JPWO2017094776A1 - シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 - Google Patents
シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017094776A1 JPWO2017094776A1 JP2017554142A JP2017554142A JPWO2017094776A1 JP WO2017094776 A1 JPWO2017094776 A1 JP WO2017094776A1 JP 2017554142 A JP2017554142 A JP 2017554142A JP 2017554142 A JP2017554142 A JP 2017554142A JP WO2017094776 A1 JPWO2017094776 A1 JP WO2017094776A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- cytb
- cytochrome
- acid sequence
- glucose dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 215
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 190
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 152
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 110
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 70
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 claims abstract description 62
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 232
- 101150001086 COB gene Proteins 0.000 claims description 203
- 101150053771 MT-CYB gene Proteins 0.000 claims description 203
- 101150006264 ctb-1 gene Proteins 0.000 claims description 203
- 101150088166 mt:Cyt-b gene Proteins 0.000 claims description 203
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 108010052085 cellobiose-quinone oxidoreductase Proteins 0.000 claims description 86
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 77
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 61
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 44
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 40
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 39
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 241001450911 Circinella Species 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 241000800403 Crassicarpon hotsonii Species 0.000 claims description 10
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- 241000002049 Amesia atrobrunnea Species 0.000 claims description 5
- 241000266801 Circinella mucoroides Species 0.000 claims description 5
- 241001231443 Circinella simplex Species 0.000 claims description 5
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 claims description 5
- 241001643512 Hypoxylon haematostroma Species 0.000 claims description 5
- 241000306281 Mucor ambiguus Species 0.000 claims description 5
- 241000907556 Mucor hiemalis Species 0.000 claims description 5
- 241001495429 Thielavia terrestris Species 0.000 claims description 5
- 241000235389 Absidia Species 0.000 claims description 4
- 241000908198 Actinomucor Species 0.000 claims description 4
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 4
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 claims description 4
- 241000143682 Hypoxylon Species 0.000 claims description 4
- 241001541164 Mucor guilliermondii Species 0.000 claims description 4
- 241000800402 Myriococcum Species 0.000 claims description 4
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 claims description 4
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241001570673 Absidia cylindrospora Species 0.000 claims description 3
- 240000005007 Actinomucor elegans Species 0.000 claims description 3
- 235000013650 Actinomucor elegans Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001231458 Circinella angarensis Species 0.000 claims description 3
- 241001231456 Circinella chinensis Species 0.000 claims description 3
- 241001231446 Circinella minor Species 0.000 claims description 3
- 241000467320 Circinella muscae Species 0.000 claims description 3
- 241001450910 Circinella umbellata Species 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 3
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims description 3
- 241001305961 Lichtheimia hyalospora Species 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 3
- 241000498617 Mucor javanicus Species 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 3
- 241001231447 Circinella lacrymispora Species 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 142
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 121
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 118
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 99
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 82
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 65
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 19
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- 238000000970 chrono-amperometry Methods 0.000 description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 101000641031 Homo sapiens Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Proteins 0.000 description 11
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 9
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 7
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 7
