werden.
Ein grünes
Fluoreszenzprotein, wie hier verwendet, ist ein Protein, das mit
grünem
Licht fluoresziert, und ein blaues Fluoreszenzprotein ist ein Protein,
das mit blauem Licht fluoresziert. GFPs sind aus der Leuchtqualle
Aequorea victoria, aus der Weichkoralle Renilla reniformis und aus
Phialidium gregarium isoliert worden (Ward et al., 1982, Photochem.
Photobiol., 35: 803–808; Levine
et al., 1982, Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77–85).
-
Es
ist eine Vielzahl von Aequorea-verwandten GFPs mit nützlichen
Anregungs- und Emissionsspektren durch Modifikation der Aminosäuresequenz
aus einem natürlich
vorkommenden GFP aus Aequorea victoria hergestellt worden (Prasher
et al., 1992, Gene, 111: 229–233;
Heim et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 12501–12504;
PCT/US95/14692). Wie hier verwendet, ist ein Fluoreszenzprotein
dann ein Aequorea-verwandtes Fluoreszenzprotein, wenn eine beliebige
zusammenhängende
Sequenz von 150 Aminosäuren aus
dem Fluoreszenzprotein wenigstens 85% Sequenzidentität mit einer
Aminosäuresequenz,
entweder zusammenhängend
oder nicht zusammenhängend,
aus dem wildtypischen grünen
Fluoreszenzprotein von Aequorea (SwissProt Zugangsnummer P42212)
besitzt. Entsprechend kann das Fluoreszenzprotein unter Verwendung
derselben Standards mit den wildtypischen Fluoreszenzproteinen von
Renilla oder Phialidium in Verwandtschaftsbeziehung gesetzt werden.
-
Aequorea-verwandte
Fluoreszenzproteine beinhalten z.B. wildtypisches (natives) Aequorea
victoria GFP, dessen Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
unter den GenBank-Zugangsnummern L29345, M62654, M62653 dargestellt
sind, sowie andere Aequorea-verwandte, erzeugte Versionen des grünen Fluoreszenzproteins,
von denen oben einige aufgelistet sind. Einige von diesen, d.h.
P4, P4-3, W7 und W2 fluoreszieren bei deutlich kürzeren Wellenlängen als
der Wildtyp.
-
Ein
spezifischer Vorteil der Fluoreszenzproteine besteht darin, dass
sie die FACS-Sortierung
von Zellen in einer von der Reportergen-Expression abhängigen Weise
unterstützen
(Norman, S.O. (1980), Flow cytometry. Med. Phys. 7, 609–615; Mackenzie,
N.M. & Pinder,
A.C. (1986)). Zur Anwendung der Durchfluss-Mikrofluorimetrie bei
der biomedizinischen Forschung und Diagnose wird verwiesen auf:
A review. Dev. Biol. Stand. 64, 181–193.
-
Andere
Reportergene können
auxotrophe Mutationen komplementieren oder den Wirtsbakterien Antibiotikaresistenz
oder andere selektierbare Merkmale verleihen. Reportergene können für die Wirtszelle
vollständig
oder teilweise heterolog sein und über Mutagenese und/oder Transformation
mittels geeigneter Vektoren eingeführt werden. Alternativ können endogene,
gegenüber σ54 Antwort
gebende Gene als Reportergene verwendet werden.
-
Das
Reportergen enthält
auch eine Bindungsstelle für σ54-RNAP.
Die Konsensus-Sequenz
für die
Bindung von σ54-RNAP
ist 5'-TGGCAC-N5-TTGCa/t-3'. Diese Sequenz liegt
bei –12
bis –24
im Bezug zum Transkriptionsstart, während die häufigere sigma 70-Erkennungssequenz
bei –10
bis –35
liegt. Das GG und das GC müssen
dabei auf derselben Seite der DNA-Helix liegen.
-
Um
die Spezifität
zu erhöhen,
können
Kombinationen von zwei oder mehr Reportergenen (bevorzugt in Tandemanordnung)
verwendet werden.
-
Da,
wo das Reportergen chimär
ist, d.h. heterologe Bindungsstellen für die Nukleinsäurebindungssequenz
und die Bindungsstelle der σ54-RNAP,
eingebaut in derselben Nukleinsäure,
umfasst, ist der Abstand zwischen der σ54-RNAP-Bindungsstelle und der
Bindungsstelle der Nukleinsäurebindungssequenz
bevorzugt entsprechend dem natürlichen
Gen, aus dem die σ54-RNAP-Bindungsstelle
entnommen ist, beibehalten. Vorteilhafter Weise ist der Abstand
zumindest so berechnet, dass die räumliche Beziehung der Elemente
auf den entsprechenden Seiten der Nukleinsäurehelix erhalten bleibt.
-
Reportergene
umfassen vorteilhafter Weise eine Bindungsstelle für einen
weiteren Aktivierungsfaktor, wie etwa IHF. Man nimmt an, dass diese
Faktoren die Krümmung
der DNA induzieren und somit die Aktivierung der durch σ54-RNAP angetriebenen
Transkription durch σ54-Aktivatoren
verstärken.
