ES2671642T3 - Mutantes de O-fosfoserina sulfhidrilasas y procedimiento de producción de cisteína utilizando los mismos - Google Patents

Abstract

Un mutante de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) derivado de Mycobacterium smegmatis, que consiste en la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, excepto por la eliminación de los últimos tres a siete restos de aminoácido del extremo C de la secuencia de aminoácidos de una OPSS de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION

Mutantes de O-fosfoserina sulfhidrilasas y procedimiento de producción de cisteína utilizando los mismos Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un mutante de O-fosfoserina sulfhidrilasa (al que se hace referencia también como “OPSS”) que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de Mycobacterium smegmatis que se corresponde con la de SEQ ID NO: 1 excepto por la eliminación de los últimos tres a siete restos de aminoácido del extremo C. La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS, un vector de expresión que lleva la molécula de ácido nucleico, y un transformante transformado con el vector de expresión. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de cisteína haciendo reaccionar la O-fosfo-L-serina (OPS) con un sulfuro en presencia del mutante de OPSS.

Técnica antecedente

La L-cisteína es un aminoácido que tiene un papel importante en el metabolismo del azufre en todos los organismos vivos. Se utiliza en la biosíntesis de proteínas, tal como la queratina capilar, glutatión, biotina, metionina, y otros metabolitos que contienen azufre, así también sirve como precursor de la coenzima A. Además, se sabe que la biosíntesis de cisteína está asociada estrechamente con la biosíntesis de otros aminoácidos que incluyen L-serina, L-glicina, y L-metionina. Industrialmente, la L-cisteína y sus derivados tienen aplicaciones en una variedad de campos incluyendo la industria farmacéutica (para el tratamiento de enfermedades bronquiales), la industria cosmética (en champú capilar, composiciones para ondas permanentes, etc.), y la industria alimentaria (antioxidantes, potenciadores del sabor, aditivos de masa, etc.).

Tradicionalmente, la L-cisteína se obtenía industrialmente por hidrólisis ácida del pelo humano o las plumas de animales (Biotechnology of the Amino Acids Production editado por Ko Aida, p 217-223, 1986). Sin embargo, la producción de cisteína a partir del pelo o las plumas no solo asegura un rendimiento bajo del 7-8 %, sino que también el uso del ácido clorhídrico o ácido sulfúrico produce una cantidad significativa de desechos contaminantes para el medio ambiente. Además, los consumidores pueden tener una fuerte aversión a la extracción a partir de pelo o plumas. Estos problemas han causado un empuje en el desarrollo de procedimientos de producción de L-cisteína que respeten el medio ambiente, dando lugar a la fermentación de L-cisteína utilizando microorganismos.

Ente la producción microbiana de L-cisteína representativa es la conversión biológica de D, L-ATC utilizando un microorganismo (Ryu OH, Ju JY, y Shin CS, Process Biochem., 32:201-209, 1997). Este procedimiento de conversión, sin embargo, es difícil de aplicar de manera industrial debido a la baja solubilidad del precursor D, L- ATC. Otro procedimiento de producción de L-cisteína es la fermentación directa utilizando E. coli (Patente N.° EP 0885962B; Wada M y Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). La acumulación excesiva de L-cisteína en el microorganismo da lugar a toxicidad intracelular, lo que da como resultado la producción de L-cisteína a altas concentraciones. Para superar este obstáculo, se emplearon proteínas que exportan L-cisteína, sin embargo no ha habido una mejoría significativa de la productividad.

En referencia a la ruta de biosíntesis de la L-cisteína en bacterias y plantas, la O-acetil-serina (OAS) actúa como un precursor intermedio proporcionando el armazón carbónico de la L-cisteína (Kredich NM y Tomkins GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). La enzima O-acetilserina sulfhidrilasa (OASS), que utiliza sulfuro de hidrógeno como donante de azufre, cataliza la conversión de O-acetilserina en S-sulfocisteína y finalmente en cisteína, liberando acetato. De manera alternativa, el SO4 se puede reducir a tiosulfato para su uso como donante de azufre en la producción de cisteína (akamura T, Kon Y, Iwahashi H, y Eguchi Y, J. Bacteriol., 156: 656-662, 1983). La ruta de biosíntesis de cisteína mediante el uso de OAS utiliza las dos enzimas de serina acetiltransferasa (CysE), que cataliza la conversión de serina en OAS, y la cisteína sintasa (CysK), que cataliza la conversión de OAS en cisteína. De manera notable entre ellas la serina acetiltransferasa (CysE) es altamente sensible a la inhibición por retroalimentación por el producto cisteína final (Wada M y Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Por lo tanto, es necesaria una enzima que no sea sensible a la inhibición por retroalimentación , sin embargo, es difícil de desarrollar.

Divulgación

rProblema técnico]

Lo que da lugar a la presente invención, la investigación intensa y exhaustiva en la producción de l-cisteína con altor rendimiento que llevaron a cabo los presentes inventores que tenía como objetivo superar los problemas encontrados en la técnica anterior, dio como resultado el hallazgo de que existe una O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) en Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, y Trichomonas vaginalis que toman una ruta específica de O-fosfo-L-serina (OPS), mejor que la ruta específica de OAS, para sintetizar L-cisteína (Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW, y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC, y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006) y que la OPSS de M. tuberculosis, que cataliza la conversión de OPS en cisteina con las enzimas adicionales mec+ y cysO, pueden utilizar el Na2S como donante de azufre en la conversión de OPS en

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cisteína incluso en ausencia de enzimas adicionales cuando se han retirado cinco aminoácidos del extremo C de las mismas (Agren D, Schnell R y Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336 2009).

La secuencia de la cisteína sintasa (Cys11) de Mycobacterium smegmatis de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 se conocía por la base de datos UniProt (n° de acceso A0R1X2).

rSolución técnica]

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un mutante de la o-fosfoserina sulfhidrilasa (a la que también se hace referencia como “OPSS”) que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de Mycobacterium smegmatis que se corresponde con la de SEQ ID NO: 1 excepto por la eliminación de los últimos tres a siete restos de aminoácido del extremo C.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un vector de expresión que lleva la molécula de ácido nucleico.

Un objetivo adicional más de la presente invención es proporcionar un transformante transformado con el vector de expresión.

Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar un procedimiento de conversión de O-fosfo-L-serina en cisteína con un sulfuro en presencia del mutante de OPSS.

rEfectos ventajosos]

Como se ha descrito anteriormente, el mutante de OPSS con la actividad enzimática mejorada que es esencial para la conversión enzimática de O-fosfoserina en L-cisteína se puede utilizar para producir L-cisteína a partir de oPs a gran escala con un alto rendimiento de una manera simple.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un gráfico que muestra la actividad de OPSS según la temperatura.

La FIG. 2 es un conjunto de gráficos que muestra la sensibilidad de la OPSS al pH.

La FIG. 3 es una fotografía que muestra el nivel de expresión de la enzima en un sistema pET y un sistema pCL- Pcj1 que se analiza mediante SDS-PAGE.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra la actividad enzimática de OPSS para convertir un caldo de fermentación con OPS purificado en cisteína.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra la actividad enzimática de la OPSS para convertir un caldo de fermentación con OPS en cisteína.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra la producción de OPS y cisteína que se convierte mediante la OPSS utilizando OPS como sustrato a escala de una jarra de 1 l.

La FIG. 7 es una vista esquemática que muestra el mapa de un vector de expresión pCL-Pcj1 que lleva un gen que codifica un mutante de OPSS.

Mejor modo

De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente invención proporciona un mutante de OPSS derivado de Mycobacterium smegmatis con la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, con la excepción de que carece de 3 a 7 restos de aminoácidos del extremo C de la secuencia de aminoácidos de la O-fosfoserina sulfhidrilasa de tipo silvestre.

En una realización de la presente divulgación, el mutante de OPSS de la presente invención puede tener una de las tres secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El mutante de OPSS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 puede modificarse adicionalmente para que tenga una sustitución del resto de prolina (Pro) de la posición 77 por un resto de serina (Ser). Además, el mutante de OPSS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 puede modificarse adicionalmente para que tenga una sustitución del resto treonina (Thr) en la posición 131 con un resto de alanina (Ala), el resto de lisina (Lys) en la posición 137 con un resto de asparagina (Asp) y el resto de treonina (Thr) de la posición 238 por un resto de serina (Ser). Además, se desvelan en el presente documento las secuencias de aminoácidos que comparten una homología de al menos un 50 %, preferentemente un 60 %, 70 %, 75 %, y 80 %, más preferentemente del 85 %, 90 % y 95 %, y más preferentemente del 97 % al 99 % con los mutantes mencionados anteriormente.

La expresión “Mycobacterium smegmatis" se refiere a una cepa con forma de bacilo del filum Actinobacteria que es fino, recto o ligeramente curvado, tiene ramas irregulares, y se pueden teñir con el colorante básico anilina. En la presente invención, se descubrió que cuando esta secuencia de aminoácidos se modificaba, la O-fosfoserina sulfhidrilasa derivad de la cepa podía catalizar la biosíntesis de L-cisteína con un aumento de rendimiento.

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Como se utiliza en el presente documento “O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS)” se refiere a una enzima que cataliza la conversión de OPS en cisteína. La enzima se encontró por primera vez en Aeropyrum pernix y se le puso el nombre (Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003, SEQ ID NO: 6).

Se pueden utilizar distintos procedimientos bien conocidos para obtener OPSS. Ejemplos ilustrativos de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, técnicas de síntesis genética basadas en optimización del codón por las que se pueden obtener las enzimas de interés con alto rendimiento, y procedimientos de exploración bioinformática de fuentes de enzimas útiles basados en los almacenamientos masivos de información genética de microorganismos. En una realización de la presente invención, las enzimas OPSS que utilizan la OPS como sustrato para sintetizar cisteína se seleccionaban de entre distintos microbios. A este respecto, los aglomerados obtenidos utilizando un medio y condiciones de cultivo adecuados conocidos en la técnica se lisaron, seguido por purificación del sobrenadante que contiene la enzima para conseguir la enzima OPSS.

Como se utiliza en el presente documento, el término “mutante” se refiere a un cultivo o un individuo que muestra una alteración estable del fenotipo heredable o no heredable. Cuando se utiliza en conjunción con OPSS (O- fosfoserina sulfhidrilasa), el término “mutante” quiere significar una enzima OPSS que está alterada genéticamente de manera que su actividad se puede mejorar eficazmente en comparación con el tipo silvestre.

