CN117264856A - 高产辅酶q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用 - Google Patents

高产辅酶q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高产辅酶Q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用。所述代谢工程改造菌为如下1)‑3)中的任一种：1)包括如下步骤：将甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；2)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；3)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因和磷酸果糖激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌。本发明首次发现了在糖酵解途径和辅酶Q10的能量转换途径中影响目标产物辅酶Q10合成的关键基因，并对关键基因进行代谢工程改造，获得了高产辅酶Q10的代谢工程改造菌。

Description

高产辅酶Q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及高产辅酶Q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用。
背景技术
辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上已广泛用于心血管系统疾病的预防和治疗。在保护肺炎，乙肝和肾疾病等方面也有应用。近期研究表明，辅酶Q10在治疗坏血病，糖尿病和原发性醛固酮增多症等方面有一定的疗效。
目前辅酶Q10的生产方法主要有四种：化学合成法、半化学合成法、动植物体内提取法、微生物发酵法。其中，微生物发酵是生物药物的重要来源，工业上常用类球红细菌发酵生产辅酶Q10。1998年，烟台康泰药业制品公司开始进行光合菌发酵法生产辅酶Q10的研究，它可作为一种潜在的功能性药物和保健食品添加剂。但该方法存在如下缺点：辅酶Q10的产量和产率较低、发酵液中的残糖浓度较高、基质的转化率较低，这些因素都导致了生产成本的提高，同时单位产品的“三废”产生也提高，而导致以上结果的主要原因是优良菌种的缺乏。
优良菌种是保障微生物发酵生产稳定、高效的关键竞争性因素，生产中需要不断选育优良的微生物菌种，以提高产品产量和生产性能。因此，如何获得优良的微生物菌种成为制约微生物发酵产业发展的关键问题，关系到工业生产的效率和效益，通过代谢工程有目的地进行菌种改造来提高辅酶Q10产量和产率已经成为主要手段。该方法的关键就是需要对目标产物的代谢途径有一个清晰的认知，并找到影响产物合成的关键基因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过对类球红细菌的辅酶Q10生物合成途径进行分析，找到与类球红细菌辅酶Q10产量相关的关键基因，并对其进行代谢调控，从而提高类球红细菌辅酶Q10的产量和产率。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法。
本发明提供的重组菌构建方法为如下1)-3)中的任一种：
1)包括如下步骤：将甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；
2)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；
3)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因和磷酸果糖激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌。
进一步的，所述类球红细菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3。
本发明中的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学)，其分类命名为Rhodobacter sphaeroides，保藏编号为CCTCC NO:M 2021735。
再进一步的，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示。所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因具体如序列表中序列7所示；
所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因具体如序列表中序列3所示；
所述磷酸果糖激酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述磷酸果糖激酶的编码基因具体如序列表中序列1所示。
更进一步的，所述1)中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh为将序列表中序列7所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒；
所述2)中，所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-pkac导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-pkac为将序列表中序列3所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒；
所述3)中，所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因和所述磷酸果糖激酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac为将序列表中序列1所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间，且将序列表中序列3所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了由上述构建方法构建得到的重组菌。
所述重组菌具体为重组类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)RS.GAPDH。
本发明中的重组类球红细菌RS.GAPDH(简称重组菌RS.GAPDH)已于2021年12月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，其分类命名为Rhodobacter sphaeroides，保藏编号为GDMCC NO:62095。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如下A1)-A10)任一种应用：
A1)上述重组菌的构建方法或上述重组菌在生产辅酶Q10中的应用；
A2)上述重组菌的构建方法或上述重组菌在制备生产辅酶Q10的产品中的应用；
A3)上述重组菌的构建方法或上述重组菌在提高辅酶Q10产量或产率中的应用；
A4)上述重组菌的构建方法或上述重组菌在制备提高辅酶Q10产量或产率的产品中的应用；
A5)甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A6)甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用；
A7)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A8)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用；
A9)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料与磷酸果糖激酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A10)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料与磷酸果糖激酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用。