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 7
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 7
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 7
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 7
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 7
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 6
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 6
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 4
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 4
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100008162 Candida tropicalis Cytb5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101000806046 Nicotiana plumbaginifolia Glutamate dehydrogenase A Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M chlorosilver;silver Chemical compound [Ag].[Ag]Cl GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 150000002988 phenazines Chemical class 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003304 ruthenium compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012036 ultra high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 1
- GUWSQVZFXHIGLN-UHFFFAOYSA-M 1-(4-amino-2-methylpyrimidin-5-ylmethyl)-3-(2-hydroxyethyl)-2-methylpyridinium bromide Chemical compound [Br-].NC1=NC(C)=NC=C1C[N+]1=CC=CC(CCO)=C1C GUWSQVZFXHIGLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUBPKGGBDDBMOV-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)triazol-1-yl]-1-[4-[4-[4-[2-[4-(2-hydroxyethyl)triazol-1-yl]acetyl]piperazin-1-yl]-6-[2-[2-(2-prop-2-ynoxyethoxy)ethoxy]ethylamino]-1,3,5-triazin-2-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1=NC(CCO)=CN1CC(=O)N1CCN(C=2N=C(N=C(NCCOCCOCCOCC#C)N=2)N2CCN(CC2)C(=O)CN2N=NC(CCO)=C2)CC1 AUBPKGGBDDBMOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001143500 Aceraceae Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 102100038385 Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000743767 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001231445 Mucor durus Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102220602575 Ubiquitin conjugation factor E4 A_C88A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 102220363731 c.196A>T Human genes 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 101150098038 cdh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000003869 coulometry Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004072 flavinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 239000000182 glucono-delta-lactone Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000007646 gravure printing Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002907 osmium Chemical class 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 125000001484 phenothiazinyl group Chemical class C1(=CC=CC=2SC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
- 125000001644 phenoxazinyl group Chemical class C1(=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N pyrroloquinoline quinone Chemical compound C12=C(C(O)=O)C=C(C(O)=O)N=C2C(=O)C(=O)C2=C1NC(C(=O)O)=C2 MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/80—Cytochromes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
- C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
[1] (i)天然においてシトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼに由来するグルコースデヒドロゲナーゼ部分と、(ii)シトクロムb部分とを融合させた、電子移動特性が改変され、酵素から電極への直接電子移動が可能な、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。
[2] 前記シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1300と比較して、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2300が1.5倍以上増大している、すなわちA2300/A1300が1.5以上であるか、または
前記シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1500と比較して、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2500が1.5倍以上増大している、すなわちA2500/A1500が1.5以上であり、
ここで、前記応答電流A1300、A2300、A1500、又はA2500は、試料添加後であって電圧印加による測定開始から40秒後における応答電流であり、前記応答電流はシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼタンパク質80μgを用いた場合における応答電流であり、遊離型メディエーター不在下及びグルコース存在下でのシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値から遊離型メディエーター不在下及びグルコース不在下でのシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値を減算した値である、[1]に記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。
[3] (i) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分の全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号4のアミノ酸配列と70%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1の32〜34位、58〜62位、106〜109位、111〜116位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜574位、584〜586位、592〜594位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、
(ii) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号12のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号12の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、
(iii) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号14のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号14の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、
