MX2013014939A - Metodos para producir carbamoil fosfato y urea. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir carbamoil fosfato, el método comprende hacer reaccionar amoníaco, ATP, bicarbonato y CO2, o una forma hidratada del mismo, en una composición en la presencia de una carbamato cinasa, en donde el amoníaco y CO2, o forma hidratada del mismo, son convertidos a carbamato en una reacción química y el carbamato y ATP son convertidos a carbamoil fosfato en una reacción catalizada por enzima por la carbamato cinasa, y en donde el pH de la composición es aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12. La invención también se refiere a métodos para producir urea.

Description

METODOS PARA PRODUCIR CARBAMOIL FOSFATO Y UREA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para producir carbamoil fosfato, el método comprende hacer reaccionar amoniaco, ATP, bicarbonato y CO2, o una forma hidratada del mismo, en una composición en la presencia de una carbamato cinasa, en donde el amoniaco y C02, o forma hidratada del mismo, son convertidos a carbamato en una reacción química y el carbamato y ATP son convertidos a carbamoil fosfato en una reacción catalizada por enzima por la carbamato cinasa, y en donde el pH de la composición es aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12. La invención también se refiere a métodos para producir urea.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La urea es el fertilizante de nitrógeno más común y representa más de 50% del mercado de fertilizante en el mundo. Este fertilizante es actualmente manufacturado usando el proceso Bosch-Meiser de energía intensivo de amoníaco preparado usando el proceso Haber. El requerimiento para los grandes aportes de energía y gas natural en la producción de urea se ha enfocado en la producción de urea a regiones que tienen abundantes suministros de combustibles fósiles, como una consecuencia muchos países importan una proporción significante de su urea y los costos del transporte asociado son altos. La entrada de alta energía, dependencia del gas natural y altos costos de transporte también se acoplan al costo de fertilizantes de urea con los precios de combustibles fósiles, lo cual es sensible a fluctuaciones dependientes del suministro. Una consideración adicional para impactos futuros en el costo de fertilizantes de urea es la introducción propuesta del Esquema de Reducción de Contaminación de Carbono para ser puesto en marcha en 2015, debido a los costos asociados para emisiones de CO2 conectadas con la producción y transporte de fertilizantes.

La mayoría del nitrógeno aplicado como fertilizantes de urea se pierde en varias corrientes de residuos, que incluyen residuos municipales y animales. Estas corrientes de residuos contienen cantidades significantes de nitrógeno como nitratos, nitritos, amoníaco y compuestos de nitrógeno orgánico (aminoácidos y nucleótidos), los cuales deben ser removidos de la corriente residual para prevenir los efectos eutróficos (tales como floraciones bacterianas). El nitrógeno en los tratamientos de aguas residuales es finalmente perdido como óxidos de nitrógeno gaseoso (N20, un GHG potente, y NO) y nitrógeno (N2). Recielar el nitrógeno en estos sistemas podría: i) proporciona una baja energía, baja fuente de GHG de fertilizante de nitrógeno; ii) remover nitrógeno de corrientes de residuos, prevenir los efectos eutróficos de corriente descendente; y iii) reducir la producción de óxidos nitrosos. Adicionalmente, la producción de fertilizantes de urea obtenida nitrógeno de residuos recielados podría probablemente ser distribuida localmente, reduciendo los costos de transportación y la huella ambiental total del producto.

El ciclo de urea es el proceso etabólico a través del cual el nitrógeno es apropiadamente diseminado por una serie de cinco enzimas, destoxificando en amoníaco a urea excretada en animales y proporcionando intermediarios metabólicos nitrogenosos en otros organismos. La primera etapa en el ciclo de urea es la producción de carbamoil fosfato a partir de ácido carbónico, fósforo orgánico (ATP), y ya sea amoníaco o glutamato, por la enzima carbamoil fosfato sintetasa.

El amoníaco tiene un pKa de 9.25 y es por lo tanto amonio no amoníaco el que está principalmente disponible a pH biológico. En efecto 99.4% del amoníaco es protonado a pH 7. El ciclo de la urea es requerido para transformar carbamoil fosfato a urea debido a bajos niveles de amoníaco encontrados en la mayoría de los organismos (Jones and Lipman, 1960). El carbamoil fosfato sufre otras 4 transformaciones enzimáticas resultando finalmente en la formación de urea. Químicamente, estas etapas concurrentes podrían ser eliminadas con conversión de carbamoil fosfato a urea después del tratamiento con amoníaco.

El carbamoil fosfato es inestable a pH fisiológico y temperatura con una vida útil (ti/2) de 5 minutos (Wang et al., 2008). Debido a esta inestabilidad, sufre además transformación que proporciona citrulina, arginina, nucleótidos de pirimidina y urea. La descomposición térmica de carbamoil fosfato es evitada a través de la estabilización por transcarbamoilasas. El aspartato y ornitina transcarbamoilasa reducen la relación de descomposición térmica de carbamoil fosfato por un factor de 5,000. En solución ausente de transcarbamoilasas, el carbamoil fosfato se descompone vía un intermediario más plano (Alien and Jones, 1964). Esta geometría está prohibida en el sitio activo de aspartato y ornitina transcarbamoilasa y el carbamoil fosfato es de este modo estabilizado y capaz de ser transformado en productos de ureido estables.

El carbamoil fosfato es inestable en ambientes acuosos y se descompone fácilmente (Wang et al., 2008). La trayectoria a través de la cual ocurre la descomposición es dependiente del pH. Bajo hidrólisis ácida, ocurre descomposición a amonio, ortofosfato y dióxido de carbono (Alien and Jones, 1964), mientras el dianión, presente en condiciones alcalinas, se descompone a ortofosfato y cianato (Alien and Jones, 1964). La trayectoria de descomposición es importante para transformaciones subsecuentes ya que la sustitución de nitrógeno adicional no es posible con amoniaco y carbonato pero se sabe que ocurre fácilmente con cianato (Wen and Brooker, 1994). Por ejemplo, la formación de urea no ocurre cuando el carbonato es tratado con amoniaco, sin embargo se forma cuando el cianato es tratado con amoniaco y la producción de urea se incrementa con la concentración incrementada de amoniaco.

La inestabilidad de carbamoil fosfato se ha considerada impráctica como un intermediario comercial. De este modo, existe una necesidad de métodos para producir carbamoil fosfato, asi como también métodos para producir urea. Además, existe una necesidad de métodos para reducir niveles de amoniaco a partir de material residual.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han desarrollado un método de este modo el amoniaco puede ser convertido a carbamoil fosfato usando una enzima única.

De este modo, en un primer aspecto la presente invención proporciona un método para producir carbamoil fosfato, el método comprende hacer reaccionar amoniaco, ATP, bicarbonato y CO2, o una forma hidratada del mismo, en una composición en la presencia de una carbamato cinasa, en donde el amoniaco y CO2, o forma hidratada del mismo, son convertidos a carbamato en una reacción química y el carbamato y ATP son convertidos a carbamoil fosfato en una reacción catalizada por enzima por la carbamato cinasa, y en donde el pH de la composición es aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12.

En una modalidad preferida, el pH es aproximadamente 9.9, aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11, aproximadamente 9.25 hasta aproximadamente 11.25, aproximadamente 10.25 hasta aproximadamente 11.25, o aproximadamente 10.5 hasta aproximadamente 11.5. En esta modalidad se prefiere que la carbamato cinasa se derive de una bacteria hipertermófila, o sea un mutante del mismo biológicamente activo. Ejemplos de bacteria hipertermófila incluyen, pero no se limitan a, Pyrococcus sp. y Thermococcus sp. Ejemplos de Pyrococcus sp. incluyen, pero no se limitan a, Pyrococcus abyssi , Pyrococcus endeavori , Pyrococcus glycovorans , Pyrococcus horikoshii y Pyrococcus woesei . Ejemplos de Thermococcus sp. incluyen, pero no se limitan a, Thermococcus acídaminovorans , Thermococcus aegaeus, Thermococcus aggregans , Thermococcus alcaliphilus , Thermococcus atlanticus , Thermococcus barophilus , Thermococcus barossii , Thermococcus celer , Thermococcus celericrescens, Thermococcus chitonophagus , Thermococcus coalescens , Thermococcus fumicolans , Thermococcus gammatolerans , Thermococcus gorgonarius , Thermococcus guaymasensis , Thermococcus hydrothermalis , Thermococcus kodakarensis , Thermococcus litoralis , Thermococcus marinus, Thermococcus mexicalis , Thermococcus nautilus , Thermococcus onnurineus, Thermococcus pacificus, Thermococcus peptonophilus, Thermococcus profundus , Thermococcus radiotolerans , Thermococcus sibiricus , Thermococcus siculi, Thermococcus stetteri , Thermococcus thioreducens , Thermococcus waimanguensls , Thermococcus waiotapuensls y Thermococcus zilligii . Además, ejemplos de tales carbamato cinasas incluyen aquellas las cuales comprenden a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:l a 9, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:1 a 9, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

En otra modalidad, la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:4 a 9. b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:4 a c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

En una modalidad adicional, la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como SEC ID NOs:1, 8 o 9, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:l, 8 o 9, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

En una modalidad adicional, la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como SEC ID NO:8 o SEC ID NO:9, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica a una cualquiera o más de la SEC ID NO:8 o SEC ID NO:9, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

En las modalidades anteriores la temperatura es aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 100 °C. En una modalidad, la temperatura es aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 80 °C. En otra modalidad, la temperatura es aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60 °C. En otra modalidad, la temperatura es aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C.

En otra modalidad preferida, a pH 11 0·5 mM de carbamato cinasa producen al menos 0.5 pmol/min/mg, al menos 0.9 pmol/min/mg, o entre 0.5 y 3pmol/min/m, ADP después de treinta minutos de incubación en NaHCO3 (0.2 M), ATP (10 mM) y 20 mM NH¾OH a 40 °C.

En otra modalidad preferida, a pH 11.5 0.5 mM de carbamato cinasa producen al menos 0.25 pmol/min/mg, al menos 0.6 pmol/min/mg, o entre 0.25 y 2.5pmol/min/m, ADP después de treinta minutos de incubación en NaHC03 (0.2 M), ATP (10 mM) y 20 M NH4OH a 40 °C.

En una modalidad alterna, el pH es aproximadamente 9 hasta aproximadamente 10.5, o aproximadamente 9.5 hasta aproximadamente 10.5. En esta modalidad, se prefiere que la carbamato cinasa se derive de una bacteria termófila, o sea un mutante de la misma. Ejemplos de bacteria termófila incluyen, pero no se limitan a, Fervidobacterium sp. (por ejemplo, Fervidobacterium nodosum) , Thermosipho sp. (por ejemplo, Thermosipho melanesiensis) , Anaerobaculum sp. (por ejemplo, Anaerobaculum hydrogeniformans y Aminobacterium colombiense) , Thermanaerovibrio sp. (por ejemplo, Thermanaerovibrio acidaminovorans) , Halothermothrix sp. (por ejemplo, Halothermothrix orenii) , Kosmotoga sp. (por ejemplo, Kosmotoga olearia) y Moorella sp. (por ejemplo, Moorella thermoacetica ) . Ejemplos de tales carbamato cinasas incluyen aquellas las cuales comprenden a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:28 a 35, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:28 a 35, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b). Además, en una modalidad la temperatura es aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 60 °C, aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 60 °C, aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 40 °C, o es aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C. Además, en una modalidad a pH 10.50.5 mM de carbamato cinasa producen al menos 0.6 pmol/min/mg ADP después de treinta minutos de incubación en NaHCO3 (0.2 ), ATP (10 mM) y 200 mM NH4OH a 40 °C.

En una modalidad preferida, la carbamato cinasa mantiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80% de su actividad después del almacenaje por 1 año a 4°C y/o almacenaje por 60 horas a 40°C.

En una modalidad adicional, la presión es aproximadamente 0 hasta aproximadamente 350 MPa, o entre aproximadamente 1 atm y aproximadamente 10 atm.

En una modalidad, el método es realizado en un sistema continuo.

En una modalidad adicional, la carbamato cinasa es inmovilizada sobre un soporte sólido.

En aún otra modalidad, la fuente del amoniaco es material residual.