Basándose en el informe de que el mutante de OPSS derivado del Mycobacterium tuberculosis H37Rv con cinco restos de aminoácidos del extremo C eliminados mostraba un aumento de afinidad por una fuente de azufre que contenía un grupo S2- incluso en ausencia de enzimas adicionales, se preparó un mutante de OPSS eliminando cinco restos de aminoácidos del extremo C de la OPSS de Mycobacterium smegmatis. El mutante de OPSS de acuerdo con la presente invención consiste en la secuencia de aminoácidos derivada de Mycobacterium smegmatis que se corresponde con la SEQ ID NO: 1 en la que se han eliminado de tres a siete, preferentemente cinco, restos de aminoácidos del extremo C.

En una realización de la presente divulgación, se observó que el mutante que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 presentaba una tasa de conversión del 100 % en una hora después de aplicarse a la conversión de OPS en cisteína (Tabla 5).

La sustitución de aminoácidos puede aumentar adicionalmente la actividad enzimática del mutante de OPSS de la presente invención. A condición de que sea bien conocido en la técnica, se puede utilizar cualquier procedimiento para mejorar la enzima. En la presente divulgación, preferentemente, se empleó mutagénesis aleatoria para obtener una mejora de la actividad enzimática del mutante de OPSS. En detalle, después de permitir que la OPSS se sometiera a mutagénesis aleatoria, se seleccionaron los mutantes con actividad enzimática mejorada utilizando el sistema de exploración desarrollado basándose en HTS (exploración de alto rendimiento) por los presentes inventores. Como resultado, se obtuvieron los mutantes de OPSS, Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3, que tenían una actividad enzimática mejorada llevando a cabo la exploración HTS en un gen Msm-T. La Msm-T-HA2 es un mutante de OPSS que tiene la misma secuencia de SEQ ID NO: 2, con la excepción de que el resto prolina (Pro) de la posición 77 se sustituyó con un resto de serina (Ser). La Msm-T-EP3 es un mutante de OPSS que tiene los mismos restos de aminoácidos que la SEQ ID NO: 2, con la excepción de que la mutación de sustitución se produce con un resto de alanina (A) para el resto de treonina (Thr) de la posición 131, con un resto de asparagina (Asp) para el resto lisina (Lys) de la posición 137, y con un resto de serina (Ser) para el resto de treonina (Thr) en la posición 238. También se desvelan en el presente documento los mutantes de OPSS Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3 que tienen secuencias de aminoácidos representados por las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

En una realización de la presente divulgación, se descubrió que tanto Msm-T-HA2 como Msm-T-EP3 presentaban una actividad enzimática mayor que la de Msm-T que tiene los restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (Tablas 5 y 6). En detalle, se midió que los mutantes de OPSS Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3 que presentaban tasas de conversión con un aumento de 5 veces y 1,2 veces en un estadio temprano de la reacción de conversión, en comparación con la Msm-T de control. Además, incluso cuando se utilizaba la Msm-T-HA2 mutante cuya actividad de síntesis de cisteína es 4 veces mayor que la de la enzima Msm-T y en una cantidad que correspondía a un 40 % de la Msm-T, la tasa de conversión en cisteína era similar.

El término “homología”, como se utiliza en el presente documento, quiere referirse al porcentaje de identidad entre dos polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y la otra se pueden determinar por técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar la homología por comparación directa de la información de secuencia entre las dos moléculas polipeptídicas alineando la información de secuencia y utilizando programas de computadora fácilmente disponibles. De manera alternativa, la homología se puede determinar por hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre las regiones homólogas, seguido por la digestión con una nucleasa específica de cadena única, y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

Como se utiliza en el presente documento, el término “homólogo” y todas sus formas gramaticales y variaciones se refiere a la relación entre proteínas que poseen un “origen evolutivo común”, incluyendo las proteínas de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) y las proteínas homólogas de diferentes especies (por ejemplo, la cadena ligera de miosina, etc.). Dichas proteínas (y sus genes codificantes) tienen una homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia. Sin embargo, en el uso común y en la

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presente solicitud, el término “homólogo”, cuando se modifica con un adverbio tal como “altamente”, se puede referir a una similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen evolutivo común.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “similitud de secuencia” en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común. En una realización específica, dos secuencias de aminoácidos son “sustancialmente homólogas “o “sustancialmente similares” cuando al menos un 21 % (preferentemente al menos aproximadamente un 50 %, y más preferentemente aproximadamente un 75 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %) de los aminoácidos coinciden durante una longitud definida de las secuencias de aminoácidos. Las secuencias que son sustancialmente homólogas se pueden identificar comparando las secuencias utilizando un software convencional disponible en los bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas como se defina para el sistema en particular. Las condiciones de hibridación definidas están en el ámbito de la técnica (por ejemplo, Sambrook y col., 1989, infra).

Los mutantes de OPSS de la presente invención pueden catalizar la transferencia de un grupo tiol (grupo SH) a la OPS para producir cisteína. Preferentemente, las condiciones que permiten a los mutantes de OPSS de la presente invención ejercer su actividad óptima incluyen i) la presencia de 0-2 mM de PLP (fosfato de 5'-piridoxal) o 0-100 mM de DTT (ditiotreitol) como cofactor, ii) una temperatura de reacción de 25 a 60 °C, y iii) un pH de desde 6,0 a 10, 0, pero no se limitan a estas.

Un ensayo para la actividad enzimática de OPSS que cataliza la síntesis de cisteína transfiriendo un grupo tiol al sustrato con OPS se desveló junto con la nomenclatura de Ape-OPSS (Ape-O-fosfoserina sulfhidrilasa). Particularmente, debido a que la Ape-OPSS tiene la actividad de convertir OAS en cisteína transfiriendo un grupo TIOL, el ensayo se basa en la medición de la actividad de la enzima de síntesis de cisteína de E. coli (OASS, O- acetilserina sulfhidrilasa, EC 4.2.99.8)) (Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003).

En el ensayo de acuerdo con una realización de la presente invención, se añade PLP que proporciona un grupo tiol para la OAS (O-acetilserina) u OPS, que sirve como cofactor de OASS u OPSS en la conversión en cisteína a una concentración de 0,2 mM. También se añade DTT no solo para evitar la oxidación de la cisteína expuesta al aire en cisteína, sino también para cuantificar la cantidad de cisteína oxidada, gracias a su poder reductor. Preferentemente, cuando se añadían 25 mM de DTT o 0,2 Mm de PLP, la conversión en cisteína aumentaba unas 2,3 veces. Es decir, PLP y DTT tienen una influencia positiva en la conversión de OPS en cisteína.

Las enzimas Ape-OPSS, Mtb-OPSS, y Mtb-R tienen una temperatura de reacción óptima de 60 °C o 37 °C, con un pH óptimo de 7,4, como se había informado anteriormente (Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Agren D, Schnell R y Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009). Basándose en el informe, se pueden optimizar las condiciones de reacción de conversión para los mutantes de OPSS con actividad enzimática mejorada. En una realización de la presente invención, los mutantes de OPSS pueden catalizar la conversión a una temperatura de desde 37 °C a 80 °C. En detalle, la enzima Ape-OPSS de Archea spp., que pueden crecer incluso a altas temperaturas, muestra una actividad enzimática más alta a 60 °C que a 37 °C. También, la estabilidad a alta temperatura de la propia enzima da lugar a una temperatura óptima de 60 °C. Por otro lado, la Msm-R muestra una actividad enzimática óptima a 37 °C y es vulnerable al tratamiento por calor a 60 °C. Se descubrió que las enzimas OPSS mantienen la actividad de conversión en un intervalo de pH de desde 6,0 a 10,0. La actividad enzimática óptima se detectó a un pH 7,4 en Ape-OPSS y un pH de 8,0 a 9,0 en Msm-T. Por lo tanto, la Msm-T es estable en un intervalo más amplio de pH que la Ape-OPSS.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “molécula de ácido nucleico” pretende englobar moléculas de ADN y ARN. Los nucleótidos, que constituyen las unidades estructurales de las moléculas de ácido nucleico, incluyen no solamente los nucleótidos de origen natural, sino análogos modificados en un resto de azúcar o un resto de base (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman y Peyman, Chemical Reviews, 90:543- 584 (1990)).

De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invención proporciona un vector de expresión que lleva la molécula de ácido nucleico.

Un “vector” se refiere a cualquier vehículo para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico dentro de una célula huésped. Un vector puede ser un replicón al que se ha unido otro segmento de ADN de manera que dé lugar a la replicación del segmento unido. Un “replicón” se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, un plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, se capaz de replicación bajo su propio control. El término “vector” incluye tanto vehículos víricos y no víricos para introducir el ácido nucleico en una célula y huésped in vitro, ex vivo, o in vivo. El término “vector” puede incluir también ADN minicirculares. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido sin secuencias de ADN bacteriano. La retirada de las secuencias de ADN bacteriano que son ricas en regiones CpG han demostrado que disminuyen el silenciamiento de expresión transgénica resulta en una expresión más persistente a partir de vectores de ADN

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plasmídico (véase, por ejemplo, Ehrhardt, A. y col. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) Mol Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. y col. (2004) Gene Ther 11: 856-64). El término “vector” puede incluir también transposones tales como Sleeping Beauty (Izsvak y col. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), o cromosomas artificiales.

Como vector, se conoce bien en la técnica el sistema pET (Novagen) que utiliza un promotor T7. En la presente invención, se pueden utilizar distintos sistemas de expresión conocidos en la técnica sin limitación.

En una realización de la presente invención, se empleó un sistema de expresión que utiliza un promotor CJ1, desarrollado por los presentes inventores, para la expresión de un gen exógeno (véase, la Publicación de Patente coreana abierta a inspección pública N° 10-2006-0068505, FIG. 7).

En una realización de la presente invención, los niveles de expresión de OPSS entre el sistema pET que comprende un promotor T7 y el sistema CJ1 que comprende un promotor CJ1 se compararon dando las mismas condiciones. Como resultado el sistema CJ1 presentaba un nivel de expresión más alto de OPSS que el sistema pET (FIG. 3). Además, la sobreexpresión de OPSS necesitaba una temperatura baja (18 HC) y un largo periodo de tiempo en el sistema pET, pero una alta temperatura (37 HC) y un corto periodo de tiempo en el sistema CJ1. Por lo tanto, se prefiere utilizar el promotor CJ1 para obtener OPSS eficazmente, aunque la presente invención no se limita a este.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la misma, la presente invención proporciona un transformante transformado con el vector de expresión.

