CN107937361A - 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过蛋白质工程改造嗜热古细菌(Archaeoglobus fulgidus)来源丙氨酸脱氢酶，使其最适酶活温度由82℃降至50℃，在大肠杆菌K12中删除L‑丙氨酸合成竞争路径上的关键基因，减少副产物生产，重组菌株中的编码L‑丙氨酸脱氢酶alaD基因和丙氨酸消旋酶dadX基因替换为改造后的嗜热古细菌来源的丙氨酸脱氢酶基因，利用该重组菌株进行在发酵罐中进行两阶段发酵，发酵42h，L‑丙氨酸产量达到153.9g/L，糖酸转化率81.0％。

Description

一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-丙氨酸是最小的手性分子之一，是一种白色结晶或结晶性粉末，带有甜味，易溶于水，在食品、医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸作为天然甜味剂，不但可提高食品的营养价值，而且能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养补充剂，同时L-丙氨酸也是合成维生素B6、泛酸钙和其他有机化合物的重要原料化学品。
L-丙氨酸生产的主要方法是利用固定化L-天冬氨酸-β-脱羧酶或者德阿昆哈假单胞菌的细胞菌悬液，以L-天冬氨酸为底物脱羧生产的。生产L-天冬氨酸的原料是富马酸，富马酸是经石油炼制生产的。随着石油资源的日渐短缺，原料受困于原油价格，且石油资源不可再生。利用可再生资源葡萄糖通过微生物发酵合成L-丙氨酸受到关注。通过系统代谢工程策略，删除L-丙氨酸合成的关键竞争途径、过量表达限速基因和染色体调控基因的启动子等，以及转运蛋白，可以在E.coli中实现了L-丙氨酸的高效生产。Smith等利用质粒在大肠杆菌ALS929中过量表达alaD，48h发酵能够生产88g/L的L-丙氨酸，但是重组菌培养需要添加抗生素和诱导剂，且L-丙氨酸生产强度不能达到工业生产水平。周丽等通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，并将嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)丙氨酸脱氢酶基因(alaD)引入E.coli菌株，利用温度开关进行调节，在28～45℃两阶段发酵26h，产生106g/L高光学纯度的L-丙氨酸。嗜热古细菌(Archaeoglobusfulgidus)来源丙氨酸脱氢酶(AlaD)催化活力更高而且加稳定，D.T.Gallagher等已经解析出该酶的晶体结构，但是该酶在82℃下才能表现出最佳酶活。大肠杆菌适宜生长温度在25～45℃，温度过高或者过低都不利于菌体生长和目标产物的积累，但是该温度下嗜热古细菌丙氨酸脱氢酶酶活力显著降低，不利于L-丙氨酸的生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过蛋白质工程改造嗜热古细菌来源的AFAlaD酶，使其保持原本的高酶活力的同时最适温度降至50℃，再引入L-丙氨酸生产菌株，实现了L-丙氨酸更加高效的生产。
本发明的第一个目的是提供一种丙氨酸脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述丙氨酸脱氢酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述丙氨酸脱氢酶突变体的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以E.coli K12为出发菌株，敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径中的关键基因：乙酸激酶基因ack-pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、富马酸还原酶基因frdA、发酵型D-乳酸脱氢酶基因ldhA，得到E.coliΔ5(Δack-ptaΔpflBΔadhEΔfrdAΔldhA)，将核苷酸序列如SEQID NO.3所示的基因重组于E.coliΔ5，得到工程菌株E.coliΔ5D2。
在本发明的一种实施方式中，所述重组的方法具体为：
1)将带有同源臂和kan基因的DNA片段1导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组替换E.coli K12的L-丙氨酸脱氢酶alaD基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到中间菌E.coliΔ5D1；
2)将带有同源臂和kan基因的DNA片段11导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组和替换E.coliΔ5D1的丙氨酸消旋酶dadX基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到最终重组菌E.coliΔ5D2。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因来源于嗜热古细菌ATCC 49558，经过密码子优化和基因突变得到。
本发明的第五个目的是提供所述重组菌发酵生产L-丙氨酸的方法，所述方法是将摇瓶种子4～8％接种量接种于发酵培养基，空气量0.6～1.0vvm，温度28～32℃，搅拌250～350rpm培养6～8h，将通气量降低至0.01～0.1vvm，温度上升至40～45℃，继续搅拌40～80rpm，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，每升发酵液一次性补加90～110g葡萄糖，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵。
