KR101186718B1

KR101186718B1 - 변이 글루코오스 탈수소효소

Info

Publication number: KR101186718B1
Application number: KR1020067024473A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 야마오카
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2012-09-27
Also published as: JP4639302B2; EP1739174A1; ATE490316T1; EP1739174A4; EP1739174B1; US8012729B2; KR20070006921A; DE602005025104D1; JPWO2005103248A1; WO2005103248A1; CN1973036B; US20110076707A1; US7803592B2; US20080280312A1; CN1973036A

Abstract

서열 번호 13으로 나타내는 아미노산 서열을 가진 글루코오스 탈수소효소의 472위치 및/또는 475위치의 아미노산잔기를 다른 아미노산잔기로 치환함으로써, 상기 효소의 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시킨다.

Description

변이 글루코오스 탈수소효소{MUTATED GLUCOSE DEHYDROGENASE}

본 발명은, 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소에 관한 것이다. 본 발명의 변이 글루코오스 탈수소효소는, 글루코오스 센서, 및 글루코오스 어세이 키트(assay kits) 등에 바람직하게 사용할 수 있으며, 생화학 분야, 임상 분야 등에서 유용하다.

근래 바이오 센서 소자로서 여러가지 효소가 이용되고 있다. 당뇨병의 진단을 목적으로 한 혈액속의 글루코오스 농도를 측정하는 센서 소자로서, 글루코오스옥시다아제(GOD)가 벌써 실용화되어 있지만, GOD는 샘플내의 용존 산소에 영향을 받는 것이 문제시 되고 있다. 따라서 샘플내의 용존 산소에 영향을 받지 않는 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase; GDH)가 GOD를 대신하는 것으로서 주목받고 있다.

GDH에는, NAD(P)⁺을 조효소로 하는 것(E.C.1.1.1.47)이나 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 조효소로 하는 것(PQQGDH;E.C.1.1.99.17)등이 보고되고 있다. NAD(P)⁺을 조효소로 하는 GDH는, 측정계에 NAD(P)⁺를 첨가할 필요가 있다는 점에서 센서 소자로서 문제가 있다. 한편, PQQGDH 등의 조효소 결합형 GDH는 측정계에 조효소를 첨 가할 필요가 없다.

또한, 센서 소자에는, 연속 사용이나 실온에 방치되어 있어도 센서로서의 기능을 잃지 않도록 하는 안정성이 요구된다.

고온하에서 생육하는 호열성(thermophilic) 세균 유래의 효소는, 일반적으로 높은 열안정성을 가지며, 장기 보존이나 연속 사용 등에도 높은 안정성을 나타내기 때문에, 센서 소자로서의 응용이 기대되고 있다. 그러나, 호열균 유래의 내열성 GDH에 대해서는, 서모게네스?아시도필름(Thermoplasma acidophilm), 술포로버스?솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 GDH가 보고되고 있지만, 모두 NAD(P)⁺를 조효소로 하는 것이다.

한편, 중도(moderately) 호열성 세균인 버콜데리아?세파시아(Burkholderia cepacia)가 생산하는 내열성 GDH는 FAD 결합형이며, 이미 최적반응 온도, 열안정성, 기질특이성 등의 효소학적 성질이 분명하게 되어 있다(특허문헌 1). 이 GDH는, 통상적으로는, 높은 내열성을 가진 촉매 서브유닛(α 서브유닛), 시토크롬 C인 전자 전달 서브유닛(β 서브유닛), 기능 불명의 γ서브유닛으로부터 구성되는 헤테로 올리고머로서 존재하고, 45℃에서 최적반응 온도를 가지지만, 50℃ 이상의 열처리를 실시함으로써 서브유닛의 해리가 일어나, 75℃에서 최적반응 온도를 가진 α서브유닛 단량체가 된다. α서브유닛 단량체는 열에 안정적이며, 60℃에서 30분의 열처리후에도 80% 이상의 잔존 활성을 나타낸다. 이러한 서브유닛을 코드하는 유전자도 단리되어 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).

그러나, 조효소 결합형 GDH는 일반적으로 기질 특성이 넓고, 글루코오스 이외에 말토오스나 갈락토오스 등과도 반응한다. 당뇨병 환자를 위한 혈당 측정 전용의 글루코오스 센서로서 응용했을 경우에, 당뇨병 환자가 복막 투석을 실시해야만 하는 중증인 증상의 경우는, 투석액에 말토오스가 대량으로 포함되어 있기 때문에, 본래의 혈당치보다 높게 측정치가 나와 버릴 위험성이 있다. 버콜데리아?세파시아(Burkholderia cepacia)의 GDH도 마찬가지로, 글루코오스 이외에 말토오스나 갈락토오스와도 반응성을 가지고 있다.

아미노산 치환 변이를 도입하는 것에 의해서, GDH의 기질 특이성을 변화시키는 기술이 알려져 있다. 이러한 변이 GDH로서는, 예를 들면, E.coli(특허문헌 3, 4), 아시네토백터?칼코아세티카스(Gluconobacter calcoaceticus)(특허문헌 5), 또는 아시네토백터?바우만니(특허문헌 6～8) 유래의, 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하는 PQQGDH가 알려져 있다.

특허문헌 1 :미국 특허 출원 공개 제2004/0023330호

특허문헌 2 : 국제 공개 제03/091430호 팜플렛

특허문헌 3 : 일본 특개평10-243786호 공보

특허문헌 4 : 일본 특개2001-197888호 공보

특허문헌 5 : 일본 특개2004-173538호 공보

특허문헌 6 : 일본 특개2004-313172호 공보

특허문헌 7 : 일본 특개2004-313180호 공보

특허문헌 8 : 일본 특개2004-344145호 공보

[발명이 해결하고자 하는 과제]

본 발명은, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상된 FAD 결합형 GDH를 제공하는 것을 과제로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 버콜데리아?세파시아의 FAD 결합형 GDH의 특정 부위의 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 글루코오스에 대한 반응성을 유지하면서, 다른 당에 대한 반응성을 저하시킬 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열, 또는, 동(同) 아미노산 서열에 있어서 하기의 위치 이외의 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실(deletion), 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 하기중의 어느 하나의 아미노산 치환 변이를 가진, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소(숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 아미노산잔기는 상기 위치에 있어서의 치환후의 아미노산잔기를 나타내며, 「+」는 동시에 2개의 아미노산 치환을 가진 것을 나타낸다.);

(A)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Cys, 472Glu, 472Gly, 472His, 472Ile, 472Leu, 472Met, 472Phe, 472Pro, 472Ser, 472Trp, 472Tyr, 472Val

(B)475Asp, 475Cys, 475Glu, 475Gly, 475His, 475Met, 475Phe, 475Ser, 475Tyr, 475Val,

(C)472Arg+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asn+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asp+475(His, Phe, Ser, Val),

472Cys+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Glu+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Gly+475(Asp, Cys, Gly, Met, Phe, Ser, Tyr),

472His+475(Cys, Glu, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Ile+475(Asp, Cys, Glu, Gyl, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Leu+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Phe+475(Asp, Glu, Gyl, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Pro+475His

472Ser+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser),

472Trp+475(His, Phe, Ser),

472Tyr+475(Asp, His, Phe, Ser),

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser),

(2) 상기 (A)～(C)에 나타내는 아미노산 치환 변이 이외에는, 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열을 가진, 상기의 변이 글루코오스 탈수소효소.