Alternativ kann die DNA von sich aus gekrümmt sein, sodass eine konstitutive
Verstärkung
der σ54-spezifischen
Aktivierung bereitgestellt wird.
-
G: Anordnungen der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung kann in drei grundlegenden Weisen angeordnet
sein: einer ersten Anordnung, bei der die Reportergen-Aktivierung
von der Interaktion zwischen der Nukleinsäure und einer Nukleinsäurebindungs-Domäne in dem
Hybridprotein abhängt;
eine zweite Anordnung, bei der die Reportergen-Aktivierung von der
Interaktion zwischen Köder- und Beute-Polypeptiden
abhängt,
die dazu dient, die zwei oder mehr Komponenten des Hybridproteins
zusammenzubringen; und eine dritte Anordnung, bei der die Reportergen-Aktivierung durch
einen σ54-Aktivator
von der Anwesenheit DNA-krümmender
Polypeptide abhängig
ist. Wie hier verwendet, ist eine Interaktion vorteilhafter Weise
eine Bindungsinteraktion.
-
Wenn
die Erfindung dafür
angeordnet ist, Protein-Nukleinsäure-Interaktion
zu detektieren, können
Bibliotheken von Proteinen und/oder Nukleinsäuren gemäß obiger Beschreibung hergestellt
werden. Es können Proteine
mit verbesserter Nukleinsäurebindung
oder Nukleinsäuresequenzen
mit verbesserter Affinität
für Proteindomänen durch
Mutagenese und Selektion von Kandidatensequenzen entwickelt werden.
Alternativ können
Protein- und/oder Nukleinsäuresequenzen
verwendet werden, um zugehörige
Bindungspartner in vivo zu identifizieren.
-
Chimäre σ54-Aktivatoren
bieten auch die Möglichkeit,
Aspekte des Prozesses der Transkriptionsaktivierung an σ54-Promotoren
besser zu verstehen. Im Fall von NifA ist es bekannt, dass die Bindung
der Zielsequenz zusammen mit der Bindung von ATP die Oligomerisierung
von NifA unterstützt.
Man nimmt an, dass es das Oligomer ist, das mit der Polymerase in
Kontakt tritt und die durch ATP angetriebene Isomerisierung des
Polymerase-Holoenzyms
katalysiert. Unter Ausnutzung des oben beschriebenen Effekts der
Superaktivierung kann es möglich
sein, Fragen wie diejenige anzugehen, welche Bestandteile des Oligomers
es sind (z.B. hinsichtlich des DNA-gebundenen NifA gegenüber NifAΔC, d.h. dem
NifA mit fehlender DNA-Bindungsdomäne), die mit der Polymerase
in Kontakt treten und/oder die ATP-Hydrolyse mit der Transkriptionsaktivierung koppeln
usw. Weiterhin erlaubt die Verwendung von NifAΔC-Cofaktoren aus verschiedenen
Arten (zusammen mit deren Diversifizierung durch PCR-gesteuerte
Austausche) eine Identifizierung der Sequenzregionen, die für die Transkriptionsaktivierung
und für
die „Reifung" des NifAΔC-Coaktivators
entscheidend sind. Tatsächlich haben
wir NifA aus K. pneumoniae als einen gegenüber NifA aus A. vinelandii überlegenen
Cofaktor ermittelt. Schließlich
kann es möglich
sein, Chimären
einer bekannten DNA-Bindungsdomäne
(z.B. GCN4) mit einer cDNA-Bibliothek als prokaryotische „Enhancer-Falle" (enhancer trap)
zu verwenden, um σ54-Aktivatoren
im Größenmaßstab
des Genoms zu isolieren.
-
Die
Anordnung der Erfindung zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen
folgt dem allgemeinen Schema des Hefe-zwei-Hybrid-Tests; die in
der Erfindung verwendeten Reagenzien können entsprechend ausgestaltet
bzw. angeordnet sein. Im allgemeinen wird die Erfindung daher eine
Nukleinsäurebindungsdomänen-Köder-Fusion
und eine Beute-σ54-Aktivatordomänen-Fusion
enthalten. Obwohl sich „Köder" im allgemeinen auf
ein bekanntes Polypeptid und „Beute" auf ein unbekanntes
Polypeptid bezieht, können
die Begriffe in austauschbarer Weise verwendet werden. Tatsächlich umfasst
die Erfindung auch Anordnungen, bei denen sowohl Köder als
auch Beute bekannt sind oder bei denen beide unbekannt sind.
-
Die
Bindung zwischen dem Köder
und der Beute resultiert im Zusammenbau eines Hybridproteins, das
sowohl eine Nukleinsäurebindungsdomäne als auch
eine σ54-Aktivator-Domäne umfasst.
Das Hybridprotein ist befähigt,
die Transkription von einem Reportergen zu aktivieren und so ein
von der Köder:Beute-Bindung
abhängiges
Signal bereitzustellen.
