DE10020996A1 - Isoprenoidbiosynthese - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Aktivität, welche in die Isoprenoidbiosynthese involviert ist, sowie die Inhibitoren, besonders Herbizide für Enzyme in der Terpenoidbiosynthese. Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Screening-Verfahren für das Auffinden solcher Inhibitoren, und enzymatisch aktive Proteine für die Durchführung der Verfahren, sowie gereinigte isolierte DNA, welche die Proteine codiert. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung neue Inhibitoren, welche mittels der Screening-Verfahren auffindbar sind, sowie Zusammensetzungen und Verfahren zur Hemmung der Terpenoidbiosynthese und zur Wachstumskontrolle von Organismen basierend auf solchen Inhibitoren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Entwicklung von Inhibitor-resistenten, pflanzlichen Enzymen und Pflanzen, Pflanzengeweben, Pflanzensamen und Pflanzenzellen.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Isoprenoidbiosynthese und besonders auf
Gene, Enzyme und Intermediate, die in Isoprenoidbiosynthese involviert sind, und auch
auf Inhibitoren, insbesondere Herbizide, für Enzyme der Isoprenoidbiosynthese.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Screeningmethoden für die
Entdeckung solcher Inhibitoren und auf enzymatisch aktive Proteine für die Durchführung
solcher Methoden, sowie auf gereinigte, isolierte DNA, welche für solche Proteine codiert.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neuartige Inhibitoren, die durch die
besagten Methoden entdeckt werden können, ebenso wie auf Zubereitungen und
Verfahren für die Hemmung der Synthese von Isoprenoiden und für die
Wachstumskontrolle von Organismen auf der Grundlage besagter Inhibitoren. Die
Erfindung bezieht sich auch auf die Entwicklung von Inhibitor-resistenten, pflanzlichen
Enzymen und Pflanzen, pflanzlichem Gewebe, Pflanzensamen und Pflanzenzellen.
Durch die klassischen Untersuchungen von Bloch, Cornforth, Lynen und Mitarbeitern wur
den Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) als Schlüs
selintermediate der Biosynthese von Isoprenoiden über Mevalonsäure nachgewiesen.
Bakterien, Pflanzen und das Protozoon Plasmodium falciparum synthetisieren Isoprenoide
auf einem alternativen Biosyntheseweg über 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat. Dieser
Biosyntheseweg wurde bisher erst teilweise erforscht (Abb. 1), aber seine Abwesenheit in
tierischen Zellen macht ihn zu einem idealen Ziel für Pestizide oder für medizinische
Zwecke. Weiterhin reduziert die idiosynkratische Natur der Reaktionen in diesem Bio
syntheseweg das Risiko von Überkreuzhemmungen anderer Enzyme, insbesondere von
Säugetierenzymen. Für ein genaueres Verständnis dieser Erfindungsaspekte wird der
Biosyntheseweg im folgenden kurz erklärt. Er beginnt mit der Kondensation von Pyruvat
(1) mit Glyceraldehyd-3-phosphat (2) zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP, 3).
Anschließend wird DXP in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (4) umgewandelt durch eine
Zweistufenreaktion, die eine Umlagerung und eine Reduktion umfasst. Die
anschließenden Schritte zu Isoprenoiden sind bisher nicht erforscht worden. Es kann aber
angenommen werden, dass der Biosyntheseweg Intermediate vom Typus des IPP und
DMAPP enthält. Auf jeden Fall sind der Biosyntheseweg und insbesondere die
nachfolgenden enzymatischen Reaktionsschritte ideale Ziele für das Screening von
Inhibitoren in chemischen Bibliotheken.
Der Mevalonat-unabhängige Biosyntheseweg (alternativer Isoprenoidbiosyntheseweg), mit
dem sich die vorliegende Erfindung befasst, erzeugt die zentrale C5-Verbindung (IPP
und/oder DMAPP oder, eine äquivalente Verbindung), von welcher sich alle höheren,
durch stromab gelegene Biosynthesewege Isoprenoide ableiten. Höhere Isoprenoide
werden Terpenoide genannt. Darum ist jeder Inhibitor eines Enzyms des Mevalonat-
unabhängigen Biosyntheseweges auch gleichzeitig ein Inhibitor aller sich anschließenden
Isoprenoidbiosynthesewege, sozusagen ein Inhibitor der Terpenoidbiosynthesewege.
Wo immer eine phosphorylierte Verbindung oder eine Carbonsäureverbindung erwähnt
ist, kann diese als freie Säure oder als Salz, wobei mindestens ein Proton durch ein
Ammonium- oder ein Metallion oder ein organisches Kation ersetzt ist, vorliegen. Das
Metallion kann ein Alkalimetall- oder ein Erdalkalimetallion sein. Das organische Kation
kann von einem Amin abgeleitet sein. Es mag ein Sulfonium- oder ein Guanidinium- oder
ein Heteroaromatenion sein. Solch eine phosphorylierte Verbindung wird in wässriger
Lösung im Dissoziationsgleichgewicht vorliegen.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung funktioneller Enzyme,
die im alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-
phosphat wirksam werden. Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Proteine gemäß den
Ansprüchen 1 bis 14.
Aufgabe der Erfindung ist weiterhin die Bereitstellung gereinigter, isolierter DNA, ins
besondere DNA, welche für ein Enzym in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1
bis 14 codiert, oder einem Vektor, der eine solche DNA enthält. Diese Aufgabe wurde
durch den Gegenstandsstoff der Ansprüche 15 bis 18 gelöst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren für das Screening
in chemischen Bibliotheken nach Inhibitoren eines Enzyms im alternativen
Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Diese
Aufgabe wurde erreicht durch die Screening-Verfahren gemäß den Ansprüchen 19 bis 30.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Intermediaten im
alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg, welche Produkte der Enzyme entsprechend den
Ansprüchen 1 bis 14 sind. Diese Aufgabe wird erreicht durch die chemischen
Verbindungen entsprechend den Ansprüchen 31, 34, 36, 39 und durch die
Herstellungsmethoden entsprechend den Ansprüchen 32, 35, 37, 40. Ein weiterer Gegen
stand der Erfindung ist die Verwendung des besagten Intermediats als ein Substrat für
das Screening von Inhibitoren des Isoprenoidbiosynthesewegs. Diese Aufgabe wird gelöst
gemäß einem der Ansprüche 33, 38, 41.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Methode zum Identifizieren
von Inhibitor-resistenten Varianten eines Enzyms aus dem alternativen
Isoprenoidbiosyntheseweg, sowie Nucleinsäuren und DNA-Vektoren, welche für solche
Varianten codieren, sowie Pflanzenzellen und -samen, die einen solchen Vektor besitzen,
sowie eine Methode für die Übertragung von Inhibitor-Resistenz auf Pflanzen und eine
entsprechende Methode einer Saatkontrolle. Diese Aufgaben werden erreicht
entsprechend den Ansprüchen 42 bis 51.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Inhibitoren von Enzymen
im alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat,
Zubereitungen solcher Inhibitoren und von Methoden zur in-vivo-Inhibition der
Isoprenoidbiosynthese. Diese Aufgaben werden gelöst entsprechend den Ansprüchen 52
bis 54.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer ökonomischen Methode für
die effiziente Herstellung der Intermediate ausgehend von leicht zugänglichem
Ausgangsmaterial.
Diese Aufgabe ist durch das Verfahren nach Anspruch 55 gelöst. Bevorzugte
Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen 56 bis 61 definiert. Das Verfahren kann
für die Herstellung des benötigten Produktes mit jeder benötigten Isotopenmarkierung
benutzt werden.
Mit den Erkenntnissen dieser Erfindung wird das Gesamtschema des Mevalonat-
unabhängigen alternativen Isoprenoidbiosyntheseweges erkennbar, welches aus 3
Segmenten besteht. Das erste Segment bis hinzu 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphat
(bereits früher bekannt) umfasst die Bildung des Isoprenoidkohlenstoffskeletts. Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit dem zweiten Segment, in welchem alle drei
Phosphorylierungsschritte der Aktivierungsform als 2,4-Cyclopyroposphat dienen, welche
für das sich anschließende Segment notwendig ist. Dies bestätigt die funktionelle
Kohärenz und Einzigartigkeit dieser Erfindung. Das dritte Segment betrifft die
unbekannten Reduktions- und Eliminierungsschritte für die Bildung von IPP, DMAPP oder
einer äquivalenten Verbindung.
Abb. 1 zeigt den bereits früher bekannten Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg.
Abb. 2 zeigt die enzymatischen Schritte, aufgrund von YgbP und YchB, stromab vom
bereits früher bekannten Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg in Abb. 1.
Abb. 3 zeigt den dritten enzymatischen Schritt, aufgrund YgbB, stromab vom
Biosyntheseweg in Abb. 2.
Annex A zeigt ein Alignment von YgbP und YgbB aus verschiedenen Organismen.
Annex B zeigt ein Alignment von YchB aus verschiedenen Organismen.
Annex C zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenz der klonierten cDNA von ygbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz) und der Aminosäuresequenz des YgbP-Genproduktes gefunden in der Datenbank (siehe Tabelle 1).
Annex Da zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Db zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbP aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ea zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Eb zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ec zeigt ein Alignment der Wildtypen-Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum (ohne Leadersequenz) und der Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum adaptiert für E.-coli-Codongebrauch für hochexprimierte Gene (ohne Leadersequenz).
Annex F1 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO113.
Annex F2 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO-SB-H6-ACYC184.
Annex G zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbB aus P. falciparum.
Annex B zeigt ein Alignment von YchB aus verschiedenen Organismen.
Annex C zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenz der klonierten cDNA von ygbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz) und der Aminosäuresequenz des YgbP-Genproduktes gefunden in der Datenbank (siehe Tabelle 1).
Annex Da zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Db zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbP aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ea zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Eb zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ec zeigt ein Alignment der Wildtypen-Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum (ohne Leadersequenz) und der Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum adaptiert für E.-coli-Codongebrauch für hochexprimierte Gene (ohne Leadersequenz).
Annex F1 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO113.
Annex F2 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO-SB-H6-ACYC184.
Annex G zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ygbB aus P. falciparum.
Wir haben überraschenderweise entdeckt, daß das nächste Intermediat stromab von 2C-
Methyl-D-erythritol-4-phosphat 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (5) (Abb. 2) ist.
Auf der Grundlage dieses Befunds haben wir bewiesen, dass dieses Intermediat aus 2C-
Methyl-D-erythritol-4-phosphat und CTP biosynthetisiert wird. Wir haben ausserdem ein
Escherichia-coli-Protein in einer enzymatisch funktioneller Form für diese Umwandlung
produziert. Dieses Enzym wird als 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase
bezeichnet. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms und die korrespondierende DNA-
Sequenz sind als unannotierter, offener Leserahmen enthalten im Genom von E. coli
unter der Bezeichnung ygbP (Accessions-Nr. gb AE000358). Die DNA entsprechend
diesem offenen Leserahmen (ORF) wurde isoliert und in einen Vektor hoher Kopienzahl
kloniert, und mit diesem Vektorkonstrukt wurden E.-coli-Zellen transformiert. Über
raschenderweise wurde das korrespondierende Genprodukt in 12 getesteten rekombinan
ten E.-coli-Klonen in löslicher Form exprimiert in einer Menge entsprechend etwa 10%
des gesamten löslichen Zellproteins. Dies wurde durch SDS-PAGE festgestellt. Weiterhin
zeigten Zellextrakte von 4 geprüften rekombinanten Klonen Aktivität entsprechend der
Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aus CTP und 2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat. Diese spezifische Aktivität war mindestens 100fach höher im
Vergleich mit Extrakten von E. coli Wildtyp-Zellen.
Wir haben weiterhin Sequenzen mit hoher Homologie zu ygbP in einer Anzahl von Bakte
rien, in Arabidopsis thaliana sowie in Plasmodium falciparum nachgewiesen durch BLAST
Search in GenBank sowie in der Datenbank kompletter und inkompletter Genome. Wir
haben dadurch einen Weg eröffnet für die Expression funktioneller Formen des YgbP-Pro
teins in jedem der genannten oder in anderen Organismen. Insbesondere wurde die
cDNA entsprechend dem ORF von Arabidopsis thaliana (siehe Tabelle 1) isoliert und in
einen Expressionsvektor hoher Kopienzahl kloniert und das korrespondierende
Genprodukt wurde in enzymatisch aktiver Form heterolog in E. coli exprimiert.
Wir haben weiterhin gezeigt, dass ygbP in Bakterien häufig in einem Operon enthalten ist,
in dem direkt anschließend ein offener Leserahmen (bezeichnet als ygbB in E. coli) in kur
zem Abstand oder sogar überlappend nachfolgt. Wir haben weiterhin gezeigt, dass die
Proteine YgbP und YgbB in einigen Bakterien fusioniert sind unter Ausbildung eines bi
funktionellen Enzyms. In Übereinstimmung mit diesen Befunden haben wir festgestellt,
dass YgbB als Enzym wirksam wird im alternativen Terpenoidbiosyntheseweg unmittelbar
stromab von YgbP, wobei es 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol weiter umsetzt
(Abb. 2). Die DNA entsprechend dem ORF ygbB im Genom von E. coli wurde isoliert, in
einen Vektor hoher Kopienzahl kloniert und das entsprechende Genprodukt wurde in E.
coli in enzymatisch aktiver Form exprimiert.
Die Bezeichnungen YgbP und YgbB im E.-coli-Genom werden im Folgenden auch für die
homologen Enzyme in anderen Organismen gebraucht. Die Gruppe an zu ygbB und ygbP
homologen Leserahmen in anderen Organismen ist in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Alignment
der Aminosäuresequenzen des korrespondierenden Genprodukts zeigt Annex A. Das
Alignment wurde mit dem Pileup Programm konstruiert unter Benutzung der Standard
einstellung (Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin). Es wurde editiert mit dem
GeneDoc-Programm (http://www.comhketchuplgenedoc.shtml). Die Namen der Orga
nismen stehen abgekürzt auf der linken Seite des Alignments entsprechend Tabelle 1.
Aminosäurereste sind im IUPAC Einbuchstabencode geschrieben und sind für Referenz
zwecke fortlaufend nummeriert am oberen Ende jeder Alignmentseite. Die funktionelle
YgbP Domäne erstreckt sich von Rest 1 bis ungefähr Rest 360 und die funktionelle YgbB
Domäne erstreckt sich ungefähr von Rest 360 bis zum Ende. Die fortlaufende Gesamtzahl
für jede Aminosäuren ist in der rechten Kolonne des Alignments für jede Zeile angegeben.
Lücken im Alignment werden durch einen Bindestrich (-) symbolisiert. Die Symbole < und
< bezeichnen ein Fragment. Das Symbol \ \ bezeichnet einen C-Terminus. Das Symbol *
bezeichnet ein Stopcodon resultierend aus einer Leserasterverschiebung. Im Falle eines
Fragmentes sind die Sequenzen zu Beginn und am Ende unvollständig aufgrund der
Tatsache, dass diese durch das BLAST-Programm zum Auffinden der Sequenzen aus der
Datenbank unkompletter Genome ignoriert werden. Sie können vollständig ausgehend
von der entsprechenden Nucleotidsequenz erhalten werden, indem man bis zum Start
codon ATG (oder GTG oder CTG) vorwärtsschreitet und rückwärts bis zum Stopcodon
geht.
Wir haben überraschenderweise entdeckt, daß die nächsten Intermediate stromab von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-
phosphat (6) (Abb. 2) und 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (7) (Abb. 3) sind.
Auf der Grundlage dieses Befunds haben wir bewiesen, dass 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol-2-phosphat aus 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und ATP
biosynthetisiert wird. Wir haben ausserdem ein Escherichia coli Protein in einer
enzymatisch funktionellen Form für diese Umwandlung produziert. Dieses Enzym wird als
4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase bezeichnet. Wir haben ebenso
gefunden, dass das oben erwähnte YgbB-Protein 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol-2-phosphat in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und CMP (7) (Abb.
3) umwandelt.
Die Aminosäuresequenz des YchB-Enzyms und die korrespondierende DNA-Sequenz
sind als unannotierter, offener Leserahmen enthalten im Genom von E. coli unter der Be
zeichnung ychB (Accessions- Nr. gb AE000219). Die DNA entsprechend diesem offenen
Leserahmen (ORF) wurde isoliert und in einen Vektor hoher Kopienzahl kloniert, und mit
diesem Vektorkonstrukt wurden E. coli Zellen transformiert. Überraschenderweise wurde
das korrespondierende Genprodukt in 6 getesteten rekombinanten E.-coli-Klonen in
löslicher Form exprimiert in einer Menge entsprechend etwa 10% des gesamten löslichen
Zellproteins. Dies wurde durch SDS-PAGE festgestellt. Weiterhin zeigten Zellextrakte von
4 geprüften rekombinanten Klonen Aktivität entsprechend der Bildung von 4-Diphospho
cytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aus ATP und 4-Diphosphocytidyl-2C-Methyl-D-
erythritol. Diese spezifische Aktivität war mindestens 100fach höher im Vergleich mit
Extrakten von E. coli Wildtyp-Zellen.
Wir haben weiterhin Sequenzen mit hoher Homologie zu ychB in einer Anzahl von Bakte
rien, in Arabidopsis thaliana sowie in Lycopersicon esculentum (Tomate) nachgewiesen
durch BLAST Search in GenBank sowie in der Datenbank kompletter und inkompletter
Genome. Die orthologe cDNA-Sequenz pTOM41 aus Tomate (gb Accessions-Nr.
U62773) wurde als reifungsassoziiertes Transkriptionsprodukt beschrieben.
Wir haben dadurch einen Weg eröffnet für die Expression funktioneller Formen des YchB-
Proteins in jedem der genannten oder in anderen Organismen. Insbesondere wurde die
cDNA entsprechend dem ORF von Arabidopsis thaliana (gb Accessions-Nr. AC005168)
isoliert und in einen Expressionsvektor hoher Kopienzahl kloniert.
Die Bezeichnung YchB im E. coli Genom wird im Folgenden auch für die orthologen
Enzyme in anderen Organismen gebraucht. Die Gruppe an zu ychB homologen
Leserahmen in anderen Organismen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Ein Alignment der
Aminosäuresequenzen des korrespondierenden Genprodukts zeigt Annex B. Das
Alignment wurde mit dem Pileup Programm konstruiert unter Benutzung der Standard
einstellung (Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin). Es wurde editiert mit dem
GeneDoc Programm (http:/ /www.com/~ketchup/genedoc.shtml). Die Namen der Orga
nismen stehen abgekürzt auf der linken Seite des Alignments entsprechend Tabelle 2.
Aminosäurereste sind im IUPAC Einbuchstabencode geschrieben und sind für Referenz
zwecke fortlaufend nummeriert am oberen Ende jeder Alignmentseite. Die fortlaufende
Gesamtzahl für jede Aminosäure ist in der rechten Kolonne des Alignments für jede Zeile
angegeben. Lücken im Alignment werden durch einen Bindestrich (-) symbolisiert. Die
Symbole < und < bezeichnen ein Fragment. Das Symbol \ \ bezeichnet einen C-Terminus.
Das Symbol * bezeichnet ein Stopcodon resultierend aus einer Leserasterverschiebung.
Im Falle eines Fragmentes sind die Sequenzen zu Beginn und am Ende unvollständig
aufgrund der Tatsache, dass diese durch das BLAST Programm zum Auffinden der
Sequenzen aus der Datenbank unkompletter Genome ignoriert werden. Sie können
vollständig ausgehend von der entsprechenden Nucleotidsequenz erhalten werden, indem
man bis zum Startcodon ATG (oder GTG oder CTG) vorwärtsschreitet und rückwärts bis
zum Stopcodon geht.
Mit diesen funktionellen Zuordnungen von YgbP, YchB und YgbB und mit der Herstellung
von Proteinen mit enzymatisch aktiven Faltungsstrukturen haben wir diese Proteine sowie
die gereinigte, isolierte für diese Proteine codierende DNA erstmals in den Bestand der
technischen Kenntnis für technische und kommerzielle Nutzung als neue Verbindungen
eingeführt. Gleichzeitig werden damit Wege eröffnet für die Herstellung der Produkte der
enzymatischen Reaktion von YgbP, YchB und YgbB 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-
erythritol-cyclopyrophosphat oder deren Salze, insbesondere Salze mit Alkalimetallen, wie
Li, K, Na, oder Ammoniak oder Amine, und für deren Nutzung in verschiedenen in-vitro-
Reaktionen des einen nachfolgenden Reaktionsschritts im alternativen Weg der
Isoprenoidbiosynthese.
Auf der Grundlage dieser Fortschritte haben wir neue Wege eröffnet für die Hemmung
des alternativen Terpenoidwegs in Pflanzen ebenso wie in Bakterien und in Protozoen,
wie z. B. Plasmodium.
Die Enzyme YgbP und YgbB und ebenso YchB oder größere Kernfragmente dieser
Enzyme aus unterschiedlichen Organismen sind im Annex A und Annex B kompiliert. Auf
der Grundlage dieses Alignments kann eine große, aber endliche Klasse von
Enzymsequenzen mit den Funktionen von YgbP, YgbB und YchB definiert werden auf der
Grundlage der Aminosäurevariabilität, die für jede Position im Alignment angegeben wird.
Für ein beliebiges Protein dieser Klasse kann die Menge der möglichen äquivalenten
Aminosäuren an jeder Position unmittelbar eindeutig und individuell aus Annex A und
Annex B entnommen werden. Damit wird die ausreichende Funktionsfähigkeit mit hoher
Wahrscheinlichkeit abgesichert.
Alternativ wird für jedes Gen eine orthologe Sequenzklasse mittels
Nucleinsäurehybridisierung von cDNA oder genomischer DNA oder RNA unter
Bedingungen mittlerer Stringenz (wie eine wässrige Lösung von 2X SSC bei 65°C)
festgelegt.
Wir haben festgestellt, dass in Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana die zu YgbP,
YchB und YgbB homologen Enzyme ein Signalpeptid besitzen, welche in bakteriellen
Enzymen nicht vorkommt. Dieses Signalpeptid dient dem Transport des Enzyms in
Plastiden. Diese spezifische Signalsequenz kann ersetzt werden durch irgend eine andere
Signalsequenz aus Arabidopsis thaliana oder aus einer anderen Pflanze. Alternativ kann
die Signalsequenz eliminiert werden.
Die Arabidopsis thaliana YgbP-Sequenz in Tabelle 1 und im Alignment von Annex A
wurde durch Genomsequenzierung erhalten. Wir haben das Gen ygbP von A. thaliana se
quenziert, durch Isolierung von RNA aus Zellen von A. thaliana, Produktion von so
genannter RNA-komplementären cDNAs durch RT-PCR, anschließende Amplifikation der
codierenden Region für YgbP mit geeigneten, genspezifischen Primern durch PCR und
schließlich Klonierung der erhaltenen DNA. Die Signalsequenz wurde zuerst nicht kloniert
und sequenziert. Aber später wurde das vollständige Gen ausgehend von RNA kloniert.
Die cDNA-Sequenz des klonierten ygbP Gens von A. thaliana unterschied sich von der in
der Datenbank aufgefundenen DNA-Sequenz (gb AC004136) aufgrund der Introns. Die
Aminosäuresequenz, die zu dieser cDNA gehört, ist auch verschieden von der
Aminosäuresequenz aus der Datenbank (gb AC004136). Dies scheint zurückführbar auf
irrtümliches, rechnerisches Intronspleissen aus chromosomaler DNA. Dieser Befund wird
gezeigt in einem Alignment der Aminosäuresequenzen von klonierter cDNA und YgbP-
Genprodukt aus der Datenbank (Annex C). Die Aminosäuresequenzen sind auf der
rechten Seite des Alignments nummeriert. Nummer 1: klonierte Sequenz von ygbP aus A.
thaliana ohne Signalsequenz; Nummer 2: gb AC004136. Identische Reste sind
eingerahmt. Die cDNA-Sequenz und die zugehörige Proteinsequenz von ygbP von A.
thaliana sind in Annex Da gezeigt. Die cDNA Leadersequenz war identisch zur
Datenbankvorhersage (Annex Db).
Die Gene ygbP, ygbB und ychB von E. coli wurden durch PCR erhalten unter Benutzung
von Primern mit spezifischen Restriktionsschnittstellen und von chromosomaler DNA als
Matrize. In dieser PCR-Reaktion werden zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme
eingeführt am 5'-Ende und am 3'-Ende. Die bevorzugte Erkennungsstelle ist NcoI oder
EcoRI am 5'-Ende und PstI am 3'-Ende. Das amplifizierte PCR-Fragment und der
Expressionsvektor werden mit denselben Restriktionsenzymen verdaut und zusammen
ligiert mit T4-Ligase. Dabei wird ein rekombinantes Plasmid erhalten, welches zur
autonomen Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist. Das rekombinante Plasmid wird
benutzt, um den Wirtsorganismus zu transformieren. Der bevorzugte Wirtsorganismus ist
E. coli. Die gleiche Methode wurde benutzt für die Gene ygbP und ychB von Arabidopsis
thaliana.
