TWI404798B - Ｄｎａ聚合酶突變株 - Google Patents

Description

DNA聚合酶突變株

本發明關係一種篩選高活性突變DNA聚合酶基因的方法，以及一種突變之新穎DNA聚合酶I及其應用。特言之，本發明係提供一種利用加熱去活性篩選高活性或耐熱性DNA聚合酶的方法，以及一種新穎高活性Taq DNA聚合酶及其基因，包括突變之蛋白質及DNA序列及其在製備長片段DNA或高靈敏性檢測試劑組之應用。

DNA聚合酶負責複製及維持基因組的完整性，可正確將遺傳訊息一代一代傳遞下去。DNA聚合酶在細胞的功能是種負責合成DNA的酵素，其以金屬離子當活化劑，例如Mg²⁺，以DNA為模板，用鹼基互補的原理，依模板DNA的序列將去氧核苷三磷酸，一一聚合成互補股去氧多核苷酸鏈。在生物體內DNA聚合酶參與DNA合成程序包括DNA複製、DNA修補、重組及基因增幅(Korberg and Baker,DNA Replication,W.H.Freeman and Co.,New York(1992))。DNA聚合酶依其胺基酸序列可分為三族(D.K.and Ito,J.(1993)Nucl.Acids Res,21,787-802)。DNA聚合酶I除具有合成DNA功能外一般有5`→3`及3`→5`外切酶活性是一種修補DNA酶，聚合酶II以損壞模板開始進行DNA合成，用以防止突變，聚合酶III是細胞進行複製DNA之酵素具高合成速率(約30,000/分)，其沒有5`→3`外切酶活性。其他DNA聚合酶之特性則來自出處，例如原自高溫菌之耐熱性DNA聚合酶。所有種類DNA聚合酶立體折疊形式，大致相似於拇指與其它手指張開之人類右手型狀，包括手掌、拇指及其他手指等三個不同次區塊，(Beese et al.Science 260,352-355(1993)；Patel etal.,Biochemistry 34：5351-5363(1995)，手指及母指次區塊在不同DNA聚合酶之大小不 同，而進行催化反應之手掌次區塊則所有種類DNA聚合酶都一致重疊。X-光散射研究DNA聚合酶I、DNA模板及核苷酸基質三者之共結晶，指出每個區塊在催化反應中的功能(S.Doublie.et al.Nature 391(1998)251-258；Y.Li,et.al.EMBOJ.17(1998)7514-7525；J.R.Kiefer.et.al.Nature391(1998)304-307)DNA聚合酶是維持基因組完整性之中心。他們催化DNA合成反應以DNA其中一股為模板指引加入互補去氧核苷酸到一條DNA引子進行引子延伸反應，其功能為複製、修復及重組DNA。酵素使用其掌狀及拇指區塊把握住DNA引子及模板之雙股DNA，而手指則彎曲靠近掌部而形成新鹼基對之咬合袋。引子-模板聚合反應有方向性，引子3`端接近手指而5`端接近拇指。進行催化反應時，此些DNA聚合酶區塊會進行二種構型轉換。第一種開放(open)構型是將拇指移離手掌，打開拇指-手掌以咬住DNA基質，第二種閉合(closed)構型是將手指彎曲轉向手掌，並進行核苷酶接合，酵素由”開放(open)”到”閉合(closed)”構型轉變會限制活性位置大小，形成手指與核苷酸重要接觸及協助建立基質辨識及併入所需的構型正確核苷酸。

生物體內在每種DNA合成程序中，DNA模板被複製一次，產生相同的複本。相反的在試管中，DNA複製可多次反覆進行，例如，聚合酶鏈反應(Mullis,U.S.Pat.No.4683202)，可多次反覆複製特定DNA片段，製備大量DNA。DNA聚合酶鏈反應技術在起始應用階段時，必須加入DNA聚合酶在每個複製DNA週期的起始步驟(U.S.Pat.NO.4683202)。後來由長在溫泉中菌株獲得耐熱性DNA聚合酶，耐熱性酵素參與PCR反應只需加入一次(Gelfand,U.S.Pat.NO.4889818)，在PCR高溫階段，這些酵素並不會被變性。因此，在聚合酶鏈反應的循環重覆之DNA合成週期中，並不需要在每週期DNA合成的起始步驟都補充新鮮DNA聚合酶。DNA聚合酶，尤其是耐熱性DNA聚合酶，在大部分有關重組DNA技術及病原核酸的 醫學檢測都扮演著關鍵角色。尤其是檢驗方面的應用，一個標的核酸序列可能只是待測DNA或RNA中小部份，所以若沒有PCR增幅反應可能很難檢測到標的核酸序列。因此DNA聚合酶在生物技術及醫學上應用層面廣泛其產業價值高。

許多DNA聚合酶演化出具有選擇基質及高效率催化DNA合成的功能。他們能夠剔除非互補鹼基去氧核苷酸及核苷酸，DNA聚合酶正確性缺陷可能會導致老化及增加癌症機率。DNA聚合酶選擇性不但對生物學家很重要同樣對生物技術人員也很重要。高正確性耐熱DNA聚合酶可用以基因選殖而低正確性DNA聚合酶則用於突變PCR增幅反應。DNA聚合酶對雙去氧核苷酸或螢光標記核苷酸較有效率者，則通用在Sanger定序及DNA陣列使用。