(iv) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号16のアミノ酸配列と45%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号12の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、
(v) 上記の(ii)、(iii)または(iv)に記載の該シトクロムb部分について、配列番号12のアミノ酸配列における第95位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第197位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号12のアミノ酸配列における93−95位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met(Xaaは任意のアミノ酸)であり、配列番号12のアミノ酸配列における120−123位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro(Xaaは任意のアミノ酸)であり、配列番号12のアミノ酸配列における150−153位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys(Xaaは任意のアミノ酸)である、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、あるいは
(vi) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が上記の(i)に記載したものであり、かつ、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分が上記の(ii)、(iii)、(iv)または(v)に記載したものである、[1]または[2]に記載の融合タンパク質、あるいは
(vii) 前記(vi)の融合タンパク質について、前記(v)に規定された位置以外の位置において、グルコースデヒドロゲナーゼ部分及び/又はシトクロムb部分の1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、[1]または[2]に記載の融合タンパク質。
[4] 融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分とシトクロムb部分とがリンカーにより連結されている、[1]〜[3]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[5] 前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、カラクサケカビ(Circinella)属、ムコール・プライニ(Mucor prainii)、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、ムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)、ムコール・サブチリスマス(Mucor subtilissimus)、ムコール・ギリエルモンディ(Mucor guilliermondii)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus)、ムコール・ダイモルフォスポラス(Mucor dimorphosporus)、アブシジア・シリンドロスポラ(Absidia cylindrospora)、アブシジア・ヒアロスポラ(Absidia hyalospora)、アクチノムコール・エレガンス(Actinomucor elegans)、シルシネラ・シンプレックス(Circinella simplex)、シルシネラ属種(Circinella sp.)、シルシネラ・アンガレンシス(Circinella angarensis)、シルシネラ・シネンシス(Circinella chinensis)、シルシネラ・ラクリミスポラ(Circinella lacrymispora)、シルシネラ・マイナー(Circinella minor)、シルシネラ・ムコロイデス(Circinella mucoroides)、シルシネラ・リジダ(Circinella rigida)、シルシネラ・アンベラータ(Circinella umbellata)又はシルシネラ・ムスカエ(Circinella muscae)由来である、[1]〜[4]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[6] 前記融合タンパク質中のシトクロムb部分が、Myriococcum属由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ(CDH)が有するCytbドメイン、Myriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud属由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus属由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメイン又はAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon属由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon haematostroma由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium属由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium attrobruneum由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora属由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora crassa由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola属由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola insolens由来のCDHが有するCytbドメイン、Thielavia属由来のCDHが有するCytbドメイン、又はThielavia terrestris由来のCDHが有するCytbドメインに由来するものである、[1]〜[5]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[7] 前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、以下の特性、
作用:グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約70kDaであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約80kDaである、
基質特異性:D−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びD−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性:フラビン結合型である、
を備える、[1]〜[6]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[8] (a)[1]〜[7]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号33、35、37、39、41、43、114、116または118に示すアミノ酸配列をコードするDNA、
(c) 配列番号34、36、38、40、42、44、115、117または119に示す塩基配列を有するDNA、或いは
(d) 配列番号34、36、38、40、42、44、115、117または119に示す塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、遊離型メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質をコードするDNA、
からなる電子移動特性が改変されたシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子。
[9] [8]に記載の遺伝子を含む、ベクター。
[10] [9]記載のベクターを含む、宿主細胞。
[11] 以下の工程:
[10]に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を回収する工程
を含む、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を製造する方法。
[12] [1]〜[7]のいずれかに記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
[13] [1]〜[7]のいずれかに記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコース測定キット。
[14] [1]〜[7]のいずれかに記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコースセンサー。
第一の実施形態において本発明はシトクロムb−グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質を本明細書においてCytb-GDHと記載することがある。該融合タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ末端(以下、N末端と記載することがある)側にシトクロムbが連結されていてもよく、またはグルコースデヒドロゲナーゼのカルボキシ末端(以下、C末端と記載することがある)側にシトクロムbが連結されていてもよい。特に断らない限り、Cytb-GDHとの記載は、この両者を包含するものとする。なお、GDH-Cytbとの記載は、特に断らない限り、グルコースデヒドロゲナーゼのC末端側にCytbが連結されている融合タンパク質を表し、グルコースデヒドロゲナーゼのN末端側にCytbが連結されている融合タンパク質は包含しないものとする。グルコースデヒドロゲナーゼには、一または複数のCytbが連結されていてもよい。便宜上、前記のCytb-GDHとの記載は、複数のCytbが連結された融合タンパク質も包含するものとする。なお、Cytbx2-GDHとの記載は、特に断らない限り、グルコースデヒドロゲナーゼにCytbが2連結されている融合タンパク質を表わす。融合タンパク質中のCytb部分とグルコースデヒドロゲナーゼ部分とは、リンカーにより連結されていてもよい。またCytbが複数連結されている場合には、Cytb同士が場合によりリンカーを介して互いに連結されていてもよい。こうした態様もCytb-GDHとの記載に包含されるものとする。