En una modalidad adicional, el método además produce uno o ambos de cianato y ácido ciánico a través de la descomposición de al menos algo del carba oil fosfato.

En una modalidad adicional, la carbamato cinasa es una proteina de fusión que comprende al menos otro polipéptido. Al menos otro polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que mejora la estabilidad de la carbamato cinasa, un polipéptido que promueve la secreción de la proteina de fusión a partir de una célula tal como una célula bacteriana o una célula de levadura, un polipéptido que ayuda en la purificación de la proteína de fusión y/o un polipéptido que ayuda en la unión del polipéptido a un soporte sólido.

La transformación in situ de carbamoil fosfato urea y/o otras mercancías transportables estables permiten el reemplazo de procesos comerciales intensivos de energía de corriente con trayectorias biológicas eficientes. De este modo, en un aspecto adicional la presente invención proporciona un método para producir un compuesto a partir de carbamoil fosfato, el método comprende i) realizar el método de la invención para producir carbamoil fosfato, y ii) realizar una o más reacciones adicionales para producir el compuesto.

Los presentes inventores contemplan un procedimiento simple para producir urea. Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida el compuesto es urea y la etapa ii) comprende hacer reaccionar el carbamoil fosfato producido de la etapa i) con amoniaco para producir urea vía un intermediario el cual es uno o ambos de cianato y ácido ciánico. El amoniaco puede ser que esté presente durante la etapa i) y/o se agrega amoniaco adicional durante la etapa ii).

En una modalidad, cuando se produce urea al menos la etapa ii) se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 90°C. Más preferiblemente, cuando se produce urea al menos la etapa ii) se realiza a una temperatura de aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 100 °C.

En una modalidad adicional, el método comprende i) realizar el método de la invención para producir carbamoil fosfato con la carbamato cinasa inmovilizada en un soporte sólido, ii) separar el carbamoil fosfato producido por la etapa i) a partir del soporte sólido, iii) unir el carbamoil fosfato a una resina, y iv) lavar la resina en una solución que comprende amoniaco para convertir el carbamoil fosfato vía un intermediario, el cual es uno o ambos de cianato y ácido ciánico, en urea.

La etapa iv) no solamente produce la urea sino también libera la molécula de la resina permitiendo a la urea ser recolectada en el material eluido de la resina.

En una modalidad, la etapa iv) se realiza a una temperatura de aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 100 °C.

En una modalidad adicional, el compuesto es un intermediario del ciclo de urea seleccionado de citrulina, argininosuccinato, arginina, ornitina y una combinación de dos o más de los mismos.

En otra modalidad, el método comprende realizar un método de la invención para producir uno o ambos de cianato y ácido ciánico, y hacer reaccionar el cianato, y/o ácido ciánico con un nucleófilo.

En una modalidad, el compuesto es una pirimidina. Ejemplos de pirimidinas incluyen, pero no se limitan a, uracilo, citosina o timina, o un derivado del mismo con uno, dos o tres grupos fosfato.

En una modalidad, el método es realizado en un recipiente único.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para reducir la concentración de amoníaco en un material residual, el método comprende realizar un método de la invención.

En una modalidad, el material residual está en agua.

Los presentes inventores también han identificado un polinucleótido el cual, cuando se expresa en una célula bacteriana, resulta en niveles superiores de producción de una carbamato cinasa que comprende una secuencia de aminoácido como se proporciona en la SEC ID N0:1 que el marco lector abierto nativo (SEC ID NO-.ll). De este modo, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que codifica una carbamato cinasa, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada como SEC ID NO:10. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que codifica una carbamato cinasa, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 o 36 a 43.

En una modalidad preferida, el polinucleótido está operablemente ligado a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula.

También proporcionado está un vector que comprende un polinucleótido de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedera o extracto de la misma que comprende un polinucleótido de la invención y/o un vector de la invención. Ejemplos de células hospederas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula vegetal. Preferiblemente, la célula hospedera es una célula bacteriana. En una modalidad, la célula bacteriana es una célula de E. coli . En una modalidad adicional, el método es realizado en un sistema libre de célula ya sea usando un extracto de una célula hospedera de la invención y/o el vector de la invención en un sistema libre de célula.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una carbamato cinasa, el método comprende cultivar una célula hospedera de la invención o un extracto de la misma que comprende el polinucleótido, o un vector de la invención, bajo condiciones las cuales permiten la expresión del polinucleótido que codifica la carbamato cinasa.

En una modalidad, el método produce al menos lOmg, más preferiblemente al menos 15mg, de carbamato cinasa a partir de un gramo de células.

En un aspecto adicional, se proporciona carbamoil fosfato producido usando un método de la invención.

También se proporciona un compuesto producido usando un método de la invención. Preferiblemente, el compuesto es urea, citrulina, argininosuccinato, arginina, ornitina, o una pirimidina.

Cualquier modalidad de la presente debe ser considerada para aplicarse mutatis mutandis a cualquier otra modalidad a menos que se declare específicamente de otro modo.

La presente invención no está limitada en el campo por las modalidades específicas descritas en la presente, las cuales están propuestas para el propósito de ejemplificación solamente. Productos funcionalmente equivalentes, compósíciones y métodos están claramente dentro del campo de la invención, como se describe en la presente.

A través de esta especificación, a menos que se decláre específicamente de otro modo o el contexto lo requiera de otro modo, referencia a una etapa única, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia, deben ser considerados por abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de aquellas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

La invención es posteriormente descrita por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A Descomposición del anión de carbamoil fosfato. IB Descomposición del dianión de carbamoil fosfato.

Figura 2. Análisis de soluciones estándares múltiples que contienen AMP ADP y ATP a concentraciones de: a) 0.2 mM; b) 0.4 mM; c) 0.6 mM; y d) 0.8 mM.

Figura 3. dependencia de pH de producción catalítica de Pfu CK (0.5 mM) ADP en NaHCO3 (0.2 M), ATP (10 mM) y NH4OH (¦= 200 mM, ¨ = 20 mM,? = 2 mM) a 40 °C.

Figura 4. Dependencia de temperatura de producción catalítica de Pfu CK de ADP en NaHC03 (0.2 M), ATP (10 mM) y NH4ÓH (20 mM) a pH 9.9.

Figura 5. Dependencia de pH de producción catalítica Pfu CK de ADP después de treinta minutos de incubación en NaHC03, ATP (10 mM) y NH4OH (200 mM y 20 mM) a 40 ÓC.

Figura 6. Comparación de integraciones de resonancias de carbón observadas en soluciones de amoníaco (2 M) y bicarbonato de sodio etiquetado con 13C (0.2 M) en agua, ajustada a pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 y 11.4.

Figura 7. dependencia de pH de producción catalítica CKs de ADP después de treinta minutos de incubación en NaHCO3, ATP (10 mM) y NH40H (200 mM y 20 mM) a 40 °C.

Figura 8. Dependencia de temperatura de producción catalítica de CKs de ADP en NaHC03 (0.2 M), ATP (10 mM) y NH4OH (200 mM) a pH 9.9.

Figura 9. Dependencia de temperatura de producción catalítica CKs de ADP en NaHC03 (0.2 M), ATP (10 mM) y NH4OH (200 mM) a pH 9.9.

Figura 10. Análisis de urea auténtica por a) XH NMR y b) 13C NMR, disuelta en DMSO.

Figura 11. Análisis del producto de urea después de la incubación de carbamoil fosfato (10 mg) en amoníaco acuoso (2.5M) a 100°C por 4 horas, a) XH NMR y b) 13C NMR, disuelto en DMSO.

Figura 12. Análisis del producto de urea después de la incubación de Pfu CK (0.5 mM) en una solución de bicarbonato de sodio (0.2 M), ATP (10 mM) y amoníaco acuoso (2.5M) a 100°C por 4 horas, a) 1H NMR y b) 13C NMR, disuelto en DMSO.

Figura 13. Alineación de algunas carbamato cinasas útiles para la invención. Solamente se muestran los aminoácidos los cuales varían de carbamato cinasa de P. furiosus .

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIA SEC ID NO:l - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Pyrococcus furiosus (Ref NCBI: NP_578405.1).

SEC ID NO:2 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Pyrococcus horikoshii (Ref NCBI: NP_143170).

SEC ID NO:3 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Pyrococcus abyssi (Ref NCBI: NP_126565.1).

SEC ID NO:4 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus sp. (Ref NCBI: ZP_04879925.1).

SEC ID NO:5 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus gamma tolerans (Ref NCBI: YP_002958486.1).

SEC ID NO:6 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus kodakarensis (Ref NCBI: YP_184571.1).

SEC ID NO:7 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus onnurineus (Ref NCBI: YP_002307889.1).

SEC ID NO:8 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus barophilus (Ref NCBI: YP_004071992.1).

SEC ID NO:9 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermococcus sibirícus (Ref NCBI: YP 002995234.1).

SEC ID NO:10 Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus furiosus .

SEC ID NO:11 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus furiosus (Ref NCBI: NC_003413).

SEC ID NO:12 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus horikoshii .

SEC ID NO:13 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus horikoshii (Ref NCBI: NCJ 00961).

SEC ID NO:14 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus abyssi .

SEC ID NO:15 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Pyrococcus abyssi (Ref NCBI: NC_000868).

SEC ID NO:16 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococc us sp. .

SEC ID NO:17 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus sp. (complemento inverso de Ref NCBI: NZ DS999059).

SEC ID NO:18 Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus gamma tolerans .

SEC ID NO:19 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus gammatolerans (Ref NCBI: NC_012804).

SEC ID NO:20 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus kodakarensis .

SEC ID NO:21 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus kodakarensis (Ref NCBI: NC_0Q6624).

SEC ID NO:22 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus onnurineus .

SEC ID NO:23 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus onnurineus (Ref NCBI: NC_011529).

SEC ID NO:24 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus barophilus.

SEC ID NO:25 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus barophilus (Ref NCBI: NC 014804).

SEC ID NO:26 Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus sibiricus .

SEC ID NO:27 - Secuencia de nucleótido que codifica la carbamato cinasa de Thermococcus sibiricus (Ref NCBI: NC_012883).

SEC ID NO:28 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Fervidobacteríum nodosum (Ref NCBI: A7HNY8).

; SEC ID NO:29 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermosipho melanesiensis (Ref NCBI: A6LPA8).

SEC ID NO:30 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Anaerobaculum hydrogeniformans (Ref NCBI: D3L0Z7).

SEC ID NO:31 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Aminobacterium colombiense (Ref NCBI: D5ECR9).

SEC ID NO:32 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Thermanaerovibrio acidamínovorans (Ref NCBI: D1B8A3).

SEC ID NO:33 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Halothermothrix orenii (Ref NCBI: B8D2J8).

; SEC ID NO:34 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Kosmotoga olearia (Ref NCBI: C5CE22).

SEC ID NO:35 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Moorella thermoacetica (Ref NCBI: Q2RGN0).

I SEC ID NO:36 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Fervidobacterium nodosum.

SEC ID NO:37 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermosipho melanesiensis .

SEC ID NO:38 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Anaerobaculum hydrogeniformans .

SEC ID NO:39 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Aminobacterium colombiense.

SEC ID NO:40 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Thermanaerovibrio acidaminovorans .

SEC ID NO:41 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Ha ix orenii .

I ¡ ID NO:42 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Kosmotoga olearia .

SEC ID NO:43 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Moorella thermoacetica .

\ SEC ID NO:44 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Enterococcus faecalis (Ref NCBI: P0A2X7).

SEC ID NO:45 - Secuencia de aminoácido de carbamato cinasa de Clostridium tetani (Ref NCBI: Q890W1).

SEC ID NO:46 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Enterococcus faecalis .

SEC ID NO:47 - Secuencia de nucleótido de codón optimizado que codifica la carbamato cinasa de Clostridium tetani .

SEC ID NO:48 y 49 - Cebadores de oligonucleótido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Teenicas Generales y Definiciones A menos que se especifica de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente deben ser considerados por tener el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, enzimología, producción de urea, química de proteína, y bioquímica).

A menos que se indique de otro modo, la proteína recombinante, cultivo celular, y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas son descritas y explicadas a través de la literatura en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wilcy and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" debe ser entendido por significar ya sea "X e Y" o "X o Y" y debe ser considerado para proporcionar soporte explícito para ambos significados o para cualquier significado.