Como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” en todas sus formas gramaticales y variaciones se refiere a la alteración genética de una célula que resulta de la introducción de un gen ajeno en la célula huésped de manera que el gen introducido se pueda replicar por sí mismo o como un factor incorporado en el cromosoma.

El vector de la presente invención se puede introducir en células huésped por técnicas convencionales adecuadas conocidas en la técnica, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a electroporación, co-precipitación en fosfato cálcico, infección retrovírica, microinyección, DEAE-dextrano, y calcio catiónico en liposomas.

La expresión “célula transformada con un vector recombinante”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula huésped que tiene anclado un vector recombinante en la misma que lleva un gen de interés. La célula huésped adecuada para su uso en la presente invención puede ser procariota o eucariota. Ejemplos incluyen, bacterias enterobacterias y corineformes, con preferencia por Escherichia spp. y Serratia spp., teniendo la mayor preferencia por la E. coli.

De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de cisteína, que comprende la conversión de OPS con un sulfuro en presencia del mutante de OPSS de la presente invención.

El mutante de la presente invención se puede aplicar a la producción en masa de cisteína. Cuando se utiliza el transformante que expresa el mutante, la producción en masa de cisteína se puede conseguir en condiciones de cultivo óptimas que se conocen bien en la técnica. Por lo tanto, el procedimiento de producción en masa de cisteína comprende el cultivo de los transformantes en condiciones óptimas que son bien conocidas en la técnica.

Para su uso como sustrato, la OPS tiene que estar en forma pura o puede estar en forma de un cultivo de fermentación que contienen OPS. La OPS pura puede estar disponible en el mercado, como se identifica en el N.° de catálogo P0878 de Sigma-Aldrich o CAS407-41-0 de Wako. Sin embargo, el cultivo que contiene OPS que se obtiene por fermentación microbiana tiene ventajas económicas sobre la OPS pura disponible en el mercado ya que el cultivo que contiene OPS se puede utilizar sin purificación adicional y el cofactor PLP necesario para la conversión se puede obtener en el cultivo fermentado.

Se puede utilizar cualquier compuesto de azufre en la presente invención, a condición de que se pueda convertir en un grupo tiol (SH). Preferentemente, se puede utilizar Na2S, H2S, o S2O3, sea en forma de líquido o gas.

En una realización de la presente invención, se utilizó Na2S como fuente de azufre. El Na2S se puede añadir a una concentración molar de 0,1 a 3 veces tan alta como la de OPS utilizada en la conversión enzimática. En detalle, la Msm-T-HA2, que tiene una tasa de conversión en cisteína del 80 % que es equivalente a la de la Msm-T, se utiliza a una concentración de 50 pg/ml en condiciones de reacción que comprenden caldo de fermentación con 50 mM de OPS yo caldo de fermentación con 60 mM de OPS purificada, 100 0 120 mM de Na2S, y 0,2 mM de PLP.

Será evidente y fácilmente entendible por los expertos en la técnica que el procedimiento de conversión enzimática se puede optimizar y aumentar de escala con enzimas altamente activas. En una realización, cuando se incuban 19,317 g/l de caldo de fermentación con OPS en presencia de 50 mg de Msm-T-HA2, se produjo cisteína a una concentración de hasta 9,075 g/l. En una jarra de 1 l, se convirtió OPS en cisteína con una tasa del 71,83 % en presencia del mutante (FIG. 6).

Abreviaturas y terminología

Para explicar mejor la presente invención y para instruir a los técnicos en la técnica para llevar a cabo la presente invención, se da una descripción de las siguientes palabras y procedimientos. A menos de que el contexto necesite otra cosa, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, las palabras “comprende”, “comprendiendo”, y similares 5 se consideran en un sentido incluyente en oposición a un sentido excluyente o exhaustivo, esto quiere decir, en el sentido de “que incluye, pero no se limita a”. Los términos singulares de “un”, “una” y “el” incluyen las referencias en plural a menos de que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión “que comprende una célula” significa “que incluye una célula o una pluralidad de dichas células, pero no se limita a estas”.

Cuando se utiliza en referencia a una lista de dos o más artículos, la palabra “o” cubre todas las siguientes 10 interpretaciones de la palabra: cualquiera de los artículos de la lista, todos los artículos en la lista, y cualquier combinación de artículos en la lista. A menos de que se establezca otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tiene los mismos significados que entiendes lo expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Se desvelan posteriormente los procedimientos y materiales pertinentes, pero se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes en las prácticas o experimentos de la presente 15 invención. Los materiales, procedimientos, y ejemplos que se dan posteriormente serán evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Eliminación: Una mutación en la que se han eliminado uno o más restos de nucleótidos o aminoácidos de una molécula de ácido nucleico o una proteína, respectivamente.

Modo de la invención

20 Se puede obtener un mejor entendimiento de la presente invención mediante los siguientes ejemplos que se exponen para ilustrar la presente invención.

Ejemplo 1: Desarrollo de OPSS

Se ha informado que Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, y Trichomonas vaginalis tienen OPSS, una enzima que utiliza la OPS, en vez de la OAS de E. coli, como sustrato para la síntesis de cisteína (Mino K e Ishikawa 25 K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW, y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC, y Coombs gH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). Basándose en el informe, los presentes inventores descubrieron dos tipos de OPSS que convierten la OPS en cisteína de Aeropyrum pernix y Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Entre ellas, la enzima OPSS derivada del Mycobacterium tuberculosis se utilizó para explorar la homología de aminoácidos. Como 30 resultado, se aseguraron tres mutantes de OPSS, Msm-OPSS, Rjo-OPSS y Nfa-OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa 155, Rhodococcus jostii RHA1, y Nocardia farcinica IFM 10152, respectivamente.

Para obtener la OPSS de cada cepa, se construyó un sistema de vector pET28a (Novagen), que se utiliza normalmente para la expresión enzimática. Cada una de las matrices y cebadores para su uso en la clonación de las cinco enzimas OPS sulfhidrilasa diferentes y los plásmidos recombinantes resultantes se resumen en la Tabla 1, 35 posterior. Las combinaciones adecuadas de matriz y los cebadores, como se dan en la Tabla 1, se utilizaron para la PCR para la amplificación de cada uno de los genes de OPSS. Los productos de la PCR y el vector pET28a se digirieron con Ndel e HindlII (a 37 °C durante 3 horas). Cada uno de los fragmentos genéticos se ligaron al vector pET28a digerido (Novagen). La secuenciación de bases confirmó la construcción de los vectores de expresión que llevaban cada uno de los genes OPSS. Los vectores de expresión enzimática se introdujeron en E. coli (DE3) para 40 producir cepas capaces de expresar las enzimas OPSS. Los nombres de las enzimas se dan en la Tabla 1, posteriormente.

[Tabla 1]

Enzima

Vector Matriz Cebador

Ape-OPSS

pET28a-Ape-OPSS ADN sintético SEQ ID NO: 7 y 8

Mtb-OPSS

pET28a-Mtb-OPSS ADN genómico de Mtb SEQ ID NO: 9 y 10

Msm-OPSS

pET28a-Msm-OPSS ADN genómico de Msm SEQ ID NO: 11 y 12

Rjo-OPSS

pET28a-Rjo-OPSS ADN genómico de Rjo SEQ ID NO: 13 y 14

Nfa-OPSS

pET28a-Nfa-OPSS ADN genómico de Nfa SEQ ID NO: 15 y 16

La expresión de las enzimas se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema pET 45 (Novagen). Las colonias únicas de cada cepa de las placas LB se inocularon en 5 ml de caldo LB y se incubaron a 37 °C durante 16 horas mientras se agitaba a 200 rpm. Los cultivos se transfirieron a 25 ml de caldo LB reciente (en matraces de 250 ml) y se incubaron hasta una DO600 de 0,5 ~ 0,6 (durante 2 ~ 3 horas) en las mismas condiciones,

inmediatamente después de lo cual se añadió 1 mM de IPTG al medio para inducir que se expresaran las enzimas durante la incubación a 18 °C durante 18 horas mientras se agitaba a 120 rpm. Las enzimas se purificaron utilizando columnas Ni-NTA por marcador His, con la ayuda de His SpinTrap (GE Healthcare). De las cinco enzimas OPSS aisladas, se encontró que cuatro eran en forma soluble, siendo una (Rjo-OPSS) un cuerpo de inclusión según se 5 analizó por electroforesis en un 14 % SDS-PAGE.

Ejemplo 2: Ensayo de OPSS respecto a la actividad de síntesis de cisteína

Las cuatro enzimas OPSS obtenidas por distintas cepas de microorganismos se ensayaron en cuanto a la capacidad para catalizar la conversión de la OPS en cisteína. Con respecto a las condiciones de ensayo y procedimientos (ensayo enzimático cysM), se hizo referencia a informes previos Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 10 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW, y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602

11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). La cantidad de sustrato utilizada está representada por una unidad en ml. Las condiciones de ensayo para la actividad enzimática se resumen en la Tabla 2, a continuación.

[Tabla 2]

Sol. de materia prima

Conc. Final Blanco OPS sulfhidrilasa

Enzima 6xHis

- 40 (50 mg)

1 M HEPES (pH 7, 4)

100 mM HEPES 100 100

0,5 M Na2S

10 mM Na2S 20 20

10 mM PLP

0,2 mM PLP 20 20

100 mM OPS

5 mM OPS 0 50

AD

790 750

Total

1000 1000

15

Las soluciones de reacción exceptuando las enzimas se incubaron a 37 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 50 mg de OPSS purificada a la solución de reacción. En los momentos predeterminados durante la incubación a 37 °C, se tomaron 100 ml de las reacciones enzimáticas y se mezclaron con 100 ml de 33,2 % de TCA para detener la reacción enzimática. Las concentraciones de cisteína de las reacciones enzimáticas se analizaron 20 cuantitativamente midiendo la absorbancia a DO560 de acuerdo con el procedimiento Gaitonde. Las actividades de síntesis de cisteína de las cuatro enzimas OPS sulfhidrilasas diferentes se resumen en la Tabla 3, posteriormente. Los títulos de síntesis de cisteína de las enzimas OPSS se expresan como las tasas de conversión en cisteína en el tiempo de reacción.

