JP4455164B2 - 安定化pqq依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物及びグルコース測定用試薬組成物 - Google Patents
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Description
すなわち、請求項1に記載の発明は、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた1種の安定化剤を含む安定化PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物を要旨とする。
グルコース+電子受容体→σ-グルコノラクトン+還元型電子受容体
この酵素活性は、PQQ−GDHによるグルコースの酸化に伴って還元されるPQQの量を酸化還元試薬の呈色反応により定量することができる。呈色試薬として例えば、PMS-DCIP、1-methoxy-PMS-XTT、フェリシアン化カリウムなどを用いることができる。
本発明においてPQQ−GDH活性の測定を原則として以下の試薬を用い以下の条件で行なうことができる。
〈試薬〉
10mmol/L MOPS(pH7.0)、1mmol/L 1-methoxy PMS(フェナジンメトサルフェート)、0.25mmol/L XTT、5mmol/L グルコース
〈測定条件〉
上記試薬混液140μLを25℃で約5分予備加温した後に0.1mLの酵素溶液を加え、緩やかに混和する。その後、水を対照とし25℃に制御された分光光度計で15分間記録し、その直線部分から1分間あたりの410nmの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、同様に吸光度変化を測定する。上記条件で1分間に生成するホルマザン1/2μmol/Lの酵素量を1単位(U)とする。
以下に示す方法でPQQ−GDH生産菌を作成した。
アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobactor calcoaceticus)IFO12552株の染色体DNAを次の方法で分離した。同菌株を10mLのLB培地で30℃、一晩振とう培養した後、遠心処理(15000rpm、10分間)により集菌した。得られた菌体からDneasy tissue kit(キアゲン社)を用いて染色体DNAを抽出、精製し、TEバッファーに溶解した。その後、次のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、目的とするPQQ−GDH遺伝子を含むDNA領域を増幅させた。尚、ここで使用されるプライマーは、アシネトバクター・スピーシーズ L.M.D 79.41株由来の可溶性PQQ−GDHの塩基配列(A-M Cleton-JansenらMol. Gen. Genet., 217, 430(1989))を基に設計した。
フォワードプライマー:5’-ACAAATCATATAGAGAACTCG-3’(配列番号1)
リバースプライマー:5’-TTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAGAGATCCTGGG-3’(配列番号2)
PCRは、以下に示す組成の溶液中で行ない、94℃2分間の反応、次に94℃30秒間、48℃30秒間、及び72℃2分間の反応を30サイクル、最後に72℃10分間の反応を行なう条件とした。
TAKARA LA-taq:0.5μL、10-fold buffer:5μL、25mM MgCl2:5μL、 dNTP mix(2.5mM):8μL、フォワードプライマー(10pmol/μL):1μL、リバースプライマー(10pmol/μL):1μL、テンプレート:H2Oで50μLに調整
フォワードプライマー:5’-GCGGCCGCGAATTCATGAATAAACATTTATTGGCTAAAATTACTTTAT-3’
(配列番号3)
フォワードプライマー:5’-GCGGCCGCCTGCAGCTATTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAGAGATCCTGGG-3’(配列番号4)
PCRは以下に示す組成の溶液中で行ない、94℃2分間の反応、次に94℃30秒間、55℃30秒間、および72℃2分間の反応を30サイクル、最後に72℃10分間の反応を行なう条件とした。
Sigma KlenTaq:0.5μL、10-fold buffer:5μL、dNTP mix(10mM):2.5μL、フォワードプライマー(10pmol/μL):2μL、リバースプライマー(10pmol/μL):2μL、テンプレート:H2Oで50μLに調整
実施例1で作成したPQQ−GDH生産菌を以下に示すように培養後精製を行ないPQQ−GDHを得た。
前培養培地組成は、酵母エキス 0.5%、ペプトン 1.0%、NaCl 1.0%、アンピシリンナトリウム 0.01%(pH7.0)とした。その後、121℃20分間滅菌後、生産菌を接種し37℃、7時間培養した。前培養液を本培地に接種後、33℃、48時間ジャーファーメンターで通気撹拌培養を行なった。本培地は、酵母エキス 0.5%、ペプトン 1.0%、NaCl 1.0%(pH6.5)とした。滅菌は121℃、20分間行なった。遠心分離で得られた菌体をマルチビーズショッカーにより破砕した。その後、凝集処理、ろ過、UF、DEAE-セファロースカラムクロマト、CM-セファロースカラムクロマト、UFを行なった後以下に示す様にPQQ−GDHに安定化剤を添加後、凍結乾燥を行ない、各種サンプルを作成した。尚、安定化剤の添加割合は凍結乾燥前の溶液の蛋白量を基準に添加した。
サンプル(1):無添加
サンプル(2):サリチル酸ナトリウム20重量%添加
サンプル(3):サリチル酸ナトリウム30重量%添加
サンプル(4):サリチル酸ナトリウム重量20%、アルブミン200重量%添加
サンプル(5):サリチル酸ナトリウム30重量%、アルブミン200重量%添加
サンプル(6):サリチル酸ナトリウム20重量%、ゼラチン200重量%添加
サンプル(7):サリチル酸ナトリウム30重量%、ゼラチン200重量%添加
サンプル(8):サリチル酸ナトリウム20重量%、アルブミン200重量%、フェリシアン化カリウム30重量%添加
サンプル(9):サリチル酸ナトリウム20重量%、フェリシアン化カリウム30重量%添加
実施例2で得た各サンプルを37℃で4ヶ月放置しPQQ−GDH活性を測定した。凍結乾燥直後のサンプル残存活性を100%として各サンプルの1ヶ月毎の残存活性を相対値で測定した。また、4ヶ月処理後のサンプルについて、水溶解時の混濁生成の有無を調べた
(混濁生成する場合:+、混濁生成しない場合:−)。結果は、図1に示した。
Claims (3)
- サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた1種の安定化剤を含む安定化PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
- PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた1種の安定化剤を添加するPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
- 請求項1に記載の安定化PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物と電子受容体と、を含むグルコース測定用試薬組成物。
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JP2004156982A JP4455164B2 (ja) | 2004-05-27 | 2004-05-27 | 安定化pqq依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物及びグルコース測定用試薬組成物 |
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