WO2013058448A1 - 내분비계 장애물질 노출에 대응하는 바다송사리 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법 - Google Patents

내분비계 장애물질 노출에 대응하는 바다송사리 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법 Download PDF

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gene
protein
subunit
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염승식
우선옥
원효경
이애경
류재천
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한국해양연구원
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a marine pinefish gene corresponding to endocrine disrupting chemical (EDC) exposure and a method for diagnosing aquatic environmental pollution using the same.
  • EDC endocrine disrupting chemical
  • Endocrine disrupting chemical is a compound that enters the body from outside and disrupts the physiology of hormones in the endocrine organs and is known as an environmental hormone.
  • Well known are dioxin, PCB, PAH, furan, phenol and the like.
  • 17 ⁇ -estradiol which is a type of endocrine disruptor, is the most potent estrogens of estrogens of mammals (estrone (E1), 17 ⁇ -estradiol and estriol). , E3)]. In humans, it is mainly formed in the ovaries and placenta of women of childbearing age, but also in the adipose tissue of men and menopausal women. The synthesized form of 17 ⁇ -estradiol has been used to control various symptoms associated with menopause in women, such as vascular dyskinesia, vulva and vaginal contraction disorders, osteoporosis and the like.
  • Estrone and estriol including 17 ⁇ -estradiol secreted by humans and animals are discharged to the environment by sewage treatment plants and animal wastes. These released steroid hormones pose a threat to ecosystem stability.
  • the normal endocrine system function of males is inhibited through the action such as vitellogenin synthesis and induction of femaleization in male fish, which leads to the deterioration of the reproductive ability of males and the disturbance of ecosystem. It is expected. Therefore, there is a need to develop a method for predicting the presence of 17 ⁇ -estradiol, predicting the biological change caused by exposure, and early diagnosis.
  • Bisphenol A is a chemical that has been widely used in the manufacture of plastic products since the 1950s. It is used not only for plastic but also for the production of epoxy resins applied to the inside of food cans. The main influx of bisphenol A is to take food stored in containers made from bisphenol A. In particular, it is known that more bisphenol A is released when the surface of the container is damaged or when heat is applied. In addition, bisphenol A is directly discharged into the environment through waste water and domestic sewage of a plastics factory, or eluted from plastic waste disposed of in the environment.
  • Bisphenol A thus released is known to affect the growth, reproduction and development of aquatic life in the environment. Invertebrates, fish, amphibians and reptiles have been shown to have endocrine disrupting effects at actual concentrations in non-acute toxicity environments. In Canada, 55% of females in non-contaminated aquatic fish populations accounted for 85% of females, whereas 85% of females in endocrine disruptors, including bisphenol A. This suggests that endocrine obstructions are likely to cause serious ecological disturbances by destroying the sex ratios of biological groups.
  • bisphenol A like estrogen, is known as an endocrine disruptor of organisms, and abnormal expression of genes through inhibition of developmental and developmental disorders, attention deficit hyperactivity disorder through nervous system disturbances, malformation and DNA methylation inhibition. It is known to cause. It is also expected to stimulate the development of various cancer cells.
  • Canada designated bisphenol A as a toxic substance for the first time in the world, and is currently prohibited for use in infant feeding bottles in the European Union and Canada. Therefore, it is necessary to develop a method for predicting the presence of bisphenol A, predicting biological changes caused by exposure to the aquatic system, and diagnosing the disease early.
  • Living organisms have evolved defense mechanisms to maintain homeostasis in response to environmental changes such as environmental pollution, climate change and pathogenic microbial infections. Most of these bioprotective mechanisms appear to regulate the amount of specific proteins by actively changing the amount of expression of certain genes. Therefore, by identifying specific genes for specific changes and monitoring the changes in their expression levels, not only the information on environmental changes in a specific region, but also the information on the impact of these environmental changes on life phenomena and the health of ecosystems can be obtained. have.
  • sea risk fish or Oryzias javanicus
  • Oryzias javanicus Inoue and Takei, Zoological
  • sea risk fish or Oryzias javanicus
  • E2 17 ⁇ estradiol
  • 17 ⁇ -estradiol or bisphenol may be used as a biomarker capable of detecting exposure to endocrine disruptor 17 ⁇ -estradiol or a biomarker capable of detecting endocrine disruptor bisphenol A exposure.
  • a biomarker capable of detecting exposure to endocrine disruptor 17 ⁇ -estradiol or a biomarker capable of detecting endocrine disruptor bisphenol A exposure There is no research confirming the gene expression of the sea pod that changes in response to the exposure of A.
  • the present inventors have attempted to discover biomarkers corresponding to marine environmental pollution such as endocrine obstruction exposure to sea pods, specifically biomarkers capable of confirming 17 ⁇ -estradiol exposure and expression of these gene biomarkers.
  • biomarkers capable of confirming the amount change and the exposure of bisphenol A and the expression amount change of these gene biomarkers were identified, and the present invention was completed by confirming that the biomarkers could be used in a method for diagnosing aquatic environmental pollution.
  • An object of the present invention is to determine whether exposure to 17 ⁇ -estradiol (E2), a kind of endocrine disrupting chemical (EDC), aquatic ecosystem pollution detection or diagnostic microarray chip and water using the same
  • the present invention provides a method for detecting whether the ecosystem is exposed to 17 ⁇ -estradiol or a method for diagnosing environmental pollution.
  • Another object of the present invention is to determine whether exposure to bisphenol A (Bisphenol A, BPA), which is a kind of endocrine disruptor, aquatic ecosystem pollution detection or diagnostic microarray chip and whether or not bisphenol A exposure of aquatic ecosystem using the same It provides a method for detecting or diagnosing environmental pollution.
  • BPA Bisphenol A
  • the present invention provides an oligonucleotide comprising all or part of the sea trellis gene sequence whose expression is increased or decreased in response to exposure to 17 ⁇ -estradiol (E2), an endocrine barrier
  • E2 17 ⁇ -estradiol
  • an endocrine barrier Provided is a microarray chip for detecting exposure to 17 ⁇ -estradiol and diagnosing environmental pollution in which oligonucleotide molecules complementary to the oligonucleotides are integrated.
  • the present invention also provides a method for detecting exposure to 17 ⁇ -estradiol and diagnosing environmental pollution using the gene.
  • the present invention also provides a kit for stress detection and environmental pollution diagnosis according to 17 ⁇ -estradiol exposure, comprising the microarray chip.
  • the present invention also provides a kit for detecting stress and diagnosing environmental pollution according to 17 ⁇ -estradiol exposure, comprising primer pairs complementary to the gene and capable of amplifying the gene.
  • the present invention also provides a use of a gene whose expression changes in response to 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample for detecting the presence of 17 ⁇ -estradiol in a sample and manufacturing a microarray chip for diagnosing environmental pollution.
  • the present invention also provides the use of a gene whose expression changes in response to 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample for the detection of 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample and the manufacture of a kit for diagnosing environmental pollution.
  • the present invention is an oligonucleotide comprising all or a portion of the sea trout gene sequence whose expression is increased or decreased in response to exposure to the endocrine barrier bisphenol A (BPA), or complementary to the oligonucleotide
  • BPA endocrine barrier bisphenol A
  • a microarray chip for detecting bisphenol A exposure and diagnosing environmental pollution in which oligonucleotide molecules are integrated.
  • the present invention also provides a method for detecting bisphenol A exposure and diagnosing environmental pollution using the gene.
  • the present invention also provides a kit for stress detection and environmental pollution diagnosis according to bisphenol A exposure, including the microarray chip.
  • the present invention also provides a kit for stress detection and environmental pollution diagnosis according to bisphenol A exposure, comprising primer pairs complementary to the gene and capable of amplifying the gene.
  • the present invention also provides a use of a gene whose expression changes in response to BPA exposure in a sample for detecting BPA exposure in a sample and manufacturing a microarray chip for diagnosing environmental pollution.
  • the present invention provides a use of a gene whose expression changes in response to BPA exposure in a sample for the detection of BPA exposure in a sample and the manufacture of a kit for diagnosing environmental pollution.
  • the method for diagnosing environmental pollution of aquatic ecosystems uses a gene of a sea urchin whose expression level changes in response to 17 ⁇ -estradiol, which is an endocrine obstacle, or a gene of a sea urchin whose expression level changes in response to bisphenol A. Specifically, since the genes down- or up-regulated in the sea trout exposed to 17 ⁇ -estradiol or the genes down- or up-regulated in the sea trout exposed to bisphenol A were identified, the gene of the sea trellis corresponding to the 17 ⁇ -estradiol was identified.
  • a diagnostic method using a primer pair complementary to a gene integrated in a microarray chip according to the present invention and amplifying the gene, and a kit including the primer pair may also be useful for stress detection or health diagnosis of marine ecosystems. Can be used.
  • the present invention has discovered a marine trout gene whose expression changes in response to exposure of 17 ⁇ -estradiol, an endocrine disruptor, or a marine trance gene whose expression changes in response to exposure of bisphenol A, among which Genes that are deeply related to self-defense mechanisms were identified. Therefore, the microarray chip incorporating the marine trance gene whose expression level changes with respect to the 17 ⁇ -estradiol exposure can be used to detect stress of the 17 ⁇ -estradiol exposed sample and to detect contamination of the water ecosystem. In addition, a microarray chip incorporating a marine songi gene whose expression level changes with respect to bisphenol A exposure can be used to detect stress in a bisphenol A exposed sample and to detect contamination of aquatic ecosystems.
  • the present invention provides genes for detecting 17 ⁇ -estradiol exposure and diagnosing environmental pollution, which are composed of the following groups:
  • SEQ ID NO: 1 Dimethylglycine dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 2 Frazier dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 3 Fatty acid binding protein 10 liver basic
  • SEQ ID NO: 4 Gene (Claudin)
  • gene described by SEQ ID NO: 5 Cytochrome P450 2P3
  • gene described by SEQ ID NO: 6 Aldolase B
  • gene described by SEQ ID NO: 7 Cytochrome c-1, cyc1
  • SEQ ID NO: 8 The gene described (Selenoprotein M), the gene described in SEQ ID NO: 9 (ATPase H + transporting V1 subunit F, atp6v1f), the gene described in SEQ ID NO: 10 (Cytochrome oxidase subunit I, COI), the gene described in SEQ ID NO: 11 ATP citrate lyase isoform 2), the gene described by SEQ ID NO:
  • Genes that increase expression in response to 17 ⁇ -estradiol in the gene group may include, but are not limited to, the following genes:
  • SEQ ID NO: 7 The gene described in SEQ ID NO: 7 (Cytochrome c-1, cyc1), the gene described in SEQ ID NO: 8 (Selenoprotein M), the gene described in SEQ ID NO: 9 (ATPase H + transporting V1 subunit F, atp6v1f), SEQ ID NO: 10
  • the gene described (Cytochrome oxidase subunit I, COI), the gene described in SEQ ID NO: 11 (ATP citrate lyase isoform 2), the gene described in SEQ ID NO: 12 (Ribosomal protein L13a, rpl13a), the gene described in SEQ ID NO: 13 Cytochrome c oxidase subunit I), the gene described in SEQ ID NO: 14 (Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), the gene described in SEQ ID NO: 15 (Exs-related protein), the gene described in SEQ ID NO: 16 (Cy
  • a gene whose expression is reduced in response to 17 ⁇ -estradiol may include, but is not limited to:
  • SEQ ID NO: 1 Dimethylglycine dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 2 Frazier dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 3 Fatty acid binding protein 10 liver basic
  • SEQ ID NO: 4 Gene
  • SEQ ID NO: 5 Cytochrome P450 2P3
  • SEQ ID NO: 6 Aldolase B
  • SEQ ID NO: 39 Olesaccharyltransferase complex subunit, ostc
  • SEQ ID NO: 40 Gene (Abhydrolase domain containing 11).
  • the microarray chip may be an oligonucleotide or a complementary strand molecule thereof, which is a whole or a fragment thereof, of a nucleic acid sequence of a gene involved in a self-defense mechanism against any one or more external stress selected from the following groups, but is not limited thereto. I never do that:
  • the gene may be derived from Oriszias javanicus, but is not limited thereto.
  • the microarray chip may detect a reaction corresponding to 17 ⁇ -estradiol contamination of the sea song, but is not limited thereto.
  • the present inventors exposed sea pods to 100 ⁇ g / L of 17 ⁇ -estradiol for 24 hours and 48 hours, respectively, in order to discover sea pod genes corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure.
  • the changing genes were examined. Specifically, cDNA was synthesized after each mRNA was isolated from sea trout (control) or sea trout (experimental) tissue cultured in seawater containing 17 ⁇ -estradiol. PCR fragments were used to amplify gene fragments with altered expression levels. As a result, 56 genes with increased or decreased expression were selected in response to 17 ⁇ -estradiol exposure (see Table 1 and Table 2).
  • Estrogen-based steroid hormones such as 17 ⁇ -estradiol, inhibit the normal endocrine system function of males by inducing vitelogenin synthesis and femaleization in male fish, resulting in lowered fertility of males and disrupting ecosystems May result. Therefore, it is possible to confirm the stress and health status of marine organisms according to the change of external environment by checking the change of gene expression, which is the cause of physiological and metabolic changes, and use these genes as biomarkers for diagnosing the health of the environment and organisms. Can be.
  • marker genes and microarray using the same for diagnosis of the condition and stress detection caused by persistent toxic substance contamination such as 17 ⁇ -estradiol It can be usefully used as a chip.
  • step 2) hybridizing cDNA labeled with different fluorescent materials of step 2) with the microarray chip;
  • the fluorescent material of step 2) is Cy3, Cy5, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate ( rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) and rhodamine may be selected from the group consisting of, but not limited to, fluorescent materials known to those skilled in the art can be used.