[Tabla 3]

Tasa de conversión en cisteína ( %)

10 min

30 min 60 min

Ape-OPSS

63,4 89,7 97,4

Mtb-OPSS

1,7 4,8 10,1

Msm-OPSS

12,8 25 43,7

Nfa-OPSS

0,1 0,1 0,2

25

Como se puede ver en la Tabla 3, se confirmó que las enzimas OPSS derivadas de Aeropyrum pernix y Mycobacterium tuberculosis H37Rv tenían la actividad de utilización de la OPS como sustrato para sintetizar cisteína. La actividad de síntesis de cisteína de la nueva OPSS derivada de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155, que se obtuvo explorando la homología de aminoácidos con la enzima Mtb-OPSS, se encontró primero. Por 30 otra parte, la nueva OPSS derivada de Nocardia farcinica IFM 10152, obtenida por la exploración de homología, presentaba una actividad insuficiente para convertir la O-fosfoserina en cisteína.

Como se ve en los datos de la Tabla 3, la tasa de conversión a partir de OPS en cisteína de la Ape-OPSS alcanzaba cerca del 100 % en una hora.

La tasa de conversión de la enzima Msm-OPSS, que se seleccionó recientemente mediante la exploración

enzimática basándose en la OPSS derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv expuesta previamente, era del 43,7 % que es 4,3 veces mayor que la de Mtb-OPSS.

Ejemplo 3: Preparación de Mtb-T y Msm-T, mutantes con 5 restos de aminoácido del extremo C de Mtb-OPSS y Msm-OPSS

5 La OPSS derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb-OPSS), que catoliza la conversión de OPS en cisteína con la ayuda de las enzimas adicionales mec+ y cysO, es capaz de utilizar una fuente de azufre que contiene S2" en la conversión de OPS en cisteína incluso en ausencia de las enzimas adicionales cuando se retiraban de la misma cinco restos de aminoácido del extremo C. Basándose en este hecho, se obtuvo la Mtb-T (SEQ ID NO: 24), que puede convertir rápidamente la OPS en presencia de S2" como fuente de azufre. A partir de la 10 Msm-OPSS que comparte una alta homología de aminoácidos con la Mtb-OPSS, se obtuvo también la Msm-T eliminado 5 restos de aminoácido del extremo C. Los vectores de expresión que llevaban los dos mutantes enzimáticos se construyeron. A este respecto, se llevó a cabo una PCR pfu sobre el ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv y Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 en presencia de cada uno de los pares de cebadores de SEQ ID nO: 17 y 18 y SEQ ID NO: 19 y 20. Los fragmentos genéticos de OPSS así 15 obtenidos se trataron con Ndel e HindlII y se clonaron en el vector pET28a digerido con las mismas enzimas de restricción para construir los vectores de expresión recombinante llamados pET28a-Mtb-T y pET28a-Msm-T, respectivamente. Los vectores de expresión recombinantes se introdujeron en E. coli (DE3). La expresión de los dos mutantes de OPSS obtenidas en las mismas condiciones como en el Ejemplo 1 se confirmó por un 14 % de SDS- PAGE. Como resultado se obtuvieron Mtb-T (SEQ ID NO: 5) y Msm-T (SEQ ID NO: 2).

20 Ejemplo 4: Ensayo de Mtb-T y Msm-T respecto a la actividad de síntesis de cisteína

Las Mtb-T y Msm-T, obtenidas anteriormente, se evaluaron respecto a la actividad enzimática midiendo las tasas de conversión en cisteína finales. La actividad enzimática se ensayó de la misma manera que en el Ejemplo 2. La cisteína convertida se analizó cuantitativamente utilizando el procedimiento de Gaitonde y los resultados se resumen en la Tabla 4, a continuación.

25 [Tabla 4]

Tasa de conversión en cisteína ( %)

10 min

30 min 60 min

Mtb-T

9,5 18,6 37,1

Msm-T

20,3 54,6 100

Como se ve en la Tabla 4, la Msm-T mutante permitía la conversión en cisteína a partir del sustrato con una tasa del 100 % en una hora.

Ejemplo 5: Ensayo de actividad de síntesis de cisteína de Los mutantes derivados de Msm-T, Msm-T-HA2 y 30 Msm-T-EP3

Basándose en la Msm-T, que puede convertir la OPS en cisteína con una tasa del 100%, se obtuvieron dos enzimas mutantes con actividad mejorada utilizando un procedimiento enzimático evolutivo, y se llamaron Msm-T- HA2 (SEQ ID NO: 25) y Msm-T-EP3 (SEQ ID NO: 26). Se introdujeron mutagénesis aleatorias utilizando el tratamiento con hidroxilamina y un kit de PCR tendente a error (kit de mutagénesis aleatoria de diversidad de PCR. 35 Clontech) en la Msm-T para construir una biblioteca de Msm-T mutantes que se exploraron entonces para seleccionar los mutantes de OPSS con una actividad enzimática mejorada.

Se descubrió que los mutantes de OPSS Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3, que se obtienen por exploración HTS sobre un gen Msm-T, tenían secuencias de aminoácidos de sEq ID NO: 3 y 4, respectivamente, según se analizaron por secuenciación de bases.

40 Las Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3 mutantes y la Msm-T de control se ensayaron respecto a la actividad enzimática y los resultados se resumen en las Tablas 5 y 6. El ensayo de actividad enzimática se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 2.

[Tabla 5]

Tasa de conversión en cisteína ( %)

10 min

30 min 60 min

Msm-T

20,3 54,6 100

5

10

15

20

25

30

35

Tasa de conversión en cisteína ( %)

10 min

30 min 60 min

Msm-T-HA2

101,6 101,2 97,5

Msm-T-EP3

24 65,7 100,7

[Tabla 6]

Msm-T Msm-T-HA2 Msm-T-EP3

Actividad específica (cisteína (mmoles)/min/mg)

14,96 44,82 16,72

Como se puede ver en las Tablas 5 y 6, los mutantes de OPSS Msm-T-HA2 y Msm-T-EP3, que se obtienen por el procedimiento evolutivo, se midió que presentaban tasas de conversión aumentadas 5 veces y 1,2 veces, respectivamente, a los 10 minutos después del inicio de la reacción, en comparación con la Msm-T de control. También, se compararon en términos de actividad específica (concentración de producto/tiempo/cantidad de enzima), que se utiliza ampliamente en la determinación de la actividad enzimática. La actividad específica de Msm- T-HA2 aumentaba tres veces en comparación con la Msm-T de control, indicando que el mutante de OPSS esta mejorada en actividad enzimática, con una capacidad de sintetizar cisteína en cantidades mayores por tiempo por unidad de enzima.

Ejemplo 6: Necesidad de un cofactor para la actividad de OPSS

Para examinar el efecto de los cofactores en la conversión en cisteína de las OPSS, se midió la tasa de conversión en cisteína de Msm-T en ausencia o presencia de PLP y DTT. A este respecto, se hicieron reaccionar los sustratos de 50 mM de caldo con OPS y 100 mM de Na2S a 37 °C durante 30 min en presencia de 25 mM de DTT o 0,2 mM de PLP. La cisteína así producida se analizó cuantitativamente utilizando el procedimiento Gaitonde. Los resultados se resumen en la Tabla 7, a continuación.

[Tabla 7]

Msm-T

Tasa de conversión en cisteína ( %)

(-) PLP, (-) DTT

23,62

(+) PLP, (-) DTT

33,21

(-) PLP, (+) DTT

40,08

(+) PLP, (+) DTT

54,65

Como se ve en la Tabla 7, la tasa de conversión en cisteína en presencia de PLP y DTT era 2,3 veces mayor que en ausencia de PLP y DTT. Por lo tanto, se observó que tanto PLP como DTT tenían una influencia positiva sobre la conversión.

Ejemplo 7: Actividad de OPSS por la temperatura

Se examinaron las tasas de conversión en cisteína de la Ape-OPSS de acuerdo con la temperatura. Se midió la actividad enzimática a 37 °C y 60 °C a los 2, 5, 10, 30 y 60 min después de la reacción. La reacción se llevó a cabo en condiciones de 100 mM de HEPES (pH 7,4), 5 mM de OPS, 10 mM de Na2S, 0,2 mM de PLP y 50 pg/ml de CysM. La cantidad de cisteína producida se determinó utilizando el procedimiento Gaitonde. Los resultados se muestran en la FIG. 1.

En condiciones de tampón, como se muestra en la FIG. 1, la Ape-OPSS demostraba una tasa de reacción inicial más rápida a 37 °C así como una mayor reactividad a 60 °C que la Msm-T.

Ejemplo 8: Estabilidad con calor de las OPSS

Se analizaron las Ape-OPSS y Msm-T en cuanto a la estabilidad con calor. Cada una de las enzimas se diluyó hasta una concentración de 2 mg/ml en un caldo con OPS y se sometieron a tratamiento térmico a 37 °C y 60 °C durante 10, 30, 60, 120 y 240 min, seguido por la reacción a 37 °C durante 30 min en condiciones de 5 mM de OPS, 10 mM de Na2S, 0,2 mM de PLP, y 100 mM de HEPES (pH 7,4). Para esta reacción, se emplearon 10 pg/ml de Ape-OPSS y 50 pg/ml de Msm-T. Las cantidades de cisteína producida se midieron utilizando el procedimiento Gaitonde y se

5

10

15

20

25

30

resumen en la Tabla 8, a continuación.

[Tabla 8]

Actividad relativa (%)

Tiempo de calentamiento (min)

(-) 10 min 30 min 60 min 120 min 240 min

Ape-OPSS

100 102 107 100 107 101

Msm-T

100 82 50 32 19 8

A pesar del tratamiento con calor a 60 °C durante 4 horas, como se ve en la Tabla 8, se observó que la Ape-OPSS mantenía su actividad intacta mientras que la actividad de Msm-T se mantenía a 37 °C, pero disminuía un 50 % con el tratamiento por calor a 60 °C durante 3o min.

Se hizo un examen sobre la retención de la actividad enzimática a 37 °C cuando se utilizó la Msm-T en una cantidad de 50 |jg/ml, que es una concentración práctica en el caldo con OPS. En ausencia de Na2S, se trataron 50 jg/ml de Msm-T, junto con 50 mM de caldo con OPS y 0,2 mM de PLP a 37 °C durante 0,5, 1,2, 4, y 6 horas, tras lo cual se añadió Na2S para inducir la reacción enzimática. Después de la reacción durante 30 min, se midió la actividad de la Msm-T. Las cantidades de cisteína producida se determinó utilizando el procedimiento de Gaitonde y se dan en la Tabla 9, a continuación.

[Tabla 9]

Tiempo

(-) 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min

Tasa de conversión en cisteína ( %)

100 88 73 47 11 3

Como se puede ver en la Tabla 9, la actividad de Msm-T disminuía por debajo del 50 % dos horas después de la reacción a 37 °C en caldo con OPS.

