DE19604798A1

DE19604798A1 - Herstellung von L-Ascorbinsäure

Info

Publication number: DE19604798A1
Application number: DE19604798A
Authority: DE
Inventors: Ralf Prof Mattes; Klaus-Dieter Prof Dr Kulbe
Original assignee: Herbstreith und Fox KG Pektin Fabriken
Current assignee: Herbstreith und Fox KG Pektin Fabriken
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1997-08-14
Also published as: WO1997029194A2; WO1997029194A3; EP0879287A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure sowie dafür geeignete rekom binante Enzyme und dafür codierende Nukleinsäuren.

L-Ascorbinsäure oder Vitamin C wird von der chemischen Indu strie in großen Mengen hergestellt. Während der letzten 20 Jahre hat eine ständige Zunahme der Produktion stattgefunden und im Jahr 1984 erreichte die Weltproduktion 35.000 Tonnen. Gegenwärtig dürfte sie mehr als 70.000 Tonnen betragen.

L-Ascorbinsäure wurde erstmals chemisch durch das Reichstein-Verfahren hergestellt. In diesem Verfahren wird Glucose als Substrat verwendet und in fünf Schritten wie folgt umgesetzt:

1. Reduktion von Glucose zu D-Sorbitol unter Verwendung eines Nickelkatalysators,
2. Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose, die durch Aceto bacter xylinum oder durch Acetobacter suboxidans durchge führt werden kann,
3. Herstellung von Diacetonsorbose oder 2,3 : 4,6-Diisopro pyliden-L-xylo-2-hexafuranose durch Behandlung mit Aceton und Schwefelsäure,
4. Oxidation dieses Produkts zu 2-Keto-L-Gulonsäure unter Verwendung von Platin als Katalysator,
5. Enolisierung und intramolekulare Lactonbildung zu L-As corbinsäure.

Bis heute hat dieses Verfahren große Bedeutung aufgrund der Verwendung von Glucose als preisgünstigem Ausgangssubstrat und der chemischen Stabilität der Zwischenprodukte, insbesondere Diaceton-Sorbitol. Derzeit liegt die praktische Ausbeute die ses Verfahrens im Bereich von ca. 50%.

Nachteile dieses Verfahrens bestehen in der großen Zahl von Synthesestufen, die in Folge der Bildung von Nebenprodukten mit erheblichen Ausbeuteverlusten verbunden sind. Insbesondere wird eine kontinuierliche Verfahrensdurchführung durch den mikrobiologischen Oxidationsschritt von D-Sorbitol zu L-Sor bose unterbrochen. Weitere Nachteile entstehen aufgrund der Verwendung von Aceton als Schutzgruppe und den damit verbunde nen Abwasserproblemen.

Weitere mikrobielle Verfahren zur Biosynthese von Ascorbin säure werden in einem Übersichtsartikel von J. Boudrant (En zyme Microb. Technol., 12, 1990, 322-329) offenbart. Diese Verfahren umfassen ausgehend von Glucose mehrere enzymatische Umsetzungsschritte, bei denen schließlich 2-Keto-L-gulonsäure entsteht. Die Umsetzung dieses Produkts zu L-Ascorbinsäure erfolgt unter Anwesenheit von Säure und Alkohol unter Ausbeu ten von etwa 75%. Auch diese Verfahren weisen Nachteile hin sichtlich der Ausbeute und der Schwierigkeit der Durchführung auf.

Das deutsche Patent 35 02 141 offenbart ein Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehr stufigen enzymatischen Synthesen, wobei man im gleichen Reak tor ein Substrat enzymatisch reduziert und das dabei erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidationsprodukt über führt oder ein Substrat enzymatisch oxidiert und das dabei erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktionspro dukt überführt und das gewünschte Endprodukt in an sich be kannter Weise isoliert, wobei für die gekoppelten Vorgänge der Oxidation und Redaktion zwei Enzyme verwendet werden, die gleiche Cofaktor-Spezifität besitzen. Dieses Verfahren kann beispielsweise auch zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus D- Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure eingesetzt werden, die gegebenenfalls in ihre Lactone oder ein Gemisch der Lactone überführt werden und anschließend enzymatisch zu den entspre chenden 2-Keto-Säuren oxidiert und zu Ascorbinsäure umgelagert werden, die dann in an sich bekannter Weise isoliert wird.

EP-A 0 476 442 offenbart eine L-Gulono-γ-lacton-Dehydrogenase in gereinigter Form, welche die Oxidation von L-Gulono-γ-lac ton zu L-Ascorbinsäure katalysiert, z. B. in Gegenwart eines von Sauerstoff verschiedenen Elektronenakzeptors. Ein derarti ges Enzym ist aus Gluconobacter oxydans erhältlich, hat eine hohe Substratspezifität für L-Gulono-γ-lacton, ein pH-Optimum von 7-8 und ist aus 3 Untereinheiten aufgebaut, bei denen es sich um ein Flavoprotein, ein Cytochrom c Protein und ein einfaches Protein mit Molekulargewichten von ca. 61.000, 32.500 bzw. 16.500 D handelt. Cu²⁺- und Mn²⁺-Ionen zeigen eine starke Hemmung des Enzyms. Das Enzym bzw. ein dieses Enzym enthaltender Mikroorganismus oder Mikroorganismenextrakt kann zur Synthese von L-Ascorbinsäure unter Verwendung von L-Gu lono-γ-lacton als Substrat eingesetzt werden. Nachteile dieses Enzyms bestehen jedoch darin, daß es eine relativ geringe Aktivität und Stabilität aufweist. Weiterhin wird durch den Aufbau aus 3 separaten Untereinheiten eine rekombinante Gewin nung des Enzyms sehr erschwert.

Angesichts dieses Standes der Technik bestand die der vorlie genden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe darin, neue Enzyme für die L-Ascorbinsäuresynthese sowie ein neues Synthesever fahren bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein neues Enzym, welches die enzymatische Umsetzung von D-Glucu ronsäure bzw. Galacturonsäure zu L-Gulonsäure bzw. L-Galacton säure katalysiert, eine dafür codierende Nukleinsäure und ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Enzyms. Dieses Enzym, das als Uronat-Reduktase (UDH) bezeichnet werden kann, ist aus dem Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae erhält lich. D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sind Substrate dieses Enzyms, die mit den Coenzymen NADPH oder/und NADH redu ziert werden. Der K_M-Wert für die Substrate D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure ist 65 mM bzw. 4,5 mM. Der K_M-Wert für das Coenzym NADPH ist 0,008 mM. Das Enzym ist stabil, zeigt ein Optimum bei pH 6,2-8,5 und einer Temperatur von 45°C.

Zur Gewinnung dieses Enzyms wurde das von Fobo (Dissertation Universität Hohenheim, Stuttgart (1988)) beschriebene Enzym L-Hexonatdehydrogenase (HDH) aus Lipomyces starkeyi vollständig aufgereinigt. Aus diesem gereinigten Produkt konnten nach tryptischer Verdauung kurze Aminosäuresequenzen ermittelt und aufgrund der Sequenzdaten Oligonukleotide synthetisiert wer den, mit denen das für UDH codierende Gen aus genomischer Saccharomyces cerevisiae DNA isoliert werden konnte.

Die UDH aus S.cerevisiae hat eine wesentlich höhere Affinität für die Substrate D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sowie für das Coenzym NADPH als die HDH aus L.starkeyi. Weiterhin besitzt UDH eine höhere Stabilität als HDH und kann bei -20°C für unbegrenzte Zeit aufbewahrt werden. Selbst bei 8°C sind nach 650 h noch über 50% der Ausgangsaktivität meßbar.

Die für das udh-Gen codierende DNA-Sequenz wurde bereits bei Oechsner et al., (FEBS Lett. 238 (1988), 123-128) als GCY (galactose-inducible, crystalline-like yeast protein) codie rendes Gen beschrieben. Die Funktion des GCY-Proteins im He festoffwechsel sowie die Verwendung dieses Proteins zur L-Ascorbinsäure waren bisher nicht bekannt.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduktase- Aktivität codiert und

(a) die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisie renden Nukleotidsequenz umfaßt, zur Herstellung eines Enzyms für die Synthese von L-Ascorbinsäure.

Die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz codiert für die vollständige Uronat-Reduktase aus dem Mikroorganismus Saccha romyces cerevisiae. Neben dieser Sequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes ent sprechenden Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit glei cher Aminosäuresequenz codiert, umfaßt die vorliegende Erfin dung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequen zen hybridisiert, vorausgesetzt, daß sie für ein Protein co diert, das eine Uronat-Reduktase-Aktivität besitzt.

Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) ver wendet. Vorzugsweise spricht man von einer Hybridisierung, wenn nach Waschen für 1 Stunde mit 1 X SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 Stunde in 0,2 X SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidse quenz hybridisierende Nukleotidsequenz wird von der vorliegen den Erfindung erfaßt.

Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße DNA-Sequenz eine Nu kleotidsequenz auf, die zu der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nu kleotidsequenz eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% und am meisten bevorzugt von mindestens 90% aufweist.

Erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen sind insbesondere aus Mikroorganismen der Gattungen Saccharomyces erhältlich.

Vorzugsweise wird ein rekombinanter Vektor verwendet, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem die erfindungsgemäße DNA-Sequenz sich vorzugsweise unter Kontrolle eines Expres sionssignals (Promotor, Operator, Enhancer, etc.) befindet. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäße Vektoren sind proka ryontische Vektoren, insbesondere zirkuläre Plasmidvektoren, die z. B. bei Sambrook et al., Supra, Kapitel 1-4 beschrieben sind.

Besonders bevorzugt befindet sich die DNA-Sequenz unter Kon trolle eines regulierbaren Promotors, der durch Zugabe eines chemischen Induktors oder durch Temperaturänderung aktiviert werden kann. Beispiele derartiger Promotoren sind dem Fachmann bekannt, z. B., der lac-Promotor, der tac-Promotor, der trp-Promotor sowie Promotoren des Bakteriophagen Lambda etc.

Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukary ontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor. Beispiele derartiger Vektoren finden sich bei Sambrook et al. supra, Kapitel 16.

Zur Herstellung des Enzyms für die Synthese von L-Ascorbin säure verwendet man vorzugsweise eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Vorzugsweise ist diese Zelle eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine gram-negative proka ryontische Zelle, z. B. eine E.coli Zelle. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z. B. Hefe), eine tie rische oder eine pflanzliche Zelle. Verfahren zur Transforma tion prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen mit exogenen Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig (vgl. z. B. Sambrook et al., Kapitel 1-4 und 16).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Proteins mit einer Uronat-Reduktase-Aktivität, das von einer erfindungs gemäßen DNA-Sequenz codiert ist, als Enzym in einem Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure. Vorzugsweise umfaßt die ses Protein (a) die in SEQ ID No. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder (b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80%, insbeson dere mindestens 90% homologe Aminosäuresequenz.

Die Herstellung des Enzyms kann einerseits aus Zellen erfol gen, die natürlicherweise ein für das Protein mit Uronat-Re duktase-Aktivität codierendes Gen enthalten. Bevorzugt ist jedoch die Herstellung des Enzyms durch rekombinante DNA-Tech nologie, wobei man eine Zelle mit einer wie vorstehend defi nierten DNA-Sequenz oder einem diese DNA-Sequenz enthaltenden Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingun gen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.

Vorzugsweise verwendet man für die rekombinante Herstellung eines Proteins mit Uronat-Reduktase-Aktivität eine E.coli Zelle und isoliert das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt. Auf diese Weise kann unter Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems, z. B. des tac-Promotors, aus 400 mg E.coli Rohextrakt, 670 U Uronat-Reduktase mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg erhalten werden. Im Gegensatz dazu kön nen nach 9-tägiger Kultur des Ausgangsorganismus Lipomyces starkeyi nur 18 U Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 33 U/mg nach Reinigung erhalten werden.

Vorzugsweise befindet sich das Uronat-Reduktase-Gen unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals, z. B. eines durch Lactose regulierbaren Expressionssignals, z. B. dem lac- oder dem tac-Promotor. Um im produktionstechnischen Maßstab mit Lactose anstelle des teuren synthetischen Induktors IPTG arbeiten zu können, muß das udh-Gen in eine Wirtszelle über führt werden, die Lactose aufnehmen und verstoffwechseln kann. Bevorzugte Wirtszellen sind E.coli B und E.coli RM 82. E.coli B ist ein Stamm mit intaktem Lactoseoperon, die Zellen sind in der Lage durch ein spezifisches Transportsystem Lactose aus dem Medium aufzunehmen und in den eigentlichen Induktor Allo lactose umzuwandeln. Bei E.coli RM 82 ist das spezifische Transportsystem für Lactose defekt, so daß Lactose nur in geringen Mengen über andere Transportsysteme in die Zelle gelangt und dort normal verstoffwechselt wird.

Mittels der oben genannten DNA-Sequenzen, Vektoren, transfor mierten Zellen ist die Bereitstellung von Proteinen mit Uro nat-Reduktase-Aktivität auf einfache Weise möglich, die sich hervorragend in Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure eignen. In einem solchen Verfahren wird eine ein Coenzym ent haltende Substratlösung mit UR in Kontakt gebracht, wobei in einer enzymatischen Reaktion L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure gebildet werden. Diese Produkte werden anschließend durch weitere enzymatische Reaktionen zu L-Ascorbinsäure umgesetzt. Als Substrate verwendet man vorzugsweise D-Glucuronsäure, D-Galacturonsäure, D-Glucurono-γ-lacton oder/und D-Galacturono-γ-lacton. Besonders bevorzugt verwendet man D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure. Diese Substrate können auf ein fache Weise in großtechnischem Maßstab durch chemo-enzyma tische Verfahren aus Stärke, Pektin (Kulbe et al. (1987): Ann. N.Y. Acad. Sci. 506, 543-551), Saccharose oder Lactose herge stellt werden.

Die Konzentration der Substrate im Reaktionsansatz kann je nach den Reaktionsbedingungen über einen weiten Bereich vari iert werden. Gute Ergebnisse werden mit Konzentrationen von 20 mM-500 mM, z. B. 50 mM oder 250 mM erzielt.

Als Coenzyme werden NADPH oder/und NADH, insbesondere NADPH eingesetzt. Die Konzentration der Coenzyme im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise von 0,05-0,5 mM und besonders bevorzugt von 0,08-0,25 mM, wobei während der Reaktion günstigerweise eine Nachdosierung erfolgt.

Zur Vereinfachung der Reaktionsführung wird das Verfahren vorzugsweise in Gegenwart eines Systems zur Coenzymregenerie rung durchgeführt. Beispiele für geeignete Systeme zur Coen zymregenerierung finden sich in der bereits genannten deut schen Patentschrift 35 02 143. Ein besonders bevorzugtes Sy stem zur Coenzymregenerierung ist die Glucose-Dehydrogenase (GDH), die D-Glucose zu D-Gluconsäure umsetzt, wobei aus NADP⁺, NADPH und H⁺ entstehen. GDH ist ein kommerziell erhältliches Enzym und kann z. B. aus Bacillus cereus gewonnen werden.

Durch die kontinuierliche Coenzymregenerierung kann die wäh rend der Reaktion notwendige Nachdosierung des Coenzyms stark verringert oder völlig weggelassen werden. Zur Beschleunigung der Reaktion und bei einer längeren Reaktionsdauer kann es sich jedoch selbst bei einer Coenzymregenerierung manchmal als günstig erweisen, das Coenzym während der Reaktion nachzudo sieren.

Die Stabilität der UDH wird in Gegenwart eines Sulfhydrylrea genz, insbesondere DTT oder DTE, verbessert. Das Sulfhydryl reagenz kann am Beginn der Reaktion zugesetzt werden. Vorzugs weise erfolgt während der Reaktion eine Nachdosierung. Die Konzentration des Sulfhydrylreagenz im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise 1-50 mM, besonders bevorzugt 2-20 mM.

Eine weitere Stabilitätserhöhung der UDH wird durch Zusatz eines Komplexierungsmittels, insbesondere EDTA, erreicht. Die Konzentration des Komplexierungsmittels im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise 0,1-10 mM, besonders bevorzugt 0,5-5 mM.

Die UDH und, sofern vorhanden, die GDH können als bakterieller Rohextrakt oder als gereinigtes Enzym eingesetzt werden. Gege benenfalls können die Enzyme auch in immobilisierter Form vorliegen. Besonders bevorzugt ist eine kontinuierliche Ver fahrensführung. Hierzu wird eine das Substrat für UDH und das Substrat des für die Coenzymregenerierung verwendeten Enzyms, im Falle von GDH Glucose, in einen Enzymreaktor geleitet, in dem sich UDH, das zur Coenzymregenerierung verwendete Enzym, z. B. GDH, und das Coenzym, z. B. NADPH oder/und NADH, befinden.