Como se usa en la presente, el término aproximadamente, a menos que se declare lo contrario, se refiere a +/- 20%, más preferiblemente +/- 10%, más preferiblemente +/- 5%, del valor designado.

A través de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprenden", se entenderán por implicar la inclusión de un elemento declarado, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas.

Como se usa en la presente, un "termófilo" es un organismo, preferiblemente una bacteria, la cual puede sobrevivir a temperaturas de aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 70°C. Como se usa en la presente, un "hipertermófilo" es un organismo, preferiblemente una bacteria, la cual puede sobrevivir a temperaturas de aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 120°C.

Síntesis de Carbamoil Fosfato El carbamoil fosfato es un metabolito clave para transferencia en sistemas biológicos y es sintetizado por enzimas carbamoil fosfato sintetasa (CPS) y carbamato cinasa (CK). Pyrococcus furiosus (Pfu) CK (EC6.3.4.16) (SEC ID N0:1) fue originalmente clasificado como una CPS hasta que se descubrió que es cierto que el sustrato fue carbamato y que se usó solamente mole de ATP. Diferente a CPS, el cual produce enzimáticamente el carbamato el cual se vuelve a carbamoil fosfato, la Pfu CK se vuelve a carbamato formado químicamente de dióxido de carbono y amoníaco (Ecuación 1).

El equilibrio formado con amoníaco, dióxido de carbono y carbamato es ampliamente determinado por la relación de C02 a NH3 (Maní et al., 2006). Cuando cantidades iguales de amoniaco y CO2 están en solución, el bicarbonato de amonio es el producto primario (Ecuación 2). Si un exceso de amoniaco está disponible entonces el equilibrio favorece la formación de carbamato de amonio (Ecuación 3).

NH3 + co2 + H2O ¾=¾ NH4+ + HCO3- * .(293) - 3.63 x 105 (3) e Los presentes inventores han desarrollado un metodo donde el amoniaco puede ser convertido a carba oil fosfato en un proceso único. Una ventaja de este sistema es que puede ser realizado a tanto pH alto como a concentraciones bajas de amoniaco. El pH alto asegura que la mayoría del amoníaco no está en la forma de amonio, mientras la concentración relativamente baja de amoníaco hace al método adecuado para remover amoníaco a partir de fuentes tales como productos de aguas residuales y biológicos.

Los perfiles de índice-pH enzimáticos proporcionados en los Ejemplos indican la relación máxima de carbamato cinasa a aproximadamente pH 9.9 en la presencia de 2 mM, 20 mM y 200 mM de amoníaco. Esto es contrario a los resultados reportados por Durbecq et al. (1997). Es también aparente que a las concentraciones adecuadas de amoníaco, los niveles de pH más neutrales son actualmente perjudiciales parq la síntesis de carbamoil fosfato debido a reducciones asociadas en la disponibilidad del carba ato.

La estabilidad del producto es también afectada por el pH. El carbamoil fosfato es inestable en ambientes acuosos y fácilmente se descompone (Wang et al., 2008). La trayectoria a través de la cual ocurre la descomposición es dependiente del pH. El anión, presente de pH 2 a 4, se descompone a amoníaco, carbonato y fosfato (Figura 1A), mientras el dianión, presente en condiciones alcalinas, se descompone a fosfato y cianato (Figura IB). La trayectoria de descomposición es importante para transformaciones subsecuentes ya que la sustitución de nitrógeno adicional no es posible con amoníaco y carbonato pero se sabe que ocurre fácilmente con cianato (Wen and Brooker, 1994). Por ejemplo, la formación de urea no ocurre cuando el carbonato es tratado con ‘amoniaco, sin embargo se forma cuando uno o más de cianato y ácido ciánico es tratado con amoníaco y la producción de urea incrementa con la concentración incrementada de amoníaco.

Preferiblemente, la concentración de amoníaco en la reacción para producir carbamoil fosfato es al menos aproximadamente 1 mM. En una modalidad, la concentración de amoníaco es aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 M. En otra modalidad, la concentración de amoníaco es aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 2 M. Cuando altas concentraciones de amoníaco están presentes, la urea puede ser formada de carbamoil fosfato a través de un intermediario como se describe en la presente.

En una modalidad, la concentración de ATP es al menos aproximadamente O.lmM. En otra modalidad, la concentración de ATP es aproximadamente O.lmM hasta aproximadamente lOOmM. En una modalidad adicional, la concentración de ATP es aproximadamente lmM hasta aproximadamente 20mM. En aún otra modalidad, la concentración de ATP es aproximadamente lOmM.

En una modalidad, el bicarbonato se proporciona como bicarbonato de sodio. En una modalidad, la concentración de bicarbonato es al menos aproximadamente lOmM. En otra modalidad, la concentración de bicarbonato es aproximadamente lOmM hasta aproximadamente 1M. En una modalidad adicional, la concentración de bicarbonato es aproximadamente lOOmM hasta aproximadamente 500mM. En aún otra modalidad, la concentración de bicarbonato es aproximadamente 200mM.

Dependiendo de la temperatura una enzima específica puede ser tolerada, la reacción puede ser realizada a un intervalo de temperaturas que incluyen aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 100 °C. En una modalidad, la temperatura es aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 80 °C. Sin embargo, en algunas circunstancias puede ser más económico y/o práctico (tal como cuando se usa amonio/amoniaco en agua residual) para realizar la reacción a una temperatura inferior que la temperatura óptima de la enzima, tal como aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C. Para ciertas enzimas, tales como aquellas proporcionadas como SEC ID NOs 1 a 9 a temperaturas superiores, tales como aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 100 °C, y en la presencia de niveles suficientes de amoniaco, producirá urea.

En otra modalidad, la carbamato cinasa mantiene al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, o al menos 60% de su actividad máxima a pH 10.5, 11 o 11.5. Esto puede ser determinado, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 5 usando una concentración de NH4OH de 20mM o 20Om .

La invención puede ser usada para remover, o al menos reducir la concentración de, amoniaco de agua, tal como material de agua residual. Por ejemplo, el residuo puede ser derivado de procesos agrícolas o industriales. En una modalidad, el material residual está en un líquido tal como agua a partir de una presa o una corriente. En otra modalidad, el material residual es aguas negras o de alcantarillado, particularmente que comprenden residuos humanos y/o animales. En otra modalidad, el material residual es un gas tal como un gas de escape En una modalidad, el material residual está en un liquido el cual es clarificado para remover los sólidos suspendidos. La clarificación puede llevarse a cabo usando equipo convencional tal como un clarificador de escape, un filtro de pulido, etc.

Síntesis de Urea Dos diferentes trayectorias han sido propuestas para la conversión de amonio y cianato (por ejemplo) en urea. La primera es a través de un mecanismo iónico NH4+ + NCO CO (NH2)2 y la otra es un mecanismo no iónico con la reacción de amoníaco y ácido ciánico NH3 + HNCO CO(NH2)2. La evidencia más convincente de la cual este mecanismo actual fue reportado por Wen y Brooker (1994). Reportaron que la relación de reacción de cianato a urea fue directamente proporcional a la concentración de amonio en lugar de amoníaco el cual soporta un mecanismo iónico.

El carbamoil fosfato producido usando los métodos de la invención puede ser usado para sintetizar urea. El amoníaco es requerido para la reacción, el cual es en general realizado a una alta temperatura de al menos aproximadamente 90°C.

En una modalidad, la urea es producida en recipiente único, preferiblemente en un sistema continuo.

En una modalidad alterna, la urea se produce en un número de etapas. Por ejemplo, mientras el CK es funcional a temperaturas arriba de 90°C (por ejemplo 90°C a 100°C), la producción de carbamoil fosfato es típicamente más eficiente a temperaturas inferiores (por ejemplo aproximadamente 60°C). El un ejemplo, el carbamoil fosfato se produce de conformidad con la invención con la enzima inmovilizada en un soporte sólido. El carbamoil fosfato producido es entonces separado a partir del soporte sólido, por ejemplo por el soporte sólido estando en la forma de una columna y el carbamoil fosfato siendo eluido de la columna. El carbamoil fosfato eluido puede entonces ser unido a una resina adecuada seguida lavando la resina en una solución que comprende amoníaco para convertir el carbamoil fosfato vía un intermediario como se define en la presente en urea. Esto no solamente produce la urea sino también libera la molécula de la resina permitiendo a la urea ser recolectada en el material eluido de la resina.

Las resinas adecuadas para la invención incluyen resinas mono- o di-aniónicos, tales como aquellas usadas para la remoción de fosfato a partir de agua residual y suciedad. Ejemplos incluyen KFR-3tT-40, SBS-3 y Amberlite IRA-400 (Rohm & Haas).

Preferiblemente, la concentración de amoniaco en la reacción para producir urea es al menos aproximadamente 2.5M. En una modalidad, la concentración de amoniaco es aproximadamente 2.5M hasta aproximadamente 40M. En otra modalidad, la concentración de amoníaco es aproximadamente 2.5M hasta aproximadamente 10M.

Carbamato Cinasas Como se usa en la presente, una "carbamato cinasa" o "CK" es una enzima capaz de convertir carbamato a carbamoil fosfato. En los métodos de la invención, amoniaco y C02, o forma hidratada del mismo, son convertidos a carbamato en una reacción química, y el carbamato y ATP resultantes son convertidos a carbamoil fosfato en una reacción catalizada por enzima por la carbamato cinasa. Una carbamato cinasa usada en los métodos de la invención puede o no puede tener alguna actividad de carbamoil fosfato sintetasa (CPS), y de este modo ser capaz de síntesis de carbamoil fosfato irreversiblemente a partir de amoníaco, bicarbonato y ATP en tres etapas. En una modalidad preferida, la carbamato cinasa no tiene actividad de CPS.

Los términos "polipéptido", "proteína" y "carbamato cinasa" son en general usados de manera intercambiable y se refieren a una cadena de polipéptido única la cual puede o no puede ser modificada por adición de grupos no aminoácidos. Podrá entenderse que tales cadenas de polipéptido pueden asociarse con otros polipéptidos o proteínas u otras moléculas tales como co-factores. Los términos "proteínas", "polipéptidos", "carbamato cinasa" como se usan en la presente también incluyen variantes, mutantes, fragmentos biológicamente activos, modificaciones, análogos y/o derivados de los polipéptidos descritos en la presente.

El % de identidad de un polipéptido es determinado por análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización de creación de hueco =5, y una penalización de extensión de hueco =0.3. La secuencia de consulta es al menos de 25 aminoácidos en longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 25 aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos de 50 aminoácidos en longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos de 100 aminoácidos en longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos de 250 aminoácidos en longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Aún más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos de 300 aminoácidos en longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 aminoácidos. Aún más preferiblemente, el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre su longitud completa.

Como se usa en la presente un "fragmento biológicamente activo" es una porción de un polipéptido como se describe en la presente la cual mantiene la capacidad para convertir carbamato y ATP en carbamoil fosfato. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser de cualquier tamaño en la medida en que mantengan la actividad definida. Preferiblemente, los fragmentos biológicamente activos son de al menos 200, más preferiblemente al menos 300, aminoácidos en longitud.

Con respecto a un polipéptido definido, se apreciará que las figuras de % de identidad superior que aquellas proporcionadas anteriormente abarcarán modalidades preferidas. De este modo, donde sea aplicable, envista de las figuras de % de identidad mínimo, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácido la cual es al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.1%, más preferiblemente al menos 99.2%, más preferiblemente al menos 99.3%, más preferiblemente al menos 99.4%, más preferiblemente al menos 99.5%, más preferiblemente al menos 99.6%, más preferiblemente al menos 99.7%, más preferiblemente al menos 99.8%, y aún más preferiblemente al menos 99.9% idéntica a la SEC ID NO. nominada relevante.

Los mutantes de la secuencia de aminoácido de un polipéptido descrito en la presente pueden ser preparados introduciendo cambios de nucleótido apropiados en un ácido nucleico definido en la presente, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácido. Una combinación de supresión, inserción y sustitución puede hacerse para llegar al constructo final, siempre que el producto de polipéptido final posea las características deseadas.