Ejemplo 9: Sensibilidad de OPSS al pH

Se midieron las tasas de conversión en cisteína de Ape-OPSS y Msm-T de acuerdo con el pH. En 100 mM de tampón, se sometieron las Ape-OPSS y Msm-T, teniendo cada una, una concentración de 50 jg/ml, a una reacción a 37 °C durante 10 min. A este respecto, se utilizaron un tampón fosfato k con un pH de 6,4/7,0/7,4/8,0, un tampón Tris-HCl con un pH de 7,0/7,4/8,0/8,5/8,8 y un tampón de carbonato Na con un pH de 8,0/8,5/9,0/10,0. Se llevó a cabo el análisis cuantitativo de la cisteína producida utilizando el procedimiento Gaitonde. Los resultados se resumen en la FIG. 2.

Como se ve en la FIG. 2, la Msm-T presentaba la mayor actividad a un pH de desde 8,0 a 9,0 independientemente del tampón. Para la Ape-OPSS, su mayor actividad se detectó en fosfato K (pH 7,4), con un pH óptimo que diferenciaba un tampón de otro.

Ejemplo 10: Efecto de los iones sobre la actividad de las OPSS

Se examinaron los efectos de los iones sobre la actividad de las enzimas OPSS de la siguiente manera. En una mezcla de reacción que contenía 5 mM de OPS, 10 mM de Na2S, 0,2 mM de PLP, y 100 mM de HEPES (pH 7,4), las enzimas se sometieron a una reacción a 37 °C durante 30 min en presencia de (NH4)2SO4 [1, 3, 5, 10, 20 g/l], KH2PO4 [0,5, 1,2, 4, 8 g/l], o NH4Cl [0,2, 0,5, 1, 2 g/l]. Se utilizaron Ape-OPSS y Msm-T a una concentración de 10 jg/ml, respectivamente. Las cantidades de cisteína producida se determinaron utilizando el procedimiento de Gaitonde se resumen en la Tabla 10, a continuación.

[Tabla 10]

Actividad relativa (%)

NH4Cl

Ape-OPSS Msm-T

0

100,00 100,00

0,2

86,26 91,49

0,5

73,35 91,30

5

10

15

20

25

30

35

40

Actividad relativa (%)

NH4Cl

Ape-OPSS Msm-T

1

49,11 67,11

2

27,72 47,12

No se detectaron cambios en la tasa de conversión en cisteína cuando se añadían (NH4)2SO4 o KH2PO4a la mezcla de reacción. Por otra parte, como se puede ver en la Tabla 10, la tasa de conversión en cisteína disminuía con un aumento de la concentración de NH4CL Particularmente, la actividad enzimática máxima disminuía más del 70 % cuando se añadían 2 g/l de NH4. Por lo tanto, se observaba que (NH4)2SO4 y KH2PO4 tenían un efecto negativo en la actividad de conversión de la OPSS.

Ejemplo 11: Efecto de la fuente de azufre en la actividad de síntesis de cisteína de la OPSS

Se llevó a cabo un experimento para examinar el efecto de fuentes de azufre sobre la actividad de síntesis de cisteína de cada enzima. En una mezcla de reacción que contenía 5 mM de OPS, 0,2 mM de PLP, y 100 mM de HEPES, se sometió cada enzima (50 pg/ml de Ape-OPSS, 50 pg/ml de Msm-T) a una reacción a 37 °C durante 1 hora en presencia de 10 mM de Na2S, NaSH, o Na2S2O3. Las cantidades de cisteína producida se midieron utilizando el procedimiento de Gaitonde. Se observó que la Ape-OPSS refería Na2S2O3 como fuente de azufre, mientras que a Msm-T prefería Na2S. Los resultados se resumen en la Tabla 11, a continuación.

[Tabla 11]

Actividad relativa ( %)

Enzima

Na2S NaSH Na2S2O3

Ape-OPSS

100.0 95.2 142.3

Msm-T

106.7 98.3 66.2

Ejemplo 12: Construcción de un vector de expresión que lleva OPSS (sistema Pcl-Pcj1) y expresión de la enzima

Se llevó a cabo una PCR utilizando cebadores de SEQ ID NO: 21 y 22, sirviendo el vector pET28a-Msm-T como matriz. El producto de la PCR que se obtiene de esta manera se trató con EcoRV e HindlII, y se clonó para construir un vector recombinante llamado pCL-P(CJ1)-Msm-T (pCJ1-MsmT CysM, FIG. 7). Para examinar una diferencia en el nivel de expresión de Msm-T entre el sistema pET y el sistema PCL-Pcj1, se prepararon las cepas para la expresión de la enzima. El sistema pET se introdujo en Rosetta (DE3) mientras que el sistema pCL-Pcj1 empleaba la cepa K12G. Las colonias únicas escogidas de las placas LB se inocularon en 5 ml de caldo LB y se cultivaron a 37 °C durante 16 horas mientras se agitaba a 200 rpm. Estos cultivos se transfirieron a 25 ml de caldo LB reciente que contenía kanamicina y espectinomicina y un 0,2% de glucosa (en matraces de 250 ml) y es incubaron hasta una DO600 de 0,5-0,6, inmediatamente después de lo cual se añadió 1 mM de IPTG al medio para inducir que se expresaran las enzimas. Durante la incubación a 37 °C mientras se agitaba a 200 rpm, se midieron los niveles de expresión de la enzima en distintos momentos del cultivo (8, 16, 24 horas). Los niveles de expresión enzimática de los dos sistemas se analizaron en un 14 % de SDS-PAGE y se muestran en la FIG. 3.

En las mismas condiciones, como se ve en la FIG. 3, el sistema pCL-Pcj1 asegura un nivel de expresión más alto de la enzima que el sistema pET. Además, hay una mejoría en las condiciones del cultivo debido a una temperatura tan alta como de 37 °C y una concentración de IPTG tan baja como de 0,1 mM que permitía al sistema expresar la enzima. Por lo tanto, el sistema pCL-Pcj1 puede funcionar suficientemente en sustitución del pET.

Ejemplo 13: Síntesis de cisteína de OPSS con el uso de caldo de fermentación con OPS purificada como sustrato

Se determinaron las tasas de conversión de OPS purificada en cisteína de Msm-T y Ape-OPSS. En presencia de 75 pg/ml de cada una de las enzimas y 0,2 mM de PLP, 60 mM de OPS purificada de un caldo de fermentación con OPS se hizo reaccionar con 120 mM de Na2S a 37 °C o 70 °C durante 30, 60, 90 y 120 min. La reacción se llevó a cabo solo a 37 °C para Msm-T, pero a 37 °C y 70 °C para Ape-OPSS. Las cantidades de cisteína producida se midieron utilizando el procedimiento de Gaitonde. Los resultados se muestran en la FIG. 4.

Como se ve en la FIG. 4, un caldo de fermentación de OPS purificada servía bien como sustrato para la conversión enzimática en cisteína. Particularmente, la tasa de conversión en cisteína de Ape-OPSS aumentaba a 70 °C incluso al utilizar el caldo de fermentación de OPS purificada.

Ejemplo 14: Síntesis de cisteína por OPSS con el uso de caldo de fermentación OPS como sustrato

Cuando un caldo de fermentación con OPS se utilizó como sustrato, las tasas de conversión en cisteína de Msm-T y Ape-OPSS se midieron de acuerdo a las concentraciones de las enzimas. En presencia de 5 |jg/ml o 50 |jg/ml de cada una de Msm-T y Ape-OPSS y 0,2 mM de PLP, se hicieron reaccionar 50 mM de caldo de fermentación con 5 OPS con 100 mM de Na2S a 37 °C. Las cantidades de cisteína producida se midieron utilizando el procedimiento de Gaitonde. Los resultados se muestran en la FIG. 5.

Como se ve en la FIG. 5, la mayor tasa de conversión se detectó con 50 jg/ml de Msm-T. Además, al utilizar el caldo de fermentación con OPS como sustrato, la actividad de Msm-T era mayor que la de Ape-OPSS.

Ejemplo 15: Tasa de conversión en cisteína de acuerdo con la concentración de OPSS

10 A un caldo de OPS que contenía OPS a una concentración de 9,76 g/l, se añadió Na2S en una cantidad dos veces mayor que el número molar de OPS, seguido por la incubación a 37 °C durante 5 min. A continuación, se añadió Msm-T purificado en una cantidad de 50 mg mientras que se utilizaba Msm-T-HA2 en una cantidad de 5 jg, 10 jg, 20 jg, y 50 jg. En momentos predeterminados durante la incubación a 37 °C, se tomaron 100 ml de la mezcla de reacción enzimática y se mezclaron con 100 ml de TCA al 33,2% para parar la reacción enzimática. Las 15 concentraciones de cisteína de las reacciones enzimáticas se analizaron cuantitativamente midiendo la absorbancia a una DO560 de acuerdo con el procedimiento Gaitonde. Las actividades de síntesis de cisteína de las enzimas OPSS de acuerdo con las concentraciones enzimáticas se resumen en la Tabla 12, a continuación.

[Tabla 12]

Tasa de conversión en cisteína ( %)

Tiempo

0 min 10 min 20 min 30 min 60 min

Msm-T 50 jg

0,00 20,69 48,45 62,68 59,82

Msm-T-HA2 5 jg

0,00 0,00 4,77 10,66 27,23

Msm-T-HA2 10 jg

0,00 10,46 24,78 37,43 57,32

Msm-T-HA2 20 jg

0,00 14,90 31,31 48,09 59,94

Msm-T-HA2 50 jg

2,33 44,02 56,72 62,17 63,52

20 Como se ve en la Tabla 12, incluso cuando la Msm-T-HA2 mutante cuya actividad de síntesis de cisteína se había mejorado y se utilizaba en una cantidad correspondiente a un 40 % de la de Msm-T, la tasa de conversión en cisteína ( %) final era similar. Además, cuando se utilizaban en la misma cantidad, la Msm-T-HA2 mutante presentaba una actividad de reacción inicial más rápida en comparación con la Msm-T.

Ejemplo 16: Tasa de conversión en cisteína por concentraciones de OPS

25 Para examinar el efecto de la concentración de OPS sobre la tasa de conversión de Msm-T y Msm-T-HA2, se añadieron cantidades predeterminadas de OPS purificada añadida a un caldo de fermentación de OPS para inducir la reacción de conversión. La enzima se utilizó en una cantidad de 50 jg para Msm-T y 20 jg para Msm-T-HA2. La cantidad de cisteína en la solución de reacción se midieron utilizando el procedimiento Gaitonde. Los resultaos se resumen en las Tablas 13 a 15.