在生技產業上依據應用目的不同，需不同特性之DNA聚合酶，適於DNA定序之酵素則需對雙去氧及去氧核苷酸分辨度不好，相對了具有3`→5`外切酶活性之聚合酶則不適於DNA定序，PCR技術應用領域相當廣泛，由古生物DNA鑑定、刑事鑑定、親子鑑定、病毒檢測，每個領域對所使用DNA聚合酶特性要求不一，例如病毒檢測之PCR技術要求高效率、高靈敏性，鑑定PCR技術則需求高特異性，基因選殖要求高正確性，突變PCR則要求高突變性、低正確性，DNAShuffing PCR技術則要求較低溫的最適延伸溫度，熱啟動PCR技術則要求低溫沒殘餘聚合酶活性，長片段PCR技術則需求快速合成及少許校讀活性的DNA聚合酶；不同PCR應用領域要求不同特性DNA聚合酶，因此有需要開發各種不同特性DNA聚合酶以合乎各領域的需求，例如破壞5`→3`外切酶活性可以增加DNA聚合酶耐熱性(Merkens,L.S.(1995)Biochem.Biophys.Acta 1264,243-248,Jacobsen,H.(1974)Eur.J.Biochem.45,623-627；Bames,W.M.(1992)Gene112,29-35)。減少區別雙去氧及去氧核苷酸能力以增加DNA定序的效能(Tabor S.and Richardson,C.C.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92, 6339-6343)。在產業製備DNA聚合酶層面，許多特性聚合酶將有便於製備增加產率，降低成本，增加產品市場競爭力，例如高比活性將會增加產量；高耐熱性會增加純化方便性，都能有效降低聚合酶成本，提高聚合酶品質，增加聚合酶市場競爭力。所以製備具有不同特性的DNA聚合酶突變株以符合不同領域的需求，例如高正確性或高比活性，將會有很高的產業優勢。

本計劃目的即是建立一種利用加熱去活性篩選高活性或耐熱性DNA聚合酶的方法，並篩選出高比活性聚合酶。

發明簡述

本發明之目標即係建立一種快速篩選高活性DNA聚合酶的方法，並篩選一種新穎突變之高比活性DNA聚合酶。

本發明進一步之目標係提供一種新穎突變之高比活性DNA聚合酶基因，蛋白質表現質體及轉形菌株等。

本發明另進一步之目標係提供製備長DNA片段或高靈敏性檢測試劑組，其包含本發明所揭示之新穎高比活性DNA聚合酶。

發明詳細說明

本發明係揭示快速篩選高活性DNA聚合酶的方法及突變之新穎高比活性DNA聚合酶基因及其蛋白質。

本發明所揭示之快速篩選高活性DNA聚合酶之方法，係將隨機突變之DNA聚合酶基因庫轉形表現宿主細胞，每個突變基因轉形之細胞並形成單一細胞株，用牙籤將每個單一株細胞種於不含DNA聚合酶之PCR反應液中，進行PCR反應前，先以高溫處理失活DNA聚合酶，再進行PCR反應，偵測及挑選有殘留DNA聚合酶活性之細胞株；重覆此篩選步驟，並逐次延長高溫前處理時間，即可有層次篩選出活性越來越高的細胞株及其攜帶之突變高活性或高耐熱性DNA聚合酶 基因。

本發明亦揭示新穎高比活性Taq DNA聚合酶及其基因、表現質體與菌株，係利用易突變PCR技術突變野生型Taq DNA聚合酶基因，將突變Taq DNA聚合酶基因黏接於蛋白質表現載體並轉形勝任細胞，構築突變Taq DNA聚合酶基因庫，再用前述之快速篩選高活性DNA聚合酶的方法篩選突變Taq DNA聚合酶基因庫，逐次延長高溫前處理時間，最後在95℃前處理20分鐘後仍有一細胞株(T003)殘留DNA聚合酶活性；培養此高活性T003細胞株並抽其質體(pUC18/Taq(T003)/His)轉形勝任細胞，轉形之細胞株，以95℃前處理20分鐘後仍具有殘留之DNA聚合酶活性，確認pUC18/Taq(T003)/His為高活性DNA聚合酶表現質體；進一步以限制酶由表現質體將Taq DNA聚合酶基因切出並重新接入pUC18表現載體，再轉形勝任細胞，轉形之細胞株，以95℃前處理20分鐘仍具有殘留之DNA聚合酶活性，確認由高活性細胞所抽取之高活性pUC18/Taq(T003)/His表現質體其具有T003高活性突變Taq DNA聚合酶基因，定序此T003高活性突變Taq DNA聚合酶基因，並與野生株Taq DNA聚合酶基因序列比對，發現在2027鹼基位置由A突變成G，導致Taq DNA聚合酶第676胺基酸由組胺酸(Histidine)變成精胺酸(Arginine)；進一步利用PCR技術進行定點突變，將野生株Taq DNA聚合酶基因第2027鹼基，由A改成T003 Taq DNA聚合酶基因之G鹼基；黏接於表現載體，並轉形勝任細胞，轉形後之細胞，以95℃前處理20分鐘後，檢測其DNA聚合酶殘留活性，經實驗證明只要第676胺基酸為精胺酸以95℃前處理20分鐘後都有殘留DNA聚合酶活性，而第676位置若為組胺酸之Taq DNA聚合酶經95℃前處理20分鐘後則沒有殘留活性。

進一步分析高活性R676 Taq DNA聚合酶性質，將純化之1μg R676及H676 Taq DNA聚合酶活性2倍序列稀釋後用PCR反應測其相對活 性，等量之R676 Taq DNA聚合酶活性約為H676 Taq DNA聚合酶之4倍，所以R676 Taq DNA聚合酶之比活性約為H676 Taq DNA聚合酶4倍；另比較其PCR增幅反應之效率，引子延伸反應72℃ 8分鐘可合成15 kb λ噬菌體DNA片段，而H676 Taq DNA聚合酶只能合成到12 kb，同樣合成之12 kb λ噬菌體DNA片段，R676之產量也顯著較H676 Taq DNA聚合酶多，所以R676 Taq DNA聚合酶其PCR增幅反應效率亦較H676 Taq DNA聚合酶好；另進一步比較PCR檢測之靈敏性，在相同PCR增幅條件下，檢測10倍序列稀釋之質體，結果顯示R676 Taq DNA聚合酶可檢測到10個質體，而H676 Taq DNA聚合酶僅能檢測到10⁴個，兩者相差約1000倍。

所以本發明揭示一種新穎高比活性及高效率R676 Taq DNA聚合酶及其基因、表現質體與轉形細胞株，不但其轉形菌株之總活性產量較野生型轉形菌株高，可降低生產者製備Taq DNA聚合酶成本，且PCR增幅反應之效率也較H676 Taq DNA聚合酶高，可增加PCR產量、增幅長片段標的DNA及檢測微量標的DNA。