上述应用中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示。所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶相关生物材料为编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子或含有编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子的重组质粒。编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子具体如序列表中序列7所示。含有编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子的重组质粒具体为上述重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh。
所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。所述环腺苷酸依赖蛋白激酶相关生物材料为编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子或含有编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子的重组质粒。编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子具体如序列表中序列3所示。含有编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子的重组质粒具体为上述重组质粒pBBR1MCS-4-pkac或重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac。
所述磷酸果糖激酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述磷酸果糖激酶相关生物材料为编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子或含有编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子的重组质粒。编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子具体如序列表中序列1所示。含有编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子的重组质粒具体为上述重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种辅酶Q10的生产方法。
本发明提供的辅酶Q10的生产方法包括如下步骤：发酵培养上述重组菌。
进一步的，所述发酵培养包括如下步骤：
a、将所述重组菌接种于种子培养基中培养，得到种子液；
b、将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得到发酵液。
所述种子培养基(7.2)溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L。
所述发酵培养基(6.7)溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆干粉12g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵3g/L、七水硫酸镁12.5g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L。
所述辅液溶剂为水，溶质及其浓度分别为：烟酸1g/L、盐酸硫铵1g/L、生物素0.015g/L。
再进一步的，所述步骤a前还包括将所述重组菌在抗性培养基平板中进行活化的步骤；所述抗性培养基平板是在基础培养基中添加氨苄青霉素得到的；所述氨苄青霉素在所述抗性培养基平板中的浓度为100μg/mL。
更进一步的，所述活化的条件可为在温度为32℃，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养5～6天。
所述步骤a中的培养条件可为在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养至OD600nm值＝1.5。
所述步骤b中的培养条件为在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养72h。
本发明通过对类球红细菌的辅酶Q10生物合成途径进行分析，首次发现了在糖酵解途径和辅酶Q10的能量转换途径中影响目标产物辅酶Q10合成的关键基因，其中，糖酵解途径中影响目标产物辅酶Q10合成的关键基因为磷酸果糖激酶(PFK)和环腺苷酸依赖蛋白激酶(PKAC)，辅酶Q10的能量转换途径中影响目标产物辅酶Q10合成的关键基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和ATP水解酶(KdpC)，对上述关键基因进行代谢工程改造，获得了高产辅酶Q10的代谢工程改造菌。
附图说明
图1为辅酶Q10标准曲线。
图2为葡萄糖标准曲线。
图3为NADH，NAD+和ATP标准曲线。
图4为VK-2-3，RS.PFK，RS.PKAC和RS.PFK-PKAC的辅酶Q10产量、产率、细胞干重和生产性能检测结果。
图5为VK-2-3，RS.PFK，RS.PKAC和RS.PFK-PKAC的发酵液中残糖浓度检测结果。
图6为VK-2-3，RS.KdpC，RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH的发酵液中残糖浓度检测结果。
图7为VK-2-3，RS.KdpC，RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH的辅酶Q10产量、产率、细胞干重、生产性能和NADH/NAD+检测结果。
图8为VK-2-3，RS.KdpC，RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH的ATP浓度检测结果。
保藏说明
拉丁名：Rhodobacter sphaeroides
菌株编号：VK-2-3
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国武汉市武汉大学
保藏日期：2021年6月21日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO:M 2021735
拉丁名：Rhodobacter sphaeroides
菌株编号：RS.GAPDH
保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心
保藏机构简称：GDMCC
地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
保藏日期：2021年12月6日
保藏中心登记入册编号：GDMCC NO:62095
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pBBR1MCS-4质粒是淼灵质粒平台(www.miaolingbio.com)的产品，货号为P0308。
实施例1、类球红细菌VK-2-3的获得、鉴定与保藏
一、类球红细菌VK-2-3的获得
1、重离子诱变
将类球红细菌V-0(Rhodobacter sphaeroides)培养至对数期，吸取2mL菌液装入无菌辐照皿中并用封口膜密封，然后转移至辐照室用12C6+离子束进行辐照诱变(辐照速率为40Gy/min；重离子诱变选择的辐照剂量分别为：25Gy、50Gy、75Gy、100Gy、125Gy、150Gy、175Gy、200Gy、225Gy、250Gy、275Gy和300Gy；每个辐照剂量设3个平行样，并设对照组)。然后通过筛选得到类球红细菌V-4(V代表具有维生素K3抗性；4代表重离子诱变剂量为100Gy)，类球红细菌V-4记载于如下文献：重离子诱变类球红细菌提高辅酶Q10产量，内蒙古工业大学学报，Vol.39No.22020。
2、高压芒刺电场诱变
(1)活化培养
从-70℃冰箱中取出类球红细菌V-4冻存管，室温缓慢解冻，然后采用稀释涂布法均匀涂布于基础培养基平板中，32℃培养5～6天。
(2)高压芒刺电场诱变