30 [Tabla 13]

Tasa de conversión en cisteína (OPS medida 10,65 g/l)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

Msm-T 50 ug

0 23,03 65,38 65,70 61,95 55,35

Msm-T-HA2 20 ug

0 13,70 43,82 61,32 63,77 53,74

[Tabla 14]

Tasa de conversión en cisteína (OPS medida 36,09 g/l)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

Msm-T 50 ug

0 1,15 10,23 28,07 97,84 100,34

Tasa de conversión en cisteína (OPS medida 36,09 g/l)

Msm-T-HA2 20 ug

0 2,33 12,04 27,57 77,65 80,01

[Tabla 15]

Tasa de conversión en cisteína (OPS medida 55,6 g/l)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

Msm-T 50 ug

0 0 2,36 7,41 42,69 66,67

Msm-T-HA2 20 ug

0 0,32 4,76 12,15 50,16 62,46

Cuando la concentración de OPS era aproximadamente 30 g/l, como se ve en las Tablas 13 a 15, las mayores tasas 5 de conversión que se detectaron eran del 100% para Msm-T y del 80% para Msm-T-HA2. Se descubrió que cuando la concentración de OPS excedía 50 g/l, la tasa de conversión y el porcentaje de conversión disminuían.

Los datos de las Tablas 13 a 15 se utilizaron para seleccionar una relación de concentración óptima entre OPS y Msm-T-HA2 para un procedimiento de conversión utilizando una alta concentración de OPS, y para reducir el tiempo de reacción de Msm-T-HA2 en comparación con la de Msm-T.

10 Ejemplo 17: Tasa de conversión en cisteína por las concentraciones de Na2S

Para examinar el efecto de la cantidad de Na2S utilizada como fuente de azufre en la tasa de conversión en cisteína, las reacciones de conversión de OPS se llevaron a cabo en presencia de 20 |jg de Msm-T-HA2 cuando se utilizaba Na2S a una concentración de 160 mM, 320 mM, y 480 mM, que se corresponden a cantidades equivalentes y de dos veces y tres veces mayores que el número molar de OPS, respectivamente. Las tasas de conversión en cisteína 15 resultantes se resumen en la Tabla 16, a continuación.

[Tabla 16]

Tasa de conversión en cisteína (OPS medida 29,76 g/l)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

160 mM Na2S

0 0 0 0 0 0

320 mM Na2S

0 13,43 34,58 78,78 67,76 74,95

480 mM Na2S

0 14,90 25,99 54,42 51,24 58,25

Como se ve en la Tabla 16, la tasa de conversión en cisteína tenía un pico cuando el número molar de Na2S era dos veces mayor que el de la OPS utilizada. A partir de los resultados, se entiende que una condición óptima se fija 20 cuando la relación molar de Na2S respecto a OPS es de 2.

Ejemplo 18: Tasa de conversión en cisteína por el pH

Para examinar el efecto de pH en la conversión enzimática de OPS en cisteína, se llevó a cabo una reacción de conversión en presencia de 20 jg de Msm-T-HA2 a distintos valores de pH. Los resultados se resumen en la tabla 17, a continuación.

25 [Tabla 17]

Tasa de conversión en cisteína ( %)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min

pH 8,5 (OPS 35,02 g/l)

0,24 4,74 20,74 40,19 69,13

pH 9 (OPS 34,59 g/l)

0,19 6,00 24,03 43,86 63,88

pH 9,5 (OPS 35,34 g/l)

0,26 9,85 28,48 44,82 64,68

pH 10 (OPS 34,59 g/l)

0,25 10,97 28,54 40,19 58,14

Como se puede ver, se midió que el pH óptimo para la reacción de conversión era entre 8,5 y 9,5.

Ejemplo 19: Procedimiento de conversión a escala de una jarra de 1 l

El procedimiento de reacción para convertir un caldo con OPS en cisteína se escaló hasta una jarra de 1 l. Basándose en las características de OPSS y el conjunto de datos de la reacción de conversión en condiciones de un 5 tubo de 1 ml, se estableció un procedimiento de reacción de conversión para Msm-T-HA2.

Precediendo la reacción de conversión en una escala de una jarra de 1 l, el caldo de fermentación con OPS obtenido en una jarra de 1 l se centrifugó (10.000 rpm, 10 min, 4 °C) y el sobrenadante se pasó a través de una membrana (0,45 |jm) para retirar las células. Se añadieron 72 g de Na2S al caldo con OPS filtrado (19,317 g/l), seguido filtrando el precipitado a través de un papel de filtro Whatman (6 jm). Después de la adición de 10 mM de PLP, la mezcla de 10 reacción se pre-incubó a 37 °C durante 5 min, mientras se agitaba a 200 rpm. Finalmente, se llevó a cabo una reacción de conversión en presencia de 50 mg de Msm-T-HA2 en una escala de una jarra de 1 l. A los 0, 10, 30, 60, 120, y 180 min durante la incubación a 37 °C, se tomaron 100 jl de las reacciones enzimáticas y se mezcló con 100 jl de TCA al 33,2 % para detener la reacción enzimática. Las muestras que se tomaron se diluyeron en HCl 1 N y se analizaron en cuanto a los contenidos en cisteína y cistina utilizando LC. También, se utilizó el procedimiento 15 Gaitonde para determinar la cantidad de cisteína. La concentración de los sustratos y las enzimas utilizadas en el procedimiento de reacción de conversión se resumen en la Tabla 18, a continuación. La cantidad de los sustratos utilizados se representan por una unidad de ml.

[Tabla 18]

Caldo de fermentación con OPS

pH 9,01 después de la adición de Na2S, pH 9,16 después de la filtración

Final

Volumen

Concentración de OPS final

101,47 mM

Msm-T-HA2 (2,59 jg/jl)

50 jg 19

Na2S (72 g)

300 mM 0

10 mM PLP

0,1 mM 10

Caldo con OPS (19,317 g/l)

104,42 mM 1000

AD

0

Total

1029

20 Las concentraciones de cisteína en la mezcla de reacción obtenida después de la reacción de conversión que se lleva a cabo en las condiciones de la Tabla 18 se analizaron cuantitativamente por el procedimiento Gaitonde y LC, y los resultados se muestran en la FIG. 6. Cuando se incubó el caldo con OPS a 19,317 g/l se incubó durante 2 horas en presencia de 50 mg de Msm-T-HA2, como se ve en la FIG. 6, la cantidad de cisteína o cistina producida tenía un pico de hasta 9,075 g/l, indicando que la cisteína y cistina se puede producir a partir de OPS a una tasa del 71,83 % 25 mediante un procedimiento de conversión enzimática a escala de una jarra de 1 l.

[Tabla 19]

Tasa de conversión en cisteína/cistina ( %)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

Caldo con OPS

10,81 28,08 51,26 67,21 71,83 69,45

[Tabla 20]

Cisteína/cistina (g/l)

Tiempo

0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min

Caldo con OPS

1,366 3,548 6,476 8,492 9,075 8,775

5

10

15

20

25

30

Aplicabilidad industrial

Como se describe en el presente documento, los mutantes de OPSS de la presente invención puede ser útil para la producción en masa de L-cisteína, cuyos y de cuyos derivados pueden encontrar aplicaciones en una variedad de campos incluyendo la industria farmacéutica (para el tratamiento de enfermedades bronquiales), la industria cosmética (en champús capilares, composiciones para ondas permanentes, etc.), y la industria alimentaria (antioxidantes, potenciadores del sabor, aditivos de masa, etc.).

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> MUTANTES DE O-FOSFOSERINA SULFHIDRILASAS Y PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE CISTEÍNA UTILIZANDO LAS MISMAS

<130> T3049 EP/1 S3

<150> KR10-2010-0102665 <151>

<150> EP 11 18 5853.6 <151>

<160> 26

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1 <211> 323 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Msm-OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 1

Met 1

Thr Arg Tyr Asp 5 Ser Leu Leu Gln Ala 10 Leu Gly Asn Thr Pro 15 Leu

val

Gly Leu Gln 20 Asn Leu Ser Pro Arg 25 Trp Asp Asp Glu Asp 30 Gly Lys

Pro

His val 35 Arg Leu Trp Ala Lys 40 Leu Glu Asp Arg Asn 45 Pro Thr Gly

Ser

lie 50 Lys Asp Arg Pro Ala 55 Leu Arg Met lie Glu 60 Gln Ala Glu Arg

Asp 65

Gly Leu Leu Gln Pro 70 Gly Ala Thr lie Leu 75 Glu Pro Thr Ser Gly 80

Asn

Thr Gly lie Ser 85 Leu Ala Met Ala Ala 90 Leu Leu Lys Gly Tyr 95

Asn

Met

lie Cys val 100 Met Pro Glu Asn Thr 105 Ser lie Glu Arg Arg 110 Gln lie

Leu

Glu Leu 115 Tyr Gly Ala Arg lie 12 0 lie Phe Ser Pro Ala 125 Glu Gly Gly

Ser

Asn 130 Thr Ala Val Ala Thr 135 Ala Lys Glu Leu Ala 140 Ala Gln Asn Pro

Ser 145

Trp Val Met Leu Tyr 150 Gln Tyr Gly Asn Pro 155 Ala Asn Ser Asp Ala 160

His

Tyr Phe Gly Thr 165 Gly Pro Glu Leu Leu 170 Ala Asp Leu Pro Glu 175 lie

Thr

His Phe Val 180 Ala Gly Leu Gly Thr 185 Thr Gly Thr Leu Met 190 Gly

Thr

5

10

Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln lie Val Ala Ala 195 200 205

Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn lie Asp Glu 210 215 220

Gly Phe He Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Thr Arg Phe

225 230 235 240

Ser Val Gly Ser Phe Asp Ala Val Arg Arg Thr Arg Glu Leu Val Thr

245 250 255

Arg Glu Gly lie Phe Ala Gly lie Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala 260 265 270

Ala Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp 275 280 285

lie Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu Gly Gln

305 310 315 320

Leu Trp Ala

<210>2 <211> 318 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Msm-T de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400>2