以下茲舉若干實例以具體說明本發明內容，但本發明之範例並不受此等實例所限。

實例一、pUC18/His表現載體構築

本實例目的在構築含有編碼6個組胺酸序列之pUC18/His載體，便利後續將Taq DNA聚合酶基因加入後能表現出Taq DNA聚合酶且蛋白質羧端具有6個組胺酸，便於後續蛋白質純化，首先根據pET20b(Novogen公司)序列，設計PET(SEQ ID NO：1)及PXR(SEQ ID NO：2)引子對，以pET20b(+)為模板，利用PCR技術，擴增出pET20b從EcoR I切位到TGA(轉譯終止碼)後約110 bp DNA片段，5’端有EcoR I切位，3’端為Xba I切位；再以EcoR I及Xba I切位接到pUC18 表現載體上，即構築成pUC18/His表現載體，詳細實驗步驟如下：根據pET20b(+)載體序列(Novogen公司)，設計正向引子PER(SEQ ID NO：1)，5’端有EcoR I切位；反向引子PXR(SEQ ID NO：2)，5’端有Xba I切位，用pET20b(+)載體為模板，以PCR增幅反應，擴增約110 bp的DNA片段，將PCR產物以PCR純化試劑組純化，並以EcoR I及Xba I限製酶切割PCR產物及pUC18載體，純化限制酶切割後之DNA片段，並將其混合，加入T4 DNA連接酶，在16℃反應30分鐘後轉形DH5α勝任細胞，塗在LB/Amp平盤上，在37℃隔夜培養，將長於平盤上之單一菌株種於3 mL LB/Amp培養基中，37℃隔夜培養，用試劑組抽質體，以EcoR I及Xba I切出約110 bp及2.5 Kb DNA片段，証明已將110 bp DNA片段接入pUC18，命名為pUC18/His表現載體。

實例二、Taq DNA聚合酶表現質體構築

本實例目的在製備能表現Taq DNA聚合酶之質體，首先根據EMBL基因庫之J04639報告之Taq DNA聚酶基因序列，設計引子，並在正向引子加入EcoR I限切酶序列，反向引子加入Not I限切酶序列；用PCR技術由Thermus aquaticus YT-1菌株(BCRC1710)之DNA擴增出Taq DNA聚合酶基因，並以EcoR I及Not I限切酶位點接入pUC18/His載體，構築成pUC18/Taq/His質體，將其轉形到DH5α菌株，經LB/Amp平盤篩選，挑單一菌株以LB/Amp培養基培養，加IPTG誘導，超音波破菌，離下菌渣，可在上清液測得耐熱性DNA聚合酶之活性，詳細實驗步驟如下：

Taq DNA聚合酶基因的選殖

根據EMBL J04639報告，設計正向引子TEF(SEQ ID NO：3)與反向 引子TNR(SEQ ID NO：4)，正向引子在5’端帶有EcoR I限制酶切位，反向引子在5’端為Not I限制酶序列，以Thermus aquaticus YT-1菌株(BCRC1710)總DNA為模板加入TEF(SEQ ID NO：3)及TNR(SEQ ID NO：4)引子對，以PCR增幅反應，擴增出約2.5 Kb的DNA片段。將PCR擴增產物以PCR純化試劑組(Qiagen)純化，以EcoR I及Not I限制酶切割PCR擴增產物及puc18/His載體，純化限制酶切割後的pUC18及2.5 Kb DNA片段(PCR產物)並將其混合，加T4 DNA連接酶，在16℃反應30分鐘後，轉形DH5α勝任細胞，塗在LB/Amp平盤上，在37℃隔夜培養，將長於平盤上之單一菌株種於3 mL LB/Amp培養基中，37℃隔夜培養，用試劑組(Qiagen)抽質體，命名為pUC18/Taq/His質體。將pUC18/Taq/His質體轉形DH5α勝任細胞，種單一菌株在3 mL LB/Amp培養基中隔夜培養後，加入0.5 mM IPTG誘導4小時，超音波破菌，取上清液，以8% SDS-PAGE分析可看到約94 KDa蛋白質被誘導出，另將1 μl上清液加入不含Taq DNA聚合酶之PCR混合液，進行PCR增幅反應可增幅出標的DNA片段，顯示上清液含有Taq DNA聚合酶活性，確認puc18/Taq/His表現質體帶有編碼且具活性Taq DNA聚合酶之基因，根據J04639之報告，每隔500 bp合成一段引子且正、反向各設計6個引子共用12段引子(SEQ ID NO：5到16)分別為TD350、TD700F、TD1050F、TD1400F、TD1750F、TD2100、TD2150R、TD1700R、TD1350R、TD1000R、TD650R、TD300R定序pUC18/Taq之Taq基因全長DNA序列，定序結果如SEQ ID NO：17所示，其編碼之蛋白質序列如SEQ ID NO：18所示，此Taq/His融合蛋白質共有846個胺基酸，第1到5個胺基酸屬pUC18多選殖位點序列；Taq/His第6到835個胺基酸屬Taq DNA聚合酶，由Taq DNA聚合酶第3到最後一個胺基酸，Taq/His蛋白質第836到846胺基酸屬原pET20b質體編碼之Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His序列。

實例三.隨機突變Taq基因庫之構築

本實例目的在製備隨機突變Taq之基因庫，係以易突變(error-prone)PCR技術突變Taq基因，然後以pUC18為載體，連接成pUC18/mt Tag/His質體，再將其轉形DH5α宿主菌株，以LB/Amp平盤篩選，即完成隨機突變Taq基因庫之構築，詳細實驗步驟如下：

