TR201807729T4 - O-fosfoserin sülfidrilaz mutantları ve bunların kullanıldığı sistein üretimine yönelik yöntem. - Google Patents

Abstract

Üç ilâ yedi C-terminal amino asit kalıntısından yoksun SEQ ID NO: 1'inkine karşılık gelen bir Mycobacterium smegmatis -deriveli amino asit dizisine sahip bir O-fosfoserin sülfidrilaz (OPSS) mutantı açıklanır. Ayrıca OPSS mutantını kodlayan bir nükleik asit molekülü, nükleik asit molekülünü taşıyan bir ifade vektörü ve ifade vektörü ile transforme olan bir transformant açıklanır. Ek olarak, O-fosfo-L-serinin (OPS), OPSS mutantının varlığında bir sülfit ile reakte edildiği sistein üretimine yönelik bir yöntem sağlanır. OPSS mutantı, enzimatik aktiviteyi geliştirmiştir ve basit bir enzimatik dönüşüm reaksiyonu vasıtasıyla L-sisteinin çevre dostu üretimine uygulanabilir.

Description

TARIFNAME O-FOSFOSERIN SÜLFIDRILAZ MUTANTLARI VE BUNLARIN KULLANILDIGI SISTEIN ÜRETIMINE YÖNELIK YÖNTEM Mevcut bulus, en az üç ila yedi C-terminal amino asit kalintisinin silinmesi hariç olmak üzere SEQ lD NO: liinkine karsilik gelen bir Mycobacterium smegmatis- derive amino asit dizisinden olusan bir O-fosfoserin sülfidrilaz (ayrica “OPSS” olarak refere edilir) mutanti ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrica OPSS mutantini kodlayan bir nükleik asit molekülü, nükleik asit molekülünü tasiyan bir ifade vektörü ve ifade vektörü ile transforme edilen bir transformant ile ilgilidir. Ayrica mevcut bulus, OPSS mutantinin varliginda O-fosfo-L-serin (OPSYnin bir sülfit ile reaksiyona girmesi ile sistein üretimine yönelik bir yöntem ile ilgilidir.

L-sistein, yasayan tüin organizmalardaki sülfür metabolizmasinda önemli bir rol oynayan bir amino asittir. Bu, koenzimin bir öncülü olarak islev görmesinin yani sira bir saç keratini, glutatyon, biyotin, metiyonin ve diger sülfür içeren metabolitler gibi proteinlerin biyosentezinde kullanilir. Ayrica sistein biyosentezinin, L-serin, L-glisin ve L-metiyonin dahil olmak üzere diger amino asitlerin biyosentezi ile yakindan iliskili oldugu bilinir. Endüstriyel olarak L- sistein ve deriveleri, farmasötik endüstri (brons hastaliklarinin tedavisine yönelik), kozmetik endüstrisi (saç sampuanlarinda, sürekli dalgalara yönelik bilesimler vb.) ve gida endüstrisinde (antioksidanlar, aroma arttiricilar, hamur yardimci maddeleri) dahil olmak üzere çesitli endüstrilerde uygulamalar bulur.

Klasik olarak L-sistein, insan saçinin veya hayvan tüylerinin asit hidrolizi araciligiyla endüstriyel olarak elde edilmistir (Ko Aida tarafindan düzenlenen 01537-P-0027 birlikte saçtan veya tüylerden sistein üretimi sadece %7-851ik kadar düsük bir verim saglamaz ayni zamanda hidroklorik asit veya sülfürik asidin kullanimi çevre kirletici atigin önemli derecede bir miktarini üretir. Ayrica tüketiciler, yag veya tüylerden ekstraksiyona karsi kuvvetli bir isteksizlige sahip olabilirler. Bu problemler mikroorganizmalari kullanan L-sistein fermantasyonuna sebep olarak L-sisteinin çevre dostu üretim proseslerinin gelistirilmesine yönelik bir hamle yapilmasina neden olur.

L-sisteinin mikrobiyal üretimi arasindaki temsilci, bir mikroorganizma kullanarak D, L-ATC*nin biyolojik dönüsümüdür (Ryu OH, Ju JY ve Shin CS, Process düsük çözünürlügü nedeniyle endüstriyel olarak uygulamak üzere zordur. L- sistein üretiminin bir diger yöntemi E. coli kullanilan dogrudan fermantasyondur (Patent No. EP 0885962B;Wada M ve Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., konsantrasyonda L-sistein üretimine yönelik sinirlama ile sonuçlanarak hücre içi toksisiteye neden olur. Bu dezavantaji gidermek üzere L-sistein-çikarici proteinler kullanilmistir ancak verimlilikte önemli derecede gelismeler olmamistir.

Bakteri ve bitkilerde L-sisteinin biyosentez yolagi refere edilerek O-asetil-serin (OAS), L-sisteinin karbon omurgasi saglayarak bir ara öncül olarak hareket eder donör olarak hidrojen sülfit kullanilarak enzim O-asetilserin sülfidrilaz (OASS), asetat salgilayarak O-asetilserinin S-sülfosisteine dönüsümünü ve son olarak sisteine dönüsümünü katalize eder. Alternatif olarak 804, sistein üretiminde bir sülfür donör olarak kullanima yönelik tiyosülfata indirgenebilir (Nakamura T, vasitasiyla sistein biyosentez yolagi, serinin OAS°ye dönüsümünü katalize eden serin asetiltransferazinin (CysE) ve OASinin sisteine dönüsümünü katalize eden sistein sentazinin (CysK) iki enzimini kullanir. Açik bir sekilde bunlarin arasinda serin asetiltransferazi (CysE), nihai ürün sistein araciligiyla geri beslemeli 01537-P-0027 inhibisyona oldukça hassastir (Wada M ve Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., inhibisyona hassas olmayan degisken bir enzime ihtiyaç duyulur.

Mevcut bulusu meydana getirerek, önceki teknikte karsilasilan problemlerin üstesinden gelmeyi amaçlayan, mevcut bulusçular araciligiyla yürütülen yüksek bir verimde L-sistein üretimine yönelik yogun ve kapsamli arastirma, L-sisteini sentezlemek üzere Aeropyrum pemix, Mycobacteri'um tuberculosz's ve OAS- spesifik yolak haricinde bir O-fosfo-L-serin (OPS)-spesifîk yolagi alan Trichomonas vaginalis°de O-fosfoserin sültîdrilaz (OPSS)”nin var olmasi (Mino Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW, and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: sisteine dönüsümünü katalize eden M. Tuberculosi'min OPSSinin bes C-terminal amino asit kalintisi buradan uzaklastirildiginda ek enzimlerin yoklugunda OPS°nin sisteine dönüsümünde bir sülfür donör olarak NagSiyi kullanabilmesi bulgu ile sonuçlanmistir.

SEQ 1D NO: l°e göre Mzcobacterium smegmatis°den sistein sentaz dizisi (Cysl 1), UniProt veri tabanindan (erisim no. AOR1X2) bilinmektedir.

Bu nedenle mevcut bulusun bir amaci, en az üç ila yedi C-terminal amino asit kalintisinin delesyonu hariç olmak üzere SEQ ID NO: l”inkine karsilik gelen bir 01537-P-0027 Mycobacterium smegmatis-deriveli amino asit dizisinden olusan bir o-fosfoserin sülfidrilaz (ayrica “OPSS” olarak refere edilir) mutantinin saglanmasidir.

Mevcut bulusun bir diger amaci, OPSS mutantini kodlayan bir nükleik asit molekülünün saglanmasidir.

Mevcut bulusun ayrica bir amaci, nükleik asit molekülünü tasiyan bir ifade vektörünün saglanmasidir.

Mevcut bulusun ayrica bir amaci, ifade vektörü ile transforme edilen bir transfonnantin saglanmasidir.

Mevcut bulusun bir diger amaci, OPSS mutantinin varliginda bir sülfit ile yönelik O-fosfo-L-serin (OPS)°nin sisteine dönüsmesine yönelik bir yöntemin saglanmasidir.

Yukarida açiklandigi üzere O-fosfoserinin L-sisteine enzimatik dönüsümüne yönelik gerekli olan gelistirilmis enzimatik aktiviteye sahip OPSS mutanti, basit bir sekilde kütlesel ölçekte yüksek bir verimde OPS”den L-sistein üretilmek üzere kullanilabilir.

SEKIL 1, sicakliga göre OPSS°nin aktivitesini gösteren bir grafiktir.

SEKIL 2. OPSS”riin pH hassasiyetini gösteren grafiklerin bir grubudur.

SEKIL 3, SDS PAGE araciligiyla analiz edildigi üzere bir pET sistemi ve bir pCL-Pcjl sisteminde enzimin ifade seviyesini gösteren bir fotograftir.

SEKIL 4, sailastirilmis OPS fermantasyon besiyerini sisteine dönüstürmek üzere OPSS°nin enzimatik aktivitesini gösteren bir grafiktir. 01537-P-0027 SEKIL 5, OPS ferinantasyon besiyerini sisteine dönüstürmek üzere OPSSinin enzimatik aktivitesini gösteren bir grafiktir.

SEKIL 6, bir 1 L kavanoz ölçeginde bir substrat olarak OPS kullanilarak OPSS araciligiyla dönüstürülen OPS ve sistein üretimi gösteren bir grafiktir.

SEKIL 7, bir OPSS mutantini kodlayan bir gen tasiyan bir pCL-Pcjl ifade vektörünün bir haritasini gösteren sematik bir görüntüdür.