Met 1

Thr Arg Tyr Asp 5 Ser Leu Leu Gln Ala 10 Leu Gly Asn Thr Pro 15 Leu

Val

Gly Leu Gln 20 Asn Leu Ser Pro Arg 25 Trp Asp Asp Glu Asp 30 Gly Lys

Pro

His Val 35 Arg Leu Trp Ala Lys 40 Leu Glu Asp Arg Asn 45 Pro Thr Gly

Ser

lie 50 Lys Asp Arg Pro Ala 55 Leu Arg Met lie Glu 60 Gln Ala Glu Arg

Asp 65

Gly Leu Leu Gln Pro 70 Gly Ala Thr ile Leu 75 Glu Pro Thr Ser Gly 80

Asn

Thr Gly He Ser 85 Leu Ala Met Ala Ala 90 Leu Leu Lys Gly Tyr 95

Asn

Met

lie Cys Val 100 Met Pro Glu Asn Thr 105 Ser lie Glu Arg Arg 110 Gln lie

Leu

Glu Leu 115 Tyr Gly Ala Arg lie 120 lie Phe Ser Pro Ala 125 Glu Gly Gly

Ser

Asn Thr Ala val Ala Thr Ala Lys Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro

130 135 140

Ser 145

Trp val Met Leu Tyr 150 Gln Tyr Gly Asn Pro 155 Ala Asn Ser ASp Ala 160

His

Tyr Phe Gly Thr 165 Gly Pro Glu Leu Leu 170 Ala ASp Leu Pro Glu 175 ile

Thr

His Phe Val 180 Ala Gly Leu Gly Thr 185 Thr Gly Thr Leu Met 190 Gly

Thr

Gly

Arg Phe 195 Leu Arg Glu His Val 200 Pro Gly Val Gln lie 205 Val Ala Ala

Glu

Pro 210 Arg Tyr Gly Glu Gly 215 val Tyr Ala Leu Arg 220 Asn lie Asp

Glu

Gly 225

Phe lie Pro Glu Leu 230 Tyr Asp Ala Asp Val 235 Leu Thr Thr Arg Phe 240

Ser

Val Gly Ser Phe 245 Asp Ala Val Arg Arg 250 Thr Arg Glu Leu Val 255 Thr

Arg

Glu Gly lie 260 Phe Ala Gly lie Ser 265 Thr Gly Ala Val Leu 270 His Ala

Ala

Leu Gly 275 Met Ala Ala Lys Ala 280 val Lys Ala Gly Glu 285 Arg Ala ASp

ile

Ala 290 Phe val val Ala Asp 295 Ala Gly Trp Lys Tyr 300 Leu Ser Thr Gly

Ala 305

Tyr Ala Gly Ser Leu 310 Asp Asp Ala Glu Asp 315 Ala Leu Glu

<210>3 <211> 318 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<223> Msm-T-HA2 de Mycobacterium smegmatis CC1 <400>3

Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 15 10 15

Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30

Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45

Ser lie Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met lie Glu Gln Ala Glu Arg 50 55 60

Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr lie Leu Glu Ser Thr Ser Gly

65 70 75 80

Asn Thr Gly lie Ser Leu Ala Met Ala Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Asn

85 90 95

Met

He Cys val Met Pro Glu Asn Thr Ser He Glu Arg Arg Gln He

100 105 110

Leu

Glu Leu Tyr Gly Ala Arg He He Phe Ser Pro Ala Glu Gly Gly

115 120 125

Ser

Asn Thr Ala Val Ala Thr Ala Lys Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro

130 135 140

Ser

Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Ser Asp Ala

145

150 155 160

HiS

Tyr Phe Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu lie

165 170 175

Thr

HiS Phe val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly

Thr

180 185 190

Gly

Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln lie Val Ala Ala

195 200 205

Glu

Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn lie Asp

Glu

210 215 220

Gly

Phe He Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Thr Arg Phe

225

230 235 240

Ser

val Gly Ser Phe Asp Ala val Arg Arg Thr Arg Glu Leu val Thr

245 250 255

Arg

Glu Gly lie Phe Ala Gly lie Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala

260 265 270

Ala

Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp

275 280 285

He

Ala Phe val val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Ala

Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu

305

310 315

<210>4 <211> 318 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Msm-T-EP3 de Mycobacterium smegmatis CC2

10

<400>4

Met Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu 15 10 15

Val Gly Leu Gln Asn Leu Ser Pro Arg Trp Asp Asp Glu Asp Gly Lys 20 25 30

Pro His Val Arg Leu Trp Ala Lys Leu Glu Asp Arg Asn Pro Thr Gly 35 40 45

Ser lie Lys Asp Arg Pro Ala Leu Arg Met lie 61u Gln Ala Glu Arg 50 55 60

Asp Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Thr lie Leu Glu Pro Thr Ser Gly

65 70 75 80

Asn Thr Gly lie Ser Leu Ala Met Ala Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Asn

85 90 95

Met lie Cys Val Met Pro Glu Asn Thr Ser lie Glu Arg Arg Gln lie 100 105 110

Leu Glu Leu Tyr Gly Ala Arg lie lie Phe Ser Pro Ala Glu Gly Gly 115 120 125

Ser Asn Ala Ala Val Ala Thr Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gln Asn Pro 130 135 140

Ser Trp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Gly Asn Pro Ala Asn Ser Asp Ala 145 150 155 160

His Tyr Phe Gly Thr Gly Pro Glu Leu Leu Ala Asp Leu Pro Glu lie 165 170 175

Thr His Phe Val Ala Gly Leu Gly Thr Thr Gly Thr Leu Met Gly Thr 180 185 190

Gly Arg Phe Leu Arg Glu His Val Pro Gly Val Gln lie Val Ala Ala 195 200 205

Glu Pro Arg Tyr Gly Glu Gly Val Tyr Ala Leu Arg Asn lie Asp Glu 210 215 220

Gly Phe lie Pro Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Val Leu Thr Ser Arg Phe

225 230 235 240

Ser Val Gly Ser Phe Asp Ala Val Arg Arg Thr Arg Glu Leu Val Thr

245 250 255

Arg Glu Gly lie Phe Ala Gly lie Ser Thr Gly Ala Val Leu His Ala 260 265 270

Ala Leu Gly Met Ala Ala Lys Ala Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Asp

275 280 285

lie Ala Phe Val Val Ala Asp Ala Gly Trp Lys Tyr Leu Ser Thr Gly 290 295 300

Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Asp Asp Ala Glu Asp Ala Leu Glu

305 310 315

<210>5 <211> 318 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mtb-T de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400>5

Met

Thr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gln Ala Leu Gly Asn Thr Pro Leu

1

5 10 15

Val

Gly Leu Gln 20 Arg Leu Ser Pro Arg 25 Trp Asp Asp Gly Arg 30 Asp Gly

Pro

His Val 35 Arg Leu Trp Ala Lys 40 Leu Glu Asp Arg Asn 45 Pro Thr Gly

Ser

lie 50 Lys Asp Arg Pro Ala 55 val Arg Met lie Glu 60 Gln Ala Glu Ala

Asp 65

Gly Leu Leu Arg Pro 70 Gly Ala Thr lie Leu 75 Glu Pro Thr Ser Gly 80

Asn

Thr Gly lie Ser 85 Leu Ala Met Ala Ala 90 Arg Leu Lys Gly Tyr Arg 95

Leu

lie Cys Val 100 Met Pro Glu Asn Thr 105 Ser Val Glu Arg Arg 110 Gln

Leu

Leu

Glu Leu 115 Tyr Gly Ala Gln lie 120 lie Phe Ser Ala Ala 125 Glu Gly Gly

Ser

Asn 130 Thr Ala val Ala Thr 135 Ala Lys Glu Leu Ala 140 Ala Thr Asn Pro

Ser 145

Trp Val Met Leu Tyr 150 Gln Tyr Gly Asn Pro 155 Ala Asn Thr Asp Ser 160

His

Tyr Cys Gly Thr 165 Gly Pro Glu Leu Leu 170 Ala Asp Leu Pro Glu 175 lie

Thr

His Phe Val 180 Ala Gly Leu Gly Thr 185 Thr Gly Thr Leu Met 190 Gly

Thr

Gly

Arg Phe 195 Leu Arg Glu His Val 200 Ala Asn val Lys lie 205 val Ala Ala

Glu

Pro 210 Arg Tyr Gly Glu Gly 215 Val Tyr Ala Leu Arg 220 Asn Met Asp

Glu

Gly 225

Phe Val Pro Glu Leu 230 Tyr Asp Pro Glu lie 235 Leu Thr Ala Arg Tyr 240

Ser

val Gly Ala val 245 Asp Ala val Arg Arg 250 Thr Arg Glu Leu val 255 His

Thr

Glu Gly lie 260 Phe Ala Gly lie Ser 265 Thr Gly Ala val Leu 270 His Ala

Ala

Leu Gly 275 Val Gly Ala Gly Ala 280 Leu Ala Ala Gly Glu 285 Arg Ala Asp

lie

Ala 290 Leu Val Val Ala Asp 295 Ala Gly Trp Lys Tyr 300 Leu Ser Thr Gly

Ala 305

Tyr Ala Gly Ser Leu 310 ASp Asp Ala Glu Thr 315 Ala Leu Glu

<210>6 <211> 389 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Ape-OPSS de Aeropyrum pernix (ADN sintético) 5 <400>6