完成步骤(1)后，将平板上菌落长势良好的菌株作为诱变对象，进行高压芒刺电场诱变。诱变效果受诱变场强与诱变时间两个变量的影响，因此设计了4种场强下的2个诱变时间的8组诱变试验，分别为：2kv/cm诱变10min、2.6kv/cm诱变10min、3.2kv/cm诱变10min、3.8kv/cm诱变10min；2kv/cm诱变20min、2.6kv/cm诱变20min、3.2kv/cm诱变20min、3.8kv/cm诱变20min。最终得到24株诱变后的菌株，诱变结束后用接种环将诱变菌落挑入0.9％生理盐水中备用。
二、类球红细菌VK-2-3的鉴定
1、初筛
吸取实施例1的步骤一(2)得到的菌液100μL于离心管，用无菌水稀释至10-6稀释度后取40μL均匀涂布于含不同筛选物的基础培养基平板(L代表氯霉素浓度为1.9mg·L-1，R代表罗红霉素浓度为6.0mg·L-1，K代表卡那霉素浓度为45mg·L-1)，培养5～6天。培养条件：避光、32℃，空气湿度35％～45％。
氯霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加氯霉素和维生素K3得到的；培养基中，氯霉素的浓度为1.9mg·L-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L-1。
罗红霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加罗红霉素和维生素K3得到的；培养基中，罗红霉素的浓度为6.0mg·L-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L-1。
卡那霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加卡那霉素和维生素K3得到的；培养基中，卡那霉素的浓度为45mg·L-1，维生素K3的浓度为5.0mg·L-1。
基础培养基(pH7.2)溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、琼脂粉20g/L、辅液1mL/L。其中，辅液溶剂为水，溶质及其浓度分别为：烟酸1g/L、盐酸硫铵1g/L、生物素0.015g/L。
从氯霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和氯霉素双抗菌株，即类球红细菌VL-1-1、类球红细菌VL-1-2、类球红细菌VL-1-3、类球红细菌VL-1-4、类球红细菌VL-2-1、类球红细菌VL-2-2、类球红细菌VL-2-3、类球红细菌VL-2-4。
从罗红霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和罗红霉素双抗菌株，即类球红细菌VR-1-1、类球红细菌VR-1-2、类球红细菌VR-1-3、类球红细菌VR-1-4、类球红细菌VR-2-1、类球红细菌VR-2-2、类球红细菌VR-2-3、类球红细菌VR-2-4。
从卡那霉素筛选平板上获得了多株维生素K3和卡那霉素双抗菌株，即类球红细菌VK-1-1、类球红细菌VK-1-2、类球红细菌VK-1-3、类球红细菌VK-1-4、类球红细菌VK-2-1、类球红细菌VK-2-2、类球红细菌VK-2-3、类球红细菌VK-2-4。
2、复筛
供试菌株分别为：步骤二初筛得到的抗性菌株以及类球红细菌V-4。
(1)将供试菌株接种于抗性培养基平板在温度为32℃，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养5～6天。
(2)完成步骤(1)后，将单菌落用接种环挑入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养至OD600nm值＝1.5(此时达到对数生长期)，得到种子液。将6mL种子液接种于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养72h。
种子培养基(7.2)溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖3g/L、氯化钠2g/L、酵母提取粉8g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L。
发酵培养基(6.7)溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆干粉12g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵3g/L、七水硫酸镁12.5g/L、氯化钴0.01g/L、辅液1mL/L。
(3)完成步骤(2)后，检测辅酶Q10产量。
(4)完成步骤(2)后，取样5mL培养体系，转移至50mL的棕色容量瓶中，先加1mol·L-1的盐酸水溶液0.5mL，然后加入30％过氧化氢水溶液0.5mL，再加入适量无水乙醇，于超声波清洗仪中超声2～3分钟至气泡全部被赶出后加入无水乙醇定容至50mL，控制超声波清洗仪中水温在55～60℃，然后超声破碎45分钟，最后用0.22μm有机系针筒式滤膜过滤并收集滤液。
(5)取步骤(4)得到的滤液，进行高效液相色谱检测。
高效液相色谱检测辅酶Q10含量的参数见表1。
表1高效液相色谱检测辅酶Q10含量的检测条件
色谱柱型号 C18反相柱(4.6mm×150mm×5μm)
流动相 甲醇：无水乙醇(体积比)＝65：35
检测波长 275nm
流速 1.0～2.0mL/min
进样量 10μL
柱温 35℃
运行时间 20min
辅酶Q10标准品按照表1的参数进行高效液相色谱检测，出峰时间为14min。辅酶Q10浓度和峰面积的标准曲线见图1。
根据标准曲线完成步骤(2)的培养体系中的辅酶Q10产量计算，单位为mg·L-1。
维生素K3和氯霉素双抗菌株的筛选结果见表2。在相同的发酵培养条件下，类球红细菌VL-2-3的辅酶Q10产量高于类球红细菌V-4，较类球红细菌V-4提高了2.33％。
表2维生素K3和氯霉素双抗条件下菌株的筛选结果
菌株编号 辅酶Q10产量(mg·L-1) 增长率
V-4 356.62±4.52ABa ——
VL-1-1 306.11±4.31De -14.16％
VL-1-2 346.18±6.93ABbc -2.92％
VL-1-3 336.01±12.02BCbcd -5.78％
VL-1-4 318.17±7.34CDde -10.78％
VL-2-1 331.18±4.84BCDcd -7.13％
VL-2-2 354.57±4.22ABab -0.57％
VL-2-3 364.94±15.66Aa 2.33％
VL-2-4 353.17±8.15ABab -0.97％
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
维生素K3和罗红霉素双抗菌株的筛选结果见表3。在相同的发酵培养条件下，维生素K3和罗红霉素双抗菌株的辅酶Q10产量相对于类球红细菌V-4均未提高。
表3维生素K3和罗红霉素双抗条件下菌株的筛选结果
菌株编号 辅酶Q10产量(mg·L-1) 增长率
V-4 361.43±5.81Aa ——
VR-1-1 342.28±9.10Aab -5.30％
VR-1-2 309.23±9.50BCc -14.44％
VR-1-3 334.38±10.09ABb -7.49％
VR-1-4 283.61±10.98CDd -21.53％
VR-2-1 265.60±5.63Dd -26.51％
VR-2-2 352.76±12.66Aab -2.40％
VR-2-3 360.04±1.44Aa -0.39％
VR-2-4 342.84±5.47Aab -5.14％
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
维生素K3和卡那霉素双抗菌株的筛选结果见表4。VK-1-4与VK-2-1在筛选平板上没有生长。在相同的发酵培养条件下，类球红细菌VK-2-3的辅酶Q10产量高于类球红细菌V-4，较类球红细菌V-4提高了4.15％，差异显著。
表4维生素K3和卡那霉素双抗条件下菌株的筛选结果
菌株编号 辅酶Q10产量(mg·L-1) 增长率
V-4 370.83±2.49Ab ——
VK-1-1 294.05±12.17Bc -20.71％
VK-1-2 292.62±1.69Bc -21.09％
VK-1-3 270.17±5.31Cd -27.14％
VK-2-2 301.73±7.88Bc -18.64％