Bunun bir açisina göre mevcut bulus, dogal sus O-fosfoserin sülfidrilaz amino asit dizisinin yetersiz 3 ilâ 7 C-terminal amino asit kalintisi hariç olmak üzere SEQ ID NO: l°inki ile ayni amino asit dizisine sahip bir Mycobacterium smegmati'cs- derive OPSS mutanti saglar Mevcut tarifriamenin bir düzenlemesinde mevcut bulusun OPSS mutanti, SEQ ID NO : 2°nin amino asit dizilerinin bir tanesine sahip olabilir. SEQ lD NO: 2”nin bir amino asit dizisine sahip OPSS mutanti ayrica bir serin kalintisi (Ser) ile pozisyon 77°de prolin kalintisinin (Pro) bir sübstitüentine sahip olmak üzere modifiye edilebilir. Ayrica SEQ ID NO: ?nin bir amino asit dizisine sahip OPSS mutanti, bir alanin kalintisi (Ala) ile pozisyon 131”de treonin kalintisinin (Thr), bir asparagin kalintisi (Asp) ile pozisyon 137”de lisin kalintisinin (Lys) ve bir serin kalintisi (Ser) ile pozisyon 238°de treonin kalintisinin (Thr) bir sübstitüentine sahip olmak üzere ayrica modifiye edilebilir. Ayrica, yukarida bahsedilen asit dizileri burada açiklanir. dallara sahip ve bazik boya anilin ile boyanabilen Aktinobakteri subesindeki bir bacillus seklinde susa refere eder. Mevcut bulusta, bunun amino asit dizi modifiye 01537-P-0027 edildiginde sustan derive edilen O-fosfoserin sülfidrilazin artmis bir veri ile L- sistein biyosentezini katalize edebilecegi bulunmustur.

Burada kullanildigi üzere "O-fosfoserin sültîdrilaz (OPSS)" terimi, OPSinin sisteine dönüsümün katalize eden bir enzime refere eder. Enzim ilk olarak Aeropyrum perm'x”de bulunmustur ve adlandirilmistir (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, .

Iyi bilinen çesitli yöntemler, OPSSayi elde etmek üzere kullanilabilir. Yöntemin örnek niteligindeki örnekleri, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, ilgili enzimlerin yüksek bir verimde elde edilebilmesi araciligiyla kodon optimizasyonuna dayanan gen sentezi tekniklerini ve mikroorganizmalarin genetik bilgisinin çok büyük depolarina dayanan faydali enzim kaynaklarinin biyoinfonnatik tarama yöntemlerini içerir. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde sisteini sentezlemek üzere bir substrat olarak OPS°yi kullanan OPSS enzimleri, çesitli mikroplardan seçilmistir. Bu baglamda OPSS enzimini saglamak üzere enzim içeren üst fazin saflastirilmasi ile takip edilen, teknikte bilinen uygun ortam ve kültür kosullari kullanilarak elde edilen hücre pelletleri (parçalanmistir).

Burada kullanildigi üzere “mutant” terimi, fenotipte kalitsal veya kalitsal olmayan stabil bir degisim gösteren bir kültüre veya bir bireye refere eder. OPSS (O- fosfoserin sülfidrilaz) ile bir arada kullanildiginda “mutant” teriminin, dogal sus ile karsilastirildiginda bunun aktivitesinin etkili bir sekilde gelistirilebildigi genetik olarak degistirilen bir OPSS enzimini ifade etmesi tasarlanir.

Mycobacterium tuberculosis H37Rv-derive OPSS mutantlari Silinen bes C- terminal amino asit kalintisinin, ek enzimlerin yoklugunda bile bir SZ` grubunu içeren sülfür kaynagina yönelik artmis atinite gösterdigine dair rapora dayanarak Mycobacterium smegmatis°in OPSS°sinden bes C-terminal amino asit kalintisi silinerek bir OPSS mutanti hazirlanmistir. Mevcut bulusa uygun olarak OPSS mutanti, üç ilâ yedi, tercihen bes C-terminal amino asit kalintisi silinen SEQ ID 01537-P-0027 NO: 1°inkine karsilik gelen bir Mycobacterium smegmatz's derive amino asit dizisinden olusur.

Mevcut tarifnamenin bir düzenlemesinde SEQ ID NO: Zinin amino asit dizisine sahip olan mutantin, OPS°nin sisteine dönüsümüne uygulandiktan sonra bir saat içinde %100°lük bir dönüsüm orani sergiledigi gözlemlenmistir (Tablo 5).

Amino asit sübstitüenti ayrica mevcut bulusun OPSS mutantinin enzimatik aktivitesini arttirabilir. Teknikte iyi bilindigi sürece enzimi gelistirmek üzere herhangi bir yöntem kullanilabilir. Mevcut tarifnamede, tercihen, OPSS mutantinin enzimatik aktivitesinde bir gelisme gerçeklestirmek üzere rastgele mutajenez kullanilmistir. Detayli olarak OPSS”ye rastgele mutajenez geçirmek üzere olanak tanindiktan sonra gelistirilmis enzimatik aktiviteye sahip mutantlar, mevcut bulusçular araciligiyla HTSiye (yüksek verimli tarama) dayanarak gelistirilen tarama sistemi kullanilarak seçilmistir. Sonuç olarak enzimatik aktiviteyi gelistiren OPSS mutantlari, Msm-T-HA2 ve Msm-T-EP3, bir Msm-T geni üzerinde HTS taramasi yapilarak elde edilmistir. Msm-T-HA2, bir serin kalintisi (Ser) ile sübstitüe ediln pozisyon 77”deki prolin kalintisi (Pro) hariç olmak üzere SEQ ID NO: 2 ile ayni amino asit dizisine sahip olan bir OPSS mutantidir. Msm-T-EP3, pozisyon 131°de treonin kalintisina (Thr) yönelik bir alanin kalintisi (Ala) ile, pozisyon 1373de lisin kalintisina (Lys) yönelik bit asparagin kalintisi (Asp) ile ve pozisyon 238”de treonin kalintisina (Thr) yönelik bir serin kalintisi (Ser) ile meydana gelen sübstitüsyon mutasyonu hariç EQ ID NO: 2 ile ayni amino asit kalintisina sahip bir OPSS mutantidir. Burada ayrica sirasiyla SEQ ID NO: 3 ve SEQ ID NO: 4 ile temsil edilen amino asit dizilerine sahip OPSS mutantlari Msm-T-HA2 ve Msm-T-EP3 açiklanir.

Mevcut tarifnamenin bir düzenlemesinde Msm-T-HA2 ve Msm-T-EP3°ün SEQ bir enzimatik aktivite sergiledigi bulunmustur (Tablo 5 ve 6). Detayli olarak OPSS mutantlari Msm-T-HA2 ve Msm-T-EP3, kontrol Msm-T ile 01537-P-0027 karsilastirildiginda dönüsüm reaksiyonunun bir ilk asamasindaki 5-kat ve 1.2-kat artmis dönüsüm oranlarini sergiledigi ölçülmüstür. Ek olarak, sistein sentez aktivitesinin Msm-T-HAZ mutanti, Msm-T enzimininkinden 4-kat daha yüksek oldugunda ve %40”lik Msm-T”ye karsilik gelen bir miktarda kullanildiginda nihai sistein dönüsüm orani benzer olmustur.

Burada kullanildigi üzere “homoloji “teriminin, iki polipeptit arasindaki özdeslik yüzdesine refere etmesi tasarlanir. Bir dizi ilâ digeri arasindaki uyum teknikte bilinen teknikler araciligiyla belirlenebilir. Örnegin homoloji, dizi bilgisi hizalanarak ve kolay bir sekilde elde edilebilir bilgisayar programlari kullanilarak iki polipeptit arasindaki dizi bilgisinin dogrudan bir karsilastirmasi araciligiyla belirlenebilir. Alternatif olarak homoloji, tek iplikli-spesifik nükleaz ile sindirim ve sindirilmis parçalarin boyutun belirlenmesi ile takip edilen homolog bölgeler arasinda stabil dubleksleri olusturan kosullar altinda polinükleotitlerin melezlesmesi araciligiyla belirlenebilir.

Burada kullanildigi üzere tüm dil bilgisel formlari ve yazim varyasyonlarinda familyasi) ve farkli türlerden homolog proteinler (örnegin, miyozin hafif zincir, Vb.) dâhil olmak üzere bir “ortak evrimsel kökene” sahip proteinler arasindaki iliskiye refere eder. Bu tür proteinler (ve bunlarin kodlayici genleri), dizi benzerlikleri ile yansitildigi üzere dizi homolojisine sahiptir. Ancak yaygin kullanimda ve mevcut uygulamada “yüksek derecede” gibi bir zarf ile modifiye edildiginde “homolog” terimi dizi benzerligine refere edebilir ve bir ortak evrimsel köken ile ilgili olabilir veya olmayabilir.

Burada kullanildigi üzere tüm dil bilgisel forrnlarinda “dizi benzerligi” terimi, bir ortak evrimsel kökeni paylasabilen veya paylasamayan proteinlerin nükleik asit veya amino asit dizileri arasindaki uyum veya özdeslik derecesine refere eder.

