CN116926103A - 一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents
一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用。本发明通过在圆红冬孢酵母中异源表达粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2，以及酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶编码基因MET14，同时弱化脂肪酸合成途径关键基因ACC1，最终构建得到高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株。通过实验证明：该菌株以葡萄糖为唯一碳源，在5L发酵罐中培养72h，麦角硫因的产量可达6.2g/L。对于麦角硫因工业生产来说，本发明构建的高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株的构建方法及其应用，特别涉及一种异源表达粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2和酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶基因MET14，且弱化脂肪酸合成途径关键基因ACC1的圆红冬孢酵母工程菌株及其在发酵生产麦角硫因中的应用。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine，EGT)是在麦角真菌中发现的含硫氨基酸，在液体中，EGT以硫酮和硫醇的形式存在，在中性或碱性环境中以硫酮为主，是一种珍贵并且有效的抗氧化剂，在改善神经退行性疾病和心血管疾病方面具有巨大的潜力。麦角硫因在其他生物中也可以合成，如粗糙脉孢菌、分枝杆菌和丝状真菌等少量微生物，但产量最高的只有2mg/L。
麦角硫因的生产方法有化学合成法、提取法和微生物合成法。由于化学合成法和提取法成本高和工艺复杂，因此微生物发酵生产麦角硫因更受研究者青睐。在自然界中，EGT通过两种不同的途径产生：细菌途径和真菌途径。这两种途径都使用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，使用egtD编码的麦角硫因生物合成甲基转移酶或Egt1编码的麦角硫因生物合成蛋白1将组氨酸甲基化三次，形成组氨酸甜菜碱。在真菌途径中，组氨酸被Egt1甲基化3次以形成海西氨酸，然后相同的酶连接半胱氨酸生成海西半胱氨酸亚砜，再经β-裂解酶Egt2将丙酮酸铵与中间体分离，随后硫的还原产生EGT。与细菌相比，这种真菌途径只涉及两种酶，而且不需要γ-谷氨酰-半胱氨酸参与反应，因此在一定程度上消除了EGT与谷胱甘肽之间的生物合成竞争，故而比细菌途径更有效。
发明内容
本发明的目的是提供高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种产麦角硫因重组菌的构建方法。
本发明提供的产麦角硫因重组菌的构建方法包括如下步骤：提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性；且提高所述圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性，且降低所述圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性。
进一步的，所述麦角硫因合成酶Ncegt1为A1)或A2)所示的蛋白质：
A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt1活性的由A1)衍生的蛋白质；
所述麦角硫因合成酶Ncegt1的编码基因为a1)或a2)所示的DNA分子：
a1)序列表中序列1所示的DNA分子；
a2)与a1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt1的DNA分子。
所述麦角硫因合成酶Ncegt2为B1)或B2)所示的蛋白质：
B1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt2活性的由B1)衍生的蛋白质；
所述麦角硫因合成酶Ncegt2的编码基因为b1)或b2)所示的DNA分子：
b1)序列表中序列3所示的DNA分子；
b2)与b1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt2的DNA分子。
所述ATP硫酸化酶MET14为C1)或C2)所示的蛋白质：
C1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
C2)由序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ATP硫酸化酶MET14活性的由C1)衍生的蛋白质；
所述ATP硫酸化酶MET14的编码基因为c1)或c2)所示的DNA分子：
c1)序列表中序列8所示的DNA分子；
c2)与c1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述ATP硫酸化酶MET14的DNA分子。
所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1为D1)或D2)所示的蛋白质：
D1)由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
D2)由序列表中序列15所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1活性的由D1)衍生的蛋白质；
所述脂肪酸合成途径蛋白ACC1的编码基因为d1)或d2)所示的DNA分子：
d1)序列表中序列14所示的DNA分子；
d2)与d1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的DNA分子。