Bei einem Einsatz der Enzyme in löslicher Form besitzt der Reaktor an seiner Ausströmöffnung eine Membran, die eine Rück haltung der Enzyme und des Coenzyms gestattet. Diese Membran ist vorzugsweise eine negativ geladene Ultrafiltrationsmem bran, z. B. aus sulfoniertem Polysulfon, wie sie z. B. bei Ho waldt et al. (1988): Ann. N.Y. Acad. Sci 542, 400-405, oder Kulbe and Chmiel (1988): Ann. N.Y. Acad. Sci 542, 444-464 beschrieben ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Enzymreaktor, umfassend

(a) ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität,
(b) ein Coenzym, ausgewählt aus NADH oder/und NADPH,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub strat,
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt, und
(e) gegebenenfalls ein Enzym zur Coenzymregenerierung.

Ein Beispiel für einen bevorzugten Reaktor ist in Abb. 1 dar gestellt. Hierbei wird eine Substrat, Coenzym und gegebenen falls Stabilisatoren enthaltene Lösung 10 durch einen Steril filter 12 in einen Enzymreaktor 14 eingeleitet. Der Reaktor 14 enthält UR und gegebenenfalls GDH in löslicher Form. Der Reak tor ist mit einem Septum 16 und einer Rührvorrichtung 18 aus gestattet. An der Ausströmöffnung des Reaktors ist eine nega tiv geladene Ultrafiltrationsmembran 20 angeordnet. Weiterhin enthält der Reaktor Meßvorrichtungen zur Bestimmung der Leit fähigkeit 22, des Drucks 24 und des pH-Werts 26. Der pH-Wert kann beispielsweise durch Zudosierung von Säure 28 (z. B. HCl) oder Lauge 30 (z. B. NaOH) über einen Regler 32 eingestellt werden. Aus dem Reaktor strömt schließlich die Produktlösung 34 aus.

Durch Umsetzung der Substrate D-Glucuronsäure bzw. D-Galactu ronsäure mit UDH entstehen L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure. Diese Produkte werden anschließend zu L-Ascorbinsäure weiter reagiert. Vorzugsweise wird hierzu zunächst die gebildete L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure in das entsprechende Lacton, d. h. insbesondere L-Gulono-γ-lacton bzw. L-Galactono-γ-lacton überführt. Diese Lactonbildung kann durch Ansäuern und Erhit zen erfolgen. Zum Ansäuern wird vorzugsweise eine starke an organische Säure, insbesondere HCl, verwendet. Die Konzentra tion der Säure beträgt vorzugsweise 100-1000 mM, insbesondere 200-500 mM. Bei Verwendung von HCl wird bei einer Konzentra tion ab 250 mM ein Maximum an Lactonbildung gefunden. Das Erhitzen erfolgt auf eine Temperatur von vorzugsweise minde stens 45°C, insbesondere mindestens 50°C. Am meisten bevorzugt beträgt die Temperatur 55-70°C. Die Inkubationsdauer beträgt vorzugsweise mindestens 15 min. Ab einer Inkubationsdauer von 30 min. werden ca. 50-60% Lacton gebildet. Eine längere Inku bationsdauer bringt keine signifikante Ausbeutesteigerung mit sich. Weiterhin kann die Lactonbildung auch durch Inkubation mit einer geeigneten Lactonase erfolgen.

Noch ein weiterer Gegenstand des ersten Aspekts der vorliegen den Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduktase-Aktivität codiert und eine mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz oder einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, dadurch ge kennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz um mindestens eine Aminosäure unterscheidet.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Mutagenese der in SEQ. ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz neue Nukleo tidsequenzen erhältlich sind, die für enzymatisch aktive Pro teine mit einer höheren Affinität für das Coenzym NADH als das Ausgangsprodukt codieren. Bei großtechnischen Verfahren ist die Verwendung des Coenzyms NADH gegenüber dem Coenzym NADPH aus Kostengründen deutlich bevorzugt. Daher können modifi zierte Proteine mit erhöhter Affinität für NADH insbesondere bei großtechnischen Anwendungen eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität, das sich um mindestens eine Aminosäure von der in SEQ ID. No. 2 gezeigten Aminosäure sequenz unterscheidet. Vorzugsweise weist dieses Protein eine Homologie von mindestens 80% zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 auf. Besonders bevorzugt besitzt das Protein für NADH als Coenzym eine höhere maximale Umsatzgeschwindigkeit oder/ und einen geringeren K_M-Wert als das Protein mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäusresequenz.

Spezifische Beispiele für solche modifizierten Proteine unter scheiden sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäurese quenz durch einen Austausch von Arg (57) durch Glu, einen Austausch von Tyr (47) durch Glu oder/und einen Austausch von Gln (29) durch Gly.

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die rekom binante Herstellung von Proteinen mit L-Gulono-γ-Lactonoxi dase-Aktivität (GulOx) in hoher Ausbeute und die Verwendung dieser Proteine bei der Synthese von Vitamin C.

GulOx katalysiert die Oxidation von L-Gulono-γ-Lacton bzw. L-Galactono-γ-Lacton in Anwesenheit von O₂ zu L-Ascorbinsäure. GulOx ist aus Eukaryonten, z. B. aus der Mikrosomenfraktion der Rattenleber erhältlich (Nishikimi et al., Arch. Biochem. Bio phys. 175 (1976), 427-435) . GulOx besitzt als prosthetische Gruppe einen kovalent gebundenen Flavinanteil, der am Elek tronentransfer auf 02 beteiligt ist. Im SDS-Gel wurde das Molekulargewicht mit 51 kd bestimmt. Im nativen Zustand liegen jedoch Aggregate mit einer Größe von etwa 500 kd vor. Der K_M-Wert für L-Gulono-γ-Lacton wurde mit 0,066 mM bestimmt. Neben L-Gulono-γ-Lacton setzt GulOx auch L-Galactono-, D-Mannono- und D-Altrono-γ-Lacton zu L-Ascorbinsäure um.

Bei der rekombinanten Expression von GulOx in Affenzellkultu ren (Yagi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 177 (1991), 659-663) wurden bisher nur sehr geringe Ausbeuten, nämlich eine spezifische Aktivität von 0,38 mU/mg erhalten. Eine re kombinante Expression in E.coli wurde bisher nicht erreicht.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß bei rekombinanter Expression von GulOx in E.coli das Enzym in einer um ein Viel faches höheren spezifischen Aktivität als bei der rekombinan ten Expression in Affenzellkulturen und bei der Aufreinigung aus Mikrosomenpräparationen von Leberzellextrakten erhalten werden konnte.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine pro karyontische Zelle, die in der Lage ist, eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und (a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleo tidsequenz, zur Expression zu bringen.

Vorzugsweise ist die prokaryontische Zelle eine gram-negative Zelle, insbesondere eine E.coli Zelle. Die für die GulOx co dierende DNA-Sequenz ist unter Kontrolle eines geeigneten Expressionssignals, welches vom Transkriptionsapparat der prokaryontischen Zelle erkannt wird. Vorzugsweise befindet sich die DNA-Sequenz auf einem geeigneten rekombinanten Vektor unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals (siehe oben).

Die erfindungsgemäße Zelle kann bei Expression der DNA-Sequenz und anschließendem Zellaufschluß einen Extrakt mit einer spe zifischen GulOx-Aktivität von 5 mU/mg, insbesondere von 10 mU/mg und besonders bevorzugt von 10-200 mU/mg ergeben.

Die Enzymausbeute nach der Expression kann erhöht werden, wenn man die Zellen nach der Ernte in Puffer wäscht und anschlie ßend zentrifugiert. Durch eine anschließende Fällung mit 16% Ammoniumsulfat, bei der das aktive Enzym sich im Niederschlag befindet, kann eine weitere signifikante Erhöhung der spezifi schen Aktivität erreicht werden.

Die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz kodiert für die vollständige L-Gulono-γ-Lacton-Oxidase aus der Ratte. Neben dieser Sequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degene ration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit gleicher Aminosäuresequenz codiert, umfaßt die vorliegende Erfindung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen hybridisiert. Die Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung bestimmt werden kann, sind dabei wie zuvor beschrieben.

Vorzugsweise weist die DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz auf, die zu der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von minde stens 80% und am meisten bevorzugt von mindesten 90% auf weist.

Die DNA-Sequenz befindet sich in der erfindungsgemäßen Zelle vorzugsweise auf einem für die Genexpression in Prokaryonten geeigneten Vektor. Beispiele geeigneter Vektoren wurden be reits genannt.