本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：初始葡萄糖80～100g/L，玉米浆4～8g/L，(NH4)2SO42～4g/L，K2HPO4·12H2O 8～12g/L，KH2PO44～8g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L，柠檬酸铁铵0.1～0.3g/L。
本发明的第六个目的是提供所述丙氨酸脱氢酶突变体在生产L-丙氨酸中的应用。
本发明的有益之处：
1.嗜热古细菌的AlaD酶在高温下才能充分发挥高酶活，利用已经报道的AlaD的晶体结构，同源建模后将该酶Loop结构上第41位赖氨酸K突变为组氨酸H，第65赖氨酸K突变为色氨酸W，改变其蛋白质的柔性，实现该酶在50℃下达到最高酶活。
2.将改造后AFalaD**基因引入L-丙氨酸生产菌株，且该菌株发酵过程中不需要添加抗生素和诱导剂，通过两阶段控温分批补料发酵，该菌株利用廉价易得的葡萄糖实现L-丙氨酸的高效生产。
附图说明
图1所示为温度对AFalaD**酶活的影响。
具体实施方式
下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得
下述实施例中，以E.coli K12为出发菌株，也包括K12大肠杆菌衍生菌株或其他修饰后可以生产L-丙氨酸的大肠杆菌
L-丙氨酸脱氢酶酶活检测：参照Ahaoroniwtz的方法，反应温度为30℃，每分钟氧化lμmol NADH的酶量为一个酶活力单位，使用NADH的摩尔消光系数(6.23x l03)计算其浓度，比活力以u/mg蛋白质表示。
L-丙氨酸含量的测定：高效液相色谱法，以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂，色谱柱:ZO RBAX SB-C18，流动相A为10mmol/LKH2PO4(8mol/LKOH调节pH 5.3)，流动相B为乙腈：甲醇：A相＝5∶3∶1(冰醋酸调pH 5.3)梯度洗脱，流速1mL/min，荧光检测器，检测波长330，460nm，柱温30℃。
葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。
生产强度的计算：生产强度(g/L/h)＝L-丙氨酸产量(g/L)/发酵时间(h)。
实施例1：嗜热古细菌丙氨酸脱氢酶基因的获取
(1)将购买的嗜热古细菌接种于营养肉汤培养基，80℃培养10h后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)使用引物alaD1(5'ATGGAGACTCTTATTTTGACTCAGG 3'，SEQ ID NO.5)和alaD2(5'TCATATCCTGAAAAACTTTATTTTA3'，SEQ ID NO.6)从基因组DNA中克隆得到编码丙氨酸脱氢酶的AFalaD基因；
(3)将该基因连接至PMD19 simple克隆载体测序，得到基因序列如SEQ ID NO.1；
(4)将SEQ ID NO.1按照E.coli基因密码子表达的偏好性进行密码子优化后得到AFalaD*基因，基因序列如SEQ ID NO.2，优化后基因GC含量由50.5％降至48.9％，密码子适应指数(CAI)由0.222提高至0.974；
(5)将基因AFalaD和AFalaD*克隆，使用Nde1和Xho1双酶切后连接于pET24a载体，重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到工程菌E.coli BL21-AFalaD和E.coli BL21-AFalaD*；
(6)上述两工程菌株使用LB培养基培养，当OD600＝0.6～0.8时加入0.4mmol/LIPTG，25℃诱导8h，收集菌体检测AlaD酶活；
(7)酶活检测结果如表1，在相同培养条件下，在大肠杆菌中密码子优化后AlaD酶活提高了85.0％。
表1密码子优化对AlaD酶活的影响
实施例2：嗜热古细菌丙氨酸脱氢酶蛋白质工程改造
(1)使用Modeller软件对AFAlaD蛋白进行同源建模(JMB 342,119-130(2004))，对AFalaD*基因催化活性中心的Loop结构的关键氨基酸K41、R52、K65、R108、D297定点饱和突变为丙氨酸；突变后按照实施例1中的方法构建重组菌株，进行酶活检测，结果如表2，将第41位赖氨酸K和第65赖氨酸K突变为丙氨酸A，AFAlaD最适酶活温度分别降低为77℃和72℃，因此选择两位点进行组合突变。
表2不同突变体酶活测定
(2)对K41和K65进行组合突变，发现当41位赖氨酸K突变为组氨酸H，第65赖氨酸K突变为色氨酸W，即将SEQ ID NO.2中122位碱基A突变为C，将193位、194位、195位的碱基A突变为TGG，得到AFalaD**基因，基因序列如SEQ ID NO.3。AFAlaD最适酶活温度降为50℃，此时酶活为1100U/mL，从图1中可以看出AFAlaD**在45～60℃可以维持85％以上的酶活，30℃时酶活为50℃的26.9％。
实施例3：高产L-丙氨酸大肠杆菌的构建
以E.coli K12为出发菌株，用Red同源重组方法敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径中的关键基因：乙酸激酶基因ack-pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、富马酸还原酶基因frdA、发酵型D-乳酸脱氢酶基因ldhA，得到E.coliΔ5菌株，将蛋白质工程改造后嗜热古细菌来源的AFalaD**基因整合表达于E.coliΔ5，替换编码L-丙氨酸脱氢酶alaD基因和丙氨酸消旋酶dadX基因，得到工程菌株E.coliΔ5D2。该重组菌株培养不需要添加抗生素或诱导剂。
上述采用Red同源重组系统方法：
1)将带有同源臂和kan基因的DNA片段1导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组替换E.coli K12的L-丙氨酸脱氢酶alaD基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到中间菌E.coliΔ5D1。