  • FITC poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate
  • rhodamine-B-isothiocyanate rhodamine-B-isothiocyanate
  • rhodamine may be selected from the group consisting of, but not limited to, fluorescent materials known to those skilled in the art can be used.
  • the microarray chip of step 4) can be used as long as the gene is loaded. All of the above procedures are preferably performed according to a general microarray chip experimental protocol, but are not limited thereto.
  • RT-PCR real-time reverse transcript polymerase chain reaction
  • step 2) comparing the gene product of step 2) with a control group to determine the expression level, it provides a 17 ⁇ - estradiol exposure detection and environmental pollution diagnostic method.
  • the primer pair of step 2) is complementary to the gene selected in the present invention, and any primer pair capable of amplifying the gene can be used.
  • the present inventors have identified 56 gene groups whose expression is increased or decreased in response to 17 ⁇ -estradiol exposure, and it was found that the genes can be used to diagnose the condition of the environment following 17 ⁇ -estradiol exposure. Therefore, the gene corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure of the present invention can be usefully used for stress detection and environmental pollution diagnosis using a microarray chip or real-time RT-PCR.
  • the present invention provides a kit for detecting the exposure and pollution detection 17 ⁇ - estradiol comprising the microarray chip.
  • the kit may additionally include a sea trout.
  • the kit may additionally include any one selected from the group consisting of a streptavidin-alkali dephosphorase conjugate, a chemical substance consisting of a chemilurorensce and a chemiluminescent substance. However, it is not limited thereto.
  • the kit is any one selected from the group of reaction reagents consisting of a buffer used for hybridization, reverse transcriptase for synthesizing cDNA from RNA, dNTPs and rNTP (premixed or separated feed), a marker reagent, and a wash buffer. It may be additionally included, but is not limited thereto.
  • the inventors By identifying 56 groups of genes whose expression increases or decreases in response to 17 ⁇ -estradiol exposure, the inventors have found that the genes can be used to diagnose conditions of the environment corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure. . Therefore, the gene corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure of the present invention can be usefully used as a kit for stress detection and environmental pollution diagnosis including a microarray chip.
  • the present invention provides a kit for detecting 17 ⁇ -estradiol exposure and environmental pollution, comprising a primer pair complementary to a gene integrated in a microarray chip and capable of amplifying the gene.
  • the primer pair is complementary to the gene, and both forward and reverse primer pairs designed to amplify the gene and designed for amplification products of 100 to 300 bp are available.
  • the kit may additionally include a sea trout.
  • the kit may further include any one or more selected from the group of reverse reagents for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (premixed or separated feed), DNA polymerase, and a reaction reagent group.
  • any one or more selected from the group of reverse reagents for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (premixed or separated feed), DNA polymerase, and a reaction reagent group may further include any one or more selected from the group of reverse reagents for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (premixed or separated feed), DNA polymerase, and a reaction reagent group.
  • it is not limited thereto.
  • the present invention also provides the use of the following genes whose expression changes in response to 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample for the detection of 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample and the manufacture of microarray chips for diagnosing environmental pollution;
  • SEQ ID NO: 1 Dimethylglycine dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 2 Frazier dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 3 Fatty acid binding protein 10 liver basic
  • SEQ ID NO: 4 Gene (Claudin)
  • gene described by SEQ ID NO: 5 Cytochrome P450 2P3
  • gene described by SEQ ID NO: 6 Aldolase B
  • gene described by SEQ ID NO: 7 Cytochrome c-1, cyc1
  • SEQ ID NO: 8 The gene described (Selenoprotein M), the gene described in SEQ ID NO: 9 (ATPase H + transporting V1 subunit F, atp6v1f), the gene described in SEQ ID NO: 10 (Cytochrome oxidase subunit I, COI), the gene described in SEQ ID NO: 11 ATP citrate lyase isoform 2), the gene described by SEQ ID NO:
  • the present invention provides the use of the following genes whose expression changes in response to 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample for the detection of 17 ⁇ -estradiol exposure in a sample and for the manufacture of a kit for diagnosing environmental pollution;
  • SEQ ID NO: 1 Dimethylglycine dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 2 Frazier dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 3 Fatty acid binding protein 10 liver basic
  • SEQ ID NO: 4 Gene (Claudin)
  • gene described by SEQ ID NO: 5 Cytochrome P450 2P3
  • gene described by SEQ ID NO: 6 Aldolase B
  • gene described by SEQ ID NO: 7 Cytochrome c-1, cyc1
  • SEQ ID NO: 8 The gene described (Selenoprotein M), the gene described in SEQ ID NO: 9 (ATPase H + transporting V1 subunit F, atp6v1f), the gene described in SEQ ID NO: 10 (Cytochrome oxidase subunit I, COI), the gene described in SEQ ID NO: 11 ATP citrate lyase isoform 2), the gene described by SEQ ID NO:
  • the present inventors have identified 56 gene groups whose expression is increased or decreased in response to 17 ⁇ -estradiol exposure, and it was found that the genes can be used to diagnose the condition of the environment following 17 ⁇ -estradiol exposure. Therefore, it can be usefully used as a kit for detecting 17 ⁇ -estradiol whether it contains a primer pair for a gene corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure of the present invention and for diagnosing environmental pollution.
  • the present invention also provides a microarray chip for detecting whether bisphenol A (BPA) is exposed in a sample in which an oligonucleotide or a complementary strand molecule of the nucleic acid sequence of any one or more genes selected from the following groups is integrated. :
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • gene described in SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • gene described in SEQ ID NO: 74 MHC Class Region I, gene depicted in SEQ ID NO: 75 (vitellogenin II), gene depicted in SEQ ID NO: 76 (retinoid X receptor beta (RXRB) gene), gene depicted in SEQ ID NO: 77 (protein tyrosine phosphatase-like, member b)
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein), the gene described in SEQ ID NO: 79 (HSPC038 protein), the gene described in SEQ ID NO: 80 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), described in SEQ ID NO: 81 Gene (proteasome subunit, beta type 8), gene (SEQ ID NO: 82), gene (SEQ ID NO: 83)
  • the gene may be derived from Oriszias javanicus, but is not limited thereto.
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • SEQ ID NO: 74 MHC Class I region, gene described by SEQ ID NO: 75 (vitellogenin II)
  • gene described by SEQ ID NO: 76 retinoid X receptor beta (RXRB) gene
  • gene described by SEQ ID NO: 77 protein tyrosine phosphatase-like, member b
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein
  • the gene described in SEQ ID NO: 79 HSPC038 protein
  • the gene described in SEQ ID NO: 80 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 81 Genes (proteasome subunit, beta type 8)
  • genes described in SEQ ID NO: 82 trypsinogen
  • genes described in SEQ ID NO: 81 Genes (prote
  • the gene described in SEQ ID NO: 114 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), the gene described in SEQ ID NO: 115 (40S ribosomal protein S19), the gene described in SEQ ID NO: 116 (alcohol dehydrogenase Class VI, ADH8 ), The gene described in SEQ ID NO: 117 (malate dehydrogenase), the gene described in SEQ ID NO: 118 (carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), the gene described in SEQ ID NO: 119 (alpha-2-macroglobulin), to SEQ ID NO: 120
  • the gene described in SEQ ID NO: 124 (kelch-like ECH-associated protein
  • SEQ ID NO: 163 Arylamine N-acetyl transferase
  • SEQ ID NO: 164 Apolipoprotein E1
  • SEQ ID NO: 165 Baseigin
  • SEQ ID NO: 166 Complement component C8 beta
  • the gene described in SEQ ID NO: 167 C1q-like adipose specific protein
  • the gene described in SEQ ID NO: 135 Catalase
  • the gene described in SEQ ID NO: 168 Calcium binding protein P22
  • described in SEQ ID NO: 169 Gene (Ceruloplasmin), gene described in SEQ ID NO: 131 (Complement factor B / C2-B), gene described in SEQ ID NO: 170 (Chitinase), gene described in SEQ ID NO: 171 (Choline kinase), described in SEQ ID NO: 130 Gene (Choriogenin L), gene described in SEQ ID NO: 172 (Delta-6
  • step 2) hybridizing cDNA labeled with different fluorescent materials of step 2) with the microarray chip;
  • the sample may be any one selected from the group consisting of biological samples, food samples, chemical samples, industrial samples, clinical samples, and environmental samples, but is not limited thereto.
  • the fluorescent material of step 2) is Cy3, Cy5, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate (rhodamine-B- isothiocyanate, RITC) and rhodamine may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • RNA of step 1) Performing quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction (qRT-PCR) using RNA of step 1) using primer pairs complementary to each of the following genes and capable of amplifying the genes step;
  • qRT-PCR quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • gene described in SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • gene described in SEQ ID NO: 74 MHC Class Region I, gene depicted in SEQ ID NO: 75 (vitellogenin II), gene depicted in SEQ ID NO: 76 (retinoid X receptor beta (RXRB) gene), gene depicted in SEQ ID NO: 77 (protein tyrosine phosphatase-like, member b)
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein), the gene described in SEQ ID NO: 79 (HSPC038 protein), the gene described in SEQ ID NO: 80 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), described in SEQ ID NO: 81 Gene (proteasome subunit, beta type 8), gene (SEQ ID NO: 82), gene (SEQ ID NO: 83)
  • the sample may be any one selected from the group consisting of biological samples, food samples, chemical samples, industrial samples, clinical samples, and environmental samples, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a kit for detecting whether bisphenol A is exposed, including the microarray chip.
  • the kit may additionally include any one selected from the group consisting of a streptavidin-alkali dephosphorase conjugate, a chemical substance consisting of a chemilurorensce and a chemiluminescent substance. However, it is not limited thereto.
  • the kit is any one selected from the group of reaction reagents consisting of a buffer used for hybridization, reverse transcriptase for synthesizing cDNA from RNA, dNTPs and rNTP (premixed or separated feed), a marker reagent, and a wash buffer. It may be additionally included, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a kit for detecting bisphenol A exposure, comprising a primer pair complementary to each of the following genes and capable of amplifying the gene:
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • gene described in SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • gene described in SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • gene described in SEQ ID NO: 74 MHC Class Region I, gene depicted in SEQ ID NO: 75 (vitellogenin II), gene depicted in SEQ ID NO: 76 (retinoid X receptor beta (RXRB) gene), gene depicted in SEQ ID NO: 77 (protein tyrosine phosphatase-like, member b)
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein), the gene described in SEQ ID NO: 79 (HSPC038 protein), the gene described in SEQ ID NO: 800 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), described in SEQ ID NO: 81 Gene (proteasome subunit, beta type 8), gene (SEQ ID NO: 82), gene (SEQ ID NO: 83)
  • the primer pair may be one or more of the following, but is not limited thereto:
  • Primer pair 1 forward primer of SEQ ID NO: 182 and reverse primer of SEQ ID NO: 183; Primer pair 2: forward primer of SEQ ID NO: 184 and reverse primer of SEQ ID NO: 185; Primer pair 3: forward primer of SEQ ID NO: 186 and reverse primer of SEQ ID NO: 187; Primer pair 4: forward primer of SEQ ID NO: 188 and reverse primer of SEQ ID NO: 189; Primer pair 5: forward primer of SEQ ID NO: 190 and reverse primer of SEQ ID NO: 191; Primer pair 6: forward primer of SEQ ID NO: 192 and reverse primer of SEQ ID NO: 193; Primer pair 7: forward primer of SEQ ID NO: 194 and reverse primer of SEQ ID NO: 195; Primer pair 8: forward primer of SEQ ID NO: 196 and reverse primer of SEQ ID NO: 197; Primer pair 9: forward primer of SEQ ID NO: 198 and reverse primer of SEQ ID NO: 199; Primer pair 10: forward primer of SEQ ID NO
  • the sea trout in order to discover the sea trout gene corresponding to the BPA, the sea trout was exposed to seawater and general seawater containing 76 ⁇ g / L of BPA for 48 hours, and then the mRNA of the sea trout was extracted. CDNA was synthesized, and genes of varying expression levels were examined using a microarray. As a result, 96 genes whose expression was increased or decreased in response to BPA exposure were selected (see Table 5). Among these genes, 28 genes related to the self-defense mechanism against external stress were selected, and primers for quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction (qRT-PCR) were designed and synthesized. (See Table 6). The synthesized primers were used for qRT-PCR, genes with varying expression levels were examined, and changes in expression levels were confirmed (see Table 7).
  • qRT-PCR quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction
  • the present invention also provides the use of the following genes whose expression changes in response to BPA exposure in a sample for the detection of BPA exposure in a sample and the manufacture of microarray chips for diagnosing environmental pollution;
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • gene described in SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • gene described in SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • gene described in SEQ ID NO: 74 MHC Class I region
  • gene described by SEQ ID NO: 75 vitellogenin II
  • gene described by SEQ ID NO: 76 retinoid X receptor beta (RXRB) gene
  • gene described by SEQ ID NO: 77 protein tyrosine phosphatase-like, member b)
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein), the gene described in SEQ ID NO: 79 (HSPC038 protein), the gene described in SEQ ID NO: 80 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), described in SEQ ID NO: 81 Gene (proteasome subunit, beta type 8), gene (SEQ ID NO: 82), gene (SEQ ID NO: 83) (carnitine O-
  • the present invention provides the use of the following genes whose expression changes in response to BPA exposure in a sample for the detection of BPA exposure in a sample and the manufacture of a kit for diagnosing environmental pollution;
  • SEQ ID NO: 71 proline rich 6
  • gene described in SEQ ID NO: 72 telomerase reverse transcriptase gene
  • gene described in SEQ ID NO: 73 uridine phosphorylase 2
  • gene described in SEQ ID NO: 74 MHC Class I region
  • gene described by SEQ ID NO: 75 vitellogenin II
  • gene described by SEQ ID NO: 76 retinoid X receptor beta (RXRB) gene
  • gene described by SEQ ID NO: 77 protein tyrosine phosphatase-like, member b)
  • the gene described in SEQ ID NO: 78 (TRAF-binding protein), the gene described in SEQ ID NO: 79 (HSPC038 protein), the gene described in SEQ ID NO: 80 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), described in SEQ ID NO: 81 Gene (proteasome subunit, beta type 8), gene (SEQ ID NO: 82), gene (SEQ ID NO: 83) (carnitine O-
  • the males of the sea larvae were transferred to 3 L beakers containing 2 L of filtered seawater, and each was incubated for 24 hours.