SpesiIik bir düzenlemede amino asitlerin en azindan %2lsi (en azindan yaklasik 01537-P-0027 dizilerinin tanimlanan uzunlugu ile eslestiginde iki amino asit dizisi, “büyük ölçüde homolog” veya “büyük ölçüde benzer” olur. Büyük ölçüde homolog olan diziler, dizi veri bankalarinda veya bu özel sisteme yönelik tanimlandigi üzere örnegin siki kosullar altinda bir Southern melezleme deneyinde bulunabilen standart yazilim kullanilarak dizilerin karsilastirilmasi araciligiyla tanimlanabilir.

Tanimlanan melezleme kosullari, teknik kapsami içindedir (örnegin, Sambrook et al. 1989, asagi bakiniz).

Mevcut bulusun OPSS mutantlari, sistein üretmek üzere bir tiyol grubunun (SH grup) OPS°ye transferini katalize edebilir. Tercihen mevcut bulusun OPSS mutantlarina optimal aktivitelerini kullanmak üzere olanak taniyan kosullar bunlarla sinirli olmamakla birlikte i) 0 - 2 mM PLP (piridoksal-S'-fosfat) varligi veya bir kot`aktör olarak 0 - 25 ilâ 60°C arasinda bir reaksiyon sicakligi ve iii) 6.0 ilâ 10.0 arasinda pH degeri içerir.

Bir tiyol grubunun OPS°ye transfer edilmesi ile sistein sentezini katalize eden OPSS°nin enzimatik aktivitesine yönelik bir analiz, Ape-OPSS (Ape-O-fosfoserin sülfidrilaz) adlandirilmasi ile açiklanmistir. Özellikle, Ape-OPSS°nin bir tiyol grubunun transferi ile OAS*nin sisteine dönüsüm aktivitesine sahip olmasi nedeniyle analiz, E. colz' sistein sentez enzimi (OASS, O-asetilserin sülfidrilaz, EC 138, 2003).

Mevcut bulusun bir düzenlemesine uygun olarak analizde, sistein dönüsümünde OASS veya OPSS”nin bir kofaktörü olarak islev gören OAS (O-asetilserin) veya OPS°ye yönelik bir yiyol grubu saglayan PLP, 0.2 mM”lik bir konsantrasyona eklenmistir. Ayrica DTT, sadece sistein içindeki havaya maruz kalan sisteinin oksiditasyonunu önlemek üzere degis ayni zamanda azalan gücü sayesinde önceden oksitlenmis sistein miktarini belirlemek üzere eklenir. Tercihen 25mM DTT veya 0.2mM PLP eklendiginde sistein dönüsüm orani, 2.3 kez arttirilmistir. 01537-P-0027 Diger bir deyisle PLP ve DTT, OPS”nin sisteine dönüsümü üzerinde pozitif etkilere sahiptir.

Enzimler Ape-OPSS, Mtb-OPSS ve Mtb-T daha önce rapor edildigi üzere 7.4,lük optimal bir pH degeri ile 60°C veya 37°C°lik optimal bir reaksiyon sicakligina gelistirilmis enzimatik aktiviteye sahip OPSS mutantlarina yönelik dönüsüm reaksiyon kosullari en uygun hale getirilebilir. Mevcut bulusun bir düzenlemesinde OPSS mutantlari, 37°C ilâ 80°C arasinda bir sicaklikta dönüsümü katalize edebilir. Detayli olarak, yüksek sicakliklarda dahi büyüyebilen Archea sppfden Apc-OPSS enzimi, 60°C`de 37°C”dekinden daha yüksek enzimatik aktivite gösterir. Ayrica enzimin yüksek isi stabilitesi 60°C°lik optimal bir sicakliga yol açar. Diger taraftan Msm-T, 37°C°de optimal enzimatik aktivite gösterir ve 60°C°de isil isleme karsi savunmasizdir. OPSS enzimleri, 6.0 ilâ .0”lik bir pH araligi üzerinde dönüsüm aktivitesini sürdürmek üzere bulunmustur. Optimal enzimatik aktivite, Ape-OPSS°de pH7.4°te ve Msm-T`de 8.0 ilâ 9.0,lik bir pH degerinde saptanmistir. Bu nedenle Msm-T, Ape-OPSSSnin oldugundan daha genis bir pH araligi üzerinde stabildir.

Bunun bir diger açisina uygun olarak mevcut bulus, OPSS mutantini kodlayan bir nükleik asit molekülü saglar. moleküllerini içermesi tasarlanir. Nükleik asit moleküllerinin yapisal birimlerini olusturan nükleotidler, sadece dogal bir sekilde olusan nükleotidleri degil ayni zamanda seker kisim- veya baz kisim- modifiye edilmis analoglari içerir (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman ve Peyman, 01537-P-0027 Bunun ilave bir açisina uygun olarak mevcut bulus, nükleik asit molekülünün tasiyan bir ifade vektörü saglar.

Bir “vektör”, bir konakçi hücrede bir nükleik asidin klonlanmasi ve/veya transferine yönelik herhangi bir araca refere eder. Bir vektör, bagli segmentin replikasyonunu meydana getirmek amaciyla bir diger DNA segmentinin baglandigi bir replikon olabilir. Bir “replikon”, in vivo DNA replikasyonunun otonom bir birimi olarak islev gören, diger bir deyisle kendi kontrolü altinda replikasyon yapabilir herhangi bir genetik elemana (örnegin, plazmid, faj, kozmidi kromozom, Virüs) refere eder. “Vektör” terimi, nükleik asidin in vitro, ex vivo veya in vivo bir konakçi hücreye yerlestirilmesine yönelik viral ve viral olmayan araçlara refere eder. “Vektör” terimi ayrica küçük daire DNAslari içerebilir. Örnegin vektör, bakteriyel DNA dizileri olmaksizin bir plazmid olabilir. CpG bölgelerinde yogun olan bakteriyel DNA dizilerinin uzaklastirilmasi, transgen ifade susturulmasini ve plazmid DNA vektörlerinden daha çok sürekli ifade ile sonuçlanmasini arttirmak üzere gösterilmistir (bakiniz Ehrhardt. A. et al. (2003) içerebilir.

Bir vektör olarak bir T7 promotörü kullanan pET sistemi (Novagen), teknikte iyi bilinir. Mevcut bulusta teknikte bilinen çesitli ifade sistemleri sinirlama olmaksizin kullanilabilir.

Mevcut bulusun bir düzenlemesinde bir eksojen genin ifade edilmesine yönelik olarak mevcut bulusçular araciligiyla gelistirilen bir Cl 1 promotörü kullanan bir ifade sistemi (bakiniz Kore Patent Kamunun Incelemesine Açik Yayin No. 10- 01537-P-0027 Mevcut bulusun bir düzenlemesinde bir T7 promotörü içeren pET sistemi ile bir C] 1 promotörü içeren CJl sistemi arasindaki OPSS°nin ifade seviyeleri, ayni kosullar dikkate alindiginda karsilastirilmistir. Sonuç olarak CJl sistemi, pET sistemininkinden daha yüksek bir OPSS ifade seviyesini göstermistir (SEKIL 3).

Ek olarak OPSS°nin asiri ifadesi, pET sisteminde düsük bir sicaklik (18°C) ve uzun bir zaman dilimine ancak CJ 1 sisteminde yüksek bir sicaklik (37°C) ve kisa bir zaman periyoduna ihtiyaç duymustur. Bu nedenle CJl promotörünün, OPSS°yi etkili bir sekilde elde etmek üzere kullanilmasi tercihe edilir ancak mevcut bulus, buna sinirlandirilmaz.

Bunun ilave bir açisina uygun olarak mevcut bulus, ifade vektörü ile transforme edilen bir transformant saglar.

Burada kullanildigi üzere tüm dilbilgisel formlari ve yazim varyasyonlarinda olarak kromozoma dahil edilebilecegi sekilde yabanci bir genin konakçi hücreye uygulanmasi ile sonuçlanan bir hücrenin yapay genetik alterasyona refere eder.

Mevcut bulus vektörü, teknikte bilinen uygun standart teknikler araciligiyla konakçi hücrelere uygulanabilir, bunun örnekleri, bunlarla sinirli olmamakla birlikte elektroporasyon, kalsiyum fosfat birlikte çöktürme, retroviral enfeksiyon, mikroenjeksiyon, DEAE-dekstran ve katyonik lipozom kalsiyum içerir.

Burada kullanildigi üzere “bir rekombinant vektör ile transforme olan konakçi hücre” terimi, içinde ilgili bir geni tasiyan bir rekombinant vektörünü sabitleyen bir konakçi hücreye refere eder. Mevcut bulusta kullanima yönelik uygun konakçi hücre, prokaryotik veya ökaryotik olabilir. Örnekler, Escherichiaspp. ve Serratia spp. Tercihi ile en yüksek E. 0011' olmasi tercihi ile enterobakteria ve coryneforin bakteri içerir. 01537-P-0027 Bunun bir diger açisina uygun olarak mevcut bulus, mevcut bulusun OPSS mutantinin varliginda bir sülfit ile OPS”nin dönüstürülmesinden olusan, sistein üretimine yönelik bir yöntem saglar.

Mevcut bulus inutanti, sisteinin toplu üretimine uygulanabilir. Mutanti ifade eden transformant kullanildiginda sisteinin toplu üretimi, teknikte iyi bilinen optimal kültür kosullari altinda gerçeklestirilebilir. Bu nedenle sisteinin toplu üretimine yönelik yöntem, teknikte iyi bilinen optimal bir kosulda transformantin kültürlenmesini içerir.