VK-2-3 386.22±0.67Aa 4.15％
VK-2-4 373.67±0.13Aab 0.76％
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
三、类球红细菌VK-2-3的保藏
VK-2-3菌株已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学)，其分类命名为Rhodobacter sphaeroides，保藏编号为CCTCCNO:M 2021735。
实施例2、重组质粒及重组菌的构建
1、重组质粒的构建
将序列表中序列1所示的双链DNA分子(磷酸果糖激酶编码基因pfk)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-pfk。
将序列表中序列3所示的双链DNA分子(环腺苷酸依赖蛋白激酶编码基因pkac)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的Hind III和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-pkac。
将序列表中序列1所示的双链DNA分子(磷酸果糖激酶编码基因pfk)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的BamH I和Hind III酶切位点之间，且将序列表中序列3所示的双链DNA分子(环腺苷酸依赖蛋白激酶编码基因pkac)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的Hind III和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac。
将序列表中序列5所示的双链DNA分子(ATP水解酶编码基因kdpc)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-kdpc。
将序列表中序列7所示的双链DNA分子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gapdh)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的Hind III和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh。
将序列表中序列5所示的双链DNA分子(ATP水解酶编码基因kdpc)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的BamH I和Hind III酶切位点之间，且将序列表中序列7所示的双链DNA分子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gapdh)插入pBBR1MCS-4质粒(具有氨苄青霉素抗性)的Hind III和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-4-kdpc-gapdh。
上述各个重组质粒均已进行测序验证。
2、重组菌的构建
采用电转法分别将步骤1制备的各个重组质粒导入类球红细菌VK-2-3的感受态细胞中，分别得到重组菌。
将重组质粒pBBR1MCS-4-pfk导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.PFK；
将重组质粒pBBR1MCS-4-pkac导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.PKAC；
将重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.PFK-PKAC；
将重组质粒pBBR1MCS-4-kdpc导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.KdpC；
将重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.GAPDH；
将重组质粒pBBR1MCS-4-kdpc-gapdh导入类球红细菌VK-2-3中得到的重组菌记作RS.KdpC-GAPDH。
三、重组菌RS.GAPDH的保藏
重组菌RS.GAPDH已于2021年12月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，其分类命名为Rhodobactersphaeroides，保藏编号为GDMCC NO:62095。
实施例3、利用重组菌发酵生产辅酶Q10
供试菌株：实施例1中的类球红细菌VK-2-3，实施例2中构建的重组菌RS.PFK、RS.PKAC、RS.PFK-PKAC、RS.KdpC、RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH。
将供试菌株按照如下步骤进行操作：
1、菌株初筛
将供试菌株涂布到氨苄青霉素抗性平板培养基上，在温度为32℃，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养5～6天。
氨苄青霉素抗性平板培养基是在基础培养基中添加氨苄青霉素得到的；培养基中，氨苄青霉素的浓度为100μg/mL。
2、摇瓶复筛
将氨苄青霉素抗性平板上长势较好的单菌落用接种环挑入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养至OD600nm值＝1.5(此时达到对数生长期)，得到种子液。
将6mL种子液接种于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中，每株三个平行样，在温度为32℃，摇床转速为220rpm，空气湿度为35％～45％，避光条件下培养72h，得到发酵液。
3、测定发酵液中辅酶Q10产量、残糖浓度、细胞干重、NAD+浓度、NADH浓度、ATP浓度，并计算辅酶Q10产率、生产性能和NADH/NAD+，从而复筛出高产菌株。同时从种子液中取一部分送至上海生工测序，以验证高产菌株中确实导入了相应目标基因。
按照如下公式计算辅酶Q10产率：辅酶Q10产率(mg/g)＝辅酶Q10产量(mg/L)÷细胞干重(g/L)。
按照如下公式计算辅酶Q10生产性能：辅酶Q10生产性能[mg/(g·g·h·L)]＝A÷(B×C×D)。其中，A为辅酶Q10产率(单位为mg/g)；B为糖消耗量(发酵培养基中的初始葡萄糖含量减去发酵液中的残糖含量，单位为g/L)；C为发酵液体积(单位为L)；D为发酵时间(单位为h)。
按照如下公式计算NADH/NAD+：NADH/NAD+＝NADH浓度/NAD+浓度。
辅酶Q10产量的具体检测方法见实施例1步骤二。
残糖浓度的具体检测方法如下：
(1)葡萄糖标准曲线的绘制
准确称取10g的葡萄糖标准品，用5mmol/L稀硫酸溶液定容至100mL，配制成100g/L的葡萄糖标准品母液，按照表5稀释至不同浓度，得到不同浓度的葡萄糖标准品溶液。高效液相色谱检测不同浓度的葡萄糖标准品溶液，参数见表6。葡萄糖浓度和峰面积的标准曲线见图2。
表5葡萄糖标准曲线的绘制
表6高效液相色谱检测葡萄糖浓度的检测条件
项目 条件
流动相 5mmol/L H2SO4
进样量 20μL
流动相流速 0.5mL/min
柱温 50℃
色谱柱 Aminex HPX-87H column(300mm×7.8mm×9μm)，美国伯乐
检测器 Waters 2414RI示差检测器
(2)样品处理及检测
取5mL发酵液利用台式高速离心机在4200rpm下离心15min，去除菌体和杂质，取上清经0.22μm的水系滤膜过滤后进行高效液相色谱检测，利用(1)中的标准曲线计算葡萄糖浓度即为发酵液中残糖浓度。
细胞干重的具体检测方法如下：
(1)将若干个干燥的50mL离心管置于95℃的烘箱中，使其水分彻底烘干后取出，待试管冷却后称重并记录m空。
(2)在每个试管中分别准确加入40mL的发酵液，注意发酵液需要摇匀。
(3)在转速为13000r/min的高速冷冻离心机离心10min。
(4)离心完毕后，取出试管，彻底去除上清液，尽量不要吸出沉淀。然后把试管放入95℃烘箱中烘干至恒重。
(5)待试管冷却后称重并记录m烘干。
(6)按照如下公式计算菌体(细胞)干重：菌体(细胞)干重＝m烘干－m空。
NADH，NAD+和ATP浓度的具体检测方法如下：
(1)NADH，NAD+和ATP标准曲线绘制