(3) 상기 아미노산 치환 변이가, 하기의 변이로부터 선택되는, 상기의 변이 글루코오스 탈수소효소;

(D)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Glu, 472Gly, 472Phe, 472Pro,

(E)475Asp, 475Cys, 475Glu, 475Gly, 475Met, 475Phe

(F)472Arg+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Asn+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Asp+475(His, Ser),

472Cys+475(Gly, His, Phe),

472Glu+475(Glu, His, Phe, Tyr),

472Gly+475(Asp, Phe, Tyr),

472His+475(His, Ser),

472Ile+475(Asp, Glu, Gly, His, Ser),

472Leu+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Phe+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Ser+475(Glu, Gly, His, Phe),

472Trp+475(His, Phe),

472Tyr+475His,

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe).

(4) 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열, 또는, 동 아미노산 서열에서 하기의 위치 이외의 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 하기의 특징을 가진 글루코오스 탈수소효소;

(ⅰ)서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열중에서, 적어도 472위치의 아르기닌잔기 또는 475위치의 아스파라긴잔기의 어느 하나가 다른 아미노산잔기로 치환하고 있으며,

(ⅱ)상기 변이를 도입한 글루코오스 탈수소효소의 글루코오스에 대한 활성비와, 말토오스에 대한 활성비의 비((말토오스에 대한 반응성/글루코오스에 대한 반응성)×100)가, 변이를 도입하지 않는 글루코오스 탈수소효소에 비해 10% 이상 저하되고 있다.

(5) 상기 변이 글루코오스 탈수소효소와, 전자 전달 서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.

(6) 상기 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.

(7) 상기 DNA를 유지하고, 상기의 변이 글루코오스 탈수소효소 또는 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체를 생산하는 미생물.

(8) 상기의 변이 글루코오스 탈수소효소, 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체, 또는 미생물을 포함한, 글루코오스 어세이 키트.

(9) 상기의 변이 글루코오스 탈수소효소, 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체, 또는 미생물을 포함한, 글루코오스 센서.

본 명세서에서, 변이 GDH란, 변이 GDH 복합체와의 대비에서는 변이 α 서브유닛을 말하지만, 변이 α 서브유닛 및 변이 GDH 복합체를 총칭하여 「변이 GDH」로 하는 경우가 있다.

도 1은 DH5α/pTrc99A/γ+α의 글루코오스 및 말토오스를 기질로 하는 탈수소효소 활성을 나타낸다. 마름모형은 글루코오스, 정방형은 말토오스를 나타낸다(도 2～5도 마찬가지임).

도 2는 DH5α/pTrcγαAsn475Asp의 글루코오스 및 말토오스를 기질로 하는 탈수소효소 활성을 나타낸다.

도 3은 DH5α/pTrc99Aγαβ의 글루코오스 및 말토오스를 기질로 하는 탈수소효소 활성을 나타낸다.

도 4는 DH5α/pTrcγαβAsn475Asp의 글루코오스 및 말토오스를 기질로 하는 탈수소효소 활성을 나타낸다.

도 5는 DH5α/pTrcγαβAsn475Glu의 글루코오스 및 말토오스를 기질로 하는 탈수소효소 활성을 나타낸다.

도 6은 GDHα서브유닛의 472위치 및 475위치의 코돈 치환에 이용한 PCR 프라이머의 서열을 나타낸다.

도 7은 변이 GDH의 SV플롯을 나타낸다.

도 8은 변이 GDH의 SV플롯을 나타낸다.

도 9는 글루코오스 센서의 구조를 나타낸다.

도 10은 글루코오스 센서의 각 시약부를 나타낸다.

도 11은 야생형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의 글루코오스에 대한 반응성 을 나타낸다.

도 12는 472Glu475Tyr형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의 글루코오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 13은 472Asp475His형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의 글루코오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 14는 야생형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의, 글루코오스 존재하에 있어서의 말토오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 15는 472Glu475Tyr형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의, 글루코오스 존재하에 있어서의 말토오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 16은 472Asp475His형 GDH를 이용한 글루코오스 센서의, 글루코오스 존재하에 있어서의 말토오스에 대한 반응성을 나타낸다.

도 17은 야생형 GDH 및 변이 GDH를 이용한 글루코오스 센서를 이용하여 측정된 외관상의 혈당값을 나타낸다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 변이 GDH는, 야생형 GDH에 특정의 변이를 도입함으로써 제조된다. 야생형 GDH로서는, 버콜데리아?세파시아가 생산하는 GDH를 들 수 있다. 버콜데리아?세파시아의 GDH로서는, 버콜데리아?세파시아 KS1주, JCM 2800주 또는 JCM2801주가 생산하는 GDH를 들 수 있다. KS1주는, 평성 12년 9월 25일에 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(우편번호305-8566 일본 이바라키현 츠 쿠바시 히가시 1초메 1번지 1 중앙 제6)에, 수탁 번호 제FERM BP-7306으로서 기탁되어 있다. JCM2800주 또는 JCM2801주는, 독립 행정법인 이화학 연구소 미생물 계통 보존 시설(Japan Collection of Microorganisms, JCM)에 보존되어 있다.

KS1주의 GDHα서브유닛 유전자, 및 β서브유닛 유전자의 일부를 포함한 염색체 DNA 단편의 염기 서열을 서열 번호 11에 나타낸다(미국 특허 출원 공개 제2004/0023330호). 이 염기 서열에는 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 존재하고, 5'말단측으로부터 2번째 및 3번째의 ORF는, 각각 α서브유닛(서열 번호 13), 및 β 서브유닛(서열 번호 14)을 코드하고 있다. 또한, 1번째의 ORF는 γ서브유닛(서열 번호 12)를 코드하고 있다고 추정된다. 또한, 서열 번호 15에, β 서브유닛 유전자 전체 길이를 포함한 단편의 염기 서열을 나타낸다. 또한, β 서브유닛의 아미노산 서열을 서열 번호 16에 나타낸다. 서열 번호 16에 있어서, 아미노산 번호 1～22는 시그널 펩티드로 추정된다. 한편, 서열 번호 15 및 16에 있어서, 제1번째의 아미노산잔기는 Val로 기재되어 있지만, Met일 가능성이 높고, 또한, 번역후에 탈락할 가능성이 있다.

본 발명의 변이 GDH는,α서브유닛뿐이어도 좋고, α서브유닛과 β서브유닛의 복합체, 또는 α서브유닛, β서브유닛 및 γ서브유닛으로 이루어진 복합체여도 좋다. 본 발명의 변이 GDH는, 어느 경우나 α서브유닛에 특정의 변이가 도입된 것이지만, 이 특정의 변이 외에, 보존적인 변이를 가지고 있어도 좋다. 또한, 다른 서브유닛은 야생형이어도 좋고, 보존적인 변이를 가진 것이어도 좋다. 한편, 「보존적 변이」란, GDH 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 변이를 말한다.

본 발명의 변이형 α서브유닛은, 바람직하게는, 후술하는 특정의 변이 이외는, 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열을 가진다. 또한, 변이형 α서브유닛은, GDH 활성을 가진 한, 상술한 바와 같은 보존적 변이를 가지고 있어도 좋다. 즉, 서열 번호 13의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정의 변이 이외에, 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 단백질이어도 좋다. 한편, 서열 번호 13에는, 서열 번호 11의 염기 서열에 의해서 코드될 수 있는 아미노산 서열을 나타내고 있지만, N말단의 메티오닌잔기는, 번역 후에 탈락할 가능성이 있다. 상기 「1 또는 복수」란, 바람직하게는 1～10개, 보다 바람직하게는 1～5개, 특히 바람직하게는 1～3개이다.