Bir substrat olarak kullanima yönelik olarak OPS, saf formda olabilir veya OPsiyi içeren bir fermantasyon kültürü formunda olabilir. Saf OPS, Sigma-Aldrich”den olarak elde edilebilir. Ancak, OPS içeren kültürün ek saflastirma olmaksizin kullanilabilmesi ve dönüsüme yönelik gerekli olan kofaktör PLP°nin fermente edilen kültürde elde edilebilmesi bakimindan mikrobiyal fermantasyon araciligiyla elde edilen OPS içeren kültür, ticari olarak elde edilebilir saf OPS”ye karsi ekonomik avantaja sahiptir.

Herhangi bir sülfür bilesigi, bir tiyol grubuna (SH) dönüstürtülebildigi sürece mevcut bulusta kullanilabilir. Tercihen gaz veya sivi formunda NagS, 1128 veya 8203 kullanilabilir.

Mevcut bulusun bir düzenlemesinde NazS, bir sülfür kaynagi olarak kullanilabilir.

Nazs, enzimatik dönüsümde kullanilan 0.] ilâ 3 kat OPSsninki kadar yüksek bir molar konsantrasyona eklenebilir. Detayli olarak, Msm-Tininkine esdeger fermantasyon besiyeri veya 60 mM fermantasyon besiyeri, 100 mM veya 120 mM Nazs ve 0.2 mM PLP içeren bir reaksiyon durumunda 50 ug/mL°lik bir konsantrasyonda kullanilir. 01537-P-0027 Bir enzim dönüsüm prosesinin en uygun hale getirilebilecegi ve yüksek derecede aktif` enzimler ile ölçeginin büyütülebilecegi teknikte uzman kisiler için açik ve kolay bir sekilde anlasilir olacaktir. Bir düzenlemede 19.317 g/L OPS fermantasyon besiyeri, 50 mg°lik Msm-T-l-IAZ varliginda inkübe edildiginde sistein 9.075 g/L°ye kadar bir konsantrasyonda üretilmistir. Bir 1 Lilik kavanoz ölçeginde OPS, mutant varliginda %71.8351ük bir oranda sisteine dönüstürülmüstür (SEKIL 6) Kisaltma ve Terminoloji Mevcut bulusu gerçeklestirmek üzere mevcut bulusu daha iyi açiklamak ve teknikte bu teknikleri ögretmek amaciyla asagidaki kelimeler ve yöntemlerin bir açiklamasi verilir. Baglam açik bir sekilde aksini belirtinedikçe açiklamalar ve istemler boyunca `“içerir” ve “içerme” kelimeleri ve benzerleri hariç tutulan veya ayrintili anlamina karsi olarak kapsayici anlamda diger bir deyisle “ile sinirli olmamakla birlikte” anlaminda yorumlanacaktir. “Bir” ve “bu” tekil terimleri, baglam açik bir sekilde aksini belirtmedikçe çogul referanslari içerir. Örnegin, birçok hücreyi içerir” anlamina gelir.

Bir veya daha fazla ögenin bir listesine referansta kullanildiginda “veya” kelimesi, kelimenin asagidaki tüm yorumlamalarini: listedeki ögelerin herhangi biri, listedeki ögelerin hepsi veya listedeki ögelerin herhangi bir kombinasyonu, içerir.

Aksi belirtilmedikçe burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, mevcut bulusun ait oldugu teknikte uzman kisilerce anlasilan ayni anlamlara sahiptir.

Ilgili yöntemler ve materyaller asagida açiklanir ancak benzer ve esdeger yöntem ve materyaller, mevcut bulusun uygulamalarinda veya deneylerinde kullanilabilir.

Asagida bahsedilen materyaller, yöntemler ve örnekler, mevcut bulusu göstermek üzere ifade edilir. Mevcut bulusun diger özellikleri ve avantajlari, asagidaki açiklama ve ekli istemlerden anlasilabilir olacaktir. 01537-P-0027 Silme: Bir veya daha fazla nükleotidler veya amino asit kalintilari, sirasiyla bir nükleik asit molekülünden veya bir proteinden uzaklastirilmistir.

Mevcut bulusun daha iyi bir sekilde anlasilmasi, mevcut bulusu göstermek üzere belirtilen asagidaki örnekler vasitasiyla elde edilebilir. ÖRNEK 1: OPSS,nin gelisimi Aeropyrum perm'x, Mycobacteri'um tuberculosis ve T richomonas vaginali's°in sistein sentezine yönelik bir substrat olarak E. (3011' içinde OAS yerine OPS”yi kullanan bir enzim, OPSS'ye sahip oldugu rapor edilir (Mino K ve lshikawa K, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC, ve Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: Mycobacterium tiiberculosi's H37vaden OPS”yi sisteine dönüstüren iki tip OPSS bulmuslardir. Bunlarin arasinda Mycobacterium tuberculosis H37Rv-derive OPSS enzimi, amino asit homolojisinin taranmasina yönelik olarak kullanilmistir. Sonuç olarak üç OPSS mutanti Msm-OPSS, Rjo-OPSS ve Nfa-OPSS, sirasiyla Mycobacterium smegmatis susu MC2 155, Rhodococcus josti'i' RHA1”den ve Nacardiafarcinica [FM 10152°den saglanmistir.

Her bir sustan OPSS elde etmek üzere tipik olarak enzim ifadesine yönelik olarak kullanilan bir pET28a vektör sistemi (Novagen) olusturulmustur. Bes farkli OPS sülfidrilaz enziminin klonlanmasindan kullanima yönelik her bir sablon ve primerler ve ortaya çikan rekombinant plazmidler, asagidaki Tablo 1”de gösterilir.

Tablo lide verildigi üzere sablon ve primerlerin uygun kombinasyonlari, her bir OPS geninin güçlendirilmesine yönelik olarak PCR”ye yönelik kullanilmistir.

PCR ürünleri ve pET28a vektörü, NdeI ve HindIII ile sindirilmistir (3 saat 01537-P-0027 boyunca 37°C). gen parçalarinin her biri, sindirilmis pET28a vektörüne (Novagen) baglanmistir. Baz dizileme, her bir OPSS genini tasiyan ifade vektörlerinin yapimini dogrulamistir. Enzim ifade vektörleri, bes OPSS enzimini ifade edebilen suslar üretmek üzere E. coli' (DE3)”e uygulanmistir. Enzim adlari, asagidaki Tablo 1°de verilir.

Enzim Vektör Sablon Primer Apc-OPSS pETZSa-Ape-OPSS Sentetik DNA SEQ ID NO: 7 ve 8 Mtb-OPSS pET28a-Mtb-OPSS Mtb genomik DNA SEQ ID NO: 9 ve 10 Msm-OPSS pET28a-Msm-OPSS Msm genomik DNA SEQ ID NO: 11 ve 12 Rjo-OPSS pETZSa-Rjo-OPSS Rjo genomik DNA SEQ ID NO: 13 ve 14 Nfa-OPSS pET28a-Nfa-OPSS Nfa genomik DNA SEQ ID NO: 15 ve 16 Enzimlerin ifadesi, pET sistemi üreticilerinin (Novagen) talimatlarina uygun olarak yapilmistir. LB plakalarindan her bir susun tekli kolonileri, 5 mL”lik LB besiyerinde asilanmistir ve 200 rpm”de çalkalanirken 16 saat boyunca 37°C5de inkübe edilmistir. Kültürler, 25 mL°lik taze LB besiyerine ( transfer edilmistir ve ayni kosulda 0.5 ~ 0.6 (2 ~ 3 saat boyunca) bir ODÖOOSa inkübe edilmistir, hemen akabinde 1 mM IPTG, 120 rpmide Çalkalanirken 18 saat boyunca 18°C”de inkübasyon esnasinda ifade edilecek enzimleri indüklemek üzere ortama eklenmistir. Enzimler, His SpinTrap (GE Healthcare) yardimiyla His-tag”e yönelik Ni-NTA kolonlari kullanilarak saflastirilmistir. Izole edilen bes OPSS enziminin dördünün, %14 SDS-PAGE elektroforez araciligiyla analiz edildigi üzere bir inklüzyon cisimcigi olan bir tanesi (Rjo-OPSS) ile çözünür formda olacagi bulunmustur. 01537-P-0027 ÖRNEK 2: Sistein Sentez Aktivitesine yönelik olarak OPSS”nin Analizi Çesitli mikroorganizma suslarindan elde edilen dört OPSS, OPSinin sisteine dönüsümü katalize etme yetenegine yönelik olarak analiz edilmistir. Analiz kosullari ve yöntemleri (eysM enzim analizi) ile ilgili olarak referans, önceki raporlara yapilmistir (Mino K ve lshikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Bums KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW ve Begley substrat miktari, bir birim mL ile temsil edilir. Enzim aktivitesine yönelik analiz kosullari asagida Tablo 27de gösterilir.