(一)隨機突變Taq(mTag)基因之製備

A.易突變(error-prone)PCR

以P18EF(SEQ ID NO：19)和P18XR(SEQ ID NO：20)引子對及pUC18/Taq/His質體當模板，利用易突變PCR技術增幅Taq基因。PCR的反應液(50 μl)包含1X PCR緩衝液(2.5 mM MgCl₂)，0.2 μM 18EF(SEQ ID NO：19)，0.2 μM 18XR(SEQ ID NO：20)，0.25mM dNTPs，10% DMSO，0.08 ng pUC18/Taq質體及0.08 U/μl Taq DNA polymerase。反應條件為：94℃ 1分鐘；接著於94℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 2.5分鐘重複35個循環；然後再於72℃ 3分鐘。以PCR增幅出DNA片段，以0.8%洋葉膠於1X TAE緩衝液進行電泳分離，並於UV燈下照相檢視有2.5 Kb DNA片段。再以PCR純化試劑組(Qiagen公司)進行純化，依說明書步驟純化PCR產物。

B.限制酵素切割

PCR產物經純化後以限制酵素Xba I及EcoR I剪切，於37℃在H緩衝液反應2小時，以0.8%洋菜膠分離PCR產物，並切下2.5 Kb DNA片段。使用膠純化試劑組(Qiagen公司)依說明書步驟進行2.5 Kb DNA片段純化。最後以30 μl EB緩衝液沖提出2.5 Kb DNA片段。將純化出的DNA片段以0.8%洋菜膠於1X TAE緩衝液進行電泳分離，並於UV燈下照相檢測為約2.5 Kb DNA片段。

(二)pUC18載體表現隨機突變Taq基因庫

A. pUC18載體的製備

pUC18質體轉形DH5α，挑單一菌落接種至3 mL含100 μg/mL LB/Amp培養基震盪培養14~16小時。以質體純化試劑組抽取質體，依說明書步驟抽取，最後以50 μl EB緩衝液沖提出pUC18質體。pUC18質體以限制酵素Xba I及EcoR I剪切，於37℃以H緩衝液反應2小時，使pUC18切出Xba I及EcoR I接位。酵素反應完之產物以0.8%洋菜膠分離，並切下線性質體以膠純化試劑組進行純化，根據說明書步驟操作純化出約2.6 Kb的線性pUC18 DNA。

B.隨機突變Taq基因庫之構築

以限制酵素Xba I及EcoR I剪切過之載體pUC18及突變(mt)Taq基因經膠純化後，跑電泳檢視DNA量的對比。以DNA莫耳數比值約1：4(pUC18：mtTaq)混合，再加入等量DNA黏合緩衝液(TaKaRa公司)，置於16℃反應30分鐘後，加入100 μl DH5α勝任細胞(益生生技公司)混合均勻，靜置於冰上20分鐘，接著置於42℃恆溫水浴槽中45秒，然後放回冰上，加入900 μl LB培養基混合均勻後，平均直接塗於3盤LB/Amp平盤上，置於37℃培養14~16小時，長出之菌株具有pUC18/隨機突變Taq/His質體，全部之菌株即構成一組隨機突變Taq基因庫。

實例四.Taq高活性菌株之篩選

本實例之目的係由隨機突變Taq DNA聚合酶之基因庫，先利用高溫前處理去活性後在以不含耐熱性DNA聚合酶之PCR混合液，利用PCR增幅反應檢測有殘留活性之較高活性或高耐熱性菌株，並逐次延長前處理時間就可逐次篩選到更高活性或更高耐熱性之菌株；本發明經由前處理20分鐘後仍殘留Tag活性之T003菌株，抽取其質體，重新轉形DH5 α，挑單一個菌株培養並加IPTG誘導Taq DNA聚合酶表現後破菌取上清液，將上清液序列2倍稀釋後以PCR增幅反應檢測Taq DNA 聚合酶活性，其具有PCR產物之最高稀釋倍數較原pUC18/Tag轉形之菌株上清液多4倍表示其原上清液活性高約4倍，顯示所篩選到之質體為高活性Taq DNA聚合酶之表現質體；詳細之實驗步驟如下：

(一)Taq高活性菌株之快速篩選

利用PCR擴增反應，篩選有Taq DNA聚合酶活性之菌株。不含Taq DNA聚合酶之PCR反應液(25 μl)包含1X PCR緩衝液(1.5 mM MgCl₂)、0.2 μM P18F(SEQ ID NO：21)引子、0.2 μM P18R(SEQ ID NO：22)引子、0.25 mM dNTPs及0.08 ng pUC18質體，以牙籤由Amp/LB平盤挑單一菌落在96孔平盤中攪拌及在新的LB/Amp平盤上留樣，平盤置於37℃培養12~16小時。96孔平盤先95℃前處理一段時間；接著進行PCR擴增反應95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分鐘，重複30個循環；然後再於72℃ 1分鐘。PCR擴增之1 Kb DNA片段以0.8%洋菜膠於1X TAE buffer進行電泳分離，並於UV燈下照相檢視。有PCR產物的菌株再重覆上述PCR擴增反應並逐次延長95℃前處理時間，最後在95℃前處理20分鐘後，僅剩一菌株，命名為T003，仍殘留有DNA聚合酶活性，如圖一所示。

(二)菌種保存

在微量離心管中添加400 μl LB/Amp培養基，將篩選出有活性的菌株種在LB/Amp培養基中，置於37℃震盪培養12~16小時。隔天在新的微量離心管中加200 μl 100%甘油，再添加200 μl菌液混合均勻，保存於-80℃冰箱。

(三)菌株粗萃取液之Taq DNA聚合酶活性檢測

T003菌株種於3 mL的LB/Amp培養基在37℃隔夜培養，利用質體抽取試劑組(GeneMark公司)依說明書步驟進行質體抽取。將新抽取之pUC18/Taq(T003)/His及pUC18/Taq/His質體重新轉形DH5α勝任細胞。pUC18/Taq(T003)/His及pUC18/Taq/His轉形菌株分別種於3 mL的LB/Amp培養基中，37℃培養16小時，加入3 μl 1M IPTG誘導3小時，離心1分鐘丟棄上清液收菌塊，加入200 μl TE緩衝液打散菌塊，利用超音波破菌機分解菌體。破菌完成後在4℃以12000 rpm離心10分鐘，取上清液至新微量離心管。

