JP4639302B2 - 変異グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Description
高温下で生育する好熱性細菌由来の酵素は、一般に高い熱安定性を有し、長期保存や連続使用などにおいても高い安定性を示すことから、センサ素子としての応用が期待されている。しかし、好熱菌由来の耐熱性GDHについては、サーモゲネス・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilm)、スルファロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のGDHが報告されているが、いずれもNAD(P)+を補酵素とするものである。
(1)配列番号13に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において下記の位置以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、下記のいずれかのアミノ酸置換変異を有する、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「+」は同時に2つのアミノ酸置換を有することを示す。);
(A)472Arg、472Asn、472Asp、472Cys、472Glu、472Gly、472His、472Ile、472Leu、472Met、472Phe、472Pro、472Ser、472Trp、472Tyr、472Val、
(B)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475His、475Met、475Phe、475Ser、475Tyr、475Val、
(C)472Arg+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asn+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asp+475(His,Phe,Ser,Val)、
472Cys+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Glu+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Cys,Gly,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472His+475(Cys,Glu,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Ile+475(Asp,Cys,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Leu+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Pro+475His
472Ser+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、
472Trp+475(His,Phe,Ser)、
472Tyr+475(Asp,His,Phe,Ser)、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、
(2)前記(A)〜(C)に示すアミノ酸置換変異以外は、配列番号13に示すアミノ酸配列を有する、前記の変異グルコース脱水素酵素。
(3)前記アミノ酸置換変異が、下記の変異から選ばれる、前記の変異グルコース脱水素酵素;
(D)472Arg、472Asn、472Asp、472Glu、472Gly、472Phe、472Pro、
(E)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475Met、475Phe
(F)472Arg+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Asn+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Asp+475(His,Ser)、
472Cys+475(Gly,His,Phe)、
472Glu+475(Glu,His,Phe,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Phe,Tyr)、
472His+475(His,Ser)、
472Ile+475(Asp,Glu,Gyl,His,Ser)、
472Leu+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Ser+475(Glu,Gly,His,Phe)、
472Trp+475(His,Phe)、
472Tyr+475His、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe)。
(4)配列番号13に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において下記の位置以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、下記の特徴を有するグルコース脱水素酵素;
(i)配列番号13に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも472位のアルギニン残基又は475位のアスパラギン残基の何れかが他のアミノ酸残基に置換しており、
(ii)前記変異を導入したグルコース脱水素酵素のグルコースに対する比活性と、マルトースに対する比活性との比 ((マルトースに対する反応性/グルコースに対する反応性)×100)が、変異を導入しないグルコース脱水素酵素に比べて10%以上低下している。
(5)前記変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
(6)前記変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
(7)前記DNAを保持し、前記の変異グルコース脱水素酵素又は変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
(8)前記の変異グルコース脱水素酵素、変異グルコース脱水素酵素複合体、又は微生物を含む、グルコースアッセイキット。
(9)前記の変異グルコース脱水素酵素、変異グルコース脱水素酵素複合体、又は微生物を含む、グルコースセンサ。
本明細書において、変異GDHとは、変異GDH複合体との対比においては変異αサブユニットをいうが、変異αサブユニット及び変異GDH複合体を総称して「変異GDH」ということがある。
本発明の変異GDHは、野生型GDHに特定の変異を導入することにより、製造される。野生型GDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するGDHが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのGDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアKS1株、JCM2800株又はJCM2801株が産生するGDHが挙げられる。KS1株は、平成12年9月25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に、受託番号第FERM BP−7306として寄託されている。JCM2800株又はJCM2801株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設(Japan Collection of Microorganisms, JCM)に保存されている。
(B)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475His、475Met、475Phe、475Ser、475Tyr、475Val、
(C)472Arg+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asn+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asp+475(His,Phe,Ser,Val)、
472Cys+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Glu+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Cys,Gly,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472His+475(Cys,Glu,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Ile+475(Asp,Cys,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Leu+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Pro+475His
472Ser+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、
472Trp+475(His,Phe,Ser)、
472Tyr+475(Asp,His,Phe,Ser)、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、