  • the 5 males of the sea squid males of Example ⁇ 1-1> were exposed to 100 ⁇ g / L of 17 ⁇ -estradiol for 24 hours and 48 hours, respectively.
  • 5 males of the sea squid male of Example ⁇ 1-1> were exposed to BPA 76 ⁇ g / L for 48 hours.
  • the exposure concentration was determined at a very low level, equivalent to 1/100 of the BPA Lythal concentration 50 (LC50) of Oryzias latipes.
  • the fish were moved to ice water one by one, stunned momentarily, their heads were cut off, their ships split, and their livers were removed.
  • LC50 BPA Lythal concentration 50
  • TRI Reagent solution (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) between the 17 ⁇ -estradiol exposure test group (24 and 48 hours) obtained in Example ⁇ 1-2> or sea stalks of the unexposed control group 1 ML was added, homogenized using a glass homogenizer, and left at room temperature for 5 minutes. 200 ⁇ l of chloroform was added thereto, mixed well, left at room temperature for 10 minutes, and centrifuged for 15 minutes (12,000 ⁇ g, 4 ° C). The supernatant was taken, 500 ⁇ l of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • RNA from purified exposed and control groups was labeled with Cy3 and Cy5 using Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus (Agilent Technologies, USA) as follows. Specifically, 1 ⁇ g of RNA was mixed with a dT-promoter primer and a MMLV-Reverse transcriptase, and reverse transcription was performed at 40 ° C. for 2 hours. Then, linear amplification was performed for 2 hours at 40 ° C. by adding T7 polymerase. Through the amplification process, the experimental and control samples were labeled with Cy3-CTP and Cy5-CTP, respectively.
  • Fluorescently labeled cDNA samples were purified using a Qiagen PCR purification kit and eluted with distilled water. Purified fluorescence-cDNA samples were added to hybridization buffer (3x SSC, 0.3% SDS, 50% formamide, 20 ⁇ g Cot-1 DNA, 20 ⁇ g yeast tRNA). Concentration with microcon YM-30 gave a hybridization mixture. The hybridization mixture was denatured by heating to 95 ° C. for 3 minutes and centrifuged at 12,000 g for 30 seconds to lower the temperature of the heated hybridization compound. Coverslips were prepared on the prepared Sakura cDNA microarray and the denatured hybridization mixture was pipetted.
  • the microarray was placed in a GT-Hyb chamber (Chamber) and reacted at 65 ° C. for 16 hours. After the hybridization was completed, the microarray was removed from the chamber, the washing process was performed in the following order, and the microarray was rotated to dry and stored in the dark until scanning.
  • Experimental seafish microarrays were scanned using an Axon GenePix 4000B scanner (Axon Instrument, USA). In the GenePix Pro 6.0 program, each point is drawn from the scanned image using a grid file and quantified to include a GPR file including analysis values such as Cy5 / Cy3 intensity and ratio of each point. Got.
  • Example ⁇ 2-4> seven genes of the following species, which are deeply related to the self-defense mechanism against external stress, were selected among the genes of the marine larva whose expression levels changed more than two times after 17 ⁇ -estradiol exposure. .
  • Apolipoprotein B Cytochrome P450 1A, CYP1A, Glutamate dehydrogenase 1b, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Transferrin , Vitellogenin 1 and Selenoprotein M.
  • CDNA was synthesized using the AB high capacity RAN-to-cDNA Kit (Applide Biosystems, USA) as a template of the RNA extracted by the method of Example ⁇ 2-1>. An amount corresponding to 1 ⁇ g of RNA was aliquoted and titrated to 9 ⁇ l by adding distilled water. Add 10 ⁇ l of 2 ⁇ RT buffer and 1 ⁇ l of 20 ⁇ enzyme mix, mix well, precipitate by centrifugation, and react at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the reaction was completed by heating to 95 ° C. for 5 minutes. The synthesized cDNA was stored at -20 ° C.
  • 0.5 ⁇ g (corresponding to about 10 ng / ⁇ l) of the synthesized cDNA was added 0.8 ⁇ l of the primer pair of the gene and 10 ⁇ l of the 2 SYBR1 mixture. The final amount was titrated to 20 ⁇ l using distilled water. 40 cycles of PCR were carried out under the conditions of 95 ° C 10 minutes, 95 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 seconds.
  • CT values of the gene of interest ( ⁇ -actin) and the gene of interest for each sample were compared, and the relative standard curve method was used to quantify the expression change of the gene of interest as a relative value (Table 4).
  • TRI Reagent solution (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) was placed between the BPA-exposed test group (48 hours) or the non-exposed control group obtained in Example ⁇ 1-2>, and the glass homogeneity. Homogenized using a glass homogenizer and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 200 ⁇ l of chloroform was added thereto, mixed well, left at room temperature for 10 minutes, and centrifuged for 15 minutes (12,000 ⁇ g, 4 ° C). The supernatant was taken, 500 ⁇ l of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • RNA from purified exposed and control groups was labeled with Cy3 and Cy5 using Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus (Agilent Technologies, USA) as follows. Specifically, 1 ⁇ g of RNA was mixed with a dT-promoter primer and a MMLV-Reverse transcriptase, and reverse transcription was performed at 40 ° C. for 2 hours. Then, linear amplification was performed for 2 hours at 40 ° C. by adding T7 polymerase. Through the amplification process, the experimental and control samples were labeled with Cy3-CTP and Cy5-CTP, respectively.
  • Fluorescently labeled cDNA samples were purified using a Qiagen PCR purification kit and eluted with distilled water. Purified fluorescence-cDNA samples were added to hybridization buffer (3x SSC, 0.3% SDS, 50% formamide, 20 ⁇ g Cot-1 DNA, 20 ⁇ g yeast tRNA). Concentration with microcon YM-30 gave a hybridization mixture. The hybridization mixture was denatured by heating to 95 ° C. for 3 minutes and centrifuged at 12,000 g for 30 seconds to lower the temperature of the heated hybridization compound. Coverslips were prepared on the prepared Sakura cDNA microarray and the denatured hybridization mixture was pipetted.
  • the microarray was placed in a GT-Hyb chamber (Chamber) and reacted at 65 ° C. for 16 hours. After the hybridization was completed, the microarray was removed from the chamber, the washing process was performed in the following order, and the microarray was rotated to dry and stored in the dark until scanning.
  • Experimental seafish microarrays were scanned using an Axon GenePix 4000B scanner (Axon Instrument, USA). In GenePix Pro 6.0 program, each point from the scanned image is drawn using a grid file and quantified to include a GPR file including analysis values such as Cy5 / Cy3 intensity and ratio of each point. Got.
  • Arylamine N-acetyl transferase (SEQ ID NO: 163), Apolipoprotein E1 (SEQ ID NO: 164), Basigin (SEQ ID NO: 165), Complement component C8 beta (SEQ ID NO: 166), C1q-like adipose specific protein (SEQ ID NO: 167), Catalase, Calcium binding protein P22 (SEQ ID NO: 168), Ceruloplasmin (SEQ ID NO: 169), Complement factor B / C2-B, Chitinase (SEQ ID NO: 170), Choline kinase (SEQ ID NO: 171), Choriogenin L, Delta-6 fatty acyl desaturase (SEQ ID NO: 172), Delta 6-desaturase, Glutaminase (SEQ ID NO: 173), Glutathione S-transferase, Hepcidin (SEQ ID NO: 174), Leukocyte elastase inhibitor, Lipoprotein lipase (SEQ
  • CDNA was synthesized using the AB high capacity RAN-to-cDNA Kit (Applide Biosystems, USA) as a template of the RNA extracted by the method of Example ⁇ 4-1>. An amount corresponding to 1 ⁇ g of RNA was aliquoted and titrated to 9 ⁇ l by adding distilled water. Add 10 ⁇ l of 2 ⁇ RT buffer and 1 ⁇ l of 20 ⁇ enzyme mix, mix well, precipitate by centrifugation, and react at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the reaction was completed by heating to 95 ° C. for 5 minutes. The synthesized cDNA was stored at -20 ° C.
  • 0.5 ⁇ g (corresponding to about 10 ng / ⁇ l) of the synthesized cDNA was added 0.8 ⁇ l of the primer pair of the gene and 10 ⁇ l of the 2 SYBR1 mixture. The final amount was titrated to 20 ⁇ l using distilled water. 40 cycles of PCR were performed under the conditions of 95 ° C 10 minutes, 95 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 seconds.
  • Genes of sea pods corresponding to 17 ⁇ -estradiol exposure which is a type of endocrine disruptor in the present invention, or genes of sea pods corresponding to BPA exposure, endocrine disruption of aquatic ecosystems and the situation of aquatic ecosystems It can be usefully used as a component of biosensor for monitoring and diagnosing In addition, it can be used as a biomarker and sensor that can predict future pathological phenomena by specifying metabolic / physiological changes of the organism based on the functions of the genes presented. Can be effectively used.

Abstract

본 발명은 내분비계 장애물질에 대응하는 바다송사리 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법에 관한 것으로써, 구체적으로 본 발명에 따른 수생태계 환경오염 진단 방법은 17β-에스트라디올에 대응하여 발현량이 변화하는 바다송사리의 유전자 또는 비스페놀 A에 대응하여 발현량이 변화하는 바다송사리의 유전자를 이용하는 것으로써, 17β-에스트라디올에 노출된 바다송사리에서 변화되는 유전자 또는 비스페놀 A에 노출된 바다송사리에서 변화되는 유전자들을 확인하였으므로, 상기 17β-에스트라디올에 대응하는 바다송사리의 유전자 또는 비스페놀 A에 대응하는 바다송사리의 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 진단방법 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트를 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

내분비계 장애물질 노출에 대응하는 바다송사리 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법
본 발명은 내분비계 장애물질(Endocrine disrupting chemical, EDC) 노출에 대응하는 바다 송사리 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법에 관한 것이다.
내분비계 장애물질(Endocrine disrupting chemical, EDC)은 생체 외부에서 들어와 내분비 기관 안에서 호르몬의 생리작용을 교란시키는 화합물이며, 환경 호르몬으로 알려져 있다. 잘 알려진 것으로서 다이옥신, PCB, PAH, 푸란, 페놀 등이 있다.
구체적으로, 내분비계 장애물질의 일종인 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2)은 포유동물의 가장 강력한 에스트로젠 계열의 스테로이드 호르몬[에스트론(estrone, E1), 17β-에스트라디올 및 에스트리올(estriol, E3)]이다. 인간의 경우 가임기 여성의 난소와 태반에서 주로 형성되나, 남성 및 폐경 여성의 지방조직에서도 만들어진다. 합성된 형태의 17β-에스트라디올은 여성의 폐경과 관련된, 혈관운동장애, 외음부 및 질 수축장애, 골다공증 등과 같은 여러 가지 증상의 조절에 이용되고 있다. 인간 및 동물에 의해 분비된 17β-에스트라디올을 포함한 에스트론 및 에스트리올 등이 하수처리장 및 동물폐기물 등에 의해서 환경으로 배출된다. 이와 같이 배출된 스테로이드 호르몬들은 생태계의 안정에 위협이 되고 있다. 즉, 수컷 어류에서의 비텔로제닌(vitellogenin) 합성과 암컷화를 유도 등과 같은 작용을 통해 수컷의 정상적인 내분비계 기능을 저해되고, 이로 인해 수컷의 생식능력이 저하되어 생태계를 교란하는 결과를 초래할 것으로 예상된다. 따라서 17β-에스트라디올의 존재 여부를 예측하고, 이에 노출됨으로써 야기되는 생물학적 변화를 예측하고, 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
아울러, 내분비계 장애물질의 다른 예로 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)이 있다. 비스페놀 A는 1950년대부터 플라스틱 제품의 제조에 널리 사용되어 온 화학물질로써, 플라스틱뿐만 아니라, 식품 캔의 내부에 바르는 에폭시수지의 제조에도 사용된다. 비스페놀 A의 주된 체내 유입 경로는 비스페놀 A를 원료로 만들어진 용기에 보관된 음식을 섭취하는 것이다. 특히 용기의 표면이 손상되어 있거나, 열을 가했을 경우 더 많은 양의 비스페놀 A가 방출되어 나오는 것으로 알려져 있다. 또한, 비스페놀 A는 플라스틱 공장의 폐수 및 생활하수를 통해 직접 환경으로 유출되거나, 환경에 버려진 플라스틱 쓰레기에서 용출된다.