-
Die
Protein-Protein-Interaktionen können
unter Verwendung des bevorzugten NifA-Systems selektiert werden, bei dem der
Hybrid-σ54-Transkriptionsaktivator
die NifA-Aktivierungsdomäne beinhaltet.
Das bakterielle NifA-zwei-Hybridsystem kann zur Erzeugung von Interaktionsmatrizes
zwischen cDNA-Bibliotheken verwendet werden. Schließlich können solche
Interaktionsmatrizes eine Interaktionskarte der Proteine eines Organismus
ergeben. Die Erfindung stellt eine Alternative zum Hefe-zwei-Hybridsystem
bereit.
-
Systeme,
die auf σ54
basieren, besitzen eine Reihe von Vorteilen gegenüber den
anderen verfügbaren
Systemen, z.B. dem vom Konzept her ähnlichen Hefe-ein-Hybridsystem
und Hefe-zwei-Hybridsystem.
Ein bakterieller Wirt erlaubt die Gewinnung eines wesentlich größeren Repertoires
und somit eine viel größere molekulare
Vielfalt, die durchgetestet werden kann. Insbesondere unter Verwendung
kombinatorischer Infektion erlaubt das System der Erfindung die „Kreuzung" von σ54-Chimären-Repertoires
mit Bibliotheken von Hybrid-Reporterkonstrukten,
was somit die Coevolution von DNA-Bindungsdomänen und Erkennungsstellen für DNA-Bindungsdomänen bzw.
Zielstellen aus genomischen Bibliotheken erlaubt.
-
Da
die Selektion bei dem σ54-basierten
System auf einem positiven Ableseergebnis, d.h. auf der Aktivierung
der Transkription basiert, neigt dieses weniger zu falsch positiven
Ergebnissen als andere Ansätze, die
auf dem inhibitorischen Effekt der exprimierten DNA-Bindungsdomänen beruhen,
wie etwa der Transkriptions-Interferenz-Test (Elledge S.J. of al.
(1989) Proc. Nat. Acad. Sci USA 86, 3689). Die in vivo-Selektion
kann im allgemeinen zur Selektion neuer DNA-Bindungsdomänen führen, die
besser darauf eingestellt sind, unter realistischen Bedingungen
zu arbeiten, einschließlich
des Supercoilings der Erkennungsstelle, der Anwesenheit eines großen Überschusses
an chromosomaler DNA und einer hohen Proteinkonzentration. Ein anderer Vorteil
des Systems der Erfindung besteht darin, dass extrem niedrige Niveaus
des Hybridproteins auszureichen scheinen, eine maximale Aktivierung
der Transkription auszulösen.
Dies ist besonders hilfreich im Fall von DNA-Bindungsdomänen, die
zur Aggregation neigen.
-
Die
auf σ54
basierenden Systeme der vorliegenden Erfindung können weiter angepasst werden,
um potentielle Nachteile bakterieller Expression zu berücksichtigen.
Beispielsweise kann die E. coli-Expression bei großen eukaryotischen
Transkriptionsfaktoren suboptimal sein. Jedoch können große eukaryotische Proteine oft
in kleinere Domänen
gespalten werden, die ihre Funktion behalten und für gewöhnlich problemlos
in E. coli exprimiert werden.
-
Gemäß der dritten
Anordnung kann ein konstitutiv aktiver σ54-Aktivator verwendet werden,
um eine Bibliothek von Kandidaten für DNA-krümmende Polypeptide durchzutesten,
bevorzugt in einem IHF-negativen Wirt. Da das Ausmaß der Aktivierung
durch den σ54-Aktivator von der
DNA-Krümmung
durch zusätzliche
Faktoren abhängig
sein kann, werden die Expressionsniveaus des Reportergens durch
die DNA-krümmende
Aktivität
der Kandidaten für
DNA-krümmende
Polypeptide moduliert werden.
-
Die
Erfindung wird weiterhin und allein zum Zweck der Veranschaulichung
in den folgenden Beispielen beschrieben.
-
Beispiele
-
NifA
aus A. vinelandii ist ein gut untersuchtes Mitglied der Familie
der bakteriellen Enhancer und ist ein positiver Regulator für die Expression
von Nitrogenase-Komponenten in Diazotrophen. Es wird in Reaktion auf
die Anwesenheit von Sauerstoff oder Ammoniak durch NifL inhibiert.
Bei der Expression in E. coli, dem endogenes NifL oder ein Äquivalent
hierzu fehlt, ist NifA konstitutiv aktiv. Aufgrund der hochgradig
konservierten Natur des Aktivierungsmechanismus der σ54-RNA-Polymerase
ist NifA ein sehr starker Aktivator der Transkription in E. coli.