准确称取0.1g NADH，NAD+和ATP标准品溶于1L 0.2mol/L的PBS缓冲液(甲液：准确称取23.996g的Na2HPO4，加蒸馏水定容到1L；乙液：准确称取28.392g的KH2PO4，加蒸馏水定容到1L。将甲液与乙液按不同的比例混合调节pH＝7.0)中，配制成终浓度为100mg/L的NADH，NAD+和ATP母液，按照表7稀释到不同浓度，得到不同浓度的NADH，NAD+和ATP标准品溶液，高效液相色谱分别检测不同浓度的NADH，NAD+和ATP标准品溶液，参数见表8，利用测定254nm处波长，以NADH，NAD+和ATP浓度对λ254下的最大吸收波长绘制标准曲线图。NADH，NAD+和ATP标准曲线见图3。
测定NADH和NAD+所需流动相为：准确称取10.93g NaH2PO4和3.04g Na2HPO4溶于水中，加入四丁基溴化铵3.22g，用10％的NaOH调节pH为6.5，真空抽滤后定容至1L，按86:14(v:v)比例与乙腈混合。
测定ATP所需流动相为：准确称取13.6g的KH2PO4，加0.1mol/L的NaOH溶液152mL，定容至1000mL，调节pH到6.5。
表7 NADH，NAD+和ATP标准曲线测定
100mg/L NADH，NAD+，ATP母液(mL) PBS缓冲液(mL) NADH，NAD+，ATP终浓度(mg/L)
0 10 0
0.5 9.5 5
1.0 9.0 10
1.5 8.5 15
2.0 8.0 20
2.5 7.5 25
3.0 7.0 30
3.5 6.5 35
4.0 6.0 40
4.5 5.5 45
表8高效液相色谱检测NADH，NAD+和ATP的检测条件
(2)样品处理及检测
取5mL发酵液利用台式高速离心机在4℃，8000r/min的条件下离心10min得细胞沉淀。将湿细胞重新悬浮在5mL 0.2mol/L的PBS磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，超声破碎10min(功率22％，破碎10s，间隔10s)，离心，并将上清液经0.22μm的滤膜过滤后进行高效液相色谱检测，利用(1)中的标准曲线计算NADH，NAD+和ATP浓度。
4、检测结果
辅酶Q10产量、产率、细胞干重、生产性能及NADH/NAD+的检测结果如表9、表10、图4和图7所示。结果显示：和VK-2-3菌株相比，RS.PKAC，RS.PFK-PKAC和RS.GAPDH的辅酶Q10产量和产率及生产性能均有所提高，其中，RS.GAPDH的NADH/NAD+较VK-2-3菌株也有所提高。
发酵液中残糖浓度检测结果如表11、表12、图5和图6所示。结果显示：和VK-2-3菌株相比，RS.PKAC，RS.PFK-PKAC和RS.GAPDH的发酵液残糖浓度均有所降低。
ATP浓度检测结果如表13和图8所示。结果显示：和VK-2-3菌株相比，RS.GAPDH的ATP浓度显著提高。
表9 VK-2-3，RS.PFK，RS.PKAC，RS.PFK-PKAC辅酶Q10产量等参数检测结果
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
表10 VK-2-3，RS.KdpC，RS.GAPDH，RS.KdpC-GAPDH辅酶Q10产量等参数检测结果
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
表11 VK-2-3、RS.PFK、RS.PKAC和RS.PFK-PKAC发酵液中残糖浓度检测结果
菌株 发酵液中残糖浓度(g/L)
VK-2-3 3.10±0.14Cc
RS.PFK 5.05±0.21Aa
RS.PKAC 1.95±0.07De
RS.PFK-PKAC 2.43±0.04Dd
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
表12 VK-2-3、RS.kdpC、RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH发酵液中残糖浓度检测结果
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
表13 VK-2-3、RS.kdpC、RS.GAPDH和RS.KdpC-GAPDH发酵液中ATP浓度检测结果
菌株 ATP浓度(mg/L)
VK-2-3 101.73×10-3±0.4×10-3Bb
RS.KdpC 91.19×10-3±0.1×10-3Cc
RS.GAPDH 152.12×10-3±0.1×10-3Aa
RS.KdpC-GAPDH 76.04×10-3±0.1×10-3Dd
注：肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 内蒙古工业大学
<120> 高产辅酶Q10的代谢工程改造菌及其制备方法与应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 945
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgatcccca ttctcacgtt gacgctgaac ccggcgatcg acctcgcggc cgacgtgccg 60
caggtcctgc cgggcatcaa gctgcgctgc accgagcccc gggtcgatcc gggcggcggc 120
ggtctgaacg tcagccgcgc catccgcatc ctcggcggcc ggagcaccgc cttcgtggcc 180
ctgggcggca acatcggcgg gcggctggcc gccctggtcg cggcggccgg catcgagatc 240
gtgcccttct cgggccccgg cgagacgcgc gaaagcctca ccgtcaccga aacggccacg 300
ggccggcagt tccgcttcat gctgccgggc gccgcctggg acgcagagcg cgtcgaggcc 360
gctctggccc ggatcgaccg cgccgtgccc gaaggcggca tggtggtcct ctcggggtcg 420
ctgccgcccg gcgtgccggc cgacttcccg gccatggtct cccgggtgct gggcaagcgc 480
gcccggcttc tggtcgacac gtccggcgcg ccgctcgccc atctcgccgc gggcggggtg 540
cccgacctcg acatcctgcg gatggacgat ggcgaggccg cgagcctcgc cggccgcccc 600
ctcgcctgcg cctccgaaac ggccgatttc gcctcgatcc tcgtggcccg cggcgtggcc 660
gagtgcgtga tcgtcgcccg cggcgccgac ggctcggtcc tcgccgatgc ccgcggccgc 720
tggcacgccc gctccgaacc ggtcgaggtg gtgagcgcgg tgggtgcggg cgacacgttc 780
gtcggcgcct tcgtcctcgc cctctcgcgg ggcgccccgc cggaagaggc cctggcccat 840
ggcgtggccg gcgccgcggc ggccgtcctc accgaggcga ccgaactctg ccatcccgag 900
gatgtggcgc gcctcctgcc ctcctgtgcc gcgacggccc tctga 945
<210> 2
<211> 314
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ile Pro Ile Leu Thr Leu Thr Leu Asn Pro Ala Ile Asp Leu Ala
1 5 10 15
Ala Asp Val Pro Gln Val Leu Pro Gly Ile Lys Leu Arg Cys Thr Glu
20 25 30
Pro Arg Val Asp Pro Gly Gly Gly Gly Leu Asn Val Ser Arg Ala Ile
35 40 45
Arg Ile Leu Gly Gly Arg Ser Thr Ala Phe Val Ala Leu Gly Gly Asn
50 55 60