Der offene Leserahmen des ygbB-Gens von E. coli wurde auch in den pQE30-Expres
sionsvektor hoher Kopienzahl von Qiagen (Hilden, Deutschland) kloniert. Dieser Vektor
erlaubt die Expression von Proteinen in E. coli mit hoher Ausbeute, die am N-terminalen
Ende einen Schwanz bestehend aus 6 Histidinresten tragen. Das rekombinante "6-His-
Protein" konnte dann sehr leicht in einem Schritt mittels immobilisierender Metallchelat-
Affintitätschromatographie zur Homogenität gereinigt werden.
Die Klonierung des ygbB Gens von E. coli in den pQE30 Vektor führte zur Expression von
löslichem, enzymatisch aktivem YgbB-Genprodukt, welches N-terminal His-beladen war.
Rekombinante E. coli Zellen, die überexprimiertes His-beladenes Fusionsprotein ent
hielten, zeigten eine spezifische Aktivität in der Umsetzung von 4-Diphosphosphocytidyl-
2C-methyl-D-erythritol, die mindestens 80 mal höher als die in E. coli XL1-Blue Wildtyp
Zellen war. Das Enzym wurde gemäß Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie zur Homo
genität gereinigt. Die Reinheit des Enzyms wurde mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacryl
amidgelelektrophorese festgestellt.
Dieselbe Methode wurde für ygbB aus Plasmodium falciparum, um das Fusionsprotein
6xHis-YgbB zu erhalten, verwendet.
Die korrespondierende Proteinsequenz des klonierten ychB Gens aus A. thaliana war
identisch zur Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz aus der Datenbank (gb
AC005168). Die DNA-Sequenz und die korrespondierende Proteinsequenz ohne
Leadersequenz ist in Annex Ea gezeigt. Das vollständige ychB Gen aus A. thaliana wurde
zusätzlich kloniert ausgehend von RNA. Die Sequenz ist in Annex Eb gezeigt.
Die Stämme, welche die rekombinanten Plasmide enthalten, können in gewöhnlichen
Kulturmedien bei 15 bis 40°C kultiviert werden. Die bevorzugte Temperatur ist 37°C. Die
E. coli Stämme werden mit 0,5 bis 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid induziert bei einer
optischen Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 nm. Die Zellen werden 2 bis 12 Stunden
inkubiert, vorzugsweise 5 Stunden. Die Zellen werden mit Lysozym lysiert und mit einem
Sonifier aufgebrochen. Der Zellextrakt mit rekombinantem YgbP-, YgbB- oder YchB-
Protein wird gereinigt mittels Chromatographie, insbesondere durch Anionenaustausch
chromatographie und Affinitätschromatographie. Die erhaltenen Proteine, insbesondere
die aus E. coli, A. thaliana, L. esculentum und P. falciparum, haben die geeignete
Faltungsstruktur für die Erzielung der gewünschten Enzymaktivität.
Die Enzyme YgbP, YgbB und YchB kommen in Tieren nicht vor. Deshalb haben
Inhibitoren geben YgbP und YgbB großen Wert als (a) Herbizide gegen Unkraut, Pflanzen
oder Algen; (b) antibiotische Wirkstoffe gegen pathogene Bakterien; (c) Wirkstoffe gegen
Protozoen wie z. B. Plasmodium falciparum, den Verursacher der Malaria.
Mit der Entdeckung, dass 4-Phosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 4-Phosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol Intermediate sind, haben wir
auch wesentliche Determinanten für Strukturen von Inhibitoren ermittelt, d. h., die
Strukturen einer Untermenge von Inhibitoren sollten Ähnlichkeit zeigen zu mindestens
einem Teil der Ausgangsverbindungen oder des Produkts oder des Übergangszustands
(bzw. der Übergangszustände) zwischen der Ausgangsverbindung (2C-Methyl-D-erythritol-
4-phosphat und CTP) und den Produkten (Pyrophosphat und 4-Diphosphocytidyl-2C-me
thyl-D-erythritol). Auf der Grundlage dieser Determinanten wurden Ribitol-5-phosphat und
Erythritol-4-phosphat synthetisiert als mögliche Inhibitoren für YgbP.
Wir haben auch Methoden erstellt zum Screening nach Inhibitoren von YgbP, YgbB und
YchB. Bei diesen Methoden kann eines der Enzyme YgbP, YgbB oder YchB aus der oben
definierten Enzymklasse benutzt werden. Es kann ein monofunktionelles oder ein
bifunktionelles Enzym benützt werden. Die Reaktion sollte vorzugsweise bei pH 5,5 bis 9,
insbesondere 7 bis 8,5 ausgeführt werden. Sie sollte ausgeführt werden in Anwesenheit
eines divalenten Metallsalzes, vorzugsweise Mg2+ im Fall von YgbP und YchB und Mg2+
oder Mn2+ im Fall von YgbB. Die Temperatur ist vorzugsweise im Bereich von ± 10° von
der optimalen Temperatur. Mindestens 2 aufeinanderfolgende Enzyme der Enzymklassen
YgbP, YgbB und YchB können auch gemeinsam in einem kombinierten Screeningtest
benutzt werden. Oder YgbP kann kombiniert werden mit einem oder mehreren Enzymen
stromauf von YgbP mit den geeigneten Substraten und Cofaktoren.
Das für den Test ausgewählte Enzym sollte vorzugsweise identisch sein mit dem Enzym
des Zielorganismus. Im Fall einer Zielgruppe von Organismen (z. B. Pflanzen oder Bak
terien), wie z. B. alle mono- und dicotyledonen Pflanzen, kann irgendein Wildtypenzym
eines spezifischen Organismus aus der besagten Gruppe ausgewählt werden oder aber
ein konstruiertes Enzym, dessen Sequenz die größte Gemeinsamkeit mit einigen oder
allen relevanten Enzymsequenzen aus dieser Gruppe aufweist, welche bekannt sind und
derart repräsentativ sind für die gesamte Gruppe. Im Fall von Pflanzenenzymen kann die
Signalsequenz eliminiert werden.
Die Reaktion kann gestartet werden durch Hinzufügen von mindestens einer essentiellen
Komponente. Die Reaktion kann gestoppt werden mit Methanol, Chelatoren wie z. B.
EDTA oder Säuren wie z. B. Trichloressigsäure.
Im Fall von YgbP kann die Enzymaktivität nachgewiesen werden (in Gegenwart oder Ab
wesenheit eines potentiellen Inhibitors) durch Messung der Produktbildung, nämlich Py
rophosphat oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder den Verbrauch des
Startmaterials, nämlich CTP oder 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Entsprechend kann
im Fall von YgbB der Nachweis erfolgen durch Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-me
thyl-D-erythritol oder alternativ der Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol-2-phosphat und/oder die Bildung von 2C-Methyl-D-erythritol oder
Cytidylmonophosphat. Im Fall von YchB kann der Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol oder Adenosin-5'-triphosphat (ATP) oder die Bildung von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat oder Adenosin-5'-diphosphat (ADP)
Die Messungen können entweder direkt in der Reaktionsmischung oder nach Trennung
der Reaktionsmischung durch Chromatographie, z. B. HPLC erfolgen.
Die Rate der Pyrophosphatbildung kann bestimmt werden durch Kopplung mit UDP, Glu
kosepyrophosphorylase, Phosphoglukomutase und Glukosedehydrogenase. Die Bildung
von Pyrophosphat ist äquivalent zur Bildung von NADPH, welche spektrophotometrisch
bei 340 nm verfolgt werden kann. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kann auch
direkt beobachtet werden durch Benutzung 14Cmarkierter Substrate und Detektion der
Produkte mit einem Radiomonitor. Der Verbrauch von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
(unmarkiert, 13C- oder 14C-markiert) und die Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol kann auch bestimmt werden während der Reaktion oder nach der Reaktion
durch 31P- oder 13C-NMR-Spektroskopie bzw. Detektion mit einem Radiomonitor. Die
selben Methoden können benutzt werden zum Screening nach einem Enzym, welches
gegen einen spezifischen Inhibitor resistent ist.
Die Rate der ADP-Bildung kann mittels UV bestimmt werden. 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol-2-phosphat kann auch direkt beobachtet werden durch Benutzung 14C-
markierter Substrate und Detektion des Produktes mit einem Radiomonitor. Der
Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (unmarkiert, 13C- oder 14C-
markiert) und die Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
können auch bestimmt werden während der Reaktion oder nach der Reaktion durch 3'P-
oder 13C-NMR-Spektroskopie bzw. Detektion mit einem Radiomonitor.
Wir haben festgestellt, daß YgbB 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
(6) in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (7) überführen kann. Die Struktur des
Produktes wurde ermittelt. Das erhaltene 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist
eine wertvolle Verbindung für Screeningverfahren. Es kann als Referenzsubstanz in
Screeningverfahren, in welchen die Effektivität von prospektiven Inhibitoren gegen YgbB
mittels der Effektivität von YgbB 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat zu bilden,
detektiert wird.
Unsere Entdeckung eröffnet einen Weg für neuartige Screeningverfahren zum Auffinden
von Inhibitoren gegen YgbB. Als eine Alternative zur Messung des Verschwindens von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat können wir nun das Erscheinen von
2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat messen. Die Messung kann entweder direkt
mit der Reaktionsmischung oder nach Auftrennung der Reaktionsmischung mittels
Chromatographie, wie HPLC durchgeführt werden. Die Detektion kann mittels NMR oder
mit einem Radiodetektor durchgeführt werden.
Dieselbe Methode kann für das Screening nach mutierten Enzymen, welche resistent
gegen einen spezifischen Inhibitor sind, durchgeführt werden.
Die Ausgangsmaterialien für die umfassende Großherstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol im Großmaßstab sind Dihydroxyacetonphosphat und Pyruvat, wobei
diese Ausgangsmaterialien als freie Säuren oder als Salze mit einem monovalenten oder
divalenten Kation, bevorzugt Natrium oder Kalium, benützt werden können. Sie können in
äquimolaren Mengen oder in einem Molaren Verhältnis zwischen 10 : 1 und 1 : 10 von
Dihydroxyacetonphosphat zu Pyruvat benützt werden.
Glyceraldehyd-3-phosphat ist das Substrat für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase.
Es ist äquivalent zu Dihydroxyacetonphosphat, welches in Verbindung mit
Triosephosphatisomerase als dessen Quelle dient. Dihydroxyacetonphosphat wird wegen
seiner Stabilität bevorzugt. Weiterhin ist Glukose in Gegenwart von ATP und der
glykolytischen Enzyme Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase,
Aldolase und Triosephosphatisomerase äquivalent.
Die benützten Enzyme können alle aus dem selben Organismus sein, z. B. E. coli, oder
aus verschiedenen Organismen. Sie werden benützt in katalytischen Mengen im Molaren
Verhältnis von 0,00001 zu 0,1, bevorzugt 0,001 zu 0,1 von Dihydroxyacetonphosphat oder
Pyruvat.
Das Magnesiumsalz kann bevorzugt Magnesiumchlorid oder -sulfat und das Mn2+-Salz
kann Mn2+-chlorid oder -sulfat sein. Thiaminpyrophosphat kann als freie Säure oder als
Salz benützt werden, bevorzugt als Natrium- oder Kaliumsalz.
Jeder enzymatisch geeignete Puffer kann benützt werden. Tris-Hydrochlorid ist ein
bevorzugter Puffer. Der pH-Wert liegt bevorzugt zwischen 7 und 9 und im speziellen
zwischen 7,5 und 8,5, meistens bei 8,0. NADP+ kann in stöchiometrischen Mengen
benützt werden. Es kann auch in situ regeneriert werden. Für diesen Zweck können
Glukose und Glukosedehydrogenase benützt werden. Das Molare Verhältnis von Glukose
oder Dihydroxyacetonphosphat zu Pyruvat ist bevorzugt 1 zu 10, speziell 1 zu 3.
Die Reaktionstemperatur sollte in Übereinstimmung mit dem Temperaturoptimum der En
zyme gewählt werden. Bevorzugt sollten alle Enzyme so gewählt werden, dass ihr Tem
peraturoptimum das selbe ist oder in einem engen Bereich von 10°C, bevorzugt 5°C
liegt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 35 bis 45°C und besonders 35 bis 40°C.
Die im Anspruch 55 definierten Reaktionsschritte können getrennt voneinander ausgeführt
werden, jeder mit seinen optimalen Bedingungen. Die intermediären Reaktions
mischungen können in einer Gefriertruhe gelagert werden, bevorzugt bei -30°C bis -10°C,
besonders bei -20°C. Vor dem Einfrieren kann die Reaktion gestoppt werden durch
Zugabe von Säure, wie HCl, um den pH-Wert herabzusenken auf 2 bis 4, besonders auf
2.5 bis 3,5, bevorzugt auf 3,0. Die drei Reaktionsschritte können auch als Eintopfreaktion
durchgeführt werden. Es wird bevorzugt, jegliches während der drei Reaktionen ent
standenes Präzipitat durch Zentrifugation zu entfernen.
Die markierten Substrate können mit 32Phosphor, 14Kohlenstoff, 13Kohlenstoff, Deuterium
oder Tritium markiert sein. Diese Markierungstypen können allein oder in einer beliebigen
Kombination benützt werden, beispielsweise mit der Kombination 13C und Deuterium.
Die Markierung mit 14C oder 13C kann ein einzelnes Kohlenstoffatom betreffen, wobei jede
der Kohlenstoffpositionen markiert werden kann. Alternativ können die Substrate mehr
fach markiert sein, z. B. zweifach, dreifach, vierfach oder fünffach. Die totale 13C-Markie
rung ist besonders bevorzugt im Fall der 13C-Markierung.
Die Markierung mit Deuterium oder Tritium kann einfach oder mehrfach erfolgen. 1-Des
oxy-D-xylulose-5-phosphat kann mit Deuterium oder Tritium markiert werden in Position 1,
3, 4 oder 5, vorzugsweise in Position 3, 4 oder 5; und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
kann Deuterium- oder Tritium markiert werden in Position 1, 3, 4 oder der Methylgruppe.
Andere Intermediate stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat mit korrespondieren
der Markierung können benützt werden.
Die markierten Substrate können enzymatisch oder chemisch hergestellt werden.
Enzymatisch kann tritiiertes 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat hergestellt werden aus [3-
3H]Pyruvat für die Tritiierung in Position 1; oder aus [1-3H]Glyceraldehyd-3-phosphat oder
[1-3H]Dihydroxyaceton-3-phosphat für Tritiierung in Position 3 oder aus [2-
3H]Glyceraldehyd-3-phosphat für Tritiierung in Position 4 oder aus [3-3H]Glyceraldehyd-3-
phosphat für Tritiierung in Position 5; und anschließend können die tritiierten 2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat enzymatisch erhalten werden aus den korrespondierenden tritiierten
1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphaten.
Spezifisch kann [1-3H]Glyceraldehyd-3-phosphat synthetisiert werden aus [3-3H]Glukose
durch enzymatische Einwirkung von Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phospho
fruktokinase, Aldolase und Triosephosphatisomerase. Die Reaktionsmischung mit einem
Gehalt an [1-3H]Glyceraldehyd-3-phosphat kann direkt benützt werden für die Synthese
von [3-3H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat. [3-3H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat kann
synthetisiert werden aus [1-3H]Glyceraldehyd-3-phosphat und Pyruvat durch enzymati
sche Einwirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase.
[1-3H]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat kann synthetisiert werden aus [3-3H]1-Desoxy-D-
xylulose-5-phosphat durch katalytische Einwirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-
Reduktoisomerase.
[2-3H]Glyceraldehyd-3-phosphat kann synthetisiert werden aus [2-3H]Glukose durch en
zymatische Wirkung von Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase
und Aldolase. Die Reaktionsmischung mit einem Gehalt an [2-3H]Glyceraldehyd-3-phos
phat kann direkt benützt werden für die Synthese von [4-3H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phos
phat wie oben für [3-3H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat beschrieben. [3-3H]2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat kann aus [4-3H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat synthetisiert werden
durch katalytische Wirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase.
Deuterium-markierte 13C-markierte oder 14C-markierte Substrate können analog her
gestellt werden.
Die grundlegenden enzymatischen Prozesse sind bekannt aus G.A. Sprenger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci USA 94, 12857-12862 (1997); und Kuzuyama et al., Tetrahedron Lett. 39,
44509-44512 (1998).
Alternativ können die markierten 1-Desoxy-D-xylulose-Verbindungen hergestellt werden
durch Benutzung der entsprechend markierten Ausgangsmaterialien in dem Prozess der
beschrieben wurde durch Yokota, A. und Sasajima, K. in Agric. Biol. Chem. 48, 149-158
(1984) und ibid. 50, 2517-2524 (1986).
Die markierten 2C-Methyl-D-erythritol-Verbindungen können chemisch erhalten werden
durch den folgenden Prozess unter Benutzung entsprechend markierter Ausgangs
verbindungen:
- a) Reaktion von 1,2,5,6-Di-O-isopropyliden-D-mannitol mit Bleitetraacetat zu Iso propylidenglyceraldehyd; welcher
- b) anschließend umgesetzt wird zu 1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol durch Reaktion mit Methylmagnesiumiodid;
- c) Bildung von 3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon aus dem Produkt Schritt b) durch Oxidation, vorzugsweise mit Natriumperiodat in Anwesenheit von Rutheniumdioxid;
- d) Bildung von 1,2-O-Isopropyliden-3-O-trimethyl-(2R, 3RS)-1,2,3-trihydroxy-3-cyano butan durch Reaktion des Produkts von Schritt c) mit Trimethylsilylcyanid;
- e) Umwandlung des Produkts von Schritt d) in eine Mischung von 2C-Methyl-D- erythrono-1,4-lacton und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton durch Hydrolyse mit einer Säure;
- f) Herstellung von 2, 3-O-Isopropyliden-2C-Methyl-Derythrono-1,4-lacton durch Reak tion der Produkte von Schritt e) mit Aceton in Anwesenheit von wasserfreiem Zink chlorid;
- g) Umwandlung des Produkts von Schritt f) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D- erythrofuranose durch Reaktion mit einem Hydriddonor, vorzugsweise Diisobutyl aluminiumhydrid;
- h) Umwandlung des Produkts von Schritt g) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D- erythrose-(O-benzyl)oxim durch Reaktion mit O-Benzylhydroxylamin;
- i) Reaktion des Produkts aus Schritt h) mit Tribenzylphosphit und Iod um 2,3-O-Iso propyliden-2C-methyl-Derythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat zu erhalten;
- j) Umwandlung des Produkts von Schritt i) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D- erythrose-4-dibenzylphosphat durch Ozonisierung;
- k) Umwandlung des Produkts von Schritt j) zu 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D- erythritol-4-dibenzylphosphat durch Reaktion mit Natriumborhydrid;
- l) Umwandlung des Produkts von Schritt k) in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure durch Hydrierung, vorzugsweise in Anwesenheit von Palladium.
Tritiierung in Position 1 ist dadurch möglich, dass Schritt k) ausgeführt wird mit tritiiertem
Natriumborhydrid, wobei die Bedingungen für den folgenden Schritt l) im übrigen identisch
sind. Tritiierung in Position 2' ist dadurch möglich, dass Schritt b) mit tritiiertem Methyl
magnesiumiodid ausgeführt wird, welches hergestellt wurde aus tritiiertem Methyliodid und
Magnesium. Die anschließenden Schritte c) bis l) bleiben unverändert. Die Kombination
der Tritiierungsschritte ist möglich und liefert 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure mit
Tritiierung in Position 1 und/oder 2.
Deuterium-markierte, 13C-markierte oder 14C-markierte Substrate können analog her
gestellt werden.
Totale C-Markierung kann vorteilhaft ausgeführt werden indem man von [U-13C6]Glukose
und [U-13C3]Natriumpyruvat oder [2,3-13C2]Pyruvat ausgeht. In Anwesenheit von Thiamin
pyrophosphat, ATP und MgCl2 werden die folgenden Enzyme benützt für die Herstellung
von [U-13C]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat; Triosephosphatisomerase, Hexokinase,
Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase, 1-Desoxy-D-xylulose-5-phos
phat-Synthase. Anschließend können die Produkte umgewandelt werden zu [U-13C]2C-
Methyl-D-erythritol-4-phosphat mit 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase
und Glukose, NADP+ und MgCl2.
Weiterhin kann (U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol in [U-13C5]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol, [U-13C5]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und [U-13C5]2C-
methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat unter Benützung der Enzyme YgbP, YchB und
YgbB in Gegenwart von CTP, ATP, MgCl2 und MnCl2 umgesetzt werden. Für die
Regeneration von ATP ist es auch möglich Pyruvatkinase in Gegenwart von
Phosphoenolpyruvat zu benützen.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden zahlreiche Techniken in Mole
kularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Proteinbiochemie benützt, welche
z. B. ausführlich beschrieben sind in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Labora
tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.);
Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984
(Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in
EnzyMology (Academic Press, Inc.); and Protein Purification: Principles and Practice, Se
cond Edition (Springer-Verlag, NY.).
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuresequenzen, welche Pflanzenenzyme,
daraus abgeleitete enzymatisch aktive Fragmente und verwandte abgeleitete Sequenzen
aus anderen Pflanzenarten umfassen. Erfindungsgemäss zieht sich eine Nukleinsäure,
welche "abgeleitet ist" aus einer Sequenz, auf eine Nukleinsäuresequenz entsprechend
einer Region der Sequenz oder homologen Sequenzen oder komplementär zu Sequenzen
oder "Sequenzkonservativen Varianten" und "Funktionskonservativen Varianten". Se
quenzkonservative Varianten sind die, in denen die Änderung in einem oder mehreren
Nukleotiden in einer gegebenen Kodonposition keine Änderung in der Aminosäure
codierung dieser Position bewirkt. Funktionskonservative sind die, in welchen ein gege
bener Aminosäurerest geändert wurde ohne die Gesamtkonformation und Funktion des
Polypeptids zu ändern unter Einschluß aber nicht unter Begrenzung auf den Ersatz von
Aminosäuren durch eine solche mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften (so
wie z. B. sauer, hydrophob usw.). Enzymfragmente, welche enzymatische Aktivität behal
ten können identifiziert werden entsprechend den hier beschriebenen Methoden, z. B. Ex
pression in E. coli mit anschließender enzymatischer Untersuchung des Zellextrakts.
Sequenzen, die sich von anderen Pflanzen als Arabidopsis thaliana ableiten, können iso
liert werden durch Routineexperimente unter Benutzung der hier zur Verfügung gestellten
Methoden und Zusammensetzungen. Z. B. kann die Identifizierung von Homologen erfol
gen durch Hybridisierung einer Nukleinsäure, welche die Gesamtheit oder Teile einer
Arabidopsis-Sequenz enthält unter Bedingungen intermediärer Stringenz (so wie z. B. eine
wässrige Lösung von 2X SSC bei 65°C) an cDNA oder genomische DNA, welche von
anderen Pflanzenarten abgeleitet wurden. Von verschiedenen Pflanzenarten abgeleitete
cDNA-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (Clontech, Palto Alto, CA; Stratagene, La
Jolla, CA). Alternativ können PCR-basierte Methoden benutzt werden um verwandte Se
quenzen zu amplifizieren aus cDNA oder genomischer DNA, welche aus anderen Pflan
zen abgeleitet wurde.
Die Expression der identifizierten Sequenz, beispielsweise in E. coli, unter Benutzung von
Methoden, die hier im Detail beschrieben werden wird dann durchgeführt um die enzyma
tische Aktivität des von der Sequenz codierten Polypeptids zu bestätigen. Dement
sprechend fallen Sequenzen, welche von dicotyledonen und monocotyledonen Pflanzen
abgeleitet sind in den Bereich der Erfindung.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen Purin- und Pyrimidin-enthaltende
Polymere von beliebiger Menge, entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleo
tide oder gemischte Polyribo-Polydesoxyribonukleotide. Diese umfassen einzel- und dop
pelsträngige Moleküle, z. B. DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA Hybride ebenso wie Pro
teinnukleinsäuren (PNA), welche gebildet sind durch Konjugation von Basen an ein Ami
nosäurerückgrat. Dies schließt auch Nukleinsäuren mit modifizierten Basen ein. Die Nu
kleinsäuren können direkt aus Zellen isoliert werden. Alternativ kann PCR benützt werden
zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung unter Benutzung von chemisch synthe
tisierten Strängen oder genomischem Material als Matrize. Für die PCR benützte Primer
können synthetisiert werden unter der Benutzung der hier bereitgestellten Sequenz
information und können weiterhin so konstruiert werden, dass nach Bedarf neue Restrik
tionsstellen eingeführt werden um den Einbau in einen gegebenen Vektor für die rekombi
nante Expression zu erleichtern.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können flankiert sein durch natürliche
Arabidopsis Regulationssequenzen oder können assoziiert sein mit heterologen
Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancern, Responselementen,
Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nichtcodierende
Regionen und ähnliches. Die Nukleinsäuren können auch modifiziert sein durch viele
Maßnahmen entsprechend dem Stand der Forschung. Nicht-limitierende Beispiele für sol
che Modifikationen enthalten Methylierung, "Caps", Substitution einer oder mehrerer der
natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, und Internukleotidmodifikationen,
wie z. B. diejenigen mit ungeladenen Verknüpfungen, (z. B. Methylphosphonate, Phospho
triester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B.
Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.). Nukleinsäuren können eine oder mehrere
zusätzliche kovalent verknüpfte Einheiten enthalten wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen,
Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), Intercalatoren (z. B., Acridin, Psora
len, etc.), Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle, etc.) und
Alkylatoren. Die Nukleinsäuren können abgeleitet werden durch Bildung einer Methyl-
oder Ethylphosphotriesterbindung oder einer Alkylphosphoramidatbindung. Weiterhin
können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung auch modifiziert werden
mit einer Markierung, welche ein direkt oder indirekt detektierbares Signal liefert. Exem
plarische Markierungen schließen Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin und wei
teres ein.
Die Erfindung stellt auch Nukleinsäurevektoren bereit, welche die offen gelegten HPPD-
Sequenzen oder Derivate oder Fragmente davon umfassen. Eine große Zahl von Vekto
ren, einschließlich Plasmid und Pilzvektoren sind beschrieben worden für die Replikation
und/oder Expression in einer Vielfalt von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten.
Nicht-limitierende Beispiele umfassen pKK Plasmide (Clontech), pUC Plasmide, pET
Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI) oder pRSET oder pREP (Invitrogen, San Diego,
CA) und viele geeignete Wirtszellen unter Benutzung von Methoden, die hier offengelegt
oder zitiert werden oder die dem Fachmann anderweitig bekannt sind. Rekombinante
Klonierungsvektoren umfassen oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonie
rung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z. B. Anti
biotikaresistenz und ein oder mehrere Expressionskassetten. Geeignete Wirtszellen kön
nen transformiert/transfiziert/infiziert werden je nach Bedarf durch eine geeignete Methode
unter Einschluß von Elektroporation, CaCl2-vermittelten DNA-Aufnahme, tungae-Infektion,
Mikroinjektion, Mikroprojektil oder andere etablierte Methoden.
Geeignete Wirte schließen Bakterien, Archaebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, Pflan
zen und tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen ein. Von besonderer Bedeutung sind
E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizo
saccharomyces pombi, SF9 Zellen, C129 Zellen, 293 Zellen, Neurospora, und CHO Zel
len, COS Zellen, HeLa Zellen und immortalisierte myeloide und lymphoide Säugetier
zellen. Bevorzugte Replikationssysteme schließen M13, ColE1, SV40, Baculovirus,
Lampda, Adenovirus und ähnliches ein. Eine große Anzahl von Transkriptions-, Initiations-
und Terminationsregulationsregionen sind isoliert worden und ihre Wirksamkeit in der
Transkription und Translation heterologer Proteine in den verschiedenen Wirten ist ge
zeigt worden. Beispiele für diese Regionen, Methoden für die Isolierung, Art der Hand
habung, etc. sind dem Fachmann bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen
können Wirtszellen benützt werden als Quelle für rekombinant produzierte Enzymabgelei
tete Peptide und Polypeptide.
Vorteilhafterweise können Vektoren ein Transkriptionsregulationselement (d. h. einen
Promoter) einschließen, der operational verknüpft ist mit dem Enzymanteil. Der Promoter
kann nach Bedarf Operatorportionen und/oder Ribosomenbindungsstellen enthalten.
Nicht-limitierende Beispiele für bakterielle Promotoren, welche mit E, coli kompatibel sind
schließen ein: trc-Promoter, β-Lactamase (Penicillinase)-Promoter, Lactosepromoter,
Tryptophan (trp)-Promoter, Arabinose BAD Operon-Promoter, lambda-abgeleiteter P1-
Promoter und N Gen Ribosomenbindungsstelle und den Hybriden Tac Promoter, der ab
geleitet ist aus Sequenzen von trp und lac UV5 Promotoren. Nicht-limitierende Beispiele
für Hefepromotoren umfassen 3-Phosphoglyceratkinasepromoter, Glyceraldehyd-3-phos
phatdehydrogenase (GAPDH) Promoter, Galactokinase (GALI) Promoter, Galacto
epimerase Promoter und Alkoholdehydrogenase (ADH) Promoter. Geeignete Promotoren
für Säugerzellen umfassen ohne Limitierung virale Promotoren wie z. B. solche aus Simian
Virus 40 (SV40), Rous sarcoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapilloma Vi
rus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequenzen und Poly A Additions
sequenzen benötigen und Enhancersequenzen, welche die Expression erhöhen können
eingeschlossen werden. Sequenzen, welche die Amplifizierung von Genen verursachen
können ebenfalls wünschenswert sein. Weiterhin können Sequenzen eingeschlossen
werden, welche die Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Zelle erleichtern unter
Einschluß aber ohne Begrenzung auf Bakterien, Hefen und tierische Zellen, wie z. B. se
kretorische Signalsequenzen und/oder Prohormon pro Region-Sequenzen.
Nukleinsäuren, welche Wildtyp oder Variantenenzympolypeptide codieren können in Zel
len auch durch Rekombinationsereignisse eingeführt werden. Z. B. kann eine Sequenz in
eine Zelle eingeführt werden und dadurch homologe Rekombination am Ort des endo
genen Gens oder einer Sequenz mit substantieller Identität mit dem Gen bewirken. An
dere rekombinationsbasierte Methoden, wie z. B. nicht-homologe Rekombination oder
Deletion endogener Gene durch homologe Rekombination kann ebenfalls benützt werden.
Enzym-abgeleitete Polypeptide entsprechend der vorliegenden Erfindung unter Einschluss
funktionskonservativer Enzymvarianten können aus Wildtyp oder Mutanten Arabidopsis
Zellen oder aus heterologen Organismen oder Zellen (unter Einschluss aber nicht unter
Beschränkung auf Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen- und Säugetier-Zellen) isoliert
werden, in welche eine Enzym-abgeleitete Protein-codierende Sequenz eingeführt und
exprimiert worden ist. Weiterhin können die Polypeptide Zellen rekombinanter Fusions
proteine sein. Alternativ können Polypeptide chemisch synthetisiert werden durch kom
merziell verfügbare, automatisierte Prozeduren unter Einschluss aber nicht unter Be
schränkung auf ausschließliche Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden,
Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese.
"Reinigung" eines Enzympolypeptids bezieht sich auf die Isolierung des Enzympolypeptids
in einer Form, welche es erlaubt, seine enzymatische Aktivität zu messen ohne Be
einträchtigung durch andere Komponenten der Zelle, in welcher das Polypeptid exprimiert
wird. Methoden zur Polypeptidreinigung unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung
auf präparative Disc-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, reverse Phase
HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Partitionschromatographie und
Gegenstromverteilung sind dem Fachmann wohlbekannt. Für bestimmte Zwecke ist es
vorzuziehen, das Polypeptid in einem rekombinanten System zu produzieren, in welchem
das Protein einen zusätzlichen Sequenzabschnitt ("sequence tag"), wie z. B. aber nicht
ausschließlich eine Polyhistidinsequenz, enthält, welche die Reinigung erleichtert. Das
Polypeptid kann dann aus einem Rohlysat der Wirtszelle gereinigt werden durch
Chromatographie an einer geeigneten Festphasenmatrix. Alternativ können gegen das
Enzym oder gegen davon abgeleitete Peptide produzierte Antikörper als
Reinigungsreagenz benützt werden. Andere Reinigungsmethoden sind möglich.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Derivate und Homologe der Enzympolypeptide.
Für bestimmte Zwecke können Peptid-codierende Nukleotidsequenzen geändert werden
durch Substitution, Addition oder Deletion, welche funktionell äquivalente Moleküle, z. B.
funktionskonservative Varianten, liefern. Z. B. kann ein oder mehrere Aminosäurereste
innerhalb der Sequenz substituiert werden durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen
Eigenschaften, wie z. B. positiv geladene Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin); nega
tiv geladene Aminosäuren (Aspartat und Glutamat); polare, neutrale Aminosäuren; und
nicht-polare Aminosäuren.
Die isolierten Polypeptide können z. B. modifiziert werden durch Phosphorylierung, Sulfa
tisierung, Acylierung oder andere Proteinmodifikationen. Sie können auch modifiziert wer
den mit einer Markierung, welche ein detektierbares Signal liefern kann, und zwar ent
weder direkt oder indirekt unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf Radio
isotope und fluoreszierende Verbindungen.
Gene, welche YgbP (oder YgbB) oder YchB aus irgendeiner Pflanze entsprechen können
isoliert werden durch gut bekannte Techniken, wie z. B. Southern-Hybridisierung oder PCR
unter Benutzung entarteter Primer. Insbesondere kann eine cDNA-Bank dieser fraglichen
Pflanze gescreent werden unter Benutzung des Nukleinsäure-Direktmarkierungs- und De
tektionssystemkits, welches geliefert wird von Amersham Pharmacia Biotech (Heidelberg,
Deutschland). Hybridisierungsbedingungen sind z. B. 7% Natriumdodecylsulfat (SDS),
0,5. Positiv hybridisierende Plaques werden detektiert durch Lumineszenzdetektion (oder
in anderen Systemen durch Autoradiographie). Nach Reinigung zu einzelnen Plaques
werden cDNAs isoliert und ihre Sequenz wird bestimmt durch die Kettenabbruchmethode
unter Benützung von Dideoxyterminatoren, welche mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert
sind (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Dieses experimentelle Protokoll kann
vom Fachmann benützt werden um Gene mit substantieller Ähnlichkeit zum Arabidopsis-
Gen aus irgendeiner Pflanze zu erhalten.
Die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können benützt wer
den zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Funktion von Enzymen hemmen
und dadurch z. B. nützlich sind als Herbizide oder als Leitverbindungen für die Entwicklung
von nützlichen Herbiziden. Dies kann erreicht werden durch Bereitstellung einer Zelle,
welches das Enzym exprimiert und dadurch Zellkulturen produziert, welche das Enzym
exprimieren und Inkubation besagter Zelllinien in Gegenwart von Testverbindungen um
Testkulturen zu bilden und in Abwesenheit von Testverbindungen um Kontrollkulturen zu
bilden. Man lässt die Inkubation über eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedin
gungen erfolgen damit die Einwirkung auf die Enzymfunktion eintreten kann. Zu einer vor
bestimmten Zeit nach dem Start der Inkubation mit einer Testverbindung wird ein Test
ausgeführt um die Enzymaktivität zu bestimmen. In einer Ausführungsform wird die En
zymaktivität in ganzen Zellen bestimmt. Alternativ kann die Enzymaktivität bestimmt wer
den in Zellextrakten oder Medien, welche das isolierte Enzym enthalten unter Benutzung
von Methoden so wie die unten beschriebenen. Zusätzliche Kontrollen, sowohl im Hinblick
auf Kulturproben und Testproben, werden ebenfalls eingeschlossen, wie z. B. eine Wirts
zelle, welche das Enzym nicht exprimiert (z. B. eine Wirtszelle, welche transformiert ist mit
einem Expressionsplasmid, welche das Enzymgen in reverser Orientierung enthält oder
welche kein Insert enthält). Enzymhemmende Verbindungen werden als solche identifi
ziert, welche die Enzymaktivität in den Testkulturen relativ zu den Kontrollkulturen verrin
gern.
Wirtszellen, die benützt werden können um die vorliegende Erfindung auszuüben um
fassen ohne Einschränkung Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen. Vor
zugsweise werden bakterielle Zellen benützt. Am meisten bevorzugt werden bakterielle
Zellvarianten (wie z. B. die imp Mutante von E. coli), welche erhöhte Membranpermeabilität
für Testverbindungen im Vergleich mit der Wildtypwirtszelle zeigen.
Vorzugsweise werden die Methoden der gegenwärtigen Erfindung angepasst für einen
"highthroughput screen", welcher es erlaubt eine Vielfalt von Verbindungen in einem ein
zigen Test zu prüfen. Solche hemmenden Verbindungen können z. B. gefunden werden in
Bibliotheken von Naturprodukten, Fermentationsbibliotheken (welche Pflanzen und Mikro
organismen umfassen), kombinatorischen Bibliotheken, Verbindungsdatenbanken und
synthetischen Verbindungsbibliotheken. Z. B. sind synthetische Verbindungsbibliotheken
kommerziell erhältlich von Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex
(Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), und Microsource (New Milford, CT).
Eine seltene chemische Bibliothek ist verfügbar von Aldrich Chemical Company, Inc.
(Milwaukee, WI). Alternativ sind Bibliotheken von Naturstoffen in Form von Bakterien, Pil
zen, Pflanzen und Tierextrakten verfügbar, z. B. von Pan Laboratories (Bothell, WA) oder
MycoSearch (NC), oder können leicht hergestellt werden. Außerdem können natürliche
und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht modifiziert werden
durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel (Blondell et al.,
TibTech 14 : 60, 1996). Hemmtests entsprechend der vorliegenden Erfindung sind vorteil
haft insofern, als sie viele unterschiedliche Lösungsmitteltypen zulassen und dadurch die
Testung von Verbindungen aus vielen Quellen erlauben.
Nachdem eine Verbindung durch die Methoden der vorliegenden Erfindung als Inhibitor
identifiziert wurde, können in-vivo- und in-vitro-Tests durchgeführt werden um die Natur
und den Mechanismus der Hemmwirkung weiter zu charakterisieren. Der Effekt einer
identifizierten Verbindung auf eine in vitro Enzymaktivität eines gereinigten oder partiell
gereinigten Enzyms kann bestimmt werden und Enzymkinetikplots können benützt werden
um z. B. zwischen kompetitiven und nicht-kompetitiven Inhibitoren zu unterscheiden.
Verbindungen, welche als Inhibitoren identifiziert wurden unter Benutzung der Methoden
der vorliegenden Erfindung können modifiziert werden um die Potenz, Wirksamkeit, Auf
nahme, Stabilität und Brauchbarkeit für die Benutzung in kommerziellen Herbizid
applikationen etc. modifiziert werden. Diese Modifikationen werden erreicht und getestet
unter Benutzung von Methoden, welche dem Fachmann wohlbekannt sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Isolierung von Enzymvarianten, welche resistent
sind gegen die Wirkung von Enzyminhibitoren/Herbiziden. Die Enzymvarianten können
natürlich vorkommen oder können erhalten werden durch zufällige oder ortsgerichtete
Mutagenese.
In einer Ausführungsform wird eine Population von Zellen oder Organismen, welche das
Enzym exprimieren mutagenisiert unter Benutzung von dem Fachmann wohlbekannten
Methoden, wonach die Zellen oder Organismen einem Auswahlverfahren unterworfen
werden um diejenigen zu Identifizieren, welche resistent sind gegen die toxischen Effekte
von Inhibitoren. Das Variantenenzym wird dann aus den resistenten Zellen oder Organis
men isoliert, beispielsweise unter Benutzung von PCR-Techniken.
In einer anderen Ausführungsform wird ein isoliertes Enzymgen der stochastischen oder
ortsspezifischen Mutagenese in vitro unterworfen, wonach mutagenisierte Versionen des
Gens in eine geeignete Zelle, wie z. B. E. coli zurückübertragen wird und die Zellen werden
einer Selektions- oder Auswahlprozedur unterworfen, wie oben beschrieben.
Die Variantengene werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert und die enzymatischen
Eigenschaften von Variantenenzympolypeptiden werden mit dem Wildtypenzym vergli
chen. Vorzugsweise führt eine gegebene Mutation zu einem Enzymvariantenpolypeptid,
welches in vitro Aktivität behält, während es katalytische Aktivität zeigt, die relativ resisten
ter ist gegen das (die) ausgewählte(n) Herbizid(e) als das Wildtypenzym. Vorzugsweise
hat das Variantenenzym ausreichende katalytische Aktivität um die Lebensfähigkeit der
Zelle, in der es exprimiert wird zu unterhalten, wenn es in einer Zelle exprimiert wird, wel
che Enzymaktivität zur Überlebensfähigkeit benötigt; oder katalytische Aktivität in Kombi
nation mit anderen Herbizid-resistenten Enzymvariantenproteinen, die ebenfalls in der
Zelle exprimiert werden, welche die selbe oder verschieden vom ersten Enzymprotein sein
können, die ausreichend sind, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten in der es ex
primiert wird; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter ist gegen das Herbizid als das
Wildtypenzym.
Es ist deshalb nicht unbedingt erforderlich, dass ein bestimmtes Enzymvariantenprotein
die gesamte katalytische Aktivität hat, die notwendig ist um die Lebensfähigkeit der Zelle
aufrecht zu erhalten, sondern es muss eine gewisse katalytische Aktivität in einem Aus
maß haben, allein oder in Kombination mit der katalytischen Aktivität zusätzlicher Kopien
der gleichen Enzymvariante und/oder der katalytischen Aktivität anderer Enzymvarianten
proteine, die ausreichend ist um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten, die Enzym
aktivität zum Überleben benötigt. Z. B. kann die katalytische Aktivität erhöht werden bis zu
minimal akzeptablen Niveaus durch Einführen multipler Kopien eines Varianten-codieren
den Gens in die Zelle oder durch Einführen des Gens, welches weiterhin einen relativ
starken Promoter einschließt um die Produktion der Variante zu erhöhen.
Resistenter bedeutet, dass die katalytische Aktivität der Variante durch das Herbizid wenn
überhaupt, zu einem geringeren Grad als die katalytische Aktivität des Wildtyps durch das
Herbizid (die Herbizide) verringert wird. Eine bevorzugte resistentere Enzymvariante hält
ausreichend katalytische Aktivität um die Lebensfähigkeit einer Zelle oder einer Pflanze
oder eines Organismus, in dem bei der gleichen Konzentration des gleichen Herbizids
(der gleichen Herbizide) das Wildtypenzym keine ausreichende katalytische Aktivität be
halten würde um die Lebensfähigkeit der Zelle der Pflanze oder des Organismus zu erhal
ten.
Vorzugsweise beträgt die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids mindestens
5% und vorzugsweise mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtypenzyms in
Abwesenheit des Herbizids (der Herbizide).
Herbizid-resistente Enzymvarianten können als genetische Marker in jeglicher Zelle be
nützt werden, welche unter normalen Umständen empfindlich bezüglich inhibitorischer
Effekte, welche von Herbiziden ausgebildet werden, sind. In dieser Darstellung wird DNA,
welche für eine herbizid-resistente Enzymvariante codiert, in ein Plasmid unter der Kon
trolle eines geeigneten Promoters inkorporiert. Jegliche, benötigte DNA kann dann in ein
Plasmid inkorporiert werden, und das letztliche rekombinante Plasmid kann in eine herbi
zid-empfindliche Zelle eingeführt werden. Zellen, welche mit dem Plasmid transformiert
wurden, werden dann selektiert oder gescreent durch Bebrütung in Gegenwart einer aus
reichenden Konzentration an Herbizid, um das Wachstum und/oder die Pigmentbildung zu
inhibieren.
Die gegenwärtige Erfindung schließt transgene Zellen, eingeschlossen, aber nicht be
grenzt auf Samen, Organismen und Pflanzen, in welche Gene, welche für herbizid
resistente Enzymvarianten codieren, eingeführt wurden, ein. Nicht-limitierende Beispiele
für geeignete Empfängerpflanzen sind in Tabelle 3 unten aufgeführt:
Expression von den Polypeptidvarianten in transgenen Pflanzen überträgt ein hohes Mass
von Resistenz gegen Herbizide, was den Gebrauch dieser Herbizide während der Kultivie
rung der transgenen Pflanzen erlaubt.
Methoden für die Einführung von Fremdgenen in Pflanzen sind allgemein bekannt. Nicht
limitierende Beispiele dieser Methoden schließen die Agrobakterium-Infektion, Partikel
bombardierung, Polyethylenglykol-(PEG)Behandlung von Protoplasten, Elektroporation
von Protoplasten, Mikroinjektion, Makroinjektion, Ähreninjektion, Pollenschlauch-Bio
synthese, Trockensameneinsaugung, Laserperforation und Elektrophorese. Diese Metho
den sind z. B. in B. Jenes et al., und S. W. Ritchie et al. In Transgenic Plants, Vol. 1, En
gineering and Utilization, Ed. S.-D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace
Jovanovich 1993; und L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310,
1994 beschrieben.
In einer bevorzugten Darstellung wird die DNA, die für eine Enzymvariante codiert in einen
DNA-Vektor kloniert, welcher ein Antibiotika-Resistenz-Markergen enthält, und das DNA
für das rekombinante Enzym enthaltende Plasmid wird in Agrobakterium tumefaciens,
welches ein Ti-Plasmid enthält, eingeführt. Dieses "binäre Vektor-System" wird z. B. in
U. S. Patent Nr. 4, 490,838, und in An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3; 1-19 (1988) be
schrieben. Das transformierte Agrobakterium wird dann ko-kultiviert mit Blattscheiben der
Empfängerpflanze, um eine Infektion und Transformation der Pflanzenzellen zu erlauben.
Transformierte Pflanzenzellen werden dann in Regenerationsmedium kultiviert, welches
die Bildung von Schösslingen fördert, zuerst in Gegenwart eines geeigneten Antibiotikums
für das Selektionieren von transformierten Zellen, dann in Gegenwart von Herbiziden. In
Pflanzenzellen, welche erfolgreich mit für herbizid-resistenten Enzymen codierender DNA
transformiert wurden, findet Schösslingbildung sogar in Gegenwart von Herbizidmengen
statt, welche die Schösslingbildung aus nicht transformierten Zellen inhibierten. Nach Be
stätigung des Vorhandenseins von DNA für die Enzymvariante, unter Benützung, zum
Beispiel, der Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)Analyse, werden die transformierten
Pflanzen auf ihre Fähigkeit, der Herbizidspritzung zu widerstehen, und auf ihr Vermögen
zur Samenkeimung und Wurzelbildung und Gedeihung in Gegenwart von Herbiziden ge
testet.
Die Methoden und Zubereitungen der gegenwärtigen Erfindung können für die Herstellung
von herbizid-resistenten Enzymvarianten benützt werden, welche in Pflanzen eingeführt
werden können, um selektive Herbizid-Resistenz auf Pflanzen zu übertragen. Intermediä
re Enzymvarianten (zum Beispiel Varianten, die nicht ganz optimale spezifische Aktivität,
aber hohe Herbizid-Resistenz zeigen, oder das Gegenteil) sind nützlich als Muster für den
Entwurf von Enzymvarianten der zweiten Generation, welche adäquate spezifische Aktivi
tät und hohe Resistenz behalten.
Gene für Herbizid-Resistenz-Enzyme können in einer oder mehreren Kopien in Spezies
von Feldfrüchten transformiert werden, um die Herbizid-Resistenz zu übertragen. Die all
gemeine grosstechnische Produktion von Nutzpflanzenspezies mit einer reduzierten Emp
findlichkeit gegen Herbizide kann:
- 1. Das Spektrum und die Flexibilität der Verabreichung von spezifisch wirksamen und umweltfreundlichen Herbiziden erhöhen;
- 2. Den kommerziellen Wert dieser Herbizide verstärken;
- 3. Den Unkrautanteil in Nutzpflanzenfeldern durch die effektive Nutzung von Herbiziden bei herbizid-resistenten Nutzpflanzenspezies reduzieren und den entsprechenden Ernteertrag erhöhen;
- 4. Den Verkauf von Samen für herbizid-resistente Pflanzen erhöhen;
- 5. Die Resistenz gegenüber der Nutzpflanzenvernichtung wegen des Übertrags von Herbiziden, welche in früherer Pflanzung verabreicht wurden, erhöhen;
- 6. Die Anfälligkeit gegenüber Veränderungen der Herbizideigenschaften, resultierend aus ungünstigen klimatischen Bedingungen verringern und
- 7. Die Toleranz gegenüber ungleichmässig falsch angewendeten Herbiziden erhöhen.
Zum Beispiel können die transgenen Protein der Enzymvariante enthaltenden Pflanzen
kultiviert werden. Die Nutzpflanze kann mit für Unkraut wachstumkontrollierend
ausreichender Menge an Herbiziden behandelt werden, gegen welches die transgene
Pflanze mit der Enzymvariante resistent ist, resultierend in der Wachstumskontrolle für
Unkraut im Nutzpflanzenfeld ohne die kultivierte Nutzpflanze dramatisch zu beeinflussen.
Die Verbindungen, welche durch die oben genannten Screeningmethoden als Inhibitoren
entdeckt wurden können eingesetzt werden als Reinsubstanzen oder als Mischung ge
meinsam mit geeigneten Additiven zur Hemmung der Enzyme in Pflanzen, Bakterien oder
in Protozoen. Gebräuchliche Additive im Bereich der Herbizide, antibakteriellen Agentien
oder Antiprotozoenwirkstoffe können benutzt werden.
Die Erfindung wird nun beschrieben im Hinblick auf spezifische Beispiele.