將上清液樣品2倍序列稀釋：2X、4X、8X、16X、32X、64X。配置PCR反應液：0.08 ng/μl pUC18、1X PCR緩衝液(1.5 mM Mgcl₂)、0.2 μM P18F(SEQ ID NO：21)引子、0.2 μM P18R(SEQ ID NO：22)引子、0.25mM dNTPs、補ddH₂O至總體積為24 μl，再將各序列稀釋上清液樣品1 μl加入。先95℃ 1分鐘，再進行PCR擴增反應：95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分鐘，進行30個循環，再72℃延伸1分鐘。將PCR增幅反應結果跑0.8%洋菜膠，發現原pUC18/Taq(T003)/His轉形菌株之上清液可稀釋到256倍，而pUC18/Taq轉形菌株之上清液僅仍稀釋到64倍，顯示pUC18/Taq(T003)/His轉形菌株之粗萃取液活性較pUC18/Taq/His轉形菌株活性多4倍，如圖二所示。

實例五.Taq DNA polymerase突變位點的鑑定

本實例之目的在確認突變之pUC18/Taq(T003)/His表現質體其突變位點在Taq DNA聚合酶基因上且定序及比對出其突變鹼基位置。首先以Xba I及Eco RI限切酶由pUC18/Taq(T003)/His上，切出T003之Taq DNA聚合酶基因，再將其重新接到pUC18載體，轉形DH5α菌株，測其耐熱性DNA聚合酶活性，發現其活性與pUC/Taq(T003)/His突變株相同，故確認pU18/Taq/(T003)/His其突變位點在Taq DNA聚合酶基因上；根據EMBL基因庫J04639報告之Taq DNA聚合酶基因序列，約相隔500 bp設計定序引子，正向及反向各以6個引子定序Taq DNA聚合酶基因。DNA序列結果與野生株之序列比對，發現T003之Taq DNA聚合酶基因在第2027鹼基依EMBL基因庫J04639之Taq DNA聚合酶基因之鹼基序列編號由A變成G，其編碼之第676胺基 酸由組胺酸變成精胺酸。本實例詳細實驗步驟如下：

(一)突變Taq基因之確認

確認pUC 18/Taq(T003)/His突變位置是否位於Taq基因片段上，首先將2 μg pUC18/Taq(T003)/His質體，加入2.5 μl 20 U/μl的Eco R I、Xba I和10 μl的10X H緩衝液，補ddH₂O至100 μl，在37℃切反應2小時。將酵切後產物利用膠純化試劑組(Gene Maker公司)進行純化。因為pUC18載體和T003 Taq基因片段大小相當接近，所以利用Acl I在pUC18載體上剪切兩刀，使pUC18載體形成3小片段，透過膠純化分離便可以得到約2.5 Kb的T003 Taq基因片段，再將T003 Taq基因片段重新接至pUC18載体上，轉形DH5α菌株。將LB/Amp平盤上的菌株點菌在不含Taq DNA聚合酶之PCR反應液中檢測活性，先前處理95℃ 20分鐘後再用PCR增幅反應分析活性，挑出有活性菌株進行培養後質體抽取，將新抽取質體及原pUC18/Taq(T003)/His及pUC18/Taq等質體分別重新轉形DH5α菌株，進行粗萃取液Taq DNA聚合酶活性分析，結果顯示可檢測到PCR產物之粗萃取液最大稀釋倍數，與原先pUC18/Taq(T003)/His轉形DH5α之菌株相同為256倍而pUC18/Taq轉形之DH5α菌株為64倍，表示高活性之pUC18/Taq(T003)/His質體，其高活性自於T003 Taq DNA聚合酶基因。

(二)T003 Taq DNA聚合酶基因定序

利用先前定序Taq DNA聚合酶基因引子，定序T003 Taq DNA聚合酶基因。T003 Taq DNA聚合酶基因與野生株之Taq DNA聚合酶基因比對，顯示TaqDNA聚合酶基因在第2027個鹼基(依EMBL基因庫J04639之Taq DNA聚合酶基因之鹼基序列編號)由A變成G，其相對編碼之第676胺基酸由組胺酸突變成精胺酸，野生株與T003之TaqDNA聚合酶基因第676胺基酸附件序列此對如圖三所示。

實例六.Taq基因突變位點的置換

本實例之目的係利用PCR定點突變技術將野生株Taq DNA聚合酶基因利用PCR定點突變技術直接將編碼第676胺基酸由組胺酸改成精胺酸，亦可發現此轉形菌株之粗萃取液之Taq DNA聚合酶與pUC18/Taq/(T003)/His轉形菌株之活性相同都較pUC18/Taq/His高約4倍，所以證明Taq DNA聚合酶第676胺基酸為精胺酸時其活性較野生株Taq DNA聚合酶的組胺酸高約4倍。本實例詳細步驟如下：

(一)Taq基因第2027位置之A鹼基突變成G鹼基

以pUC18/Taq/His質體為模板進行PCR反應，使用正向引子TAlelF(SEQ ID NO.23)(含有Taq基因之Ale I切位)而反向引子T2027CR(SEQ ID NO.24)可將Taq基因在編碼第676位點的胺基酸由組胺酸修改為精胺酸，PCR反應液為：2 μl 10 ng/μl pUC18/Taq/His質體、10 μl 10X PCR緩衝液、2.5 μl 10 μM TAlelF引子、2.5 μl 10 μM T2027CR引子、2.5 μl 2 U/μl Taq/Pfu酵素、1 μl 25 mM dNTPs、補ddH₂O 79.5 μl使總體積為100 μl，樣品混勻後進行PCR反應，其PCR反應為：94℃ 1分鐘；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分30秒，重複35個循環；72℃延伸2分鐘。將PCR產物膠純化後得到約700 bp DNA片段。用Ale I及Nhe I限切酶，切割DNA片段，酵切反應液為60 μl DNA片段，2.0 μl Nhe I(10U/μl,NEB)，2.0 μl Ale I(10U/μl,NEB)，8 μl 10X No.4緩衝液，8.0 μl ddH₂O在37℃，反應2小時，後用PCR純化試劑組純化，得到Tag DNA聚合酶基因第1332到2052鹼基DNA片段。