이와 같이 배출된 비스페놀 A는 환경에서 수생생물의 성장, 생식 및 발생과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 급성 독성을 나타내지 않는 환경에서의 실제 농도에서 무척추동물, 어류, 양서류 및 파충류에서 내분비계 장애 효과를 보이는 것으로 확인되기도 하였다. 캐나다에서의 연구결과, 오염되지 않는 수계에서의 특정 어류 집단의 경우 암컷이 55%인데 반해, 비스페놀 A를 포함한 내분비계 장애물질에 오염된 수계에서는 암컷이 85%로 나타났다. 이는 내분비계 장애물질들이 생물집단의 성비를 파괴함으로써, 심각한 생태적 교란을 초래할 가능성이 높다는 것을 암시한다. 아울러, 비스페놀 A는 에스트로겐과 같이 생물의 내분비계 장애물질로 알려져 있으며, 발생과 발달 저해, 신경계 교란 등을 통한 주의력결핍과잉행동장애, 기형 형성 및 DNA 메틸레이션(methylation)의 저해를 통한 유전자 발현 이상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 다양한 암세포의 발달을 자극하는 것으로 예상되고 있다. 2010년 9월 캐나다는 세계최초로 비스페놀 A를 독성물질로 지정하였으며, 현재 유럽연합과 캐나다에서는 유아 젖병에 사용이 금지되어 있는 실정이다. 따라서 수생태계를 대상으로 비스페놀 A의 존재 여부를 예측하고, 이에 노출됨으로써 야기되는 생물학적 변화를 예측하고, 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
생물들은 환경오염, 기후변화 및 병원성 미생물의 감염 등과 같은 외부 환경변화에 대응하여, 항상성을 유지하기 위해 생체방어기작을 진화시켜왔다. 이 생체방어기작의 대부분은 특정 유전자의 발현량을 능동적으로 변화시켜, 특정 단백질의 양을 조절하는 것으로 나타난다. 따라서 특정 변화에 대한 특이적인 유전자들을 발굴하여 이들의 발현량 변화를 모니터링한다면, 특정지역의 환경변화에 관한 정보뿐만 아니라, 이러한 환경변화가 생명현상에 미치는 영향 및 생태계의 건강에 관한 정보를 얻을 수 있다.
구체적으로, 담수와 해수의 유해화학물질에 대한 환경위해성평가에 지구에 존재하는 모든 수계(담수와 해수)에 서식 가능한 어류인 바다송사리(또는 자바송사리, 학명: Oryzias javanicus)(Inoue와 Takei, Zoological Sci., 19, 727-734, 2002)가 적용 가능할 것으로 예상된다. 현재까지 유해화학물질에 대한 바다송사리의 단백질 및 유전자 발현 변화에 대해 다음과 같은 연구가 있었다. 17β 에스트라디올(17β estradiol, E2) 노출에 대한 생식력 변화와 수컷 간 조직에서의 비텔로제닌(vitellogenin) 단백질 농도 변화에 대한 연구(Imai 등, Mar. Poll. Bull., 51, 708-714, 2005); E2 노출에 의한 수컷 간 조직에서의 코리오제닌(choriogenin) H 및 L 유전자의 발현 변화(Yu 등, Aquat. Toxicol., 77, 348-358, 2006); 다양한 중금속 노출에 대한 간 조직에서의 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자의 발현량 변화(Woo 등, Mar. Biotech., 8, 654-662, 2006); 환경내의 에스트론(estrone, E1) 노출에 의한 바다송사리의 생식력 및 간 조직내의 비텔로제닌 단백질 농도 변화(Imai 등, Environ. Toxicol. Chem., 26, 726-731, 2007)에 대한 연구 결과가 보고된 바 있다. 또한 6 종의 주요 중금속(Ag, Cd, Cr, Cu, Ni, Zn)에 노출된 이후(Woo 등, Comp. Biochem. Physiol. C, 149, 289-299, 2009); 유기인계 농약인 이프로벤포스(Iprobenfos) 노출(Woo 등, Comp. Biochem. Physiol. C, 149, 427-432, 2009); 폴리염화 캄펜인 톡사펜(Toxaphene) 노출(Woo 등, Comp. Biochem. Physiol. C, 153, 355-361, 2011) 이후 나타나는 항산화효소 및 스트레스 관련 유전자들의 발현량 변화에 대한 연구보고가 있다. 하지만 아직까지, 내분비계 장애물질인 17β-에스트라디올 노출 여부를 검출할 수 있는 생체 지표 또는 내분비계 장애물질인 비스페놀 A 노출 여부를 검출할 수 있는 생체 지표로 사용하기 위해, 17β-에스트라디올 또는 비스페놀 A의 노출에 대응하여 변화하는 바다송사리의 유전자 발현을 확인한 연구는 없는 실정이다.
본 발명자들은 바다송사리를 대상으로 내분비계 장애물질 노출과 같은 해양환경오염에 대응하는 생체지표의 발굴을 시도하였으며, 구체적으로 17β-에스트라디올 노출 여부를 확인할 수 있는 생체지표 및 이들 유전자 생체지표들의 발현량 변화와 비스페놀 A 노출 여부를 확인할 수 있는 생체지표 및 이들 유전자 생체지표들의 발현량 변화를 규명하였고, 이를 수생태계 환경오염 진단 방법에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 내분비계 장애물질(Endocrine disrupting chemical, EDC)의 일종인 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2)에 대한 노출 여부 확인, 수생태계 환경오염 검출 또는 진단용 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 수생태계의 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 또는 환경오염 진단 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 내분비계 장애물질의 일종인 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)에 대한 노출 여부 확인, 수생태계 환경오염 검출 또는 진단용 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 수생태계의 비스페놀 A 노출 여부 검출 또는 환경오염 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내분비계 장애물질인 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 바다송사리 유전자 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출에 따른 스트레스 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출에 따른 스트레스 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 시료내 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 변화하는 유전자의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 시료내 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 변화하는 유전자의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 내분비계 장애물질인 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA) 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 바다송사리 유전자 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된, 비스페놀 A 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한, 비스페놀 A 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는, 비스페놀 A 노출에 따른 스트레스 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 비스페놀 A 노출에 따른 스트레스 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 시료내 BPA 노출에 대응하여 발현이 변화하는 유전자의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 시료내 BPA 노출에 대응하여 발현이 변화하는 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 수생태계 환경오염 진단 방법은 내분비계 장애물질인 17β-에스트라디올에 대응하여 발현량이 변화하는 바다송사리의 유전자 또는 비스페놀 A에 대응하여 발현량이 변화하는 바다송사리의 유전자를 이용하는 것으로써, 구체적으로 17β-에스트라디올에 노출된 바다송사리에서 하향 또는 상향 조절되는 유전자 또는 비스페놀 A에 노출된 바다송사리에서 하향 또는 상향 조절되는 유전자들을 확인하였으므로, 상기 17β-에스트라디올에 대응하는 바다송사리의 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 진단방법 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트 또는 비스페놀 A에 대응하는 바다송사리의 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 진단방법 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트를 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용한 진단 방법 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 키트도 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 내분비계 장애물질인 17β-에스트라디올의 노출에 대응하여 발현이 변화하는 바다송사리 유전자 또는 비스페놀 A의 노출에 대응하여 발현이 변화하는 바다송사리 유전자를 발굴하였으며, 그 중에서, 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 깊이 관련되어 있는 유전자를 발굴하였다. 따라서, 상기 17β-에스트라디올 노출에 대하여 발현량이 변화하는 바다송사리 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩을 17β-에스트라디올 노출 시료의 스트레스 검출 및 수생태계의 오염을 검출하는데 이용할 수 있다. 아울러, 비스페놀 A 노출에 대하여 발현량이 변화하는 바다송사리 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩을 비스페놀 A 노출 시료의 스트레스 검출 및 수생태계의 오염을 검출하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 하기 군으로 구성된, 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 유전자를 제공한다:
서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
상기 유전자군에서 17β-에스트라디올에 대응하여 발현이 증가하는 유전자는 하기의 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit I), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen, 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1 , GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)) 및 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)).
상기 유전자군에서 17β-에스트라디올에 대응하여 발현이 감소하는 유전자는 하기의 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc) 및 서열번호 40으로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11).
상기 마이크로어레이 칩은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 외부 스트레스에 대한 자기 방어적 기작에 관련된 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 이의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
서열 번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 1A, CYP1A)), 서열 번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
상기 유전자는 바다송사리(Oryzias javanicus)로부터 유래되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 마이크로어레이 칩은 바다송사리의 17β-에스트라디올 오염에 대응하는 반응을 검출하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명자들은 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 바다송사리 유전자를 발굴하기 위하여, 바다송사리를 17β-에스트라디올 100 ㎍/L에 각각 24시간과 48시간 동안 노출한 후 바다송사리의 cDNA를 합성하여 발현량이 변화하는 유전자들을 조사하였다. 구체적으로, 일반해수에서 배양한 바다송사리(대조군) 또는 17β-에스트라디올을 포함하는 해수에서 배양한 바다송사리(실험군) 조직에서 mRNA를 각각 분리한 후, cDNA를 합성하였다. PCR을 이용하여 발현량이 변화한 유전자 단편을 증폭하였다. 그 결과, 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소한 유전자 56개를 선별하였다(표 1 및 표 2 참조). 17β-에스트라디올과 같은 에스트로겐 계열의 스테로이드 호르몬은 수컷 어류에서의 비텔로제닌 합성과 암컷화를 유도함으로써 수컷의 정상적인 내분비계 기능이 저해되고, 이로 인해 수컷의 생식능력을 저하시켜 생태계를 교란하는 결과를 초래할 수 있다. 그러므로 생리 및 대사 변화의 원인인 유전자 발현량의 변화를 확인함으로써 외부 환경 변화에 따른 해양 생물의 스트레스 및 건강상태를 확인할 수 있고, 이들 유전자들을 환경 및 생물의 건강을 진단할 수 있는 생체지표로 이용할 수 있다.
따라서, 상기 유전자들은 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 유전자 발현에 유의적인 변화가 나타났으므로, 17β-에스트라디올과 같은 잔류성 독성 물질 오염에 따른 상태 진단 및 스트레스 검출을 위한 마커 유전자 및 이를 이용한 마이크로어레이 칩으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 마이크로어레이 칩은 상기 유전자가 탑재된 것이라면 모두 사용 가능하다. 상기 모든 절차는 일반적인 마이크로어레이 칩 실험 프로토콜에 따라 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 상기 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 프라이머 쌍은 본 발명에서 선별된 유전자와 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍이라면 모두 사용가능하다.
본 발명자들은 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 56개의 유전자군을 규명함으로써, 상기 유전자를 이용하여 17β-에스트라디올 노출에 따른 환경의 상태를 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 유전자는 마이크로어레이 칩 또는 실시간 RT-PCR을 이용한 스트레스 검출 및 환경오염 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 바다송사리를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명자들은 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 56개의 유전자군을 규명함으로써, 상기 유전자를 이용하여 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 환경의 상태를 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 유전자는 마이크로어레이 칩을 포함하는 스트레스 검출 및 환경오염 진단용 키트로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트를 제공한다.
상기 프라이머 쌍은 상기 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭 산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용가능하다.
상기 키트는 바다송사리를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 키트는 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), DNA 중합효소 및, 세척 완충용액으로 구성된 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 시료내 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 변화하는 하기 유전자의 용도를 제공한다;
서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
아울러, 본 발명은 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 시료내 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 변화하는 하기 유전자의 용도를 제공한다;
서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
본 발명자들은 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 56개의 유전자군을 규명함으로써, 상기 유전자를 이용하여 17β-에스트라디올 노출에 따른 환경의 상태를 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 유전자에 대한 프라이머 쌍을 포함하는 17β-에스트라디올 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 시료내 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA) 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩을 제공한다:
서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A- Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
상기 유전자는 바다송사리(Oryzias javanicus)로부터 유래되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95으로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor ⅡA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111으로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)) 및 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA)로 구성된 군으로 부터 선택되는 유전자는 비스페놀 A 노출에 대응하여 발현이 감소하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class VI, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-IV4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)) 및 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자는 비스페놀 A 노출에 대응하여 발현이 증가하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 135로 기재되는 유전자(Catalase), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 131로 기재되는 유전자(Complement factor B/C2-B), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 130으로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 143으로 기재되는 유전자(Delta 6-desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 162로 기재되는 유전자(Glutathione S-transferase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 110으로 기재되는 유전자(Leukocyte elastase inhibitor), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 136으로 기재되는 유전자(Ring finger protein 141), 서열 번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 73으로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 2), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243))로 구성된 군으로 부터 선택되는 유전자는 외부 스트레스에 대한 기작에 관련된 유전자일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 비스페놀 A 노출 여부 검출 방법을 제공한다.
상기 시료는 생체시료, 식품시료, 화학시료, 공업시료, 임상시료 및 환경시료로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 피검시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 하기 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A- Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 비스페놀 A 노출 여부 검출 방법을 제공한다.