Die Erfindung betrifft auch ein unglykosiliertes Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität aus Prokaryonten, das codiert ist von einer DNA-Sequenz, welche (a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Vorzugsweise umfaßt dieses Protein (a) die in SEQ ID No. 4 gezeigte Sequenz oder (b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80%, insbesondere mindestens 90% homologe Aminosäuresequenz.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins erfolgt da durch, daß man eine prokaryontische Zelle (i) einer DNA-Se quenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxi dase-Aktivität codiert und (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, oder (ii) einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz aus (a), (b) oder/und (c) enthält, trans formiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kulti viert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.

Vorzugsweise wird das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt, gegebenenfalls nach Ammoniumsulfatfällung, gewonnen. Der Zell extrakt weist eine spezifische GulOx-Aktivität von 5 mU/mg auf.

Das aus Prokaryonten erhältliche erfindungsgemäße unglykosi lierte Protein mit L-Gulono-γ-lacton Oxidase-Aktivität oder ein dieses Protein enthaltender Zellextrakt kann in einem Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure eingesetzt werden.

Hierbei bringt man eine O₂ enthaltende Substratlösung mit der GulOx in Kontakt und gewinnt anschließend die durch enzyma tische Umsetzung des Substrats gebildete L-Ascorbinsäure. Als Substrat werden vorzugsweise L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-lacton eingesetzt.

Die GulOx kann dabei sowohl als bakterieller Rohextrakt, der gegebenenfalls gewaschen und aufkonzentriert sein kann, als Ammoniumsulfat-Fällungsprodukt und auch als solubilisiertes Enzym eingesetzt werden. Besonders bevorzugt verwendet man eine immobilisierte GulOx.

Die Reaktion wird vorzugsweise im Bereich von pH 6-8 durch geführt. Dabei findet man, daß im Bereich von pH 7-8 die GulOx eine höhere enzymatische Aktivität und Stabilität aufweist, daß aber im Bereich von 6-7 die L-Ascorbinsäure stabiler ist. Die Wahl des pH-Werts muß daher je nach spezifischen Erforder nissen optimiert werden.

Weiterhin wurde festgestellt, daß der Zusatz eines Sulfhydryl- Reagenz, insbesondere Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythri tol (DTE) die Stabilität der Ascorbinsäure verbessert und somit die Ausbeute erhöht. Vorzugsweise wird das Sulfhydryl reagenz in einer Konzentration von etwa 1-5 mM zugesetzt. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn man das Sulf hydrylreagenz während der Reaktion nachdosiert, z. B. eine Zugabe von 2 mM DDT nach jeweils 5 Stunden Reaktionsdauer.

Auch die Durchführung der Reaktion in Gegenwart von Katalase kann bevorzugt sein. Die Wasserstoffperoxid-zersetzende Wir kung der Katalase wirkt sich günstig auf die Stabilität der Ascorbinsäure aus und versorgt die GulOx zusätzlich mit mole kularem Sauerstoff, der beim Abbau von H₂O₂ gebildet wird. Durch Zusatz von Katalase kann eine stabilisierende Wirkung erreicht werden, die in etwa mit der Zugabe des Sulfhydrylrea genz vergleichbar ist.

Die Substratkonzentration kann in weiten Bereichen variiert werden und beträgt im allgemeinen etwa 1-500 mM, insbesondere von 20-250 mM. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß eine Erhöhung der Substratkonzentration im Produktansatz zu einer Vergrößerung der jeweils maximal erreichbaren L-Ascor binsäurekonzentration führt.

Eine Stabilisierung der durch die Reaktion gebildeten Ascor binsäure kann durch Ansäuern, insbesondere auf einen pH-Wert von 5 insbesondere einem pH von etwa 3 erreicht werden.

Um die Produktivität der GulOx zu erhöhen, ist es bevorzugt, die L-Ascorbinsäuresynthese in einem kontinuierlichen System mit einem immobilisierten Enzym durchzuführen (vgl. Abb. 2). Die mit Sauerstoff angereicherte Substratlösung 40 wird dabei mit konstantem Fluß in einem Enzymreaktor 42 eingeleitet. Der Reaktor 42 enthält immobilisierte GulOx 44, die vorzugsweise an eine partikelförmige Matrix mit großer Oberfläche gebunden ist. Der pH-Wert innerhalb des Enzymreaktors kann auf einem für die Enzymaktivität günstigen, d. h. hohen pH von 7-8 gehal ten werden. Nach Verlassen des Reaktors kann der pH-Wert durch Zugabe von Säure (46) gesenkt und damit die Ascorbinsäure stabilisiert werden. Aus der auf diese Weise erhaltenen Pro duktlösung 48 erfolgt schließlich die Gewinnung der L-Ascor binsäure.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Enzymreaktor, um fassend

(a) ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität,
(b) Sauerstoff als Cosubstrat,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub strat, und
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Synthese von L-Ascorbinsäure in einem mehrstufigen Verfahren, bei dem ein erster enzymatischer Reaktionsschritt, der von einem Pro tein mit Uronat-Reduktase-Aktivität katalysiert wird, mit einem zweiten enzymatischen Reaktionsschritt kombiniert wird, der durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität katalysiert wird.

Bei der erfindungsgemäßen Kopplung von UDH und GulOx kann zwi schen einer direkten Kopplung und einer indirekten Kopplung unterschieden werden. Bei der direkten Enzymkopplung wird im ersten enzymatischen Reaktionsschritt als UDH-Substrat D-Glu curonsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäure-γ-lacton ver wendet. Als Produkt des ersten enzymatischen Reaktionsschritts wird L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton erhalten, das direkt als Substrat für den zweiten enzymatischen Reak tionsschritt eingesetzt werden kann. Dieses Verfahren ist jedoch weniger bevorzugt, da die Substratspezifität der UR für Lactone relativ gering ist. Bevorzugt ist daher eine indirekte Kopplung, bei der der erste und zweite enzymatische Reaktions schritt räumlich getrennt eingesetzt werden. Das bei Verwen dung von D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure im ersten Schritt entstehende Produkt wird lactonisiert und die entste hende Lösung als Substrat für den zweiten Schritt verwendet. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die im ersten Schritt entstehende Produktlösung nach Lactonisierung direkt in den zweiten Schritt ohne vorhergehende Aufreinigung einge setzt werden kann.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren mit direkter Enzym kopplung, wobei man

(a) D-Glucuronsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäure-γ-lacton durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton über führt, und
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte direkt durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L-Ascorbinsäure überführt.

Bevorzugt ist jedoch ein Verfahren zur Synthese von L-Ascor binsäure mit indirekter Enzymkopplung, wobei man

(a) D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulonsäure oder/und L-Galactonsäure überführt,
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch Lactonisie rung in L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton überführt und
(c) die in Schritt (b) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L-Ascorbin säure überführt.

Die als Substrate für den Schritt (a) des indirekten Verfah rens verwendeten D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure sind beispielsweise durch enzymatische Isomerisierung der aus Saccharose zugänglichen Fructuronsäure z. B. durch Glucuronat- Isomerase (EC 5.3.1.12) aus E.coli (Karapally und Dietrich (1970): Can J. Biochem. 48, 154-160) erhältlich. Darüber hin aus besteht die Möglichkeit, durch enzymatische Oxidation von UDP-Glucose durch die NAD-abhängige UDP-Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.22) aus Pseudomonas elodea (Tazuke et al. (1977): J. Ferment. Technol. 55, 501-509) UDP-Glucuronsäure zu erhalten. UDP-Glucose wird wiederum aus Glucose-1-phosphat (G1P) herge stellt. Phosphorylasen, welche aus Stärke bzw. Maltodextrinen G1P synthetisieren, sind bekannt, z. B. Maltodextrinphosphory lase (EC 2.4.1.1) aus Corynebacterium callunae (Weinhäusel et al. (1994): Appl. Microbiol. Biotechnol. 41, 510-515; Nidetzky et al. (1995): J. Carbohydrate Chemistry 14, 1017-1028), aus E.coli (Weinhäusel et al. (1995): Enzyme Microbiol. Techn. 17, 140-146) oder Stärkephosphorylase (EC 2.4.1.1) aus Kartoffeln (EP-A 0 305 908).

Vorzugsweise wird als Protein mit Uronat-Reductase-Aktivität ein Protein verwendet, welches von der in SEQ ID No. 1 gezeig ten Nukleotidsequenz, einer dieser Sequenz im Rahmen der Dege neration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz oder einer mit diesen Sequenzen hybridisierenden Nukleotidse quenz codiert ist.