(D)472Arg、472Asn、472Asp、472Glu、472Gly、472Phe、472Pro、
(E)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475Met、475Phe
(F)472Arg+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Asn+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Asp+475(His,Ser)、
472Cys+475(Gly,His,Phe)、
472Glu+475(Glu,His,Phe,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Phe,Tyr)、
472His+475(His,Ser)、
472Ile+475(Asp,Glu,Gyl,His,Ser)、
472Leu+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Ser+475(Glu,Gly,His,Phe)、
472Trp+475(His,Phe)、
472Tyr+475His、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe)。
ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミドとして、GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、WO02/036779に記載のプラスミドpTrc99A/γ+αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアKS1株(FERM BP-7306)染色体DNAから単離された、GDH γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むDNA断片が、ベクターpTrc99A(Pharmacia社)のクローニング部位であるNcoI/HindIIIに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のGDHγα遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99A/γ+αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようして調製した。
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン 10g、酵母抽出液 1g、NaCl 5g、KH2PO4 2g、グルコース 5g;1L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、50℃で6時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で10分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、2倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするDNA断片を増幅した。
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'(配列番号5)
〔リバースプライマー〕
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'(配列番号6)
市販の部位特異的変異導入キット(Stratagene社、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit)を用いて、実施例1に記載のプラスミドpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の475位のアスパラギンのコドン(AAT)をアスパラギン酸(GAT)又はグルタミン酸(GAA)のコドンに置換した。プライマーには、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。以下、475位のアスパラギン残基からアスパラギン酸残基へ置換を「Asn475Asp」、475位のアスパラギン残基からグルタミン酸残基へ置換を「Asn475Glu」と記載する。
〔フォワードプライマー〕
5'-CGCGCCGAACGATCACATCACGGGC-3'(配列番号7)
〔リバースプライマー〕
5'-GCCCGTGATGTGATCGTTCGGCGCG-3'(配列番号8)
Asn475Glu置換用プライマー
〔フォワードプライマー〕
5'-GAATTCGCGCCGAACGAACACATCACGGGCTCG-3'(配列番号9)
〔リバースプライマー〕
5'-CGAGCCCGTGATGTGTTCGTTCGGCGCGAATTC-3'(配列番号10)
PCR反応は、以下の反応組成で、95℃、30秒の後、95℃ 30秒、55℃ 1分、68℃ 8分を15サイクル繰り返し、68℃ 30分の反応を行った後、4℃で保持した。
鋳型DNA(5ng/μl) 2μl
(pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ)
10×反応緩衝液 5μl
フォワードプライマー(100ng/μl) 1.25μl
リバースプライマー(100ng/μl ) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸留水 38.5μl
DNAポリメラーゼ 1μl
合計 50μl
得られた反応液で、エシェリヒア・コリDH5α(supE44, ΔlacU169(φ80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi-1, relA1)のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)を含むLB寒天培地(バクトリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%)上に生育してきたコロニー数個からプラスミドDNAを調製し、配列解析を行って、GDH αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。Asn475Asp変異が導入されたpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβを、各々pTrcγαAsn475Asp、及びpTrcγαβAsn475Aspと命名した。また、Asn475Glu変異が導入されたpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβを、各々pTrcγαAsn475Glu、及びpTrcγαβAsn475Gluと命名した。
実施例2で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。
pTrcγαAsn475Glu、及びpTrcγαβAsn475Gluを導入したエシェリヒア・コリDH5α株を、各々2mlのLB培地(アンピシリン50μg/ml及びカナマイシン30μg/ml含有)で、L字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、150mlのLB培地(アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン30μg/ml含有)を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、37℃で振とう培養した。培養開始から3時間後にIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに2時間培養した。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.2% Triton X100を含む10mMリン酸カリウムバッファー(PPB)(pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液を遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー(カラム名:オクチルセファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー(Q-セファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
前記精製酵素サンプル8μlに、活性測定用試薬(12μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、120μlの6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPBを加え、全量480μlとした溶液)を8μl添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で1分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質(グルコース又はマルトース)、または蒸留水を8μl加えて攪拌し、分光光度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600 nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS、0.6mM。基質の終濃度は40mM,20mM,10mM,および5mMである。
結果を、表1及び図1〜5に示す。