상기 시료는 생체시료, 식품시료, 화학시료, 공업시료, 임상시료 및 환경시료로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는, 비스페놀 A 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 비스페놀 A 노출 여부 검출용 키트를 제공한다:
서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 800으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 66으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A- Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 108로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
상기 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
프라이머 쌍 1: 서열번호 182의 정방향 프라이머 및 서열번호 183의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 2: 서열번호 184의 정방향 프라이머 및 서열번호 185의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 3: 서열번호 186의 정방향 프라이머 및 서열번호 187의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 4: 서열번호 188의 정방향 프라이머 및 서열번호 189의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 5: 서열번호 190의 정방향 프라이머 및 서열번호 191의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 6: 서열번호 192의 정방향 프라이머 및 서열번호 193의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 7: 서열번호 194의 정방향 프라이머 및 서열번호 195의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 8: 서열번호 196의 정방향 프라이머 및 서열번호 197의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 9: 서열번호 198의 정방향 프라이머 및 서열번호 199의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 10 : 서열번호 200의 정방향 프라이머 및 서열번호 201의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 11 : 서열번호 202의 정방향 프라이머 및 서열번호 203의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 12 : 서열번호 204의 정방향 프라이머 및 서열번호 205의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍13 : 서열번호 206의 정방향 프라이머 및 서열번호 207의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 14 : 서열번호 208의 정방향 프라이머 및 서열번호 209의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 15 : 서열번호 210의 정방향 프라이머 및 서열번호 211의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 16 : 서열번호 212의 정방향 프라이머 및 서열번호 213의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 17 : 서열번호 214의 정방향 프라이머 및 서열번호 215의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 18 : 서열번호 216의 정방향 프라이머 및 서열번호 217의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 19 : 서열번호 218의 정방향 프라이머 및 서열번호 219의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 20 : 서열번호 220의 정방향 프라이머 및 서열번호 221의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 21 : 서열번호 222의 정방향 프라이머 및 서열번호 223의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 22 : 서열번호 224의 정방향 프라이머 및 서열번호 225의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 23 : 서열번호 226의 정방향 프라이머 및 서열번호 227의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 24 : 서열번호 228의 정방향 프라이머 및 서열번호 229의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍25 : 서열번호 230의 정방향 프라이머 및 서열번호 231의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 26 : 서열번호 232의 정방향 프라이머 및 서열번호 233의 역방향 프라이머; 프라이머 쌍 27 : 서열번호 234의 정방향 프라이머 및 서열번호 235의 역방향 프라이머; 및 프라이머 쌍 28 : 서열번호 236의 정방향 프라이머 및 서열번호 237의 역방향 프라이머.
본 발명의 구체적인 실시예에서, BPA에 대응하는 바다송사리 유전자를 발굴하기 위하여, 바다송사리를 BPA 76 ㎍/L를 포함하는 해수 및 일반해수에 각각 48시간 동안 노출한 후, 바다송사리의 mRNA를 추출하였고, cDNA를 합성하였으며, 마이크로어레이(Microarray)를 이용하여 발현량이 변화하는 유전자들을 조사하였다. 그 결과, BPA 노출에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 유전자 96개의 유전자를 선별하였다(표 5 참조). 이들 유전자 중 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 관련되어 있는 28종의 유전자를 선정하였고, 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 위한 프라이머를 디자인하고 합성하였다(표 6 참조). 합성된 프라이머를 이용하여 qRT-PCR하였고, 발현량이 변화하는 유전자들을 조사하였으며, 발현량 변화를 확인하였다(표 7 참조).
또한, 본 발명은 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 시료내 BPA 노출에 대응하여 발현이 변화하는 하기 유전자의 용도를 제공한다;
서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96으로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
아울러, 본 발명은 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 시료내 BPA 노출에 대응하여 발현이 변화하는 하기 유전자의 용도를 제공한다;
서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96으로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
따라서, BPA 노출에 대응하여 바다송사리의 유전자 발현에 유의적인 변화가 나타났으므로, 발현이 증가 또는 감소한 바다송사리의 유전자를 BPA와 같은 잔류성 독성 물질 노출에 따른 상태 진단 및 스트레스 검출을 위한 마커 유전자 및 이를 이용한 마이크로어레이 칩으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예1> 바다송사리의 배양 및 내분비계 장애물질인 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 또는 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA) 노출
<1-1> 바다송사리의 배양
바다송사리는 세 종류의 필터(10, 10 및 1 μm)를 거친 자연해수에 배양하였다. 수중 히터를 이용하여 수온은 25℃로 고정하였으며, 하루에 한번 아르테미아 살리나(Artemia salina) 유생을 먹이로 공급하였다.
<1-2> 17β-에스트라디올 또는 BPA 노출
배양수조에서 사육중인 바다송사리 수컷을 여과된 해수 2 L가 담긴 3 L 비커로 10 마리씩 옮기고, 24시간 동안 순치시켰다. 상기 실시예 <1-1>의 바다송사리 수컷 5 개체를 17β-에스트라디올 100 ㎍/L에 각각 24시간과 48시간 동안 노출하였다. 아울러, 상기 실시예 <1-1>의 바다송사리 수컷을 5 개체씩을 BPA 76 ㎍/L에 48시간 동안 노출하였다. 노출 농도는 송사리(Oryzias latipes)의 BPA 반수치사농도(Lethal concentration 50, LC50)의 1/100에 해당되는 매우 낮은 수준의 농도로 결정하였다. 바다송사리를 한 마리씩 얼음물로 옮겨, 순간적으로 기절시킨 후, 머리를 잘라내고, 배를 갈라, 간을 적출하였다.
<실시예 2> 17β-에스트라디올 노출에 의한 유전자 변화 측정
<2-1> RNA의 분리
상기 실시예 <1-2>에서 수득한 17β-에스트라디올 노출 시험군(24 시간 및 48 시간) 또는 노출하지 않은 대조군의 바다송사리 간에 TRI Reagent 용액(Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) 1 ㎖를 넣고, 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 균질화하고, 실온에 5 분간 방치하였다. 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞고, 실온에서 10 분간 방치하고, 15 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)하였다. 상층액을 취하여, 이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕를 넣고, 상온에 5 분간 방치하였다. 약 20 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 후, 용액을 제거하여 침전물만을 취했다. 상기 침전물에 70 % 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5 분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켰다. 건조 후, 적당량의 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)-처리수에 용해하였다.
<2-2> Cy3 및 Cy5 표지
정제된 노출군 및 대조군의 전체 RNA는 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus(Agilent Technologies, USA)를 사용하여 다음과 같이 Cy3 및 Cy5로 표지하였다. 구체적으로, RNA 1 ㎍을 dT-프로모터 프라이머(dT-promoter primer)와 MMLV-역전사효소(MMLV-Reverse transcriptase)와 혼합하여 40℃에서 2시간 동안 역전사반응을 수행하였다. 그런 다음, T7 중합효소(T7 polymerase)를 첨가하여 40℃에서 2시간 동안 선형 증폭(linear amplification)을 수행하였다. 이와 같은 증폭과정을 통해 실험군 및 대조군의 시료를 각각 Cy3-CTP와 Cy5-CTP로 표지하였다.
<2-3> 혼성화(Hybridization) 및 스캐닝(scanning)
형광물질이 라벨링된 cDNA 시료를 Qiagen PCR purification kit을 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다. 정제된 형광표지-cDNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)(3x SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 ㎍ Cot-1 DNA, 20 ㎍ 효모균(yeast) tRNA)에 첨가한 후, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물을 만들었다. 상기 혼성화 혼합물을 95℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고, 12,000 g에서 30초간 원심분리하여 가열된 혼성화 화함물의 온도를 떨어뜨렸다. 제조된 바다송사리 cDNA 마이크로어레이(microarray)에 커버슬립(coverslip)을 덮고, 변성시킨 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)하였다. 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(Chamber)에 넣고 65℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 혼성화가 끝난 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 아래의 순서대로 세척과정을 수행하고, 마이크로어레이를 회전하여 건조한 후 스캐닝(scanning)할 때까지 암실에서 보관하였다. 실험이 완료된 바다송사리 마이크로어레이를 Axon GenePix 4000B scanner(Axon Instrument, USA)를 사용하여 스캔하였다. GenePix Pro 6.0 program에서, 스캔 이미지로부터 각 점을 그리딩 파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율등의 분석값이 포함된 GPR 파일(GPR file)을 얻었다.
<2-4> 마이크로어레이 자료 분석
GenePix Pro Program에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 GeneSpring 7.3.1(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다. 표준화(Normalization): LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였다. 신뢰할 수 있는 유전자(Reliable gene): 중앙값의 합이 배경(background) 보다 낮거나, 각 화소(pixel) 값의 표준편차가 유의하지 않은 점을 플래그 아웃(flag-out)함으로써 유의한 유전자를 얻었다. 유의한 유전자(Significant genes) : 평준화된 비율(normalized ratio) 값이 10 배 이상 차이를 보이는 점을 선별하였다.
그 결과, 24시간(표 1) 및 48시간(표 2) 동안의 17β-에스트라디올 노출에 의해 유전자 발현량이 대조군에 비해 2 배 이상 증가 또는 감소하는 유전자들을 확인하였으며, 이중 10 배 이상 발현량의 변화를 보이는 52 종을 서열번호 1 내지 52로 기재하며, 이들에 대한 핵산 서열은 하기와 같다.
표 1 17β-에스트라디올 노출 24 시간 후 발현량이 변화하는 유전자 및 그 변화량
유전자 이름 배수 증가 서열 번호
하향조절
Dimethylglycine dehydrogenase 20.2 ± 0.01 1
Fructose-bisphosphate aldolase B 14.3 ± 0.02 2
Fatty acid binding protein 10, liver basic 12.5 ± 0.08 3
Claudin 10.0 ± 0.02 4
Cytochrome P450 2P3 10.0 ± 0.03 5
Aldolase B 10.2 ± 0.05 6
상향조절
Cytochrome c-1(cyc1) 10.3 ± 0.03 7
Selenoprotein M 10.3 ± 0.03 8
ATPase, H+ transporting, V1 subunit F(atp6v1f) 10.4 ± 0.03 9
Cytochrome oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene 10.7 ± 0.06 10
Similar to ATP citrate lyase isoform 2 11.4 ± 0.03 11
Ribosomal protein L13a(rpl13a) 11.7 ± 0.09 12
Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ 12.6 ± 0.45 13
Pyrroline-5-carboxylate reductase 1(pycr1) 12.8 ± 0.23 14
Similar to Exs-related protein (LOC100150890) 13.0 ± 0.05 15
Cysteine-rich with EGF-like domains 2(creld2) 13.2 ± 0.02 16
Selenoprotein 15 13.4 ± 0.03 17
Beta-galactoside-binding lectin 14.9 ± 0.01 18
hv1 gene for histone H2 variant 14.9 ± 0.05 19
Similar to LAG1 longevity assurance 2 17.1 ± 0.02 20
Inositol oxygenase 17.1 ± 0.06 21
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 17.3 ± 0.23 22
Tetraspanin-3(putative) 17.9 ± 0.01 23
Microsomal triglyceride transfer protein 18.1 ± 0.01 24
Amino-terminal enhancer of split (aes) 18.1 ± 0.09 25
non-classical MHC class Ⅰ antigen(Orda-UDA) 18.2 ± 0.03 26
NADH-cytochrome b5 reductase 3 19.7 ± 0.06 27
rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin(fbrl) 20.5 ± 0.23 28
Vitellogenin Ⅱ(vit-6) 20.8 ± 0.13 29
Choriogenin H minor 21.5 ± 0.03 30
Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 21.5 ± 0.18 31
Mannose-P-dolichol utilization defect 1b(mpdu1b) 21.6 ± 0.02 32
RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic) 23.7 ± 0.03 33
Tax1(human T-cell leukemia virus type I) binding protein 1b 25.0 ± 0.01 34
40S ribosomal protein S24-like protein 26.8 ± 0.02 35
Exosome complex exonuclease RRP4 35.2 ± 0.04 36
Similar to Iduronate 2-sulfatase precursor(ids) 36.8 ± 0.03 37
Vitellogenin 1(ol-vit1) 53.1 ± 0.13 38
표 2 17β-에스트라디올 노출 48 시간 후 발현량이 변화하는 유전자 및 그 변화량
유전자 이름 배수 증가 서열번호
하향조절
Oligosaccharyltransferase complex subunit(ostc) 100.0± 0.01 39
Abhydrolase domain containing 11 11.1 ± 0.06 40
Fatty acid binding protein 10, liver basic 10.0 ± 0.04 3
Fructose-bisphosphate aldolase B 10.2 ± 0.01 2
상향조절
B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor 10.0 ± 0.05 41
Cytochrome oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) 10.5 ± 0.01 10
Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ 10.5 ± 0.07 42
Inositol oxygenase 11.5 ± 0.03 21
Glutathione reductase(mitochondrial) 11.7 ± 0.02 43
Pyrroline-5-carboxylate reductase 1(pycr1) 11.8 ± 0.01 14
Choriogenin L 12.1 ± 0.02 44
Similar to integral membrane protein 1 12.3 ± 0.02 45
Complement control protein factor Ⅰ-B 12.5 ± 0.02 46
Glutamate receptor, ionotropic, delta 1(GRID1) 12.7 ± 0.03 47
Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12) 12.7 ± 0.03 48
Macrosialin precursor 13.3 ± 0.02 49
hv1 gene for histone H2 variant 13.6 ± 0.06 19
Similar to ATP citrate lyase isoform 2 13.7 ± 0.01 11
Selenoprotein M 13.9 ± 0.01 8
40S ribosomal protein S24-like protein 14.6 ± 0.03 35
Metalloreductase STEAP4 14.7 ± 0.02 50
Vitellogenin Ⅱ(vit-6) 14.9 ± 0.01 29
NADH-cytochrome b5 reductase 3 16.4 ± 0.02 27
Similar to Exs-related protein (LOC100150890) 16.7 ± 0.05 15
RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic) 17.2 ± 0.01 33
Tetraspanin-3 17.4 ± 0.08 23
Beta-galactoside-binding lectin 18.9 ± 0.02 18
Similar to LAG1 longevity assurance 2 19.3 ± 0.05 20
14-alpha demethylase(CYP51) 19.7 ± 0.04 51
Exosome complex exonuclease RRP4 21.7 ± 0.02 36
Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b 23.4 ± 0.01 34
Mannose-P-dolichol utilization defect 1b(mpdu1b) 23.6 ± 0.01 32
Choriogenin H minor 23.9 ± 0.02 30
Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 27.8 ± 0.23 31
rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin(fbrl) 31.7 ± 0.12 28
Microsomal triglyceride transfer protein 37.1 ± 0.08 24
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 40.1 ± 0.01 22
Bromodomain containing 2(RING3) 45.2 ± 0.03 52
Similar to Iduronate 2-sulfatase precursor(ids) 49.1 ± 0.01 37
Vitellogenin 1(ol-vit1) 59.1 ± 0.02 38
<실시예 3> 17β-에스트라디올 노출 후 발현이 변화되어 선별된 유전자들의 발현량 변화 정량분석
<3-1> 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 관련된 유전자들의 선별
상기 실시예 <2-4>에서 17β-에스트라디올 노출 후에 2배 이상 유전자 발현량이 변화되는 바다송사리의 유전자 중, 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 깊이 관련되어 있는, 하기 7 종의 유전자를 선별하였다.