Der erste enzymatische Reaktionsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird sowohl bei direkter als auch bei indirekter Enzymkopplung vorzugsweise in Gegenwart eines Systems zur Coenzymregenerierung, wie oben beschrieben, durchgeführt. Weiterhin ist es bevorzugt, diesen Verfahrensschritt kontinu ierlich in einem Enzymreaktor durchzuführen.

Schritt (b) des indirekten Verfahrens umfaßt die Lactonisie rung der im Schritt (a) gebildeten Produkte. Dies erfolgt, wie zuvor beschrieben, vorzugsweise durch Erhitzen und Ansäuern.

Für den zweiten enzymatischen Reaktionsschritt wird vorzugs weise ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität verwendet, welches von einer DNA-Sequenz mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleotidsequenz, eine dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleo tidsequenz oder einer mit diesen Sequenzen hybridisierenden Nukleotidsequenz codiert ist. Vorzugsweise wird das Protein aus prokaryontischen Zellen gewonnen. Das Protein mit GulOx-Aktivität verwendet vorzugsweise O₂ als Cosubstrat.

Das Verfahren wird günstigerweise als kontinuierlicher Prozeß durchgeführt. Bei der direkten Verfahrensvariante kann die Reaktion in einem einzigen Enzymreaktor durchgeführt werden. Bei der indirekten Verfahrensvariante verwendet man günstiger weise zwei separate Reaktoren.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber bekannten Ver fahren zahlreiche signifikante Vorteile auf. Zunächst müssen kleine Schutzgruppen verwendet werden, was zur Vermeidung von Abwasserproblemen führt. Weiterhin kann das Verfahren unter milden Reaktionsbedingungen mit einer geringen Anzahl von Synthesestufen durchgeführt werden. Es ist keine chemische Hydrierung, keine Verwendung von H₂ und keine Verwendung von Cl₂ erforderlich. Schließlich können mit Hilfe der beschriebe nen Enzyme wesentlich bessere Aktivitäten und Ausbeuten als im Stand der Technik erreicht werden.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Sequenz protokolle und Abbildungen erläutert werden. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 die Nukleotidsequenz eines Uronat-Dehydroge nase-Gens,
SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz einer Uronat-Dehydrogena se,
SEQ ID No. 3 die Nukleotidsequenz eines L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Gens,
SEQ ID No. 4 die Aminosäuresequenz einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase,
SEQ ID No, 5 und 6 Aminosäureteilsequenzen der Hexonat-Dehydroge nase aus L. starkeyi,
SEQ ID No. 7 und 8 Nukleotidsequenzen von degenerierten Oligonu kleotidprimern zur Isolierung des Uronat-Dehy drogenase-Gens aus S. cerevisiae,
SEQ ID. No. 9 und 10 Nukleotidsequenzen von Oligonukleotidprimern zur Isolierung des L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Gens aus einer Ratten cDNA-Bank,
Abb. 1 einen Uronat-Dehydrogenase-Enzymreaktor und
Abb. 2 einen L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Enzymreaktor.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachstehen den Beispiele erläutert werden:

Methoden 1. Aktivitätstests für UDH und GDH

Die Enzymaktivitäten wurden mit Hilfe eines optischen Tests im Photometer bestimmt, indem die Extinktionsände rung bei 340 nm infolge der Abnahme bzw. Zunahme der NADP (H) -Konzentration bei 25°C gemessen wurde. Meßgröße war die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit, die proportional zur umgesetzten Coenzymkonzentration ist. Eine Einheit (U) ist die Menge an Enzym, die unter Testbedingungen 1 µmol Substrat pro Minute bei 25°C umsetzt.

Reaktionsansatz zur Bestimmung von UDH

100 mM Substrat (D-Glucuronsäure) in 0,1 mM Coenzym (NADPH) in Reaktionspuffer (5 mM K-Phosphatpuffer pH 7,0, 100 mM KCl und 0,1% NaN₃).

Reaktionsansatz zur Bestimmung von GDH

100 mM Substrat (D-Glucose), 0,2 mM Coenzym (NADP) in Reaktionspuffer (siehe oben).

2. Aktivitätstest für GulOx

Die Aktivität von GulOx wurde durch Konzentrationsmessung des Endprodukts L-Ascorbinsäure bestimmt. Dieser Test beinhaltete die Oxidation der Ascorbinsäure und eine an schließende Umwandlung zum Bis-(Dinitrophenyl)hydrazon, welches mit HPLC bei 495 nm nachgewiesen werden kann. Eine Einheit (U) ist diejenige Menge an Enzym, die unter Testbedingungen 1 µmol Substrat pro Minute bei 37°C um setzt.

Reaktionsansatz zur Bestimmung von GulOx

50 µl Probelösung, 2,5 mM Substrat (L-Gulono-γ-lacton) in Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, 50 mM Na-Citrat, 1,7 mM DTT) in einem Gesamtvolumen von 300 µl; Inkubationsdauer: 15 min bei 37°C.

Nach der enzymatischen Reaktion wurden die Proben mit 50 µl einer 30-%igen Meta-Phosphorsäure abgestoppt und 5 min bei 10 000 g abzentrifugiert. Von dem Überstand wurden 330 µl abpipettiert und in ein neues Reaktions gefäß überführt, in das die zur Derivatisierung von L-Ascorbinsäure notwendigen Lösungen zugegeben wurden:
20 µl Dichlorphenol indophenol (0,2%)
300 µl Thioharnstoff (2% in 5%iger Metaphosphorsäure)
60 µl Dinitrophenylhydrazin (2% in 9 N H₂SO₄).

Die Probe wurde 90 min. bei 50°C inkubiert. Danach er folgte eine Elution des Hydrazons durch Ausschütteln in 400 µl Ethylacetat. Die HPLC Auftrennung der Probe wurde einer Polygosil 60-5 (Silikasäure) durchgeführt. Als Laufmittel wurde n-Hexan/Ethylacetat/n-Propanol/Essig säure (4/3/0,2/0,1) verwendet.

Beispiel 1 Uronat-Reduktase 1.1. Aufreinigung von HDH aus Lipomyces starkeyi

Die Aufreinigung der Hexonat-Reduktase (HDH) aus L.star keyi bis zur Homogenität erfolgte aus dem Rohextrakt durch Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylse pharose fast flow, gefolgt von Anionenaustausch-Chromato graphie an Q-Sepharose fast flow und abschließender er neuter Hydrophober Chromatographie an Alkyl-Superose HR 5/5 bis zu einer spezifischen Aktivität von 33 U/mg (220fache Anreicherung).

Aus dem gereinigten Enzym konnten nach tryptischer Ver dauung 2 kurze Aminosäurensequenzen ermittelt werden (SEQ ID No. 5 und 6). Aufgrund dieser Sequenzdaten wurden Oligonukleotide synthetisiert, um das udh-Gen aus geno mischer Saccharomyces cerevisiae DNA zu isolieren.

1.2. Charakterisierung des Uronat-Reduktase-Gens

Die Isolierung genomischer DNA aus Saccharomyces cerevi siae erfolgte nach Sambrook et al., Supra. Durch PCR-Technik unter Verwendung der aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 5 und 6 abgeleiteten degenerierten Oligonu kleotide SEQ ID No. 7 und 8 konnte ein DNA-Fragment am plifiziert und isoliert werden. Dieses wurde als Sonde verwendet, um aus genomischer DNA von S.cerevisiae ein genomisches Fragment durch Hybridisierung nachzuweisen und zu isolieren. Das Fragment wurde kloniert und sequen ziert. Die in SEQ ID No. 1 gezeigte Sequenz ist darin enthalten und codiert für ein Polypeptid mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz.

1.3. Rekombinante Expression von UDH

Das von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 codierte Poly peptid konnte mit hoher Ausbeute in E.coli JM 109 syn thetisiert werden. Die im SDS-Gel sichtbare Proteinbande entsprach etwa 15-20% der Gesamtmenge an löslichem Pro tein. Die Zellen wurden nicht in ihrem Wachstum beein trächtigt.

D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sind Substrate, die mit dem Coenzym NADPH reduziert werden. Der K_M-Wert für die D-Glucuronsäure ist 7,64 mM. Für die D-Galacturon säure ist der K_M-Wert 4,5 mM. Das Enzym ist stabil, zeigt ein pH-Optimum bei pH 6, 2-8,5 und ein Temperaturoptimum bei 45°C.