(二)AleI及NheI酵素切割pUC18/Taq/His質體

酵切反應液為：57 μl pUC18/Taq/His質體、2.5 μl Ale I限切酶、2.5 μl Nhe I限切酶、10 μl 10X No.4緩衝液，補28 μl ddH₂O使總體 積為100 μl，樣品混勻後置於37℃反應2小時。用0.8%洋菜膠分離DNA切下約4.8 Kb DNA片段，利用試劑組(QIAGEN公司)進行純化，依說明書步驟純化，最後得到約4.8 Kb DNA片段，為原pUC18/Taq/His質體，刪掉Taq DNA聚合酶基因之Ale I到Nhe I位點之DNA片段。

將前述製備之0.7 Kb DNA片段及4.3 Kb DNA片段混合液加入5 μl DNA黏合緩衝液(Takara公司)，將樣品移至16℃的低溫水浴反應30分鐘進行黏合。黏合混合液加入100 μl轉形DH5α勝任細胞置冰1分鐘後於無菌操作台中加入300 μl LB培養基混勻，各取200 μl混合液均勻塗抹在2片LB/Amp平盤上，經過37℃隔夜培養後，利用PCR篩選有活性菌株。菌株培養於3 ml LB/Amp，於37℃隔夜培養後利用套組抽取質體，且定序DNA，確認第2027鹼基，由Taq DNA聚合酶之A變成G，其編碼之676胺基酸由組胺酸變成精胺酸。將菌株用3 mL LB/Amp培養，加IPTG誘導，萃取上清液，經2倍序列稀釋活性分析，確認其活性與pUC18/Taq(T003)/His相同，較pUC18/Taq/His大約4倍。

實例七.Taq DNA聚合酶純化及特定分析

本實例之目的係進一步純化H676Taq DNA聚合酶及R676 Taq DNA聚合酶，並進一步分析其菌株酵素表現量，酵素比活性及PCR效率，發現等量R676 Taq DNA聚合酶活性較H676 Taq高約4倍，所以其比活性約為原Tag DNA聚合酶4倍。另外，等單位活性Taq DNA聚合酶，在相同時間進行PCR擴增反應，R676 Taq DNA聚合酶所合成PCR產物也較H676Taq DNA聚合酶長且可檢測到最低標的基因個數也較H676 Taq DNA聚合酶低1000倍，顯示R676 Taq DNA聚合酶之PCR擴增效率較好，本實例詳細步驟如下：

(一)Taq DNA聚合酶之純化

將pUC18/Taq/His、pUC18/Taq(T003)/His質體轉型DH5α菌株，將轉形菌株各挑一顆養在3 ml LB/Amp中，置於37℃5震盪培養箱200 rpm隔夜培養，各取100 μl隔夜培養菌液加至新鮮50 ml LB/Amp培養基中，37℃ 200 rpm震盪培養8小時，8小時後取1 ml測菌液測OD₅₉₅是否為0.8~1.2，再加入50 μl 1M IPTG誘導培養16~18小時。取50 ml菌液至50 ml離心管後在4℃以8000 rpm離心15分鐘，丟棄上清液。留下菌塊，各加入1 ml TE緩衝液打散菌塊至均勻後轉移到5 ml塑膠管中，利用超音波破菌機分解菌體，將破菌後樣品轉移至微量離心管，在4℃以12000 rpm離心10分鐘，取出破菌上清液保存於4℃並留存20 μl待測活性。加入0.4 g(NH₄)₂SO₄到上清液，在4℃混合30分鐘，再將樣品在4℃以15000 rpm離心15分鐘並丟棄上清液，加入2.5 ml的NapA緩衝液(20mM Sodium phosphate、0.5M NaCl、20mM Imidazole)溶解沉澱物，溶解完後取到15 ml離心管在4℃以3000 rpm離心15分鐘，離心後收集上清液於5 ml塑膠管中冷藏於4℃，留存50 μl待測活性。將收集的上清液加入200 μl的鎳離子螯合樹脂後，在4℃混合15分，將樣品在4℃以3000 rpm離心5分鐘後丟棄上清液，另加入100 μl NapA於樣品中，在4℃混合10分鐘後，樣品在4℃以3000 rpm離心5分鐘並丟棄上清液，加入NapB(20mM Sodium phosphate、0.5M NaCl、200mM Imidazole)200 μl於樣品中在4℃混合15分鐘，將樣品在4℃以3000 rpm離心5分鐘收集上清液為最終純化Taq DNA聚合酶樣品。

(二)蛋白質濃度定量

以BSA當作標準品，將10 μg/μl BSA濃度序列稀釋為0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.75、2、2.5、3、3.5 μg/ml。BSA標準品及待測樣品的製備：取1 μl序列稀釋BSA標準品或樣品加399 μl H₂O及100 μl的Coomassie Brilliant Blue G-250。將序列濃度標準樣品與待測樣品，利用分光光度計(HITACHI U-2001)檢測OD_595nm吸收數值，將 BSA標準品之濃度與吸收值作線性迴歸，即可算出Taq DNA聚合酶蛋白質濃度(μg/μl)。

(三)H676及R676 Taq DNA聚合酶之SDS-PAGE電泳分析

H676及R676 Taq DNA聚合酶樣品的配置：首先將H676及R676 Taq DNA聚合酶樣品稀釋成5 μg/10 μl再各別加入3 μl 5X SDS樣品染料，將樣品加熱95℃ 3分鐘後振盪10秒，再以12000 rpm離心10分鐘。將預鑄之8% SDS-PAGE電泳膠片置入電泳槽，內外層皆注入電泳緩衝液，將欲分析的樣品注入樣品槽當中，並在其中一個樣品槽中注入3 μl蛋白質標準品(Gene Maker公司)以確認分子大小，電泳完畢後將膠體取出以ddH₂O浸泡，置於搖擺器50 rpm 10分鐘，倒掉ddH₂O後加入Instant Blue(GENE MARK公司)反應30分鐘，倒掉染劑，之後再以清水清洗膠體，將膠體以兩片透明玻璃紙包封，小心趕去氣泡，以夾子固定於玻璃板上並自然風乾，結果如圖四所示，H676及R676之Taq DNA聚合酶在純度、分子量，完整性及蛋白質量都相當一致。