Stok solüsyonu Nihai Konsantrasyon Bosluk OPS sülfidiraz 6xhis-enzim - 40 (50mg) 0.5 M Na2S 10 mM Nazs 20 20 mM PLP 0.2 mM PLP 20 20 lOOmM OPS SmM OPS 0 50 DW 790 750 Toplam 1000 1000 Enzimler haricindeki reaksiyon solüsyonlari, 50 mgilik saflastirilmis OPSS, reaksiyon solüsyonuna eklendikten sonra 5 dakika boyunca 37°Csde inkübe edilmistir. 37°C°de inkübasyon esnasinda önceden belirlenmis sürelerde enzimatik reaksiyonu sonlandirmak üzere 100 mLilik enzim reaksiyonlari alinmistir ve 100 mL71ik %332 TCA ile karistirilmistir. Enzim reaksiyonlarinin sistein konsantrasyonlari, Gaitonde yöntemine uygun olarak ODsöoida absorbans ölçülerek nicelik bakimindan analiz edilmistir. Dört farkli OPS sülfidrilaz 01537-P-0027 enziminin sistein sentezi asagidaki Tablo 3°te gösterilir. OPSS enzimlerinin sistein sentez titreleri, reaksiyon süresi ile sistein dönüsüm oranlari olarak ifade Sistein Dönüsüm Orani (%) dakika 30 dakika 60 dakika Apc-OPSS 63.4 89.7 97.4 Mtb-OPSS 1.7 4.8 10.1 Msm-OPSS 12.8 25 43.7 Nfa-OPSS 0.1 0.1 02 Tablo 3lten görüldügü üzere Aeropyrum perni'x ve Mycobacteri'um tuberculosi's H37Rvâden derive edilen OPSS enzimlerinin, sisteini sentezlemek üzere bir substrat olarak OPS kullanilmasinin aktivitesine sahip oldugu dogrulanmistir. Ilk olarak Mtb-OPSS enzimi ile amino asit homolojisinin taranmasi ile elde edilmis yeni Mycobacteri'um smegmati's susu MC2 155-derive OPSSSnin sistein sentez aktivitesi bulunmustur. Diger yandan, homoloji taramasi ile elde edilen yeni Nocardiafarcim'ca IFM 10152-derive OPSS, O-fosfoserinin sisteine dönüsümünün yetersiz aktivitesini sergilemistir.

Tablo 37teki verilerden görüldügü üzere OPS”den Ape-OPSS”nin sisteinine dönüsüm orani bir saatte yaklasik %100”e ulasmistir.

Daha önceden raporlanan Mycobacterium tuberculosis H37Rv-derive OPSS bazindan enzim taramasi yoluyla yeni olarak seçilmis Msm-OPSS enziminin nihai dönüsüm orani %43.7”dir, bu 4.3 kat Mtb-OPSS°ninki kadar yüksektir. 01537-P-0027 ÖRNEK 3: Mtb-OPSS ve Msm-OPSSlnin 5 C-Terminal Amino Asit kalintisi silinen mutantlari olan Mtb-T ve Msm-T,nin hazirlanmasi Ek enzimler mec+ ve eysOinun yardimiyla OPS°nin sisteine dönüsümünü katalize eden Mycobacterium tuberculosis H37Rv-derive OPSS (Mtb-OPSS), bes amino asit kalintisi burada uzaklastirildiginda ek enzimlerin yoklugunda dahi OPS”nin sisteine dönüsümünde sülfür kaynagi içeren bir 82' kullanabilir. Bu gerçek bazinda, bir sülfür kaynagi olarak SZ' varliginda OPS,yi hizli bir sekilde dönüstürebilen Mtb-T (SEQ ID NO: 24) elde edilmistir. Mtb-OPSS ile yüksek bir amino asit homolojisi paylasan Msm-OPSS°den ayrica 5 C-terminal amino asit kalintisi silinerek Msm-T elde edilmistir. Iki enzim mutantlarim tasiyan ifade vektörleri olusturulmustur. Bu baglamda pfu PCR, SEQ ID NO: 17 ve 18 ve SEQ tuberculosi's H37RV ve Mycobacteriiim smegmati's susu MC2 155 ”in genomik DNA°si üzerinde gerçeklestirilmistir. Böylelikle elde edilen OPSS gen parçalari, Ndel ve Hindlll ile islem görmüstür ve sirasiyla pET28a-Mtb-T ve pET28a-Msm- T olarak adlandirilan rekombinant ifade vektörlerini olusturmak üzere ayni restriksiyon enzimi ile beslenen pET28a vektöründe klonlanmistir. Rekombinant ifade vektörleri E. coli (DE3)”e uygulanmistir. Örnek 1”deki ile ayni kosul altinda elde edilen iki OPSS mutantlarinin ifadesi %14 SDS PAGE araciligiyla dogrulanmistir. Sonuç olarak Mtb-T (SEQ 1D NO: 5) ve Msm-T (SEQ 1D NO: 2) elde edilmistir. ÖRNEK 4: Sistein Sentez Aktivitesine yönelik olarak Mtb-T ve Msm-T Analizi Yukarida elde edilen Mtb-T ve Msm-T, nihai sistein dönüsüm oranlari ölçülerek enzimatik aktiviteye yönelik olarak degerlendirilmistir. Enzimatik aktivite, Örnek 2”deki ile ayni sekilde analiz edilmistir. Dönüstürülen sistein, Gaitonde yöntemi kullanilarak nicelik bakimindan analiz edilmistir ve sonuçlar asagidaki Tablo 4°te gösterilir. 01537-P-0027 Sistein Dönüsüm Orani (%) dakika 30 dakika 60 dakika Tablo 43te görüldügü üzere Msm-T mutanti, bir saatte %10091ük bir oranda sisteinin substrattan dönüsümüne olanak tanimistir. ÖRNEK 5: Msm-T-Derive Mutantlari Msm-T-HAZ ve Msm-T-EP3”ün Sistein Sentez Aktivitesine yönelik Analiz OPS°yi %100”1ük bir oranda sisteine dönüstürebilen Msm-T bazinda gelistirilmis aktiviteye sahip enzim mutantlari, bir enzim evrim yöntemi kullanilarak elde edilmistir ve Msm-T-HA2 (SEQ ID NO: 25) ve Msm-T-EP3 (SEQ ID NO: 26) olarak adlandirilmistir. Hidroksilamin islemi ve bir hata egilimli PCR kiti (Clontech. Diversity PCR random mutagenesis kit) kullanan rastgele mutajenez, akabinde gelistirilmis enzimatik aktivite ile OPSS mutanlarini seçmek üzere taranmis Msm-T mutanlarinin bir kütüphanesini olusturmak üzere Msm-Tlye uygulanir.

Bir Msm-T geni üzerinde HTS taramasi yapilarak elde edilen OPSS mutantlari Msm-T-HA2 ve Msin-T-EP3°ün, baz dizileme ile analiz edildigi üzere sirasiyla SEQ ID NO: 3 ve 4”ün amino asit dizilerine sahip oldugu bulunmustur.

Mutantlar Msm-T-HAZ ve Msm-T-EP3 ve kontrol Msm-T, enzimatik aktiviteye yönelik analiz edilmistir ve sonuçlar Tablo 5 ve 6°da gösterilir. Enzim aktivite analizi. Örnek 2°deki ile ayni sekilde yapilmistir. 01537-P-0027 Sistein Dönüsüm Orani (%) dakika 30 dakika 60 dakika Tablo 5 ve 6°da görüldügü üzere, bir enzim evrim yöntemi araciligiyla elde edilen OPSS mutantlari Msm-T-HAZ ve Msm-T-EP3 kontrol Msin-T ile karsilastirildiginda reaksiyon baslamasindan sonra 10 dakika içinde sirasiyla 5-kat ve 1.2-kat artmis dönüsüm orani sergilemek üzere Ölçülmüstür. Ayrica bunlar, genis ölçüde enzim aktivitesinin belirlenmesinde kullanilan spesifik aktivite (ürün konsantrasyonu/süre/enzim miktari) bakimindan karsilastirilmistir. Msm-HA2”nin spesifik aktivitesi, OPSS mutantinin enzim aktivitesinde birim enzim basina süre basina daha yüksek miktarlarda sistein sentezleme kapasitesi ile gelistirildigini gösteren kontrol Msm-T°ninki ile karsilastirildiginda üç-kat arttirilmistir. ÖRNEK 6: OPSS Aktivitesine yönelik Kofaktör Ihtiyaci OPSSSnin sistein dönüsümü üzerinde kofaktörlerin etkisini incelemek üzere Msm- T7nin sistein dönüsümü, PLP ve DTT yoklugunda veya varliginda ölçülmüstür.

Bu baglamda 50 mM OPS besiyerinin ve 100 mM Nazssnin substratlari, 25 mM DTT veya 0.2 mM PLP varliginda 30 dakika boyunca 37°C9de reakte edilmistir. 01537-P-0027 Böylelikle üretilen sistein, Gaitonde yöntemi kullanilarak nicelik bakimindan analiz edilmistir. Sonuçlar asagidaki Tablo 7'de gösterilmistir.

Msm-T Sistein Dönüsüm Orani (%) Tablo 7°de görüldügü üzere PLP ve DTT varliginda sistein dönüsüm orani, 2.3 kat PLP ve DTT yoklugundaki kadar büyüktür. Bu nedenle PLP ve DTT°nin, dönüsüm üzerinde pozitif bir etkiye sahip oldugu gözlemlenmistir. ÖRNEK 7: Sicaklik araciligiyla OPSS Aktivitesi Sicakliklara göre Ape-OPSS ve Msm-T”nin sistein dönüsüm oranlari incelenmistir. 37°C ve 60°C”de enzimatik aktivite, reaksiyondan sonra 2, 5, 10, , ve 60 dakikada ölçülmüstür. Reaksiyon, , 5 mM OPS. 10 mM NazS, 0.2 mM PLP ve CysM 50 ug/mUlik kosul altinda yürütülmüstür. Üretilen sistein miktari, Gaitonde yöntemi kullanilarak belirlenmistir. Sonuçlar, SEKIL lsde gösterilir.