2)将带有同源臂和kan基因的DNA片段11导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组和替换E.coli K12的丙氨酸消旋酶dadX基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到最终重组菌E.coliΔ5D2。
实施例4：重组菌株E.coliΔ5D2发酵生产L-丙氨酸
(1)种子培养基配方：LB培养基，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
发酵培养基配方：葡萄糖80～100g/L，玉米浆5g/L，(NH4)2SO43g/L，K2HPO4·12H2O10g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，柠檬酸铁铵0.2g/L，葡萄糖单独灭菌，121℃，消毒20min。
(2)从斜面挑取适量E.coliΔ5D2接种于种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养10h，摇瓶种子按照4～8％接种量接种于发酵培养基，接种后5L发酵罐中装液量为3.0L，稀硫酸和氨水控制发酵pH在6.8～7.2，培养6～8h，通气量0.6～1.0vvm，温度30℃，搅拌300rpm，此时OD600为25.0左右，将通气量降低至0.1vvm，温度上升至43℃，继续搅拌50rpm，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，每升发酵液中补加90～110g的葡萄糖，补加葡萄糖溶液体积0.5L，发酵42h时葡萄糖耗尽，结束发酵。
(3)发酵前期6～8h好氧发酵，温度控制30℃，AFAlaD**酶活仅为50℃时的26.9％，有利于菌体的快速积累，43℃下AFAlaD**酶活为50℃时的85.0％，此时厌氧发酵有利于L-丙氨酸的快速积累，最终检测L-丙氨酸产量为153.9g/L，糖酸转化率达到81％，L-丙氨酸的生产强度为3.66g/L/h。
实施例5：重组菌株E.coliΔ5D2发酵生产L-丙氨酸
按照实施案例4中进行种子培养，之后摇瓶种子液按照4～8％接种量接种于发酵培养基，接种后5L发酵罐中装液量为3.0L，稀硫酸和氨水控制发酵pH在6.8～7,2，通气量0.6～1.0vvm，温度37℃，搅拌300rpm，培养6～8h，此时OD600为25.0左右，维持37℃，将通气量降低至0.1vvm，继续搅拌50rpm，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，每升发酵液中补加90～110g的葡萄糖，补加葡萄糖溶液体积0.5L，发酵60h时葡萄糖耗尽，结束发酵。
发酵过程中恒温37℃发酵，发酵周期延长至60h，此时L-丙氨酸产量为138.0g/L，L-丙氨酸生产强度显著降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggagactc ttattttgac tcaggaggaa gtagaatccc tgatatcgat ggacgaggcg 60
atgaatgctg ttgaggaggc gttcagactt tacgctcttg gtaaagctca aatgccgcca 120
aaggtgtatc ttgagttcga aaaaggcgat ttaagggcta tgccggcgca tttaatgggg 180
tacgcaggat tgaagtgggt gaactcccat cccggaaatc cggataaagg cctgccaaca 240
gtcatggcgt tgatgatact gaacagccct gagacggggt ttcccttggc tgtgatggac 300
gcaacctaca cgacctctct gagaaccggt gctgctggag gaatagcggc gaagtatctg 360
gcaaggaaga acagcagcgt ttttggattt atcggctgcg gaactcaggc gtatttccag 420
ctcgaagctc tgaggagagt gtttgatata ggagaagtca aggcctacga tgttagggaa 480
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cctgctgagg aggcgagcag atgcgatgtc cttgtcacca caactccgtc acgaaaacca 600
gttgttaagg ctgagtgggt tgaggagggg acgcacataa acgcaatcgg tgcggacggg 660
cctggaaagc aggaactgga tgtagaaata cttaaaaagg ctaaaattgt tgtcgatgac 720
cttgaacagg ccaagcacgg cggggagatt aatgtggcgg tttcaaaagg cgtcataggt 780
gttgaagatg ttcacgcaac catcggggag gttatagccg gtctgaagga tggaagggag 840
agcgatgagg agattacaat cttcgactcc acaggcttgg cgattcagga cgtggctgtt 900
gcaaaagtcg tttatgagaa cgcccttagc aagaacgtgg ggagtaaaat aaagtttttc 960
aggatatga 969
<210> 2
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Glu Thr Leu Ile Leu Thr Gln Glu Glu Val Glu Ser Leu Ile Ser
1 5 10 15