아포지방단백 B(Apolipoprotein B), 시토크롬 P450 1A(Cytochrome P450 1A, CYP1A), 글루탐산탈수소효소 1b(Glutamate dehydrogenase 1b), 포도당-6-인산탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase), 트랜스페린(Transferrin), 비텔로제닌 1(Vitellogenin 1) 및 셀렌단백질 M(Selenoprotein M).
이들에 대해서 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)을 위한 프라이머를 디자인하고 합성하였다(표 3). 상기 유전자들의 발현량의 변화를 17β-에스트라디올에 48시간 동안 노출한 바다송사리의 간 시료를 대상으로 확인하였다.
표 3 실시간 정량적 PCR을 위한 대상 유전자들의 프라이머 염기서열
유전자 프라이머의 염기서열 서열 번호
아포지방단백 B F: 5’-AAGCTAATGCCGAGGTTGATC-3’R: 5’-GGAGGCAGAGGACTTGAATG-3’ 5758
시토크롬 P450 1A(CYP1A) F: 5’-TCAACCAGTGGCAGATAAACC-3’R: 5’-CTGGCACTTCCTCAAATCTC-3’ 5960
글루탐산탈수소효소 1b F: 5’-CGATGCCAGGTCCGATGAAAC-3’ R: 5’-GCCCAACACAGCCAGCACACAG-3’ 6152
포도당-6-인산탈수소효소 F: 5’-AGGTGTCCCACTATCGGTTC-3’R: 5’-CTTCATCCTCCAGAGCTTGTG-3’ 6364
트랜스페린 F: 5’-CCTGGAATCTGACGACTACCA-3’ R: 5’-CCTGGAATCTGACGACTACC-3’ 6566
비텔로제닌 1 F: 5’-ACAAAAGGTTCCACTCTCAGC-3’R: 5’-CCAACTTTAACCTCCATCTCC-3’ 6768
셀렌단백질 M F: 5’-GGTCAAAGCTTTTGTGACTC-3’R: 5’-TCTGGCTTCTCCTTCTTGTAG-3’ 6970
<3-2> cDNA 합성
실시예 <2-1>의 방법으로 추출된 RNA를 주형으로 AB High Capacity RAN-to-cDNA Kit(Applide Biosystems, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA 1 ㎍에 해당되는 양을 분주하고, 증류수를 첨가하여 9 ㎕가 되도록 적정하였다. 2×RT 버퍼 10 ㎕, 20× enzyme Mix 1 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, 원심분리하여 침전하고 37 ℃에서 60 분 동안 반응시킨다. 반응 후, 95 ℃로 5 분 동안 가열하여 반응을 종료하였다. 합성된 cDNA는 -20 ℃에 보관하였다.
<3-3> 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR) 분석
상기 합성된 cDNA 0.5 ㎍(약 10 ng/㎕에 해당)에 해당 유전자의 프라이머쌍을 0.8(10 pmol/㎕), 2 SYBR1 혼합물을 10 ㎕ 넣었다. 증류수를 이용하여 최종 양을 20 ㎕로 적정하였다. PCR의 온도조건은 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 조건으로 40 사이클을 수행하였다.
17β-에스트라디올 노출 후에 각 시료에 대한 대조유전자(β-actin)와 관심유전자의 CT 값을 비교하고, 상대 표준 곡선(relative Standard Curve) 방법으로 관심 유전자의 발현 변화를 상대적인 값으로 정량하였다(표 4).
표 4 실시간 정량적 PCR 분석에 의한 대상 유전자의 발현량 변화
유전자 노출시간 서열번호
24 시간
아포지방단백 B 2.5배 감소 53
시토크롬 P450 1A(CYP1A)(CYP1A) 2.7배 감소 5
글루탐산탈수소효소 1b 5.2배 감소 54
포도당-6-인산탈수소효소 2.2배 감소 55
트랜스페린 3.6배 감소 56
비텔로제닌 1 59.1배 증가 37
셀렌단백질 M 7.7배 증가 8
<실시예 4> BPA 노출에 의한 유전자 변화 측정
<4-1> RNA의 분리
상기 실시예 <1-2>에서 수득한 BPA 노출 시험군(48 시간) 또는 노출하지 않은 대조군의 바다송사리 간에 TRI Reagent 용액(Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) 1 ㎖를 넣고, 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 균질화하고, 실온에 5 분간 방치하였다. 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞고, 실온에서 10 분간 방치하고, 15 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)하였다. 상층액을 취하여, 이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕를 넣고, 상온에 5 분간 방치하였다. 약 20 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 후, 용액을 제거하여 침전물만을 취했다. 상기 침전물에 70 % 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5 분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켰다. 건조 후, 적당량의 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)-처리수에 용해하였다.
<4-2> Cy3 및 Cy5 표지
정제된 노출군 및 대조군의 전체 RNA는 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus(Agilent Technologies, USA)를 사용하여 다음과 같이 Cy3 및 Cy5로 표지하였다. 구체적으로, RNA 1 ㎍을 dT-프로모터 프라이머(dT-promoter primer)와 MMLV-역전사효소(MMLV-Reverse transcriptase)와 혼합하여 40℃에서 2시간 동안 역전사반응을 수행하였다. 그런 다음, T7 중합효소(T7 polymerase)를 첨가하여 40℃에서 2시간 동안 선형 증폭(linear amplification)을 수행하였다. 이와 같은 증폭과정을 통해 실험군 및 대조군의 시료를 각각 Cy3-CTP와 Cy5-CTP로 표지하였다.
<4-3> 혼성화(Hybridization) 및 스캐닝(scanning)
형광물질이 라벨링된 cDNA 시료를 Qiagen PCR purification kit을 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다. 정제된 형광표지-cDNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)(3x SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 ㎍ Cot-1 DNA, 20 ㎍ 효모균(yeast) tRNA)에 첨가한 후, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물을 만들었다. 상기 혼성화 혼합물을 95℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고, 12,000 g에서 30초간 원심분리하여 가열된 혼성화 화함물의 온도를 떨어뜨렸다. 제조된 바다송사리 cDNA 마이크로어레이(microarray)에 커버슬립(coverslip)을 덮고, 변성시킨 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)하였다. 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(Chamber)에 넣고 65℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 혼성화가 끝난 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 아래의 순서대로 세척과정을 수행하고, 마이크로어레이를 회전하여 건조한 후 스캐닝(scanning)할 때까지 암실에서 보관하였다. 실험이 완료된 바다송사리 마이크로어레이를 Axon GenePix 4000B scanner(Axon Instrument, USA)를 사용하여 스캔하였다. GenePix Pro 6.0 program에서, 스캔 이미지로부터 각 점을 그리 딩 파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율등의 분석값이 포함된 GPR 파일(GPR file)을 얻었다.
<4-4> 마이크로어레이 자료 분석
GenePix Pro Program에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 GeneSpring 7.3.1(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다. 표준화(Normalization): LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였다. 신뢰할 수 있는 유전자(Reliable gene): 중앙값의 합이 배경(background) 보다 낮거나, 각 화소(pixel) 값의 표준편차가 유의하지 않은 점을 플래그 아웃(flag-out)함으로써 유의한 유전자를 얻었다. 유의한 유전자(Significant genes) : 평준화된 비율(normalized ratio) 값이 10 배 이상 차이를 보이는 점을 선별하였다.
BPA 노출에 의한 유전자 변화를 측정한 결과, 48시간 동안의 BPA 노출에 의해 유전자 발현량이 대조군에 비해 2 배 이상 증가 또는 감소하는 유전자들 92종을 확인하였으며, 이들을 서열번호 71 내지 162로 기재하였다(표 5).
표 5 BPA 노출 48 시간 후 발현량이 2배 이상 감소 또는 증가되는 유전자 및 그 변화량
번호 유전자 발현량 변화
하향조절
71 proline rich 6 -5.99
72 telomerase reverse transcriptase gene -4.31
73 uridine phosphorylase 2 -3.77
74 MHC Class ⅠRegion -3.70
75 vitellogenin Ⅱ -3.69
76 retinoid X receptor beta(RXRB) gene -3.42
77 protein tyrosine phosphatase-like, member b -3.23
78 TRAF-binding protein -3.17
79 HSPC038 protein -3.05
80 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase -3.03
81 proteasome subunit, beta type 8 -2.96
82 trypsinogen -2.88
83 carnitine O-acetyltransferase precursor -2.78
84 tubulin, beta 5 -2.56
85 muscleblind mRNA -2.53
86 phosphoenolpyruvate carboxykinase -2.51
87 protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta -2.50
88 eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit -2.45
89 40S ribosomal protein S18 -2.43
90 trypsinogen -2.42
91 estrogen receptor beta 2 -2.37
92 bromodomain containing 2(RING3) gene -2.35
93 glutathione S-transferase -2.33
94 cysteine dioxygenase -2.32
95 cyclin G2 -2.27
96 protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1 -2.22
97 septin 7b(sept7b), transcript variant 1 -2.20
98 c-type lysozyme mRNA -2.18
99 Uridine phosphorylase 1 -2.16
100 60S acidic ribosomal protein P1 -2.13
101 heart-type fatty acid-binding protein -2.12
102 choriogenin Hminor -2.09
103 ribosomal protein L13 -2.09
104 glucose-regulated protein 94 -2.09
105 cathepsin F -2.08
106 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA -2.06
107 mitogen-activated protein kinase 1 -2.06
108 Transcription initiation factor IIA gamma chain -2.06
109 ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1 -2.04
110 leukocyte elastase inhibitor -2.04
111 Putative transmembrane 4 superfamily member protein -2.02
112 mitogen-activated protein kinase(p38) -2.02
113 DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA -2.01
상향조절
114 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 +2.00
115 40S ribosomal protein S19 +2.00
116 alcohol dehydrogenase Class Ⅵ(ADH8) +2.01
117 malate dehydrogenase +2.01
118 carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2 +2.01
119 alpha-2-macroglobulin +2.01
120 TBT-binding protein +2.02
121 keratin 15 +2.02
122 complement component C9 +2.03
123 alpha-2-macroglobulin-2 +2.03
124 kelch-like ECH-associated protein 1b +2.06
125 hepcidin-like precursor +2.07
126 NADH dehydrogenase subunit 4 +2.08
127 cyclin Y-like 1 +2.09
128 complement regulatory plasma protein +2.11
129 protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2 +2.12
130 choriogenin L +2.12
131 complement factor B/C2-B +2.12
132 Nedd4 family interacting protein 2 +2.13
133 Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2) +2.14
134 ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1 +2.15
135 catalase +2.16
136 ring finger protein 141 +2.16
137 Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase) +2.16
138 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 +2.17
139 cytochrome P450 CYP2Y3 +2.18
140 chymotrypsinogen 2-like protein +2.22
141 Iron-responsive element-binding protein 1 +2.25
142 calreticulin +2.25
143 delta 6-desaturase +2.39
144 kelch domain containing 10 +2.42
145 arginyl-tRNA synthetase +2.52
146 ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b +2.59
147 adult alpha-type globin +2.59
148 GTP cyclohydrolase 1 precursor +2.60
149 Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component +2.62
150 sex hormone-binding globulin +2.62
151 protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform +2.63
152 cyclin B2 +2.66
153 Isocitrate dehydrogenase +2.72
154 ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2 +2.84
155 decorin mRNA +2.87
156 apolipoprotein A-Ⅳ4 +2.94
157 Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon +3.00
158 Ribosomal protein S14, transcript variant 4 +3.11
159 Transmembrane protein 85 +5.22
160 heat shock protein 84b +5.53
161 warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79) +5.88
162 glutathione S transferase Rho-class +6.90
발현량 변화: -, 하향조절(발현량 감소); +, 상향조절(발현량 증가)
<실시예 5> BPA 노출 후 발현이 변화되어 선별된 유전자들의 발현량 변화 정량분석
<5-1> 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 관련된 유전자들의 선별
BPA 노출 후에 2배 이상 유전자 발현량이 변화되는 92 종의 유전자 중 9종의 유전자와 유전자 발현량 변화가 2배에 달하지는 않지만, 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 관련이 있는 유전자 19종 등, 총 28종의 유전자를 선별하였다.
Arylamine N-acetyl transferase(서열번호: 163), Apolipoprotein E1(서열번호: 164), Basigin(서열번호: 165), Complement component C8 beta(서열번호: 166), C1q-like adipose specific protein(서열번호: 167), Catalase, Calcium binding protein P22(서열번호: 168), Ceruloplasmin(서열번호: 169), Complement factor B/C2-B, Chitinase(서열번호: 170), Choline kinase(서열번호: 171), Choriogenin L, Delta-6 fatty acyl desaturase(서열번호: 172), Delta 6-desaturase, Glutaminase(서열번호: 173), Glutathione S-transferase, Hepcidin(서열번호: 174), Leukocyte elastase inhibitor, Lipoprotein lipase(서열번호: 175), N-acetyltransferase(서열번호: 176), Plasminogen(서열번호: 177), Retinol binding protein 4(서열번호: 178), Ring finger protein 141, TBT-binding protein, Transferrin(서열번호: 179), Uridine phosphorylase 2, Vitellogenin 1(서열번호: 180), Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)(서열번호: 181)
이들에 대해서 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)을 위한 프라이머를 디자인하고 합성하였으며, 실시간 정략적 PCR을 위한 대상 유전자들의 프라이머 염기서열은 하기 표2에 기재하였다(표 6).