更进一步的，所述提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性的方法可为将提高麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
所述提高圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性的方法可为将提高ATP硫酸化酶基因MET14表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
所述降低圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性的方法为将敲除脂肪酸合成途径关键基因ACC1或其启动子的质粒导入圆红冬孢酵母中。
在本发明的一个具体实施例中，所述提高麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2表达量的质粒为2*Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒，所述2*Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒将Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒中Xba I和Spe I酶切位点之间的片段替换为Ppgk2-Ncegt1-P2A-Ncegt2-Tnos2片段(Ppgk2-Ncegt1-P2A-Ncegt2-Tnos2片段的核苷酸序列如序列7所示)后得到的质粒。所述Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoRⅤ酶切位点之间的片段替换为Ncegt1-P2A-Ncegt2片段(Ncegt1-P2A-Ncegt2片段的核苷酸序列如序列6所示)后得到的质粒。
所述提高ATP硫酸化酶基因MET14表达量的质粒为pkocar2-MET14质粒。所述pkocar2-MET14质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoRⅤ酶切位点之间的片段替换为MET14基因序列片段后得到的质粒。
所述敲除脂肪酸合成途径关键基因ACC1或其启动子的质粒为所述敲除脂肪酸合成途径关键基因ACC1启动子的质粒。所述敲除脂肪酸合成途径关键基因ACC1启动子的质粒为NM810-ACC1gRNA质粒。所述NM810-ACC1gRNA质粒为将sgRNA片段(sgRNA片段的核苷酸序列如序列12所示)连入至NM810载体的Bsa I酶切位点处后得到的质粒。
上述方法中，所述圆红冬孢酵母可为圆红冬孢酵母ΔKU70菌株。
在本发明的一个具体实施例中，所述重组菌具体可为圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001 CGMCC No.27505。
为了实现上述目的，本发明又提供了按照上述构建方法构建得到的重组菌。
为了实现上述目的，本发明还提供了一株圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides HYRT1001。
本发明提供的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001的保藏编号为CGMCCNo.27505。
所述圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001已于2023年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)。
为了实现上述目的，本发明还提供了如下1)-6)中任一所述的应用：
1)上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001在生产麦角硫因中的应用；
2)上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001在提高麦角硫因产量中的应用；
3)上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001在制备生产麦角硫因的产品中的应用；
4)上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001在制备提高麦角硫因产量的产品中的应用；
5)提高麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2含量和/或活性的物质和/或提高ATP硫酸化酶MET14含量和/或活性的物质和/或降低脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1含量和/或活性的物质在构建产麦角硫因重组菌中的应用；
6)提高麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2含量和/或活性的物质和/或提高ATP硫酸化酶MET14含量和/或活性的物质和/或降低脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1含量和/或活性的物质在制备构建产麦角硫因重组菌的产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明最后提供了一种生产麦角硫因的方法。
本发明提供的生产麦角硫因的方法包括如下步骤：将上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001进行发酵培养，得到发酵产物，所述发酵产物中含有麦角硫因。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
1)将上述重组菌或圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001接种于YPD液体培养基中培养，得到种子液；
2)将所述种子液接种于YPD液体培养基中培养，得到发酵产物。
更进一步的，所述1)中，所述培养的条件可为在30℃，250rpm条件下培养24h。
所述2)中，所述培养的条件可为28℃，转速500～800rpm，与溶氧偶联，溶氧控制40％，通气量4L/min，pH维持6.5条件下培养72h。