또한, β서브유닛은, 전형적으로는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진다. 그러나, GDH의 β서브유닛으로서 기능할 수 있는 한, 서열 번호 16의 아미노산 번호 23～425로 이루어진 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 단백질이어도 좋다. 상기 「1 또는 복수」란, 바람직하게는 1～20개, 보다 바람직하게는 1～10개, 특히 바람직하게는 1～5개이다. 한편, GDH의 β서브유닛으로서 기능한다는 것은, GDH의 효소 활성을 손상시키지 않고 시토크롬 C로서 기능하는 것을 말한다.

야생형 α서브유닛 유전자로서 구체적으로는, 서열 번호 11의 염기 번호 764～2380으로 이루어진 염기 서열을 포함한 DNA를 들 수 있다. 또한, α서브유닛 유전자는, 서열 번호 11의 염기 서열의 염기 번호 764～2380으로 이루어진 염기 서열을 가진 DNA, 또는 이 서열로부터 조제될 수 있는 프로브(probe)와 엄격한 조 건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈(hybridize)하고, 또한, GDH 활성을 가진 단백질을 코드하는 DNA라도 좋다.

또한, β서브유닛 유전자로서 구체적으로는, 서열 번호 9의 염기 번호 187～1398로 이루어진 염기 서열을 포함한 DNA를 들 수 있다. 또한 β서브유닛 유전자는, 서열 번호 9의 염기 번호 187～1398로 이루어진 염기 서열을 가진 DNA, 또는 이 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, β서브유닛으로서 기능할 수 있는 단백질을 코드하는 DNA라도 좋다.

상기 엄격한 조건으로서는, 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가진 DNA끼리가 하이브리다이즈하는 조건, 구체적으로는, 1×SSC, O.1%SDS, 60℃를 들 수 있다.

α서브유닛 유전자 및 β서브유닛 유전자는, 예를 들면, 버콜데리아?세파시아 KS1주의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해서, 취득할 수 있다. PCR용 프라이머는, 상기의 염기 서열에 기초하여 화학 합성하는 것에 의해서 조제할 수 있다. 또한, 상기 서열에 기초하여 제작한 올리고 뉴클레오티드를 프로브로 하는 하이브리다이제이션에 의해서, 버콜데리아?세파시아 KS1주의 염색체 DNA로부터 취득할 수도 있다. 또한, 버콜데리아?세파시아의 다른 균주로부터도, 마찬가지로 하여 배리언트(variants)를 취득할 수 있다. 다른 균주로서는, 상기의 JCM2800주 및 JCM2801주를 들 수 있다. 이들 균주가 생산하는 GDH의 α서브유닛은, KS1주의 α서브유닛과 각각 95.4% 및 93.7%의 상동성을 가지고 있다.

또한, 다른 미생물이 생산하는 GDH라 하더라도, 버콜데리아?세파시아의 GDH 와 유사한 구조 및 효소학적 성질을 가진 것이면, 본 발명의 변이 GDH의 제조에 이용할 수 있다.

본 발명의 변이 GDH는, 상기와 같은 야생형 GDH에 특정의 변이를 도입하는 것에 의해서, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 것이다. 「글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한」이란, 글루코오스에 대한 반응성을 실질적으로 유지한 채로, 다른 단당류, 이당류 또는 올리고당 등의 당류, 예를 들면 말토오스, 갈락토오스, 크실로오스 등에 대한 반응성이 저하한 것, 혹은, 글루코오스에 대한 반응성이 다른 당류에 대한 반응성에 비해 향상한 것을 포함한다. 예를 들면, 글루코오스에 대한 반응성이 저하해도, 다른 당류에 대한 반응성이 그 이상으로 저하하면, 글루코오스에 대한 기질 특이성은 향상한다. 또한, 다른 당류에 대한 반응성이 상승해도, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 그 이상으로 상승하면, 글루코오스에 대한 기질 특이성은 향상한다. 구체적으로는 예를 들면, 글루코오스에 대한 활성비와, 다른 당류, 예를 들면 말토오스에 대한 활성비의 비((다른 당류에 대한 반응성/글루코오스에 대한 반응성)×100)이 10%이상, 바람직하게는 20%이상, 보다 바람직하게는 50%이상 저하되고 있으면, 글루코오스에 대한 기질 특이성은 향상하고 있다.

상기 특정의 변이란, 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열의 472위치에 있어서의 아미노산 치환, 475위치에 있어서의 아미노산 치환, 또는 472위치 및 475위치의 양쪽 모두에 있어서의 아미노산 치환중의 어느 하나이다. 보다 구체적인 변이로서는, 이하에 나타내는 아미노산 치환을 들 수 있다. 한편, 하기의 숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 아미노산잔기는 상기 위치에 있어서의 치환후의 아미노산잔기를 나타내며, 「+」는 동시에 2개의 아미노산 치환을 가진 것을 나타낸다. 하기 아미노산 치환중에서, (A)는 472위치에 있어서의 아미노산 치환이고, (B)는 475위치에 있어서의 아미노산 치환이며, (C)는 472위치 및 475위치의 양쪽 모두에 있어서의 아미노산 치환이다. 예를 들면, 「472Asn+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr)」는, 472위치의 아미노산잔기(야생형에서는 Ala)가 Asn로 치환되고, 또한, 475위치(야생형에서는 Asn)가 Asp, Gly, His, Phe, Ser 또는 Tyr중의 어느 하나로 치환되는 변이를 나타낸다.

(A)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Cys, 472Glu, 472Gly, 472His, 472Ile, 472Leu, 472Met, 472Phe, 472Pro, 472Ser, 472Trp, 472Tyr, 472Val,

(C)472Arg+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asn+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asp+475(His, Phe, Ser, Val),

472Cys+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Glu+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Gly+475(Asp, Cys, Gly, Met, Phe, Ser, Tyr),

472His+475(Cys, Glu, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Ile+475(Asp, Cys, Glu, Gly, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Leu+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Phe+475(Asp, Glu, Gly, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Pro+475His

472Ser+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser),

472Trp+475(His, Phe, Ser),

472Tyr+475(Asp, His, Phe, Ser),

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser),

상기 아미노산 치환 가운데, 바람직한 것을, 하기에 나타낸다.

(D)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Glu, 472Gly, 472Phe, 472Pro,

(E)475Asp, 475Cys, 475Glu, 475Gly, 475Met, 475Phe

(F)472Arg+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Asn+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Asp+475(His, Ser),

472Cys+475(Gly, His, Phe),

472Glu+475(Glu, His, Phe, Tyr),

472Gly+475(Asp, Phe, Tyr),

472His+475(His, Ser),

472Ile+475(Asp, Glu, Gly, His, Ser),

472Leu+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Phe+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Ser+475(Glu, Gly, His, Phe),

472Trp+475(His, Phe),

472Tyr+475His,

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe).