Das Molekulargewicht der rekombinanten UDH liegt bei SDS-PAGE zwischen 30 und 43 kD. Die Affinität zum Coenzym NADPH ist mit K_M = 0,008 mM deutlich besser als die von HDH aus L.starkeyi (K_M = 0,035 mM).

Bei rekombinanter Expression in E.coli konnte nach vier stündiger Induktion durch Ammoniumsulfatfällung (40%) des Zellextrakts und anschließender fraktionierter Ionen austausch-Chromatographie des Überstands an einer Mono-S-Säule ein nahezu reines Protein mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg erhalten werden.

1.4. Optimierung der udh-Expression

Der im Beispiel 1.3. zur Expression verwendete Induktor IPTG ist sehr teuer und kann zudem toxisch auf E.coli Zellen wirken. Um mit dem wesentlich kostengünstigeren Induktor Lactose arbeiten zu können, mußte das udh-Gen in einen Wirt überführt werden, der Lactose aufnehmen und verstoffwechseln kann. Ein Beispiel für einen geeigneten Bakterienstamm ist E.coli B (Donch und Greenbert (1986), B.J. Bacteriol. 95, 1555-1559), ein Stamm mit intaktem Lactoseoperon, der Lactose aus dem Medium aufnehmen und in den eigentlichen Induktor Allolactose umwandeln kann. Zur Expression in E.coli B wurde das udh-Gen in den Ex pressionsvektor pBTac 1 (Brosius et al. (1981), J. Mol. Biol, 148, 107-127) hinter den regulierbaren tac-Promotor kloniert. Um sicherzustellen, daß das Gen ohne Zugabe von Induktor nicht exprimiert wird, wurden die Bakterien noch mit einem zweiten Plasmid pFDX500 (Brinkmann et al. (1989), Gene 85, 109 ä114) cotransformiert, das ein Gen für den Repressor des lac-Promotors trägt. Dieser Repres sor kann auch den tac-Promotor regulieren.

Ein weiterer geeigneter Bakterienstamm ist E.coli RM82 (Mattes (1985), Habilitationsschrift Universität Regens burg). Bei diesen Zellen ist das spezifische Transportsy stem für Lactose defekt, so daß Lactose nur in sehr ge ringen Mengen in die Zelle gelangen kann. In der Zelle wird es normal verstoffwechselt. Auch hier wurde ein weiteres Plasmid pREM6677 (Mattes (1985), Habilitations schrift Universität Regensburg) cotransformiert, das ebenfalls den lac-Repressor enthält.

Eine Induktion der obengenannten Bakterienstämme konnte bei einer Lactosekonzentration von 0,2% im Medium erreicht werden. Während der Kultivierung folgt vorzugs weise eine kontinuierliche oder/und diskontinuierliche Zugabe von Induktor. Es konnten im Rohextrakt 2,4 U/mg (E.coli B) bzw. 1,5 U/mg (E.coli RM82) gemessen werden, was einer Ausbeute von etwa 70% gegenüber der Induktion mit IPTG entspricht.

Bei E.coli B Zellen wurde nach vierstündiger Induktion mit 0,2% Lactose eine maximale spezifische Aktivität des Rohextrakts erreicht. Bei Verwendung von E.coli RM 82 wurde bereits nach einer Stunde Induktionszeit die hier maximale spezifische Aktivität im Rohextrakt erreicht.

1.5. UDH-Mutanten

Es wurden drei UDH-Mutanten hergestellt. Bei der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz wurde das Arginin 57 gegen Glutaminsäure, das Tyrosin 47 gegen Glutaminsäure oder das Glutamin 29 gegen Glycin ausgetauscht.

In Tabelle 1 sind die Werte für die maximale Geschwindig keit (v_max) sowie die Michaelis-Konstante (K_M) des nativen Enzyms sowie der Mutanten mit NADH bzw. NADPH als Coenzym und D-Galacturonsäure als Substrat angegeben.

Tabelle 1

Die Mutante R57E hatte keine großen Auswirkungen auf die Coenzymspezifität. Es wurde eine Verringerung der maxima len Umsatzgeschwindigkeit mit NADPH als Coenzym festge stellt. Für NADH wird eine etwas verbesserte maximale Umsatzgeschwindigkeit gefunden.

Die Mutante Q29G zeigte bei NADPH eine schlechtere maxi male Umsatzgeschwindigkeit und einen schlechteren K_M-Wert. Für NADH wurde ebenfalls eine Verschlechterung der maxi malen Umsatzgeschwindigkeit, aber eine drastische Verbes serung des K_M-Werts gefunden.

Die Mutante Y47E zeigte für NADPH einen etwas verschlech terten K_M-Wert. Für NADH wurde die maximale Umsatzge schwindigkeit verschlechtert, aber der K_M-Wert war sehr stark verbessert.

1.6. UDH-katalysierte Substratumsetzung mit Coenzymregenerierung

Durch Kopplung der UDH-Reaktion mit einem System zur Coenzymregenerierung konnten hohe Substratumsätze erzielt werden.

1.6.1. Batchreaktionen

Der Standardansatz für eine Batchreaktion war wie folgt:
0,15 U UDH/ml; 0,5 U GDH/ml und 50 bzw. 250 mM Substrat in einem Gesamtvolumen von 20 ml.

Als Substrate wurden D-Glucuronsäure, D-Galacturonsäure und D-Glucurono-γ-lacton verwendet. Bei einer Substrat konzentration von 250 mM konnte eine nahezu vollständige Umsetzung der Substratlösungen erreicht werden.

Die Anfangskonzentration des Coenzyms in den Ansätzen betrug 0,06 mM, 0,012 mM bzw. 0,15 mM. Durch Erhöhung der Konzentration von 0,06 mM auf 0,012 mM konnte eine deut liche Umsatzverbesserung erreicht werden. Eine Erhöhung auf 0,15 mM hatte keine weitere Umsatzsteigerung zur Folge. Im Enzymsystem UDH/GDH konnte das Coenzym bis zu 2000 mal recyclisiert werden.

Es wurde auch der Einfluß des UDH/GDH-Verhältnisses auf die Reaktion untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß eine GDH-Zugabe im Überschuß nicht nötig war und daß eine ausreichende Coenzymbereitstellung für die UDH auch bei einer annähernd gleichen UDH- und GDH-Aktivität zumindest für eine Coenzymstartkonzentration von 0,15 mM gegeben war. UDH/GDH-Enzymverhältnisse (Aktivität) von 1/1 bzw. 1/1,5 lieferten bei ausreichender Coenzymmenge vergleich bare Umsätze. Bei geringen Coenzymkonzentrationen oder längerer Reaktionsdauer erwies sich jedoch im GDH-Über schuß als vorteilhaft.

Eine Zugabe von 10 mM DTT zum Ansatz führte zu einer deutlichen Verbesserung der Stabilität von UDH. Auch durch Zusatz von 2 mM EDTA konnte die Stabilität von UDH verbessert werden.

1.6.2. Kontinuierliche Ansätze

Kontinuierliche Reaktorversuche wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Puffer: 5 mM Kaliumphosphat, 100 mM KCl, 0,1% NaN₃
Temperatur: 25°C
Rührergeschwindigkeit: 300 RPM
pH-Wert: 7,0
Substratkonzentration: 50 mM D-Glucuronsäure, 50 mM D-Glucose, 0,15 mM NADP
Zusätze: 5 mM DTT
Gesamtmenge an Enzym: UDH 15 U/GDH 80 U
Während der Reaktionsdauer erfolgte eine Nachdosierung von NADP. Durch Verdoppelung der Flußrate von 5 ml/h (mittlere Verweilzeit 10 h) auf 10 ml/h (mittlere Ver weilzeit 5 h) konnte die Produktivität verbessert werden. Die in den ersten 100 h gebildete Produktmenge erhöhte sich um 79%. Der Umsatz lag bei den kontinuierlichen Reaktorversuchen im Durchschnitt bei 77-85%.

1.7. Lactonisierung

L-Gulon- bzw. L-Galactonsäurelösungen (100 mM) wurden bei 60°C für 15 min. und Zugabe von HCl (Endkonzentration von 250 mM) inkubiert. Die Ausbeute der Lactonbildung betrug dabei ca. 45%. Durch Verlängerung der Inkubationsdauer auf 30 min konnte die Ausbeute auf ca. 60% verbessert werden. Eine längere Inkubationsdauer brachte keine wei tere Ausbeutesteigerung mit sich.

L-Galactonsäurelösungen wurden in Gegenwart unterschied licher HCl-Konzentrationen bei 60°C inkubiert. Bei einer Konzentration ab 250 mM wurde die maximale Lactonbildung erreicht.

