CN104789600A

CN104789600A - 一种提高光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的方法

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Publication number: CN104789600A
Application number: CN201510202617.6A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 靳丛丛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: CN104789600B

Abstract

本发明公开了一种提高光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的方法，属于生物工程领域。本发明通过改造光滑球拟酵母，构建一株基因缺失突变菌株Cgade12Δ，对构建的菌株的胞内ATP水平进行测定，并通过平板生长实验和细胞活性分析菌株的有机酸耐受性。发现缺失基因CgADE12后，0.2％乙酸胁迫下，菌株的胞内ATP水平下降、乙酸胁迫下的生长能力升高，乙酸耐受性增强。

Description

一种提高光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的方法，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母(Candida glabrata)是微生物发酵生产丙酮酸的主要菌株。此外光滑球拟酵母在生产苹果酸,富马酸及α-酮戊二酸等有机酸方面也有巨大潜力。在发酵过程中，随着有机酸的积累，胞外pH不断下降，有机酸的解离度也持续下降从而以未解离态进入细胞。细胞质中较高的pH使得有机酸解离，释放出质子不断积累，最终导致细胞质酸化并影响细胞代谢的代谢和生长从而影响发酵过程。在工业生产中，通常加入大量NaOH、CaCO₃等中和剂以维持培养基的pH稳定。但中和剂的添加也导致了发酵液的渗透压升高和后期产物纯化成本增加。因此提高微生物的有机酸耐受性是提高产量的途径之一。在有机酸胁迫下，ATP被大量消耗，添加柠檬酸等添加剂可以通过影响菌株的ATP水平影响菌株的酸耐受性。

细胞中的AMP代谢可以影响细胞的ATP水平。光滑球拟酵母中，CgADE12是AMP的合成基因，将IMP转化成AMP。CgADE12可以通过影响AMP代谢影响ATP水平。酿酒酵母中，ADE12的缺失显著影响菌株的ATP水平，但其对菌株有机酸耐受性的影响尚不清晰。

AMP在细胞内的信号调控系统中也起着重要的作用。有机酸胁迫下，细胞内多种复杂调控手段的实验，需要细胞内信号转到系统的支持。AMPK途径是细胞内调控的全局性调控体系。AMPK中含有单个腺苷酸的结合位点，其中两个被AMP和ATP竞争结合。细胞内的任何能量变动都可以显著影响AMPK途径的活性。在不良条件下，细胞内ATP水平下降，菌株内的AMPK途径被激活。通过对靶基因的磷酸化AMPK调节下游基因的活性，细胞的耗能过程，如脂质的合成的减少，减少能量和物质的消耗，最大限度的保证细胞的活性。而菌株内的细胞内的ATP水平提高抑制AMPK途径活性，细胞的能量大量用于物质的合成和细胞的生长，提高菌株的生长性能。但此时，细胞对不良环境的耐受性降低。但当AMP代谢途径合成途径被改变时，菌株的AMP水平首先受到影响，其后ATP水平也发生明显变化。但是其对菌株的AMP途径的影响尚不清晰。

发明内容

本发明提供的一种参与光滑球拟酵母酸胁迫的腺苷基琥珀酸合酶基因CgADE12，其功能是在ATP水平及乙酸胁迫耐受的调控中发挥重要作用，敲除该基因，酵母ATP水平下降，乙酸耐受性上升。本发明提供的该调控光滑球拟酵母耐乙酸胁迫能力的腺苷基琥珀酸合酶基因CgADE12，能用于构建抗酸胁迫的有机酸生产菌株。

本发明的第一个目的是提供一种提高酵母酸胁迫能力的方法，所述方法是敲除酵母的腺苷基琥珀酸合酶基因。

所述腺苷基琥珀酸合酶，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述腺苷基琥珀酸合酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述酵母，在本发明的一种实施方式中，是光滑球拟酵母。

所述酵母，在本发明的一种实施方式中，为C.glabrataATCC 55，购自美国培养物集存库American type culture collection(ATCC)。

本发明的第二个目的是提供一种酸胁迫抗性提高的酵母，所述酵母缺失了腺苷基琥珀酸合酶基因。

所述腺苷基琥珀酸合酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述酵母，在本发明的一种实施方式中，为光滑球拟酵母。