상기 아미노산 치환 변이의 위치는, 서열 번호 13, 즉 버콜데리아?세파시아 KS1주의 야생형 GDHα서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의 위치이지만, 서열 번호 13의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정의 변이 이외에, 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 GDHα서브유닛의 호모로그(homologue) 또는 배리언트에 있어서는, 서열 번호 13의 아미노산 서열과의 얼라인먼트(alignment)에 있어서, 상기 아미노산 치환의 위치에 해당하는 위치를 나타낸다. 예를 들면, 1～471위치의 영역에서 1개의 아미노산잔기의 결실을 가진 GDHα서브유닛의 보존적 배리언트에 있어서는, 472위치 및 475위치는, 상기 배리언트의 471위치 및 474위치를 나타낸다.

본 발명자들은, 기질 특이성을 향상시키는 변이를 도입하는 위치로서, 글루코오스 탈수소 효소의 FAD와의 결합에 관여하는 영역 또는 그 주변 영역에 대하여 검토했다.

FAD와의 결합에 관여하는 영역으로서는, FAD 근방 영역(FAD-covering lid) 또는 FAD 결합 도메인, 구체적으로는 서열 번호 1～4에 나타내는 아미노산 서열에 상당하는 영역을 생각할 수 있었다.

상기 「아미노산 서열에 상당하는 영역」이란, 서열 번호 13에 나타내는 아미노산 서열을 가진 버콜데리아?세파시아 KS1주의 GDHα서브유닛에서는, 서열 번호 1, 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열을 가진 영역, 즉 서열 번호 13의 아미노산 번호 88～92, 57～61, 470～504로 이루어진 영역이다. 또한, 서열 번호 13의 아미노산 서열과 상동성을 가진 아미노산 서열을 가진 GDHα서브유닛에 있어서는, 서열 번호 13의 아미노산 서열과의 얼라인먼트에 있어서, 상기 버콜데리아?세파시아 KS1주의 GDHα서브유닛의 아미노산 번호 88～92, 57～61, 470～504로 이루어진 영역에 해당하는 영역이다.

본 발명자는, FAD를 조효소로서 가진 GMC 옥시도리덕타제(oxidoreductase) 패밀리인 글루코노백터?옥시단스(Gluconobacter oxydans)의 소르피톨 탈수소효소(GenBank accession AB039821), 에르비니아?헤르비콜라(Erwinia herbicola )의 2-케토글루타르산 탈수소효소(GenBank accession AF068066), 파네로케이트?클리소스포륨(Phanerochaete chrysosporium )의 셀로비오스 탈수소효소(CDH)(J. Mol. Biol., 315(3), 421-34(2002)), 스트렙트마이세스?스피시즈(Streptomyces species)의 콜레스테롤옥시다아제(COD)(J. Struct. Biol. 116(2), 317-9(1996)), 페니실륨?아마가사키엔스(Penicillium amagasakiens)의 글루코오스옥시다아제(Eur. J. Biochem. 252, 90-99(1998))의 아미노산 서열을 비교하여, FAD 결합 도메인 및 FAD 근방 영역(FAD-covering lid) 등의 보존된 영역, 및 단백질의 중첩에 관여하는 아미노산잔기인 프롤린이 보존되어 있는 영역을 발견하였다. 그리고, 이 들 영역과 다른 영역의 경계 부근의 서열을 개변함으로써, 기질 특이성을 향상할 수 있는 가능성에 대하여 검토한 결과, 상기 아미노산잔기의 변이에 의해서 기질 특이성을 향상할 수 있는 것을 확인했다.

원하는 변이를 가진 GDHα서브유닛은, GDHα서브유닛을 코드하는 DNA(α서브유닛 유전자)에, 부위 특이적 변이법에 의해서, 원하는 아미노산 변이에 대응하는 뉴클레오티드 변이를 도입하여, 얻어진 변이 DNA를 적당한 발현계를 이용하여 발현시킴으로써, 취득할 수 있다. 또한, 변이 GDHα서브유닛을 코드하는 DNA를, β서브유닛을 코드하는 DNA(β서브유닛 유전자), 또는 β서브유닛 유전자와 γ서브유닛을 코드하는 DNA(γ서브유닛 유전자)와 함께 발현시킴으로써, 변이 GDH 복합체를 취득할 수 있다. 한편, GDHα서브유닛을 코드하는 DNA에의 변이의 도입은, γ서브유닛, α서브유닛 및 β서브유닛을 이 순서대로 코드하는 폴리시스트로닉(polycistronic) DNA 단편을 이용해도 좋다.

변이가 도입된 GDHα서브유닛 또는 GDH 복합체의 당류에 대한 기질 특이성은, 실시예에 기재된 방법에 따라 각종 당류에 대한 반응성을 조사하여, 야생형 GDHα서브유닛 또는 야생형 GDH 복합체의 반응성과 비교하는 것에 의해, 결정할 수 있다.

γ서브유닛,α서브유닛 및 β서브유닛을 이 순서대로 코드하는 폴리시스트로닉 DNA 단편은, 예를 들면, 버콜데리아?세파시아 KS1주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 12, 13의 염기 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR에 의해서 취득할 수 있다(후기의 실시예 참조).

GDH의 각 서브유닛의 유전자의 취득, 변이의 도입, 유전자의 발현 등에 이용하는 벡터로서는, 예를 들면 에쉐리히어(Escherichia)속 세균에서 기능하는 벡터, 구체적으로는 pTrc99A, pBR322, pUCl8, pUC118, pUC19, pUC119, pACYCl84, pBBRl22 등을 들 수 있다. 유전자의 발현에 이용하는 프로모터로서는, 예를 들면 lac, trp, tac, trc, PL, tet, PhoA 등을 들 수 있다. 또한, 프로모터를 포함한 발현 벡터의 적당한 부위에, α서브유닛 유전자 또는 다른 서브유닛 유전자를 삽입하는 것에 의해서, 이들 유전자의 벡터에의 삽입과 프로모터의 연결을 같은 공정으로 실시할 수 있다. 이러한 발현 벡터로서는, pTrc99A, pBluescript, pKK223-3 등을 들 수 있다.

또한, α서브유닛 유전자 또는 다른 서브유닛 유전자는, 발현 가능한 형태로 숙주 미생물의 염색체 DNA중에 조립되어도 좋다.

재조합 벡터로 미생물을 형질 전환하려면, 예를 들면 칼슘 처리에 의한 컴피턴트 셀(competent cell)법, 프로토플래스트(protoplast)법 또는 엘렉트로포레이션(electroporation)법 등을 들 수 있다.

숙주 미생물로서는, 바실루스?서브틸리스(Bacillus subtilits ) 등의 바실루스속 세균, 사카로마이세스?세레비시에(Saccharomyces cerevisiae ) 등의 효모, 아스페르길루스?니거(Aspergillus niger ) 등의 사상균을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 이종 단백질 생산에 적절한 숙주 미생물이면 이용할 수 있다.

본 발명의 변이 α서브유닛 혹은 변이 GDH 복합체 또는 이들을 발현하는 미생물은, 글루코오스 센서의 효소 전극, 또는 글루코오스의 어세이 키트의 구성요소 로서 이용할 수 있다. 버콜데리아?세파시아의 야생형 GDH를 이용한 글루코오스 센서 및 글루코오스 어세이 키트는, 미국 특허 공개 제2004/0023330 Al에 기재되어 있다. 본 발명의 변이 GDH도, 마찬가지로 하여 사용할 수 있다.