本发明首先通过在圆红冬孢酵母中异源表达粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2，构建得到麦角硫因产量提高的重组圆红冬孢酵母工程菌株Rt-1。进一步的，通过在重组菌Rt-1中过表达酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶编码基因MET14，同时弱化脂肪酸合成途径关键基因ACC1，最终构建得到高效生产麦角硫因的重组圆红冬孢酵母工程菌株HYRT1001。通过实验证明：HYRT1001菌株以葡萄糖为唯一碳源，在5L发酵罐中培养72h，麦角硫因的产量可达6.2g/L。对于麦角硫因工业生产来说，本发明构建的高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明中构建两种启动子分别表达Ncegt1和Ncegt2基因的质粒图谱。
图2为本发明中对两种启动子分别表达Ncegt1和Ncegt2基因质粒的双酶切验证图(SpeI/NcoI，11263bp/5490bp/783bp)，其中M为DNA Marker，1为SpeI/NcoI双酶切验证质粒。
图3为本发明中构建的Ncegt1-P2A-Ncegt2基因表达质粒图谱。
图4为本发明中对Ncegt1-P2A-Ncegt2表达质粒双酶切验证图(EcoRV/NcoI，12065bp/3017bp/783bp)，其中M为DNA Marker，1、2为EcoRV/NcoI双酶切验证质粒。
图5为本发明中构建的2*Ncegt1-P2A-Ncegt2基因表达质粒图谱。
图6为本发明中对2*Ncegt1-P2A-Ncegt2表达质粒双酶切验证图(EcoRV/XbaI，15006bp/6649bp)，其中M为DNA Marker，5号为EcoRV/XbaI双酶切验证正确的质粒。
图7为本发明中构建的MET14基因表达质粒的图谱。
图8为本发明中对MET14基因表达质粒双酶切验证图(Xba I/PmeI，10649bp/1709bp)，其中M为DNA Marker，1、2为Xba I/PmeI双酶切验证质粒。
图9为本发明中利用CRISPR-Cas9技术构建的ACC1基因的启动子gRNA质粒的图谱。
图10为本发明中对ACC1基因启动子的测序结果。突变位置见序列比对结果图。
图11为本发明中出发菌和重组菌摇瓶发酵生产麦角硫因的产量。
图12为本发明中出发菌和重组菌发酵罐发酵生产麦角硫因的产量。
保藏说明
中文名：圆红冬孢酵母
拉丁名：Rhodosporidium toruloides
菌株编号：HYRT1001
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年05月31日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.27505
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用引物序列如表1所示。
表1
下述实施例中的LB液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L，pH调至7.0-7.2，LB固体培养基添加1.5％(W/V)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至50-60℃左右时加入壮观霉素至终浓度150μg/mL。
下述实施例中的YPD液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：蛋白胨20g/L，酵母浸出物10g/L，葡萄糖20g/L，YPD固体培养基添加1.5％(W/V)的琼脂粉。115℃灭菌30min。
下述实施例中的IMA培养基的制备方法如下：15g琼脂粉加水至905.7mL，121℃灭菌20min，微波加热待琼脂完全溶解后，加入10mL K盐，20mL M盐，2.5mL 20％NH4NO3，1mL1％ CaCl2，5mL Z盐，10mL 0.01％ FeSO4·7H2O，20mL 20％葡萄糖，40mL 1M MES，10mL50％甘油。待IMA冷却至50℃左右，再加入4mL 0.1M AS。其中，K盐：20.5％ K2HPO4、14.5％KH2PO4，121℃灭菌20min；M盐：3％ MgSO4·7H2O、1.5％ NaCl、2.5％(NH4)2SO4，121℃灭菌20min；Z盐：0.01％ ZnSO4·7H2O、0.01％ CuSO4·5H2O、0.01％ H3BO3、0.01％MnSO4·H2O、0.01％ Na2MoO4·2H2O，滤膜过滤灭菌。
下述实施例中的pkocar2载体记载于文献“Koh CM,et al.Molecularcharacterization of KU70 and KU80 homologues and exploitation of a KU70-deficient mutant for improving gene deletion frequency in Rhodosporidiumtoruloides.BMC Microbiol.2014Feb 27；14:50.”中。
下述实施例中的NM810(NM8-5S-tRNA-tRNA-SgH)载体记载于文献“Schultz JC,etal..Development of a CRISPR/Cas9 system for high efficiency multiplexed genedeletion in Rhodosporidium toruloides.Biotechnol Bioeng.2019Aug；116(8):2103-2109.”中。
下述实施例中的pZPK-PGK-hyg-Tnos质粒记载于文献“Wang Y,etal.Overexpression ofΔ12-Fatty Acid Desaturase in the Oleaginous YeastRhodosporidium toruloides for Production of Linoleic Acid-Rich Lipids.ApplBiochem Biotechnol.2016Dec；180(8):1497-1507.”中。