本发明的第三个目的是提供一种所述酵母的构建方法。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中是：利用融合PCR技术将标记基因CgHIS3同基因CgADE12的左臂和右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框电击转化到光滑球拟酵母C.glabrataATCC 55的感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgADE12替换成标记基因CgHIS3，利用重组后的基因CgHIS3可合成尿嘧啶这一特征筛选缺失CgADE12基因的突变菌株，将验证正确的突变菌株即为酸胁迫抗性提高的酵母。

本发明还要求保护所述酵母在有机酸生产中的应用。

本发明的有益效果：

(1)通过CgADE12基因的敲除，显著提高了酵母在有机酸胁迫下的生长性能。在0.2％乙酸胁迫下，Cgade12Δ的OD值较wt高22.93％以上；在0.4％丙酮酸胁迫下Cgade12Δ的OD值较wt高19.21％以上；在0.6％苹果酸胁迫下，Cgade12Δ的OD值较wt高38.85％。

(2)通过CgADE12基因的敲除，显著提高了酵母的耐酸胁迫能力。Cgade12Δ在0.5％乙酸胁迫下的细胞活力较wt提高30.27％(8h)、142.26％(20h)；在1％丙酮酸下存活率提高了87.94％(4h)、89.48％(8h)、60.10％(12h)；2％苹果酸胁迫下的活细胞数则缓慢增加，其细胞活性分别较wt提高7.08％(12h)、43.76％(24h)、568.72％(36h)倍。

(3)CgADE12基因缺失菌株，在酸胁迫条件下，具有显著提高的胞内pH值、H⁺-ATPase的活性，以及显著降低的胞内ROS水平，这可能是基因缺失菌株有机酸耐受性提高的原因。

附图说明

图1：基因缺失菌株的验证；其中M泳道代表10000bp的DNA marker；“-”泳道代表以菌株wt基因组模板进行PCR的对照；“1”泳道为菌株Cgaade12Δ的阳性转化子基因组为模板P7/P8为验证引物进行的PCR验证；

图2：胞内ATP水平变化；

图3：wt、Cgade12Δ在0.2％乙酸胁迫下的生长性能；

图4：wt、Cgade12Δ在丙酮酸、苹果酸胁迫下的生长性能；其中A为丙酮酸胁迫，B为苹果酸胁迫，C为0.6％丙酮酸胁迫，D为0.8％苹果酸胁迫。

具体实施方式

ATP水平测定：取适量对数期的菌体，液氮研磨破碎细胞，加入适量预冷的PBS溶液，4℃，12000rpm离心2min，利用HPLC迅速测定上清。色谱条件：Agilent ZORBAX SB-Aq反相柱，检测波长UV 254nm，柱温35℃，进样量10uL，流速1mL/min，流动相为磷酸盐缓冲液(10.93g NaH₂PO₄，3.04g Na₂HPO₄，3.22g四正丁基溴化铵，超纯水定容至1L)：乙腈＝86:14。利用试剂盒测定上清的可溶蛋白量。ATP水平＝ATP浓度/蛋白浓度。实验数据是至少三次独立实验的平均值。

平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％Yeast Nitrogen BasewithoutAminoAcids，2％Glucose，pH 5.2)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝l.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在YNB-0.2％乙酸固体培养基上，30℃培养2天，观察菌体的生长情况并拍照。

生长曲线测定：将对数期的待测菌株接种于YNB-0.2％乙酸液体培养基，初始OD₆₀₀＝0.1，30℃摇床培养，每隔一定的时间取菌液200μL，测定其在600nm处的吸光值，生长曲线以A₆₀₀为纵坐标，以时间为横坐标绘制。

细胞活性测定：将对数期的待测菌株接种于pH 2.0的YNB液体培养基，初始OD₆₀₀＝0.1，30℃摇床培养，每隔一定的时间取菌液200μL，稀释适当倍数(每块平板上的单菌落数控制在30-300个)，涂布YPD(1％Yeast Extract，2％Peptone，2％Glucose)固体培养基，24h后进行单菌落计数，活菌浓度根据下面的公式计算：