표 6 실시간 정량적 PCR을 위한 대상 유전자들의 프라이머 염기서열
프라이머 유전자 　 서열
ANAT Arylamine N-acetyl transferase F 5'-CATTCACTGTGGTGAGAGGA-3'(서열번호: 182)
R 5'-TCCAAAGCTCACGTCTGTAA-3'(서열번호: 183)
AP Apolipoprotein E1 F 5'-GGATCCATACTTCTCTCAGGT-3'(서열번호: 184)
R 5'-GTCTGAACATGTTTCCATGAG-3'(서열번호: 185)
Bsgn Basigin F 5'-ATCCTCGTGACCATCATCTT-3'(서열번호: 186)
R 5'-AGGAACTTTGCAGAAAGCAC-3'(서열번호: 187)
C8 Complement component C8 beta F 5'-GTGCACTATAACCCCGACTT-3'(서열번호: 188)
R 5'-AGTGACCTCACAGCTCCTTC-3'(서열번호: 189)
C-ASP C1q-like adipose specific protein F 5'-CTGTTGACGTTGTTGCTTTG-3'(서열번호: 190)
R 5'-AAAAACTACTGGGGTTCGTG-3'(서열번호: 191)
Cat Catalase F 5'-GCGGTACAACAGCGCCGATGA-3'(서열번호: 192)
R 5'-GGATGGACGGCCTTCAAGTTCT-3'(서열번호: 193)
CBP-P22 Calcium binding protein P22 F 5'-CCACAGTCAGATCACTCGAC-3'(서열번호: 194)
R 5'-CAAAGTGCAGCTTGTTCATC-3'(서열번호: 195)
Cer Ceruloplasmin F 5'-GTCAGTTTGAAGTGGTCTCTG-3'(서열번호: 196)
R 5'-GAACCTATGAATCCTCCTTGT-3'(서열번호: 197)
CF-B/C2 Complement factor B/C2-B F 5'-CGTGGACATATGTGACCCTA-3'(서열번호: 198)
R 5'-TGTCCAAATCTGTTGGAATG-3'(서열번호: 199)
Chi Chitinase F 5'-GATGCAGGATAGAGAGAGGTT-3'(서열번호: 200)
R 5'-AGATCCATGGAAGTCATAGGT-3'(서열번호: 201)
Chka Choline kinase F 5'-CCAGAAGTACCCCTCAAAGA-3'(서열번호: 202)
R 5'-TTCTTCTGCTGGAAGTAGGC-3'(서열번호: 203)
ChL Choriogenin L F 5'-TGCAACACCAGGAAACTATG-3'(서열번호: 204)
R 5'-TTTTCGGCTCATACCAATAC-3'(서열번호: 205)
FADSD6 Delta-6 fatty acyl desaturase F 5'-TGGACAATGACTTTCCTGTG-3'(서열번호: 206)
R 5'-CCTGAAGATATTGGGTTTG-3'(서열번호: 207)
FD6D Delta 6-desaturase F 5'-TCTCGTGTCATTAGCCACTAT-3'(서열번호: 208)
R 5'-ATTCTTCTCTGCCTGAACTCT-3'(서열번호: 209)
Gls Glutaminase F 5'-TGAGTCAGGAAGTGTCATGG-3'(서열번호: 210)
R 5'-TTACCAAGGCGATCTAAAGG-3'(서열번호: 211)
Gst Glutathione S-transferase F 5'-TCGACAAGATGGAGCACAAATC-3'(서열번호: 212)
R 5'-CAGTTTGTTCCCCTGAGACTTGA-3'(서열번호: 213)
Hep Hepcidin F 5'-AACTGCTGCAAGAACTACAAG-3'(서열번호: 214)
R 5'-CCAACAGCCTTTATCTGTTT-3'(서열번호: 215)
LE Leukocyte elastase inhibitor F 5'-GTTTGATGCAAAGGAAACTC-3'(서열번호: 216)
R 5'-CATGAAGTTCTCGTAGGTCAG-3'(서열번호: 217)
LPL Lipoprotein lipase F 5'-TTCACTGTTTGGAACTCACG-3'(서열번호: 218)
R 5'-ACCAGATCAGCAAACTCTCC-3'(서열번호: 219)
NAT13 N-acetyltransferase F 5'-TCGAGATCATCGAGACAAAA-3'(서열번호: 220)
R 5'-GCAGAAATTGCCTTTGAAAC-3'(서열번호: 221)
Plg Plasminogen F 5'-TGCTGAGCAGATCTCAACAT-3'(서열번호: 222)
R 5'-AATGTAAGCGAAGGATTTGC-3'(서열번호: 223)
RBP4 Retinol binding protein 4 F 5'-AGAACCAGGTATGCAGGTGT-3'(서열번호: 224)
R 5'-ACCCCAGTATTTCATCCTGA-3'(서열번호: 225)
RFP Ring finger protein 141 F 5'-TCTGCACCAAGATCAACAAG-3'(서열번호: 226)
R 5'-TTTGTCGATGCATTTCTGAC-3'(서열번호: 227)
TBT-bp TBT-binding protein F 5'-CCATCAATGTTAGCCACAAA-3'(서열번호: 228)
R 5'-CGTAATGTATTCGGGTTCCT-3'(서열번호: 229)
TF Transferrin F 5'-TCACACAGACTCCTTCCTCTA-3'(서열번호: 230)
R 5'-TCAGTCACAGATCAGATCCTC-3'(서열번호: 231)
Upp2 Uridine phosphorylase 2 F 5'-GACATTCTGTACCACTTCAGC-3'(서열번호: 232)
R 5'-CCACTTTGTACATGGAGTAGC-3'(서열번호: 233)
Vit1 Vitellogenin 1 F 5'-ACAAAAGGTTCCACTCTCAGC-3'(서열번호: 234)
R 5'-CCAACTTTAACCTCCATCTCC-3'(서열번호: 235)
Wap65　 Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243) F 5'-CGACAAGGGTCAAACTTTTT-3'(서열번호: 236)
R 5'-TTTGGATAGCCTTCCTCAAG-3'(서열번호: 237)
<5-2> cDNA 합성
실시예 <4-1>의 방법으로 추출된 RNA를 주형으로 AB High Capacity RAN-to-cDNA Kit(Applide Biosystems, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA 1 ㎍에 해당되는 양을 분주하고, 증류수를 첨가하여 9 ㎕가 되도록 적정하였다. 2×RT 버퍼 10 ㎕, 20× enzyme Mix 1 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, 원심분리하여 침전하고 37 ℃에서 60 분 동안 반응시킨다. 반응 후, 95 ℃로 5 분 동안 가열하여 반응을 종료하였다. 합성된 cDNA는 -20 ℃에 보관하였다.
<5-3> 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR) 분석
상기 합성된 cDNA 0.5 ㎍(약 10 ng/㎕에 해당)에 해당 유전자의 프라이머쌍을 0.8(10 pmol/㎕), 2 SYBR1 혼합물을 10 ㎕ 넣었다. 증류수를 이용하여 최종 양을 20 ㎕로 적정하였다. PCR의 온도조건은 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 조건으로 40 사이클을 수행하였다.
BPA 노출 후에 각 시료에 대한 대조유전자(β-actin)와 관심유전자의 CT 값을 비교하고, 상대 표준 곡선(relative Standard Curve) 방법으로 관심유전자의 발현 변화를 상대적인 값으로 정량하였다(표 7).
표 7 실시간 정량적 PCR 분석에 의한 대상 유전자의 발현량 변화
프라이머 유전자 발현량 변화
ANAT Arylamine N-acetyl transferase -1.69
AP Apolipoprotein E1 +2.30
Bsgn Basigin +4.25
C8 Complement component C8 beta -1.37
C-ASP C1q-like adipose specific protein -2.17
Cat Catalase -1.49
CBP-P22 Calcium binding protein P22 +1.19
Cer Ceruloplasmin +2.09
CF-B/C2 Complement factor B/C2-B -2.27
Chi Chitinase -5.56
Chka Choline kinase +4.18
ChL Choriogenin L +50.00
FADSD6 Delta-6 fatty acyl desaturase -1.39
FD6D Delta 6-desaturase +1.43
Gls Glutaminase -1.35
Gst Glutathione S-transferase -1.85
Hep Hepcidin -1.14
LE Leukocyte elastase inhibitor +1.12
LPL Lipoprotein lipase +1.11
NAT13 N-acetyltransferase -2.50
Plg Plasminogen +1.25
RBP4 Retinol binding protein 4 +1.12
RFP Ring finger protein 141 +1.23
TBT-bp TBT-binding protein -1.66
TF Transferrin -1.30
Upp2 Uridine phosphorylase 2 -1.72
Vit1 Vitellogenin 1 -100.00
Wap65 Warm temperature acclimation(C243) +1.07
본 발명에서 제시한 내분비계 장애물질의 일종인 17β-에스트라디올 노출에 대응하는 바다송사리의 유전자 또는 BPA 노출에 대응하는 바다송사리의 유전자는 수생태계의 내분비계 장애물질 오염 및 이에 따른 수생태계의 상황을 모니터링하고 진단하기 위한 바이오센서의 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, 제시된 유전자들의 기능에 의거하여 본 생물의 대사/생리변화를 구체화함으로써 앞으로 일어날 수도 있는 병리적 현상을 예측할 수 있는 생체지표 및 센서로 이용할 수 있으며, 수생태계의 스트레스원 검출 또는 건강 진단 방법에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 이의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 시료내 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩:
    서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 바다송사리(Oryzias javanicus)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩.
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen, 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1 , GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)) 및 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3))는 에스트로겐 계열의 스테로이드 호르몬 노출에 대응하여 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 계열의 스테로이드 호르몬 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc) 및 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11)는 17β-에스트라디올 노출에 대응하여 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐 계열의 스테로이드 호르몬 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 외부 스트레스에 대한 자기 방어적 기작에 관련된 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 이의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 것을 특징으로 하는 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩:
    서열 번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 1A, CYP1A)), 서열 번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
  6. 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법.
  7. 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를, 제 1항의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단 방법.
  8. 제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트.
  9. 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트.
  10. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 시료내 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA) 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩:
    서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96으로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
  11. 제 10항에 있어서, 상기 유전자는 바다송사리(Oryzias javanicus)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩.
  12. 제 10항에 있어서, 서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F),서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor ⅡA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111으로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)) 및 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 중 비스페놀 A 노출에 대응하여 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩.
  13. 제 10항에 있어서, 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class VI, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-IV4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)) 및 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 중 비스페놀 A 노출에 대응하여 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩.
  14. 제 10항에 있어서, 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 136으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 135로 기재되는 유전자(Catalase), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 131로 기재되는 유전자(Complement factor B/C2-B), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 130으로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 143으로 기재되는 유전자(Delta 6-desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 162로 기재되는 유전자(Glutathione S-transferase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 110으로 기재되는 유전자(Leukocyte elastase inhibitor), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 136으로 기재되는 유전자(Ring finger protein 141), 서열 번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 73으로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 2), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243))로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자는 외부 스트레스에 대한 기작에 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩.
  15. 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 비스페놀 A 노출 여부 검출 방법.
  16. 1) 피검시료에 노출된 실험군의 바다송사리와, 정상 대조군의 바다송사리에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를, 하기 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
    서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A- Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 시료내 비스페놀 A 노출 여부 검출 방법.
  17. 제 10항의 마이크로어레이 칩을 포함하는, 비스페놀 A 노출 여부 검출용 키트.
  18. 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 비스페놀 A 노출 여부 검출용 키트:
    서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A- Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
  19. 제 18항에 있어서, 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 검출용 키트:
    프라이머 쌍 1 : 서열번호 182의 정방향 프라이머 및 서열번호 183의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 2 : 서열번호 184의 정방향 프라이머 및 서열번호 185의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 3 : 서열번호 186의 정방향 프라이머 및 서열번호 187의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 4 : 서열번호 188의 정방향 프라이머 및 서열번호 189의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 5 : 서열번호 190의 정방향 프라이머 및 서열번호 191의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 6 : 서열번호 192의 정방향 프라이머 및 서열번호 193의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 7 : 서열번호 194의 정방향 프라이머 및 서열번호 195의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 8 : 서열번호 196의 정방향 프라이머 및 서열번호 197의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 9 : 서열번호 198의 정방향 프라이머 및 서열번호 199의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 10 : 서열번호 200의 정방향 프라이머 및 서열번호 201의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 11 : 서열번호 202의 정방향 프라이머 및 서열번호 203의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 12 : 서열번호 204의 정방향 프라이머 및 서열번호 205의 역방향 프라이머
    프라이머 쌍 13 : 서열번호 206의 정방향 프라이머 및 서열번호 207의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 14 : 서열번호 208의 정방향 프라이머 및 서열번호 209의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 15 : 서열번호 210의 정방향 프라이머 및 서열번호 211의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 16 : 서열번호 212의 정방향 프라이머 및 서열번호 213의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 17 : 서열번호 214의 정방향 프라이머 및 서열번호 215의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 18 : 서열번호 216의 정방향 프라이머 및 서열번호 217의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 19 : 서열번호 218의 정방향 프라이머 및 서열번호 219의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 20 : 서열번호 220의 정방향 프라이머 및 서열번호 221의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 21 : 서열번호 222의 정방향 프라이머 및 서열번호 223의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 22 : 서열번호 224의 정방향 프라이머 및 서열번호 225의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 23 : 서열번호 226의 정방향 프라이머 및 서열번호 227의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 24 : 서열번호 228의 정방향 프라이머 및 서열번호 229의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 25 : 서열번호 230의 정방향 프라이머 및 서열번호 231의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 26 : 서열번호 232의 정방향 프라이머 및 서열번호 233의 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 27 : 서열번호 234의 정방향 프라이머 및 서열번호 235의 역방향 프라이머; 및
    프라이머 쌍 28 : 서열번호 236의 정방향 프라이머 및 서열번호 237의 역방향프라이머.