SEKIL 1°de gösterildigi üzere bir tampon durumunda Ape-OPSS, 60°C7de Msm- T”ninkinden daha yüksek reaktivitenin yani sira 37 OC”de daha hizli bir baslama reaksiyonu göstermistir. 01537-P-0027 ÖRNEK 8: OPSS3nin Isi Stabilitesi Ape-OPSS ve Msm-T, isi stabilitesine yönelik olarak analiz edilmistir. Enzimlerin her biri, bir OPS besiyerinde 2 mg/mL”lik bir konsantrasyona seyreltilmistir ve 5 mM OPS, 10 mM Nazs, kosul altinda boyunca 37°C ve 60°C”de termal olarak isleme tabi tutulmustur. Bu reaksiyona yönelik olarak 10 ug/mL Ape-OPSS ve 50 ug/mL Msm-T kullanilmistir. Üretilen sistein miktarlari, Gaitonde yöntemi kullanilarak ölçülmüstür ve sonuçlar asagidaki Tablo 8`de gösterilir.

Bagil aktivite (%) Tablo 8”de görüldügü üzere 4 saat boyunca isil isleme ragmen Msm-T aktivitesi 37°C”de sürdürülürken ancak 30 dakika boyunca 60°C°de isil islem üzerinde gözlemlenmistir.

Msm-T OPS besiyerinde pratik bir konsantrasyon olan 50 ug/mL'lik bir miktarda kullanildiginda 37°C”de enzimatik aktivitenin tutulumu üzerinde bir inceleme yapilmistir. NaZS yoklugunda 50 ug/mL Msm-T, 0.5, 1, 2, 4 ve 6 saat boyunca 37°C5de 50 mM OPS besiyeri ve 0.2 mM PLP ile birlikte isleme tabi tutulmustur, bundan sonra NazS, enzimatik reaksiyonu indüklemek üzere eklenmistir. 30 dakika boyunca reaksiyondan sonra Msm-T aktivitesi ölçülmüstür. Üretilen 01537-P-0027 sistein miktarlari Gaitonde yöntemi kullanilarak belirlenmistir ve asagidaki Tablo 9`da verilir.

Tablo 9°da görüldügü üzere Msm-T aktivitesi, OPS besiyerinde 37°C`de reaksiyondan sonra 2 saat boyunca %50”nin altina azaltilmistir. ÖRNEK 9: OPSS”nin pH Hassasiyeti pH”a göre Ape-OPSS ve Msm-Tsnin sistein dönüsüm oranlari ölçülmüstür. 100 mM,lik tamponda her biri 50 ug/mL`lik bir konsantrasyona sahip olan Ape-OPSS ve Msm-T, 10 dakika boyunca 37°7de reaksiyona maruz birakilmistir. Bu 9.0 / 10.0°lik bir pH degerine sahip bir Na-karbonat tamponu kullanilmistir. Üretilen sisteinin niceliksel analizi, Gaitonde yöntemi kullanilarak yapilmistir.

Sonuçlar, SEKIL 2°de gösterilir.

SEKIL 27de gösterildigi üzere Msm-T, tampona bakilmaksizin 8.0 ilâ 9.0"lik bir pH araliginda en yüksek aktiviteyi sergilemistir. Ape-OPSS söz konusu oldugunda bunun en yüksek aktivitesi. bir tampondan digerine degisen optimal bir pH ile K-fosfat (pH 7.4) içinde saptanmistir. 01537-P-0027 ÖRNEK 10: Iyonlarin OPSS Aktivitesi üzerine Etkisi Iyonlarin OPSS enzimlerinin aktivitesi üzerine olan etkisi asagidaki gibi incelenmistir. 5 mM OPS, 10 mM NazS, 0.2 mM PLP ve 100 mM HEPES (pH boyunca 37 °C°de reaksiyona maruz birakilmistir. Ape-OPSS ve Msm-T, sirasiyla ug/mL ver 50 ug/mUlik bir konsantrasyonda kullanilmistir. Üretilen sistein miktarlari Gaitonde yöntemi kullanilarak belirlenmistir ve asagidaki Tablo 109da gösterilir.

Bagil aktivite (%) NH4C1 Ape-OPSS Msm-T 1 49.1 1 67.1 1 2 27.72 47.12 (NH4)2SO4 veya KH2PO4, reaksiyon karisimina eklendiginde sistein dönüsüm oraninda hiçbir degisiklik saptanmamistir. Öte yandan Tablo 107da görüldügü üzere sistein dönüsüm orani, NH4C1 konsantrasyonunda bir artis ile azaltilmistir. Özellikle maksimum enzim aktivitesi, 2 g/L NH4 eklendiginde %70”den fazla azaltilmistir. Bu nedenle NH4C1 ve NH4°ün OPSS`nin dönüsüm aktivitesi üzerinde negatif bir etkiye sahip oldugu gözlemlenmistir. 01537-P-0027 ÖRNEK ll: Sülfür Kaynaginin OPSSinin Sistein Sentez Aktivitesi üzerindeki Etkisi Sülfur kaynaginin her bir enzimin sistein sentez aktivitesi üzerindeki etkisini incelemek üzere bir inceleme yürütülmüstür. 5 mM OPS, 0.2 mM PLP ve 100 mM HEPES içeren bir reaksiyon karisiminda her bir enzim (50 ug/mL Ape- boyunca 37°C°de reaksiyona maruz birakilmistir. Üretilen sistein miktarlari, Gaitonde yöntemi kullanilarak ölçülmüstür. Msm-T, Nazs°yi tercih ederken Ape- OPSS°nin bir sülfür kaynagi olarak Na2$203°ü tercih ettigi gözlemlenmistir.

Sonuçlar, asagidaki Tablo 11”de gösterilir.

Bagil aktivite (%) Enzim NazS NaSH NazSzOg. ÖRNEK 12: OPSS'i (pCL-Pcjl Sistemi) tasiyan Ifade Vektörünün ve Enzim Ifadesinin Olusturulmasi PCR, bir sablon olarak islev gören pETZSa-Msm-T vektörü ile SEQ ID NO: 21 ve 227nin primerleri kullanilarak gerçeklestirilir. Böylelikle elde edilen PCR ürünü, EcoRV ve HindIH ile isleme tabi tutulmustur ve pCL-P(CJ 1)-Msm-T (pCJ 1- MsmT CysM, SEKIL 7) olarak adlandirilan bir rekombinant vektör olusturmak üzere klonlanir. pET sistemi ile pCL-Pcjl sistemi arasindaki Msm-tc ifade seviyesindeki bir farkliligi incelemek üzere enzimlerin ifade edilmesine yönelik suslar hazirlanmistir. pCL-Pcjl sistemi, K12G susunu kullanirken pET sistemi, Rosetta (DE3)ie uygulanmistir. LB plakalarindan tekli koloniler, 5 mLilik LB besiyerinde asilanmistir ve 200 rpm”de çalkalanirken 16 saat boyunca 37°C”de 01537-P-0027 kültürlenmistir. Bu kültürler, 1 mM IPTG ifade edilecek enzimleri indükleinek üzere enzime eklendikten hemen sonra kanainisin veya spektinomisin ve %02 glikoz ( içeren 25 mL”lik taze LB besiyerine transfer çalkalanirken 37°C°de inkübasyon esnasinda enzimin ifade seviyeleri, çesitli kültür sürelerinde (8, 16, 24 saat) ölçülmüstür. Iki sistemin enzim ifade seviyeleri, SEKIL 3°te görüldügü üzere ayni kosulda pCL-Pcjl sistemi, pET sisteminin sagladigindan daha yüksek bir enzim ifade seviyesi saglar. Ek olarak, 37°C kadar yüksek bir sicaklik ve 0.1 mM kadar düsük bir IPTG konsantrasyon sisteme enzimi ifade etmek üzere olanak tanidiginda kültür kosullunda bir gelisme mevcuttur. Bu nedenle pCL-Pcjl sistemi, pET5e yönelik sübstitüsyonda yeterli düzeyde fonksiyon gösterebilir. ÖRNEK 13: Substrat olarak Saflastirilmis OPS Fermantasyon Besiyerinin Kullanimi ile OPSS Sentezi Saflastirilmis OPS*den Msm-T ve Ape-OPSSanin sisteinine dönüsüm oranlari belirlenmistir. Her bir enzimin 75 ug/mL”sinin ve 0.2 mM PLP°nin varliginda dakika boyunca 37°C veya 70°C”de 120 mM NazS ile reakte edilmistir.

Reaksiyon, Msm-T`ye yönelik olarak sadece 37°C3de ancak Ape-OPSSiye yönelik olarak 37°C ve 70°C°de gerçeklestirilmistir. Üretilen sistein miktarlari, Gaitonde yöntemi kullanilarak ölçülmüstür. Sonuçlar SEKIL 4”te gösterilir.