Ile Gly Gly Arg Leu Ala Ala Leu Val Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile
65 70 75 80
Val Pro Phe Ser Gly Pro Gly Glu Thr Arg Glu Ser Leu Thr Val Thr
85 90 95
Glu Thr Ala Thr Gly Arg Gln Phe Arg Phe Met Leu Pro Gly Ala Ala
100 105 110
Trp Asp Ala Glu Arg Val Glu Ala Ala Leu Ala Arg Ile Asp Arg Ala
115 120 125
Val Pro Glu Gly Gly Met Val Val Leu Ser Gly Ser Leu Pro Pro Gly
130 135 140
Val Pro Ala Asp Phe Pro Ala Met Val Ser Arg Val Leu Gly Lys Arg
145 150 155 160
Ala Arg Leu Leu Val Asp Thr Ser Gly Ala Pro Leu Ala His Leu Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Val Pro Asp Leu Asp Ile Leu Arg Met Asp Asp Gly Glu
180 185 190
Ala Ala Ser Leu Ala Gly Arg Pro Leu Ala Cys Ala Ser Glu Thr Ala
195 200 205
Asp Phe Ala Ser Ile Leu Val Ala Arg Gly Val Ala Glu Cys Val Ile
210 215 220
Val Ala Arg Gly Ala Asp Gly Ser Val Leu Ala Asp Ala Arg Gly Arg
225 230 235 240
Trp His Ala Arg Ser Glu Pro Val Glu Val Val Ser Ala Val Gly Ala
245 250 255
Gly Asp Thr Phe Val Gly Ala Phe Val Leu Ala Leu Ser Arg Gly Ala
260 265 270
Pro Pro Glu Glu Ala Leu Ala His Gly Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Val Leu Thr Glu Ala Thr Glu Leu Cys His Pro Glu Asp Val Ala Arg
290 295 300
Leu Leu Pro Ser Cys Ala Ala Thr Ala Leu
305 310
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgttcatac acgatcctga cccgacaatc accgattgca gaaactgtcc gctccggcgg 60
aaaccgctgt tccttccctt ctccgacagc gagctctcct tcatggagca gttcaaggtg 120
ggcgagctgg tcgtcgcgcc cggcgtcact gtgctcgagg aggggcaggg cagcgcgcat 180
ctcttcaccg tcctgagcgg gctcggcatc cgctcgacca tgctcgagaa cggccggcgt 240
caggtcatca acttcctctt cccgggcgat ttcatcgggc tgcaggccgg tctggcggga 300
gagatgcgcc attcggtgga aagcacgacc accatggtgc tctgtgtctt caaccgcgcg 360
gatctgtggg atctgttccg ggaagagccg gagcgtgcct acgacctcac ctggatcgca 420
gcggtcgagg agcatttcct gggcgagacc atcgcctcgc tcggccagcg ggacgcgacc 480
gagcggctgg cctgggcgct gctgcgcatc catgagcggc tgtcggccat cggcctcgcc 540
gagcggggcc gggtgccgat gccctggcgg cagcaggatc tggcggatgc gctgggactg 600
tcgctcgttc acaccaacaa gacgatccgc cgcctgcgcg agacgggcca cgcgctgtgg 660
gaggggggca ccctgttcgt cgaccgggag cggctcgcca cgctggcact ggccgatccc 720
gaccgtccgc gccgcaggcc cctcatctga 750
<210> 4
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Phe Ile His Asp Pro Asp Pro Thr Ile Thr Asp Cys Arg Asn Cys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Arg Lys Pro Leu Phe Leu Pro Phe Ser Asp Ser Glu Leu
20 25 30
Ser Phe Met Glu Gln Phe Lys Val Gly Glu Leu Val Val Ala Pro Gly
35 40 45
Val Thr Val Leu Glu Glu Gly Gln Gly Ser Ala His Leu Phe Thr Val
50 55 60
Leu Ser Gly Leu Gly Ile Arg Ser Thr Met Leu Glu Asn Gly Arg Arg
65 70 75 80
Gln Val Ile Asn Phe Leu Phe Pro Gly Asp Phe Ile Gly Leu Gln Ala
85 90 95
Gly Leu Ala Gly Glu Met Arg His Ser Val Glu Ser Thr Thr Thr Met
100 105 110
Val Leu Cys Val Phe Asn Arg Ala Asp Leu Trp Asp Leu Phe Arg Glu
115 120 125
Glu Pro Glu Arg Ala Tyr Asp Leu Thr Trp Ile Ala Ala Val Glu Glu
130 135 140
His Phe Leu Gly Glu Thr Ile Ala Ser Leu Gly Gln Arg Asp Ala Thr
145 150 155 160
Glu Arg Leu Ala Trp Ala Leu Leu Arg Ile His Glu Arg Leu Ser Ala
165 170 175
Ile Gly Leu Ala Glu Arg Gly Arg Val Pro Met Pro Trp Arg Gln Gln
180 185 190
Asp Leu Ala Asp Ala Leu Gly Leu Ser Leu Val His Thr Asn Lys Thr
195 200 205
Ile Arg Arg Leu Arg Glu Thr Gly His Ala Leu Trp Glu Gly Gly Thr
210 215 220
Leu Phe Val Asp Arg Glu Arg Leu Ala Thr Leu Ala Leu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Asp Arg Pro Arg Arg Arg Pro Leu Ile
245
<210> 5
<211> 558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgatgaccc atctccgccc cgcgctggcg agccttctgg cgctgagcct gctgaccggc 60
gtggcctatc cgctggccct gaccggcctc gcggccgtca tcgcccccga ccgcgccgcg 120
ggcagcctga tcctgcgcga ggggcaggtc gtgggctcgg ccctgatcgg gcagggcttc 180