Beispiel 2 L-Gulono-γ-lacton-Oxidase (GulOx) 2.1. Klonierung der cDNA von GulOx

Die cDNA für GulOx aus der Ratte ist bekannt (Koshizaka et al. (1988): J. Biol. Chem 263, 1619-1621). Aus einer kommerziell verfügbaren cDNA-Bank der Rattenleber (Stra tagene, Heidelberg) wurde mit Hilfe der in SEQ ID No. 9 und 10 gezeigten Oligonukleotide eine PCR-Amplifikation durchgeführt, das enthaltene Fragment isoliert, kloniert und sequenziert. Darin ist die in SEQ ID No. 3 gezeigte Sequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID No. 4 gezeigten Sequenz codiert. Gegenüber der von Koshizaka et al., Supra, publizierten Sequenz wurden 2 Unterschiede gefunden: Position 252 G statt A; Codon Val statt Ile und Position 567 C statt G, Codon His statt Glu.

2.2. Rekombinante Expression von GulOx in E.coli

Die cDNA von GulOx wurde in den Expressionsvektor pET-12a (Studier et al. (1990), Meth. Enzymol. 185, 60-89) klo niert, auf dem sie sich unter Kontrolle des T7-Promotors befindet. Mit diesem Konstrukt wurden E.coli BL21 (DE3) Zellen (Studier und Moffat (1986), J. Mol. Biol. 189, 113-130) mit pLys S (Dunn und Studier (1983), J. Mol. Biol. 166, 477-535) transformiert.

Übernachtkulturen plasmidhaltiger Zellen in LB-Medium wurden 1 : 100 verdünnt und bei 3 verschiedenen Wachs tumstemperaturen (25°C, 30°C und 37°C) angezogen. Bei einem OD600 von 0,7-0,8 erfolgte eine Induktion mit 0,4 mM IPTG, nach der dann weitere 3-4 h bei der entspre chenden Temperatur geschüttelt wurde. Die Ernte der Zel len erfolgte in allen Kulturen bei einem OD600 von etwa 2,6 mit anschließenden Konzentrierung und Aufschluß durch Ultraschallbehandlung.

Von diesen Zellextrakten wurden die spezifischen Aktivi täten bestimmt. Bei einer Anzuchttemperatur von 37°C konnte eine spezifische Aktivität von 10 mU/mg, bei 30°C eine spezifische Aktivität von 32 mU/mg und bei 25°C eine spezifische Aktivität von 24 mU/mg erhalten werden. Somit wird bei einer Anzuchttemperatur von 30°, die höchste spezifische Aktivität des Proteins erreicht. Ebenso wird bei dieser Temperatur auch die größte Menge an Enzym produziert (SDS-PAGE).

Die höchste spezifische Aktivität der GulOx, über die bisher in Publikationen berichtet wurde, beträgt nach mehrstufiger Aufreinigung aus Rattenleber ca. 500-600 mU/mg. In diesem Fall sollten die bei 30°C erhaltenen Aktivitätswerte von 32 mU/mg einen Anteil von 5-7% vom Gesamtprotein entsprechen. Dies wurde durch densitome trische Auswertung von SDS-PA-Gelen bestätigt. Daher kann angenommen werden, daß das im SDS-Gel als Bande sichtbare GulOx-Protein vollständig aktiv ist.

2.3. Optimierung der Expression

Bei dem in Beispiel 2.2. beschriebenen Verfahren wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und nach Ultraschallaufschluß direkt in den Aktivitätstest bzw. für die SDS-PAGE-Analyse eingesetzt.

Bei einmaligem Waschen der Zellen in TE-Puffer und an schließendem Zentrifugieren wurden Werte für die spezi fische Enzymaktivität von 50-60 mU/mg erhalten, die um den Faktor 2 höher als die in Beispiel 2.2. angegebenen Werte für die Expression bei 30°C lagen.

Auch bei Waschen der Zellen in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 konnte eine Verbesserung der Enzymaktivität gefunden werden. Durch Zusatz von 1,7 mM DTT zum Puffer konnte zusätzlich eine minimale Erhöhung (5%) der spezi fischen Aktivität erreicht werden.

Der durch Ultraschall aufgeschlossene Zellextrakt wurde einer Fällung mit 16% Ammoniumsulfat unterzogen. Der größte Teil des aktiven Enzyms wurde in der durch Zen trifugation pelletierten Fraktion gefunden. Dabei wurde eine Erhöhung der spezifischen Aktivität auf 120 mU/mg gefunden. Der Anteil von GulOx am Gesamtzellprotein be trug ca. 20-25%.

2.4. Stabilität der Enzymaktivität

Zur Untersuchung der Stabilität des Enzyms in der Vita min-C-Synthesereaktion wurde ein Langzeittest durchge führt, bei dem die Enzymreaktion nach unterschiedlich langen Zeiten (zwischen 15 min und 16 h) analysiert wurde. Es sollte dabei festgestellt werden, ob das Enzym über längere Zeit bei 37°C aktiv ist und das Endprodukt Vitamin C produziert.

Hierzu wurden 6 verschiedene Ansätze mit identischen Mengen (ca. 0,15 mU) GulOx enthaltendem Zellextrakt ge startet. Die nachfolgende Inkubation bei 37°C wurde zu unterschiedlichen Zeiten (15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h und 16 h) gestoppt und das gebildete Vitamin C zum Hydra zon derivatisiert. Dabei wurde ein lineares Verhältnis zwischen der gebildeten Menge an Vitamin C und der Zeit nur im Bereich zwischen 15 min und 1 h gefunden. Danach nahm die vom Enzym produzierte Menge an Vitamin C langsa mer zu. Dieser Verlust der Linearität war auf den Ver brauch des Substrats zurückzuführen.

Weiterhin wurde die Stabilität der GulOx bei 37°C unter sucht. Hierzu wurden in 7 verschiedenen Ansätzen gleiche Mengen GulOx (ca. 5 mU) bei 37°C unterschiedlich lange (zwischen 15 min und 16 h) vorinkubiert und anschließend in den standardisierten Aktivitätstest eingesetzt.

Es wurde gefunden, daß nach 1 h Vorinkubation das Enzym noch nahezu 100% Aktivität besitzt. Danach nahm die spezifische Aktivität ab. Nach 16 h Vorinkubation war noch ca. 40% der ursprünglichen Aktivität vorhanden.

Durch Zusatz von Detergenzien konnte GulOx von der Mem branfraktion getrennt und somit in Lösung gebracht wer den. Gute Ergebnisse wurden mit einem Solubilisierungs puffer erzielt, der 100 mM Kaliumphosphat, pH 7,0 bzw. 7,8, 0,4 M Saccharose, 1 mM EDTA und 1% Triton-X100 enthielt. Die Enzymausbeute betrug in beiden Fällen ca. 50% der Ausgangsaktivität. Die Überstände nach der Zen trifugation wurden zur Vitamin-C-Synthese eingesetzt. Das Detergens Triton-X100 konnte mit Hilfe von Ionenaustau scher- Chromatographie (DEAE-Sepharose fast flow) besei tigt werden.

2.6. Charakterisierung der rekombinanten GulOx pH-Optimum

Für diese Untersuchungen wurden 2 verschiedene Puffersy steme (Kaliumphosphat und Tris/HCl) ausgewählt. Die Akti vität der GulOx im Tris/HCl-Puffer und im Bereich von pH 7,6-8,2 mit ca. 12,2 mU/ml annähernd auf gleichem Niveau. Höhere Aktivitäten (bis 15,3 mU/ml wurden mit dem Caliumphosphatpuffer erreicht. Dabei steigt die Aktivität durch GulOx mit Erhöhung des pH-Werts deutlich an und erreicht ihr Maximum bei pH 7,8.

Enzymstabilität

In TE-Puffer (pH 7,0) waren bei einer Inkubationstempera tur von 5 bzw. 20°C nach 340 bzw. 490 h noch 50% der Enzymaktivität vorhanden. Im Kaliumphosphatpuffer besaß die GulOx nach ca. 540 h noch 50% Restaktivität.

Inhibitoren

Verschiedene Stoffe, die als Inhibitoren der GulOx-Akti vität in Betracht zu ziehen sind, wurden in teilweise unterschiedlichen Konzentrationen zum Standard-Enzymtest zugegeben. Neben dem Konservierungsmittel Natriumazid (0,1%) und dem Antischaummittel Polypropylenglycol (0,5%) wurden die Abbauprodukte der Ascorbinsäure L-Threonsäure (2 bzw. 10 mM) und Oxalsäure (2 bzw. 10 mM) sowie L-Gulonsäure (1 bzw. 10 mM), die bei Hydrolyse von L-Gulono-lacton entstehen kann, zugesetzt.