SEKIL 47te görüldügü üzere, saflastirilmis bir OPS fermantasyon besiyeri, bir substrat olarak sisteine enzimatik dönüsümde iyi islev görmüstür. Özellikle Ape- OPSSSnin sistein dönüsüm orani, saflastirilmis fermantasyon besiyerinin kullanimi üzerine 70°C”de attirilmistir. 01537-P-0027 ÖRNEK 14: Substrat olarak OPS Fermantasyon Besiyerinin Kullanilmasi ile OPSS Sistein Sentezi Bir substrat olarak bir OPS fermantasyon besiyeri kullanildiginda Msm-T ve Ape- OPSS°nin sistein dönüsüm orani, enzim konsantrasyonlarina uygun olarak ölçülmüstür. Her bir Msm-T ve Ape-OPSS”nin 5 ug/mL veya 50 ug/mL°si ve 0.2 mM PLP, OPS fermantasyonunun 50 mM°si, 37°Cide 100 mM NagS ile reakte edilmistir. Üretilen sistein miktari Gaitonde yöntemi kullanilarak ölçülmüstür.

Sonuçlar, SEKIL 5 `te gösterilir.

SEKIL 5”te gösterildigi üzere en yüksek dönüsüm orani, 50 ug/mL Msm-Tite saptanmistir. Ayrica substrat olarak OPS fermantasyon et suyunun kullanilmasi üzerine Msm-T aktivitesi, Ape-OPSS°ninkinde yüksek olmustur. ÖRNEK 15: OPSS Konsantrasyonuna Uygun Olarak Sistein Dönüsüm Orani 9.76 g/L`lik bir konsantrasyonda OPS içeren bir OPS besiyeri elde etmek üzere, 37°C°de 5 dakika boyunca inkübasyonu takiben iki kat OPSinin mol numarasi kadar büyük bir miktarda Nazs eklenmistir. Bu nedenle saflastirilmis Msm-T- HA2, 5 ug, 10 ug, 20 ug ve 50 ugilik bir miktarda kullanilirken saflastirilmis Msm-T, 50 mg”lik bir miktarda eklenmistir. 37°C3de inkübasyon esnasinda daha önceden belirlenen zamanlarda enzim reaksiyon karisiminin 100 mL”si alinmistir ve enzimatik reaksiyonu sonlandirmak üzere %332 TCA°nin 100 mL*si ile karistirilmistir. Enzim reaksiyonlarinin sistein konsantrasyonlari, Gaitonde yöntemine uygun olarak OD560°da absorbans ölçülerek niceliksel analiz edilmistir.

Enzim konsantrasyonlarina uygun olarak OPSS enzimlerinin sistein sentez aktiviteleri, asagidaki Tablo 127de gösterilir. 01537-P-0027 Sistein Dönüsüm Orani (%) Tablo 12`de görüldügü üzere sistein sentez aktivitesinin Msm-T-HA2 mutanti gelistirildiginde ve Msm-T°ninkinin %4031na karsilik gelen bir miktarda kullanildiginda nihai sistein konsantrasyon orani (%) benzerdir. Ayrica ayni miktarda kullanildiginda Msm-T-HAZ mutanti, Msm-T ile karsilastirildiginda daha hizli ilk reaksiyon göstermistir. ÖRNEK 16: OPS Konsantrasyonlari araciligiyla Sistein Dönüsüm Orani OPS konsantrasyonlarinin Msm-T ve Msm-T-HATnin dönüsüm orani üzerindeki etkisini incelemek üzere saflastirilmis OPS”nin daha önceden belirlenen miktarlari, dönüsüm reaksiyonunun indüklemek üzere OPS fermantasyon besiyerine eklenmistir. Enzim, Msm-T°ye yönelik 50 ug°lik ve Msm-T-HA2”ye yönelik 20 ug”lik bir miktarda kullanilmistir. Reaksiyon solüsyonundaki sistein miktarlari, Gaitonde yöntemi kullanilarak ölçülmüstür. Sonuçlar, Tablo 13 ilâ 153te gösterilir. 01537-P-0027 Sistein Dönüsüm Orani (OPS, 10.65 g/l ölçülmüstür) Sistein Dönüsüm Orani (OPS, 36.09 g/l ölçülmüstür) Sistein Dönüsüm Orani (OPS, 55.6 g/l ölçülmüstür) 61.95 63.77 97.84 77.65 42.69 50.16 55.35 53.74 100.34 80.01 66.67 62.46 OPS konsantrasyonu, Tablo 13 ilâ 15>te görüldügü üzere yaklasik 30 g/L oldugunda en yüksek dönüsüm oranlari. Msm-T°ye yönelik olarak %100 olarak ve Msm-T-HA2”ye yönelik olarak %80 olarak saptanmistir. OPS konsantrasyonu. 01537-P-0027 50 g/L”yi astiginda dönüsüm oraninin ve dönüsüm yüzdesinin azaldigi bulunmustur.

Tablo 13 ilâ lSsteki veri, OPS'nin yüksek bir konsantrasyonu kullanilarak bir dönüsüm prosesine yönelik OPS ile Msm-T-HA2 arasinda optimal bir konsantrasyon seçmek üzere ve Msm-T`ninki ile karsilastirildiginda Msm-T- HA2lnin reaksiyon süresini azaltmak üzere kullanilmistir. ÖRNEK 17: NazS Konsantrasyonlari araciligiyla Sistein Dönüsüm Orani Bir sülfür kaynagi olarak kullanilan NazS miktarinin sistein dönüsüm orani üzerine etkisini incelemek üzere, sirasiyla OPSlnin mol numarasina esdeger ve iki kat ve üç kat bu numara kadar büyük miktarlara karsilik gelen 160 mM, 320 mM ve 480 mMllik bir konsantrasyonda NazS kullanildiginda 20 ug°lik Msm-T-HAZ varliginda OPS dönüsüm reaksiyonlari gerçeklestirilmistir. Ortaya çikan sistein dönüsüm orani, asagidaki Tablo 16°da gösterilir.

Sistein Dönüsüm Orani (OPS 29.76 g/l) l60mM NazS 0 0 0 0 0 0 Tablo 16”da görüldügü üzere sistein dönüsüm orani pik yaptiginda Na28°nin mol numarasi, kullanilan OPS”ninkinin iki kati kadar büyüktür. Sonuçlardan Na2S7nin OPS”ye karsi molar oraninin 2 oldugunda optimal bir kosulun bulundugu anlasilir. 01537-P-0027 ÖRNEK 18: Ph araciligiyla Sistein Dönüsüm Orani pHHn OPS5nin sisteine dönüsüm orani üzerine olan etkisini incelemek üzere çesitli pl-I degerlerinde 20 ug°lik Msm-T-HAZ varliginda bir dönüsüm reaksiyonu gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, asagidaki Tablo 17”de gösterilir.

Sistein Dönüsüm Orani (%) Gösterildigi üzere dönüsüm reaksiyonuna yönelik optimal bir pH degeri, 8.5 ile 9.5 arasinda oldugu ölçülmüstür. ÖRNEK 19: 1 L Kavanoz Ölçeginde Dönüsüm Prosesi OPS besiyerinin sisteine dönüsümüne yönelik reaksiyon karisimi, bir 1 Lilik kavanoza yükseltilmistir. 1 mL*lik tüp kosulu altinda belirlenen dönüsüm reaksiyon verisine ve OPS karakteristiklerine dayanarak Msm-T-HA2aye yönelik bir dönüsüm reaksiyon prosesi olusturulmustur.

Bir 1 L kavanoz ölçeginde bir dönüsüm oranindan önde olmak üzere bir 1 L kavanozda elde edilen OPS fermantasyon besiyeri, santrifüjlenmistir (10,000 rpm, dakika. 4°C) ve üst faz, hücreleri uzaklastirmak üzere bir membran (0.45 um) arasindan geçirilmistir. 72 g°lik NazS. Whatman filtre kagidi (6 um) yoluyla çökeltinin filtrelenmesini takiben filtrelenmis OPS besiyerine (19.317 g/L) 01537-P-0027 eklenmistir. 10 mM PLP eklenmesinden sonra reaksiyon karisimi, 200 rpmsde çalkalanirken 37°C”de 5 dakika boyunca önceden inkübe edilmistir. son olarak bir dönüsüm reaksiyonu, bir 1 L kavanoz ölçeginde 50 mgslik Msm-T-HA2 ve 180 dakikada 100 nL°lik enzim reaksiyonlari alinmistir ve enzimatik reaksiyonu sonlandirmak üzere %332 TCA°nin 100 uLisi ile karistirilmistir.

Numuneler, 0.1 N HC] içinde seyreltilmistir ve LC kullanilarak sistein ve sistein içeriklerine yönelik olarak analiz edilmistir. Ayrica sistein miktarini belirlemek üzere Gaitonde yöntemi kullanilmistir. Dönüsüm reaksiyon prosesinde kullanilan enzim ve substratlarin konsantrasyonlari, asagidaki Tablo 187de gösterilir.

Kullanilan substratlarin miktari, bir birim mL ile temsil edilir.

OPS Fermantasyon NaZS eklenmesinden sonra pH 9.01, filtrelemeden Besiyeri sonra pH 9.16 Nihai hacim Nihai OPS konsantrasyon 101.47 mM Msm-T-HAZ (2.59 50 ug 19 Na2S (72 g) 300 mM 0 mM PLP 0.1mM 10 Toplam 1029 Tablo 18”in kosulu altinda gerçeklestirilen dönüsüm reaksiyonundan sonra elde edilen reaksiyon karisimindaki sistein konsantrasyonlari, Gaitonde yöntemi ve LC 01537-P-0027 araciligiyla nicelik bakimindan analiz edilmistir ve sonuçlar, SEKIL 63da gösterilir. 19.317 g/L OPS besiyeri, SEKIL 6°da gösterildigi üzere 50 mg°lik Msm-T-HA2 varliginda 2 saat boyunca inkübe edildiginde üretilen sistein veya sistin miktari, 1 L kavanoz ölçeginde bir enzimatik dönüsüm prosesi araciligiyla g/L”ye kadar pik yapmistir.