下述实施例中的圆红冬孢酵母Δku70(Rt.Δku70)菌株记载于文献“Koh CM,etal.Molecular characterization of KU70 and KU80 homologues and exploitation ofa KU70-deficient mutant for improving gene deletion frequency inRhodosporidium toruloides.BMC Microbiol.2014Feb 27；14:50.”中。
实施例1、重组质粒的构建
一、由两种启动子分别控制转录异源表达麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2质粒的构建
1、委托南京擎科生物科技有限公司合成麦角硫因合成酶基因Ncegt1(核苷酸序列如序列1所示，编码序列2所示的蛋白)和麦角硫因合成酶基因Ncegt2(核苷酸序列如序列3所示，编码序列4所示的蛋白)。然后以Ncegt1基因序列为模板，以egt1-F/egt1-R为引物进行PCR扩增，扩增得到Ncegt1基因序列片段；以Ncegt2基因序列为模板，以egt2-F/egt2-R为引物进行PCR扩增，得到Ncegt2基因序列片段。
2、以pZPK-PGK-hyg-Tnos质粒为模板，以Tnos-F1/Tnos-R1为引物进行PCR扩增，得到Tnos1基因序列片段；以pZPK-PGK-hyg-Tnos质粒为模板，以Ppgk-F1/Ppgk-R1为引物进行PCR扩增，得到Ppgk1基因序列片段。通过重叠PCR将Ncegt1基因序列片段和Tnos1基因序列片段进行连接，得到Ncegt1-Tnos1片段；通过重叠PCR将Ncegt2基因序列片段和Ppgk1基因序列片段进行连接，得到Ppgk1-Ncegt2片段。
3、应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将Ncegt1-Tnos1片段和Ppgk1-Ncegt2片段与经Nco I和EcoRⅤ双酶切线性化后的pkocar2载体进行连接，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有150μg/mL壮观霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得正确质粒，并将其命名为Pgdp1-Ncegt1-Tnos1-Ppgk1-Ncegt2-T35s，其质粒图谱如图1所示。双酶切验证结果如图2所示。
Pgdp1-Ncegt1-Tnos1-Ppgk1-Ncegt2-T35s质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoRⅤ酶切位点之间的片段替换为Ncegt1-Tnos1-Ppgk1-Ncegt2片段(Ncegt1-Tnos1-Ppgk1-Ncegt2片段的核苷酸序列如序列5所示)后得到的载体。其中，Ncegt1基因和Ncegt2基因分别由启动子Pgpd1和Ppgk1控制转录。
二、由P2A肽连接异源表达麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2单拷贝质粒的构建
1、委托南京擎科生物科技有限公司合成麦角硫因合成酶基因Ncegt1和麦角硫因合成酶基因Ncegt2。然后以Ncegt1基因序列为模板，以egt1-F/egt1-P2A-R为引物进行PCR扩增，得到Ncegt1-P2A基因序列片段；以Ncegt2基因序列为模板，以egt2-P2A-F/egt2-R为引物进行PCR扩增，得到P2A-Ncegt2基因序列片段。
2、应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将Ncegt1-P2A基因序列片段、P2A-Ncegt2基因序列片段与经Nco I和EcoRⅤ双酶切线性化后的pkocar2载体进行连接，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有150μg/mL壮观霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得正确质粒，并将其命名为Ncegt1-P2A-Ncegt2，其质粒图谱如图3所示。双酶切验证结果如图4所示。
Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoRⅤ酶切位点之间的片段替换为Ncegt1-P2A-Ncegt2片段(Ncegt1-P2A-Ncegt2片段的核苷酸序列如序列6所示)后得到的载体。其中，Ncegt1基因和Ncegt2基因均由启动子Pgpd1控制转录。
三、由P2A肽连接异源表达麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2双拷贝质粒的构建
1、以pZPK-PGK-hyg-Tnos质粒为模板，以Ppgk-F2/Ppgk-R2为引物进行PCR扩增，得到Ppgk2基因序列片段；以pZPK-PGK-hyg-Tnos质粒为模板，以Tnos-F2/Tnos-R2为引物进行PCR扩增，得到Tnos2基因序列片段；以Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒为模板，以egt1-pgk-F/egt2-nos-R为引物进行PCR扩增，得到Ncegt1-P2A-Ncegt2基因序列片段。
2、应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将Ppgk2基因序列片段、Ncegt1-P2A-Ncegt2基因序列片段、Tnos2基因序列片段与经Xba I和Spe I双酶切线性化后的Ncegt1-P2A-Ncegt2载体进行连接，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有150μg/mL壮观霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得正确质粒，并将其命名为2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，其质粒图谱如图5所示。双酶切验证结果如图6所示。