Los polipéptidos mutantes (alterados) pueden ser preparados usando cualquier téenica conocida en el arte. Por ejemplo, un polinucleótido descrito en la presente puede ser sometido a mutagénesis in vitro. Tales téenicas de mutagénesis in vitro pueden incluir sub-clonar el polinucleótido en un vector adecuado, transformar el vector en una cepa "mutadora" tal como la E. coli XL-1 roja (Stratagene) y propagar la bacteria transformada por un número adecuado de generaciones. En otro ejemplo, los polinucleótidos descritos en la presente (por ejemplo dos o más de las SEC ID NOs 10 a 27 o 36 a 43) son sometidos a técnicas de transposición de ADN como de describe ampliamente por Harayama (1998). Los productos derivados de ADN alterado/mutado pueden fácilmente ser seleccionados usando técnicas descritas en la presente para determinar si tienen actividad de carbamato cinasa.

En el diseño de mutantes de secuencia de aminoácido, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de la(s) característica (s) a ser modificadas. Los sitios para mutación pueden ser modificados individualmente o en series, por ejemplo, mediante (1) sustituyendo primero con elecciones de aminoácido conservativo y después con más selecciones de radical dependiendo de los resultados logrados, (2) suprimiendo el residuo objetivo, o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio localizado.

Las supresiones de secuencia de aminoácido en general variarán desde aproximadamente 1 a 15 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de polipéptido removida y un diferente residuo insertado en su lugar. Los sitios de interés son aquellos en los cuales los residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies son idénticos. Estas posi iones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, especialmente aquellos que caen dentro de una secuencia de al menos tres de otros sitios idénticamente conservados, son probablemente sustituidos en una manera relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1.

En una modalidad preferida un polipéptido mutante/variante tiene uno o dos o tres o cuatro cambios de aminoácido conservadores cuando se compara con un polipéptido que se origina naturalmente, o hasta 10 o 15 o 20 cambios de aminoácido con relación a una secuencia de referencia tal como, por ejemplo, las SEC ID NOs: 1 a 9 o 28 a 35. Detalles de cambios de aminoácido conservadores son proporcionados en la Tabla 1. Como la persona experta podría ser consciente, tales cambios menores pueden razonablemente ser pronosticados no para alterar la actividad del polipéptido cuando se expresan en una célula recombinante.

Tabla 1. Sustituciones ejemplares La estructura cristalina del CK de P. furiosus (SEC ID N0:1), y relaciones de estructura/función, ha sido descrita por Ramon-Maiques et al. (2000). Sus estudios discüten como la estructura se refiere a su termoestabilidad asi como también a como la estructura del sitio activo se refiere a su función. Fueron capaces de concluir que la termoestabilidad de la enzima puede resultar de la extensión de los contactos inter-subunidades hidrofóbicas y del gran número de pares iónicos expuestos, y la velocidad lenta a 37°C que es posiblemente una consecuencia de disociación de producto lento. Ramon-Maiques et al. (2000) atribuye la disociación de producto lento a la fuerte enlace del anillo purina el cual es "intercalado entre Met274 y TYR244" y también al enlace de los átomos de oxigeno de His268 y Ala241 que forman enlaces de hidrógeno con adenina NH2 y NH de Ala241 haciendo otro enlace de hidrógeno en adenina NI. Declara que estos enlaces deben resultar en un alto grado de especificidad de la enzima para nucleótidos de adenina. Además, la porción carbamoilo interactúa con 10Gly-Gly-Asn y 52Gly-Asn-Gly, y la transferencia de fosforilo involucra los residuos de lisina completamente conservados, Lysl31, Lys215 y Lys277 (Ramon-Maiques et al., 2000), todos los cuales son conservados en las enzimas probadas en el Ejemplo 5. Además, Asp65 y Tyr71 definen interacciones relacionadas de simetría de 2 partes entre hélices alfa beta, mientras Gln94 participa en la extensión de la red de enlaces de hidrógeno. Asp65 es conservado en todos los Thermococci analizados. El residuo cargado es convertido a través de todas las carbamato cinasas probadas como glutamato o aspartato. El número de aminoácido 71 de P. furiosus CK es tirosina o histidina en todos los Thermococci pero no está presente en las otras carbamato cinasas probadas. El número de aminoácido 94 de CK de P. furiosus es glutamina o glicina en el Thermococci, y una alanina o glutamina en las otras carbamato cinasas probadas. Como la persona experta podría estar consciente, estudios tales como aquellos por Ramon-Maiques et al. proporcionan guía considerable para el diseño de variantes funcionales de CKs que se originan naturalmente útiles para la invención.

Como la persona experta apreciará, los polipeptidos descritos en la presente (por ejemplo aquellos con una secuencia proporcionada en dos o más de las SEC ID NOs: 1 a 9 o 28 a 35) pueden ser alineados para ayudar en el diseño de enzimas mutantes/variantes (véase, por ejemplo, Figura 13). Preferiblemente, aminoácidos altamente conservados se mantienen, o posiblemente se sustituyen en una manera conservativa (véase Tabla 1). En una modalidad adicional, si un aminoácido de una proteína es alterado, es sustituido con un aminoácido encontrado en una posición correspondiente de otra; carbamato cinasa tal como una de estas proporcionada como SEC ID NOs: 1 a 9 o 28 a 35.

Además, si se desea, aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos químicos pueden ser introducidos como una sustitución o adición en un polipéptido descrito en la presente. Tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutirico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutirico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutirico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñadores tales como b-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos, y análogos de aminoácido en general.

También incluidos dentro del campo de la invención están polipéptidos los cuales son diferencialmente modificados durante o después de la síntesis, por ejemplo, por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de bloqueo/protectores conocidos, desdoblamiento proteolítico, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc.· Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido.

Polipéptidos descritos en la presente pueden ser producidos en una variedad de formas, que incluyen producción y recuperación de polipéptidos naturales, producción y recuperación de polipéptidos recombinantes, y síntesis química de los polipéptidos. En una modalidad, la enzima es producida cultivando una célula capaz de expresar el polipéptido bajo condiciones efectivas para producir el polipéptido, y recuperar el polipéptido. Una célula para cultivo preferida es una célula recombinante como se define en la presente. Condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, medio efectivo, biorreactor, temperatura, condiciones de pH y oxígeno que permiten la producción del polipéptido. Un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el cual una célula es cultivada para producir el polipéptido. Tal medio típicamente comprende un medio acuoso que tiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Las células pueden ser cultivadas en biorreactores de fermentación convencional, matraces sacudidos, tubos de ensayo, cajas microtituladoras, y placas de petri. La cultivación se puede llevar a cabo a temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiado para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivación están dentro de la experiencia de uno de habilidad ordinaria en la téenica. En una modalidad alterna, los polipéptidos descritos en la presente pueden ser producidos en un sistema libre de célula. Los sistemas libres de células típicamente comprenden una mezcla de reacción que comprende extractos biológicos y/o reactivos definidos. La mezcla de reacción comprenderá una plantilla para producción del polipéptido, por ejemplo, ADN, ARNm, etc.; aminoácidos, enzimas y otros reactivos que son necesarios para la síntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt, polimerasas, factores transcripcionales, etc. Por ejemplo, el extracto biológico puede ser de una célula de E. colí, Thermococcus sp. o Pyrococcus sp. que produce el polipéptido. Tales sistemas de reacción sintéticos son bien conocidos en la téenica, y han sido descritos en la literatura. La reacción de síntesis libre de célula puede ser realizada como lote, flujo continuo, o flujo semi-continuo, como se muestra en la técnica.

En una modalidad, la enzima comprende una secuencia de señal la cual es capaz de dirigir la secreción del polipéptido a partir de una célula. Un gran número de tales secuencias de señal han sido aisladas, los cuales incluyen secuencias de señal N- y C-terminal. Las secuencias de señal N-termina procarióticas y eucarióticas son similares, y se ha mostrado que las secuencias de señal N-terminal eucarióticas son capaces de funcionar como secuencias de secreción en la bacteria. Un ejemplo de tal secuencia de señal N-terminal es la secuencia de señal de b-lactamasa bacteriana, la cual es una secuencia bien estudiada, y ha sido ampliamente usada para facilitar la secreción de polipéptidos en el ambiente externo. Un ejemplo de secuencias de señal C-terminales son las secuencias de señal de hemolisina A (hlyA) de E. coli . Ejemplos adicionales de secuencias de señal incluyen, sin limitación, aerolisina, gen de fosfatasa alcalina (phoA), quitinasa, endoquitinasa, oí-hemolisina MIpB, pululanasa, Yops y un péptido de señal TAT.

Polinucleótidos Por un "polinucleótido aislado", que incluye ADN, ARN, o una combinación de estos, de hebra sencilla o doble, en la orientación sentido o antisentido o una combinación de ambos, dsARN o de otro modo, significan un polinucleótido el cual es al menos parcialmente separado de las secuencias de polinucleótido con las cuales está asociado o ligado en su estado nativo. Preferiblemente, el polinucleótido aislado es al menos 60% libre, preferiblemente al menos 75% libre, y muy preferiblemente al menos 90% libre de otros componentes con los ;cuales están naturalmente asociados. Además, el término "polinucleótido" es usado intercambiablemente en la presente con el término "ácido nucleico".

; El término "exógeno" en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido cuando se presenta en una célula, o en un sistema de expresión libre de célula, en una cantidad alterada comparado con su estado nativo. En una modalidad, la célula es una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. Sin embargo, la célula puede ser una célula la cual comprende un polinucleótido no endógeno que resulta en una cantidad alterada, preferiblemente incrementada, de producción del polipéptido codificado. Un polinucleótido exógeno de la invención incluye polinucleótidos los cuales no han sido separados de otros componentes de la célula transgénica (recombinante), o sistema de expresión libre de célula, en el cual está presente, y polinucleótidos producidos en tales células o sistemas libres de células los cuales son subsecuentemente purificados de al menos algunos otros componentes.

Polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas proporcionadas junto con estas, una o más mutaciones las cuales son supresiones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótido. Los mutantes pueden ser ya sea que se originan naturalmente (es decir, aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, realizando mutagénesis de sitio dirigido en el ácido nucleico).

Usualmente, los monómeros de un polinucleótido están ligados por enlaces fosfodiésteres o análogos de los mismos. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato y fosfora idato.

Vectores Recombinantes Una modalidad de la presente invención incluye un vector recombinante, el cual comprende al menos un polinucleótido aislado/exógeno de la invención insertado en cualquier vector capaz de suministrar la molécula de polinucleótido en una célula hospedera. Vectores recombinantes también pueden ser usados para producir una carbamato cinasa útil para la invención, por ejemplo un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs: 10 a 27 o 36 a 43, o una secuencia de nucleótido al menos 50% idéntica a una O más de las mismas. Tal vector contiene secuencias de polinucleótido heterólogas, es decir secuencias de polinucleótido que no son naturalmente encontradas adyacentes a las moléculas de polinucleótido que codifican una carbamato cinas;a y que preferiblemente son derivadas de especies distintas de las especies a partir de las cuales el(las) molécula (s) de polinucleótido se derivan. El vector puede ser ya sea ARN o ADN, ya sea procariótico o eucariótico, y típicamente es un transposón (tal como se describe en el documento US 5,792,924), un virus o un plásmido.

Un tipo de vector recombinante comprende el(los) polinucleótido(s) operablemente ligados a un vector de expresión. La frase operablemente ligado se refiere a la inserción de una molécula de polinucleótido en un vector de expresión en una manera tal que la molécula es capaz de ser expresada cuando es transformada en una célula hospedera. Como se usa en la presente, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula hospedera y de efectuar la expresión de una molécula de polinucleótido especificada. Preferiblemente, el vector de expresión es también capaz de replicarse dentro de la célula hospedera. Vectores de expresión pueden ser ya sea procarióticos o eucarióticos, y son típicamente virus o plásmidos. Los vectores de expresión incluyen cualquiera de los vectores que funcionan (es decir, dirigen la expresión del gen) en células recombinantes, que incluyen células bacterianas, fúngicas, endoparásitas, artrópodas, animales y vegetales. Los vectores de la invención también pueden ser usados para producir el polipéptido en un sistema de expresión libre de célula, tales sistemas son bien conocidos en la téenica.