Met l

Ala Leu Ala Asp 5 lie Ser Gly Tyr Leu 10 Asp val Leu Asp Ser 15 val

Arg

Gly Phe Ser 20 Tyr Leu Glu Asn Ala 25 Arg Glu val Leu Arg 30 Ser Gly

Glu

Ala Arg 35 Cys Leu Gly Asn Pro 40 Arg Ser Glu Pro Glu 45 Tyr Val Lys

Ala

Leu 50 Tyr Val lie Gly Ala 55 Ser Arg lie Pro Val 60 Gly Asp Gly Cys

Ser 65

His Thr Leu Glu Glu 70 Leu Gly Val Phe Asp 75 lie Ser Val Pro Gly 80

Glu

Met val Phe Pro 85 Ser Pro Leu Asp Phe 90 Phe Glu Arg Gly Lys 95 Pro

Thr

Pro Leu Val 100 Arg Ser Arg Leu Gln 105 Leu Pro Asn Gly Val 110 Arg Val

Trp

Leu Lys 115 Leu Glu Trp Tyr Asn 120 Pro Phe Ser Leu Ser 125 Val Lys Asp

Arg

Pro 130 Ala Val Glu lie lie 135 Ser Arg Leu Ser Arg 140 Arg Val Glu Lys

Gly 145

Ser Leu val Ala Asp 150 Ala Thr Ser Ser Asn 155 Phe Gly val Ala Leu 160

Ser

Ala Val Ala Arg 165 Leu Tyr Gly Tyr Arg 170 Ala Arg Val Tyr Leu 175 Pro

Gly

Ala Ala Glu 180 Glu Phe Gly Lys Leu 185 Leu Pro Arg Leu Leu 190 Gly Ala

Gln

Val lie 195 val Asp Pro Glu Ala 200 Pro Ser Thr Val His 205 Leu Leu Pro

Arg

val 210 Met Lys Asp Ser Lys 215 Asn Glu Gly Phe val 220 His val Asn Gln

Phe 225

Tyr Asn Asp Ala Asn 230 Phe Glu Ala His Met 235 Arg Gly Thr Ala Arg 240

Glu

lie Phe Val Gln 245 Ser Arg Arg Gly Gly 250 Leu Ala Leu Arg Gly 255 Val

Ala

Gly Ser Leu 260 Gly Thr Ser Gly His 265 Met Ser Ala Ala Ala 270 Phe Tyr

Leu

Gln Ser 275 val Asp Pro Ser lie 280 Arg Ala val Leu val 285 Gln Pro Ala

Gln

Gly 290 Asp Ser lie Pro Gly 295 lie Arg Arg Val Glu 300 Thr Gly Met Leu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Trp 305

lie Asn Met Leu Asp 310 lie Ser Tyr Thr Leu 315 Ala Glu Val Thr Leu 320

Glu

Glu

Ala Met Glu 325 Ala Val Val Glu Val 330 Ala Arg Ser Asp Gly 335 Leu

val

He Gly Pro 340 Ser Gly Gly Ala Ala 345 Val Lys Ala Leu Ala 350 Lys Lys

Ala

Ala

Glu 355 Gly Asp Leu Glu Pro 360 Gly Asp Tyr val val 365 val val Pro

Asp

Thr 370 Gly Phe Lys Tyr Leu 375 Ser Leu Val Gln Asn 380 Ala Leu Glu Gly

Ala 385

Gly Asp Ser Val

<210>7 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo para Ape-OPSS de Aeropyrum pernix (ADN sintético)

<400>7

gtcatatgat ggctctggct gacatctct

29

<210>8 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso para Ape-OPSS de Aeropyrum pernix (ADN sintético)

<400>8

gtaagctttt aaacagagtc accagcacc

29

<210> 9 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo para Mtb-OPSS Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400>9

gtcatatgat gacacgatac gactcgctg

29

<210> 10 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso para Mtb-OPSS de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

<400> 10

gtaagctttc atgcccatag ttgcccttc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 11 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para Msm-OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 11

ataagctttc atgcccatag ctgcccttc 29

<210> 12 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso para Msm-OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 12

ataagctttc attccagcgc gtcctcggc 29

<210> 13 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para Rjo-OPSS de ADN sintético <400> 13

gtcatatgat ggcgcggttc gattcgctg 29

<210> 14 <211> 31 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso para Rjo-OPSS de ADN sintético <400> 14

tagcggccgc tcatgcccac aactgccctt c 31

<210> 15 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para Nfa-OPSS de ADN sintético <400> 15

gtcatatgat ggcacgctac gaatcgctg 29

<210> 16 <211> 28 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso para Nfa-OPSS de ADN sintético <400> 16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

gtaagctttc aggcccagag ctggcctt 28

<210> 17 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para Mtb-T de Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 17

gtcatatgat gacacgatac gactcgctg 29

<210> 18 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso para Mtb-T de Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 18

gtaagctttc attccagagc ggtctcggc 29

<210> 19 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para Msm-T, Msm-HA2, Msm-EP3 de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 19

gtcatatgat gacgcgctac gactccctg 29

<210> 20 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso para Msm-T, Msm-HA2, Msm-EP3 de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 20

ataagctttc attccagcgc gtcctcggc 29

<210> 21 <211> 21 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo para pCL-P(CJ1)-Msm-T de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 21

gatatcgcag cagccatcat c 21

<210> 22 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso para pCL-P(CJ1)-Msm-T de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155

5

10

15

20

25

<400> 22

cccaagcttt cattccagcg cgtcctcg 28

<210> 23 <211> 972 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Msm-OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 23

atgacgcgct

acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca CGGcgctggt gggcctgcag 60

aacctgtcgc

cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120

ctcgaggacc

gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180

caggccgagc

gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240

aacaccggca

tGtcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300

atgccggaga

acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360

atcttcagcc

ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420

gcgcagaacc

cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480

cactacttcg

gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540

gcggggctcg

gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600

cccggcgtgc

agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660

aacatcgacg

agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720

tcggtgggct

cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgGg cgagggcata 780

ttcgcgggca

tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840

gtcaaggccg

gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900

ctgtcgaccg

gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaagggcag 960

ctatgggcat

ga 972

<210> 24 <211> 954 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Msm-T de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 <400> 24

atgacgcgct

acgactcoct gctgcaggoc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60

aacctgtcgc

cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120

ctcgaggacc

gcaacccgac oggttcoatc aaggaccgcc ocgcgctgog gatgatcgaa 180

caggccgagc

gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240

aacaccggca

tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgogtg 300

atgccggaga

acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360

atcttcagcc

ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420

gcgcagaacc

cgtogtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480

cactacttcg

gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540

gcggggctcg

gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcotgcg ogagcaogtt 600

cccggcgtgc

agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660

aacatcgacg

agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720

tcggtgggct

cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtoaogog cgagggcata 780

ttcgcgggca

totogacogg ogoggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840

gtcaaggccg

gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgaogccgg atggaagtat 900

ctgtcgaccg

gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954

<210> 25 <211> 954 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Msm-T-HA2 de Mycobacterium smegmatis CC1

10

<400> 25

atgacgcgct

acgactccct gctgcaggcc ctgggcaaca ccccgctggt gggcctgcag 60

aacctgtcgc

cccggtggga cgacgaggac gggaaacccc acgtgcggct gtgggccaag 120

ctcgaggacc

gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180

caggccgagc

gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaatc caccagcggc 240

aacaccggca

tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300

atgccggaga

acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360

atcttcagcc

ccgccgaggg cggctccaac accgcggtcg cgaccgcgaa agagcttgcc 420

gcgcagaacc

cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480

cactacttcg

gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540

gcggggctcg

gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600

cccggcgtgc

agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660

aacatcgacg

agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac cacccggttc 720

tcggtgggct

cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780

ttcgcgggca

tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840

gtcaaggccg

gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900

ctgtcgaccg

gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954

<210> 26 <211> 954 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Msm-T-EP3 de Mycobacterium smegmatis CC2

10

<400> 26

atgacgcgct acgactccct aacctgtcgc cccggtggga

gctgcaggcc ctgggcaaca cgacgaggac gggaaacccc

ccccgctggt gggcctgcag acgtgcggct gtgggccaag

60

120

ctcgaggacc

gcaacccgac cggttccatc aaggaccgcc ccgcgctgcg gatgatcgaa 180

caggccgagc

gcgacgggct gctgcagccc ggcgccacga tcctggaacc caccagcggc 240

aacaccggca

tctcgctggc catggcggcc ctgctcaagg gctacaacat gatctgcgtg 300

atgccggaga

acacgtcgat cgaacggcgc cagatcctcg agctctacgg cgcgcgcatc 360

atcttcagcc

ccgccgaggg cggctccaac gccgcggtcg cgaccgcgaa tgagcttgco 420

gcgcagaacc

cgtcgtgggt catgctgtat cagtacggca acccggccaa cagcgatgcg 480

cactacttcg

gcaccggccc cgaactgctc gcggacctgc ccgagatcac ccacttcgtc 540

gcggggctcg

gcaccaccgg gaccctgatg ggcaccggac gtttcctgcg cgagcacgtt 600

cccggcgtgc

agatcgtggc ggccgaaccg cgttacggcg agggcgtgta cgcactgcgc 660

aacatcgacg

agggcttcat ccccgagttg tacgacgccg acgtgctcac ctcccggttc 720

tcggtgggct

cgttcgacgc cgtgcgccgc acccgtgaac tcgtcacgcg cgagggcata 780

ttcgcgggca

tctcgaccgg cgcggtgttg cacgccgcgc tggggatggc cgccaaggcc 840

gtcaaggccg

gtgagcgtgc cgacatcgcg ttcgtcgtcg ccgacgccgg atggaagtat 900

ctgtcgaccg

gcgcgtacgc cggtagcctg gatgacgccg aggacgcgct ggaa 954

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un mutante de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) derivado de Mycobacterium smegmatis, que consiste en la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, excepto por la eliminación de los últimos tres a siete restos de aminoácido del extremo C de la secuencia de aminoácidos de una OPSS de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.
2. 2. El mutante de OPSS derivado de Mycobacterium smegmatis de la reivindicación 1, que carece de los tres o siete restos de aminoácido del extremo C de la secuencia de aminoácidos de una OPSS de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.
3. 3. El mutante de OPSS derivado de Mycobacterium smegmatis de la reivindicación 2, que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. 4. El mutante de OPSS derivado de Mycobacterium smegmatis de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una actividad óptima en condiciones que comprenden:

   i) la adición de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 2 mM de PLP (fosfato-5' de piridoxal) o aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mM de DTT (ditiotreitol) como un cofactor;

   ii) un intervalo de temperatura de reacción de 25 ~ 60 °C; y

   iii) un intervalo de pH de 6,0 ~ 10,0.
5. 5. Una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.
6. 6. Un vector de expresión que lleva una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.
7. 7. Un transformante transformado con el vector de expresión de la reivindicación 6.
8. 8. Un procedimiento de producción de cisteína que comprende hacer reaccionar la O-fosfo-L-serina (OPS) con sulfuros en presencia del mutante de OPSS de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.
9. 9. El procedimiento de producción de cisteína de la reivindicación 8, en el que la OPS está en una forma purificada o en una forma de un cultivo de fermentación que contiene OPS.
10. 10. El procedimiento de producción de cisteína de la reivindicación 8, que comprende un sulfuro seleccionado de entre el grupo que consiste en Na2S, NaSH, (NH^SH, H2S, y S2O3, estando todos en un estado gaseoso o líquido.
11. 11. El procedimiento de producción de cisteína de la reivindicación 8, en el que el sulfuro se utiliza en una cantidad de 0,1 ~ 3 veces respecto a una concentración molar de OPS.
12. 12. Uso del mutante de OPSS de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 en la biosíntesis de cisteína a partir de OPS.