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、配列番号1、配列番号4または配列番号10に示すアミノ酸配列を有するMucor属由来のグルコースデヒドロゲナーゼに基づき作製された、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号1、配列番号4または配列番号10と高い配列同一性(例えば、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)を有するアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼおよび配列番号1、配列番号4または配列番号10のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および/または挿入されたアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のGDHをアライメントしたときに、該2以上のGDHにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。また2以上のCytbをアライメントしたときに、該2以上のCytbにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
(GDHの熱安定性を向上させるアミノ酸置換について)
本発明者らは、GDHのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した(例えば国際公開2012/169512号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。本発明の融合タンパク質中のGDH部分は、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
(a)232位
(b)387位
(c)545位
場合により(a)232位に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。
場合により(b)387位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインへと置換されてもよい。
場合により(c)545位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はバリン、トレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。
(d)66位
(e)68位
(f)88位
(g)158位
(h)233位
(i)385位
(j)391位
(k)557位
(l)559位
場合により(d)66位に対応する位置のアミノ酸は、チロシンへと置換されてもよい。場合により(e)68位に対応する位置のアミノ酸は、グリシンへと置換されてもよい。場合により(f)88位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により(g)158位に対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジンへと置換されてもよい。
場合により(h)233位に対応する位置のアミノ酸は、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により(i)385位に対応する位置のアミノ酸は、トレオニンへと置換されてもよい。
場合により(j)391位に対応する位置のアミノ酸は、イソロイシンへと置換されてもよい。
場合により(k)557位に対応する位置のアミノ酸は、バリンへと置換されてもよい。場合により(l)559位に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。
本発明者らは、GDHのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した(例えば特願2014-037737を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。本発明の融合タンパク質中のGDH部分は、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
(m)88位
(n)554位
場合により(m)88位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により(n)554位に対応する位置のアミノ酸は、アスパラギン酸へと置換されてもよい。
ある実施形態において本発明のCytb-GDH中のGDH部分はフラビン結合型GDHである。GDH部分がフラビン結合型GDHである場合において、本発明の融合タンパク質中のGDH部分は以下の性質を有するものでありうる。
作用:グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約70kDaであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約80kDaである、
基質特異性:D−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、及びD−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性:フラビン結合型である。
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のCytb部分は、配列番号12、14、16または21に示すアミノ酸配列を有するCytbに基づき作製された、Cytbの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号12、14、16または21と高い配列同一性(例えば、45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)を有するアミノ酸配列を有するCytbおよび配列番号12、14、16または21のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および/または挿入されたアミノ酸配列を有するCytbを挙げることができる。ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のCytb部分は、融合型Cytbということがある。
例えば、図2では配列番号12で示されるMyriococcum thermophilumのCDH中のCytbドメイン(以下、MtCytb)と全長アミノ酸配列の配列同一性が52%以上であるCytbをアライメントした。このうち、配列番号12で示されるMtCytbを基準として第52−53位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号12で示されるMtCytbを基準として35−36位、59−61位、64−69位、73−76位、99−100位、119−120位、133−134位、143−144位、148−150位、152−154位、167−168位、174−176位、188−189位、および216−217位はMtCytbの相同性領域に該当しうる。ある実施形態ではMtCytbの相同性領域はこれらの領域からなる。
別の例として、図3では配列番号14で示されるCorynascud thermophiles由来のCDH中のCytbドメイン(以下、CtCytb)と全長アミノ酸配列の配列同一性が50%以上であるCytbをアライメントした。このうち、配列番号14で示されるCtCytbを基準として第1−2位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号14で示されるCtCytbを基準として8−10位、12−14位、23−24位、30−31位、35−37位、41−42位、50−57位、59−61位、64−74位、82−83位、85−86位、88−91位、93−97位、99−104位、110−123位、125−128位、130−134位、149−150位、152−156位、166−168位、172−175位、187−190位、194−197位、199−200位、及び202−205位はCtCytbの相同性領域に該当しうる。ある実施形態ではCtCytbの相同性領域はこれらの領域からなる。
アミノ酸配列中の相同性領域(保存領域)を決定する手法と同じ手法を用いて、アミノ酸配列中の保存アミノ酸残基または保存アミノ酸モチーフを決定することができる。マルチプルアライメントプログラム等によりアミノ酸配列をアライメントさせた後、保存されているアミノ酸残基またはアミノ酸モチーフを特定する。その後、部位特異的突然変異を導入により活性に関連することが知られてるアミノ酸残基、又は、結晶構造解析により三次元構造が明らかとなっているアミノ酸配列中の活性に関連すると考えられる特定の位置のアミノ酸残基と、アライメントから得られた保存アミノ酸残基とを比較する。これらのアミノ酸残基が一致すれば、その保存アミノ酸残基は活性に関連すると考えられる。単独のアミノ酸残基のみならず、複数のアミノ酸を有するアミノ酸モチーフについても同様である。
ある実施形態において本発明のCytb-GDH中のCytb部分は以下の性質を有するものでありうる。
作用:グルコースデヒドロゲナーゼ部分から電子を受け取ることができ、かつ、受け取った電子を遊離型メディエーターの不在下で電極へ受け渡すことができる、
分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約20−約25kDa、例えば約22.9−約23.4kDa、例えば約23kDaである、
分光特性:還元型で、Cytbに特徴的な吸収スペクトルを有する、
溶解特性:可溶性タンパク質である、
構造:アミノ末端にシグナル配列を有する。