"Operablemente ligado" como se usa en la presente se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de elementos reguladores transcripcionales a una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está operablemente ligado a una secuencia codificante, tal como un polinucleótido definido en la presente, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedera apropiada y/o en un sistema de expresión libre de célula. En general, los elementos reguladores transcripcionales promotores que son operablemente ligados a una secuencia transcrita son físicamente contiguos a la secuencia transcrita, es decir, están cis-actuando . Sin embargo, algunos elementos reguladores transcripcionales, tales como intensificadores, no necesitan ser físicamente continuos o localizados en proximidad cercana a las secuencias codificantes cuya transcripción pueden mejorar.

En particular, vectores de expresión contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de las moléculas de polinucleótido. En particular, las moléculas recombinantes incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias las cuales controlan el inicio, elongación y terminación de la transcripción. Particularmente importante las secuencias de control de la transcripción son aquellas las cuales controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, intensificadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes descritas en la presente. Una variedad de tales secuencias de control de la transcripción se conocen por aquellos expertos en la téenica. Las secuencias de control de la transcripción preferidas incluyen aquellas las cuales funcionan en células bacterianas, levadura, artrópodo, nemátodo, vegetal o animal, tales como pero no limitadas al, tac, lac, trp, trc, oxi-pro, omp/lpp, rrnB, bacteriófago lambda, bacteriófago T7, T71ac, bacteriófago T3, bacteriófago SP6, bacteriófago SP01, metalotioneina, factor de apareamiento alfa, alcohol oxidasa de Pichia, promotores subgenómicos de alfavirus (tales como promotores subgenómicos del virus Sindbis), gen de resistencia al antibiótico, baculovirus, virus de insecto Heliothis zea, virus vaccinia, virus del herpes, virus de la viruela del mapache, otros virus de la viruela, adenovirus, citoraegalovirus (tales como promotores tempranos intermediarios), virus de simio 40, retrovirus, actina, repetición terminal larga retroviral, virus de sarcoma Rous, golpe de calor, secuencias de control de transcripción de fosfato y nitrato asi como también otras secuencias capaces de controlar la expresión del gen en células procarióticas o eucarióticas.

Células Hospederas Otra modalidad de la presente invención incluye una célula hospedera, o el uso de una célula hospedera, transformada con una o más moléculas recombinantes descritas en la presente o células de progenie de las mismas. La transformación de una molécula de polinucleótido en una célula puede ser realizada por cualquier método por el cual una ;molécula de polinucleótido puede ser insertada en la célula. Las téenicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, lipoifección, adsorción, y fusión de protoplasto. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano u organismo multicelular. Las moléculas de polinucleótido transformadas pueden permanecer extracromosomales o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recómbinante) en tal manera que se logra su capacidad para ser expresada.

Células hospederas adecuadas transformación incluyen cualquier célula que puede ser transformada con un polinucleótido definido en la presente. Las células hospederas ya sea pueden ser endógenamente (es decir, naturalmente) capaces de producir polipéptidos descritos en la presente o pueden ser capaces de producir tales polipéptidos después de ser transformados con al menos una molécula de polinucleótido como se describe en la presente. Las células hospederas pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una proteina definida en la presente, e incluye células bacterianas, fúngicas (que incluyen levadura), parásitas, nemátodas, artrópodas, animales y vegetales. Ejemplos de células hospederas incluyen células de Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichoplusia, BHK (riñón de hámster bebéj, células MDCK, células CRFK, células CV-1, células COS (por ejemplo, COS-7), y células Vero. Ejemplos adicionales de células hospederas son E. coli, que incluyen derivados de E. coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, que incluyen cepas atenuadas; Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; y células G8 de mioblasto de ratón no tumorigénico (por ejemplo, ATCC CRL 1246). Células de levadura útiles incluyen Pictiia sp. , Aspergillus sp. y Saccharomyces sp. Células hospederas particularmente preferidas son células bacterianas, células de levadura o células vegetales.

Las teenologías de ADN recombinante pueden ser usadas para mejorar la expresión de una molécula de polinucleótido transformada por manipulación, por ejemplo, el número de copias de la molécula de polinucleótido dentro de célula hospedera, la eficiencia con la cual estas moléculas de polinucleótido son transcritas, la eficacia con la cual los transcriptos resultantes son traducidos, y la eficacia de las modificaciones post-traduccionales. Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de moléculas de polinucleótido incluyen, pero no se limitan a, moléculas de polinucleótido operativamente enlazantes a plásmidos de alto número de copias, integración de la molécula de polinucleótido en una o más cromosomas de células hospederas, adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, intensificadores), sustituciones o modificaciones de las señales de control traduccional (por ejemplo, sitios de : unión del ribosoma, secuencias Shine-Dalgarno), modificación de moléculas de polinucleótido para corresponder al empleo de codón de la célula hospedera (véase, por ejemplo, SEC ID NOs:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 o 36 a 43), y la supresión de secuencias que desestabilizan los transcriptos.

Composiciones Composiciones útiles para la invención incluyen excipientes, también referidos en la presente como "portadores aceptables". Ejemplos de tales excipientes incluyen agua, salina, solución Ringer, solución de dextrosa, solución Hank, y otras soluciones de sal fisiológicamente balanceadas acuosas. Vehículos no acuosos, tales como aceites fijos, aceite de sésamo, oleato de etilo o triglicéridos también pueden ser usados. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes que mejoran la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Los excipientes también pueden contener cantidades menores de derivados, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química. Ejemplos de amortiguadores incluyen amortiguador de fosfato, amortiguador de bicarbonato y amortiguador Tris, mientras, los ejemplos de preservativos incluyen timerosal u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Lo excipientes también pueden ser usados para incrementar la vida útil de una composición, por ejemplo, pero no estando limitado a, vehículos de liberación controlada poliméricos, implantes biodegradables, liposomas, bacterias, virus, otras células, aceites, ésteres, y glicoles.

En una modalidad, la carbamato cinasa es inmovilizada sobre un soporte sólido. Esto puede mejorar la producción de carbamoil fosfato, y/o incrementar la estabilidad del polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido puede ser inmovilizado en una matriz de poliuretano (Gordon et al., 1999), o encapsulado en liposomas apropiados (Petrikovics et al., 2000a y b). El polipéptido también puede ser incorporado en una composición que comprende una espuma tal como aquella usada rutinariamente en extinción de fuego (LeJéune et al., 1998). Como podría ser apreciado por el destinatario experto, la carbamato cinasa puede ser fácilmente usada en una esponja o espuma como se describe en el documento WO 00/64539. Otros soportes sólidos útiles para la invención incluyen resinas con una estructura de tipo acrilico, con grupos epoxi funcionales, tales como Sepabeads EC-EP (Resindion srl— Mitsubishi Chemical Corporation) y Eupergit C (Rohm-Degussa), o con grupos amino primario, tales como Sepabeads EC-has y EC-EA (Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation). En cualquier caso, el polipéptido es llevado en contacto con el soporte sólido e inmovilizado a través de la alta reactividad de los grupos funcionales (epóxidos) o activación del soporte con un agente bifuncional, tal como glutaraldehido, para asi unir la enzima a la matriz. Otros soportes adecuados para la invención son resinas de poliestireno, resinas macroreticulares y resinas con grupos funcionales básicos, tales como Sepabeads EC-Q1A, el polipéptido es absorbed en la resina y después estabilizado por reticulación con un agente bifuncional (glutaraldehído).

En una modalidad, la composición está en la forma de una combinación de liberación controlada que es capaz de liberar lentamente la composición en el ambiente (que incluye muestras de suelo y agua). Como se usa en la presente, una formulación de liberación controlada comprende un vehículo de liberación controlada. Los vehículos de liberación controlada adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones de bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, liposferas, y sistemas de suministro transdermal. Las formulaciones de liberación controlada preferidas son biodegradables (es decir, bioerosionables).

La concentración de la enzima dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra a ser descontaminada, la concentración de amoníaco en la muestra, y la formulación de la composición. La concentración efectiva de la enzima dentro de la composición puede ser fácilmente determinada experimentalraente usando un método de la invención.

Usos Carbamoil fosfato La transformación de carbamoil fosfato químicamente o biológicamente in situ, da origen a materias primas valiosas. El carbamoil fosfato puede ser usado para producir urea como se resume en la presente.

El carbamoil fosfato puede ser transformado en un arreglo de derivados de carbamoilo ya que actuarán con nucleófilos a través de un intermediario tal como cianato y/o ácido ciánico. Los alcoholes reaccionarán con cianato para formar carbamatos (Love and Kormendy, 1963). Por ejemplo, el grupo funcional de alcohol a partir de fenol reaccionará con carbamoil fosfato para formar fenil carbamato, el cual es un precursor sintético comúnmente usado a derivados de urea (Xiaó et al., 1997). De manera similar, el carbamoil fosfato puede reaccionar con tioles resultando en la producción de carbamotioatos, los cuales son ampliamente usados como herbicidas (Wootton et al., 1993). El carbamoil fosfato puede también ser usado para introducir la funcionalidad urea en los péptidos.

El reemplazo de enlaces amida con sustituyentes de urea ha sido de interés y estos péptidos no naturales han sido1 estudiados como inhibidores de proteasa del V1H (Kempf et al., 1991), así como también miméticos de proteína de giro-b (Nowick et al., 1995).

El carbamoil fosfato ha sido mostrado por tener un efecto profiláctico y posiblemente terapéutico en caries dentales. Se ha descubierto que el carbamoil fosfato y otros compuestos de carbamato tienen un efecto saludable en la estabilización o crecimiento del tejido del hueso y densidad ósea (documento US 20030096741).

El carbamoil fosfato puede ser cualquier fuente de energía para reacciones (documento US 20020168706).

El carbamoil fosfato, cuando reacciona con ácido aspártico, puede ser usado para formar uridina-5'-monofosfato (documento US 20020058244).

Las pirimidinas, nucleósidos de pirimidina, y nucleótidos de pirimidina son sintetizados de ácido aspártico y carbamoil fosfato (derivado de glutamina y CO2) por medio de úna trayectoria de etapas múltiples (véase O'Donovan and Neuhard, 1970).

La citrulina, formada bioquímicamente de carbamoil fosfato en el ciclo de urea, es usada como un farmacéutico para el tratamiento de enfermedades cardíacas (Barr et al., 2007) .

Urea Más del 90% de la producción de urea del mundo se usa como un fertilizante de liberación de nitrógeno. La urea tiene el contenido de nitrógeno más alto de todos los fertilizantes nitrogenosos sólidos en uso común. Muchas bacterias del suelo poseen la enzima, ureasa, la cual cataliza la conversión de la molécula de urea a dos moléculas de aminoácido y una molécula de dióxido de carbono, de este modo los fertilizantes de urea son muy rápidamente transformados a la forma de amonio en el suelo. El amoniaco y nitrato son fácilmente absorbido por las plantes, y son las fuentes dominantes de nitrógeno para el crecimiento vegetal. La urea es altamente soluble en agua y es, por lo tanto, también muy bien adecuada para uso en soluciones fertilizadoras (en combinación con nitrato de amonio), por ejemplo, en fertilizantes de "alimentación foliar". Para uso del fertilizante, los gránulos son preferidos sobre comprimidos debido a su distribución de tamaño de partícula más ,estrecho lo cual es una ventaja para la aplicación mecánica.

La urea es usualmente esparcida a relaciones de entre 40 y 300 kg/ha pero varían las relaciones. Las aplicaciones más lentas incluyen pérdidas inferiores debido a lixiviación. Durante el verano, la urea es a menudo es esparcida solo antes, o durante la lluvia para minimizar las pérdidas de la volatilización (proceso donde el nitrógeno se pierde en la atmósfera como gas de amoniaco). La urea se disuelve en agua para aplicación como una atomización o a través de sistemas de irrigación.

La urea absorbe la humedad de la atmósfera y por lo tanto es típicamente almacenada ya sea en bolsas cerradas/selladas en tarimas, o, si se almacena a volumen, bajo cubierta con una cubierta de lona. Como con la mayoría de los fertilizantes sólidos, el almacenaje en un área fría, seca, bien ventilada es recomendado.