活菌浓度＝单菌落数×5×稀释倍数(个·mL^-1)

定义0h的细胞活性为100％，并以此为基础计算每隔2h在pH 2.0中各菌株的细胞活性。

胞内环境比较

(A)胞内pH测定

(1)标准曲线的绘制：取适量wt对数生细胞，利用相应pH(2-8，0.5)的柠檬酸磷酸(CP)缓冲液洗涤细胞，并重悬细胞至OD600＝0.5，加入终浓度为0.5mM CCCP，平衡细胞内外pH；加入终浓度为160nM荧光探针CFDA-SE，30℃孵育10min。菌体用不同pH的柠檬酸-磷酸缓冲液洗涤3次，并重悬细胞。取200uL菌液加入黑色酶标板中，使用多功能酶标仪采用终点法测定激发波长490nm和430nm，发射波长为525nm处的荧光强度，增益调节至100。标准曲线以pH值做为横坐标，FI490/FI430为纵坐标。数据为至少三次试验的平均值。

(2)胞内pH的测定

待测菌株在YNB培养基中培养至对数期，转接YNB及YNB-0.2％AC培养基，调节OD600＝2，30℃ 200rpm培养2h。4℃ 5000rpm离心2min，收集菌体。50mM CP缓冲液洗涤细胞两次，并重悬细胞至OD600＝0.5。加入终浓度为160μM的CFDA-SE，涡旋混匀10s，37℃温育1h。CP缓冲液洗涤除去未交联的探针，并重新悬浮菌体于250uL缓冲液中，30℃温育30min使细胞从负载中恢复。取200uL菌液加入黑色酶标板中，多功能酶标仪使用终点法测定菌液在激发波长490nm和430nm，发射波长为525nm处的荧光强度，增益为100。计算FI490/FI430的值并根据标准曲线计算pH值。数据为至少三次试验的平均值。

(B)H+-ATPase的活性测定

(1)无机磷标准曲线的测定：配制溶液，(1)磷酸标准液[称取0.1433g在105℃干燥的磷酸二氢钾，加入硫酸溶液(30mL定容至100mL)100mL，定容至100mL，取1mL稀释100倍](2)钼酸铵硫酸溶液[1.25g钼酸铵和7.5mL浓硫酸混匀，冷却后定容至50mL，两周内使用](3)1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液[将无水亚硫酸钠3.75g、亚硫酸氢钠70.5g、1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.525g混匀，取1.5g加水溶解，定容至10mL]。分别取20、40、60、80、100、120、140、160、180μL至96孔板中，加入25μL钼酸铵硫酸溶液、10μL1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液并加超纯水至250μL，迅速吹吸混匀，室温静置30。酶标仪测定其在720nm处的吸光值。标准曲线以无机磷为横坐标，吸光值为纵坐标。

(2)总膜的提取：挑取待测菌株单菌落转接25/250mLYNB液体培养基，30℃,200rpm培养12h至对数期。取适量对数期的细胞，PBS洗涤后，4℃，9000g离心10min。去上清，1mL溶液A(Tris 100mM，EDTA 5mM，DTT 2mM，pH 10.7)重悬。并加入5mL溶液B(蔗糖0.33M，EDTA 5mM，DTT 2mM，Tris-HCl 0.1M，pH 8.0)稀释。4℃，1000g离心3min。收集上清，4℃，3000g离心5min。收集上清，4℃，19000g离心45min，得到总的膜碎片。去上清，用100μL溶液C(甘油20％，EDTA0.1mM，DTT 0.1mM，Tris-HCl 10mM，pH 7.5)重悬，直接用于实验或-70℃保存。

(3)H⁺-ATPase的活性检测：测定膜的蛋白浓度，取5μg。加入120μL混合物D(ATP 5mM，MgSO₄10mM，KCl 50mM，MES 50mM，KNO₃50mM，NaN₃5mM，钼酸铵0.2mM)，混合物在30℃温育30min。去离子水进行适当稀释。在96孔板中加入50uL培养物、25μL钼酸铵硫酸溶液、10μL1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液和25μL柠檬酸钠溶液，加水至250uL，迅速吹吸混匀，室温静置30min。酶标仪测定反应液在720nm处的吸光值。利用无机磷曲线计算培养液释放的无机磷浓度。定义酶单位为100ug总蛋白释放1umol无机磷。

