ES2533561T3

ES2533561T3 - Mutantes de O-fosfoserina sulfhidrilasa y procedimiento de producción de cisteína usando los mismos

Info

Publication number: ES2533561T3
Application number: ES11185853.6T
Authority: ES
Inventors: Soo An Shin; Jin Sook Chang; Hye Won Um; Jae Hyun Jo; Byeong Cheol Song; Kyoung Min Lee
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2010-10-20
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2015-04-13
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: EP2796549A1; MX343755B; AU2011318793A1; WO2012053777A3; LT2796549T; CN102741400A; PL2796549T3; JP2014503184A; US9127324B2; CN102741400B; RU2541782C2; RU2013122808A; WO2012053777A2; JP5789670B2; CN104762273A; DK2796549T3; DK2444486T3; TR201807729T4; BR112013009633A2; KR101208267B1

Abstract

Un mutante de la O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) de Mycobacterium smegmatis, que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3.

Description

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en la Tabla 9, a continuación.

[Tabla 9]

Tiempo: (-) 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min

Tasa de conversión de cisteína (%): 100 88 73 47 11 3

Como puede observarse en la Tabla 9, la actividad de Msm-T se redujo por debajo del 50 % 2 horas después de la reacción a 37 ºC en caldo de OPS.

Ejemplo 9: sensibilidad al pH de OPSS

Se midieron las tasas de conversión de cisteína de Ape-OPSS y Msm-T de acuerdo con el pH. En 100 mM de tampón, Ape-OPSS y Msm-T, que tenían cada una concentración de aproximadamente de 50 µg/ml, se sometieron a una reacción a 37 ºC durante 10 min. En este aspecto, se usaron un tampón K-fosfato con un pH de 6,4 / 7,0 / 7,4 / 8,0, un tampón Tris-HCl con un pH de 7,0 / 7,4 / 8,0 / 8,5 / 8,8 y un tampón Na-carbonato con un pH de 8,0 / 8,5 / 9,0 / 10,0. El análisis cuantitativo de la cisteína producida se realizó usando el procedimiento de Gaitonde. Los resultados se resumen en la FIG. 2.

Como se observa en la FIG. 2, Msm-T mostró la actividad más elevada a un pH de desde 8,0 hasta 9,0 independientemente del tampón. Así como para Ape-OPSS, su actividad más elevada se detectó en K-fosfato (pH 7,4), con un pH óptimo que difería de un tampón a otro.

Ejemplo 10: Efecto de los iones sobre la actividad de OPSS

Los efectos de los iones sobre la actividad de las enzimas OPSS se examinaron de la siguiente manera. En una mezcla de reacción que contenía OPS 5 mM, Na2S 10 mM, PLP 0,2 mM, y HEPES 100 mM (pH 7,4), las enzimas se sometieron a una reacción a 37 ºC durante 30 min en presencia de (NH4)2SO4 [1, 3, 5, 10, 20 g/l], KH2P04 [0,5, 1, 2, 4, 8 g/l], o NH4Ci [0,2, 0,5, 1,2 g/l]. Ape-OPSS y Msm-T se usaron a una concentración de 10 µg/ml y 50 µg/ml, respectivamente. Las cantidades de la cisteína producida se determinaron usando el procedimiento de Gaitonde y se resumen en la Tabla 10, a continuación.

[Tabla 10]

Actividad relativa (%)

NH4CI: Ape-OPSS Msm-T

0: 100,00 100,00

0,2: 86,26 91,49

0,5: 73,35 91,30

1: 49,11 67,11

2: 27,72 47,12

No se detectaron cambios en la tasa de conversión de cisteína cuando se añadió (NH4)2SO4 o KH2PO4 a la mezcla de reacción. Por otra parte, como puede observarse en la Tabla 10, la tasa de conversión de cisteína disminuyó con un aumento de la concentración de NH4CI. En particular, la actividad enzimática máxima disminuyó más del 70 % cuando se añadieron 2 g/l de NH4. Por lo tanto, se observó que NH4CI y NH4 tenían un efecto negativo en la actividad de conversión de OPSS.

Ejemplo 11: Efecto de la fuente de azufre sobre la actividad de síntesis de OPSS

Se realizó un experimento para examinar el efecto de las fuentes de azufre en la actividad de síntesis de cisteína de cada enzima. En una mezcla de reacción que contenía OPS 5 mM, PLP 0,2 mM, y HEPES 100 mM, cada enzima (50 µg/ml de Ape-OPSS, 50 µg/ml de Msm-T) se sometió a una reacción a 37 ºC durante 1 hora en presencia de Na2S, NaSH, o Na2S2O3 10 mM. Las cantidades de la cisteína producidas se midieron usando el procedimiento de Gaitonde. Se observó que Ape-OPSS prefería Na2S2O3 como una fuente de azufre, mientras que Msm-T prefiere Na2S. Los resultados se resumen en la Tabla 11, a continuación.