gagggcccgg gctatctgca tccccgtccc tcggcgagcg actggaacgc ggccggcacc 240
tccgcctcga acctcgggcc gacctcggct gcgctgctgg cccaagtgca ggagcggcag 300
acggcctatg aggcgcaaaa cggcgcctcc gctccggtcg atgcggtcac cgcctcgggc 360
agcgggctcg atccccatgt ctcgcccgcc aatgcccggg cgcaggcggg ccgcatcgcc 420
cgcgcccgcg gcctggagga ggccgccgtg cgccgcctga tcgaggccca tgtcgagccg 480
ccgctgctgg gtctctgggg gcaggcgcgg gtcaatgtgc tggccgtcaa cctcgcgctc 540
gacgcggccg gggcctga 558
<210> 6
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Met Thr His Leu Arg Pro Ala Leu Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Val Ala Tyr Pro Leu Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala
20 25 30
Val Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ala Gly Ser Leu Ile Leu Arg Glu Gly
35 40 45
Gln Val Val Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln Gly Phe Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Tyr Leu His Pro Arg Pro Ser Ala Ser Asp Trp Asn Ala Ala Gly Thr
65 70 75 80
Ser Ala Ser Asn Leu Gly Pro Thr Ser Ala Ala Leu Leu Ala Gln Val
85 90 95
Gln Glu Arg Gln Thr Ala Tyr Glu Ala Gln Asn Gly Ala Ser Ala Pro
100 105 110
Val Asp Ala Val Thr Ala Ser Gly Ser Gly Leu Asp Pro His Val Ser
115 120 125
Pro Ala Asn Ala Arg Ala Gln Ala Gly Arg Ile Ala Arg Ala Arg Gly
130 135 140
Leu Glu Glu Ala Ala Val Arg Arg Leu Ile Glu Ala His Val Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Leu Gly Leu Trp Gly Gln Ala Arg Val Asn Val Leu Ala Val
165 170 175
Asn Leu Ala Leu Asp Ala Ala Gly Ala
180 185
<210> 7
<211> 1002
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgaccgtga aagtggcaat caacggcttc ggccgcatcg ggcggaacgt gctccgcgcc 60
atcatcgaat cgggccggac cgatatcgag gtggtggcga tcaacgatct cggcccggtc 120
gagaccaacg cgcacctgct gcgcttcgac tcggtccacg gccgcttccc cgccaccgtc 180
accaccaccg agaagaccat cgacgtgggc cgcggcccga tggatgtgac cgcgatccgc 240
aacccggccg agcttccctg gggccatgtc gacatcgtga tggaatgcac cggcatcttc 300
accgacaagg agaaggcgaa gatccacctc gagaacggcg ccaagcgcgt gctggtctcc 360
gccccctcga ccggcgcgga caagaccatc gtcttcggcg tgaaccacga gacgctgacg 420
aaggacgatc tcgtcgtctc gaacgcctcc tgcacgacga actgcctctc gccggtggcc 480
aaggtgctga acgacacgat cggcatcacc aagggcttca tgaccacgat ccacagctac 540
accggcgacc agccgacgct ggacacaatg cacaaggatc tctaccgcgc gcgggccgcg 600
gcgctgagca tgatccccac ctcgaccggc gccgccaagg ccgtgggcct cgtgctgccg 660
gaactgaagg gcaagctcga cggcgtggcg atccgggtgc cgacgccgaa cgtctcggtg 720
gtggacctcg tgttcgaagc ctcgcgcgcg accagcgtcg aggaagtgaa cgccgccatc 780
cgcgaggccg ccgacggcaa gctgaagggc atcctcggct ataccgacca gcccaacgtc 840
tcgatggact tcaaccacga tccgcacagc tcgatcttcc acctcgacca gaccaaggtc 900
atggaaggca acatggtgcg gatcctgacc tggtacgaca acgaatgggg cttctcgaac 960
cgcatggccg atacggccgt ggccatgggc aagctcatct ga 1002
<210> 8
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Met Thr Val Lys Val Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn
1 5 10 15
Val Leu Arg Ala Ile Ile Glu Ser Gly Arg Thr Asp Ile Glu Val Val
20 25 30
Ala Ile Asn Asp Leu Gly Pro Val Glu Thr Asn Ala His Leu Leu Arg
35 40 45
Phe Asp Ser Val His Gly Arg Phe Pro Ala Thr Val Thr Thr Thr Glu
50 55 60
Lys Thr Ile Asp Val Gly Arg Gly Pro Met Asp Val Thr Ala Ile Arg
65 70 75 80
Asn Pro Ala Glu Leu Pro Trp Gly His Val Asp Ile Val Met Glu Cys
85 90 95
Thr Gly Ile Phe Thr Asp Lys Glu Lys Ala Lys Ile His Leu Glu Asn
100 105 110
Gly Ala Lys Arg Val Leu Val Ser Ala Pro Ser Thr Gly Ala Asp Lys
115 120 125
Thr Ile Val Phe Gly Val Asn His Glu Thr Leu Thr Lys Asp Asp Leu
130 135 140
Val Val Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ser Pro Val Ala
145 150 155 160
Lys Val Leu Asn Asp Thr Ile Gly Ile Thr Lys Gly Phe Met Thr Thr
165 170 175