-
Wie
andere Mitglieder der Familie bakterieller Enhancer-Proteine ist
NifA in seiner Architektur modular, und zwar sowohl strukturell
als auch funktionell, und umfasst 3 Domänen: eine N-terminale Sensor-Domäne, eine
zentrale Aktivierungsdomäne
(AD) und eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne (DBD). Die zentrale Aktivierungsdomäne (AD)
kann die Transkription unabhängig
von DNA-Bindung aktivieren, wenn sie überexprimiert wird. Somit scheint
die hauptsächliche
Funktion der DBDs darin zu bestehen, die Konzentration der Aktivatordomäne in der
Umgebung des Promotors zu erhöhen.
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Wir
haben die Modularität
der Enhancer-Struktur ausgenutzt und die natürliche NifA-DNA-Bindungsdomäne (DBD)
gegen heterologe DBDs und Bibliotheken hiervon ausgetauscht. Wir
beschreiben hier die Aktivität
dieser NifA-Chimären
bei der Aktivierung der Transkription an dem σ54-abhängigen Promotor nifH und Hybriden
hiervon.
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Materialien
und Methoden
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Medien und
Reagenzien
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2×TY und
MacConkey Agar sind an anderer Stelle beschrieben (Miller J.H. (1972)
Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, NY). Es wurden
Antibiotika in den folgenden Konzentrationen verwendet: Ampicillin
0,1 mg/ml, Chloramphenicol 10 μg/nil,
Streptomycin 25 μg/ml.
Min-lac Medium war im wesentlichen M9-Medium (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), supplementiert mit 1 mM MgSO4, 20 μM
CaCl2, 2% (Gew./Vol.) Laktose, 2 mg/ml Casaminosäuren, 40 μg/ml L-Tryptophan,
5 μg/ml
Thiamin und geeigneten Antibiotika. Min-IacX-Platten waren im wesentlichen
M9-Platten, supplementiert mit 2% Laktose, geeigneten Antibiotika und
40 μg/ml
an X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid).
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Stämme
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TG1ΔK wurde von
TG1 (Gibson T.J. (1984) Studies on the Epstein-Barr virus genome,
University of Cambridge) abgeleitet, wobei die Genom-Integrationsstrategie
von Haldimann A. of al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci USA 93, 14361,
verwendet wurde. Kurz dargestellt wurden die NifA (K. pneumoniae)-Reste
1-462 amplifiziert, wofür
Pfu-Polymerase (Stratagene) und die Primer 1 (5'-GAG TCA CTA ACG CAT ATG ATC CAT AAA
TCC GAT TCG GAC-3')
und 2 (5'-CGC GGA TCC AAG CGG
CCG CTC ATT AGC GAT GGT TGA ACA GAA TCA C-3') verwendet wurden, mit Ndel und BamHI
geschnitten, in den zielgerichteten, genomischen Selbstmord-Vektor
(Genome targeting suicide vector) pSK50D-uidA2" (Haldimann, Op. Cit.) kloniert und
in den Pir+ Wirtsstamm BW23473 (Metcalf
W.W. et al (1994) Plasmid 35,1) transformiert. Die Vektoren wurden
isoliert und in den Pir-Stamm TG1, der das Plasmid pINT-ts (Hasan
N. et al. (1994) Gene 150, 51) beinhaltet, transformiert. Die chromosomale
Integration wurde durch eine Temperaturverschiebung auf 42°C induziert,
die zur Expression von λ-Integrase von pINT-ts
und einem simultanen Stopp der Replikation führt. Zellen mit erfolgter Integration
wurden durch Kanamycin-Resistenz identifiziert und auf Nif-Coaktivierung
hin getestet. Nachdem TG1ΔK
erhalten worden war, wurde der Stamm routinemäßig ohne Antibiotika-Selektion
weiter gezüchtet.
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Konstrukte
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Die
chimären
Konstrukte basierten auf pDB737 (Austin S. et al., (1994) J. Bacteriol.
176, 3460; Buck M et al., (1986), Nature 320, 374), das NifA (A.