実施例1で得られたpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の475位およびその周辺に変異導入を実施し、変異酵素の気質特異性を評価した。変異導入は、実施例2と同様に行なった。変異導入用プライマーは以下のようにして作製した。図6に示す基本プライマー(野生型)(フォワードプライマー:配列番号17、リバースプライマー:配列番号18)に対して、所定の位置(472位および475位)のコドンを、図6の入れ替えコドン表に示すとおりに変更し、各種変異導入用のプライマーを作製した。
実施例4で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、実施例3と同様にして、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。酵素活性は、粗酵素サンプルを用いて行った。それぞれの変異GDHのグルコースに対する比活性、マルトースに対する比活性、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性。単位はU/ml)を、表2〜7に示す。尚、グルコースに対する比活性が0.5U/ml以下のものに関しては活性無しと判断し、表中「−」で示した。
実施例5で基質特異性の改善が認められたいくつかの変異GDHについて、SVプロットを取得した。各々の変異GDHは、実施例3と同様にして精製した。結果を図7〜8、及び表8に示す。
その結果、精製した酵素においても、試験した全ての基質濃度に関して、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性)が野生型と比べて低くなり改善されていることが確認できた。また結果に関しても実施例5での粗酵素溶液による測定結果とほぼ一致したことから、粗酵素による改変酵素のスクリーニングは十分可能であることが確認できた。さらにこの候補の中からグルコースセンサに用いる改変酵素を選択した。その場合において血中のマルトース濃度は最大でも200mg/dlまでしか上昇しないことから、特に基質濃度180mg/dlと90mg/dlにおける反応比に注目した。結果グルコースに対する反応性が野生型と比較してあまり落ちていない候補として472Asp475Hisを選択し、グルコースに対する反応性は落ちるがマルトースとは殆ど反応しない候補として472Glu475Tyrを選択した。
472Asp+475His型変異GDH、及び、472Glu+475Tyr型変異GDHを用いて、血糖測定用の比色式センサを作製した。
また、ヘマトクリット値42%、グルコース濃度45mg/dlに調整した血液に、さらにマルトースを0,100,200又は300mg/dlになるように添加したものを用いて、マルトースの影響を評価した。図14(野生型)、図15(472Glu475Tyr)及び図16(472Asp475His)に示す。
472Phe型置換を有する変異GDHに、さらに475位に近い部位(477〜497位)およびランダムに選択した475位から遠い部位(53〜73位)において、フェニルアラニンへの置換を導入した。
Claims (9)
- 配列番号13に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において下記の位置以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、下記のいずれかのアミノ酸置換変異を有する、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「+」は同時に2つのアミノ酸置換を有することを示す。);
(A)472Arg、472Asn、472Asp、472Cys、472Glu、472Gly、472His、472Ile、472Leu、472Met、472Phe、472Pro、472Ser、472Trp、472Tyr、472Val、
(B)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475His、475Met、475Phe、475Ser、475Tyr、475Val、
(C)472Arg+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asn+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Asp+475(His,Phe,Ser,Val)、
472Cys+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Glu+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Cys,Gly,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472His+475(Cys,Glu,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Ile+475(Asp,Cys,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Leu+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe,Ser)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Met,Phe,Ser,Tyr)、
472Pro+475His
472Ser+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、
472Trp+475(His,Phe,Ser)、
472Tyr+475(Asp,His,Phe,Ser)、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe,Ser)、 - 前記(A)〜(C)に示すアミノ酸置換変異以外は、配列番号13に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記アミノ酸置換変異が、下記の変異から選ばれる、請求項1に記載の変異グルコース脱水素酵素;
(D)472Arg、472Asn、472Asp、472Glu、472Gly、472Phe、472Pro、
(E)475Asp、475Cys、475Glu、475Gly、475Met、475Phe
(F)472Arg+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Asn+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Asp+475(His,Ser)、
472Cys+475(Gly,His,Phe)、
472Glu+475(Glu,His,Phe,Tyr)、
472Gly+475(Asp,Phe,Tyr)、
472His+475(His,Ser)、
472Ile+475(Asp,Glu,Gyl,His,Ser)、
472Leu+475(Gly,His,Phe,Tyr)、
472Met+475(Asp,Gly,His,Phe)、
472Phe+475(Asp,Glu,Gyl,His,Phe,Ser,Tyr)、
472Ser+475(Glu,Gly,His,Phe)、
472Trp+475(His,Phe)、
472Tyr+475His、
472Val+475(Asp,Glu,Gly,His,Phe)。 - 配列番号13に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において下記の位置以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、下記の特徴を有するグルコース脱水素酵素;
(i)配列番号13に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも472位のアルギニン残基又は475位のアスパラギン残基の何れかが他のアミノ酸残基に置換しており、
(ii)前記変異を導入したグルコース脱水素酵素のグルコースに対する比活性と、マルトースに対する比活性との比 ((マルトースに対する反応性/グルコースに対する反応性)×100)が、変異を導入しないグルコース脱水素酵素に比べて10%以上低下している。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
- 請求項6に記載のDNAを保持し、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素又は請求項5に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
- 請求項1〜4に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項5に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項7に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
- 請求項1〜4に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項5に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項7に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
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