2,0 µg des Vektors pQE30 (Qiagen. Hilden, Deutschland) wird mit 30 E NcoI (New
England Biolabs, Schwalbach, Deutschland (NEB)) in einem Gesamtvolumen von 60 µl,
das 6 µl NEB4 Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Nach Zugabe von 33 µM jedes dNTP's (NEB) und 5 E Klenow-Fragment der
Polymerase 1 aus E. coli (NEB) wird die Reaktionsmischung für weitere 30 min. bei 25°C
inkubiert. Die Vektor DNA wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 µl
des Puffers PB (Qiagen) werden zu 98 µl der PCR-Reaktions-Mischung gegeben und auf
eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf
wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie
oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wir ein weiteres Mal für 1
min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß
gesteckt. 50 µl H2O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min.
bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt 1,5 µg gereinigte Vektor DNA.
20 ng Vektor-DNA werden religiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein,
Deutschland), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei
dieser Reaktion resultiert das Plasmid pQE_noNco. Die Ligationsmischung wird über
Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli
XL1-Blue Zellen transformiert (Bullock, W.O., Fernandez, J.M., and Short, J.M. (1987).
XL1-Blue: a high efficieny plasmid transforming recA Escherichia coli with β-galactosidase
selection. BioTechniques 5, 376-379).
1 Liter LB-Medium wird im Verhältnis 1 : 100
beimpft mit einer frischen Übernacht-Kultur. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln
bei 220 UpM inkubiert bis eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht ist. Die Zellen
werden 20 Min. auf Eis gekühlt und 15 Min. bei 4.000 UpM und 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wird entfernt und das Pellet wird resuspendiert in 1 l eiskaltem, sterilem 10%
(v/v) Glycerol. Die Zellen werden ein weiteres mal wie vorher beschrieben zentrifugiert und
in 0,5 l bzw. 20 ml 10% eiskaltem, sterilem Glycerol resuspendiert. Die Zellen werden
erneut zentrifugiert und das Pellet wird resuspendiert in 2 ml eiskaltem 10% (v/v) Gly
cerol. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 µl eingefroren und in flüssigem Stickstoff
gelagert.
Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 µl der Zellsuspension werden
mit 2 µl der Ligationsmixtur gemischt und in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Küvette
(BioRad) eingefüllt. Die Suspension wird durch Schütteln auf den Küvettenboden gebracht
und die Küvette wird in den vorgekühlten Schlitten eingesetzt. Der Schlitten wird in die
Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,50 kV, 25 µF und Pulse Controller Stel
lung 200 Ω gepulst. Die Küvette wird aus dem Schlitten entfernt und die Zellen werden
suspendiert in 1 ml SOC-Medium (2% (w/v) Casein Hydrolysat, 0,5% (w/v), Hefeextrakt,
10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glukose). Die Sus
pension wird 1 Stunde bei 37°C geschüttelt. 100 µl der Suspension werden auf LB-
Platten mit einem Gehalt von 150 mg Ampicillin/Liter plattiert zwecks Erhaltung des
Plasmids pQE_noNco. Das Plasmid pQE_noNco wird wie vorher beschrieben isoliert.
9 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Escherichia coli XL1-Blue Zellen welche den Expressionsvektor pQE_noNco enthalten,
werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180
mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml
Kultur werden 20 Min. bei 5.000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des
Plasmids pNCO113 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland)
benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,0. 30 µg RNase A werden zugefügt. 0,3 ml einer 1% SDS-Lösung
(w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 Min. bei
Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5
werden zugefügt und die Mischung wird 10 Min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15
Min. bei 14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein
Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit einer Lösung von 750 mM
NaCl, 15% (v/v) Ethanol und 0,15% (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das
Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und
15% (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von
1250 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die
DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und mit 1
ml eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer
Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 µl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt
8,3 µg Vektor-DNA pQE_noNco.
Die DNA-Sequenz des Plasmids pQE_noNco wird nach der automatischen
Dideoxynukleotid-Methode (Sanger, F., S. Nicklen, und A. R. Coulson. (1977). DNA
sequence analysis with chain terminating inhibitors. Proc. Acad. Natl. ScL USA 74,
5463-5468) unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer (Nor
walk, USA) mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Di
visions (Foster City, USA) sequenziert. Die DNA-Sequenz stimmt mit der erwarteten
überein.
2,0 µg des Vektors pQE_noNco werden mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) in einem Ge
samtvolumen von 60 µl, das 6 µl EcoRI-Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung
wird für 3 Std. bei 37°C inkubiert. Die Vektor-DNA wird unter Benützung des PCR-
Reinigungskits gereinigt. 25 pMol der Oligonukleotide 5'-
CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGGAGGATCCGTCGACCTGCAG
CC-3' und 5'-
GGCTGCAGGTCGACGGATCCTCCCATGGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTGTGT
G-3' werden in 6 µl EcoRI-Puffer (NEB) und 54 µl H2O gelöst. Die Lösung wird 2 Min. bei
96°C erhitzt und innerhalb 12 Std. auf 10°C abgekühlt, um den DNA-Linker zu hybridisie
ren. Die Reaktionsmischung wird mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) versetzt und 3 Std.
bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird 30 Min. bei 65°C erhitzt, um die Enzyme
zu inaktivieren, und innerhalb 12 Std. auf 10°C zur Hybridisierung abgekühlt. Die Reak
tionsmischung enthält ungefähr 730 ng des DNA-Linkers.
20 ng der verdauten pQE_noNco Vektor-DNA (siehe oben) und 300 pg des DNA-Linkers
werden ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4-Liga
se-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das
Plasmid pNCO113. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der
Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
5 µg DNA des Plasmids pNCO113 werden isoliert und die DNA-Sequenz des Vektors
pNCO113 wird sequenziert wie oben beschrieben. Die DNA-Sequenz ist in Anhang 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002010020996 00004 99880 F ge
zeigt. Die Kultur wurde als Patenthinterlegung bei ATCC unter dem Titel "Escherichia coli
strain XL1-Blue harbouring plasmid pNCO113" hinterlegt, zugewiesen PTA-852, Datum
der Hinterlegung 14. Oktober 1999.
Escherichia coli XL1-Blue Zellen, welche den Expressionsvektor pNCO113 enthalten,
werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180
mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml
Kultur werden 20 Min. bei 5.000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des
Plasmids pNCO113 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland)
benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,0. 30 µg RNase werden zugefügt. 0,3 ml einer 1% SDS-Lösung (w/v)
in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 Min. bei Raum
temperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden
zugefügt und die Mischung wird 10 Min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 Min. bei
14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein
Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit 1 ml einer Lösung von 750
mM NaCl, 15% (v/v) Ethanol und 0,15% (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das
Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und
15% (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von
1250 mM NaCl und 15% (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die
DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und mit 1
ml eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer
Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 µl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt
8,3 µg DNA.
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird nach einer von Meade et
al., (Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, C. B., Brown, S. E., und Auswald, F. M. (1982).
Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium
meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122) beschriebenen
Methode isoliert. Der E. coli ORF ygbP (Accession Nr. gb AE000358) von Basenpaar (bp)
Position 6754 bis 7464 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler
E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers
AAATTAACCATGGCAACCACTCATTTGG, 25 pMol des Primers
TTGGGCCTGCAGCGCCAAAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-Polymerase
(Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung von 1,5 mM MgCl2,
50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100 in einem
Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen für jeweils 30
Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7
Min. bei 72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarose-
Gelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reingungskit von
Qiagen gereinigt. 500 µl Puffer PB (Qiagen) werden zu 98 µl der PCR-Reaktionsmischung
hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM
zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule
geladen und wie vorher zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut
1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml
Eppendorf-Röhrchen gestellt. 50 µl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule
aufgetragen, die anschließend 1 Min, bei 14.000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss
enthielt 1,5 µg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut
um DNA-Produkte mit überlappenden Enden herzustellen. Jede Restriktionsmixtur enthielt
7 µl NEB3 Puffer (NEB), 7 µg BSA, 40 E NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem
Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute
Vektor-DNA und PCR-Produkte werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 16 ng PCR-Produkt werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase
von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Ge
samtvolumen von 10 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCOygbP. Die Liga
tionsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert, mit 2 µl der Ligationsmischung werden
elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
Das Plasmid pNCOygbP wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Das DNA-Insert des Plasmids pNCOygbP wird wie in Beispiel 1 beschrieben, sequenziert.
1 g 2 Wochen alte Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stengel und Blätter) wer
den in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. 8 ml einer sterilen Lösung, die
pro Liter 600 g Guanidinthiocyanat, 5 g Natrium-N-laurylsarcosin, 50 mM Trinatriumcitrat
und 5 ml 2-Mercaptoethanol enthält werden zugefügt. Die Mischung wird vorsichtig zu 3
ml einer autoklavierten Lösung mit einem Gehalt (pro Liter) von 959 g CsCl2 und 37,2 g
EDTA zugefügt. Die Mischung wird bei 33.000 UpM und 18°C 24 Stunden zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird 10 Min. an der Luft getrocknet.
Das trockene Pellet wird in 360 µl sterilem, bidestilliertem Wasser aufgenommen. Die Lö
sung wird bei 14.000 UpM 10 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird mit 40 µl 3 M
Natriumacetat und 1 ml Ethanol gemischt. RNA wird über Nacht bei -20°C gefällt, bei
14.000 UpM und 4°C 15 Min. zentrifugiert und zwei mal mit 500 µl 75% Ethanol
gewaschen. Der Niederschlag wird luftgetrocknet und in 200 µl bidestilliertem, sterilem
Wasser aufgenommen. 500 µg RNA werden erhalten.
Eine Mischung mit einem Gehalt von 2,75 µg RNA, 50 nMol dNTP's, 1 µg hexamere
Randomprimer, 1 µg T15-Primer und 20% first strand 5x Puffer (Promega) in einem Ge
samtvolumen von 50 µl wird bei 95°C 5 Min. inkubiert und auf Eis gekühlt. 500 E M-MLV
reverse Transkriptase (Promega) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 42
°C inkubiert. Nach Inkubation bei 92°C für 5 Min. werden 20 E RNase A und 2 E RNase
H zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die resultierende cDNA (1 µl
dieser Mixtur) wird für die PCR-Amplifizierung von ygbP benutzt.
Der Expressionsvektor pNCO113 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben. Der A. tha
liana ORF ygbP (Accession Nr. gb AL004136) ohne die codierende Region für die vermu
tete Signalsequenz wird von Basenpaar (bp) Position 79845 bis 81915 durch PCR ampli
fiziert unter Verwendung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung
enthielt 25 pMol des Primers TTGTTGTGAAGGAGAAGAGTG, 25 pMol des Primers
CATGCATACCCTTGACACGTC, 1 µg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec,
Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydro
chlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94°C,
45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72°C
wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-
Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 1,5 µg gereinigtes
PCR-Produkt erhalten.
Das PCR-Amplifikat wird als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion benützt. Die Reak
tionsmischung enthielt 25 pMol Primer CAATGTTGTTGCCATGGAGAAG, 25 pMol Primer
ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG, 2 µl des ersten PCR-Amplifikats, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung mit
einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8.8 und 0.1%
(w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei
94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei
72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektro
phorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Beispiel
1 beschrieben. Dabei werden 1,2 µg gereinigtes PCR-Produkt erhalten. 2,0 µg des
Vektors pNCO113 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 1,5 µg des gereinigten PCR-
Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen.
Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E
NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen werden
3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt
werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-
Ligase (Gibco) und 2 µl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Da
bei wird das Plasmid pNCOygbPara erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4°C
inkubiert. 2 µl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen
transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden
hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pNCOygbPara wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrie
ben. Das Ergebnis ist in Annex Da gezeigt.
1 g 2 Wochen alte Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stengel und Blätter) wer
den in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. 8 ml einer sterilen Lösung, die
pro Liter 600 g Guanidinthiocyanat, 5 g Natrium-N-laurylsarcosin, 50 mM Trinatriumcitrat
und 5 ml 2-Mercaptoethanol enthält werden zugefügt. Die Mischung wird vorsichtig zu 3
ml einer autoklavierten Lösung mit einem Gehalt (pro Liter) von 959 g CsCl2 und 37,2 g
EDTA zugefügt. Die Mischung wird bei 33.000 UpM und 18°C 24 Stunden zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird 10 Min. an der Luft getrocknet.
Das trockene Pellet wird in 360 µl sterilem, bidestilliertem Wasser aufgenommen. Die Lö
sung wird bei 14.000 UpM 10 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird mit 40 µl 3 M
Natriumacetat und 1 ml Ethanol gemischt. RNA wird über Nacht bei -20°C gefällt, bei
14.000 UpM und 4°C 15 Min. zentrifugiert und zwei mal mit 500 µl 75% Ethanol
gewaschen. Der Niederschlag wird luftgetrocknet und in 200 µl bidestilliertem, sterilem
Wasser aufgenommen. 500 µg RNA werden erhalten.
Eine Mischung mit einem Gehalt von 2,75 µg RNA, 50 nMol dNTP's, 1 µg hexamere
Randomprimer, 1 µg T15-Primer und 20% first strand 5x Puffer (Promega) in einem Ge
samtvolumen von 50 µl wird bei 95°C 5 Min. inkubiert und auf Eis gekühlt. 500 E M-MLV
reverse Transkriptase (Promega) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 42°C
inkubiert. Nach Inkubation bei 92°C für 5 Min. werden 20 E RNase A und 2 E RNase
H zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die resultierende cDNA (1 µl
dieser Mixtur) wird für die PCR-Amplifizierung von ygbP benutzt.
Der Expressionsvektor pQE30 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben. Der vollständige
A. thaliana ORF ygbP (Accession Nr. gb AL004136) ohne die codierende Region für die
vermutete Signalsequenz wird von Basenpaar (bp) Position 19412 bis 21482 durch PCR
amplifiziert unter Verwendung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die
Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
CTTCTCTCAGGCGAGATAAAACATGG-3', 25 pMol des Primers 5'-
CATGCATACCCTTGACACGTC-3', 1 µg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec,
Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydro
chlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94°C,
45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72°C
wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophore
se unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qia
gen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 1,7 µg gereinigtes PCR-Produkt erhal
ten.
Das PCR-Amplifikat wird als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion benützt. Die Reak
tionsmischung enthielt 25 pMol Primer 5'-
GGCGAGAGGATCCATGGCGATGTCTCAGACG-3', 25 pMol Primer 5'-
ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG-3', 2 µl des ersten PCR-Amplifikats, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung mit
einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8.8 und 0.1%
(w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei
94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei
72°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektro
phorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Beispiel
1 beschrieben. Dabei werden 1,2 µg gereinigtes PCR-Produkt erhalten. 2,0 µg des
Vektors pQE30 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 1,5 µg des gereinigten PCR-
Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen.
Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E
BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen
werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-
Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-
Ligase (Gibco) und 2 µl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Da
bei wird das Plasmid pQEygbParakom erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4°C
inkubiert. 2 µl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen
transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden
hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbParakom wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben und ist nicht identisch mit der kalkulierten cDNA-Sequenz des
Datenbankeintrags (gb AC004136). Die DNA- und die zugehörige Aminosäuresequenz
des kompletten ygbP-Gens aus A. thaliana sind in Annex Db gezeigt.
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft
mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid
pNCOygbP enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37°C bebrütet. Bei einer opti
schen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für
weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000 UpM,
4°C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentri
fugiert wie oben beschrieben und bei -20°C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt
von 1 mM Dithioerythritol und 0,02% Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg
Lysozym pro ml und 10 µg DNasel pro ml. Die Mischung wird bei 37°C 1 Stunde inku
biert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250
(Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70% Ausgangsleistung und
Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15.000 UpM und 4°C 30
Min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (4,6 × 24 cm,
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit 200 ml
Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird bei 280
nm photometriert. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird von der Säule
mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym
wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 26 kDa. Frak
tionen mit diese Proteinbande werden gesammelt und gegen Puffer A über Nacht
dialysiert. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule aus Red Sepharose CL-6B
(2,6 × 10 cm, Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer A äquilibriert wurde. Nach
Durchgang durch die Säule wird das Enzym auf eine Source 15Q-Säule (Volumen, 20 ml;
Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Das Enzym wird eluiert mit einem
Gradienten aus 0-0,5 M Natriumchlorid in 250 ml Puffer A. Die Homogenität von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird durch SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pNCOygbPara werden kultiviert, in
duziert und geerntet wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Zellen (2 g) werden in 30 ml Puffer
A (50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM DTE, 0,02% Natriumazid) suspendiert in An
wesenheit von 12 mg Lysozym und 1,2 mg DNase I. Die Suspension wird bei 37°C
30 Min. inkubiert. Die Extraktion erfolgt durch Ultraschallbehandlung wie in Beispiel 4 be
schrieben. Zelltrümmer werden entfernt durch Zentrifugation bei 15.000 UpM für 30 Min.
Der zellfreie Extrakt wird auf eine Sepharose QFF Säule (2,6 × 10 cm) aufgebracht, wel
che äquilibriert wurde mit Puffer A bei einer Flussrate von 3 ml/min. Die Säule wird mit
Puffer A gewaschen. Das Eluat wird bei 280 nm photometriert. 4-Diphosphocytidyl-2C-me
thyl-D-erythritol-Synthase aus A. thaliana wird mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M
NaCl in Puffer A eluiert. Fraktionen, die das Enzym enthalten werden vereinigt. Das Volu
men der vereinigten Fraktionen wird durch Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA)
auf ca. 2 ml eingeengt. Die konzentrierte 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-
Synthase von A. thaliana wird auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule bei einer Flussrate
von 2 ml aufgebracht. Puffer A mit einem Gehalt von 100 mM NaCl dient als Laufpuffer.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Das Elutionsvolumen von 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol-Synthase von A. thaliana ist 140 ml. Die Homogenität von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase von A. thaliana wird durch SDS-Poly
acrylamidgelelektrophorese beurteilt.
Das Natriumsalz von D-Erythose-4-phosphat (14,6 mg, 65,7 µMol) wird in 600 µl 40%
(v/v) Methanol gelöst. Natriumborhydrid wird zugefügt. Der Reaktionsfortschritt wird über
prüft durch Aldehydnachweis nach der Methode von Stahl (Bollinger, H. R., Brenner, M.,
Gänshirt, H., Mangold, H.K., Seiler, H., Stahl, E. und Waldi, D. (1962) In: Dünnschicht-
Chromatographie; Ein Laboratoriumshandbuch (ed. Stahl, E.) Springer-Verlag, Berlin,
Göttingen, Heidelberg). Nach Verbrauch des Aldehyds wird der pH-Wert der Lösung mit
Essigsäure auf 4-5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird lyophilisiert, dabei wird D-
Erythritol-4-phosphat in fester Form erhalten.
1H-NMR (500 MHz, D2O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,20-3,55 (m, 1H), 3,60-3,67 (m, 2H), 3,68-3,71 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 1H), 3,88-3,92 (m, 1H).
1H-NMR (500 MHz, D2O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,20-3,55 (m, 1H), 3,60-3,67 (m, 2H), 3,68-3,71 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 1H), 3,88-3,92 (m, 1H).
Das Natriumsalz von D-Ribose-5-phosphat (18,5 mg, 67,5 µMol) wird in 600 µl 40% (v/v)
Methanol gelöst. Natriumborhydrid wird zugefügt. Der Reaktionsfortschritt wird durch Al
dehydnachweis nach der Methode von Stahl (Bollinger, H.R., Brenner, M., Gänshirt, H.,
Mangold, H.K., Seiler, H., Stahl, E. und Waldi, D. (1962) In: Dünnschicht-
Chromatographie; Ein Laboratoriumshandbuch (ed. Stahl, E.) Springer-Verlag, Berlin,
Göttingen, Heidelberg) ermittelt. Nach Verbrauch des Aldehyds wird der pH-Wert der
Lösung mit Essigsäure auf 4-5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird lyophilisiert und
liefert D-Ribitol-5-phosphat als Festsubstanz.
1H-NMR (500 MHz, D2O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,54 (dd, J = 11,9 Hz, J = 7,1 Hz, 1H), 3,63 (t, J = 3,3 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 11,9 Hz, J = 3,0 Hz, 1H), 3,73-3,76 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 2H), 3,93 (ddd, J = 2,9 Hz, J = 5,8 Hz, J = 8,6 Hz, 1H).
1H-NMR (500 MHz, D2O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,54 (dd, J = 11,9 Hz, J = 7,1 Hz, 1H), 3,63 (t, J = 3,3 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 11,9 Hz, J = 3,0 Hz, 1H), 3,73-3,76 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 2H), 3,93 (ddd, J = 2,9 Hz, J = 5,8 Hz, J = 8,6 Hz, 1H).
Rekombinante 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird bestimmt durch
einen spektralphotometrischen Test bei 340 nm. Dabei wird das anorganische Pyro
phosphat, welches aus der Reaktion von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und CTP ge
bildet wird verbraucht in einer Kaskade von Folgereaktionen, welche zur Reduktion von
NADP+ führen. Reaktionsmischungen enthielten 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 200 µM
2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 200 µM CTP, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 µM Glukose-
1,6-bisphosphat, 500 µM UDP-Glukose, 174 µM NADP+, 0,125 E UDP-
Glukosepyrophosphorylase, 0,16 E Phosphoglukomutase und 1 E Glukose-6-
phosphatdehydrogenase, verschiedene Konzentrationen von D-Erythritol-4-phosphat bzw.
D-Ribitol-5-phosphat entsprechend Tabelle 4 und 10 µl Enzym in einem Gesamtvolumen
von 1 ml. Eine Enzymeinheit ist definiert als die Enzymmenge, welche die Umwandlung
von 1 µMol Substrat pro Minute bei 37°C katalysiert. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 4.
Reaktionsmischungen mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 20 mM
Natriumfluorid, 10 mM MgCl2, 100 µM CTP, 10 nCi [2-14C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phos
phat, verschiedene Konzentrationen von D-Erythritol-4-phosphat bzw. D-Ribitol-5-phos
phat entsprechend Tabelle 4 und YgbP-Protein werden bei 37°C 20 Min. inkubiert. Die
Reaktion wird beendet durch Zugabe von 20 µl Methanol. Nach Zentrifugation werden
Aliquots auf Polygram Sil-NHR-Dünnschichtplatten (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
aufgetragen. Diese werden mit einer Mischung von n-Propanol/Ethylacetat/Wasser (6 : 1 : 3,
v/v) entwickelt. Radioaktivität wird mit einem Phosphor Imager (Storm 860, Molecular
Dynamics, USA) ermittelt. Der Rf-Wert des Produkts ist 0,36. Es werden ähnliche
Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 8.1.
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5
mM CTP, 5 mM 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, verschiedene Konzentrationen von D-
Erythritol-4-phosphat bzw. D-Ribitol-5-phosphat entsprechend Tabelle 4 und 0,1 mg YgbP-
Protein aus rekombinantem E. coli wird bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Der Reaktions
fortschritt wird durch 31P-NMR-Messung festgestellt. 31P-NMR-Spektren werden gemessen
mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz.
Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85% H3PO4. Das Pro
dukt zeigte zwei 31P NMR Dubletts bei -7,2 ppm und -7,8 ppm. Es wurden ähnliche Er
gebnisse erhalten wie in Beispiel 8.1.
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10
mM CTP, 0,12 µCi [2-14C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 46 mM 2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat und 225 µg YgbP Protein aus rekombinanten E.-coli-Zellen wird 1
Stunde bei 37°C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch 31P NMR-Messung verfolgt.
Das Produkt, welches zwei 31P NMR Dubletts bei -7,2 ppm und -7,8 ppm zeigt wird durch
HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm) mit einem
Eluenten aus 0,1 M Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1
ml/min getrennt. Das Eluat wird mit einem UV-Diodenarray Detektor (J TIDAS) und
einem Radiometer von Berthold analysiert. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol wird
bei 30 ml eluiert. Die Fraktion, welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol enthält
wird gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser
aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen.
1H NMR und 1H entkoppelte 13C NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem
AVANCE DRX 500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland. Die
Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz und 125,6 MHz für 1H bzw. 13C. Die chemischen
Verschiebungen werden auf externes Trimethylsilylpropansulfonat referenziert.
Zweidimensionale Korrelationsexperimente (gradient enhanced double quantum filtered
COSY, HMQC) werden mit XWINNMR-Software von Bruker ausgeführt. 31P NMR-
Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer
Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert
auf externe 85% H3PO4.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale NMR-
Spektroskopie (Tabelle 5). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert durch zwei
31P NMR-Signale bei -7,2 ppm und -7,8 ppm (Dubletts mit 31P-31P Kopplungskonstanten
von jeweils 20 Hz). Ein 31P NMR-Signal für das Substrat 2C-Methyl-D-erythritol-4-
phosphat (Singulett bei 4,9 ppm) fehlt. Der beobachtete Bereich der 31P NMR-
Verschiebung ebenso wie die 31P-31P-Kopplung besagt, dass die unbekannte Verbindung
ein Pyrophosphat ist. Zum Vergleich werden die 31P NMR-Signale von Cytidindiphosphat
(CDP) als Dubletts bei -5,1 ppm und -7,6 ppm mit Kopplungskonstanten von jeweils 21,5
Hz (2JPP) bestimmt.