Ile His Ser Tyr Thr Gly Asp Gln Pro Thr Leu Asp Thr Met His Lys
180 185 190
Asp Leu Tyr Arg Ala Arg Ala Ala Ala Leu Ser Met Ile Pro Thr Ser
195 200 205
Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Leu Val Leu Pro Glu Leu Lys Gly
210 215 220
Lys Leu Asp Gly Val Ala Ile Arg Val Pro Thr Pro Asn Val Ser Val
225 230 235 240
Val Asp Leu Val Phe Glu Ala Ser Arg Ala Thr Ser Val Glu Glu Val
245 250 255
Asn Ala Ala Ile Arg Glu Ala Ala Asp Gly Lys Leu Lys Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Tyr Thr Asp Gln Pro Asn Val Ser Met Asp Phe Asn His Asp Pro
275 280 285
His Ser Ser Ile Phe His Leu Asp Gln Thr Lys Val Met Glu Gly Asn
290 295 300
Met Val Arg Ile Leu Thr Trp Tyr Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Asn
305 310 315 320
Arg Met Ala Asp Thr Ala Val Ala Met Gly Lys Leu Ile
325 330

Claims (10)

1.重组菌的构建方法，为如下1)-3)中的任一种：
1)包括如下步骤：将甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；
2)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌；
3)包括如下步骤：将环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因和磷酸果糖激酶的编码基因导入类球红细菌中，得到所述重组菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述类球红细菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)VK-2-3，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021735。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：
所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；
所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；
所述磷酸果糖激酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于：
所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因如序列表中序列7所示；
所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因如序列表中序列3所示；
所述磷酸果糖激酶的编码基因如序列表中序列1所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于：
所述1)中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-gapdh为将序列表中序列7所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒；
所述2)中，所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-pkac导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-pkac为将序列表中序列3所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒；
所述3)中，所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的编码基因和所述磷酸果糖激酶的编码基因通过重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac导入类球红细菌中；所述重组质粒pBBR1MCS-4-pfk-pkac为将序列表中序列1所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间，且将序列表中序列3所示的双链DNA分子插入pBBR1MCS-4质粒的Hind III和Kpn I酶切位点之间后得到的质粒。
6.由权利要求1-5任一所述的构建方法构建得到的重组菌。
7.一种重组菌，为重组类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)RS.GAPDH，其保藏编号为GDMCC NO:62095。
8.如下A1)-A10)中任一种应用：
A1)权利要求1-5任一所述的方法或权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的重组菌在生产辅酶Q10中的应用；
A2)权利要求1-5任一所述的方法或权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的重组菌在制备生产辅酶Q10的产品中的应用；
A3)权利要求1-5任一所述的方法或权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的重组菌在提高辅酶Q10产量或产率中的应用；
A4)权利要求1-5任一所述的方法或权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的重组菌在制备提高辅酶Q10产量或产率的产品中的应用；
A5)甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A6)甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用；
A7)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A8)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用；
A9)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料与磷酸果糖激酶或其相关生物材料在调控类球红细菌的辅酶Q10产量或产率中的应用；
A10)环腺苷酸依赖蛋白激酶或其相关生物材料与磷酸果糖激酶或其相关生物材料在制备高产辅酶Q10的重组菌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶相关生物材料为编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子或含有编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸分子的重组质粒；
所述环腺苷酸依赖蛋白激酶相关生物材料为编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子或含有编码所述环腺苷酸依赖蛋白激酶的核酸分子的重组质粒；
所述磷酸果糖激酶相关生物材料为编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子或含有编码所述磷酸果糖激酶的核酸分子的重组质粒。
10.一种辅酶Q10的生产方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的重组菌。
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