2*Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒为将Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒中Xba I和Spe I酶切位点之间的片段替换为Ppgk2-Ncegt1-P2A-Ncegt2-Tnos2片段(Ppgk2-Ncegt1-P2A-Ncegt2-Tnos2片段的核苷酸序列如序列7所示)后得到的载体。该质粒中包括两个Ncegt1-P2A-Ncegt2片段，分别由启动子Pgpd1和启动子Ppgk2控制转录。
四、基因MET14质粒的构建
1、委托南京擎科生物合成MET14基因序列(核苷酸序列如序列8所示，编码序列9所示的蛋白)，以MET14基因序列为模板，以met14-F/met14-R为引物进行PCR扩增，得到MET14基因序列片段。
2、应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将MET14基因序列片段与经Nco I和EcoRⅤ双酶切线性化后的pkocar2载体进行连接，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有150μg/mL壮观霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得正确质粒，并将其命名为pkocar2-MET14，其质粒图谱如图7所示。双酶切验证结果如图8所示。
pkocar2-MET14质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoRⅤ酶切位点之间的片段替换为MET14基因序列片段后得到的载体。其中，MET14基因由启动子Pgpd1控制转录。
五、基因ACC1的启动子突变质粒的构建
1、根据ACC1基因启动子(核苷酸序列如序列10所示)序列设计sgRNA，设计的sgRNA靶序列如下：CAGCGGGAAGTTCGGTCGGG(序列11)，以引物gRNA-F/gRNA-R互为模板进行PCR扩增，得到sgRNA片段(sgRNA片段的核苷酸序列如序列12所示)。
2、利用BsaI酶切酶连的方法将sgRNA片段连接到经Bsa I酶线性化的NM810载体上，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL Kana的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，提质粒后送测序，并将测序正确的质粒命名为NM810-ACC1gRNA，其质粒图谱如图9所示。
NM810-ACC1gRNA质粒为将sgRNA片段连入至NM810载体的Bsa I酶切位点处后得到的载体。
实施例2、重组菌的构建
一、麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2表达圆红冬孢酵母菌株的构建
将含有实施例1步骤一中的Pgdp1-Ncegt1-Tnos-Ppgk-Ncegt2-T35s质粒的农杆菌与宿主菌株Rt.Δku70在IMA平板共培养，然后将共培养物转接于含有300μM头孢噻肟，150μg/mL潮霉素B的YPD平板中，30℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的YPD平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的Ncegt1和Ncegt2基因表达菌株Ncegt1和Ncegt2/OE。
二、麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2单拷贝表达圆红冬孢酵母菌株的构建
将含有实施例1步骤二中的Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒的农杆菌与宿主菌株Rt.Δku70在IMA平板共培养，然后将共培养物转接于含有300μM头孢噻肟，150μg/mL潮霉素B的YPD平板中，30℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的YPD平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的单拷贝Ncegt1和Ncegt2基因表达菌株Ncegt1-P2A-Ncegt2/OE。
三、麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2双拷贝表达圆红冬孢酵母菌株的构建
将含有实施例1步骤三中的2*Ncegt1-P2A-Ncegt2质粒的农杆菌与宿主菌株Rt.Δku70在IMA平板共培养，然后将共培养物转接于含有300μM头孢噻肟，150μg/mL潮霉素B的YPD平板中，30℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的YPD平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的双拷贝Ncegt1和Ncegt2基因表达菌株2*Ncegt1-P2A-Ncegt2/OE，并将其记作Rt-1。
四、基因MET14表达圆红冬孢酵母菌株的构建
将含有实施例1步骤四中的pkocar2-MET14质粒的农杆菌与重组菌Rt-1在IMA平板共培养，然后将共培养物转接于含有300μM头孢噻肟，150μg/mL潮霉素B的YPD平板中，30℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的YPD平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的MET14基因表达菌株(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14)/OE。
五、基因ACC1弱化圆红冬孢酵母菌株的构建