다음에, 실시예를 예로 들어 본 발명을 더욱 더 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 버콜데리아?세파시아의 GDH를 발현하는 플라스미드

버콜데리아?세파시아의 GDH를 발현하는 플라스미드로서 GDH의 α서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드, 및 α서브유닛, β서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드를 준비했다.

<1> GDH의 α서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드

α서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드로서는, WO 02/036779에 기재된 플라스미드 pTrc99A/γ+α를 사용했다. 상기 플라스미드는, 버콜데리아?세파시아 KS1주(FERM BP-7306) 염색체 DNA로부터 단리된, GDHγ서브유닛 구조 유전자와 α서브유닛 구조 유전자를 연속하여 포함한 DNA 단편이, 벡터 pTrc99A(Pharmacia사)의 클로닝 부위인 NcoI/HindⅢ에 삽입되어 이루어지는 플라스미드이다. 본 플라스미드중의 GDHγα유전자는, trc 프로모터에 의해서 제어된다. pTrc99A/γ+α는, 암피실린 내성 유전자를 유지하고 있다.

<2> GDH의 α서브유닛, β서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드

GDH의 α서브유닛, β서브유닛 및 γ서브유닛을 발현하는 플라스미드는, 이 하와 같이 하여 조제했다.

(1) 버콜데리아?세파시아 KS1주로부터의 염색체 DNA의 조제

버콜데리아?세파시아 KS1주부터 염색체 유전자를 통상의 방법에 따라서 조제했다. 즉, 상기 균주를 TL액체배지(폴리펩톤 10g, 효모 추출액 1g, NaCl 5g, KH₂PO₄ 2g, 글루코오스 5g; 1L, pH 7.2)를 이용하여, 34℃에서 하룻밤 진탕하였다. 증식한 균체를 원심분리기에 의해 회수했다. 이 균체를 10mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA, 0.5% SDS, 100㎍/ml의 프로티나제 K를 함유한 용액에 현탁하여, 50℃에서 6시간 처리했다. 여기에 등량의 페놀-클로로포름을 더하여 실온에서 10분간 교반한 후, 원심분리기에 의해 상청(supernatant)을 회수하였다. 여기에 최종농도 0.3M이 되도록 초산나트륨을 가하여, 2배량의 에탄올을 중층하여 중간층에 염색체 DNA를 석출시켰다. 이것을 유리봉을 이용하여 건져 올려, 70% 에탄올로 세정한 후, 적당량의 TE 버퍼에 용해시켜, 염색체 DNA 용액으로 했다.

(2) GDH의 γ서브유닛, α서브유닛 및 β서브유닛을 코드하는 DNA 단편의 조제

상기 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이하의 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR에 의해, GDH의 γ서브유닛, α서브유닛 및 β서브유닛을 코드하는 DNA 단편을 증폭했다.

[정방향(forward) 프라이머〕

5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'(서열 번호 5)

[역방향(reverse) 프라이머]

5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'(서열 번호 6)

증폭한 단편의 C말단측을 평활 말단화(blunt-ended)한 후, N말단측을 NcoI로 소화(digest)하고, 마찬가지로 처리한 pTrc99A(Pharmacia사)에 라이게이션했다. 얻어진 재조합 벡터로 E.coli DH5α를 형질 전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 함유한 LB한천 배지에서 발생하는 콜로니를 채취했다. 얻어진 형질 전환체를 액체의 LB배지에서 배양하여 플라스미드를 추출하여, 그 삽입 DNA 단편을 해석한 바, 약 3.8kb의 삽입 단편이 확인되었다. 본 플라스미드를 pTrc99Aγαβ로 명명했다. 본 플라스미드중의 GDH의 각 구조 유전자는, trc프로모터에 의해서 제어된다. pTrc99Aγαβ은, 암피실린 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 보유하고 있다.

[실시예 2] GDHα서브유닛 유전자에의 변이 도입

시판의 부위 특이적 변이 도입 키트(Stratagene사, QuikChangeⅡ Site-Directed Mutagenesis Kit)를 이용하여, 실시예 1에 기재된 플라스미드 pTrc99A/γ+α 및 pTrc99Aγαβ에 포함되는 GDHα서브유닛 유전자의 475위치의 아스파라긴의 코돈(AAT)을 아스파라긴산(GAT) 또는 글루타민산(GAA)의 코돈으로 치환했다. 프라이머에는, 하기의 올리고 뉴클레오티드를 사용했다. 이하, 475위치의 아스파라긴 잔기로부터 아스파라긴산 잔기로의 치환을 「Asn475Asp」, 475위치의 아스파라긴 잔기로부터 글루타민산 잔기로의 치환을 「Asn475Glu」라고 기재한다.

Asn475Asp 치환용 프라이머

[정방향 프라이머]

5'-CGCGCCGAACGATCACATCACGGGC-3'(서열 번호 7)

[역방향 프라이머]

5'-GCCCGTGATGTGATCGTTCGGCGCG-3'(서열 번호 8)

Asn475Glu 치환용 프라이머

[정방향 프라이머]

5'-GAATTCGCGCCGAACGAACACATCACGGGCTCG-3'(서열 번호 9)

[역방향 프라이머]

5'-CGAGCCCGTGATGTGTTCGTTCGGCGCGAATTC-3'(서열 번호 10)

PCR 반응은, 이하의 반응 조성으로, 95℃ 30초후, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 68℃ 8분을 15사이클 반복하고, 68℃ 30분의 반응을 실시한 후, 4℃로 유지했다.

[반응액조성]

주형 DNA(5ng/μl) 2μl

(pTrc99A/γ+α 및 pTrc99Aγαβ

10×반응 완충액 5μl

정방향 프라이머(100ng/μl) 1.25μl

역방향 프라이머(100ng/μl) 1.25μl

dNTP 1μl

증류수 38.5μl

DNA 폴리머라제 1μl

합계 50μl

PCR 반응후에, 반응액에 DNA 폴리머라제I를 0.5μl 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하고, 주형 플라스미드를 분해시켰다.

얻어진 반응액으로, Escherichia coli DH5α(supE44, ΔlacU169(Ø80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endAl, gyrA96, thi-1, relA1)의 컴피턴트 셀을 형질 전환했다. 암피실린(50㎍/ml) 및 카나마이신(30㎍/ml)을 포함한 LB한천 배지(박토트립톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 염화나트륨 1%, 한천 1.5%) 위에 생육해 온 콜로니 몇개로부터 플라스미드 DNA를 조제하고, 서열 해석을 실시하여, GDHα서브유닛 유전자에 목적의 변이가 도입된 것을 확인했다. Asn475Asp 변이가 도입된 pTrc99A/γ+α및 pTrc99Aγαβ를, 각각 pTrcγαAsn475Asp, 및 pTrcγαβAsn475Asp로 명명했다. 또한, Asn475Glu 변이가 도입된 pTrc99A/γ+α 및 pTrc99Aγαβ을, 각각 pTrcγαAsn475Glu, 및 pTrcγαβAsn475Glu로 명명했다.

[실시예 3] 변이 GDH의 기질 특이성의 해석

실시예 2에서 얻어진 변이 GDH 발현 플라스미드를 이용하여, 변이 GDH를 제조하여, 기질 특이성을 검토했다.