Met Asp Glu Ala Met Asn Ala Val Glu Glu Ala Phe Arg Leu Tyr Ala
20 25 30
Leu Gly Lys Ala Gln Met Pro Pro His Val Tyr Leu Glu Phe Glu Lys
35 40 45
Gly Asp Leu Arg Ala Met Pro Ala His Leu Met Gly Tyr Ala Gly Leu
50 55 60
Trp Trp Val Asn Ser His Pro Gly Asn Pro Asp Lys Gly Leu Pro Thr
65 70 75 80
Val Met Ala Leu Met Ile Leu Asn Ser Pro Glu Thr Gly Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Val Met Asp Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Arg Thr Gly Ala Ala
100 105 110
Gly Gly Ile Ala Ala Lys Tyr Leu Ala Arg Lys Asn Ser Ser Val Phe
115 120 125
Gly Phe Ile Gly Cys Gly Thr Gln Ala Tyr Phe Gln Leu Glu Ala Leu
130 135 140
Arg Arg Val Phe Asp Ile Gly Glu Val Lys Ala Tyr Asp Val Arg Glu
145 150 155 160
Lys Ala Ala Lys Lys Phe Val Ser Tyr Cys Glu Asp Arg Gly Ile Ser
165 170 175
Ala Ser Val Gln Pro Ala Glu Glu Ala Ser Arg Cys Asp Val Leu Val
180 185 190
Thr Thr Thr Pro Ser Arg Lys Pro Val Val Lys Ala Glu Trp Val Glu
195 200 205
Glu Gly Thr His Ile Asn Ala Ile Gly Ala Asp Gly Pro Gly Lys Gln
210 215 220
Glu Leu Asp Val Glu Ile Leu Lys Lys Ala Lys Ile Val Val Asp Asp
225 230 235 240
Leu Glu Gln Ala Lys His Gly Gly Glu Ile Asn Val Ala Val Ser Lys
245 250 255
Gly Val Ile Gly Val Glu Asp Val His Ala Thr Ile Gly Glu Val Ile
260 265 270
Ala Gly Leu Lys Asp Gly Arg Glu Ser Asp Glu Glu Ile Thr Ile Phe
275 280 285
Asp Ser Thr Gly Leu Ala Ile Gln Asp Val Ala Val Ala Lys Val Val
290 295 300
Tyr Glu Asn Ala Leu Ser Lys Asn Val Gly Ser Lys Ile Lys Phe Phe
305 310 315 320
Arg Ile
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggagactc ttattttgac tcagg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcatatcctg aaaaacttta tttta 25

Claims (9)

1.一种丙氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述的丙氨酸脱氢酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述的丙氨酸脱氢酶突变体的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以E.coli K12为出发菌株，敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径中的关键基因：乙酸激酶基因ack-pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、、富马酸还原酶基因frdA、发酵型D-乳酸脱氢酶基因ldhA，得到E.coliΔ5，将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因重组于E.coliΔ5，得到工程菌株E.coliΔ5D2。
7.权利要求4所述重组菌发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将摇瓶种子4～8％接种量接种于发酵培养基，空气量0.6～1.0vvm，温度28～32℃，搅拌250～350rpm培养6～8h，将通气量降低至0.01～0.1vvm，温度上升至40～45℃，继续搅拌40～80rpm，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，每升发酵液一次性补加90～110g葡萄糖，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：初始葡萄糖80～100g/L，玉米浆4～8g/L，(NH4)2SO4 2～4g/L，K2HPO4·12H2O 8～12g/L，KH2PO4 4～8g/L，MgSO4·7H2O 0.2～0.5g/L，柠檬酸铁铵0.1～0.3g/L。
9.权利要求1所述的丙氨酸脱氢酶突变体在生产L-丙氨酸中的应用。
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