(C)活性氧水平测定

待测菌株在YNB培养基中培养至对数期，转接YNB及YNB-0.2％AC培养基，调节OD₆₀₀＝1，30℃ 200rpm培养2h。4℃ 5000rpm离心2min收集菌体。用PBS缓冲液洗并重悬菌体至OD₆₀₀＝1.0。加入终浓度为100μM的DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)，28℃培养30min。PBS洗涤除去未交联的探针，并重悬菌体。取200uL细胞悬液至黑色酶标板。多功能酶标仪终点法测定激发波长488nm和发射波长530nm处的荧光强度，增益100。取剩余细胞悬液进行适当稀释，并涂布YPD培养基。30℃培养24h。计数单菌落，取50-500为有效数据。ROS＝吸光值/500细胞。实验结果为至少三次实验的平均值。

实施例1：基因敲除菌的构建

以购自美国典型培养物集存库(ATCC)的C.glabrataATCC 2001(wt)基因组为模板，分别以P1/P6、P2/P5、P3/P4为引物，扩增出待敲除基因CgADE12(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的左臂(L)、组氨酸基因(M)和右臂(R)，经融合PCR构建敲除框CgADE12-LMR。出发菌株C.glabrataATCC 55因缺失组氨酸基因不能在MM筛选培养基(葡萄糖20g·L^-1，尿素7g·L^-1，乙酸钠3g·L^-1，磷酸二氢钠5g·L^-1，七水硫酸镁0.8g·L^-1，琼脂粉20g·L^-1)上生长，而突变菌株经同源重组后，因标记基因组氨酸表达而在MM培养基上生长。对转化子进行PCR验证，如图1所示，提取转化子的基因组，发现以P7/P8为引物时，野生型菌株wt条带在3.0kb，而转化子获得2.0kb左右的条带，与敲除框大小一致。将验证正确的突变菌株命名为Cgade12Δ。

表1 引物

编号	序列(5’-3’)	SEQIDNO号
			P1	CGGGATCCTGACAAATGTGTTTTCTTCTG	3
P2	TGTTTGCTAGTTATTAATATAGAATGGCGTTTGTTAAGAGGG	4
			P3	ACTAAGGGTGTCCTAGCATAGTTGAAAAGCAAATTTAAGTCT	5
P4	CGGAATTCCCTGAAATTATCGACTGTATG	6

P5	GACTTAAATTTGCTTTTCAACTATGCTAGGACACCCTTAGTG	7
			P6	TCTTAACAAACGCCATTCTATATTAATAACTAGCAAACAATC	8
P7	ATCAAAACTGGCAATACCTAACT	9
			P8	TTCTTAGGTAGAGCATTTGCG	10

实施例2：突变前后胞内ATP的变化

YNB培养基中对Cgade12Δ胞内的腺苷酸含量进行HPLC测定，结果(图2)显示：Cgade12Δ中ATP水平为72.21，较wt降低7.69％。乙酸胁迫下对Cgade12Δ中的胞内ATP进行测定，发现wt、Cgade12ΔATP水平为40.25、37.61，分别较YNB培养基中下降了48.72％、48.61％。Cgade12Δ的ATP水平较wt低7.5％。CgADE12的缺失明显降低菌株内的ATP水平，乙酸胁迫下，CgADE12的缺失加大了与wt间的ATP水平差异。

实施例3：菌株突变前后的耐酸胁迫能力的比较

(1)乙酸胁迫

比较了不同乙酸胁迫下，wt、Cgade12Δ的的生长情况。结果显示，在0.2％乙酸胁迫下，Cgade12Δ的OD值较wt高22.93％以上(如图3所示)。说明CgADE12的缺失使得菌株在乙酸胁迫下的生长性能提高。

同时还比较了0.5％乙酸胁迫下菌株的细胞活力，结果显示Cgade12Δ较wt提高30.27％(8h)、142.26％(20h)。说明高浓度乙酸胁迫下Cgade12Δ的细胞活力较wt升高。