  20. 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 하기 유전자의 용도;
    서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
  21. 시료내 17β-에스트라디올 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 하기 유전자의 용도;
    서열번호 1로 기재되는 유전자(Dimethylglycine dehydrogenase), 서열번호 2로 기재되는 유전자(Fructose-bisphosphate aldolase B), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(Fatty acid binding protein 10 liver basic), 서열번호 4로 기재되는 유전자(Claudin), 서열번호 5로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 2P3), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(Aldolase B), 서열번호 7로 기재되는 유전자(Cytochrome c-1, cyc1), 서열번호 8로 기재되는 유전자(Selenoprotein M), 서열번호 9로 기재되는 유전자(ATPase H+ transporting V1 subunit F, atp6v1f), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ), 서열번호 11로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase isoform 2), 서열번호 12로 기재되는 유전자(Ribosomal protein L13a, rpl13a), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ), 서열번호 14로 기재되는 유전자(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, pycr1), 서열번호 15로 기재되는 유전자(Exs-related protein), 서열번호 16로 기재되는 유전자(Cysteine-rich with EGF-like domains 2, creld2), 서열번호 17로 기재되는 유전자(Selenoprotein 15), 서열번호 18로 기재되는 유전자(Beta-galactoside-binding lectin), 서열번호 19로 기재되는 유전자(hv1 gene for histone H2 variant), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(LAG1 longevity assurance 2), 서열번호 21로 기재되는 유전자(Inositol oxygenase), 서열번호 22로 기재되는 유전자(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1), 서열번호 23으로 기재되는 유전자(Tetraspanin-3), 서열번호 24로 기재되는 유전자(Microsomal triglyceride transfer protein), 서열번호 25로 기재되는 유전자(Amino-terminal enhancer of split), 서열번호 26으로 기재되는 유전자(non-classical MHC class Ⅰ antigen), 서열번호 27로 기재되는 유전자(NADH-cytochrome b5 reductase 3), 서열번호 28로 기재되는 유전자(rRNA 2-O-methyltransferase fibrillarin), 서열번호 29로 기재되는 유전자(Vitellogenin Ⅱ, vit-6), 서열번호 30으로 기재되는 유전자(Choriogenin H minor), 서열번호 31로 기재되는 유전자(Adenylosuccinate synthetase isozyme 2), 서열번호 32로 기재되는 유전자(Mannose-P-dolichol utilization defect 1b, mpdu1b), 서열번호 33으로 기재되는 유전자(RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)), 서열번호 34로 기재되는 유전자(Tax1(human T-cell leukemia virus type Ⅰ) binding protein 1b), 서열번호 35로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S24-like protein), 서열번호 36으로 기재되는 유전자(Exosome complex exonuclease RRP4), 서열번호 37로 기재되는 유전자(Iduronate 2-sulfatase precursor), 서열번호 38로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1, ol-vit1), 서열번호 39로 기재되는 유전자(Oligosaccharyltransferase complex subunit, ostc), 서열번호 40로 기재되는 유전자(Abhydrolase domain containing 11), 서열번호 41로 기재되는 유전자(B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha-chain precursor), 서열번호 42로 기재되는 유전자(Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal Ⅰ), 서열번호 43으로 기재되는 유전자(Glutathione reductase(mitochondrial)), 서열번호 44로 기재되는 유전자(Choriogenin L), 서열번호 45로 기재되는 유전자(Integral membrane protein 1), 서열번호 46으로 기재되는 유전자(Complement control protein factor Ⅰ-B), 서열번호 47로 기재되는 유전자(Glutamate receptor, ionotropic, delta 1, GRID1), 서열번호 48로 기재되는 유전자(Dolichyl-alpha-1,6-mannosyltransferase(alg12)), 서열번호 49로 기재되는 유전자(Macrosialin precursor), 서열번호 50으로 기재되는 유전자(Metalloreductase STEAP4), 서열번호 51로 기재되는 유전자(14-alpha demethylase(CYP51)), 서열번호 52로 기재되는 유전자(Bromodomain containing 2(RING3)), 서열 번호 53으로 기재되는 유전자(Apolipoprotein B), 서열 번호 54로 기재되는 유전자(Glutamate dehydrogenase 1b), 서열 번호 55로 기재되는 유전자(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 서열 번호 56으로 기재되는 유전자(Transferrin).
  22. 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 마이크로어레이 칩의 제조를 위한, 하기 유전자의 용도;
    서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96으로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
  23. 시료내 BPA 노출 여부 검출 및 환경오염 진단용 키트의 제조를 위한, 하기 유전자의 용도;
    서열번호 71로 기재되는 유전자(proline rich 6), 서열번호 72로 기재되는 유전자(telomerase reverse transcriptase gene), 서열번호 73으로 기재되는 유전자(uridine phosphorylase 2), 서열번호 74로 기재되는 유전자(MHC Class Ⅰ Region), 서열번호 75로 기재되는 유전자(vitellogenin Ⅱ), 서열번호 76으로 기재되는 유전자(retinoid X receptor beta(RXRB) gene), 서열번호 77로 기재되는 유전자(protein tyrosine phosphatase-like, member b), 서열번호 78로 기재되는 유전자(TRAF-binding protein), 서열번호 79로 기재되는 유전자(HSPC038 protein), 서열번호 80으로 기재되는 유전자(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 서열번호 81로 기재되는 유전자(proteasome subunit, beta type 8), 서열번호 82로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 83로 기재되는 유전자(carnitine O-acetyltransferase precursor), 서열번호 84로 기재되는 유전자(tubulin, beta 5), 서열번호 85로 기재되는 유전자(muscleblind mRNA), 서열번호 86으로 기재되는 유전자(phosphoenolpyruvate carboxykinase), 서열번호 87로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta), 서열번호 88로 기재되는 유전자(eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit), 서열번호 89로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S18), 서열번호 90으로 기재되는 유전자(trypsinogen), 서열번호 91로 기재되는 유전자(estrogen receptor beta 2), 서열번호 92로 기재되는 유전자(bromodomain containing 2(RING3) gene), 서열번호 93으로 기재되는 유전자(glutathione S-transferase), 서열번호 94로 기재되는 유전자(cysteine dioxygenase), 서열번호 95로 기재되는 유전자(cyclin G2), 서열번호 96으로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1), 서열번호 97로 기재되는 유전자(septin 7b(sept7b), transcript variant 1), 서열번호 98로 기재되는 유전자(c-type lysozyme mRNA), 서열번호 99로 기재되는 유전자(Uridine phosphorylase 1), 서열번호 100으로 기재되는 유전자(60S acidic ribosomal protein P1), 서열번호 101로 기재되는 유전자(heart-type fatty acid-binding protein), 서열번호 102로 기재되는 유전자(choriogenin Hminor), 서열번호 103으로 기재되는 유전자(ribosomal protein L13), 서열번호 104로 기재되는 유전자(glucose-regulated protein 94), 서열번호 105로 기재되는 유전자(cathepsin F), 서열번호 106으로 기재되는 유전자(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)-like mRNA), 서열번호 107로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase 1), 서열번호 108로 기재되는 유전자(Transcription initiation factor IIA gamma chain), 서열번호 109로 기재되는 유전자(ATPase, H+ transporting, lysosomal, V1 subunit E isoform 1), 서열번호 110으로 기재되는 유전자(leukocyte elastase inhibitor), 서열번호 111로 기재되는 유전자(Putative transmembrane 4 superfamily member protein), 서열번호 112로 기재되는 유전자(mitogen-activated protein kinase(p38)), 서열번호 113으로 기재되는 유전자(DEAD-box RNA-dependent helicase p68 mRNA), 서열번호 114로 기재되는 유전자(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3), 서열번호 115로 기재되는 유전자(40S ribosomal protein S19), 서열번호 116으로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase Class Ⅵ, ADH8), 서열번호 117로 기재되는 유전자(malate dehydrogenase), 서열번호 118로 기재되는 유전자(carboxyl ester lipase, tandem duplicate 2), 서열번호 119로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin), 서열번호 120으로 기재되는 유전자(TBT-binding protein), 서열번호 121로 기재되는 유전자(keratin 15), 서열번호 122로 기재되는 유전자(complement component C9), 서열번호 123으로 기재되는 유전자(alpha-2-macroglobulin-2), 서열번호 124로 기재되는 유전자(kelch-like ECH-associated protein 1b), 서열번호 125로 기재되는 유전자(hepcidin-like precursor), 서열번호 126으로 기재되는 유전자(NADH dehydrogenase subunit 4), 서열번호 127로 기재되는 유전자(cyclin Y-like 1), 서열번호 128로 기재되는 유전자(complement regulatory plasma protein), 서열번호 129로 기재되는 유전자(protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 2), 서열번호 130으로 기재되는 유전자(choriogenin L), 서열번호 131로 기재되는 유전자(complement factor B/C2-B), 서열번호 132로 기재되는 유전자(Nedd4 family interacting protein 2), 서열번호 133으로 기재되는 유전자(Restin(Cytoplasmic linker protein-170 alpha-2)), 서열번호 134로 기재되는 유전자(ornithine decarboxylase antizyme large isoform ORF1), 서열번호 135로 기재되는 유전자(catalase), 서열번호 136으로 기재되는 유전자(ring finger protein 141), 서열번호 137로 기재되는 유전자(Cytochrome P450 7B1(Oxysterol 7-alpha-hydroxylase)), 서열번호 138로 기재되는 유전자(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), 서열번호 139로 기재되는 유전자(cytochrome P450 CYP2Y3), 서열번호 140으로 기재되는 유전자(chymotrypsinogen 2-like protein), 서열번호 141로 기재되는 유전자(Iron-responsive element-binding protein 1), 서열번호 142로 기재되는 유전자(calreticulin), 서열번호 143으로 기재되는 유전자(delta 6-desaturase), 서열번호 144로 기재되는 유전자(kelch domain containing 10), 서열번호 145로 기재되는 유전자(arginyl-tRNA synthetase), 서열번호 146으로 기재되는 유전자(ATP-binding cassette transporter sub-family G member 2b), 서열번호 147로 기재되는 유전자(adult alpha-type globin), 서열번호 148로 기재되는 유전자(GTP cyclohydrolase 1 precursor), 서열번호 149로 기재되는 유전자(Thyroid hormone receptor-associated protein complex 150 kDa component), 서열번호 150으로 기재되는 유전자(sex hormone-binding globulin), 서열번호 151로 기재되는 유전자(protein phosphatase 2A regulatory subunit B' delta isoform), 서열번호 152로 기재되는 유전자(cyclin B2), 서열번호 153으로 기재되는 유전자(Isocitrate dehydrogenase), 서열번호 154로 기재되는 유전자(ATP citrate lyase(ACLY), transcript variant 2), 서열번호 155로 기재되는 유전자(decorin mRNA), 서열번호 156으로 기재되는 유전자(apolipoprotein A-Ⅳ4), 서열번호 157로 기재되는 유전자(Translation initiation factor eIF-2B subunit epsilon), 서열번호 158로 기재되는 유전자(Ribosomal protein S14, transcript variant 4), 서열번호 159로 기재되는 유전자(Transmembrane protein 85), 서열번호 160으로 기재되는 유전자(heat shock protein 84b), 서열번호 161로 기재되는 유전자(warm-temperature-acclimation-related-65 kDa-protein(C79)), 서열번호 162로 기재되는 유전자(glutathione S transferase Rho-class), 서열 번호 163으로 기재되는 유전자(Arylamine N-acetyl transferase), 서열 번호 164로 기재되는 유전자(Apolipoprotein E1), 서열 번호 165로 기재되는 유전자(Basigin), 서열 번호 166으로 기재되는 유전자(Complement component C8 beta), 서열 번호 167로 기재되는 유전자(C1q-like adipose specific protein), 서열 번호 168로 기재되는 유전자(Calcium binding protein P22), 서열 번호 169로 기재되는 유전자(Ceruloplasmin), 서열 번호 170으로 기재되는 유전자(Chitinase), 서열 번호 171로 기재되는 유전자(Choline kinase), 서열 번호 172로 기재되는 유전자(Delta-6 fatty acyl desaturase), 서열 번호 173으로 기재되는 유전자(Glutaminase), 서열 번호 174로 기재되는 유전자(Hepcidin), 서열 번호 175로 기재되는 유전자(Lipoprotein lipase), 서열 번호 176으로 기재되는 유전자(N-acetyltransferase), 서열 번호 177로 기재되는 유전자(Plasminogen), 서열 번호 178로 기재되는 유전자(Retinol binding protein 4), 서열 번호 179로 기재되는 유전자(Transferrin), 서열 번호 180으로 기재되는 유전자(Vitellogenin 1) 및 서열 번호 181로 기재되는 유전자(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein(C243)).
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