[Tabla 11]

Actividad relativa (%)

Enzima: Na2S NaSH Na2S203

Ape-OPSS: 100,0 95,2 142,3

Msm-T: 106,7 98,3 66,2

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Ejemplo 18: Tasa de conversión de cisteína mediante el pH

Para examinar el efecto del pH en la conversión enzimática de OPS en cisteína, se realizó una reacción de conversión en presencia de 20 µg de Msm-T-HA2 a diversos valores de pH. Los resultados se resumen en la Tabla 17, a continuación.

[Tabla 17]

Tasa de conversión de cisteína (%)

Tiempo: 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min

pH 8,5 (OPS 35,02 g/l): 0,24 4,74 20,74 40,19 69,13

pH 9 (OPS 34,59 g/l): 0,19 6,00 24,03 43,86 63,88

pH 9,5 (OPS 35,34 g/l): 0,26 9,85 28,48 44,82 64,68

pH 10 (OPS 34,59 g/l): 0,25 10,97 28,54 40,19 58,14

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Como puede observarse, un pH óptimo para la reacción de conversión se midió que era entre 8,5 y 9,5.

Ejemplo 19: Proceso de conversión a una escala de un frasco de 1 l

El proceso de reacción para convertir caldo de OPS en cisteína se amplió hasta un frasco de 1 l. Basándose en las características de OPSS y en los datos de la reacción de conversión establecidos en las condiciones del tubo de 1

10 ml, se estableció un proceso de reacción de conversión para Msm-T-HA2.

Previo a una reacción de conversión a una escala de un frasco de 1 l, el caldo de fermentación de OPS obtenido en un frasco de 1 l se centrifugó (10.000 rpm, 10 min, 4 ºC) y el sobrenadante se pasó a través de una membrana (0,45 µm) para eliminar las células. Se añadieron 72 g de Na2S al caldo de OPS filtrado (19,317 g/l), seguido de la filtración del precipitado a través de un papel de filtro Whatman (6 µm). Después de la adición de PLP 10 mM, la 15 mezcla de reacción se preincubó a 37 ºC durante 5 min, mientras que se agitaba a 200 rpm. Finalmente, se realizó una reacción de conversión en presencia de 50 mg de Msm-T-HA2 a una escala de un frasco de 1 l. A los 0, 10, 30, 60, 120, y 180 min durante la incubación a 37 °C, se tomaron 100 µL de las reacciones enzimáticas y se mezclaron con 100 µl de TCA al 33,2 % para detener la reacción enzimática. Las muestras tomadas se diluyeron en HCl 0,1 N y se analizó el contenido en cisteína y cistina usando CL. También se usó el procedimiento de Gaitonde para

20 determinar la cantidad de cisteína. Las concentraciones de los sustratos y la enzima que se usan en el procedimiento de la reacción de conversión se resumen en la Tabla 18, a continuación. La cantidad de los sustratos usada se representa mediante una unidad de ml.

[Tabla 18]

Caldo de fermentación de OPS: pH 9,01 después de la adición de Na2S, pH 9,16 después de la filtración

Final: volumen

Concentración final de OPS: 101,47 mM.

Msm-T-HA2 (2,59 µg/µl): 50 µg 19

Na2S (72 g): 300 mM. 0

PLP 10 mM: 0,1 mM. 10

caldo de OPS (19,317 g/l): 104,42 mM. 1000

A.D.: 0

Total: 1029

Las concentraciones de cisteína en la mezcla de reacción obtenida después de la reacción de conversión realizada

25 en las condiciones de la Tabla 18 se analizaron cuantitativamente por el procedimiento de Gaitonde y CL, y los resultados se muestran en la FIG. 6. Cuando se incubaron 19,317 g/l de caldo de OPS durante dos horas en presencia de 50 mg de Msm-T-HA2, como se observa en la FIG. 6, la cantidad de cisteína o cistina producida alcanzó un máximo a los 9,075 g/l, indicando que la cisteína y la cistina pueden producirse a partir de OPS a una tasa del 71,83 % por un proceso de conversión enzimática a una escala de un frasco de 1 l.

[Tabla 19]

Tasa de conversión de cisteína (%)

Tiempo: 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

caldo de OPS: 10,81 28,08 51,26 67,21 71,83 69,45

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Claims

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