La urea es una materia prima para la manufactura de muchos compuestos químicos importantes, tales como algunos plásticos (por ejemplo, resinas de urea-formaldehído), algunos adhesivos (por ejemplo, urea-formaldehído, o urea-melamina-formaldehído usados en madera contrachapada marina), cianato de potasio (materia prima industrial), y nitrato de urea, (explosivo).

En sistemas automotrices la urea es usada en una reducción no catalítica selectiva y reacciones de reducción catalítica selectivas para reducidas de contaminantes de NOx en gases de escape a partir de la combustión de diesel, combustible dual y motores a gas natural de mezcla pobre. El sistema BlueTec, por ejemplo, una solución de urea a base de agua inyectada en el sistema de escape. El amoníaco producido por la hidrólisis de la urea reacciona con las emisiones de dióxido de nitrógeno y se convierte en nitrógeno y agua dentro del convertidor catalítico.

La urea puede servir como una fuente de hidrógeno para generación de energía subsecuente en celdas de combustible. La urea presente en la orina/agua residual puede ser usada directamente (a través de bacterias que degradan normalmente rápido la urea) . Producir hidrógeno por electrólisis de la solución de urea ocurre a un voltaje inferior (0.37v) y de este modo consume menos energía que la electrólisis del agua (1.2v).

Con respecto a usos médicos, la urea es usada en productos dermatológicos tópicos para promover la rehidratación de la piel. Si se cubre por un vendaje oclusivo, el 40% de las preparaciones de urea también pueden ser para desbridamiento no quirúrgico de las uñas. Ciertos tipos de compresas frías instantáneas (o compresas de hielo) contienen agua y cristales de urea separados. La ruptura de la bolsa de agua interna comienza una reacción endotérmica y permite a la compresa ser usada para reducir la hinchazón. Como la salina, la inyección de urea se usa para realizar abortos. La urea es el componente principal de un tratamiento medicinal alternativo referido como terapia de orina. La urea etiquetada con carbono-14 o carbono-13 se usa en las pruebas de respiración de urea, las cuales se usan para detectar la presencia de la bacteria Helicobacter pylori en el estómago y duodeno de humanos, asociado con úlceras pépticas.

Otros usos posibles para urea producida usando los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, un estabilizador en explosivos de nitrocelulosa, un componente de alimento animal, una alternativa que no corroe la roca de sal para el deshielo de carreteras, repavimentación de medios tubos para practicar esquí de nieve y terrenos de parques, un aditivo que intensifica el sabor para cigarros, un ingrediente en removedores de cabello, un agente de dorado en botanas de pretzels producidas en fábricas, un ingrediente en alguna crema para la pial, humectantes, y acondicionadores del cabello, un reactivo en algunas compresas frías listas para usar, para uso en primeros auxilios, un agente de sembrado de nubes, un agente a prueba de llamas, un ingrediente en productos blanqueadores dentales, un ingredientes en jabones para lavar platos, un nutriente de levadura para fermentación de azúcares en etanol, un nutriente usado por el plancton en experimentos nodrizas en océano para propósitos de geoingeniería, un aditivo para extender la temperatura de trabajo y tiempo de apertura de pegamento oculto, un aditivo que retiene la humedad y mejora la solubilidad a baños de tintes para teñido o impresión textil, y un desnaturalizante de proteína.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Producción de Carbamato Cinasa de Pyrococcus furiosus El método de literatura actual para expresión de la Pfu CK involucra amplificación por PCR del ADN genómico de la enzima ( cpkA, Y09829.1) usando cebadores de oligonucleótido sintéticos, diseñados para introducir un sitio Ncol en el ATG iniciador y un sitio BlpI corriente abajo del codón de detención (5'-GTGGTTTCCATGGGTAAGAGGGTAGTGATTGC-3' (SEC ID NO:48) y 5'-GCATTCGCTAAGCTGGGTCTTCTAAAGTTCCTCAGG-3' (SEC ID NO:9)) (Dubecq et al., 1997). Los productos de PCR son entonces digeridos con enzimas de restricción Ncol y BlpI, insertadas en los sitios correspondientes del plásmido pET-15b y el plásmido recombinante de la Pfu CK (pCPS184) es transformado en células de E. coli DH5a. Un plásmido adicional (pSJS1240) es también transformado para permitir la expresión de los codones de ARNt para arginina (AGA y AGG) e isoleucina (ATA) (estos codones son rara vez usados en E. coli y ocurren frecuentemente en el gen de la Pfu CK). Las células transformadas de E. coli DH5a entonces se hacen crecer durante la noche en 3 1 de medio Luria-Bertani (suplementado con 0.1 mg/ml de ampicilina y 0.05 mg/ml de estreptomicina) a 37 °C en una incubadora de sacudimiento, y después de 3 horas de inducción con 1 mM de isopropil b-D- tiogalactósido, las células son recolectadas por centrifugación. Aproximadamente lOg de las células se puede obtener usando este método de expresión (Dubecq et al., 1997).

La Pfu CK entonces se aísla de estas células a 0 - 4 °C usando una serie de procesos de purificación. En primer lugar, las células son suspendidas en 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, lisadas por sonicación (oscilador sónico, 250 W, 10 kHz, 20 minutos) y centrifugadas (80000 x gr 30 minutos). Se agrega entonces sulfato de amonio a 40% de saturación, y la solución se agita por 30 minutos y centrifuga (12000 x g, 20 minutos). La concentración de sulfato de amonio entonces se incrementa a 80% de saturación y la solución es nuevamente agitada por 30 minutos y centrifugada (12000 x g, 20 minutos). La pelotilla de Pfu CK obtenida después de este fraccionamiento de sulfato de amonio es suspendida en 50 mM de Tris-HCl, pH 7.2, dializada en el mismo amortiguador y la Pfu CK se aísla en una serie de purificaciones cromatográficas (sefarosa DEAE, sefarosa Blue, DEAE Affi-gel Blue (Bio-Rad)). Usando este método de expresión y purificación, 50 g de células proporcionan aproximadamente 0.75 mg de proteína (0.015 mg/g) (Uriate et al., 1999).

Para atender este bajo rendimiento de proteína, la Pfu CK se obtiene en lugar de usar un protocolo de purificación y expresión de enzima rediseñada. En primer lugar, la secuencia de ADN genómico de Pfu CK se optimizó para expresión de E. coli, haciendo redundante el uso de pSJS1240. El gen cpkA optimizado fue entonces insertado en el vector promotor de T7 pETMCSIII entre los sitios de restricción NdeI y EcoRI para expresión subsecuente con una etiqueta N-terminal (His)6, y el plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21 (DE3). Las células transformadas se hicieron crecer durante la noche en 100 mi de medio Luria-Bertani (suplementado con 0.1 mg/ml de ampicilina) a 37 °C en una incubadora de sacudimiento, y las células se recolectaron por centrifugación (4000 x g, 5 minutos). Se obtuvo aproximadamente 1 g de células.

El aislamiento de Pfu CK se lleva a cabo a 0 - 4 °C. Las células son suspendidas en 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.4, suplementado con 500 mM de NaCl y 20 mM de imidazol, y U sadas usando una prensa French. Los desechos celulares son entonces removidos por centrifugación (12000 x g, 30 minutos) y se aísla Pfu CK del sobrenadante por cromatografía de afinidad de ión de metal (His GraviTrap (GE Healthcare)) eluyendo con 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.4, suplementado con 500 mM de NaCl y 500 mM de imidazol. Aproximadamente 16 mg de Pfu CK se aíslan de la pelotilla celular de 1 g inicial, representando un mejoramiento de 1,000 veces en el rendimiento de la enzima.

Ejemplo 2 - Producción de Carbamoil fosfato Análisis previo de convertidor catalítico de ATP a ADP por Pfu CK ha involucrado un ensayo acoplado de piruvato cinasa y lactato deshidrogenasa (Uriarte et al., 1999). En la presencia de fsofoenolpiruvato, la piruvato cinasa convierte ADP a ATP y produce piruvato, el cual es entonces convertido a lactato por lactato deshidrogenasa, con oxidación de NADH. En el estado estable, la disminución de UV monitoreada en la concentración de NADH es entonces usada como una medida de producción de ADP catalizada por Pfu CK. Puesto que este análisis cinético se basa en la detección de un producto secundario, se diseñó un ensayo alterno para medir más directamente la producción de ADP catalizada por Pfu CK. Este ensayo se basa en aquel diseñado por Buchan (2009) para la actividad monitoreada por HPLC de sinterrelaciones de ARNt.

La separación por HPLC de soluciones estándares de AMP, ADP y ATP se logró usando una columna Alltech Alltima HP C18 con un gradiente de 60 mM de dihidrógeno fosfato de amonio y 5 mM de dihidrógeno fosfato de tetrabutilamonio en agua (solvente A) y 5 mM de fosfato de tetrabutilamonio en metanol (solvente B) de conformidad con el sistema de solvente resumido en la Tabla 2. Los tiempos de retención observados para los estándares AMP, ADP y ATP fueron 7.9 minutos, 17.4 minutos y 25.6 minutos respectivamente. Para agilizar los análisis de HPLC, se determinó que 4 inyecciones podrían ser monitoreadas por análisis de 27 minutos sin co elución de AMP o ADP (véase Figura 2).

La actividad de Pfu CK para conversión catalítica de ATP a ADP fue entonces onitoreada en varias condiciones. Las soluciones de ensayo de 0.2 M de bicarbonato de sodio y 10 mM de ATP fueron hechas conteniendo 2 mM, 20 mM.o 200 mM de amoníaco, y el pH se ajustó entre pH 8.9 y 11.4 con 2 M de NaOH. La temperatura del ensayo se mantuvo a 40°C. Para permitir a los ensayos amortiguados llevarse a cabo, se agregó a pH 8, 0.1 M de Tris-HCl a las mezclas de ensayo y el pH se ajustó usando 5 M de HCl (los ensayos de control confirmaron que la adición de Tris-HCl no afecta la actividad enzimática). Las reacciones se iniciaron por la adición de Pfu CK (0.5 mM de concentración final) y las concentraciones de ADP fueron monitoreadas durante 4 horas apagando 20 mL de alícuotas de reacción con 0.1% de dodecil sulfato de sodio en agua, seguido por análisis de HPLC como se resume en la Tabla 2. Las concentraciones de ADP en las alícuotas de reacción se determinaron usando una calibración estándar, y las relaciones de cambio en concentraciones de ADP se corrigieron por antecedente.

Tabla 2. Sistema de solvente de HPLC usado para la separación de AMP, ADP y ATP.

Tiempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%) Mostrados en la Figura 3 están los perfiles de relación-pH de Pfu CK en la presencia de 2 mM, 20 mM y 200 mM de amoniaco. Las relaciones máximas se observaron a aproximadamente pH 9.9 en todas las tres concentraciones de amoniaco. A este pH, una reducción de diez veces en la concentración de amoniaco de 200 mM a 20 mM tiene efecto insignificante en la relación de producción de ADP, con ambas condiciones permitiendo una producción de ADP a una relación de aproximadamente 1.2 pmol/min/mg de enzima. Sin embargo, una reducción de diez veces adicional en la concentración de amoniaco a 2 mM a pH 9.9 resulta en una reducción del 78% en la relación a 0.26 pmol/min/mg de enzima. Estos resultados indican que a pH 9.9, el carbamato puede ser químicamente sintetizado a concentraciones de saturación enzimática después del mezclado ³ 20 mM de amoníaco con 0.2 M de bicarbonato de sodio. Estos resultados son contrastantes con aquellos de (Dubecq et al., 1997) los cuales indican que a 37°C la actividad máxima se obtuvo entre 7.8 y 8 y a 60°C por un valor cercano a pH 7.6.

Como se puede ver en la Figura 3, una reducción de diez veces en la concentración de amoníaco de 200 mM a 20 mM cuando por debajo de pH 9.9 tiene un efecto negativo en la actividad de la enzima. Esto indica que 20 mM de amoníaco es menos capaz de producir carbamato a concentraciones de saturación en estas condiciones. Esto puede ser explicado por un pH por debajo del p a de amoníaco (9.25) reduciendo las relaciones de amoníaco/amonio limitando las concentraciones de carbamato disponible a la enzima. Incrementar esta relación incrementando la concentración de amoníaco diez veces (200 mi) por lo tanto, se incrementan las concentraciones de carbamato más cercanas a los niveles de saturación. Estas tendencias son además evidentes usando 2 mM de amoníaco, con disminuciones en la relación a todos los pHs indicando disminución adicional de las concentraciones de carbamato.

