JP2021101622A - タンパク質を耐熱化するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、効率の良い新規なタンパク質耐熱化方法を提供することを目的とする。【解決手段】耐熱化するタンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に変異を有する変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、前記変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、４５℃以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、をおこなう。【選択図】なし
Description
本発明はタンパク質を耐熱化するための方法に関する
タンパク質を評価するうえでの重要な特性の一つに、タンパク質分子の耐熱性がある。耐熱性酵素の産業利用で非常に有名なものの一つが、高耐熱性ＤＮＡ合成酵素のＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＰＣＲ法）への利用である。このような高耐熱性を持つＤＮＡ合成酵素は、海底の温熱鉱床等に生息する極限環境生物である超好熱古細菌の探索とその酵素のクローニングから得られたものである。ＰＣＲ法の大成功に刺激を受けた研究者たちは挙って高耐熱性酵素の探索を行った。当初は超好熱古細菌に存する酵素を網羅的にクローニングをすることに労力が費やされたが、耐熱性を持たない酵素を耐熱化できないか、ということに研究の方向性がシフトしていった（例えば、特許文献１参照）。
従来のタンパク質合成系を用いた手法では、タンパク質合成系に含まれるタンパク質やリボソームなどの核酸成分のほとんどが耐熱性を持たず、加熱により変性し不溶化してしまうため、熱変性の有無を見極める際のバックグラウンドとなってしまう。そのため、これらの測定を行う際、加熱により変性・凝集したタンパク質合成系由来の水溶性タンパク質やリボソームなどが測定を阻害するので、耐熱化対象のタンパク質を分離し精製する必要があった。そうすると、変異を入れた遺伝子ごとに別々にタンパク質精製を行わなくてはならず、そのコストは膨大なものであった。
そこで、本発明は、効率の良い新規なタンパク質耐熱化方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施態様は、タンパク質を耐熱化するための方法であって、前記タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に変異を有する変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、前記変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う工程と、前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、４５℃以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含む。前記蛍光が確認され、前記タンパク質の沈殿が確認されなかった融合タンパク質を、耐熱化したタンパク質と判断する工程をさらに含んでもよい。前記好熱菌または超好熱菌が、好熱古細菌または超好熱菌であってもよい。前記好熱菌または超好熱菌がアーキアであってもよい。前記好熱菌または超好熱菌が、Thermococcus kodakarensis、Pyrococcus furiosus、またはSulfolobus solfataricusであってもよい。前記タンパク質の沈殿の有無が動的光散乱法によって確認され
てもよい。前記タンパク質の沈殿の有無が濁度測定によって確認されてもよい。前記タンパク質合成反応の反応液に超好熱菌由来のシャペロンが含まれてもよい。前記タンパク質
合成反応が、６０℃以上の温度で行われてもよい。前記タンパク質合成反応が、８０℃以上の温度で行われてもよい。前記融合タンパク質は、Ｃ末端とＮ末端の両側に検出波長の異なる蛍光を放出する蛍光タンパク質を有してもよい。４５℃以上の所定の温度で前記タンパク質合成反応が行われ、前記融合タンパク質由来の蛍光が確認され、前記融合タンパク質の沈殿が確認されなかった前記融合タンパク質をコードする変異遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に第２の変異を有する第２の変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、前記第２の変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、前記所定の温度以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、前記融合タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含んでもよい。前記確認する工程において、前記蛍光が確認され、前記タンパク質の沈殿が確認されなかった融合タンパク質を、耐熱化したタンパク質と判断してもよい。
てもよい。前記タンパク質の沈殿の有無が濁度測定によって確認されてもよい。前記タンパク質合成反応の反応液に超好熱菌由来のシャペロンが含まれてもよい。前記タンパク質
合成反応が、６０℃以上の温度で行われてもよい。前記タンパク質合成反応が、８０℃以上の温度で行われてもよい。前記融合タンパク質は、Ｃ末端とＮ末端の両側に検出波長の異なる蛍光を放出する蛍光タンパク質を有してもよい。４５℃以上の所定の温度で前記タンパク質合成反応が行われ、前記融合タンパク質由来の蛍光が確認され、前記融合タンパク質の沈殿が確認されなかった前記融合タンパク質をコードする変異遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に第２の変異を有する第２の変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、前記第２の変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、前記所定の温度以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、前記融合タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含んでもよい。前記確認する工程において、前記蛍光が確認され、前記タンパク質の沈殿が確認されなかった融合タンパク質を、耐熱化したタンパク質と判断してもよい。