Die Anwesenheit von Phosphoratomen in der unbekannten Verbindung zeigt sich auch im
13C Spektrum, wo vier von 14 Signalen Kopplung mit 31P zeigten (31P-13C Kopplungs
konstanten im Bereich von 9 Hz bis 5 Hz).
Die 1H und 13C NMR-Signale werden weiterhin analysiert durch zweidimensionale COSY
und HMQC Experimente. Während die beobachteten chemischen Verschiebungen ver
schieden sind von CDP und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat stimmen die
Korrelationsmuster im homonuklearen 1H-1H COSY und im heteronuklearen 1H-13C
HMQC-Experiment exakt überein mit den Korrelationssignaturen von CDP (entsprechend
den Spinsystemen der Ribosyleinheit und der Cytosineinheit) und von 2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat. Dieses Resultat erweist die Struktur des Produkts als das
Diphosphocytidyladdukt von 2C-Methyl-D-erythritol.
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird nach einer von Meade et
al., (Meade, H.M., Long, S.R., Ruvkun, C.B., Brown, S.E., und Auswald, F.M. (1982).
Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium
meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122) beschriebenen
Methode isoliert.
Der offene Leserahmen ychB aus E. coli (Accession Nr. gb AE000219) wird von bp Posi
tion 5720 bis 6571 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli
DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
GAGGAGAAATTAACCATGCGGACACAGTGGCC-3', 25 pMol des Primers 5'-
GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt
volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 25 PCR Zyklen durchgeführt
mit 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation
bei 72°C für 7 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Aga
rosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von
Qiagen gereinigt. Es werden 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts erhalten.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die
Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG-3', 25 pMol des Primers 5'-
GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 2 µl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Ge
samtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 45
Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20
Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegel
elektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter
Beispiel 1 beschrieben.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut
um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur
enthält 6 µl NEB3 Puffer, 6 µg BSA, 30 E EcoRI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem
Gesamtvolumen von 60 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert.
Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit
von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 18 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Li
gase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei
wird das Plasmid pNCOychB gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C
inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue
Zellen transformiert und 100 µl der Zell/DNA-Suspension wird auf LB-Platten, die 150 mg/l
Ampicillin zur Erhaltung des Plasmids pNCOychB enthalten, ausplattiert. Das Plasmid
pNCOychB wird wie vorher beschrieben isoliert. 9 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOychB wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben
und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000219).
Arabidopsis cDNA wird wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
Die resultierende cDNA (1 µl der Mischung) wird für die Amplifikation von ychB mittels
PCR verwendet.
Der Expressions-Vektor pNCO113 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Der A.
thaliana ORF ychB ohne die codierende Region für die vermutete Präsequenz wird durch
PCR amplifiziert unter Benutzung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die
Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
CTGATGAGAGGCTTAATAAGATAGG-3', 25 pMol des Primers 5'-
TTACATGTTTGTAACATCTCATTGG-3', 1 µg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase
(Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl
mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und
0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 40 PCR Zyklen durchgeführt
mit 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation
bei 72°C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit
von Qiagen wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt. Es werden 2,1 µg des gereinigten
PCR-Produkts erhalten.
Das PCR-Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die
Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-GTTGACACCATGGCTCCTTTGTCC-
3', 25 pMol des Primers 5'-TGTTTGTCTGCAGCTCATTGGAAATCC-3', 2 µl der ersten
PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol
dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM
KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 45
Sek, bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20
Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegel
elektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter
Beispiel 2 beschrieben. 2,4 µg des gereinigten PCR-Produkts werden erhalten. 2,0 µg des
Vektors pNCO113 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 2,5 µg des gereinigten PCR-
Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren.
Jede Restriktionsmixtur enthält 6 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 30 E
NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 µl. Die Mischungen werden
3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt
mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 23 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Li
gase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei
wird das Plasmid pNCOychBara gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C
inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue
Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das Plasmid pNCOychBara wird wie vorher
beschrieben isoliert. 6 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOychBara wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben. Das entsprechende Protein ist identisch mit der berechneten
Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb
AE005168) wie gezeigt in Annex Ea.
Die cDNA von A. thaliana wird wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
Die resultierende cDNA (1 µl der Mischung) wird für die Amplifikation von ychB mittels
PCR verwendet.
Der Expressions-Vektor pQE30 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Der komplette
A. thaliana ORF ychB (Accessions-Nr. gb AC005168) von Basenpaar- (bp) Position 82996
bis 85396 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von cDNA aus A. thaliana als
Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
GGTGACATATCAGATCAAAGAG-3', 25 pMol des Primers 5'-
TTACATGTTTGTAACATCTCATTGG-3', 1 µg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase
(Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl
mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und
0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Dann werden 40 PCR Zyklen durchgeführt
mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation
bei 72°C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit
von Qiagen wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt. Es werden 1,9 µg des gereinigten
PCR-Produkts erhalten.
Das PCR-Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die
Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-
AGAAACAGGATCCATGGCAACGGCTTCTCCTCCTCC-3', 25 pMol des Primers 5'-
ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG, 2 µl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Ge
samtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 60
Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 90 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20
Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der Agarosegel
elektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter
Beispiel 2 beschrieben. 1,4 µg des gereinigten PCR-Produkts werden erhalten. 2,0 µg des
Vektors pNCO113 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 1,4 µg des gereinigten PCR-
Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren.
Jede Restriktionsmixtur enthält 6 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 30 E
BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 µl. Die Mischungen
werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden
gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 12 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Li
gase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl. Dabei
wird das Plasmid pNCOychBara gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C
inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue
Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das Plasmid pQEychBarakom wird wie vorher
beschrieben isoliert.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEychBarakom wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben. Die DNA- und die zugehörige Aminosäuresequenz des kompletten ychB-
Gens aus A. thaliana sind in Annex Eb gezeigt.
Eine cDNA-Bibliothek von Tomaten-Blättern wird wie von Schmid J. et al. 1992 (Schmid
J., Schauer A., Leininger U., Boll W. and Amrhein N. (1992). The in-vitro synthesizes
tomato shikimate kinase precursur is enzymaticalle actiye and is imported and processed
to the mature enzyme by chloroplasts. The Plant Journal 2(3), 375-383) beschrieben
hergestellt.
Um den Codongebrauch für Hochexpression in E. coli zu adaptieren wird ein
synthetisches Gen, welches für das mutmaßliche Tomaten-YchB-Protein (Accessions-Nr.
gb U62773, bp-Position 78 bis 1283), in 8 aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen unter
Benutzung der cDNA-Bibliothek aus Tomate als Matrize hergestellt. Die Oligonukleotide
und die resultierende DNA-Sequenz dieses Gens sind in Annex Ec gezeigt.
Ein Teil des L. esculentum ORF ychB wird mittels PCR unter Verwendung von cDNA aus
L. esculentum (aus Blättern) als Matrize verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25
pMol des Primers TM-YCHB-A 5'-GGTACAGACAATTACTTTTGGATTCATC-3', 25 pMol
des Primers TM-YCHB-B 5'-AAGAGATGGAAGAACTTCAAAGGCAGGAGG-3', 1 µl der
cDNA-Bibliothek, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach,
Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl,
10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8
enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72
°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 447 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 1 wird als Matrize für eine zweite PCR verwendet.
Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-1 5'-
CTGATTATCAAAGCCCTCAATCTTTATCGTAAAAAGACCGGTACAGACAATTACTTTTG
GATTCATC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-2 5'-
GACCGCGGCCAGCAGCAATTACACGTTGTTTTAAACGTTTAAGAGATGGAAGAACTT
CAAAGCAGGAGG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von
Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der
dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM
MgSO4, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min, bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 525 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 2 wird als Matrize für eine 3. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-3 5'-
ACTAATGTTGCTGGCGTTCCACTCGATGAGCGTAATCTGATTATCAAAGCCCTCAATC
TTTATCG-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-4 5'-
TGTGCTGCCACTACCAGACATGAAGACTGCATCATATTGACCGCGGCCAGCAGCAAT
TACACG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der zweiten PCR, 1 E von Vent-DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in
einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1%
Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72
°C wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 599 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 3 wird als Matrize für eine 4. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-5 5'-
AAAATTAAGTTCTCGCTGTCACCATCGAAATCAAAGGATCGTTTATCTACTAATGTTG
CTGGCGTTCCACTC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-6 5'-
CATAGACAAATTGTGGCGATCTGGAGAGCCAACACCTACGATTGTGCTGCCACTACC
AGACATGAGG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der dritten PCR, 1 E von Vent-
DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's
in einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4,
0,1% Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 690 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 4 wird als Matrize für eine 5. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-7 5'-
GACGGTTATCATGATCTGGCGTCTCTCTTTCATGTAATTAGTCTTGGCGATAAAATTA
AGTTCTCGCTGTCACC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-8 5'-
TGCTTCTGACAAGAAGACATCTTTGTACTCTTCGTCATCATAGACAAATTGTGGCGGA
TCTGG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der vierten PCR, 1 E von Vent-DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in
einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1%
Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 779 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 5 wird als Matrize für eine 6. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-9 5'-
TTTTCTCCTTGCAAGATTAATGTTTTCCTGCGCATCACAAGCAAACGTGATGACGGTT
ATCATGATCTGGCGTCTC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-10 5'-
CAACATACCACTCGTTGGCTGGACGAGTGATGAAACTTGCTTCTGACAAGAAGACAT
CTTTG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der fünften PCR, 1 E von Vent-DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in
einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1%
Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 876 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 6 wird als Matrize für eine 7. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-11 5'-
CGTGAAGCTGGTCTTTCACGCCTCACTCTTTTTTCTCCTTGCAAGATTAATGTTTTCCT
G-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-12 5'-
CAGGTTGATCACCAATAGTGCTACCTGAAACAGGTTCAACATACCACTCGTTGGCTG
GACG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der sechsten PCR, 1 E von Vent-DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in
einem Gesamtvolumen von 100 µl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1%
Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek. bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Die gesamte Mischung wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 933 bp wird aus dem Gel
ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 7 wird als Matrize für eine 8. PCR verwendet. Die
Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-13 5'-
ATAATAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGATCGTGAAGCTGGTCTTTCAC
GCCTC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-14 5'-
TATTATTATAAGCTTAAGACATGTCAAAAGATGTAGAGAACTCAGGTTGATCACCAAT
AGTGCTACC-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der siebten PCR, 0,5 E von
Goldstar-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien), 20 mMol der dNTP's in einem
Gesamtvolumen von 100 µl, die 1,5 mM MgCl2, 75 mM Tris-Hydrochlorid, pH 9,0, 20 mM
(NH4)2SO4 und 0,01% (G/V) Tween 20 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei
95°C, 30 Sek, bei 48°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 7 Min. bei 72°C
wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird einer 2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 1015 bp wird mit dem
PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
2 µg des Vektors pNCO-SB-H6-ACYC184 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 2 µg
des gereinigten PCR-Produktes aus Stufe 8 werden verdaut, um DNA-Fragment mit
überlappenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmischung enthält 10 µl von OPA-
Puffer (10 ×; 500 mM Kaliumacetat; 100 mM Magnesiumacetat; 100 mM Tris-Acetat, pH
7,5) von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) und 50 E HindIII
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) in einem Gesamtvolumen von
100 µl und wird 3 h bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation werden 18 µl OPA-Puffer und 50 E
NcoI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) zu einem Gesamtvolumen
von 140 µl hinzugefügt. Die resultierende Mischung wird für weitere 3 h inkubiert.
Verdaute Vektor-DNA und PCR-Produkte werden mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen
wie oben beschrieben gereinigt.
20 ng präparierte Vektor-DNA und 25 ng PCR-Produkte werden zusammen ligiert mit 1 E
T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 4 µl T4-Ligase-Puffer (5 ×; 250 mM
Tris/HCl, pH 7,6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% (GN) Polyethylenglykol-
8000) in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid
pNCO-HIS6-TM-YCHB. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
Kompetente E. coli XL1-Blue (Stratagene, LaJolla, CA, USA) werden mit der
Ligationsmischung transformiert. Kompetente Zellen werden nach einer Methode von
Hanahan D. (Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with
plasmids. J. Mol. Biol., 166(4), 557-80).
Das Plasmid wird wie oben beschrieben isoliert. 5 µg DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmids pNCO-HIS6-TM-YCHB wird wie in Beispiel 1 beschrieben
mit folgenden Oligonukleotiden als Primer sequenziert: TM-YCHB-A 5'-
GGTACAGACAATTACTTTTGGATTCATC-3', TM-YCHB-B 5'-
AAGAGATGGAAGAACTTCAAAGGCAGGCAGGAGG-3', PNCO-T5 5'-
GAGCGGATAACAATTATAATAGATTC-3' und mRNA5 5'-
CTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG-3'. Die zugehörige Proteinsequenz ist identisch
zur berechneten Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz in der Datenbank (gb
Accessions-Nr. U62773).
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft
mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid
pNCOychB enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37°C bebrütet. Bei einer opti
schen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für
weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000 UpM,
4°C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentri
fugiert wie oben beschrieben und bei -20°C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt
von 1 mM Dithioerythritol und 0,02% Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg
Lysozym pro ml und 10 µg DNasel pro ml. Die Mischung wird bei 37°C 1 Stunde inku
biert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250
(Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70% Ausgangsleistung und
Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15.000 UpM und 4°C 30
Min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (Säulenvolumen
30 ml, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit
150 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird
bei 280 nm photometriert. YchB-Protein wird von der Säule mit einem Gradienten von
0-0,5 M Natriumchlorid in 150 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 30 kDa. Fraktionen mit dieser
Proteinbande werden gesammelt und es wird Ammoniumsulfat bis zu einer
Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule
aus Phenyl-Sepharose 6FF (Säulenvolumen 16 ml, Amersham Pharmacia Biotech), die
mit Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthält, äquilibriert wurde. Dann wird das YchB-
Protein mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M Ammoniumsulfat in 100 ml Puffer A
eluiert. Fraktionen, die das Protein enthalten werden vereinigt und auf 3 ml
aufkonzentriert. Dann wird das Enzym weiter gereinigt auf einer Superdex 75 HR 26160,
die mit Puffer A und 100 mM Natriumchlorid äquilibriert wurde. Das YchB-Protein eluiert
bei 165 ml. Die Homogenität von YchB-Protein wird durch SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft
mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCO-
HIS6-TM-YCHB enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37°C bebrütet. Bei einer
optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird
für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000
UpM, 4°C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen,
zentrifugiert wie oben beschrieben und bei -20°C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M
Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 µg/ml
DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 ×
10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury,
USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4
eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4°C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der
zellfreie Extrakt des rekombinanten YchB-Proteins von Tomate wird aufgetragen auf eine
Säule aus Ni2+-chelatierender Sepharose FF (Größe 2,6 × 6 cm, Amersham Pharmacia
Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule
wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. YchB-Protein wird mit einem linearen
Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YchB-Protein enthaltende
Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM Dithioerythritol, 0,02% Natriumazid über Nacht dialysiert. Das
dialysierte YchB-Protein wird auf eine Mono Q HR 5/5 Säule (Amersham Pharmacia
Biotech) aufgetragen. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M
Natriumchlorid in 60 ml Standardpuffer entwickelt. Die Homogenität des YchB-Proteins
wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 43 kDa ist
sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 3 mg
reines Enzym werden erhalten.
Reaktionsmischungen mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 100 µM
ATP, 10 mM MgCl2, 20 mM Natriumfluorid, 10 nCi [214C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol und YchB Protein werden bei 37°C 30 Min. inkubiert. Nach Zentrifugation
werden Aliquots auf Sil-NHR Dünnschichtplatten aufgetragen, die mit einer Mischung von
n-Propanol/Ethylacetat/Wasser (6 : 1 : 3, v/v) entwickelt werden. Das Radiochromatogramm
wird mit einem Phosphor Imager (Storm 860, Molecular Dynamics, USA) ermittelt. Der Rf-
Wert des Produkts ist 0,25. Diese Screening-Methode kann in der An- oder Abwesenheit
von Inhibitorkandidaten durchgeführt werden.
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5
mM ATP, 5 mM [2,2-Me-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 0,1 mg YchB
Protein aus rekombinantem E. coli wird bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Der Reaktions
fortschritt wird durch 13C-NMR-Messung festgestellt. 13C-NMR-Spektren werden
gemessen mit einem DRX 500 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz
von 125,6 MHz. Das Produkt zeigte zwei intensive Doppel-Dubletts bei 81,91 ppm und
16,86 ppm (bezogen auf externes Trimethyl-silylpropansulfat) mit Kopplungskonstanten
von 38,9 und 7,4 Hz, beziehungsweise 38,9 und 1,9 Hz.
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM [2-14C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol,
5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 100 µg gereinigtes YchB Protein und 100 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
Der Reaktionsverlauf wird durch 31P NMR-Messung verfolgt. Dann wird die Probe durch
eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland) zentrifugiert. Das
Produkt zeigt 31P NMR Signale bei 0,49, -7,28 und -8,0 ppm (bezogen auf externe 85%
Phosphorsäure) und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB
(4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) äquilibriert mit 0,1 M
Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1 ml/min, gereinigt. Das
HPLC-System ist mit einer Wellchrom HPLC Pumpe K1001, einem Wellchrom Spectro-
Photometer K-2600 (Knauer, Berlin, Deutschland) und einem Radiomonitor (Berthold,
Wildbad, Deutschland) ausgestattet. Nach Injektion der Probe wird die Säule mit 30 ml 0,1
M Ammoniumformiat in 40% Methanol gewaschen. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol-2-phosphat wird durch einen linearen Gradienten von 0,1 M Ammoniumformiat in
40% (v/v) Methanol auf 1 M Ammoniumformiat in 0% (v/v) Methanol eluiert. Fraktionen,
welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat enthalten werden
gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser
aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration an 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat ist 21 mM.
Die Strukturaufklärung wurde mit [2,2-Me-13C2]-, [1,3,4-13C1]- und [1,2,2-Me,3,4-13C5]4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (Tabelle 6) durchgeführt.
1H entkoppelte 31P NMR-Spektren des Enzymprodukts aus [2,2-Me-13C2] 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol zeigen zwei Dubletts bei -7,28 bzw. -8,00 ppm
(31P-31P-Kopplungskonstante, 20,8 Hz) und ein Doppeldublett bei 0,49 ppm (31P-31P-
Kopplungskonstanten, 7,6 Hz und 1,7 Hz). Ohne 1H Entkopplung sind die 31P NMR-
Signale bei -7,28 und -8,00 ppm verbreitert, während das Signal bei 0,49 ppm nicht von
1H-Kopplung betroffen ist. Die chemischen Verschiebungen und das beobachtete
Kopplungsmuster weisen auf einen Pyrophosphat-Rest und einen Monophosphat-Rest an
Position 2 der 2C-Methyl-erythritol-Gruppe hin. Genauer, ist skalare Kopplung zwischen
31P und 1H zu erwarten im Falle eines Phosphat-Restes an Position 1 oder 3. Andererseits
wird keine 31P-Kopplung erwartet, falls sich ein Phosphat-Rest an Position 2 befindet.
Außerdem ist die beobachtete skalare Kopplung zwischen 13C-2-Methyl und dem 31P-
Atom der Phosphatgruppe nur mit Position 2 vereinbar.
Das 31P-13C Kopplungsmuster wurde weiterhin mit einer Probe die aus [1,3,4-13C1]4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol erhalten wurde, analysiert (Tabelle 6). Die 13C
und 1H NMR-Signale wurden zugeordnet durch HMQC, HMQC-TOCSY, und
INADEQUATE-Experimente, wobei die Probe die aus [1,2,2-Me,3,4-13C5]4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol erhalten wurde, verwendet wurde. Mit diesen
Zuordnungen konnte die Struktur von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-
phosphat aufgeklärt werden.
Der offene Leserahmen ygbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp
Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler
E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1-
Blue wird isoliert entsprechend einer Methode von Meade et al., 1982. (Meade, H.
M., Long, S. R., Ruvkun, C.B., Brown, S.E., und Auswald, F.M. (1982). Physical
and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium
meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122).
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers
GAGGAGAAATTAACCATGCGAATTGGACACGGTTTTG, 10 pMol des Primers
TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E
Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem
Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM
Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen
durchgeführt mit 30 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach
weiterer Inkubation bei 72°C für 7 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein
Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR Amplifikat
wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung
enthielt 50 pMol des Primers ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG,
50 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 2,5 µl der
ersten PCR-Reaktion, 10 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien)
und 100 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 500 µl mit einem Gehalt von
1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-
100. Die Mischung wird in 5 PCR-Röhrchen portioniert.
Die Mischungen werden 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen mit
30 Sek, bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach weiterer
Inkubation für 7 Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl
wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie
unter Beispiel 1 beschrieben.
4,5 µg des Vektors pNCO113 (isoliert wie unter Beispiel 1 beschrieben) und 3,4 µg
des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit
überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 20 µl NEB3
Puffer von New England Biolabs (NEB), 100 E EcoRI (NEB), 100 E PstI (NEB) in
einem Gesamtvolumen von 200 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkte werden gereinigt mit dem PCR-
Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
100 ng Vektor-DNA und 35 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E
T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von
10 µl. Dabei wird das Plasmid pNCOygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2
Stunden bei 25°C inkubiert. 1 µl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E.
coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die
elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Der zellfreie Extrakt von YgbB-Protein aus E. coli wird in der gleichen Weise
hergestellt wie unter Beispiel 4 beschrieben. Der Überstand wird aufgebracht auf
eine Säule aus Sepharose Q FF (Säulenvolumen, 30 ml; Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland), welche vorher mit 120 ml Puffer A äquilibriert
wurde. Die Säule wird mit 90 ml Puffer A gewaschen. Das YgbB-Protein eluiert mit
einem linearen Gradient von 0-0,5 M NaCl in 150 ml Puffer A. Die Homogenität von
YgbB-Protein wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Die YgbB-Enzymaktivität wird mit einer radiochemischen Methode bestimmt.
Reaktionsmischungen enthielten 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MnCl2,
14 nCi [2-14C]-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 2 µg YgbB-Protein aus
rekombinanten E. coli Zellen. Die Mischungen werden 30 Min. bei 37°C inkubiert.
Nach Zentrifugation werden Aliquots auf Sil-NHR-Dünnschichtplatten aufgetragen,
die mit einer Mischung von n-Propanol/Ethylacetat/H2O (6 : 1 : 3, v/v) entwickelt
werden. Das Radiochromatogramm wird mit einem Phosphorimager (Storm 860,
Molecular Dynamics, USA) detektiert und ausgewertet. Der Rf-Wert von YgbB-
Produkt ist 0,5. Die Messmethode kann ausgeführt werden in Anwesenheit oder
Abwesenheit von möglichen Inhibitoren.
Der offene Leserahmen ygbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp
Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler
E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1-
Blue wird isoliert entsprechend Beispiel 2.
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers
GAGAAGGATCCATGCGAATTGGACACGGTTTTGGACG, 10 pMol des Primers
TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E
Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem
Gesamtvolumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM
Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 5 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen
durchgeführt mit 30 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 45 Sek. bei 72°C. Nach
weiterer Inkubation bei 72°C für 7 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein
Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie in Beispiel 1
beschrieben gereinigt.
1,0 µg des Vektors pQE30, isoliert wie unter Beispiel 1 beschrieben und 0,5 µg des
gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden
Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 10 µl NEB3 Puffer von New
England Biolabs (NEB), 100 E BamHI (NEB), 100 E PstI (NEB) in einem
Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert.
Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkte werden gereinigt mit dem PCR-
Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
5 fMol Vektor-DNA und 14 fMol des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E
T4-Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10
µl. Dabei wird das Plasmid pQEygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2 Stunden
bei 25°C inkubiert. 1 µl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E. coli
XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 2 beschrieben. Die
elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben. Das
Plasmid pQEygbB wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. 12 µg Plasmid-DNA
werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEygbB wird sequenziert wie in Beispiel 2
beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb
AE000358). Das 5'-Ende des DIA-Inserts trägt die codierende Region für 6
Histidinreste.
Der Expressionsvektor pQE30 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben.
Eine cDNA-Bibliothek von P. falciparum (Stamm HB3) wird mit dem Superscript-
Plasmid-System für cDNA-Synthese und Plasmid-Klonierung von Gibco hergestellt.