将含有实施例1步骤五构建的NM810-ACC1gRNA质粒的农杆菌与重组菌(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14)/OE在IMA平板共培养，然后将共培养物转接于含有300μM头孢噻肟，10μg/mL博莱霉素的YPD平板中，30℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有博莱霉素的YPD平板，筛选博莱霉素抗性转化子提取基因组，送测序验证，最终筛选得到ACC1启动子区域敲除的重组菌(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)，并将其记作HYRT1001。
测序结果表明：重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)为将重组菌(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14)/OE上的ACC1基因启动子序列(序列10)中的“CAGCGGGAAGTTCGGTCGGG(序列11)”替换为“CAGCGGGAGTTCGTCGGCG(序列13)”后得到的菌。测序比对结果如图10所示。
实施例3、重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)发酵与保藏一、重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)摇瓶发酵
供试菌株：出发菌Rt.ΔKU70、重组菌Rt-1(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2/OE)和重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)。
1、挑取YPD平板上的单菌落接种至5mL YPD液体培养基中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到培养后的菌液。
2、完成步骤1后，将培养后的菌液按5％接种量转接至含有发酵培养基的摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养120h，得到发酵液。
上述摇瓶中的发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 4.5g/L FeSO4·7H2O 0.1g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L，生物素0.5mg/L。
3、完成步骤2后，取1mL发酵液，加入0.5mm研磨珠，使用均质仪破碎菌体，然后将破碎后的菌体12000rpm离心10min，吸取上清液用于麦角硫因的检测。
4、完成步骤3后，采用高效液相色谱(HPLC)检测上清液中的麦角硫因，具体参数如下：高效液相色谱仪器为安捷伦1260，色谱柱Kromasil 100-5C18(150mm×4.6mm)，流动相为甲醇1：超纯水99，柱温30℃，波长254nm，流速0.5mL/min，进样量2μL。
结果如图11所示，结果表明：出发菌Rt.ΔKU70摇瓶发酵的麦角硫因产量为35.15mg/L，重组菌Rt-1的麦角硫因产量为560.25mg/L，重组菌HYRT1001的麦角硫因产量为925.4mg/L。
二、重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)的5L生物反应器分批补料发酵
供试菌株：出发菌Rt.ΔKU70、重组菌Rt-1(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2/OE)和重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)。
1、挑取YPD平板上的单菌落接种至20mL YPD液体培养基中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到培养后的菌液。
2、完成步骤1后，将培养后的菌液按5％接种量转接至100mL YPD液体培养基，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。
3、完成步骤2后，将种子液按10％接种量接种至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中，温度设定为28℃，转速500～800rpm，与溶氧偶联，溶氧控制40％，通气量设定为4L/min，补加氨水控制pH维持6.5，在发酵12-24h时，以10mL/h流加补料培养基，之后每隔4h取样测定葡萄糖含量，调整补料流速，使葡萄糖低于1g/L，发酵持续72h，得到发酵液。
上述发酵罐中的发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖45g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 0.3g/L，MnSO4·H2O0.1g/L，生物素0.5mg/L，聚醚类消泡剂0.6mL/L。
上述补料流加培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：葡萄糖500g/L，酵母粉60g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L。
4、按照步骤一中的样品处理方法和检测方法，对样品进行处理并检测。
结果如图12所示，结果表明：出发菌Rt.ΔKU70发酵罐的麦角硫因产量为269mg/L，重组菌Rt-1的麦角硫因产量为4.09g/L，重组菌HYRT1001的麦角硫因产量为6.2g/L。
三、重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)的保藏