vinelandii) unter der Kontrolle des T7-Promotors in dem Plasmid pT7-7
(Tabor S. und Richardson C.C. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82,
1074) codiert. Die Expression erfolgte aufgrund der „Durchlässigkeit" des T7-Promotors. Die Herstellung
von Chimären
erfolgte unter Ausnutzung einer singulären BanII-Schnittstelle in der Linker-Region zwischen
der zentralen Domäne
von NifA und der DBD. GCN4 wurde unter Verwendung von Pfu-Polymerase
(Stratagene) und der Primer 3 (5'-GCT
GCC AGC GAG AGC CCG CCG CTC GCC GCG ATT GTG CCC GAA TCC AGT GAT
CCT-3') und 4 (5'-GAG CTA AAG CTT TTA
TTA GCG TTC GCC AAC TAA TTT CTT TAA TCT GGC-3') amplifiziert, mit BanII und Hind3
geschnitten und in pDB737 ligiert, das mit BanII und Hind3 geschnitten
worden war. ERDBD wurde unter Verwendung der Primer 5 (5'-GTC GAC AAC GAG
AGC CCG CCG CTC GCC GCG GAA ACG CGT TAC TGC GCT GTT-3')TGC und 6(5'-GGT CAG CGC GTG GAT CCT TAA CCA CCA
CGA CGG TCT TTA CG-3')
amplifiziert, mit BanII und BamHI geschnitten und in pDB737 ligiert,
das mit BanII und BamHI geschnitten worden war. Der Vektor p737S1
wird von pDB737 abgeleitet, indem das bla-Gen durch aadA ersetzt
wird, das Streptomycin-Resistenz verleiht, und die Insertion eines
f1-Phagen-Origin zur Verpackung des Vektors in filamentöse Phagenpartikel
erfolgt. Kurz dargestellt, wurde aadA unter Verwendung der Primer
7 (5'-TCA GCG CAC
GCT GAC GTC GTG GAA ACG GAT GAA GGC ACG AAC-3') und 8 (5'-CCG CCT GGA GGT GGC CAT TAT TTG CCG ACT
ACC TTG GTG ATC TCG CC-3')
amplifiziert, mit AatII und MscI geschnitten und in pDB737 ligiert,
das mit AatII und ScaI geschnitten worden war. Der resultierende
Vektor p737S wurde mit AatII und ClaI geschnitten. Der fl-Origin
wurde unter Verwendung der Primer 9 (5'-GCT GCC GAC TCG ATC GAT GAA TGG CGA ATG
GCG CCT GAT GCG G-3')
und 10 (5'-CCG GGT
CGT GAC GTC AGT GTT GGC GGG TGT CGG GGC TGG C-3') amplifiziert, mit AatII und ClaI geschnitten
und in das geschnittene p737S kloniert, um p737S1 zu erhalten. Die
NifA-X-Chimären wurden
mittels Verdau mit Ndel und Hind3 (BamHI für NifA-ERDBD) von pDB737 auf
p737S1 übertragen.
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Reporter-Konstrukte
wurden von pACYC184 und dem Vektor pMB1 (Buck M. et al., (1986))
Nature 320–374)
abgeleitet. Kurz dargestellt, wurde das lac-Operon (lacZYA) mit
den Primern 11 (5'-GAG
TCA ATT CGG GGA TCC CGT CGT TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3') und 12 (5'-GAG TCA TTC TGG
CCA GTC GAC CGC TCT GCC GGT GGT TAC-3') amplifiziert und mit BamHI und MscI
geschnitten. Das nifH-Promotorsegment aus pMB1 wurde mit den Primern
13 (5'-GAG TCA TTC
AAG CTT GCG TGG AAT AAG ACA CAG GGG GCG-3') und 14 (5'-GAG TCA TTC GGG ATC CCC GGA TTT ACC
GAT ACC GCC TTT ACC-3')
amplifiziert, mit Hind3 und BamHI geschnitten und die zwei Fragmente
dann gleichzeitig mit pACYC184 ligiert, das mit Hind3 und BsaAI
geschnitten worden war, um pMB3 zu ergeben. Der fl-Origin wurde
mit den Primern 15 (5'-GCT
GCC GAC TCG GCT AGC GAA TGG CGA ATG GCG CCT GAT GCG G-3') und 16 (5'-GCC GGG TCG CTT
TAA AGT GTT GGC GGG TGT CGG GGC TGG C-3') amplifiziert, mit Nhel und Dral geschnitten
und in pMB3 ligiert, das mit Nhel und Xmnl geschnitten worden war,
um pMB31 zu ergeben.
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Selektion
und Durchmusterung
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Die
Zellen wurden entweder durch gleichzeitige oder sequenzielle Elektroporation
mit einem Expressions-Konstrukt und einem Reporter-Konstrukt cotransformiert
und über
Nacht unter geeigneter Antibiotika-Selektion bei 34°C in M9-lac-Medium
herangezogen und ausplattiert. Die Überprüfung der β-Gal-Expression erfolgte entweder
auf MacConkey- oder auf Minlac-X-Gal-Indikatorplatten oder durch
den ONPG-Enzymtest bei ausgewählten
Kolonien (siehe unten).
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Enzymtest
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Die
ONPG-Tests, die verwendet wurden, um die β-Gal-Aktivität zu messen, erfolgten im wesentlichen wie
von Kolmar H. et al. (1995) EMBO J 14, 3895 beschrieben. Kurz dargestellt,
wurden 20 μl
einer Übernachtkultur
in ein Mikrotiter-Well überführt, und
es wurden 100 μl
an Chloroform-gesättigtem
Z-Puffer (100 mM NaHPO4, 1 mM KCl, 1 mM
MgSO4, 50 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,0 (Miller J.H.
(1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY))
hinzu gegeben und die optische Dichte bei 600 nm unter Verwendung
eines ELISA-Auswertungsgeräts
bestimmt. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 50 μl Z-Puffer
mit 0,4% (Gew./Vol.) SDS lysiert und bei 30°C für 10 min inkubiert. Es wurden
dann 50 μl
Z-Puffer mit 4 mg/ml O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
hinzu gegeben, und die optische Dichte wurde bei 420 nm automatisch alle
15 sec über
einen Zeitraum von 60 min aufgezeichnet. Die spezifische β-Gal-Aktivität wurde
aus Vmax wie in Miller (Op. Cit.) berechnet.