Der komplette P. falciparum ORF ygbB (Accession Nr. gb AE001394) wird von
Basenpaar (bp) Position 2617 bis 3495 durch PCR amplifiziert unter Verwendung
von cDNA aus P. falciparum als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des
Primers 5'-TCCATATGGATCCATGTTTTTAAAAGGATACACC-3', 25 pMol des
Primers 5'-GACCTGCCTGCAGTTATGAATTTTTAGGTATTAAC-3', 1 µg cDNA, 2 E
Taq-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5
mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-
100 in einem Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mixtur wird 3 Min, bei 95°C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen von 45 Sek.
bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20
Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem
PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 2,2 µg
gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
2,0 µg des Vektors pQE30 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut
um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede
Restriktionsmixtur enthielt 7 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E
BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen
werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute
PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E
T4-Ligase (Gibco) und 2 µl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10
µl. Dabei wird das Plasmid pQEygbBPlaskom erhalten. Die Ligationsmixtur wird über
Nacht bei 4°C inkubiert. 2 µl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli
XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten
Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbBPlaskom wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben und ist identisch zur berechneten cDNA-Sequenz des
Datenbankeintrags (gb AE001394). Die cDNA-Sequenz und die zugehörige
Aminosäuresequenz des ygbB-Gens von P. falciparum ist in Annex G gezeigt.
Eine N-terminal abgeschnittener ygbB-Expressionsklons des P. falciparum ORF
ygbB wird konstruiert, der die codierende Region der mutmaßlichen Leadersequenz
nicht enthält. Die PCR-Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers 5'-
TTATTTGGATCCATGGGTATAAGAATAGGTCAAGG-3', 25 pMol des Primers 5'-
GACCTGCCTGCAGTTATGAATTTTTAGGTATTAAC-3', 1 µg cDNA, 2 E Taq-DNA-
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl2,
50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100 in einem
Gesamtvolumen von 100 µl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95°C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen von 45 Sek.
bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 60 Sek. bei 72°C. Nach weiterer Inkubation für 20
Min. bei 72°C wird die Mixtur auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot von 2 µl wird der
Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem
PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 3,0 µg
gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
2,0 µg des Vektors pQE30 und 1,5 µg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut
um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede
Restriktionsmixtur enthielt 7 µl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E
BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen
werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute
PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E
T4-Ligase (Gibco) und 2 µl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10
µl. Dabei wird das Plasmid pQEygbBPlas erhalten. Die Ligationsmixtur wird über
Nacht bei 4°C inkubiert. 2 µl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli
XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten
Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbBPlas wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben.
Rekombinante E. coli XL1-Blue Zellen, die überexprimiertes YgbB von E. coli (N-
terminal His-beladen) enthalten, werden hergestellt, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und
0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100
µg/ml DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert, auf Eis
gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power
Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und
Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4°C und
15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt des rekombinanten YgbB-Proteins von
E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+-chelatierender Sepharose FF
(Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM
Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml
Standardpuffer gewaschen. YgbB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von
20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YgbB-Protein enthaltende Fraktionen
werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid,
pH 8,0 über Nacht dialysiert. Das dialysierte YgbB-Protein wird mittels Ultrafiltration
(MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60
Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität des YgbB-
Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 17
kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse
ist. 27 mg reines Enzym werden erhalten.
Rekombinante Zellen des Stammes XL1-pQEygbBPlas mit überexprimiertem YgbB-
Protein aus P. falciparum werden hergestellt wie Beispiel 13 beschrieben.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und
0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100
µg/ml DNasel aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert, auf Eis
gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power
Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und
Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4°C und
15.000 UpM zentrifugiert. Der zelifreie Extrakt des rekombinanten YgbB-Proteins
wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+-chelatierender Sepharose FF
(Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM
Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml
Standardpuffer gewaschen. YgbB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von
20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YgbB-Protein enthaltende Fraktionen
werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid,
pH 8,0 über Nacht dialysiert. Das dialysierte YgbB-Protein wird mittels Ultrafiltration
(MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60
Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität des YgbB-
Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 22
kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse
ist. 22 mg reines Enzym werden erhalten.
Eine Lösung von 500 µl, die 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MnCl2, 0,12 µCi [2-
14C]-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 46 mM 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol und 225 µg YgbB-Protein von rekombinantem E. coli enthalten
wird bei 37°C für 1 Std. inkubiert. Die Reaktion wird mittel 31P NMR verfolgt. Das
Produkt, welches ein 31P NMR-Signal bei +21,7 ppm zeigt, wird mittels auf einer Säule
des Anionenaustauschers Nukleosil 10SB (4,6 × 260 mm) mittels HPLC gereinigt,
indem 50 mM Ammoniumformiat in 40% (v/v) als Laufmittel bei einer Flussrate von
1 ml/Min. benutzt wird. Der Durchfluss wird mittels eines Radiomonitors von Berthold
analysiert. 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat wird nach 10 ml eluiert. Die
Fraktion, die 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat enthält, wird aufgefangen und
lyophylisiert (2,6 mg). Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser gelöst und
der NMR-Analyse unterworfen.
1H NMR- und 1H entkoppelte 13C NMR-Spektren werden mit einem ADVANCE DRX
500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland aufgenommen. Die
Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz für 1H und entsprechend 125,6 MHz für 13C.
Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externes
Trimethylsilylpropansulfonat. Zweidimensionale Korrelationsexperimente (gradient
enhanced double quantum filtered COSY, HMQC) werden mit XWINNMR Software
von Bruker ausgeführt. 31P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250
Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die
chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85% H3PO4.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale
NMR-Spektroskopie (Tabelle 7). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert
durch ein einzelnes 31P NMR-Signal bei +21,7 ppm. Der ermittelte 31P NMR
chemische Verschiebungsbereich impliziert, dass die unbekannte Verbindung ein
fünfzyklisches Monophosphat ist.
Die Gegenwart eines Phosphoratoms in der unbekannten Verbindung wird weiter
reflektiert in dem 13C NMR-Spektrum, in dem drei der fünf Signale Kopplungen mit
31P zeigen (31P-13C-Kopplungskonstanten im Bereich zwischen 6 Hz und 1 Hz).
Im Einzelnen ist das 13C NMR-Signal des C2 ein Dublett mit einer 31P-13C
Kopplungskonstante von 6,5 Hz, welche typisch für eine 3JPC Kopplungskonstante
ist. Die 31P-13C Kopplungen für C3 und C4 sind kleiner (1,7 entsprechend 1,1 Hz),
welche 2JPC Kopplungen widerspiegeln. Somit impliziert die 31P-13C
Kopplungssignatur eine 3,4-Cyclophosphatstruktur.
Eine Lösung, die 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MnCl2, 5 mM 4-Diphosphocytidyl-
2C-methyl-D-erythritol und 0,1 mg YgbB-Protein aus rekombinanten E. coli Zellen
enthält, wird bei 37°C 1 Std. inkubiert. Die Reaktion wird mittels 31P NMR verfolgt.
31P NMR-Spektren werden mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer
Transmitterfrequenz von 101,3 MHz aufgenommen. Die chemischen
Verschiebungen werden referenziert auf externe 85% H3PO4. Die
Screeningmethode kann in Gegenwart und Abwesenheit von möglichen Inhibitoren
durch Messung der verbleibenden Menge an Ausgangsmaterial und Vergleich der
Ergebnisse.
Das Produkt zeigte ein 31P Singulett bei +21,7 ppm. Die Enzymaktivität kann deshalb
auch durch Messung dieses Signals für die Bestimmung der Produktmenge
bestimmt werden.
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM [2-14C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol (0,02 µCi/mMol), 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 100 µg gereinigtes
YchB Protein, 200 µg gereinigtes YgbB Protein und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH
8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Der
Reaktionsverlauf wird durch 13C- und 31P-NMR-Messung verfolgt. Dann wird die
Probe durch eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland)
zentrifugiert. Das Produkt zeigt zwei 31P NMR Signale bei -7,65 und -11,66 ppm
(Dubletts, 31P-31P-Kopplungskonstante 23,6 Hz) und zwei intensive 13C-NMR-Signale
bei 83,87 ppm und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil
10SB (4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) mit 0,1 M
Ammoniumformiat in 40% (v/v) Methanol als Eluent bei einer Flussrate von 1
ml/min, gereinigt. 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat eluiert bei 34 ml.
Fraktionen, welche 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat enthalten werden
gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser
aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration 2C-Methyl-D-
erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist 18 mM.
Die Strukturaufklärung wurde mit [2,2-Me-13C2]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-
cyclopyrophosphat (Tabelle 8) durchgeführt.
1H NMR- und 1H entkoppelte 13C NMR-Spektren werden mit einem ADVANCE DRX
500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland aufgenommen. Die
Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz für 1H und entsprechend 125,6 MHz für 13C.
Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externes
Trimethylsilylpropansulfonat. 31P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem
AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die
chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85% H3PO4.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale
NMR-Spektroskopie (Tabelle 8). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert
durch ein zwei 1H-entkoppelte 31P-NMR-Signale bei -7,65 ppm (Dublett mit 31P-31P-
Kopplungskonstante von 23,6 Hz) und -11,66 ppm (Doppel-Dublett mit 31P-31P-
Kopplungskonstante von 23,6 Hz und 31P-13C-Kopplungskonstante von 8,5 Hz). Das
31P-NMR-Signal bei -7,65 ppm ist ohne 1H-Entkopplung verbreitert. Der ermittelte 31P
NMR chemische Verschiebungsbereich und die 31P-31P-Kopplung implizieren, dass
die unbekannte Verbindung ein Pyrophosphat ist. Zusätzlich zeigt die gemessene
31P-13C-Kopplung des Signals bei -11,66 ppm in Verbindung mit der fehlenden 31P-
1H-Kopplung an, dass ein Phosphatrest mit C-2 des 2C-Methyl-D-erythritols
verknüpft ist. In Übereinstimmung mit diesem Schluß werden 13C-31P-Kopplungen für
die 13C-Signale von C-2 und C-2-Methyl beobachtet.
In Verbindung mit den beobachteten 13C-13C-Kopplungen (Tabelle 8), sind diese
Daten die Basis für die 1H und 13C-NMR-Signal-Zuordnung. Das 13C-Signal bei 65,72
ppm (entspricht C-4) zeigte 13C-31P-Kopplung, was darauf hinwies, daß das
Pyrophosphat auch mit C-4 verbunden ist. Die 13C-NMR-Zuordnung wird weiter
durch zweidimensionale INADEQUATE Experimente überprüft, die die 13C-13C-
Verknüpfungen zeigen.
Zusammenfassend zeigten die 1H-, 13C- und 31P-NMR-Daten klar, daß es sich bei
dem Produkt um 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat handelt. Die NMR-
Daten stimmten gut mit den beschriebenen Daten dieser Verbindung überein
(Ostrovsky, D., Kharatian, E., Dubrovsky, T., Ogrel, O., Shipanova, 1 und Sibeldina,
L. (1992). The ability of bacteria to synthesize a new cyclopyrophosphate correlates
with their tolerance to redox-cycling drugs: on a crossroad of chemotherapy,
enviromental toxicology and immunobiochemical problems. Biofactors 4 (1), 63-68;
1992; Turner, D.L., Santos, H., Fareleira, P., Pacheco, I., LeGall, J., und Xavier, A.
V. (1992). Structure determination of a novel cyclic phosphocompound isolated from
Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. J. 285, 381-390.)
Der Expressionsvektor pNCO113 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Chromosomale DNA aus dem Bacillus subtilis Stamm BR151 (Williams, D.
M.,Duvall, E. J., und Lovett, P. S. (1981) Cloning restriction fragments that promote
expression of a gene in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 146 (3), 1162-1165) wird isoliert
entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Methode.
Der mutmassliche ORF yqiE codierend für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase
von Bacillus subtilis (Accession Nr. dbj D84432) wird von bp Position 193991 bis
195892 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler Bacillus subtilis
DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers
TGATCCGCCATGGATCTTTTATCAATACAGG, 25 pMol des Primers
TTGAATAGAGGATCCGCGCC, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt
volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl; 10 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen
durchgeführt mit 60 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 50°C und 120 Sek. bei 72°C. Nach
weiterer Inkubation bei 72°C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein
Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat
wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 µl Puffer PB (Qiagen)
werden zu 98 µl der PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule
aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen.
0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule geladen und wie vorher zentrifugiert.
Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut 1 Min. bei 14.000 UpM
zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf-
Röhrchen gestellt. 50 µl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule aufge
tragen, die anschließend 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss
enthielt 1,8 µg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 µg des Vektors pNCO113 und 1,8 µg des gereinigten PCR-Produkts werden
verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede
Restriktionsmixtur enthält 7 µl NE84-Puffer von New England Biolabs (NEB), 7 µg
BSA (NEB), 40 E NcoI (NEB), 30 E BamHI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70
µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA
bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 34 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-
Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl.
Dabei wird das Plasmid pNCODXSBACSU gebildet. Die Ligationsmischung wird
über Nacht bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden
elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 2
beschrieben. 6 µg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCODXSBACSU wird sequenziert wie in Beispiel 1
beschrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank
(Accessions Nr. dbj D84432).
Der E. coli ORF yaeM (Accessions Nr. gb AE000126) wird von bp Position 9887 bis
11083 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E, coli DNA als
Matrize. Chromosomale DNA aus dem E. coli Stamm XL1-Blue wird isoliert
entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Methode.
Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers
GGAGGATCCATGAAGCAACTCACC, 25 pMol des Primers
GCGCGACTCTCTGCAGCCGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA
Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamt
volumen von 100 µl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1% (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 94°C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen
durchgeführt mit 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 50°C und 75 Sek. bei 72°C. Nach
weiterer Inkubation bei 72°C für 20 Min. wird die Mischung auf 4°C gekühlt. Ein
Aliquot von 2 µl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in
Beispiel 1 beschrieben.
2,5 µg des Vektors pQE30 (Qiagen), isoliert wie in Beispiel 2 beschrieben, und 2,0 µg
des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit
überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 7 µl NEB3
Puffer von New England Biolabs (NEB), 50 E BamHI, 40 E PstI (NEB) in einem
Gesamtvolumen von 70 µl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37°C inkubiert.
Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-
Reinigungskit von Qiagen wie in Beispiel 1 beschrieben.
20 ng Vektor-DNA und 22 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-
Ligase (Gibco), 2 µl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 µl.
Dabei wird das Plasmid pQEyaeM gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht
bei 4°C inkubiert. Mit 2 µl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli
XL1-Blue und M15[pREP4] (Zamenhof et al., 1972) Zellen transformiert wie unter
Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter
Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pQEyaeM wird wie in Beispiel 1 beschrieben
isoliert. 12 µg Plasmid-DNA pQEyaeM werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEyaeM wird sequenziert wie in Beispiel 2 be
schrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions
Nr. gb AE000126).
Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pNCODXSBACSU werden
kultiviert, induziert und geerntet wie in Beispiel 1 beschrieben.
2 g Zellen werden in 10 ml 25 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, die 1 mM
Dithioerythritol, 10 mM EDTA und 6 mM Phenylmethylsulfonylchlorid enthalten, in
Gegenwart von 1 mg Lysozym suspendiert. Die Mischung wird bei 37°C 0.5 Std.
inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson
SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, Kontrolleinstellung 4
eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15.000 UpM für 30 Min. Der
Überstand wird auf eine Sepharose QFF Säule (26 cm3, Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgebracht, welche zuvor mit 200 ml Tris-HCl, pH
8,0, die 0,5 mM MgCl2 und 0,03% Natriumazid (Puffer A) enthalten, äquilibiert
wurde. Die Säule wird mit 60 ml Puffer A gewaschen, während die Extinktion bei 280
nm detektiert wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mit einem Gra
dienten von 0-1 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch
SDS-PAGE, welche eine Bande bei 67 kDa zeigt, identifiziert. Fraktionen, die diese
Proteinbande zeigen, werden gesammelt und über Nacht gegen Puffer A dialysiert.
Das Enzym wird weiter auf einer Hydroxylapatitsäule (Macro pep 40 µm, 2,5 × 6 cm,
Biorad, München, Deutschland), welche mit Puffer A äquilibiert wurde, gereinigt. Das
Enzym wird durch einen Gradienten von 0-1 M Kaliumphosphat, pH 6,5 eluiert. Die
Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mittels SDS-PAGE
überprüft. Eine kräftige Bande bei 67 kDa ist erkennbar, was in Übereinstimmung mit
der berechneten Molekularen Masse ist. Die Ausbeute von reiner 1-Deoxy-D-
xylulose-5-phosphat-Synthase ist 44 mg.
Rekombinante E. coli M15[pREP4] Zellen, welche überexprimierte 1-Deoxy-D-
xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli enthalten, werden identisch zur
Herstellung in Beispiel 1 hergestellt. Die Zellen werden aufgetaut in 20 ml 20 mM
Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid
(Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 µg/ml DNase I. Die
Mischung wird bei 37°C 0.5 Std. inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem
Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA)
ultraschallbehandelt, der auf 70% Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4
eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15.000 UpM für 30 Min. Der
zellfreie Extrakt der rekombinanten 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Redukto
isomerase von E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni2+-chelatierender
Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor
mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml
Standardpuffer gewaschen. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird
mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. 1-
Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase enthaltende Fraktionen werden
entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0
über Nacht dialysiert. Die dialysierte 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-
Reduktoisomerase wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA)
konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia
Biotech) aufgetragen. Die Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-
Reduktoisomerase wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine
Bande bei 43 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten
Molekularen Masse ist. Die Ausbeute reiner 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-
Reduktoisomerase ist 60 mg.
Die Reaktionsmischung enthält 400 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM [2-
13C]Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 10 mM MgCl2, 2 mM
Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mM EDTA, 10% D20 und 0,8 mg
Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Die Mischung wird 3 Std. bei 37°C
inkubiert. Protein wird durch Zugabe von 0,1 ml 50% Trichloressigsäure (TCA)
ausgefällt. Nach Zentrifugation wird ein 13C NMR-Spektrum (62,9 MHz, Bruker,
Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Die Umsetzung wird durch Integration der
2C-Signale von Pyruvat und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat bestimmt. Pyruvat zeigt
ein 2C-Signal bei 196,5 ppm und ein Signal bei 92,7 ppm, welches dem
korrespondierenden Hydrat zugeordnet wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat zeigt
ein Signal bei 212,5 ppm.
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM
Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat (zuvor mit NaOH
neutralisiert), 10 mM MgCl2, 4 mM Thiaminpyrophosphat, 8 mM Dithiothreitol, und
0,02 mg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 25 µl. Die Mischung wird 20
Min. bei 37°C inkubiert. 25 µl 30% TCA werden hinzugefügt und der Niederschlag
abzentrifugiert. Der Überstand wird zu einem Puffer, der 200 mM Tris-Hydrochlorid,
pH 8,0, 1 mM MnSO4, 0,5 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 0,95 ml
enthielt, hinzugefügt. Die Extinktion bei 340 nm wird gemessen. Ein Lösung (50 µl,
0,1 E) von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird hinzugefügt und
die Mischung wird 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die Extinktion bei 340 nm wird
wiederum bestimmt. Die Extinktionsdifferenz ist äquivalent zum verbrauchten
NADPH (ε340 = 6300 M-1cm-1), die wiederum äquivalent zur Menge an gebildetem 1-
Deoxy-D-xylulose-5-phosphat.
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM
Natriumpyruvat, 10 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 1 mM MnSO4, 1 mM
Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,05 mM NADPH und 1 E 1-Deoxy-D-
xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die
Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37°C inkubiert und die
Extinktion bei 340 nm wird bestimmt. Der Test wird durch Zugabe von 5 µl
Enzymprobe gestartet. Die negative Steigung der Extinktion ist äquivalent zur
Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase-Reaktion.
Die Reaktionsmischung enthält 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM MnSO4,
0,05 mM NADPH und 5 µg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 1 m 42017 00070 552 001000280000000200012000285914190600040 0002010020996 00004 41898l. Die
Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37°C inkubiert und die
Reaktion wird spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt. Der Test wird gestartet
durch Zugabe von 10 µl 50 mM 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat. Die negative
Steigung der Extinktion ist äquivalent zur Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5-
phosphat-Reduktoisomerase-Reaktion.
Rohes Dihydroxyacetonphosphat wird hergestellt wie von Effenberger, F., und
Straub, A. (1987) A novel convinient preparation of dihydroxyaceton phosphate and
its use in enzymatic aldol reactions, Tetrahedron Lett. 28, 1641-1644 beschrieben. 1
g von Dihydroxyacetonphosphat wird in 70 ml einer Lösung von 57 mM [2,3-
13C2]Natriumpyruvat, 10 mM MgSO4 und 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM
Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 gelöst. 17.000 E von Triosephosphatisomerase
(Kaninchenmuskel) werden hinzugefügt und die Lösung wird 105 Min. bei 37°C
inkubiert. 0,774 ml (7,4 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase
aus B. subtilis werden hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in Beispiel 17 beschrieben
verfolgt. Nach 8 Std. wird die Reaktion durch Einstellen des pH auf einen Wert von 3
durch die Zugabe von 1 M HCl (11,2 ml) gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei
-20°C gelagert.
Zur in Stufe a erhaltenen Reaktionsmischung, die [1,213C2]1-Deoxy-D-xylulose-5-
phosphat enthält, werden 19 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, 1,1 ml 1 M MgCl2, 3 g
Glukose (72 mMol) und 6 ml einer Lösung von 0,1 M MnCl2 hinzugefügt und der pH
mit 7 ml 1 M NaOH auf 8,0 eingestellt. Präzipat wird durch Zentrifugation entfernt. Zu
einem Endvolumen von 200 ml werden Wasser, 250 E Glukosedehydrogenase aus
B. megaterium und 56,6 mg NADP+ (80 µMol) hinzugefügt. Nach 5 min.
Präinkubation bei 37°C werden 2 ml (11,2 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5-
phosphat-Reduktoisomerase aus E. coli hinzugefügt. Nach ca. 30 Std. wird die
Reaktion durch Zugabe von 8 ml 2 N HCl gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei
-20°C gelagert.
Der pH der [2,2'-13C2]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enthaltenden
Reaktionsmischung, die in Stufe b erhalten wurde, wird durch Zugabe von 4 ml 2 M
NaOH auf 7,0 eingestellt. 1,4 g CTP (2,5 mMol) werden hinzugefügt und der pH wird
mit 6 ml 2 N NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach 5 min. Präinkubation bei 37°C, werden
1,5 ml (51,8 E) YgbP-Protein aus E. coli hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in
Beispiel 7 beschrieben verfolgt. Nach ca. 5 Std. wird die Reaktionsmischung wie in
Beispiel 8 beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 550 mg reines 4-Diphosphocytidyl-
[2,2'-13C2]2C-methyl-D-erythritol werden erhalten.
Eine Reaktionsmischung, die 3 g Glukose, 1 g Dihydroxyacetonphosphat (5,7 mMol),
1,4 g CTP (2,5 mMol), 0,45 g 2,3-13C2-Natriumpyruvat (4 mMol), 56,6 mg NADP+ (80
µMol), in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 enthalten, wird hergestellt. 17.000 E
Triosephosphatisomerase, 250 E Glukosedehydrogenase, 7 E 1-Deoxy-D-xylulose-
5-phosphat-Synthase, 13 E 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und
55 E YgbP-Protein werden hinzugefügt. Zu einem Endvolumen von 200 ml werden
10 mm MgCl2, 10 mM MnSO4, 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM Tris-
Hydrochlorid, pH 8,0 hinzugefügt. Der pH wird mit 5 ml NaOH auf 8,0 eingestellt. Die
Reaktionsmischung wird bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird wie in Beispiel 7
beschrieben verfolgt. Nach 30 Std. wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 8
beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 490 mg [2,2'-13C2]4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol werden erhalten.
Diese Herstellung kann mit jeder 13C-markierten Probe von Glukose oder Pyruvat als
Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist sie für [U-13C6]Glukose und
[2,3-13C2]Pyruvat.
Eine Reaktionsmischung mit 166 mg [U-13C6]Glukose (0,89 mMol), 44 mg
Thiaminpyrophosphat, 1,02 g ATP (1,79 mMol), 200 mg [2,3-13C2]Pyruvat (1,79
mMol), 6 mM MgCl2 in 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 wird hergestellt. 410 E
Triosephosphatisomerase (aus Kaninchenmuskel, Typ 111-S. E.C. 5.3.1.1., Sigma),
360 E Hexokinase (aus Bäckerhefe, Typ VI, E.C. 2.7.1.1., Sigma), 50 E
Phosphoglukoseisomerase (aus Bäckerhefe, Typ III, E.C. 5.3.1.9., Sigma), 20 E
Phosphofruktokinase (aus Bacillus stearothermophilus, Typ VII, E.C. 2.7.1.11,
Sigma), 35 E Aldolase (aus Kaninchenmuskel, E.C. 4.1.2.13, Sigma) und 2 E
rekombinante DXP-Synthase aus B. subtilis werden auf ein Endvolumen von 58 ml
aufgefüllt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Während der
Reaktion wird der PH durch Zugabe von 1 M NaOH (2 ml) konstant bei 8,0 gehalten.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 3 ml 2 N Salzsäure gestoppt. 13C-NMR-
Spektren werden aufgenommen um die Umsetzung zu verfolgen (Tabelle 9).