重组菌HYRT1001(2*Ncegt1-P2A-Ncegt2，MET14，PACC1*)已于2023年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.27505。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种产麦角硫因重组菌的构建方法，包括如下步骤：提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性；且提高所述圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性，且降低所述圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述麦角硫因合成酶Ncegt1为A1)或A2)所示的蛋白质：
A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt1活性的由A1)衍生的蛋白质；
或，所述麦角硫因合成酶Ncegt1的编码基因为a1)或a2)所示的DNA分子：
a1)序列表中序列1所示的DNA分子；
a2)与a1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt1的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述麦角硫因合成酶Ncegt2为B1)或B2)所示的蛋白质：
B1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt2活性的由B1)衍生的蛋白质；
或，所述麦角硫因合成酶Ncegt2的编码基因为b1)或b2)所示的DNA分子：
b1)序列表中序列3所示的DNA分子；
b2)与b1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt2的DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于：所述ATP硫酸化酶MET14为C1)或C2)所示的蛋白质：
C1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
C2)由序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ATP硫酸化酶MET14活性的由C1)衍生的蛋白质；
或，所述ATP硫酸化酶MET14的编码基因为c1)或c2)所示的DNA分子：
c1)序列表中序列8所示的DNA分子；
c2)与c1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述ATP硫酸化酶MET14的DNA分子。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于：所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1为D1)或D2)所示的蛋白质：
D1)由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
D2)由序列表中序列15所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1活性的由D1)衍生的蛋白质；
或，所述脂肪酸合成途径蛋白ACC1的编码基因为d1)或d2)所示的DNA分子：
d1)序列表中序列14所示的DNA分子；
d2)与d1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的DNA分子。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于：所述重组菌为圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001 CGMCC No.27505。
7.按照权利要求1-6任一所述的构建方法构建得到的重组菌。
8.一株圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001，其保藏编号为CGMCCNo.27505。
9.如下1)-6)中任一所述的应用：
1)权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides HYRT1001在生产麦角硫因中的应用；
2)权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides HYRT1001在提高麦角硫因产量中的应用；
3)权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides HYRT1001在制备生产麦角硫因的产品中的应用；
4)权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides HYRT1001在制备提高麦角硫因产量的产品中的应用；
5)提高麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2含量和/或活性的物质和/或提高ATP硫酸化酶MET14含量和/或活性的物质和/或降低脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1含量和/或活性的物质在构建产麦角硫因重组菌中的应用；
6)提高麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2含量和/或活性的物质和/或提高ATP硫酸化酶MET14含量和/或活性的物质和/或降低脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1含量和/或活性的物质在制备构建产麦角硫因重组菌的产品中的应用。
10.一种生产麦角硫因的方法，包括如下步骤：将权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides HYRT1001进行发酵培养，得到发酵产物，所述发酵产物中含有麦角硫因。
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| GR01 | Patent grant | ||
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