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Beispiel 1: NifA-Chimären mit
heterologen DNA-Bindungsdomänen
aktivieren die Transkription nur bei Promotoren mit einer zugehörigen Erkennungsstelle.
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Um
zu untersuchen, in welcher Weise die Transkriptionsaktivierung durch
NifA von der NifA-DNA-Bindungsdomäne (DBD) und von der nativen
Struktur des nif-Promotors abhängt,
haben wir NifA-Chimären
hergestellt, bei denen die NifA-DNA-Bindungsdomäne (DBD) durch heterologe DBDs
unterschiedlicher struktureller Architekturen ersetzt war. Zuerst
untersuchten wir DBDs, welche, wie die wildtypische (WT)-DBD von
NifA, an symmetrische DNA-Erkennungsssequenzen
binden, so wie etwa die basische Leucin-Zipper (bZIP)-DBD des Hefetranskriptionsfaktors
GCN4 und die Zn-Finger-Domäne
der DNA-Bindungsdomäne
des humanen Östrogen-Rezeptors
(ERDBD), und bestimmten deren Befähigung, die Transkription eines
lacZ-Reportergens in vivo an einem Hybrid-nifH-Promotor zu aktivieren,
bei dem die NifA-UAS
deletiert und durch Erkennungsstellen für die heterologen DBDs ersetzt
worden war.
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Um
den Vergleich der Transkriptionsaktivierung durch die NifA-Chimären mit
der Aktivierung durch WT-NifA zu erleichtern, besaßen alle
Reporter-Konstrukte eine einzelne DNA-Erkennungsstelle. Die wildtypische
UAS des nifH-Promotors enthält
drei echte NifA-Erkennungsstellen.
Die Deletion der zwei stärker
distal zum Promotor gelegenen Stellen schien jedoch die Transkriptionsaktivierung
bei unserem Reporter unter den getesteten Bedingungen nicht zu reduzieren.
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Die
Transkriptionsaktivierung durch die NifA-Chimären war insofern spezifisch,
als sie die lacZ-Expression nur von Hybrid-Promotoren aus aktivierte,
die ihre zugehörigen
Erkennungssequenzen besaßen, nicht
jedoch bei Kontroll-Reporter-Konstrukten, die die wildtypische UAS
oder eine nicht zugehörige
Stelle trugen (3). In Analogie zu WT-NifA,
führte
die Anwesenheit von zwei oder mehr Erkennungsstellen (in Phase, siehe
unten) nicht zu einer gesteigerten Aktivierung durch die Nif-GCN4-Chimäre.
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Die
Aktivität
war auch abhängig
von der Phaseneigenschaft der Erkennungsstelle im Bezug auf den Promotor:
wenn die symmetrische ATF/CREB-Erkennungsstelle von GCN4 in Schritten
von 1 bp versetzt wurde, wurde optimale Aktivität dann beobachtet, wenn ATF/CREB
auf demselben Basenpaar zentriert wurde wie bei der symmetrischen
WT-UAS. Vermutlich erfordert ein effizienter Kontakt mit dem RNA-Polymerase-Holoenzym,
dass der Aktivator an der richtigen Seite der DNA gebunden wird.
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Die
Transkriptionsaktivierung durch die NifA-Chimären scheint eine genaue Spezifität der isolierten DBDs
zu wahren. Wildtypisches GCN4 bindet mit gleicher Affinität an die
symmetrische ATF/CREB-Stelle wie an die pseudo-symmetrische AP-1-Stelle.
Tatsächlich
zeigte die NifA-GCN4-Chimäre
identische Niveaus der Transkriptionsaktivierung bei Reporterkonstrukten
mit einer dieser Stellen (3). Eine
NifA-ERDBD-Chimäre zeigte
starke Aktivität
bei einem Reporter mit der zugehörigen
ERE-Stelle, jedoch keine über
Hintergrund-Niveaus
hinausgehende Aktivität
bei Reportern, die die ähnliche
GRE-Erkennungsstelle für
die nahe verwandten Glukocorticoid-Rezeptor-DBD tragen (4).
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Beispiel 2: Die Coexpression
von wildtypischem NifA mit NifA-Chimären verstärkt die spezifische Transkriptionsaktivierung
durch die NifA-Chimären
in einer spezifischen und DNA-unabhängigen Weise
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Das
Niveau der Transkriptionsaktivierung durch die Chimären NifA-GCN4
und NifA-ERDBD war
geringer (ca. 10%) als bei WT-NifA. Jedoch wurden nahezu wildtypische
Aktivitätsniveaus
(bis zu 80%) erreicht, wenn WT-NifA in derselben Zelle als ein „Coaktivator" coexprimiert wurde.
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Die
Coaktivierung war von der DNA-Bindung unabhängig, da NifA-Varianten, bei
denen die DBD deletiert worden war (NifAΔC) als fast ebenso aktiv wie
WT-NifA ermittelt wurden.