Zu der Lösung aus Schritt A wird 10 E DXP-Reduktoisomerase, 120 E Glukose
Dehydrogenase (aus Bacillus megaterium, E.C. 1.1.1.47, Sigma), 0,97 g Glukose,
200 mM MgCl2 und 0,3 mM NADP+ gegeben. Der PH wird mit 1,5 ml 4 N
Natronlauge auf 8,0 eingestellt. Nach Zentrifugation beträgt das Volumen 72 ml. Die
Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Umsetzung wird durch
13C-NMR-Spektroskopie des ansammelnden Produkts überwacht (Tabelle 10). Das
Reaktionsprodukt wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil 10
SB (16 × 250 cm) mit 0,5 M Ameisensäure als Eluenten und einer Flußrate von 13
ml/min gereinigt. Der Eluent wird mit einem Refraktometer (GAT-LCD210 von
Gamma Analyse Technik, Bremerhaven, Deutschland) überwacht. Das Produkt wird
bei 14,5 ml eluiert. Die Fraktionen, die [U-13C5]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Die Menge beträgt 86 mg.
Diese Herstellung kann mit jeder 13C-markierten Probe von 2C-Methyl-D-erythritol-4-
phosphat als Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel wird es für
[1,3,4-13C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat beschrieben.
Zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 15 mg gereinigtes [1,3,4-13C]2C-Methyl-D-
erythritol-4-phosphat (69 µMol), 34 mg CTP (69 µMol), 16 mg
Natriumphosphoenolpyruvat (69 µMol), 1,9 mg ATP (3,5 µMol), 10 mg MgCl2, 5 mM
DTT, 10 mM KCl und 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0, 60 µl YgbP-Protein (2,1
mg/ml), 200 µl YchB Protein (0,3 mg/ml) und 100 E Pyruvatkinase (aus Kaninchen
Muskel, Typ VII, E.C. 2.7.1.40, Sigma) werden zugegeben. Das Endvolumen beträgt
5 ml. Die Reaktionsmischung wird für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion
wird wie in Beispiel 15 beschrieben verfolgt. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol-2-phosphat wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil
5 SB (7,5 × 150 mm) mit einem Gradient an 1 M Ammoniumformiat (B) und 100 mM
Ammoniumformiat als Eluent bei einer Flußrate von 3,1 ml/min gereinigt.
Der Eluent wird mit einem UV-Detektor (Knauer) bei 275 nm überwacht. 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat eluiert bei 26-27 Min.
1,2 : 5,6-Di-O,O-isopropyliden-D-mannitol (5) (14 g, 53,4 mMol) wurde in 200 ml
trockenem Chloroform gelöst. Wasserfreies Kaliumcarbonat (50,5 g, 366 mMol)
wurde zugegeben, und die Suspension wurde auf 0°C gekühlt. Bleitetraacetat (27,1
g, 61,1 mMol) wurde in kleinen Portionen unter starkem Rühren eingetragen. Die
orangefarbene Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Kaliumcarbonat wurde abgenutscht, und der Filterkuchen mehrmals mit Ether
gewaschen. Das Filtrat und die Waschphase wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat
getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende
Öl, welches den Isopropylidenglycerinaldehyd enthielt wurde rasch destilliert (60°C
bei 30-40 mbar). Ausbeute: 10,5 g (80,7 mMol, 76%) reiner Isopropylidenglyce
rinaldehyd 6. Dieses Produkt wurde sofort in 35 ml trockenem Ether gelöst, um eine
Polymerisation zu verhindern. Die Lösung von 7 wurde zu einer gekühlten Lösung
aus Methylmagnesiumjodid in Ether gegeben [hergestellt aus 5,1 g (207 mMol)
Magnesium und 13,0 ml (209 mMol) Methyljodid in 140 ml Ether]. Nachdem der
Aldehyd komplett zugegeben war, wurde die Lösung über Nacht bei
Raumtemperatur weiter gerührt. Die so erhaltene Lösung wurde anschließend lang
sam auf zerkleinertes Eis geschüttet, und ausgefallenes Magnesiumhydroxid wurde
durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumchloridlösung (50 ml) wieder in Lösung
gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wässrige Phase wurde
mit Natriumchlorid gesättigt und anschließend mit Chloroform extrahiert (3 × 50 ml).
Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, und
das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Ausbeute: 9,9 g (67,8 mMol, 84%)
1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol (8).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,96 (d, 3J = 6,5 Hz), 1.07 (d, 3J = 6,5 Hz), 1,24 (s), 1,25 (s), 1,29 (s), 1,33 (s), 3,41-3,47 (m), 3,67-3,78 (m), 3,82-3,97 (m), 4,67 (d, 3J = 4,6 Hz), 4,75 (d, 3J = 5,2 Hz) (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 18,0, 19,8, 24,8, 26,1, 64,3, 65,9, 66,1, 66,9, 79,1, 79,3, 107,7, 107,7 (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); Anal, ber. für: C7H14O3: C 57,5, H 9,9, O 32,6; gef.: C 57,2, H 9,9, O 32,8.
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,96 (d, 3J = 6,5 Hz), 1.07 (d, 3J = 6,5 Hz), 1,24 (s), 1,25 (s), 1,29 (s), 1,33 (s), 3,41-3,47 (m), 3,67-3,78 (m), 3,82-3,97 (m), 4,67 (d, 3J = 4,6 Hz), 4,75 (d, 3J = 5,2 Hz) (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 18,0, 19,8, 24,8, 26,1, 64,3, 65,9, 66,1, 66,9, 79,1, 79,3, 107,7, 107,7 (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); Anal, ber. für: C7H14O3: C 57,5, H 9,9, O 32,6; gef.: C 57,2, H 9,9, O 32,8.
1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol (7) (9,9 g, 67,8 mMol) wurde in 100 ml
Chloroform gelöst. Wasser (100 ml), 30 g Kaliumcarbonat (217 mMol) und 50 mg
Rutheniumdioxid-Hydrat wurden zugegeben. Diese Suspension wurde bei
Raumtemperatur heftig gerührt, und 29 g (136 mMol) Natriumperjodat wurde in
kleinen Portionen zugefügt. Sobald der pH-Wert unter 7 fiel wurde er durch Zugabe
von festem Kaliumcarbonat wieder auf einen Wert zwischen 8 und 8,5 eingestellt.
Nach Beendigung der Perjodatzugabe ließ man die Suspension zwei weitere Tage
bei Raumtemperatur rühren. Vor der Aufarbeitung wurde ein Aliquot der
Reaktionsmischung mit Hilfe der 1H NMR-Spektroskopie überprüft. Falls noch Aus
gangsmaterial vorhanden war wurde zur Reaktionsmischung eine zusätzliche Menge
an Natriumperjodat gegeben. Wenn die Oxidation vollständig abgelaufen war, wurde
die Suspension abgenutscht und das Filtrat wurde mit Chloroform extrahiert (4 × 50
ml). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet,
und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Ausbeute: 7,2 g (50 mMol, 74%)
3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon (8).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,4 (s, 3H), 1,5 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 4,0 (dd, 2J = 8,54 Hz, 3J = 5,50 Hz, 1 H), 4,2 (dd, 2J = 8,54 Hz, 3J = 7,95 Hz, 1H), 4,41 (dd, 3J = 7,94 Hz, 3J = 5,5 Hz, 1H); 13C NMR (62 MHz, CDCl3): d (ppm) 25,3 (CH3), 25,6 (CH3), 26,3 (CH3), 66,4 (CH2), 80,4 (CH), 110,9 (Cq).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,4 (s, 3H), 1,5 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 4,0 (dd, 2J = 8,54 Hz, 3J = 5,50 Hz, 1 H), 4,2 (dd, 2J = 8,54 Hz, 3J = 7,95 Hz, 1H), 4,41 (dd, 3J = 7,94 Hz, 3J = 5,5 Hz, 1H); 13C NMR (62 MHz, CDCl3): d (ppm) 25,3 (CH3), 25,6 (CH3), 26,3 (CH3), 66,4 (CH2), 80,4 (CH), 110,9 (Cq).
3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon (8) (7,2 g, 50 mMol) wurde in 50
ml trockenem Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine katalytische
Menge Kaliumcyanid (20 mg) und der Kronenether 18-Krone-6 (20 mg) gegeben.
Unter Eiskühlung wurden 9,4 ml (70 mMol) Trimethylsilylcyanid innerhalb 20 Minuten
zugetropft. Das Lösungsmittel und überschüssiges Trimethylsilylcyanid wurden
unter reduziertem Druck entfernt. Der orangefarbene ölige Rückstand (12,0 g, 49,3
mMol, 99%) enthielt eine Mischung der Erythro- und Threoverbindung in einem
Verhältnis von 3 : 1, der darüber hinaus keine nennenswerten Mengen anderer
Produkte enthielt.
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,17 und 0,18 (25, 9H), 1,12 (s), 1,29 (s), 1,40 (s), 1,43 (s), 1,46 (s), 1,57 (s) (9H), 3,85-3,90 (m, 1 H), 3,97-4,10 (m, 2H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): erythro d (ppm) 1,2 (TMS), 24,0 (CH3), 25,0 und 26,0 ((CH3)2), 65,0 (OH2), 80,4 (CH), 110,9 (CN); threo d (ppm) -3,1 (TMS), 25,2 (CH3), 26,2 und 26,4 ((CH3)2), 66,4 (CH2), 80,8 (CH), 120,7 (CN).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,17 und 0,18 (25, 9H), 1,12 (s), 1,29 (s), 1,40 (s), 1,43 (s), 1,46 (s), 1,57 (s) (9H), 3,85-3,90 (m, 1 H), 3,97-4,10 (m, 2H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): erythro d (ppm) 1,2 (TMS), 24,0 (CH3), 25,0 und 26,0 ((CH3)2), 65,0 (OH2), 80,4 (CH), 110,9 (CN); threo d (ppm) -3,1 (TMS), 25,2 (CH3), 26,2 und 26,4 ((CH3)2), 66,4 (CH2), 80,8 (CH), 120,7 (CN).
1,2-O-Isopropyliden-3-O-trimethylsilyl-(2R,3RS)-1,2,3-trihydroxy-3-cyanobutan (9)
(12,0 g, 49,3 mMol) wurde in 30 ml 25%iger Salzsäure suspendiert. Zur
Verbesserung der Löslichkeit des lipophilen Cyanhydrins wurde Ethanol (10 ml)
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 45°C 30 Minuten lang gerührt und
anschließend 3 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Die Mischung färbte sich braun,
und ein Niederschlag aus Ammoniumchlorid setzte sich ab. Anschließend wurde die
Säure mit konzentrierter Ammoniaklösung neutralisiert, und die Mischung wurde zur
Trockene eingeengt. Der Kristallbrei wurde danach mit Methanol digeriert, und
unlösliches Ammoniumchlorid wurde abfiltriert. Das Methanol wurde im Vakuum
entfernt. Das zurückbleibende Öl enthielt die Laktone 11 und 12 sowie die
offenkettigen Carbonsäuren (10). Die Lactonisierung wurde durch Kochen mit 60
%iger Ameisensäure (30 ml) für 2 Stunden vervollständigt. Sobald keine
offenkettigen Carbonsäuren in der Mischung mehr nachweisbar waren, wurde die
Lösung unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Das zurückbleibende Öl wurde in
einer Mischung aus Ethylacetat, 2-Propanol und Wasser (5 ml, 65/24/12, v/v/v)
gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule gegeben (saure Form) und
wurde mit der Mischung aus Ethylacetat/2-Propanol/Wasser eluiert. Produkthaltige
Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der
Rückstand wurde lyophilisiert. Das zurückbleibende Öl (5,9 g, 44,7 mMol, 91%)
enthielt nach NMR-spektroskopischer Analyse 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton und
2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton in einem Verhältnis von 3 : 1.
2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton 1H NMR (250 MHz, CD3OD): d (ppm) 1,30 (s, 3H), 3,92 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 9,16 Hz, 1H), 4,13 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 5,50 Hz, 1H), 4,44 (dd, 2J = 5,50 Hz, 3J = 9,15 Hz, 1H); 13C NMR (63 MHz, CD3OD): d (ppm) 17,9 (CH3), 73,1 (CH2), 78,8 (CH), 85,8 (Cq), 161,8 (Cq); IR (Film): 1770 cm-1; Anal. ber. für C5H8O4: C 45,4, H 6,0, 48,3; gef.: C 46,2, H 6,5, O 47,3.
2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton 1H NMR (250 MHz, CD3OD): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 4,00 (dd, 2J = 1,83 Hz, 3J = 4,27 Hz, 1H), 4,09 (dd, 2J = 1,83 Hz, 3J = 9,77 Hz, 1H), 4,38 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 10,38 Hz, 1 H); 13C NMR (63 MHz, CD3OD): d (ppm) 21,9 (CH3), 73,6 (CH2), 75,0 (CH), 75,8 (Ca), 164,9 (Ca); IR (Film): 1770 cm-1
Offenkettige Carbonsäuren (Isomerenmischung 1 : 1) 1H NMR (250 MHz, D2O): d (ppm) 1,14 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 3,45-3,85 (m, 6H); 13C NMR (63 MHz, D2O): d (ppm) 19,8 (CH3), 20,7 (CH3), 64,9 (CH2), 65,2 (CH2), 70,1 (CH), 70,3 (CH), 77,8 (Cq), 77,9 (Cq), 182,5 (Cq), 182,8 (Cq).
2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton 1H NMR (250 MHz, CD3OD): d (ppm) 1,30 (s, 3H), 3,92 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 9,16 Hz, 1H), 4,13 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 5,50 Hz, 1H), 4,44 (dd, 2J = 5,50 Hz, 3J = 9,15 Hz, 1H); 13C NMR (63 MHz, CD3OD): d (ppm) 17,9 (CH3), 73,1 (CH2), 78,8 (CH), 85,8 (Cq), 161,8 (Cq); IR (Film): 1770 cm-1; Anal. ber. für C5H8O4: C 45,4, H 6,0, 48,3; gef.: C 46,2, H 6,5, O 47,3.
2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton 1H NMR (250 MHz, CD3OD): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 4,00 (dd, 2J = 1,83 Hz, 3J = 4,27 Hz, 1H), 4,09 (dd, 2J = 1,83 Hz, 3J = 9,77 Hz, 1H), 4,38 (dd, 2J = 4,27 Hz, 3J = 10,38 Hz, 1 H); 13C NMR (63 MHz, CD3OD): d (ppm) 21,9 (CH3), 73,6 (CH2), 75,0 (CH), 75,8 (Ca), 164,9 (Ca); IR (Film): 1770 cm-1
Offenkettige Carbonsäuren (Isomerenmischung 1 : 1) 1H NMR (250 MHz, D2O): d (ppm) 1,14 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 3,45-3,85 (m, 6H); 13C NMR (63 MHz, D2O): d (ppm) 19,8 (CH3), 20,7 (CH3), 64,9 (CH2), 65,2 (CH2), 70,1 (CH), 70,3 (CH), 77,8 (Cq), 77,9 (Cq), 182,5 (Cq), 182,8 (Cq).
Wasserfreies Zinkchlorid (14,1 g, 103 mMol) wurde in 100 ml Aceton gelöst. Die
Lösung wurde mit Eis gekühlt, und 5,9 g einer Mischung aus 2C-Methyl-D-erythrono-
1,4-lacton (11) (33,5 mMol) und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton (12) (11,2 mMol)
gelöst in 13 ml Aceton wurde zugegeben. Nach 18 Stunden wurde die Lösung durch
Zugabe von 150 ml Chloroform verdünnt. Zinkchlorid und unverändertes 2C-Methyl-
D-threono-1,4-lacton wurden durch Waschen mit Wasser (3 × 100 ml) entfernt. Die
organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: reines 2,3-O-Isopropyliden-2C-
methyl-D-erythrono-1,4-lactone (13) (4.4 g, 25.6 mMol, 76% ausgehend von 2C-
Methyl-D-erythrono-1,4-lacton) in Form eines farblosen Öles welches bei -20°C
kristallisierte.
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,48 (s, 3H), 4,24 (dd, 3J = 3,54 Hz, 2J = 11,06 Hz, 1H), 4,34 (dd, 2J = 11,06 Hz, 3J = 0 Hz, 1H), 4,41 (dd, 2J = 3,50 Hz, 3J = 0 Hz, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 18,4 (CH3), 26,5 (CH3), 26,9 (CH3), 68,9 (CH2), 80,3 (CH), 81,4 (Cq), 113,0 (Cq), 176,7 (Cq).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,48 (s, 3H), 4,24 (dd, 3J = 3,54 Hz, 2J = 11,06 Hz, 1H), 4,34 (dd, 2J = 11,06 Hz, 3J = 0 Hz, 1H), 4,41 (dd, 2J = 3,50 Hz, 3J = 0 Hz, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 18,4 (CH3), 26,5 (CH3), 26,9 (CH3), 68,9 (CH2), 80,3 (CH), 81,4 (Cq), 113,0 (Cq), 176,7 (Cq).
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrono-1,4-lacton (13) (2,2 g, 12,9 mMol) wurde
in 60 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Die Mischung wurde unter Stickstoff auf
-78°C gekühlt. Anschließend wurde eine Lösung aus Diisobutylaluminiumhydrid (1 M
in Hexan, 17 ml, 17 mMol) langsam zugetropft. Die Lösung ließ man im Kühlbad
über Nacht stehen. Nasser Ether (180 ml) und nasses Kieselgel (30 g) wurden
zugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt, danach auf Raumtemperatur
erwärmt und dann filtriert. Die Lösung wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und
das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl wurde durch
Chromatographie an Kieselgel mit einer Mischung aus Hexan/Ethylacetat (1/2, v/v)
gereinigt. Ausbeute: 2,0 g (11,5 mMol, 89%) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-
erythrofuranose (14) als anomere Mischung (α/β = 1/l).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,29 (s), 1,30 (s), 1,34 (s), 1,35 (s), 1,37 (s) (18 H), 3,46 (dd, 3J = 3,54 Hz, 2J = 11,06 Hz, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,78 (d, 2J = 11,50 Hz, 2H), 3,84 (d, 2J = 11,06 Hz, 1H), 3,97 (dd, 3J = 3,80 Hz, 2J = 10,40 Hz, 1H), 4,29 (dd, = 3,10 Hz, 3J = 8,85 Hz, 2H), 4,52 (d, 2J = 11,06 Hz, 1H), 5,13 (d, 3J = 2,65 Hz, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 19,4 (CH3), 21,4 (CH3), 26,3 (CH3), 26,9 (CH3), 27,2 (CH3), 28,0 (CH3), 67,1 (CH2), 71,5 (CH2), 84,9 (CH), 86,0 (Cq), 86,1 (CH), 91,4 (Cq), 101,4 (Cq), 103,3 (Cq), 112,4 (CH), 112,9 (CH).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,29 (s), 1,30 (s), 1,34 (s), 1,35 (s), 1,37 (s) (18 H), 3,46 (dd, 3J = 3,54 Hz, 2J = 11,06 Hz, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,78 (d, 2J = 11,50 Hz, 2H), 3,84 (d, 2J = 11,06 Hz, 1H), 3,97 (dd, 3J = 3,80 Hz, 2J = 10,40 Hz, 1H), 4,29 (dd, = 3,10 Hz, 3J = 8,85 Hz, 2H), 4,52 (d, 2J = 11,06 Hz, 1H), 5,13 (d, 3J = 2,65 Hz, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 19,4 (CH3), 21,4 (CH3), 26,3 (CH3), 26,9 (CH3), 27,2 (CH3), 28,0 (CH3), 67,1 (CH2), 71,5 (CH2), 84,9 (CH), 86,0 (Cq), 86,1 (CH), 91,4 (Cq), 101,4 (Cq), 103,3 (Cq), 112,4 (CH), 112,9 (CH).
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrofuranose (14) (0,5 g, 2,87 mMol) wurde in
12 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Trockenes Pyridin (1 ml) und 0,88 g (5,5
mMol) O-Benzylhydroxylaminhydrochlorid wurde auf ein Mal zugegeben. Das
Hydroxylamin löste sich innerhalb von 20 Minuten auf, und die Reaktionsmischung
wurde nach 40 Minuten trübe. Die Mischung wurde 15 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Chloroform/Ethylacetat (114, v/v, 1 ml)
suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Kieselgelsäule (1 cm × 30 cm)
aufgetragen, und das Produkt wurde mit der Lösungsmittelmischung eluiert. Produkt
haltige Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem
Druck entfernt. Ausbeute: 0,53 g (1,9 mMol, 66%) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-
erythrose-(O-benzyl)oxim (18) als farbloses Öl.
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,26 (s, 3H), 1,31 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 3,42- 3,56 (m, 2H), 3,86 (dd, 3J = 4,89 Hz, 3J = 6,72 Hz, 1H), 4,92 (s, 2H), 7,15-7,25 (m, 5H), 7,32 (s, 1H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,8 (CH3), 26,6 (CH3), 27,9 (CH3), 60,7 (CH2), 76,0 (CH2), 80,5 (CH), 84,3 (Cq), 109,4 (Cq), 127,9 (CH), 128,2 (OH), 128,3 (CH), 137,2 (Cq), 152,0 (CH).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,26 (s, 3H), 1,31 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 3,42- 3,56 (m, 2H), 3,86 (dd, 3J = 4,89 Hz, 3J = 6,72 Hz, 1H), 4,92 (s, 2H), 7,15-7,25 (m, 5H), 7,32 (s, 1H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,8 (CH3), 26,6 (CH3), 27,9 (CH3), 60,7 (CH2), 76,0 (CH2), 80,5 (CH), 84,3 (Cq), 109,4 (Cq), 127,9 (CH), 128,2 (OH), 128,3 (CH), 137,2 (Cq), 152,0 (CH).
Tribenzylphosphit (1,3 g, 3,7 mMol) wurde in 20 ml trockenem Dichlormethan gelöst.
Die Lösung wurde auf -20°C gekühlt. Jod (0,96 g, 3,8 mMol) wurde in einer Portion
zugegeben. Die Lösung wurde lichtgeschützt auf Raumtemperatur erwärmt, sobald
die violette Farbe der Lösung verschwunden war. 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-
erythrose-(O-benzyl)oxim (15) (0,53 g, 1,9 mMol) wurde in 20 ml Dichlormethan
gelöst und 2,5 ml Pyridin (31,6 mMol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde auf -20°C
gekühlt und die Lösung des Dibenzyljodphosphates wurde langsam zugetropft.
Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde
anschließend nacheinander mit Natriumhydrogensulfat (30%, w/v, 2 × 10 ml), einer
Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (5%, w/v, 10 ml), und Wasser (10 ml)
gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und an
schließend unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand
wurde in einer Mischung aus Hexan/Ethylacetat (3/1, v/v, 2 ml) suspendiert. Diese
Mischung wurde auf eine Kieselgelsäule (1 cm × 20 cm) aufgetragen und mit Hex
an/Ethylacetat (3/l, v/v) solange eluiert, bis das Benzyljodid vollständig
ausgewaschen war. Das Produkt wurde danach mit einer Mischung aus Chloro
form/Ethylacetat (1/4, v/v) eluiert. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt, und
das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 0,73 g (1,35
mMol, 71%) 2, 3-O-isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-
dibenzylphosphat (19).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,31 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 3,90- 3,99 (m, 3H), 4,94 (s, 1H), 4,97-5,02 (m, 6H), 7,24-7,33 (m, 15H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,0 (CH3), 26,6 (CH3), 28,0 (CH3), 65,3 (d, 2JCP = 5,5 Hz, CH2), 69,1-69,5 (m, CH2), 76,2 (CH2), 80,2 (Cq), 82,5 (d, 3JCP = 7,9 Hz, CH), 109,7 (Cq), 127,9-128,5 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 6,8 Hz, Cq), 137,9 (Cq), 150,3 (CH); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) -0,8 (s).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,31 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 3,90- 3,99 (m, 3H), 4,94 (s, 1H), 4,97-5,02 (m, 6H), 7,24-7,33 (m, 15H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,0 (CH3), 26,6 (CH3), 28,0 (CH3), 65,3 (d, 2JCP = 5,5 Hz, CH2), 69,1-69,5 (m, CH2), 76,2 (CH2), 80,2 (Cq), 82,5 (d, 3JCP = 7,9 Hz, CH), 109,7 (Cq), 127,9-128,5 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 6,8 Hz, Cq), 137,9 (Cq), 150,3 (CH); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) -0,8 (s).
2, 3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat (18)
(0,26 g, 0,43 mMol) wurde in 15 ml Dichlormethan gelöst, welches 2 ml Pyridin
enthielt. Die Lösung wurde auf -78°C gekühlt und wurde 7 Minuten lang mit einem
Ozondurchfluss von ungefähr 3 g/min (0,44 mMol) ozonisiert. Anschließend wurde
Stickstoff durch die tiefblaue Lösung geleitet. Sobald die blaue Farbe verschwunden
war, wurden 2 ml Dimethylsulfid zugegeben. Die Mischung ließ man noch 1 Stunde
bei -78°C stehen und ließ sie dann auf Raumtemperatur erwärmen. Das
Lösungsmittel und Pyridin wurden unter reduziertem Druck entfernt, und das
Rohprodukt wurde chromatographisch gereinigt (Kieselgel; Chloroform/ Ethylacetat
1/4, v/v). Ausbeute: 0,17 g (0,39 Mol, 81%) reiner Aldehyd.