(四)H676及R676 Taq DNA聚合酶比活性之比較

稀釋純化之H676及R676 Taq DNA聚合酶濃度為1μg/μl(1x)，再2倍序列稀釋為0.5 μg/μl(2x)、0.25 μg/μl(4x)、0.125 μg/μl(8x)、0.0625 μg/μl(16x)、0.03125 μg/μl(32x)。配置25 μl的PCR反應液含0.08 ng/μl pUC18質體、1 X PCR緩衝液(w/o BSA)、0.2 μM pUC18-5’(+)、0.2 μM pUC18-3’(-)、0.25 mM dNTPs、補ddH₂O至總體積為24 μl、並加入各序列稀釋樣品1 μl。進行PCR擴增反應，反應程式設定為94℃變性1分鐘；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分鐘，進行30個循環，72℃延伸1分鐘。將PCR產物以0.8%電泳膠分析，結果如圖五所示，有PCR產物之最大稀釋倍數，R676 Taq DNA聚合酶可稀釋到16倍而H676 Taq DNA聚合酶只稀釋到4倍，顯示0.03125μg R676 Taq與0.125μg H676 Taq有相同活性，所以R676 Taq DNA聚合酶之比活性約 為H676 Taq DNA聚合酶4倍，如圖五所示。

(五)H676及R676 Taq DNA聚合酶之長片段DNA合成效率比較

以λ ψ DNA當模板測是長片段DNA合成之效率PCR增幅反應液包括1×PCR緩衝液(1.5mM MgCl₂)、2.6 ng λDNA、0.5U Taq DNA聚合酶、0.2 mM dNTPs及0.2 μM引子對，正向引子為λ ψ F(SEQ ID NO：25)而反向引子分別為λ ψ R8(SEQ ID NO：26，8 Kb產物)、λ ψ R10(SEQ ID NO：27，10 Kb產物)、λ ψ R12(SEQ ID NO：28，12 Kb產物)；λ ψ R15(SEQ ID NO：29，15 Kb產物)；PCR增幅程式為95℃ 30秒，30個循環94℃ 5秒及72℃ 8分；72℃ 2分。PCR增幅反應結束後，取10 μl產物混合DNA填注染料，跑0.8%洋菜膠，結果如圖六所示，R676 Taq DNA聚合酶可增幅出15 Kb λ ψ DNA，而H676 Taq聚合酶只到12 Kb；另12 Kb λ ψ DNA產量，R676 Taq DNA聚合酶也較H676 Taq DNA聚合酶顯著增加。所以R676 Taq DNA聚合酶之PCR效率較H676 Taq聚合酶好，可以製備較長片段PCR產物。

(六)H676及R676 Taq DNA聚合酶之檢測靈敏性比較

以10倍序列稀釋之pUC19/R2(將神經壞死病毒(NNV)之RNA2 cDNA接到pUC19質體上)質體，測試Taq DNA聚合酶之檢測靈敏性。PCR增幅反應液包括1x PCR緩衝液(1.5 mM MgCl₂，w/o BSA)，0.5 U Taq DNA聚合酶、0.2 mM dNTPs及0.2 μM R2N251F(SEQ ID NO：30)，及0.2 μM R2N437R(SEQ ID NO：31)為引子對及各種不同濃度pUC19/R2質體(由10⁶到10⁰)，PCR反應液總體積為25 μl。PCR增幅程式為94℃ 1分鐘，35個循環94℃ 30秒及54℃ 30秒、72℃30秒；72℃ 1分。PCR增幅反應結束後，取10 μl產物混合DNA填注染料，跑2.0%洋菜膠，結果如圖七所示，R676 Taq DNA聚合酶在10個以上之pUC19/R2質體有很清楚標的DNA產物而H676 Taq DNA聚合酶必須在10⁴以上質體才檢測到，顯示R676 Taq DNA聚合酶其檢測靈敏性高於H676 Taq DNA聚合酶1000倍以上。

實例總結

本發明是由突變Taq DNA聚合酶基因庫，利用快速簡易篩選方法，篩選到高活性Taq DNA聚合酶基因(T003)，其在第2027鹼基發生突變由A變成G，其編碼之第676胺基酸也隨之由組胺酸突變成精胺酸，進一步純化、定量及分析H676及R676 Taq DNA聚合酶特性，發現R676的比活性約為H676 Taq DNA聚合酶4倍，且其PCR增幅效率也較好，可擴增出15 Kb入ψ DNA片段及檢測到10個標的DNA。所以本發明揭示一種快速簡易之篩選高活性或高耐熱性DNA聚合酶的方法，且也揭示一新穎高比活性及高效率Taq DNA聚合酶及其基因。本發明所揭之新穎之快速簡易之高活性DNA聚合酶篩選方法可供產業界快速篩選高活性或高耐熱性DNA聚合酶，所揭示之新穎基因可供業界生產高比活性Taq DNA聚合酶，增加DNA聚合酶單位活性產量，可降低成本，且所製備之新穎Taq DNA聚合酶也具有較好PCR擴增效率，可製備較長PCR產物及增加產量，更適於增幅長片段PCR產物及檢測微量標的DNA使用。

圖一、Taq DNA聚合酶高活性菌株之篩選方法

以易突變PCR技術，製備隨機突變Taq DNA聚合酶基因，再將其黏接於蛋白質表現質體，隨之轉形宿主細胞，構築成突變Taq DNA聚合酶基因庫。配製不含Taq DNA聚合酶之PCR反應液，然後將突變Taq基因庫之各菌株用牙籤點入PCR反應液中，先95℃熱前處理1分鐘再進行PCR反應，將有活性菌株再進行PCR篩選，前處理時間逐次延長，直至最後以95℃前處理20分鐘時僅T003菌株有Taq活性(白框圈出)。