(1) 배양

pTrcγαAsn475Glu, 및 pTrcγαβAsn475Glu를 도입한 Escherichia coli DH5 α주를, 각각 2 ml의 LB 배지(암피실린 50㎍/ml 및 카나마이신 30㎍/ml 함유)에서, L자관을 이용하여 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 이들 배양액을, 150ml의 LB배지(암피실린 50㎍/ml 및 카나마이신 30㎍/ml 함유)를 포함한 500ml의 판구 플라스크에 식균하고, 37℃에서 진탕 배양했다. 배양 개시부터 3시간후에 IPTG(이소프로 필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 최종농도 O.1mM가 되도록 첨가하여, 2시간 더 배양했다.

(2) 효소 샘플의 조제

상기에서 배양한 배양액으로부터 균체를 모아 세정후, 습균체 0.3mg당 1ml의 0.2% Triton X100를 포함한 10mM 인산칼륨 버퍼(PPB)(pH 7.0)로 균체를 현탁하여, 초음파 파쇄했다. 이 현탁액을 원심분리(10,000r.p.m, 10분, 4℃)하여 잔액을 제거한 후, 상청을 초원심분리(50,000r.p.m., 60분, 4℃)하여, 얻어진 상청(수용성 화분(fraction))을, 조(crude)효소 샘플로 했다. 또한, 이 샘플을, 통상의 소수성 크로마토그래피(컬럼명:옥틸세퍼로스(아마샴?바이오사이언스 제조)) 및 이온 교환 크로마토그래피(Q-세퍼로스(아마샴?바이오사이언스 제조))에 의해 정제하여, 정제 효소 샘플을 얻었다. 목적으로 하는 효소 화분의 결정은, GDH 활성을 지표로서 하였다.

(3) GDH 활성의 측정

상기 정제 효소 샘플 8μl에, 활성 측정용 시약(12μl의 600mM 메틸페나진 메토설페이트(PMS), 120μl의 6mM 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCIP)에, 0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPB를 가하여 전체량 480μl로 한 용액)를 8μl 첨가했다. 이것을 알루미늄 블록 항온조를 이용하여, 각 반응 온도에서 1분간 프리(pre) 인큐베이트한 후, 재빨리 각 농도의 기질(글루코오스 또는 말토오스), 또는 증류수를 8μl 가하여 교반하고, 분광 광도계를 이용하여 DCIP 유래의 흡수 파장인 600nm의 흡광도를 측정했다. 각 시약의 최종농도는 DCIP가 0.06mM이고, PMS가 0.6mM이다. 기 질의 최종농도는 40mM, 20mM, 10mM 및 5mM이다.

결과를, 표 1 및 도 1～5에 나타낸다.

표 1

이 결과로부터 명백하듯이, 어느 변이 GDH도, 글루코오스에 대한 반응성은 유지되면서, 말토오스에 대한 반응성이 저하되고 있는 것, 즉 글루코오스에 대한 특이성이 향상하고 있는 것이 명백하다.

[실시예 4] GDHα서브유닛 유전자에의 변이 도입

실시예 1에서 얻어진 pTrc99Aγαβ에 포함되는 GDHα서브유닛 유전자의 475위치 및 그 주변에 변이 도입을 실시하고, 변이 효소의 기질 특이성을 평가했다. 변이 도입은, 실시예 2와 같이 실시하였다. 변이 도입용 프라이머는 이하와 같이 하여 제작했다. 도 6에 나타내는 기본 프라이머(야생형)(정방향 프라이머:서열 번호 17, 역방향 프라이머:서열 번호 18)에 대해서, 소정의 위치(472위치 및 475위치)의 코돈을, 도 6의 변형 코돈표에 나타내는 대로 변경하여, 각종 변이 도입용의 프라이머를 제작했다.

[실시예 5] 변이 GDH의 기질 특이성의 해석

실시예 4에서 얻어진 변이 GDH 발현 플라스미드를 이용하여, 실시예 3과 같이 하여, 변이 GDH를 제조하여, 기질 특이성을 검토했다. 효소 활성은, 조(crude)효소 샘플을 이용해서 실시하였다. 각각의 변이 GDH의 글루코오스에 대한 활성비, 말토오스에 대한 활성비, 반응비(말토오스에 대한 활성비/글루코오스에 대한 활성비. 단위는 U/ml)를, 표 2～7에 나타낸다. 한편, 글루코오스에 대한 활성비가 0.5U/ml 이하인 것에 관해서는 활성 없음으로 판단하여, 표중에서 「-」로 나타내었다.

그 결과, 475위치에 관해서는, 실시예 2에서 실시한 아스파라긴으로부터 아스파라긴산(GAT) 또는 글루타민산(GAA)으로의 치환 이외의 치환이라 하더라도, 기질 특성을 개선하는 효과가 있는 것이 확인되었다. 또한, 475위치 근방의 472위치의 아스파라긴(AAC)을 다른 아미노산으로 치환하는 것도, 기질 특성을 개선할 수 있는 것이 발견되었다. 또한, 472위치와 475위치의 아미노산의 치환의 조합에 의해서, 상승적으로 기질 특성을 개선할 수 있는 것도 발견되었다.

표 2

표 3

표 4

표 5

표 6

표 7

[실시예 6] 정제 효소의 SV 플롯 평가

실시예 5에서 기질 특이성의 개선이 인정된 몇가지 변이 GDH에 대해서, SV플롯을 취득했다. 각각의 변이 GDH는, 실시예 3과 같이 하여 정제했다. 결과를 도 7～8, 및 표 8에 나타낸다.

그 결과, 정제한 효소에 있어서도, 시험한 모든 기질 농도에 관해서, 반응비(말토오스에 대한 활성비/글루코오스에 대한 활성비)가 야생형과 비교해서 낮아져 개선되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 결과에 관해서도 실시예 5에서의 조(crude) 효소 용액에 의한 측정 결과와 거의 일치한 점에서, 조(crude)효소에 의한 개변 효소의 스크리닝은 충분히 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 후보중에서 글루코오스 센서에 이용하는 개변 효소를 선택했다. 그 경우에 혈중의 말토오스 농도는 최대로도 200mg/dl까지 밖에 상승하지 않기 때문에, 특히 기질 농도 180mg/dl와 90mg/dl에 있어서의 반응비에 주목했다. 결과 글루코오스에 대한 반응성이 야생형과 비교해서 그다지 떨어지지 않은 후보로서 472Asp475His를 선택하고, 글루코오스에 대한 반응성은 떨어지지만 말토오스와는 거의 반응하지 않는 후보로서 472Glu475Tyr를 선택했다.

표 8

[실시예 7] 변이 GDH를 이용한 혈당 측정용 비색식(colorimetric) 센서의 제작

472Asp+475His형 변이 GDH, 및 472Glu+475Tyr형 변이 GDH를 이용하여, 혈당 측정용의 비색식 센서를 제작했다.

도 9에 나타내는 기본 구성을 가진 글루코오스 센서(1)를 제작했다. 즉, 상기 글루코오스 센서는, 투명 기판(2)에 대해서 스페이서(3)를 통하여 투명 커버(4)(재질;PET)를 적층한 형태를 가지며, 각 요소(2)～(4)에 의해서 캐필러리(capillary)(5)가 규정되어 있다. 캐필러리(5)의 치수는, 1.3mm×9mm×50㎛이다(도 9). 투명 기판(2) 및 투명 커버(4)는, 두께가 250㎛인 PET에 의해 형성하고, 스페이서(3)는 흑색의 양면 테이프에 의해 구성했다.