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,24 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,46 (s, 3H), 3,93- 4,02 (m, 2H), 4,05-4,13 (m, 1 H), 4,92-5,00 (m, 4H), 7,23-7,30 (m, 10H), 9,51 (s, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 19,7 (CH3), 26,5 (CH3), 27,8 (CH3), 64,3 (d, 2JCP = 6,0 Hz, CH2), 69,5 (m, CH2), 82,7 (d, 3JCP = 8,7 Hz, CH), 85,1 (Cq), 110,9 (Cq), 126,8 (d, 4JCP = 14,5 Hz, CH), 127,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 7,3 Hz, Cq), 202,0 (CH); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) -1,0 (s).
1H NMR (360 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,24 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,46 (s, 3H), 3,93- 4,02 (m, 2H), 4,05-4,13 (m, 1 H), 4,92-5,00 (m, 4H), 7,23-7,30 (m, 10H), 9,51 (s, 1H); 13C NMR (90 MHz, CDCl3): d (ppm) 19,7 (CH3), 26,5 (CH3), 27,8 (CH3), 64,3 (d, 2JCP = 6,0 Hz, CH2), 69,5 (m, CH2), 82,7 (d, 3JCP = 8,7 Hz, CH), 85,1 (Cq), 110,9 (Cq), 126,8 (d, 4JCP = 14,5 Hz, CH), 127,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 7,3 Hz, Cq), 202,0 (CH); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) -1,0 (s).
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17) (85 mg, 0,2
mMol) wurde in 3 ml trockenem Methanol gelöst, und die Lösung wurde auf 0°C
gekühlt. Natriumborhydrid, 20 mg (0,5 mMol), wurde in einer Portion zugegeben.
Diese Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Wasser (5 ml) wurde anschließend
zugegeben, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören, und die Mischung wurde mit
konzentrierter Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Die Suspension wurde 4 mal mit je 10
ml Chloroform extrahiert, und die organische Lösung wurde mit 20 ml einer
Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5%, w/v) gewaschen. Die organische Phase
wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter reduziertem
Druck entfernt. Ausbeute: 85,5 mg (0,2 mMol, 100%) reines 18.
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,20 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,89 (s, breit, 2H), 3,34 (m, 2H), 3,95 (dd, J = 4,70 Hz, J = 7,10 Hz, 1H), 4,08-4,20 (m, 2H), 5,00 (dd, J = 1,83 Hz, J = 8,55 Hz, 4H), 7,29 (m, 10H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,1 (CH3), 26,4 (CH3), 28,1 (CH3), 65,0 (CH2), 65,2 (d, 2JCP = 5,45 Hz, CH2), 69,4 (dd, 2JCP = 2,72 Hz, 2JCP = 5,45 Hz, CH2), 81,1 (d, 3JCP = 8,18 Hz, CH), 81,7 (Cq), 108,5 (Cq), 126,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 6,80 Hz, Cq); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,5 (s).
1H NMR (250 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,20 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,89 (s, breit, 2H), 3,34 (m, 2H), 3,95 (dd, J = 4,70 Hz, J = 7,10 Hz, 1H), 4,08-4,20 (m, 2H), 5,00 (dd, J = 1,83 Hz, J = 8,55 Hz, 4H), 7,29 (m, 10H); 13C NMR (63 MHz, CDCl3): d (ppm) 22,1 (CH3), 26,4 (CH3), 28,1 (CH3), 65,0 (CH2), 65,2 (d, 2JCP = 5,45 Hz, CH2), 69,4 (dd, 2JCP = 2,72 Hz, 2JCP = 5,45 Hz, CH2), 81,1 (d, 3JCP = 8,18 Hz, CH), 81,7 (Cq), 108,5 (Cq), 126,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, 3JCP = 6,80 Hz, Cq); 31P NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 0,5 (s).
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (18) (85,5 mg, 196
µMol) wurde in 8 ml einer Mischung, bestehend aus 4 ml Methanol und 4 ml Wasser,
suspendiert. Eine katalytische Menge Palladium/Aktivkohle wurde hinzugefügt, und
die Suspension wurde 20 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert. Der Katalysator
wurde durch Filtration durch einen 0,2 µm Membranfilter entfernt. Die saure Lösung
(pH 2) wurde auf 70°C 60 Minuten lang erhitzt. Das Methanol wurde unter
reduziertem Druck bei 40°C entfernt, und der Rückstand wurde lyophilisiert.
Ausbeute: 35,3 mg (163 µMol, 83%) Rohprodukt. Die Phosphorsäure wurde in 1 ml
Wasser gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Nukleosil SB10 HPLC Säule
aufgetragen und mit 0,5 M Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 1 ml/min
eluiert. Die Auftrennung wurde refraktometrisch verfolgt. Produkthaltige Fraktionen
(Retentionsvolumen 15 ml) wurden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 18,0 mg
reines 4.
1H NMR (500 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 1,04 (s, 3H), 3,37 (d, 2J = 11,77 Hz, 1H), 3,50 (d, 2J = 11,78 Hz, 1H), 3,64 (dd, 3J = 2,60 Hz, 3J = 8,10 Hz, 1H), 3,77 (ddd, 3JHP = 6,20 Hz, 3J = 8,10 Hz, 3J = 10,80 Hz, 1H), 4,01 (ddd, 3J = 2,50 Hz, 3JHP = 6,00 Hz, 3J = 10,80 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 18,2 (C3), 65,9 (d, 2JCP = 5,14 Hz, CH2), 66,2 (CH2), 73,1 (d, 3JCP = 7,58 Hz, CH), 73,8 (Cq); 31P NMR (101 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 3,7 (s).
1H NMR (500 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 1,04 (s, 3H), 3,37 (d, 2J = 11,77 Hz, 1H), 3,50 (d, 2J = 11,78 Hz, 1H), 3,64 (dd, 3J = 2,60 Hz, 3J = 8,10 Hz, 1H), 3,77 (ddd, 3JHP = 6,20 Hz, 3J = 8,10 Hz, 3J = 10,80 Hz, 1H), 4,01 (ddd, 3J = 2,50 Hz, 3JHP = 6,00 Hz, 3J = 10,80 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 18,2 (C3), 65,9 (d, 2JCP = 5,14 Hz, CH2), 66,2 (CH2), 73,1 (d, 3JCP = 7,58 Hz, CH), 73,8 (Cq); 31P NMR (101 MHz, D2O, pH 1): d (ppm) 3,7 (s).
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17), 85 mg (0,2
mMol) wurde in 3 ml trockenem Methanol gelöst, und die Lösung wurde auf 0°C
gekühlt. [2H]-NaBH4, 20 mg, (0,5 mMol) wurde in einer Portion zugegeben. Wasser
(5 ml) wurde zugegeben, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören, und die
Mischung wurde mit konzentrierter Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Die Suspension
wurde 4 mal mit je 10 ml Chloroform extrahiert, und die organische Lösung wurde
mit 20 ml einer 5%-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die orga
nische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter
reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 85,5 mg (0,2 mMol, 100%) reines [1-2H1]-2,3-
O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (18).
[1-2H1]-2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (85,5 mg,
196 µMol) wurde in 8 ml einer Mischung, bestehend aus 4 ml Methanol und 4 ml
Wasser, suspendiert. Eine katalytische Menge Palladium auf Aktivkohle wurde
hinzugefügt, und die Suspension wurde 20 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert.
Der Katalysator wurde durch Filtration durch einen 0,2 µm-Membranfilter entfernt.
Die saure Lösung (pH 2) wurde auf 70°C 60 Minuten lang erhitzt. Das Methanol
wurde unter reduziertem Druck bei 40°C entfernt, und der Rückstand wurde
lyophilisiert. Ausbeute: 35,3 mg (163 µMol, 83%) Rohprodukt. Die Phosphorsäure
wurde in 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Nukleosil SB10 HPLC
Säule aufgetragen und mit 0,5 M Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 1
ml/min eluiert. Die Auftrennung wurde refraktometrisch verfolgt. Produkthaltige Frak
tionen (Retentionsvolumen 15 ml) wurden gesammelt und lyophilisiert und gaben
reines [1-2H1]-4.
[3H]-NaBH4 (8,5 µMol, 100 mCi, 11,8 Ci/mMol) wurde in 500 µl trockenem Methanol
suspendiert. 170 µl einer Lösung enthaltend 33,3 µMol 2,3-O-Isopropyliden-2C-
methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17) in trockenem Methanol wurde bei
Raumtemperatur in einer Portion zur Borhydrid-Suspension gegeben. Nach 1 Stunde
bei Raumtemperatur wurde 1 ml Wasser zugegeben, um überschüssiges Borhydrid
zu zerstören. Die entstandene Suspension wurde mit Chloroform (3 × 170 µl)
extrahiert, die organischen Phasen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde
ohne zu trocknen unter reduziertem Druck entfernt.
Der Rückstand wurde in 50%igem Methanol (1 ml) gelöst, eine katalytische Menge
Palladium auf Aktivkohle wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde 12 Stunden
(Raumtemperatur, 1 atm) hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt.
Essigsäure (100%, 1 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde für 30 Minuten
auf 60°C erhitzt.
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [13C]Methyljodid in Schritt (a)
liefert die 13C-markierte Verbindung (4).
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [2H3]Methyljodid liefert die
deuteriummarkierte Verbindung (4).
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [3H]Methyljodid liefert die
tritiummarkierte Verbindung (4).
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [14C]Kaliumcyanid in Schritt (c)
liefert das 14C-markierte Produkt (4).
[1,2-14C2]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (spezifische Aktivität: 62,5 mCi/mMol)
wurde biosynthetisch aus [U-14C]Pyruvat (spezifische Aktivität: 150 mCi/mMol) und
D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat hergestellt nach der Methode, die in Sprenger et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12857-12862 beschrieben wurde.
[1-3H] 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (spezifische Aktivität: 5 mCi/mMol) wurde
entsprechend Herstellungsbeispiel 8 aus [3-3H]Pyruvat (spezifische Aktivität: 72,3 Ci/mMol)
synthetisiert.
[1,2-14C2]1-Deoxy-D-xylulose (spezifische Aktivität: 62,5 mCi/mMol) wurde hergestellt
aus [U-14C]Pyruvat mit einer spezifischen Radioaktivität von 150 mCi/mMol und
D-Glycerinaldehyd unter Verwendung des Pyruvatdehydrogenasekomplexes aus E.
coli DH5a als Katalysator. Die Ausbeute betrug 80%. Es wurde die Methode von
Yokota, A. und Sasajima, K. Agric. Biol. Chem. 48, 149-158 (1994) sowie ibid 50,
2517-2524 (1986) verwendet.
Claims (62)
1. Protein in einer enzymatisch funktionellen Form für die Umwandlung von
Cytidintriphosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat in 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in Gegenwart von Magnesiumionen.
2. Protein gemäß Anspruch 1 dergestalt, dass es eine Sequenz besitzt, die
ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von ygbP im E.-coli-Genom
codiert werden, oder der Menge der funktionellen Homologen davon.
3. Protein in einer enzymatisch funktionellen Form für die Umwandlung von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in Gegenwart von Manganionen.
4. Protein gemäß Anspruch 3 dergestalt, dass es eine Sequenz besitzt, die
ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von ygbB im E.-coli-Genom
codiert werden, oder der Menge der funktionellen Homologen davon.
5. Protein in einer enzymatisch funktionellen Form für die Umwandlung von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und Adenosintriphosphat zu 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat in Gegenwart eines
Magnesiumsalzes
6. Protein gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz
besitzt, die ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von YchB im E.
coli Genom codiert werden, oder der Menge der funktionellen Homologen
davon.
7. Protein in einer enzymatisch funktionellen Form für die Umwandlung von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat zu 2C-Methyl-D-erythritol-
2,4-cyclopyrophosphat und CMP.
8. Protein gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz
besitzt, die ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von dem Gen
YgbB im E. coli Genom oder von zu YgbB orthologen Sequenzen codiert
werden.
9. Protein in einer Form, die enzymatisch bifunktionell ist, die eine N-terminale
Domäne mit der Funktion zur Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol aus Cytidintriphosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und
eine C-terminale Domäne mit der Funktion zur Umwandlung von 4-Di
phosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aufweist.
10. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, das ein Pflanzenenzym ist.
11. Protein gemäß Anspruch 10, das ein Arabidopsis thaliana- oder ein
Lycopersicon esculentum-Enzym ist.
12. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich um ein bakterielles
Enzym handelt.
13. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich um ein protozoelles
Enzym handelt.
14. Protein gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei es sich um ein Protein eines
Organismus handelt, der ausgewählt ist aus Escherichia coli, Haemophilus,
Bacillus subtilis, Synechocystis, Mycobacterium, Aquifex aeolicus, Chlamydia,
Thermofoga maritima, Helicobacter, Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi,
Salmonella, Yersinia, Actinobacillus, Vibrio cholerae, Shewanella putrefaciens,
Pasteurella multicoda, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, Bordetella,
Thiobacillus ferrooxidans, Deinococcus radiodurans, Clostridium
acetobutylicum, Chlorobium tepidum, Porphyromonas gingivalis, Enterococcus
faecalis, Streptococcus, Staphylococcus aureus, Rhodobacter capsulatus,
Caulobacter crescentus, Campylobacter jejuni, Plasmodium falciparum.
15. Gereinigte, isolierte Nukleinsäure, welche ein Protein gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 14 codiert, und gegebenenfalls Introns umfasst.
16. DNA-Expressionsvektor, der die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15
umfasst.
17. Zelle, die den Vektor von Anspruch 16 umfasst, wobei die Zelle ausgewählt ist
aus der Gruppe, welche aus bakteriellen, protozoellen, Pilz-, Pflanzen-,
Insekten- und Säugerzellen besteht.
18. Samen umfassend eine Pflanzenzelle, wie sie in Anspruch 17 definiert ist.
19. Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Scree
ning einer chemischen Bibliothek nach Inhibitoren der Terpenoidbiosynthese.
20. Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Ab
wesenheit von Hemmung des Terpenoidbiosynthesewegs durch Blockierung
der Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aus
Cytidintriphosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat gemäß den folgenden
Schritten:
- a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Enzym gemäß Anspruch 1, 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat oder eine Quelle dafür, Cytidintriphosphat und ein divalentes Metallsalz;
- b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum hin bei einer vorbestimmten Temperatur;
- c) Bestimmung der Konzentration von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol;
- d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek;
- e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung in Schritt
- f) durch Feststellung ob die bestimmte Konzentration in Gegenwart der Testprobe erniedrigt ist oder nicht.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei Schritt c) ausgeführt wird durch Messung
der Bildungsrate von Pyrophosphat oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol oder durch Messung des Verbrauchs von Cytidintriphosphat oder 2C-
Methyl-D-erythritol-4-phosphat.
22. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das divalente Salz ein Magnesiumsalz
ist.
23. Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Ab
wesenheit von Hemmung der Terpenoidbiosynthese durch Blockierung der
Umwandlung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol gemäß den folgen
den Schritten:
- a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Enzym gemäß Anspruch 3, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder eine Quelle dafür und ein divalentes Metallsalz;
- b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum hin bei einer vorbestimmten Temperatur;
- c) Bestimmung der Konzentration von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol;
- d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek;
- e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung in Schritt
- f) durch Feststellung ob die beobachtete Konzentration in Gegenwart der Testprobe höher ist oder nicht.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei Schritt c) durchgeführt wird, durch
Messung der Bildungsrate von 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat oder
CMP oder durch Messung des Verbrauchs an 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-
erythritol.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei das divalente Salz ein divalentes Ma
gnesiumsalz ist.
26. Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Ab
wesenheit von Hemmung der Terpenoidbiosynthese durch Blockierung der
Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aus 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und Adenosintriphosphat gemäß den
folgenden Schritten:
- a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Enzym gemäß Anspruch 5, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder eine Quelle dafür, Adenosintriphosphat und ein divalentes Metallsalz;
- b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum hin bei einer vorbestimmten Temperatur;
- c) Bestimmung der Konzentration von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol-2-phosphat;
- d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek;
- e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung in Schritt
- f) durch Feststellung ob die gemessene Konzentration in Gegenwart der Testprobe niedriger ist oder nicht.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei Schritt c) durchgeführt wird, durch
Messung der Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-
phosphat oder von Pyrophosphat oder durch Messung des Verbrauchs an 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder von Adenosintriphosphat.
28. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das divalente Salz ein Magnesiumsalz
ist.
29. Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Ab
wesenheit von Hemmung der Terpenoidbiosynthese durch Blockierung der
Synthese von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat gemäß den folgen
den Schritten:
- a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Enzym gemäß Anspruch 7, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat oder eine Quelle dafür;
- b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum hin bei einer vorbestimmten Temperatur;
- c) Bestimmung der Konzentration von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4- cyclopyrophosphat;
- d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek;
- e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Hemmung in Schritt
- f) durch Feststellung ob die gemessene Konzentration niedriger ist in Gegenwart der Testprobe oder nicht.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei Schritt c) durchgeführt wird, durch
Messung der Bildung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat oder
von Cytidinmonophosphat oder durch Messung des Verbrauchs an 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder von Adenosintriphosphat.
31. Optional Isotop-markiertes 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder ein
Salz desselben.
32. Verfahren zur Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder
eines Salzes desselben durch Umsetzung von Cytidintriphosphat und 2C-
Methyl-D-erythritol-4-phosphat in Gegenwart eines Enzyms gemäß Anspruch 1
oder 2 und eines divalenten Metallsalzes.
33. Verwendung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder eines Salzes
desselben zum Screening von Inhibitoren der Terpenoidbiosynthese.
34. Optional Isotop-markiertes 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat oder ein
Salz desselben.
35. Verfahren zur Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat oder
eines Salzes desselben durch Umsetzung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-
D-erythritol in Gegenwart eines Enzyms gemäß Anspruch 4 und eines
divalenten Metallsalzes.
36. Optional Isotop-markiertes 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-
phosphat oder ein Salz desselben.
37. Verfahren zur Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-
phosphat oder eines Salzes desselben durch Umsetzung von 4-
Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol mit Adenosintriphosphat in
Gegenwart eines Enzyms gemäß Anspruch 5 oder 6 und eines divalenten
Metallsalzes.
38. Verwendung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat oder
eines Salzes desselben zum Screening nach Inhibitoren der
Terpenbiosynthese.
39. Optional Isotop-markiertes 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat oder
ein Salz desselben.
40. Verfahren zur Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
oder eines Salzes desselben durch Umsetzung von 4-Diphosphocytidyl-2C-
methyl-D-erythritol-2-phosphat mit einem Protein gemäß einem der Ansprüche
7 oder 8.
41. Verwendung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat oder einem
Salz desselben zum Screening nach Inhibitoren der Terpenbiosynthese
42. Verfahren zum Auffinden von Inhibitor-resistenten Varianten der
Pflanzenproteine der Ansprüche 10 oder 11, wobei das Methoden folgendes
umfasst:
- a) Bereitstellung einer Zellpopulation, welche eines der Pflanzenproteine exprimiert;
- b) Mutagenisierung der Zellpopulation;
- c) Behandlung solcher mutagenisierter Zellpopulationen mit einem Herbizid, unter Bedingungen, welche inhibierend für die funktionelle Effektivität eines der Proteine von nicht-mutagenisierten Zellen sind;
- d) Wiederauffindung von Zellen, welche resistent gegen die inhibitorischen Effekte solcher Herbizide sind und
- e) Isolierung und gegebenenfalls Sequenzierung der Nukleinsäure, welche für herbizid-resistente Proteine aus den wiederaufgefundenen Zellen codiert, um herbizid-resistente Proteinvarianten bereitzustellen und zu identifizieren.
43. Variante des Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Protein
herbizid-resistent ist.
44. Proteinvariante, wie in Anspruch 43 definiert, wobei die Proteinvariante, wenn
sie in einer Zelle exprimiert wird, welche die funktionelle Aktivität des Proteins
zur Lebensfähigkeit benötigt,
- a) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher sie exprimiert wird; oder eine katalytische Aktivität, die in Kombination mit einer beliebigen herbizid-resistenten Proteinvariante, welche auch in der Zelle exprimiert wird, welche dieselbe oder verschieden zu der ersten Proteinvariante sein kann, ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher sie exprimiert wird; und
- b) eine katalytische Aktivität, welche stärker resistent als das Wildtyp-Protein gegen das Herbizid ist
45. Proteinvariante, wie in Anspruch 43 definiert, wobei das Protein von
Arabidopsis thaliana abgeleitet ist.
46. Nukleinsäure, welche für eine Proteinvariante, wie in Anspruch 43 definiert, co
diert.
47. DNA-Vektor, umfassend eine Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 46 definiert ist.
48. Zelle, umfasend einen DNA-Vektor, wie er in Anspruch 47 definiert ist, wobei
die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus bakteriellen, Pilz-, Pflanzen-,
Insekten- und Säugerzellen besteht.
49. Samen, umfassend eine Pflanzenzelle, wie sie in Anspruch 48 definiert ist.
50. Verfahren zur Übertragung von Herbizid-Resistenz auf eine Pflanze, wobei das
Verfahren die Einführung einer Nukleinsäure, welche für eine herbizid-resis
tente Proteinvariante, wie in Anspruch 43 definiert, unter Bedingungen codiert,
bei welchen die Nukleinsäure in der Pflanze exprimiert wird, umfasst.
51. Verfahren zur Wachstumskontrolle von Unkraut, umfassend das Kultivieren
einer Nutzpflanze, welche ein herbizid-resistentes Gen enthält, das eine
Nukleinsäure, wie in Anspruch 46 definiert, in Gegenwart einer das Wachstum
kontrollierenden wirksamen Menge des Herbizides aufweist.
52. Inhibitor der Terpenbiosynthese ausgewählt aus der Gruppe chemischer
Substanzen, die Enzymhemmung gemäß dem Screening-Verfahren gemäß
einem der Ansprüche 20, 23, 26 oder 29 zeigen.
53. Zusammensetzung für die Hemmung der Terpenbiosynthese in Pflanzen,
Bakterien oder Protozoen, umfassend eine chemische Verbindung in einer für
eine Hemmung geeigneten Menge, wobei die Verbindung eine Hemmung in
dem Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20, 23, 26 oder 29
zeigt.
54. Verfahren für die Hemmung der Terpenbiosynthese in Pflanzen, Bakterien oder
Protozoen durch Behandlung mit einem Inhibitor gemäß Anspruch 52 oder
einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 53 in einer zur Hemmung
geeigneten Menge.
55. Umfassendes Verfahren zur Herstellung von Intermediaten der
Terpenbiosynthese abwärts von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat,
gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- a) Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat und Natriumpyruvat in Gegenwart eines Magnesiumsalzes, Thiaminpyrophosphat und Triosephosphatisomerase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase, um 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat herzustellen;
- b) Umsetzung der Reaktionsmischung aus Schritt (a) mit Glukose und NADP+ in Gegenwart eines Mg2+- oder Mn2+-Salzes, Glukose-6- phosphatdehydrogenase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase, um 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat herzustellen;
- c) Umsetzung der Reaktionsmischung aus Schritt (b) mit Cytidintriphosphat, dem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 und einem divalenten Metallsalz, um 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol herzustellen;
- d) optional Umsetzung der Reaktionsmischung, die in Schritt (c) erhalten wird, mit Adenosintriphosphat, einem divalenten Metallsalz und einem Protein gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, um 4-Diphosphocytidyl-2C- methyl-D-erythritol-2-phosphat herzustellen;
- e) optional Umsetzung der Reaktionsmischung, die in Schritt (d) erhalten wird, mit dem Protein gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, um 2C- Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat herzustellen;
- f) Isolierung des Produkts aus Schritt (c) oder Schritt (d) oder Schritt (e).
56. Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei die Stufen (a) bis (e) in einer
Eintopfreaktion ausgeführt werden.
57. Verfahren gemäß Anspruch 55 oder 56, wobei die Reaktionen bei einem pH in
einem Bereich von 7 bis 9 ausgeführt werden.
58. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 55 bis 57, wobei die Reaktionen bei
einer Temperatur von 30 bis 45°C ausgeführt werden.
59. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 55 bis 57, wobei ein Überschuss an
NADP+ verwendet wird, und Glukose und Glukose-6-phosphatdehydrogenase
in Schritt (b) eliminiert sind.
60. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 55 bis 57, wobei die Reaktionen in
Tris-HCl-Puffer ausgeführt werden.
61. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 55 bis 60, wobei Glukose in
Verbindung mit ATP und den glykolytischen Enzymen Hexokinase,
Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase und
Triosephosphatisomerase anstelle Dihydroxyacetonphosphat verwendet wird.
62. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 55 bis 61, wobei Phosphoenolpyruvat
und Pyruvatkinase in Schritt (d) von Anspruch 55 für die Regeneration von ATP
zugegeben werden.
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