Sistein/sistin Dönüsüm Orani (%) besiyeri Sistein/sistin (g/L) besiyeri Buraya kadar açiklandigi üzere mevcut bulusun OPS mutantlari, L-sisteinin toplu üretimine yönelik olarak faydalidir, bu ve bunun deriveleri, farmasötik endüstri (brons hastaliklarinin tedavisine yönelik), kozmetik endüstrisi (saç sampuanlarinda, sürekli dalgalara yönelik bilesimler vb.) ve gida endüstrisinde (antioksidanlar. aroma arttiricilar, hamur yardimci maddeleri vb.) dahil olmak üzere çesitli endüstrilerde uygulamalar bulur. 01537-P-0027 <110> CJ CheilJedang Corporation <120> O O-FOSFOSERIN SÜLFIDRILAZ MUTANTLARI VE BUNLARIN KULLANILDIGI SISTEIN ÜRETIMINE YÖNELIK YÖNTEM <130> T3049 EP/l S3 <160> 26 <170> Kopatentln 1.71 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 1555ten Msm-OPSS <400> 1 01537-P-0027 --42 :' _ '. 7.0* I . '- '-î'i' 1. 1' ' -lt 01537-P-0027 <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155°ten Msm-T <400> 2 1 'l- Wi_ 1 ` 1 i I I '-'i'r bîr' ;--'. '-'rî ".- Mat ;':ri ;Alli .'i-::i !ti '_--':L ;-.: 'Z- '. .'.::7 f::. 01537-P-0027 i .'II'ArE I i <210> 3 <211> 318 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics CC1°den Msm-T-HA2 <400> 3 7-.. 1 . 'i 01 537-P-0027 i". 7-! 2-' Xlif in -1: .'.1- ,'*.i7 .ii'i S'w ,R-::i ,kir _r..~ i':. 4( i' 7' r:uv- ' ` ,. 'r' 3 1. 3.- '5. . 'w », g.] .' '.'_\'I 5.. î v4..? - ' 'I '_-' i _I" . 51_ . i... :. v-J 34.". I.i“: I`.-, f. `-'.'.. 2-7! 7:" "l i :affi S T A r `. _ Iq.. .'. I::: 1..' . _i' -ii' . "I I ' i'r.. ...U ' ' r .KI î. ."L'Ti I , F: I . i` TK'." 31`.' .- .'T- ."il .'. 0:. 1 .1, x I, ` -:5 _~.- c ?IT I.: f'i" `. . 'L 7.. i`m? "'2; II“ 77-' Tiz' .7291 l".`i~' 01537-P-0027 <210> 4 <2ll> 318 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics CC2°den Msm-T-EP3 <400> 4 01537-P-0027 . 5 '3 .Q 9.. I ' - I .-" 4 ` - "1.7 . ,. <210> 5 <211> 318 <212> PRT <213> Yapay Dizi .1.'. 2...' .~ 7.1' 7 C.' 4.”- '-Lîi 01537-P-0027 <220> <223> Mycobacterium tuberculosis H37Rv”den Mtb-T <400> 5 01537-P-0027 .' 4_ u .(5 - _: _.- <210>6 <211> 389 01537-P-0027 <212> PRT <213> Yapay Dizi <220> < Ape-OPSS <400> 6 01 537-P-0027 4. 17 . ..r .4. -- 1-' i"î r Tli' .'Li' "'.A 'A 57 . IL ' 5 "K .' I.' .`.A t 16 . "i ' "I < ".

T.,'.. FLfi "'.A .`. I 'i . . .i'r '.'“.A '.i › '31. t'Ii'. I 7-1“. 01537-P-0027 V F::. l L "Jr ' li, H * 1 !4 s " °°°°° i 1 n “li" I'm.' T.. ..i i' l ii <210>7 <2ll>29 <212>DNA <2 1 3> Yapay Dizi <220> < Ape-OPSSaye yönelik ileri primer <400> 7 <210> 8 <21 1> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> < Ape-OPSS,ye yönelik geri primer <400> 8 01537-P-0027 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mtb-OPSS Mycobacterium tuberculosis H37Rvaye yönelik ileri primer <400> 9 <210> 10 <21 l> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium tuberculosis H37Rv°den Mtb-OPSS”ye yönelik geri <400> 10 <210> ll <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155aten Msm-OPSS°ye yönelik ileri primer 01537-P-0027 <400> 11 <210> 12 <21 l> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155`ten Msm-OPSSSye yönelik geri primer <400> 12 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Sentetik DNA”dan Rj o-OPSS,ye yönelik ileri primer <400> 13 <210> 14 <21 l> 31 <212> DNA <213> Yapay Dizi 01537-P-0027 <220> <223> Sentetik DNA”dan Rjo-OPSS geri primer <400> 14 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Sentetik DNAadan Nfa-OPSS,ye yönelik ileri primer <400> 15 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Sentetik DNASdan Nfa-OPSS,ye yönelik geri primer <400> 16 <210> 17 <211> 29 01537-P-0027 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium tuberculosis H37Rv”den Mtb-T'ye yönelik ileri primer <400> 17 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium tuberculosis H37Rv,den Mtb-T”ye yönelik geri primer <400> 18 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MCZ 155°ten Msm-T, Msm-HAZ, Msm- EP33e yönelik ileri primer <400> 19 01537-P-0027 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155°ten Msm-T, Msm-HAZ, Msm- EP3`e yönelik geri primer <400> 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 1553ten pCL-P(CJ1)-Msm-T”nin ileri primeri <400> 21 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Yapay Dizi 01537-P-0027 <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155°ten pCL-P(CJ1)-Msm-T°nin geri primeri <400> 22 <210> 23 <211> 972 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MC2 155sten Msm-OPSS <400> 23 1 1 ~ 1 011 1' 1 01 537-P-0027 <210> 24 <211> 954 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics susu MCZ 1555ten Msm-T <400> 24 01 537-P-0027 4 10 i i 1 K 3 I ' ' 1-. J :" . f' ' ` "" M?" " " › .'...I".' ' ,CL 1'. ° 'Jllt :::CHJYI <210> 25 <211> 954 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics CC] ,den Msm-T-HAZ <400> 25 01 537-P-0027 <210> 26 <21 1> 954 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Mycobacterium smegmatics CC2°den Msm-T-EP3

Claims (1)

1. ISTEMLER . Bir Mycobacterium smegmatis-deriveli O-fosfoserin sülfîdrilaz (OPSS) mutantidir, SEQ ID NO:1'e ait bir dogal sus OPSS amino asit dizisinin en az üç ila yedi C-terminal amino asit kalintisinin silinmesi hariç, SEQ ID NO: 1”inki ile ayni amino asit dizilerinden olusur. . Istem l°e göre Mycobacterium smegmatis-deriveli OPSS mutantidir, SEQ terminal amino asit kalintisini içermez. . Istem 2`ye göre Mycobacterium smegmati's-deriveli OPSS mutantidir, SEQ . Istemler 1 ila 3°ten birine göre Mycobacterium smegmati's-deriveli OPSS mutantidir, asagidakileri içeren kosullar altinda optimal aktivite gösterir: i) bir kofaktör olarak yaklasik 0.001 ila yaklasik 2 mM PLP”nin (piridoksal-S'-fosfat) veya yaklasik 0.001 ila yaklasik 100 mM DTT”nin (ditiyotretol) eklenmesi; ii) 25 ~ 60°C`lik bir reaksiyon sicaklik araligi; ve iii) 6.0 ~ 10.0”lik bir pH araligi. . Istemler 1 ilâ 3”ten birine göre OPSS mutantini kodlayan bir nükleik asit molekülüdür. . Istemler l ilâ 3”ten birine göre OPSS mutantini kodlayan bir nükleik asit molekülünü tasiyan bir ifade vektörüdür. . Istem 6°ya göre ifade vektörü ile transforme edilen bir transformanttir. Sistein üretilmesine yönelik bir yöntemdir, Istemler 1 ilâ 3'ten birine göre OPSS mutantinin varliginda O-fosfo-L-serinin (OPS) sülfitler ile reakte edilmesini içerir. lstem 8`e göre sistein üretilmesine yönelik yöntemdir, burada OPS, saflastirilmis bir formda veya OPS içeren bir fermantasyon kültürü formundadir. Istem 8`e göre sistein üretilmesine yönelik yöntemdir, hepsi bir gaz veya sivi durumunda olmak üzere Nazs, NaSH, (NH4)2SH, HzS ve 8203”ten olusan bir gruptan seçilen bir sülfit içerir. Istem 8”e göre sistein üretilmesine yönelik yöntemdir, burada sülfit OPS”nin bir mol konsantrasyonuna göre 0.1 ~3 katlik bir miktarda kullanilir. OPS`den sistein biyosentezinde Istemler 1 ilâ 3°ten birine göre OPSS mutantinin kullanimidir.