上述数据说明CgADE12在细胞活力的维持中发挥显著作用。

(2)丙酮酸胁迫

比较了0％-0.4％丙酮酸浓度下wt、Cgade12Δ的的生长情况。结果如图4所示。结果表明，在0.4％丙酮酸胁迫下Cgade12Δ的OD值较wt高19.21％以上。在1％丙酮酸胁迫下分析菌株的细胞活性，结果表明，相对wt，Cgade12Δ的存活率分别提高了87.94％(4h)、89.48％(8h)、60.10％(12h)。

(3)苹果酸胁迫

比较了0％-0.8％苹果酸浓度下wt、Cgade12Δ的的生长情况。结果显示，在0.6％苹果酸胁迫下，Cgade12Δ的OD值较wt高38.85％。2％苹果酸胁迫下，wt的细胞活性不断下降，菌株Cgade12Δ的活细胞数则缓慢增加，其细胞活性分别较wt提高7.08％(12h)、43.76％(24h)、568.72％(36h)倍(如表1所示)。

耐酸胁迫能力试验表明，菌株发生腺苷基琥珀酸合酶缺失突变后，其耐酸胁迫的能力显著增强。

表1 菌株在2％苹果酸胁迫下的存活率

实施例4：菌株突变前后细胞内环境的比较

(1)胞内pH分析

在无YNB培养中，wt、Cgade12Δ的胞内pH分别是6.15、6.11，均稳定在6.1-6.2之间，细胞间的差异不显著。乙酸胁迫下，由于细胞内质子的积累，Cgade12Δ的胞内pH下降至5.8。对照无胁迫条件，下降了4.76％。与wt相比，Cgade12Δ的胞内pH值上升1.40％。

(2)H⁺-ATPase活性

H⁺-ATPase活性是细胞乙酸耐受能力的重要因素。wt、Cgade12Δ在YNB培养基H⁺-ATPase活性分别为84.00U、86.52U。无胁迫条件下菌株的H⁺-ATPase活性差异不明显。乙酸胁迫2h后，wt、Cgade12Δ、的H⁺-ATPase上升为104.92、114.03U。分别较无胁迫条件下增加了31.80％、27.07％。此时Cgade12Δ的H⁺-ATPase，较wt，上升8.68％。Cgade12Δ较高的H⁺-ATPase活性可能是其保持胞内pH稳定的主要原因之一。

(3)ROS水平

胞内的ROS水平受到胞内pH水平的影响，且可以显著影响菌株的生长性能。在无乙酸胁迫下，菌株wt、Cgade12Δ的ROS水平分别为4.76、5.45。对照wt，Cgade12Δ的ROS水平分别升高10.53％。乙酸胁迫下，wt、Cgade12Δ的ROS水平分别增加到22.14、8.93，较YNB培养基中分别提高了4.65、1.64倍。相较wt，Cgade12Δ降低59.67％；上述数据说明Cgade12Δ的缺失菌降低胞内的ROS水平，是有机酸耐受性提高的原因之一。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高酵母酸胁迫能力的方法，其特征在于，所述方法是敲除酵母的腺苷基琥珀酸合酶基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺苷基琥珀酸合酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺苷基琥珀酸合酶腺苷基琥珀酸合酶的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是光滑球拟酵母。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为C.glabrata ATCC 55。

6.一种酸胁迫抗性提高的酵母，其特征在于，所述酵母缺失了腺苷基琥珀酸合酶基因。

7.根据权利要求6所述的酵母，其特征在于，所述腺苷基琥珀酸合酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

8.根据权利要求6所述的酵母，其特征在于，所述酵母为光滑球拟酵母。

9.一种构建权利要求6所述酵母的方法，其特征在于，所述方法是：利用融合PCR技术将标记基因CgHIS3同基因CgADE12的左臂和右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框电击转化到光滑球拟酵母C.glabrata ATCC 55的感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgADE12替换成标记基因CgHIS3，利用重组后的基因CgHIS3可合成尿嘧啶这一特征筛选缺失CgADE12基因的突变菌株，将验证正确的突变菌株即为酸胁迫抗性提高的酵母。

10.权利要求6-8任一所述酵母在有机酸生产中的应用。