Experimentos adicionales que investigan las concentraciones de temperatura óptima también se llevaron a cabo. Esto involucra ensayos de repetición de Pfu CK a pH 9.9 y en la presencia de 20 mM de amoníaco como se describe anteriormente, mientras se incrementan las temperaturas del ensayo de 40°C a 60°C y 80°C. Mostrada en la Figura 4 está la actividad de Pfu CK para la producción de ADP a estas temperaturas modificadas. Un incremento aproximado de tres veces en la producción de ADP se observó incrementando la temperatura desde 40°C a 60°C. Sin embargo, un incremento adicional en la temperatura a 80°C no resulta en un incremento similar, con la producción de ADP siendo aproximadamente la misma como se observa a 60°C. Estas observaciones sugieren una temperatura óptima para la actividad enzimática de Pfu CK de entre 60°C y 80°C.

En resumen, la Pfu CK es capaz de operar a temperaturas variables, alto pH y con bajas concentraciones de amoníaco, y por lo tanto puede ser usada para remover amoníaco tóxico a partir de aguas residuales para producir carbamoil fosfato.

Ejemplo 3- Análisis Adicional de la Producción de Carbamoil Fosfato Después de obtener los datos presentados en el Ejemplo 2, los inventores condujeron análisis adicionales optimizando algunos de los parámetros. Los procedimientos usados fueron como se describe en el Ejemplo 1, pero los desechos celulares se centrifugaron a 20,000 x g, 60 minutos y se obtuvo un mejoramiento de 1,000 veces en el rendimiento de la enzima.

La separación de soluciones estándares de AMP, ADP y DTR se logró usando una columna Alltech Alltima HP C18 eluyendo con un gradiente de 60 mM de dihidrógeno fosfato de amonio y 5 mM de dihidrógeno fosfato de tetrabutilamonio en agua (solvente A) y 5 mM de tetrabutilamonio de fosfato en metanol (solvente B) de conformidad con el sistema de solvente resumido en la Tabla 3. Los tiempos de retención observados para los estándares de AMP, ADP y ATP fueron 8 minutos, 17.5 minutos y 25.5 minutos, respectivamente.

Tabla 3. Sistema de solvente de HPLC usado para la separación de AMP, ADP y ATP. Todos los gradientes son lineales Tiempo (minutos) Solvente ? (%) Solvente B (%) La actividad de Pfu CK para conversión catalítica de ATP a ADP fue entonces monitoreada bajo varias condiciones. Las soluciones de ensayo de 0.2 M de bicarbonato de sodio y 10 mM de ATP se hicieron conteniendo 20 mM o 200 mM de amoniaco, y el pH se ajustó entre 8.9 y 11.4 con 5 M de HCl o 2 M de NaOH. La temperatura del ensayo se mantuvo a 40 °C. Las reacciones se iniciaron por la adición de Pfu CK (0.5 mM de concentración final) y las concentraciones de ADP fueron monitoreadas durante 4 horas apagando 20 mL de alícuotas de reacción con 0.1% de dodecil sulfato de sodio en agua, seguido por análisis de HPLC como se resume en la Tabla 3. Las concentraciones de ADP en las alícuotas de reacción se determinaron usando una calibración estándar.

Mostrados en la Figura 5 están los perfiles de actividad de pH de Pfu CK en la presencia de 20 mM y 200 mM de .amoníaco a un estado estable representativo de 10-30 minutos. La relación máxima se observó a aproximadamente pH 9.9. De manera más importante, la actividad se mantuvo a muy alto pH y solamente disminuyó de uno a dos tercios del máximo a pH 11.4. Esto es contrario a las carbamato cinasas mesofílicas, las cuales han sido reportadas por mostrar una disminución brusca en la actividad arriba del pH máximo (Jones, 1962). Estos resultados muestran que la Pfu CK tiene una relación máxima a 9.9 (40 °C), mientras la máximo fue previamente reportada entre 7.8 y 8 (Dubecq et al., 1997). Además, este es el primer reporte en que la Pfu CK es activa a pH tan alto como 11.4 a 40 °C. Es posible que las relaciones de amoníaco/amonio superior incrementen las concentraciones de carbaraato disponible a la enzima a pH alto, y que esto contribuya a la sorprendente actividad enzimática a pH alto.

Ejemplo 4 - Especiación de Carbamato Con el fin de determinar si la concentración de carbamato se refiere al perfil de pH de la Pfu CK, se llevaron a cabo experimentos para monitorear la concentración de carbamato como una función del pH. Las soluciones de amoniaco (2 M) y bicarbonato de sodio etiquetado con 13C (0.2 M) en agua se ajustaron usando ya sea ácido clorhídrico o hidróxido de sodio a cada uno de los pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 y 11.4 y se analizó por espectroscopia de 13C NMR .usando un inserto coaxial D20. A pH 7.2, se observó una resonancia de carbono a 159.5 ppm. Este pico se asignó al par de bicarbonato/carbonato que intercambia rápidamente. Incrementar el pH a 8.4 provoca que este pico cambie a 160.0 ppm, con una segunda resonancia de carbono que aparece a 164.9 ppm. Este segundo pico se asignó al carbamato formado a través de la reacción de amoníaco con bicarbonato (Maní et al.,!2006). Estos picos y sus integraciones relativas fueron entonces monitoreados durante el rango de intervalos de pH desde 7.2 hasta 11.4. Puesto que estos compuestos contienen solamente un átomo de carbono y están probablemente presentando tiempos de relajación muy similares durante el análisis de NMR, la integración de estos picos se usó como una medida de sus concentraciones relativas en solución. Estas integraciones y cambios químicos se muestran en la Tabla 4. La tendencia en integraciones relativas también se muestra en la Figura 6.

Tabla . Cambios químicos e integraciones relativas de resonancias de carbono observadas en soluciones de amoníaco (2 M) y bicarbonato de sodio etiquetado con 13C (0.2 M) en agua, ajustadas a pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 y 11.4.

Como se muestra en la Tabla 4, la resonancia de carbono asignada al par de intercambio de bicarbonato/carbonato a pH 7.2 (159.5 ppm) se mueve a cambio químico superior con incremento de pH. Este efecto no se observó con la resonancia de carbono asignada a carbamato, con un cambio químico constante de 164.9 ppm observado en todos los valores de pH. La integración relativa de resonancias para bicarbonato/carbonato y carbamato (Figura 6) también muestra que las concentraciones de carbamato son más altas a pH 9.9, con un 32% de abundancia de carbamato con relación de bicarbonato/carbonato. Esto indica que variar las concentraciones del sustrato carbamato se puede contribuir al perfil de actividad de la Pfu CK.

Ejemplo 5 - Selección y Análisis de Enzimas Adicionales Con el fin de determinar si el perfil de actividad de pH de la Pfu CK es peculiar a Pyrococcus furiosus se seleccionó una serie de carbamato cinasas de otros organismos para análisis y su actividad se comparó con aquella de Pfu CK. Los inventores probaron carbamato cinasas a partir de otros organismos hipertermofílicos así como también carbamato cinasas de especies termofílicas y mesofilicas con estructura similar a aquella de Pfu CK. Las estructuras de carbamato cinasa se compararon con base en la homología de secuencia de aminoácido con relación a la Pfu CK. Las .seis enzimas elegidas para análisis adicional son listadas en la Tabla 5.

Tabla 5. Enzimas de carbamato cinasa.

Homología de secuencia de aminoácido con relación a la Enzima Abreviatura Pfu CK La carbamato cinasa de Thermococcus sibiricus (TS CK, Tabla 5) se pronosticó con base en el análisis de secuencias Mardanov et al. (2009), pero no ha sido aislada hasta ahora. De manera similar, la secuencia del genoma completo de Thermococcus barophilus (TB CK, Tabla 5) se reportó en Marzo de 2011, sin embargo la TB CK no ha sido aislada (Vannier et al., 2011). La secuencia del genoma de Fervidobacterium nodosum se completó en 2007. Este trabajo se realizó por el Programa de la Oficina de Investigaciones en Ciencias, Biológicas y del Medioambiente del Departamento de Energía de los Estados Unidos por la Universidad de California. La carbamato cinasa de Fervidobacterium nodosum (FN CK, Tabla 5) no ha sido aislada. La carbamato cinasa de Thermosipho melanesiensis (TM CK, Tabl55) nuevamente aún no ha sido aislada pero su genoma se reportó en 2009 (Zhaxybayeva et al., 2009). La carbamato cinasa de Enterococcus faecalis (EF CK, Tabla 5) (anteriormente llamada Streptococcus faecalis) ha sido ampliamente estudiada desde 1964 (Kalman and Duffield, 1964). La carbamato cinasa de Clostrididium tetani (CT CK, Tabla 5) no ha sido aislada previamente. La secuencia del genoma se completó en 2003 (Brüggemann et al., 2003). La Tabla 6 proporciona un sumario de la identidad de aminoácido entre las diferentes enzimas probadas.

Tabla 6. Identidad de secuencia de aminoácido de carbamato cinasas , Con la excepción de TB CK, las enzimas listadas en la Tabla 5 fueron expresadas y purificadas usando los protocolos optimizados como se describe anteriormente para la Pfu CK. TB CK fue exitosamente sobre expresado por inducción química usando IPTG (isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido). Para la inducción de IPTG, 10 mi de precultivo que crece a 37 °C durante la noche se inoculó en 1 1 de medio LBA. Las células se hicieron crecer hasta que se alcanzó un OD de 0.55 y después se agregó 1 mi de IPTG (1 M, final 1 mM). Las células inducidas con IPTG se hicieron crecer durante la noche a 37 °C. Las células se recolectaron por centrifugación, 5,000 rpm, 15 min, a 4 °C. Los rendimientos purificados de todas las enzimas adicionales son listados en la Tabla 7. El rendimiento de EF CK fue 7 mg por 100 mi representando aproximadamente un mejoramiento de 3 veces a partir de una expresión previamente reportada (Marina et al., 1998). Además, el protocolo usado involucra una etapa de purificación única, fácilmente completada en un dia mientras el reporte previo involucra etapas múltiples (que incluyen 2 columnas y 2 precipitaciones) durante un periodo reportado de tres dias (Marina et al., 1998).

Tabla 7. Rendimientos purificados de enzimas CK adicionales expresadas. Rendimientos con base en 100 mi de cultivo liquido.

Enzima Rendimiento (mg) Después de la expresión y aislamiento, las enzimas CK fueron sometidas a ensayos de actividad de HPLC. La actividad se basa en un ensayo de 20 minutos después de la preincubación por 10 minutos y los perfiles de pH se muestran en la Figura 7, para todos pero para la enzima bacteriana que forma espora mesofilica CT CK, la cual no fue activa bajo cualquiera de las condiciones aplicadas y no fue además estudiada. Los resultados de actividad muestran que las dos enzimas hipertermofilicas (TS CK y TB CK, Tabla 5) con alta homología de secuencia relativa a la Pfu CK presentan perfiles de actividad de pH similares a aquellos de la Pfu CK (Figura 7). Como se discute anteriormente, la Pfu CK mantiene su actividad a pH inusualmente alto. Las Pfu CK, TS CK y TB CK tienen relaciones de pH máximas entre 9.4 - 9.9 y retienen una proporción sustancial de su actividad a pH 11.4. Con base en estos resultados se espera que las carbamato cinasas con alta homología de secuencia con relación a CK Pfu tengan perfiles de actividad de pH similares.

Las dos carbamato cinasa termófilas (FN CK y TM CK) con menos homología de secuencia con relación a la Pfu CK (Tablas 5 y 6) tienen perfiles de actividad de pH similares a aquellos reportados para mesófilos (Jones and Lipmann, 1960) donde una disminución brusca en actividad se observa a partir de pH 9.4 a 10.4 (comparado con poca o ninguna caída para Pfu CK, TS CK y TB CK) y no retienen actividad a pH 10.9-11.4 (Figura 7).