글루코오스 센서는, 도 10에 나타내는 제1 시약부(6), 제2 시약부(7) 및 제3 시약부(8)를 가지며, 각각 성분 및 도포량을 표 9에 나타낸다. 표중, 「Ru」는, 루테늄헥사암민 착체(Ru(NH₃)₆Cl₃)을,

CHAPS는 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid를,

ACES는 N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid를,

MTT는 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide를, 각각 나타낸다.

표 9

상기 글루코오스 센서의 캐필러리에 측정 시료를 공급하고, 그 시점으로부터 O.1초마다 흡광도를 반복하여 측정하고, 흡광도의 타임 코스를 작성했다. 각 회의 흡광도의 측정에 있어서는, 제3 시약부(8)에 대해서, 캐필러리의 높이 방향을 따라서 빛을 조사하고, 그 때에 글루코오스 센서를 투과한 빛을 수광(受光)했다. 빛의 조사는, 발광 다이오드를 이용하여 630nm의 빛을 조사함으로써 실시했다. 투과광은, 포토 다이오드에 대해 수광했다.

측정 시료로서는, 글루코오스를 첨가한 혈액을 이용했다. 헤마토크리트(hematocrit)를 42%로 조정한 혈액에, 0mg/dl, 100mg/dl, 200mg/dl, 400mg/dl의 농도가 되도록 글루코오스를 첨가한 것을 이용하여, 글루코오스 센서의 직선성을 평가했다. 결과를, 도 11(야생형), 도 12(472Glu475Tyr) 및 도 13(472Asp475His) 에 나타낸다.

또한, 헤마토크리트값 42%, 글루코오스 농도 45mg/dl로 조정한 혈액에, 말토오스를 0mg/dl, 100mg/dl, 200mg/dl 또는 300mg/dl가 되도록 첨가한 것을 이용하여, 말토오스의 영향을 평가했다. 도 14(야생형), 도 15(472Glu475Tyr) 및 도 16(472Asp475His)에 나타낸다.

글루코오스 45mg/dl에 말토오스를 첨가했을 경우, 야생형에서는 말토오스 농도에 의존하여 흡광도가 증가하여, 말토오스와 강하게 반응하고 있는 것이 시사된다. 한편 변이 효소를 이용한 센서에서는, 말토오스 농도에 따른 흡광도의 증가가 억제되어 있으며, 말토오스의 영향이 적어지고 있는 것을 알 수 있다. 이러한 데이터를 외관의 혈당 상승치로 환산한 결과를 도 17에 나타낸다. 야생형 효소를 이용한 센서에서는, 저혈당(45mg/dl 글루코오스)이 말토오스의 혼입에 의해서 정상영역(122mg/dl 글루코오스)으로 외관상 표시되어 버린다. 한편, 개변 GDH를 이용한 센서에서는, 말토오스가 최대 300mg/dl 혼입해 있는 경우에도, 외관의 혈당치가 정상영역까지 상승하는 경우는 없다.

이상의 결과로부터 명백하듯이, 변이 GDH를 이용한 글루코오스 센서는, 직선성도 야생형과 동일한 정도로 확보되고 있음에도 불구하고, 말토오스와의 반응성이 크게 저하되고 있다. 이 변이 GDH를 이용한 글루코오스 센서를 이용하면, 병원 등에서 투여되는 혈중 말토오스 농도의 상한치(200mg/dl) 이상에서도, 저혈당(50mg/dl이하)이 정상치나 고혈당으로 판정되는 경우 없이, 안전한 치료를 행할 수 있다. 또한 상술한 바와 같이 GDH는 용존 산소와도 반응하지 않기 때문에, 이 변이 GDH를 이용한 센서를 제공함으로써, 당뇨병 환자의 정확한 진단 치료를 행할 수 있다.

[실시예 8] 472위치의 아미노산 치환과 475위치 이외의 부위의 아미노산 치환의 조합 효과의 검증

472Phe형 치환을 가진 변이 GDH에, 또한 475위치에 가까운 부위(477～497위) 및 랜덤하게 선택한 475위치로부터 먼 부위(53～73위치)에 있어서, 페닐알라닌으로의 치환을 도입했다.

472위치가 페닐알라닌으로 치환된 변이 GDH를 발현하는 pTrc99Aγαβ을 이용하여, 실시예 2와 같이 하여 변이를 도입했다. 변이 도입에 이용한 정방향 프라이머의 서열은 표 10, 11에 나타내는 바와 같다. 역방향 프라이머의 서열은, 정방향 프라이머의 완전 상보쇄로 했다.

표 10

표 11

결과를 표 12, 13에 나타낸다. 이 결과로부터 명백하듯이, 472Phe와, 475위치 이외의 부위의 아미노산 치환과의 조합에 있어서는, 활성이 없어지거나, 변화가 없거나, 혹은 말토오스와의 반응성을 증대시키는 효과 밖에 볼 수 없고, 어떠한 부위에 변이를 도입하더라도 개선 효과를 볼 수 있는 것은 아닌 것이 확인되었다.

표 12

표 13

[산업상 이용가능성]