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Andererseits
erbrachte die Coexpression mit einer isolierten zentralen Domäne von NifA
(Deletion sowohl der DBD als auch der N-terminalen Sensor-Domäne (NiFAΔNC)) keine
Coaktivierung. Von verschiedenen Arten stammendes NifA zeigte eine
jeweils stark variierende Effizienz als Coaktivator. NifA-Varianten
aus K. pneumoniae (NifA Kp, NifAΔC
Kp) waren nahezu dreimal so wirksam wie NifA, während NifA-Varianten aus Rhizobium
(NifA Rh1, NifA Rh2) nur geringe Aktivität als Coaktivatoren zeigten
(5).
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Es
wurde herausgefunden, dass der Coaktivator-Effekt nur die spezifische
Transkriptionsaktivierung steigert, jedoch nicht die Hintergrundniveaus
der Transkription von Promotoren mit nicht zugehörigen Erkennungsstellen. Wir
haben daher einen E. coli-Stamm konstruiert, der NifAΔCKp (der
NifA von K. pneumoniae, dessen DBD deletiert ist) ausgehend von
einem schwachen Promotor (phoB) auf dem Chromosom exprimiert (TG1:ΔK).
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Der
Effekt der Coaktivierung besitzt Analogien zu eukaryotischer Transkription,
z.B. zum Enhancer Sp1, bei dem isolierte Sp1-Aktivierungsdomänen die
Transkriptionsaktivierung durch die die DNA-bindende Form von Sp1
stimulieren können,
ein als „Superaktivierung" bezeichnetes Phänomen.
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Beispiel 3: Die Bindung
von NifA-Chimären
an die UAS ist hinreichend für
die Aktivierung, jedoch erfordert starke Aktivierung eine korrekte
Positionierung
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Wir
haben außerdem
die Transkriptionsaktivierung durch NifA-Chimären mit asymmetrischen Erkennungsstellen,
wie etwa dem klassischen Zn-Finger Zif268 und der DBD von p53, untersucht.
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Sowohl
NifA-Zif268- als auch NifA-p53-Chimären aktivierten die Transkription,
jedoch nur auf geringen Niveaus (2-5fach über dem Hintergrund). Wenn
jedoch die Zif-Erkennungsstelle verdoppelt wurde, um eine symmetrische
pallindromische Stelle zu ergeben, so stieg die Transkriptionsaktivierung
wesentlich an. Eine nicht-pallindromische Verdoppelung der Erkennungsstelle
in Tandemanordnung erbrachte keine gesteigerte Aktivierung.
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Während eine
einfache Anheftung somit ausreichend für eine gewisse Aktivierung
ist, scheint nur eine „zweiteilige" Bindung eine starke
Aktivierung zu ergeben. Vermutlich führt die Anheftung lediglich
zu einer angenäherten
Positionierung der Aktivierungsdomäne gegenüber dem RNA-Polymerase-Holoenzym,
wodurch die Wahrscheinlichkeit produktiver Interaktion geringer
wird.
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Beispiel 4: Selektion
aktiver NifA-Chimären
durch lac-Komplementierung
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Die
Verwendung der Expression des lac-Operons (lacZYA) für unser
Reporter-Konstrukt zum Ablesen der Transkriptionsaktivierung erlaubt
die Selektion aktiver NifA-Chimären
auf Basis der metabolischen Komplementierung eines Δlac-Stammes
mit Laktose als der einzigen Kohlenstoffquelle. Zunächst versetzten
wir Populationen von NifA-ERDBD mit NifA-GCN4 in Verhältnissen
von 1/10
4 bzw. 1/10
6 in
Gegenwart des zu GCN4 gehörenden
Reporters ATF/CREB-nifH und zogen über Nacht Populationen in Minimalmedium,
supplementiert mit Laktose, heran. Die Populationen vor und nach
der Selektion wurden durch Ausplattieren auf MacConkey-Laktose-Platten
und ebenso mittels PCR-Test untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 zusammengefasst. Es konnten Selektionsfaktoren von bis zu 10.000fach
pro Runde beobachtet werden. Tabelle
1: Selektionsfaktoren der Nif-Selektion durch lac-Komplementierung
| NifGCN4/NifERDBD | Selektionsfaktor |
| 1/104 | 40fach |
| 1/105 | 40fach |
| 1/106 | 200fach |
| 1/107 | 4000fach |
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Beispiel 5: Selektion
von aktiven NifA-Chimären
mittels Durchfluss-Zytometrie
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Die
Expression von β-Galaktosidase
(lacZ) als Maßgröße für die Transkriptionsaktivierung
erlaubt die Selektion aktiver NifA-Chimären auf der Basis der metabolischen
Komplementierung eines Δlac-Stammes,
der auf Laktose als der einzigen Kohlenstoffquelle herangezogen
wird. Jedoch macht die metabolische Selektion das System anfällig für die Erzeugung
falsch positiver Treffer. Wahrscheinlich führt das lange Wachstum unter metabolischer
Selektion zur Selektion von mutanten Promotoren, die in Abwesenheit
eines passenden Enhancers aktiv sind.