Como se declara anteriormente, la enzima bacteriana que forma espora mesofilica CT CK no fue activa bajo cualquiera de las condiciones. La otra enzima mesofilica EF CK tiene un perfil de actividad de pH similar a aquel de los termófilos, FN CK y TM CK, con una disminución brusca en la actividad arriba de pH 9.5 (Figura 7).

De este modo, pos perfiles de actividad de pH de las enzimas seleccionadas pueden ser categorizados por su homología de secuencia de aminoácido comparada con la Pfu CK.

Ejemplo 6 - Perfiles de Temperatura de Diferentes Carbamato Cinasas Con el fin de investigar además la correlación entre estructura y actividad, se llevaron a cabo experimentos de actividad de temperatura.

! Se llevaron a cabo ensayos a pH 9.9 y en la presencia de 200 mM de amoníaco como se describe anteriormente, mientras se mantienen temperaturas de ensayo de 20 °C, 40 °C, 60 °C y 80 °C. La Figura 8 presenta los perfiles de temperatura de estado estable como una función de tiempo a las temperaturas designadas. Las carbamato cinasas de los organismos hipertermofílicos y con alta homología de secuencia con relación a Pfu CK (TS CK y TB CK, Tabla 5) todas tienen incremento de actividad con la temperatura con I i l 81 una actividad máxima de 80 °C de las cuatro temperaturas designadas. A 20 °C, la producción enzimática de ADP se reduce a casi niveles antecedentes. Las carbamato cinasas a partir de los termófilos y con menos homología de secuencia con relación a Pfu (FN CK y TM CK, Tabla 5) son menos activas a las temperaturas superiores (Figura 8). La FN CK fue más activa a 40 °C y la TM CK a 40-60 °C. La carbamato cinasa activa a partir del mesófilo (EF) fue la más activa a 40 °C (Figura 8) y mostró poca actividad a 60 °C u 80 °C. La producción de ADP a 80 °C en el perfil de EF CK en la Figura 8 es probablemente un artefacto de la hidrólisis de ATP antecedente.

Una gráfica de sumario del perfil de temperatura se muestra en la Figura 9. A 80 °C la Pfu CK así como también las carbamato cinasas con alta homología de secuencia con relación a Pfu CK, tienen actividades que varían desde 5 a 9.5 pmol/min/mg mientras las otras carbamato cinasas no son activas a esta temperatura.

Ejemplo 7 - Estabilidad de Diferentes Carbamato Cinasas La Pfu CK y las enzimas de homología de secuencia similares TS CK y TB CK son estables y funcionan inesperadamente a pH alto. Además, son estables y funcionan, con actividad incrementada, a temperaturas elevadas y resulta que están probablemente reteniendo la función y estructura en almacenaje. Estas características inusuales son atributos importantes para aplicaciones comerciales y los inventores por lo tanto exponen evaluar la estabilidad de las carbamato cinasas.

Se llevaron a cabo ensayos de estabilidad preliminar para Pfu CK, TS CK, TB CK, FN CK, TM CK y EF CK. Después de la incubación a 40 °C por 60 horas Pfu CK, TS CK y TB CK mantuvieron sustancialmente su actividad mientras los otros estuvieron inactivos. Además, la Pfu CK retiene su actividad después de ser almacenada por un año a 4 °C, demostrando su potencial para aplicaciones comerciales.

Ejemplo 8 - Producción de Urea Para determinar la factibilidad de la conversión química in situ del carbamoil fosfato biosintetizado a urea, se illevaron a cabo estudios modelo para determinar la reactividad de carbamoil fosfato en la presencia de varias concentraciones de amoníaco. Después de la mezcla de carbamoil fosfato (50 mg) y amoníaco líquido (10 mi) a -78 °C, se observó disolución mínima. Se pensó que las bajas temperaturas requeridas para manejar el amoníaco líquido fueron no sensibles a la solubilidad de carbamoil fosfato. Experimentos adicionales que promueven la solubilidad de I carbamoil fosfato fueron por lo tanto llevados a cabo. El I 83 carbamoil fosfato (10 mg) se mezcló con amoniaco acuoso (1 mi, 14.8 M) y calentó a 100 °C por 4 horas. La disolución de carbamoil fosfato se observó usando estas condiciones modificadas. Después de secar el producto de reacción cruda, I en análisis (TLC, 1H/13C NMR, HPLC) con comparación a una muestra auténtica confirmó que la conversión de carbamoil fosfato a urea se ha logrado (véase Figuras 10 y 11 para análisis espectrales) . Experimentos adicionales mezclando carbamoil fosfato con concentraciones disminuidas de amoniaco de 10 M, 5 M, y 2.5 M mostraron un efecto insignificante en la producción de urea, como se indica por análisis de HPL. Sin 1embargo, procediendo a concentraciones de amoniaco por debajo de 2.5 M conduce a reducciones aparentes en concentraciones de urea observadas.

Las condiciones derivadas de estos estudios de modelo fueron entonces aplicadas a un ensayo de Pfu CK en un intento por convertir carbamoil fosfato biosintetizado a urea. La Pfu CK (0.5 mM de concentración final) se agregó a una solución de 0.2 M de bicarbonato de sodio, 10 mM de ATP y 2 M de amoniaco (pH 11) y la reacción se calentó a 100 °C por 4 horas. La solución entonces se secó por nitrógeno, y analizó por 1H y 13C NMR (Figura 12). Estos análisis confirmaron que la urea ha sido sintetizada.

Esta solicitud reivindica la prioridad del I documento US 61/498,395 presentado el 17 de Junio de 2011, los ' contenidos completos del cual se incorporan en la presente por referencia.

Se apreciará por las personas expertas en la téenica que numerosas variaciones y/o modificaciones pueden hacerse a la invención como se muestra en las modalidades especificas sin apartarse del espíritu o campo de la invención como se describe ampliamente. Las presentes modalidades son, por lo tanto, para ser consideradas en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Todas las publicaciones discutidas y/o referenciadas en la presente están incorporadas aquí en su totalidad.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares los cuales han sido incluidos en la presente especificación es solamente con él propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se debe considerar como una admisión de que cualquiera o todos estos temas forman parte de la base de la técnica anterior o fueron conocimientos generales comunes en el campo relevante para la presente invención conforme existe antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

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Claims (41)

I NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para producir carbamoil fosfato, caracterizado porque el método comprende hacer reaccionar amoniaco, ATP, bicarbonato y CO2, o una forma hidratada del mismo, en una composición en la presencia de una carbamato cinasa, en donde el amoniaco y C02, o forma hidratada del mismo, son convertidos a carbamato en una reacción química y el carbamato y ATP son convertidos a carbamoil fosfato en una reacción catalizada por enzima por la carbamato cinasa, y en dond.e el pH de la composición es aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12.

¡ 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, Caracterizado porque el pH es aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11, aproximadamente 9.25 hasta aproximadamente 11.25, aproximadamente 10.25 hasta aproximadamente 11.25, o aproximadamente 10.5 hasta aproximadamente 11.5. I

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la carbamato cinasa se deriva de una i 88 bacteria hipertermófila, o sea un mutante del mismo biológicamente activo.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:1 a 9, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% !idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:1 a 9, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 9, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:4 a 9, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

¡ 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la temperatura es aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 80 °C.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque a pH 11 0.5 mM de carbamato cinasa producen al menos 0.5 pmol/min/mg ADP después de treinta minutos de incubación en NaHCO3 (0.2 M), ATP (10 mM) y 20 mM NH4OH a 40 °C.

8. El método de conformidad con cualquiera de las l reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque a pH 11.50.5 mM de barbamato cinasa producen al menos 0.25 pmol/min/mg ADP después de treinta minutos de incubación en NaHCC>3 (0.2 M), I ATP (10 mM) y 20 mM NH4OH a 40 °C.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH es aproximadamente 9 hasta aproximadamente 10.5, o aproximadamente 9.5 hasta aproximadamente 10.5. i

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la carbamato cinasa se deriva de una bacteria termófila, o sea un mutante del mismo biológicamente actiyo.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9 o; reivindicación 10, caracterizado porque la carbamato cinasa comprende a) una secuencia de aminoácido proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:28 a 35, b) una secuencia de aminoácido la cual es al menos 50% idéntica con una cualquiera o más de las SEC ID NOs:28 a 35, y/o c) un fragmento biológicamente activo de a) o b).

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque a pH 10.5 0.5 mM de carbamato cinasa producen al menos 0.6 pmol/min/mg ADP o después de treinta minutos de incubación en NaHCO3 (0.2 M), ATP (10 mM) y 200 mM NH4OH a 40 °C.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la temperatura es aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 60 °C. 1 14. El método de conformidad con cualquiera de las

I reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la temperatura es aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la carbamato cina'sa mantiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80% de su actividad después del almacenaje por 1 año a 4°C y/o almacenaje por 60 horas a 40°C.

; 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la presión es aproximadamente 0 hasta aproximadamente 10 atm.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se realiza en un sistema continuo. I

18. El método de conformidad con cualquiera de las reiyindicaciones l a 17, caracterizado porque la carbamato cinasa es inmovilizada sobre un soporte sólido.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la fuente del amoniaco es material residual.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque produce además uno; o ambos de cianato y ácido ciánico a través de la ! ^ descomposición de al menos algo del carbamoil fosfato.

21. Un método para producir un compuesto a partir I de carbamoil fosfato, caracterizado porque el método comprende ¡ i) realizar el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para producir carbamoil fosfato, y ii) realizar una o más reacciones adicionales para producir el compuesto.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es urea y la etapa ii) comprende hacer reaccionar el carbamoil fosfato producido de la etapa i) con amoniaco para producir urea vía un intermediario, el cual es uno o ambos de cianato y ácido I ciánico.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22,, Icaracterizado porque al menos la etapa ii) se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 90°C, o aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 100 °C.

24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende, ¡ i) realizar el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 con la carbamato cinasa vilizada en un soporte sólido ii) separar el carbamoil fosfato producido por la etapa i) a partir del soporte sólido, ! iii) unir el carbamoil fosfato a una resina, y iv) lavar la resina en una solución que comprende amoriíaco para convertir el carbamoil fosfato vía un intermediario, el cual es uno o ambos de cianato y ácido ciánico, en urea.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la etapa iv) se realiza a una temperatura de aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 100 °C.

; 26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es un intermediario del ciclo de urea seleccionado de citrulina, argininosuccinato, I arginina, ornitina, y una combinación de dos o más de los mismos.

27. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende realizar el método de conformidad con la reivindicación 20 para producir uno o ambos de cianato y ácido ciánico, y hacer reaccionar el cianato y/o ácido ciánico con un nucleófilo.

28. El método de conformidad con la reivindicación 21 p reivindicación 27, caracterizado porque el compuesto es una 'pirimidina.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, 'caracterizado porque la pirimidina es uracilo, citosina o timina, o un derivado del mismo con uno, dos o tres grupos fosfato. 1

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 o 26 a 29, caracterizado porque el método es realizado en un recipiente único.

31. Un método para reducir la concentración de amoniaco en un material residual, caracterizado porque el método comprende realizar un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30. I

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el material residual está en agua.

33. Un polinucleótido aislado y/o exógeno que codifica una carbamato cinasa, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada como cualquiera de las SEC ID NOs:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 o 36 a 43.

34. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque está operablemente ligado a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula.

35. Un vector caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 33 o reivindicación 34.

' 36. Una célula hospedera caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 33 o reivindicación 34, y/o un vector de conformidad con la reivindicación 35.

37. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es una célula bacteriana, célula de levadura o una célula vegetal.

I 38. Un método para producir una carbamato cinasa, caracterizado porque el método comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 36 o reivindicación 37 o un extracto de la misma que comprende el polinucleótido, o un vector de conformidad con la reivindicación 35, bajo condiciones las cuales permiten la expresión del polinucleótido que codifica la carbamato cinasa.

39. Carbamoil fosfato caracterizado porque es producido usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

40. Un compuesto caracterizado porque es producido usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32.

41. El compuesto de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque es urea, citrulina, argininosuccinato, arginina, ornitina, o una pirimidina. I I