Keine dieser Substanzen hatte eine deutliche Hemmwirkung. Lediglich die Zugabe von 10 mM Oxalsäure senkte die En zymaktivität um ca. 10%.

Beispiel 3 Kopplung der Enzyme Uronat-Reduktase und L-Gulono-γ-lacton-Oxidase 3.1. Direkte Kopplung der Enzyme UDH/GDH und GulOx

Die Versuche wurden in 100 mM Kaliumphosphat von pH 7,0 unter Zusatz von 1,7 mM DTT und 50 mM Na-Citrat durchge führt. Die Ansätze enthielten je 7,5 mM Glucose und D-Glucuronsäure bzw. D-Glucurono-γ-lacton, 280 mU UDH, 825 mU GDH und 0,75 mM NADP. Nach Zugabe von 3 mU GulOx (unbehandelter Rohextrakt) wurden die Ansätze für 2 h bei 37°C inkubiert. Bei Verwendung von D-Glucorono-γ-lacton als Substrat konnte im Ansatz L-Ascorbinsäure nachgewie sen werden.

3.2. Indirekte Kopplung (mit Lactonisierung)

Ein gemäß Beispiel 1.7. lactonisierter Reaktionsansatz wurde in den GulOx-Standardtest (Methoden) eingesetzt. Es wurde die gleiche Enzymaktivität, wie bei Zugabe von reinem Substrat gemessen. Demnach ist ein lactonisierter UDH/GDH-Ansatz ebenso gut für die Ascorbinsäureproduktion geeignet wie eine frisch hergestellte Substratlösung von käuflichem L-Gulono-γ-lacton. Die GulOx wird durch die Komponenten im Reaktionsansatz nicht gehemmt. Die Ascor bat-Konzentration war höher als im Verfahren mit der direkten Kopplung (Beispiel 3.1.).

Claims

1. Verwendung einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduktase-Aktivität codiert und

(a) die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidse quenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybri disierende Nukleotidsequenz umfaßt, zur Herstellung eines Enzyms für die Synthese von L-Ascorbinsäure.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Homologie von mindestens 70% zu der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz auf einem Vektor lokalisiert ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein prokaryontischer Vektor ist.

5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Zelle mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Vektor nach einem der An sprüche 3-5 transformiert wird.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine E.coli Zelle ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einem diese DNA-Sequenz enthaltenden Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz er folgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Expressionsprodukt in Form eines Zellextrakts gewinnt.

10. Verwendung eines Proteins mit einer Uronat-Reduktase- Aktivität, das von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert ist als Enzym in einem Verfahren zur Herstel lung von L-Ascorbinsäure.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein

(a) die in SEQ ID No. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz umfaßt.

12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein in isolierter Form oder einen das Protein enthaltenden Zellextrakt einsetzt.

13. Verwendung nach nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein Coenzym enthaltende Substratlösung mit UDH in Kontakt bringt und die gebildete L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure zu L-Ascorbinsäure weiterreagieren läßt.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat D-Glucuronsäure bzw. D-Galacturon säure oder deren Lactone einsetzt.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-14, dadurch gekennzeichnet, daß NADPH oder/und NADH als Coenzym einsetzt.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Systems zur Coen zymregenerierung, insbesondere in Gegenwart von Glucose-Dehydrogenase, durchführt.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-16, dadurch gekennzeichnet, daß man das Coenzym in einer Ausgangskonzentration von 0,05-0,5 mM, insbesondere von 0,08-0,25 mM einsetzt.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Coenzym während der Reaktion nachdosiert.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Sulfhydrylrea genz, insbesondere Dithiothreitol oder Dithioerythritol, durchführt.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das Sulfhydrylreagenz während der Reaktion nach dosiert.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Komplexierungs mittels, insbesondere EDTA, durchführt.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-21, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure kontinuierlich in einem oder mehreren Enzymreaktoren durchführt, an deren Ausströmöffnungen vorzugsweise ge ladene Ultrafiltrationsmembranen vorgesehen sein können.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-22, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildete L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure in das entsprechende Lacton überführt.

24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactonbildung durch Ansäuern und Erhitzen oder/und durch Inkubation mit einer Lactonase erfolgt.

25. Enzymreaktor, umfassend

(a) ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität,
(b) ein Coenzym ausgewählt aus NADH oder/und NADPH,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub strat,
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt, und
(e) gegebenenfalls ein Enzym zur Coenzymregenerierung.

26. Enzymreaktor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß an der Ausströmöffnung eine vorzugsweise geladene Membran vorgesehen ist, die den Durchtritt von Produkt und Rückhaltung von Enzymen und Coenzymen gestattet.

27. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduk tase-Aktivität codiert und eine mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz oder einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz um minde stens eine Aminosäure unterscheidet.

28. Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 27 codiert ist.

29. Protein nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es eine zu der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäure sequenz mindestens 80%ige Homologie aufweist.

30. Protein nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß es für NADH als Coenzym eine höhere maximale Umsatz geschwindigkeit oder/und einen geringeren K_M-Wert als das Protein mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäurese quenz besitzt.

31. Protein nach einem der Ansprüche 28-30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäure sequenz unterscheidet durch:

(a) einen Austausch von Arg (57) durch Glu,
(b) einen Austausch von Tyr (47) durch Glu oder/und
(c) einen Austausch von Gln (29) durch Gly.

32. Prokaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und

(a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degene ration des genetischen Codes entsprechende Nu kleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, zur Expression zu bringen.

33. Zelle nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine E.coli Zelle ist.

34. Zelle nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals ist.

35. Zelle nach einem der Ansprüche 32-34, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei Expression der DNA-Sequenz einen Zellextrakt mit einer spezifischen GulOx-Aktivität von 5 mU/mg ergibt.

36. Zelle nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische GulOx-Aktivität im Zellextrakt im Be reich von 10-200 mu/mg liegt.

37. Unglykosiliertes Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität aus Prokaryonten, das codiert ist von einer DNA-Sequenz, welche

(a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidse quenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybri disierende Nukleotidsequenz umfaßt.

38. Unglykosiliertes Protein nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) die in SEQ ID No. 4 gezeigte Aminosäuresequenz oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz umfaßt.

39. Verfahren zur Gewinnung eines Proteins nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß man eine prokaryontische Zelle mit

(i) einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L- Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und
- (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degene ration des genetischen Codes entsprechende Nu kleotidsequenz oder
- (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, oder
(ii) einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz aus (a), (b) oder/und (c) enthält,

transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz er folgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man eine E.coli Zelle verwendet.

41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, daß man das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt ge winnt.

42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellextrakt eine spezifische GulOx-Aktivität von 5 mU/mg aufweist.

43. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 37 oder 38 oder eines nach einem der Ansprüche 39-42 hergestellten Pro teins oder eines das Protein enthaltenden Zellextrakts in einem Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure.

44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß man eine O₂ enthaltende Substratlösung mit GulOx in Kontakt bringt und die gebildete L-Ascorbinsäure gewinnt.

45. Verwendung nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galac tono-γ-lacton einsetzt.

46. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-45, dadurch gekennzeichnet, daß eine immobilisierte GulOx einsetzt.

47. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-46, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei pH 6-8 durchführt.

48. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-47, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Sulfhydrylrea genz, insbesondere Dithiothreitol oder Dithioerythritol, durchführt.

49. Verwendung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß man das Sulfhydrylreagenz während der Reaktion nach dosiert.

50. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-49, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart von Katalase durch führt.

51. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-50, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat in einer Konzentration von 1-500 mM, insbesondere von 20-250 mM einsetzt.

52. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-51, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildete L-Ascorbinsäure durch Ansäuern, insbesondere auf einen pH-Wert 5, stabilisiert.

53. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-52, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren kontinuierlich durchführt.

54. Enzymreaktor, umfassend

(a) ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivi tät,
(b) Sauerstoff als Cosubstrat,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub strat, und (d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt.

55. Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) D-Glucuronsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäu re-γ-lacton durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galac tono-γ-lacton überführt und
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität direkt in L-Ascorbinsäure überführt.

56. Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulonsäure oder/und L-Galactonsäure überführt,
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch Lacto nisierung in L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galacto no-γ-lacton überführt und
(c) die in Schritt (b) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L-Ascorbinsäure überführt.