本発明によって、効率の良い新規なタンパク質耐熱化方法を提供できるようになった。
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝タンパク質耐熱化方法＝＝
本明細書に開示の方法は、タンパク質を耐熱化するための方法であって、タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子の、タンパク質をコードする遺伝子に変異を有する変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、４５℃以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、蛍光タンパク質の蛍光の有無と、タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含む方法である。以下、図１を参照しながら、具体的な方法を詳細に述べる。
本明細書に開示の方法は、タンパク質を耐熱化するための方法であって、タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子の、タンパク質をコードする遺伝子に変異を有する変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、４５℃以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、蛍光タンパク質の蛍光の有無と、タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含む方法である。以下、図１を参照しながら、具体的な方法を詳細に述べる。
耐熱化するタンパク質は、遺伝子が明らかになっているものであれば、特に限定されない。耐熱化するタンパク質を、蛍光タンパク質の融合タンパク質とするため、その融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製する。融合タンパク質は、耐熱化するタンパク質のＮ端側に蛍光タンパク質が融合していても、Ｃ端側に蛍光タンパク質が融合していても、かまわない。耐熱化するタンパク質のＮ端側とＣ端側の両方に融合していてもよく、その場合、Ｎ端側とＣ端側とで、異なる蛍光波長を放出する蛍光色素を用いることによって、タンパク質が初めから最後まできちんと翻訳されたかどうかを確認することができる。耐熱化するタンパク質と蛍光タンパク質との間に５〜２０残基のペプチドリンカーを導入してもよい。ペプチドリンカー内に、特異的なペプチダーゼの認識配列を入れておくと、すべての反応が終わった後で、蛍光タンパク質の部分を切断して除去することができる。これらの融合タンパク質は、発現ベクターを用いて、各々をコードする遺伝子をＤＮＡレベルで融合させ、発現させることにより合成できる。
次に、この融合遺伝子のうち、耐熱化するタンパク質をコードする遺伝子に対して、ｅ
ｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等によってランダムに変異を入れたライブラリーを作製する。融合遺伝子に対して変異を導入すると、蛍光タンパク質をコードする遺伝子にも変異が入ることがある。しかしながら、蛍光タンパク質をコードする遺伝子に変異が入って、機能が失われたとしても、後の段階で、蛍光タンパク質が蛍光を発している融合タンパク質を特定する工程があるので、蛍光を発しない融合タンパク質が混じっても、問題にならない。あるいは、先に、耐熱化するタンパク質をクローニングし、同様に変異を導入してから５’端及び／又は３’端に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を結合させることも考えられる。このようにすれば、耐熱化するタンパク質にのみ変異を導入できる。
ｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等によってランダムに変異を入れたライブラリーを作製する。融合遺伝子に対して変異を導入すると、蛍光タンパク質をコードする遺伝子にも変異が入ることがある。しかしながら、蛍光タンパク質をコードする遺伝子に変異が入って、機能が失われたとしても、後の段階で、蛍光タンパク質が蛍光を発している融合タンパク質を特定する工程があるので、蛍光を発しない融合タンパク質が混じっても、問題にならない。あるいは、先に、耐熱化するタンパク質をクローニングし、同様に変異を導入してから５’端及び／又は３’端に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を結合させることも考えられる。このようにすれば、耐熱化するタンパク質にのみ変異を導入できる。
得られた変異遺伝子のライブラリーを限界希釈する。加熱処理と光学的観察が可能なマルチウエルプレートを用いるのが好ましい。各ウエルに遺伝子が１個以下しか入らないようにする。あるいは、ドロップレットデジタルＰＣＲのためのドロップレット１個中に１分子入るよう希釈してもよい。
そのようにして準備されたサンプルに対し、ＰＣＲを行う。ドロップレットデジタルＰＣＲの場合は、反応終了後、各ドロップレット内で増幅した融合遺伝子をそれぞれマルチウエルプレートのウエルに移す。この際、すべてのサンプルを少量ずつ確保しておく。そして、熱耐性が得られたタンパク質が特定されたら、対応するＤＮＡを回収し、クローニングすることによって、利用可能になる。