본 발명의 변이 GDH는, 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상하고 있으며, 글루코오스 센서 등을 이용한 글루코오스의 측정에 적합하게 사용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> Mutant glucose dehydrogenase <130> OPC5040 <150> JP2004-128165 <151> 2004-04-23 <160> 59 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 1 Glu His Lys Phe Asn <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 2 Asp Lys Met Asp Phe 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 3 Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu 1 5 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 4 Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile Met Gly Ala 1 5 10 15 Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr Phe Asp His 20 25 30 Pro Asn Leu 35 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 catgccatgg cacacaacga caacac 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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cgaatccggt 240 gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290 Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg 1 5 10 cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338 His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln 15 20 25 ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386 Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu 30 35 40 cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434 Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met 45 50 55 acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482 Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile 60 65 70 75 ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530 Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala 80 85 90 gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578 Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr 95 100 105 cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626 Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu 110 115 120 ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc 674 Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe 125 130 135 ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722 Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys 140 145 150 155 ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769 Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala 160 165 170 gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc 817 Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val 175 180 185 gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg 865 Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val 190 195 200 atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913 Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu 205 210 215 cgc ttc 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Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys 35 40 45 atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312 Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met 50 55 60 gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360 Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly 65 70 75 80 ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408 Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His 85 90 95 ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg 456 Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val 100 105 110 tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac 504 Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr 115 120 125 ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag 552 Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu 130 135 140 atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg 600 Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp 145 150 155 160 ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc 648 Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala 165 170 175 gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc 696 Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser 180 185 190 acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac 744 Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp 195 200 205 gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac 792 Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp 210 215 220 ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg 840 Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr 225 230 235 240 cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc 888 Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val 245 250 255 gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg 936 Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser 260 265 270 aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg 984 Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr 275 280 285 gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg 1032 Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp 290 295 300 ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg 1080 Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala 305 310 315 320 tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg 1128 Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr 325 330 335 tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg 1176 Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser 340 345 350 ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg 1224 Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val 355 360 365 cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 1272 Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile 370 375 380 ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg 1320 Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala 385 390 395 400 ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg 1368 Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val 405 410 415 acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418 Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg 420 425 cggcgcaacc gataggacag gag 1441 <210> 16 <211> 425 <212> PRT <213> Burkholderia cepacia <400> 16 Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 1 5 10 15 Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys 20 25 30 Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys 35 40 45 Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met 50 55 60 Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly 65 70 75 80 Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His 85 90 95 Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val 100 105 110 Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr 115 120 125 Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu 130 135 140 Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp 145 150 155 160 Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala 165 170 175 Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser 180 185 190 Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp 195 200 205 Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp 210 215 220 Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr 225 230 235 240 Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val 245 250 255 Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser 260 265 270 Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr 275 280 285 Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp 290 295 300 Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala 305 310 315 320 Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr 325 330 335 Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser 340 345 350 Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val 355 360 365 Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile 370 375 380 Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala 385 390 395 400 Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val 405 410 415 Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg 420 425 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 cctgttcaac gacgaattcg cgccgaacaa ccacatcac 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 gtgatgtggt tgttcggcgc gaattcgtcg ttgaacacg 39 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 19 cgatccgaac catcacttta cgggctcgac gatca 35 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 20 cgatccgaac catcacatct ttggctcgac gatcatggg 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 tccgaaccat cacatcacgt tttcgacgat catgggcgc 39 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 catcacatca cgggctttac gatcatgggc gcc 33 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 atcacatcac gggctcgttt atcatgggcg ccgatgc 37 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 cacgggctcg acgtttatgg gcgccgatg 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 25 cgggctcgac gatctttggc gccgatgcg 29 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 26 gggctcgacg atcatgtttg ccgatgcgcg cga 33 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 27 gctcgacgat catgggcttt gatgcgcgcg actcc 35 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 28 cgatcatggg cgcctttgcg cgcgactcc 29 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 29 cgatcatggg cgccgatttt cgcgactccg tcgtc 35 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 30 tgggcgccga tgcgtttgac tccgtcgtcg aca 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 31 gcgccgatgc gcgcttttcc gtcgtcgaca agg 33 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 32 cgatgcgcgc gactttgtcg tcgacaagga c 31 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 33 tgcgcgcgac tcctttgtcg acaaggactg c 31 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 34 cgcgcgactc cgtctttgac aaggactgcc g 31 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 35 cgcgactccg tcgtctttaa ggactgccgc acg 33 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 36 cgactccgtc gtcgactttg actgccgcac gttcg 35 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 37 ctccgtcgtc gacaagtttt gccgcacgtt cgacc 35 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 38 cgtcgtcgac aaggactttc gcacgttcga ccatc 35 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 39 gtcgtcgaca aggactgctt tacgttcgac catccgaac 39 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 40 ggaaatcgtc gagcgcttct ttaatcagcc cgacaagatg g 41 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 41 cgagcgcttc cgctttcagc ccgacaagat g 31 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 42 gtcgagcgct tccgcaattt tcccgacaag atggacttc 39 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 43 gagcgcttcc gcaatcagtt tgacaagatg gacttcatgg c 41 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 44 gcttccgcaa tcagcccttt aagatggact tcatggcgc 39 <210> 45 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 45 ccgcaatcag cccgacttta tggacttcat ggcgccg 37 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 46 gcaatcagcc cgacaagttt gacttcatgg cgccg 35 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 47 caatcagccc gacaagatgt ttttcatggc gccgtaccc 39 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 48 cgacaagatg gacttctttg cgccgtaccc gtc 33 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 49 cgacaagatg gacttcatgt ttccgtaccc gtcgagccc 39 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 50 caagatggac ttcatggcgt tttacccgtc gagcccctg 39 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 51 acttcatggc gccgtttccg tcgagcccc 29 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 52 cttcatggcg ccgtactttt cgagcccctg ggc 33 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 53 gcgccgtacc cgtttagccc ctgggcg 27 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 54 cgccgtaccc gtcgtttccc tgggcgccg 29 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 55 ccgtacccgt cgagcttttg ggcgccgcat ccc 33 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 56 ccgtcgagcc cctttgcgcc gcatccc 27 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 57 cgtcgagccc ctggtttccg catcccgagt acg 33 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 58 cgagcccctg ggcgtttcat cccgagtacg gcc 33 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 59 ccctgggcgc cgtttcccga gtacggc 27

Claims

서열 번호 13으로 나타내는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 하기의 위치 이외의 1~10개의 아미노산잔기가 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 또한, 글루코오스 탈수소효소 활성을 가진 단백질로서, 하기중의 어느 하나의 아미노산 치환 변이를 가진, 야생형 글루코오스 탈수소효소와 비교해서 글루코오스에 대한 기질 특이성이 향상한 변이 글루코오스 탈수소효소(숫자는 아미노산 서열에 있어서의 위치를, 아미노산잔기는 상기 위치에 있어서의 치환후의 아미노산잔기를 나타내며, 「+」는 동시에 2개의 아미노산 치환을 가진 것을 나타낸다.);

(A)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Cys, 472Glu, 472Gly, 472His, 472Ile, 472Leu, 472Met, 472Phe, 472Pro, 472Ser, 472Trp, 472Tyr, 472Val

(B)475Asp, 475Cys, 475Glu, 475Gly, 475His, 475Met, 475Phe, 475Ser, 475Tyr, 475Val,

(C)472Arg+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asn+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Asp+475(His, Phe, Ser, Val),

472Cys+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Glu+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Gly+475(Asp, Cys, Gly, Met, Phe, Ser, Tyr),

472His+475(Cys, Glu, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Ile+475(Asp, Cys, Glu, Gly, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Leu+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe, Ser),

472Phe+475(Asp, Glu, Gly, His, Met, Phe, Ser, Tyr),

472Pro+475His

472Ser+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser),

472Trp+475(His, Phe, Ser),

472Tyr+475(Asp, His, Phe, Ser),

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser).
제 1 항에 있어서, 상기 (A)～(C)에 나타내는 아미노산 치환 변이 이외는, 서열 번호 13으로 나타내는 아미노산 서열과 동일한, 변이 글루코오스 탈수소효소.
제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 치환 변이가, 하기의 변이로부터 선택되는, 변이 글루코오스 탈수소효소;

(D)472Arg, 472Asn, 472Asp, 472Glu, 472Gly, 472Phe, 472Pro,

(E)475Asp, 475Cys, 475Glu, 475Gly, 475Met, 475Phe

(F)472Arg+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Asn+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Asp+475(His, Ser),

472Cys+475(Gly, His, Phe),

472Glu+475(Glu, His, Phe, Tyr),

472Gly+475(Asp, Phe, Tyr),

472His+475(His, Ser),

472Ile+475(Asp, Glu, Gly, His, Ser),

472Leu+475(Gly, His, Phe, Tyr),

472Met+475(Asp, Gly, His, Phe),

472Phe+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe, Ser, Tyr),

472Ser+475(Glu, Gly, His, Phe),

472Trp+475(His, Phe),

472Tyr+475His,

472Val+475(Asp, Glu, Gly, His, Phe).
삭제
제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소와, 글루코오스 탈수소효소의 β서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.
제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.
제 6 항에 기재된 DNA를 보유하는 미생물.
제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 어세이 키트.
제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 1 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 센서.
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제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소와, 글루코오스 탈수소효소의 β서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.
제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.
제 16 항에 기재된 DNA를 보유하는 미생물.
제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 어세이 키트.
제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 2 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 센서.
제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소와, 글루코오스 탈수소효소의 β서브유닛을 적어도 포함한 변이 글루코오스 탈수소효소 복합체.
제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA.
제 21 항에 기재된 DNA를 보유하는 미생물.
제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 어세이 키트.
제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소, 또는 제 3 항에 기재된 변이 글루코오스 탈수소효소를 코드하는 DNA를 포함하는 미생물을 포함한, 글루코오스 센서.