圖二、pUC18/Taq/His及pUC18/Taq(T003)/His轉形菌株之Taq DNA聚合酶粗萃取液活性分析

將pUC18/Taq/His及pUC18/Taq(T003)/His質體轉形DH5α菌株，IPTG誘導後，超音波破菌，離心取上清液，2倍序列稀釋，測Taq活性，結果顯示pUC18/Taq(T003)/His轉形菌株之粗萃液(A)較pUC18/Taq/His轉形菌株之粗萃液(B)活性高約4倍，證明T003突變株之高活性源自pUC18/Taq(T003)/His質體。

圖三、野生株及T003 Taq DNA聚合酶基因編碼之Taq DNA聚合酶之第676位置附件胺基酸序列比對

野生株Taq DNA聚合酶基因編碼之第676位置胺基酸為組胺酸而T003 Taq DNA聚合酶基因則編碼精胺酸。

圖四、H676及R676 Taq DNA聚合酶之SDS-PAGE分析

將純化Taq DNA聚合酶取1μg進行8% SDS-PAGE蛋白質分析，膠片結果顯示，H676及R676 Taq蛋白質片段在純度、分子量、完整性及蛋白質量都相當一致。

圖五、H676及R676 Taq DNA聚合酶之比活性比較

純化Taq DNA聚合酶各取1μg進行2倍序列稀釋後加1μl到PCR反應液(24μl)中，進行PCR反應，從電泳膠片結果顯示在相同蛋白質濃度反應下R676活性較H676 Taq DNA聚合酶高約4倍。

圖六、H676及R676 Taq DNA聚合酶之長片段DNA合成效率比較

以λ ψ DNA當模板，以ψ F為正向引子搭配各種反向引子λ ψ R8、λ ψ R10、λ ψ R12、λ ψ R15，可分別增幅出8、10、12、15 Kb等長短不同DNA片段；在相同PCR反應條件，R676 Taq DNA聚合酶可增幅出15Kb λ ψ DNA片段，而H676 Taq DNA聚合酶只合成到12Kb；另12Kb λ ψ DNA產量，R676也較H676 Taq DNA聚合酶高，顯示R676 Taq DNA聚合酶合成長DNA片段之效能較H676 Taq DNA聚合酶好。

圖七、H676及R676 Taq DNA聚合酶之檢測靈敏度比較

以各種不同濃度pUC19/R2(將神經壞死病毒(NNV)之RNA2 cDNA接到pUC19質體上)質體為模板，用NR2F251及NR2R437為引子對， 進行PCR，其DNA產物約186 bp。在相同PCR反應條件下R676 Taq DNA聚合酶可檢測到約10個質體，而H676 Taq DNA聚合酶僅能檢測到約10⁴，顯示R676 Taq DNA聚合酶之檢測靈敏性較H676 Taq DNA聚合酶高1000倍。

<110> 國立高雄海洋科技大學

<120> DNA聚合酶突變株

<160> 31

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PEF引子

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PER引子

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TEF引子

<400> 3

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNR引子

<400> 4

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD350F引子

<400> 5

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD700F引子

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1050F引子

<400> 7

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1400F引子

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1750F引子

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD2100F引子

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD2150R引子

<400> 11

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1700R引子

<400> 12

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1350R引子

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1000R引子

<400> 14

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD650R引子

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD300R引子

<400> 16

<210> 17

<211> 2540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taq DNA聚合酶基因嵌合體

<400> 17

<210> 18

<211> 846

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Taq DNA聚合酶嵌合體

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18EF引子

<400> 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18XR引子

<400> 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18F引子

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18R引子

<400> 22

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAlelF引子

<400> 23

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T2027CR引子

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> λ ψ F引子

<400> 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> λ ψ 8R引子

<400> 26

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> λ ψ 10R引子

<400> 27

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> λ ψ 12R引子

<400> 28

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> λ ψ 15R引子

<400> 29

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R2N251F引子

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R2N437R引子

<400> 31

R676‧‧‧代表R676 Taq DNA聚合酶

H676‧‧‧代表H676 Taq DNA聚合酶

1X、2X、4X、8X、16X‧‧‧代表1 μg Taq DNA聚合酶經2倍序列稀釋成1/2、1/4、1/8、1/16倍

Claims (8)

1. 一種快速篩選高活性或高耐熱性DNA聚合酶的方法，其包括下列步驟：a.突變DNA聚合酶基因，b.將突變DNA聚合酶基因與蛋白質表現載體進行黏合反應，產生重組質體，c.將重組質體轉形宿主細胞，d.利用試劑篩選有重組質體的細胞株，e.將細胞株加入不含DNA聚合酶之PCR增幅液中，f.高溫(大於70℃小於100℃)前處理後進行PCR反應，g.分析PCR產物，h.將有PCR產物之細胞株，重複進行e到g步驟，且逐次加大f步驟中高溫前處理的溫度或時間，i.篩選出較高溫度(高於野生株)或較長時間(大於野生株)前處理後，仍有PCR產物之細胞株，而野生株已無PCR產物，經過上述步驟篩選出之細胞株，會含有較耐溫(高於野生株)或較高活性(大於野生株)之DNA聚合酶基因。
2. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶，其第676位置胺基酸為精胺酸。
3. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶基因，其編碼之第676位置胺基酸為精胺酸。
4. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶表現質體，其含有申請專利範圍第3項之新穎Taq DNA聚合酶基因。
5. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶表現細胞株，其含有申請專利範圍第4項之表現質體。
6. 一種試劑組，其含有申請專利範圍第2項之新穎突變Taq DNA聚合酶。
7. 一種製備長片段DNA試劑組，其含有申請專利範圍第2項之新穎突變Taq DNA聚合酶。
8. 一種檢測試劑組，其含有申請專利範圍第2項之新穎突變Taq DNA聚合酶。