好熱菌または超好熱菌より得られた無細胞タンパク質合成系溶液を適量ずつマルチウエルプレートの各ウエルに分注する。マルチウエルプレートを４５℃〜８０℃（好熱菌）または８０℃〜９０℃（超好熱菌）で数分〜十数分間程度静置或いは振とうして、タンパク質合成を促進する。ここで、好熱菌とは、至適生育温度が４５℃〜８０℃の微生物の総称であって、超好熱菌は、至適生育温度が８０℃〜９０℃の微生物の総称である。好熱菌または超好熱菌から無細胞タンパク質合成系溶液の作製は、公知の方法で行うことができる。（Endoh et al., (2006) J. Biotech., 126, 186-195.；Gullo et al., (2019) Archaea 2019, 9848253.）用いる好熱菌または超好熱菌は特に限定されないが、アーキアであることが好ましい。特に、Thermococcus kodakarensis、Pyrococcus furiosus、またはSulfolobus solfataricusであることが好ましい。
各ウエルは限界希釈されたＤＮＡが入っているので、中にはＤＮＡが空のウエルがある。タンパク質合成反応後に、融合タンパク質からの蛍光を観察する。目視で観察してもよいが、プレートリーダーで蛍光強度を測定してもよい。ＤＮＡが増幅していれば、強い蛍光が観察される。
タンパク質合成後、反応液をさらに４５℃〜９０℃、あるいは８０℃〜９０℃で２分〜５分程度加熱する。加熱温度・時間は特に限定されず、当業者であれば適宜選択できる。変異タンパク質が熱耐性を獲得していなければ、合成された変異タンパク質は熱変性し、沈殿を生じる。そこで、濁度測定や動的光散乱測定などを行って、そのような沈殿が生じたかどうかを確認することができる。あるいは、蛍光を目視して観察するか、カメラで撮像し観察すると、沈殿ができていれば、そのウエルを容易に特定することができる。このように、耐性を付与するタンパク質に蛍光タンパク質を融合させておくことによって、ＤＮＡが増幅したことを容易に検知でき、また、熱変性したかどうかも、容易に確認できる。
こうして、熱耐性を獲得した融合タンパク質が特定できたら、それに対応するＤＮＡを、途中で確保しておいたサンプルから回収する。そのＤＮＡを用いて、この方法を繰り返し、タンパク質合成後の加熱温度を上げていくことによって、より高温の熱に耐性になったタンパク質が得られるようになる。
Claims (13)
- タンパク質を耐熱化するための方法であって、
前記タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に変異を有する変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、
前記変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、
前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、
前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、４５℃以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、
前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含む、方法。 - 前記確認する工程において、前記蛍光が確認され、前記タンパク質の沈殿が確認されなかった融合タンパク質を、耐熱化したタンパク質と判断する、請求項１に記載の方法。
- 前記好熱菌または超好熱菌が、好熱古細菌または超好熱菌である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記好熱菌または超好熱菌がアーキアである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記好熱菌または超好熱菌が、Thermococcus kodakarensis、Pyrococcus furiosus、またはSulfolobus solfataricusである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質の沈殿の有無が動的光散乱法によって確認される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質の沈殿の有無が濁度測定によって確認される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質合成反応の反応液に超好熱菌由来のシャペロンが含まれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質合成反応が、６０℃以上の温度で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質合成反応が、８０℃以上の温度で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質は、Ｃ末端とＮ末端の両側に検出波長の異なる蛍光を放出する蛍光タンパク質を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- ４５℃以上の所定の温度で前記タンパク質合成反応が行われ、前記融合タンパク質由来の蛍光が確認され、前記融合タンパク質の沈殿が確認されなかった前記融合タンパク質をコードする変異遺伝子の、前記タンパク質をコードする遺伝子に第２の変異を有する第２の変異遺伝子のライブラリーを作製する工程と、
前記第２の変異遺伝子のライブラリーを限界希釈し、デジタルＰＣＲによって各希釈液に対して核酸増幅反応を行う方法と、
前記核酸増幅反応後の各希釈液を、好熱菌または超好熱菌由来の無細胞タンパク質合成系溶液と混合する工程と、
前記混合した無細胞タンパク質合成系溶液に対して、前記所定の温度以上の温度でタンパク質合成反応を行う工程と、
前記蛍光タンパク質の蛍光の有無と、前記融合タンパク質の沈殿の有無とを確認する工程と、を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 - 前記確認する工程において、前記蛍光が確認され、前記タンパク質の沈殿が確認されなかった融合タンパク質を、耐熱化したタンパク質と判断する、請求項１２に記載の方法。
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| 今堀・山川編, 生化学辞典（第３版）, JPN6023009877, 1 March 2000 (2000-03-01), pages 861, ISSN: 0005108265 * |
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