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Wir
haben beobachtet, dass dies nur bei Bibliotheken auftritt, deren
Größe 106 übersteigt.
Tatsächlich haben
andere (unter Verwendung eines verwandten bakteriellen Zwei-Hybridsystems) herausgefunden,
dass es nicht möglich
ist, positive Klone bei Verdünnungen,
die höher
als 1/106 sind, durch metabolische lac-Selektion
wieder zu finden (G. Karimova, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci
USA 95, 12532-7). Da es wohlbekannt ist, dass Bakterien unter adaptivem
Stress einen Mutator-Phänotyp
entwickeln können
(P.D. Sniegowski, P.J. Gerrish, R.E. Lenski (1997) Nature 387, 703-5),
schlussfolgern wir, dass es zu bevorzugen ist, die Selektion von
dem Amplifikationsschritt (Wachstumsschritt) zu trennen, um die
Wahrscheinlichkeit von Revertanten zu vermindern.
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Wir
ersetzten daher lacZ durch das grüne Fluoreszenzprotein aus Aequorea
victoria (EGFP, F64L, S65T, Ex 488 nm, Ein 527 nm) (die Clontech-Variante
pGFPmut3.1, S65E, S72A, Ex 501 nm, Em 511 nm als FACS-optimierte
Variante wurde ebenfalls ausprobiert, jedoch als weniger gut befunden)
als Reporter-Protein. GFP hat den Vorteil, dass die Zellen zunächst herangezüchtet und
dann auf Basis der Fluoreszenz unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter
Zellsortierung (FACS) getrennt werden können.
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Wir
erstellten eine Versuchsbibliothek von mutanten GCN4-bZIP-DBDs (Bibliotheksgröße 108), bei der 5 Schlüssel-Reste (Asn235, Ala238,
Ala239, Ser242, Arg243) von GCN4, die mit DNA interagieren, einem
Zufallsaustausch unterzogen wurden und selektierten diese Bibliothek
gegen einen GFP-Hybrid-Reporter mit der zugehörigen ATF/CREB-Stelle. Die
Bibliothekspopulationen wurden über
Nacht bei 34°C
in nicht-fluoreszierendem Medium NFM (Minimalmedium, supplementiert
mit 2% Glucose, 0,2% Casaminosäuren,
12 ng/ml L-Trp) herangezüchtet.
Für FACS
(Cytomation Mofo, 488 nm Laser, FL-1 530/40-Filter) wurde ein 1
ml-Aliquot 10× in
NFM verdünnt
und die obersten 1 % der fluoreszierenden Zellpopulation wurden
durch Zellsortierung in eine 96 Well-Platte mit je 1 Zelle pro Well
gebracht und über
Nacht bei 34°C
herangezüchtet.
Die Zellfluoreszenz der herangezüchteten
Klone wurde unter Verwendung eines SPECTRAmax®GEMINI
Dual-Scanning Mikroplatten-Spektrofluorimeters (Molecular Devices)
bei Ex 480 und Em 520 (Ausschlusswert 515 nm) gemessen. Die Plasmide
aus den fluoreszierenden Wells wurden anschließend sequenziert. Vor und nach
der Selektion wurden die Populationen auch durch PCR-Testung und
ebenso durch Ausplattieren auf Min Glu (M9-Minimalmedium + Glucose)
bewertet und unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar
gemacht.
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Es
wurden insgesamt 105 Zellen der Zellsortierung
unterworfen, wovon sich 219 Zellen in den obersten 1 % der fluoreszierenden
Population befanden, und von denen 132 Zellen auf die 96-Well-Platten überführt wurden.
13 Zellen von diesen waren fluoreszierend. Die selektierten positiven
Treffer wurden geprüft,
indem deren mutante GCN4-bZIP-DBD-Expressorplasmide abgetrennt und
diese zusammen mit zugehörigen
und nicht-zugehörigen
Reporter-Plasmiden erneut transformiert wurden. Keiner der selektierten
positiven Treffer ergab ein Fluoreszenzsignal, wenn er mit nicht-zugehörigen Reporter-Plasmiden
kombiniert wurde, jedoch waren alle fluoreszierend, wenn sie mit
dem zugehörigen
ATF/Creb-Reporterplasmid (das, wenn es alleine transformiert wird,
keinerlei Fluoreszenz produziert) kombiniert wurden.
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Dies
zeigt an, dass die GFP-Selektion tatsächlich die Isolierung falsch-positiver
Treffer vermeidet. Weiterhin wurden beim Ausplattieren von >107 Zellen
keine fluoreszierenden Klone identifiziert, wenn die Bibliothek
vor der FACS-Sortierung geprüft
wurde. 1/10 der nach der Selektion plattierten Klone war fluoreszierend, was
in einer einzigen Runde einen Selektionsfaktor größer 106 nahelegt.