ある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のN末端側がCytb部分に連結されている。またある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のC末端側がCytb部分に連結されている。このとき、GDH部分とCytb部分とは、リンカー部分により連結されていてもよい。リンカーとしては、天然のリンカー若しくはその部分配列、それを改変した配列、遺伝子操作されたリンカー配列、同一又は異なるリンカーを反復した配列、天然リンカーの一部を欠失させた配列、およびこれらの組み合わせ等を用いることができる。天然のリンカーとは、天然のポリペプチド配列中のあるドメインと別のドメインとを連結する部分をいう。例えば天然のCDHはフラボデヒドロゲナーゼドメインとCytbドメインとを有し、このとき該フラボデヒドロゲナーゼドメインとCytbドメインとを連結している部分がリンカーである。同一リンカーを反復した配列とは、リンカーLを、L-L、L-L-L等、適当に反復した配列をいう。異なるリンカーを反復した配列とは、例えばリンカーL1とリンカーL2がある場合において、L1-L2-L1、L1-L1-L2、L1-L2-L2、L1-L2-L1-L2、L1-L1-L2-L2、L1-L1-L1-L2等、適当な順列でL1とL2とのいずれかまたは両方を反復した配列をいう。リンカーの長さは例えば1〜60アミノ酸、2〜50アミノ酸、3〜40アミノ酸、4〜35アミノ酸、5〜31アミノ酸等でありうる。
ある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のN末端がCytb部分に連結されており、又はGDH部分のC末端がCytb部分に連結されている。このとき、Ctyb部分のアミノ酸配列は、電子メディエータ機能を有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列であれば、その一部を欠失させた部分アミノ酸配列であってもよい。例えばCytb部分は、当該Cytb部分中のN末端側若しくはC末端側のアミノ酸配列の一部、例えば1〜60個、例えば2〜55個、3〜54個、4〜53個、5〜52個、6〜51個、例えば7〜50個のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列であり得る。またGDH部分はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列であれば、その一部を欠失させた部分アミノ酸配列であってもよい。例えばGDH部分は、当該GDH部分中のN末端側若しくはC末端側のアミノ酸配列の一部、例えば1〜60個、例えば2〜55個、3〜50個、4〜45個、5〜40個、6〜35個、7〜30個、8〜29個、例えば11〜28個のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列であり得る。
GDH部分は全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号4又は配列番号10で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と例えば70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の同一性を有し、配列番号1の31-41位、58-62位、71-85位、106-116位、119-127位、132-134位、136-144位、150-157位、167-171位、219-225位、253-262位、277-281位、301-303位、305-312位、314-319位、324-326位、332-337位、339-346位、348-354位、388-394位、415-417位、454-459位、477-484位、486-491位、508-511位、564-579位、584-586位、592-605位、607-617位、及び625-630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、
Cytb部分は、その全長アミノ酸配列が、配列番号12若しくは16で示されるアミノ酸配列と例えば45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有し、配列番号12の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該Cytbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、
またはその全長アミノ酸配列が、配列番号14若しくは配列番号21で示されるアミノ酸配列と例えば45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の同一性を有し、配列番号14の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該Cytbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、
または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号12のアミノ酸配列における第95位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第197位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、場合により配列番号12のアミノ酸配列における93−95位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met(Xaaは任意のアミノ酸)であり、場合により配列番号12のアミノ酸配列における120−123位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro(Xaaは任意のアミノ酸)であり、場合により配列番号12のアミノ酸配列における150−153位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys(Xaaは任意のアミノ酸)であり、かつ、
該Cytb部分は該GDH部分から電子を受け取ることができ、受け取った電子を遊離型メディエーターの不在下で電極へ受け渡すことができる、すなわちCytb-GDHから電極への直接電子移動が可能である。
GDHをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、GDH生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
本明細書においてCytb遺伝子という場合、これはCytbをコードする遺伝子のみならず、Cytbドメインをコードする遺伝子も包含するものとする。Cytbをコードする遺伝子又はCytbドメインをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、Cytb生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
Cytb-GDHをコードする遺伝子(以下、Cytb-GDH遺伝子ということがある)は、上記のGDH遺伝子と上記のCytb遺伝子とを、慣用の遺伝子操作方法により連結して作製することができる。このとき、GDH遺伝子をCytbの5'側に配置してもく、または3'側に配置してもよい。Cytb遺伝子は複数連結してもよい。またGDH遺伝子と該一又は複数のCytb遺伝子との間にはリンカーペプチドをコードする塩基配列を配置してもよい。
公知のGDHから出発し、本発明に係る融合タンパク質に用いるGDHを取得する方法として、出発GDH遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるGDHについて、酵素科学的性質を指標に選択又はスクリーニングを行うことができる。
上述のように得られた本発明のCytb-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
本発明のCytb-GDHを生産する形質転換糸状菌を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。得られた宿主細胞(形質転換体)がコロニーを形成した0.5%寒天を含む最少培地からコロニーをDPY液体培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)酵母エキス、0.5%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4・7H20)に植菌し、3日間で振とう培養を行う。得られた培養上清液を、Cytb-GDHが作用すれば発色または変色する組成とした反応液(グルコース、DCIPまたはシトクロムcを含む10mM リン酸緩衝液(pH7.0))と混合し、DCIP由来紫色またはシトクロムc由来赤褐色の変色の度合を観察する。電子移動にPMS等の遊離型メディエーターを必要とするCytb-GDHの場合、遊離型メディエーターの存在しない反応液では変色する度合が少ないが、電子移動特性が改変された本発明のCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHの場合は、反応液の変色する度合が多くなる。これを利用し、野生型Cytb及び野生型GDHから構成されるCytb-GDHを産生する株が混合された反応液の変色度合との比較により、電子移動特性が改変されたCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHを生産する形質転換体を選抜しうる。
Cytb-GDHはさらに、機能性Cytb-GDH変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したCytb-GDH遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異GDHの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。Cytb-GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはGDH活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のCytb-GDHが作用すれば発色または変色する組成とした反応液を用いてもよい。例えば96ウェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて550nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
本発明のCytb-GDHは、上述のように取得した本発明のCytb-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるCytb-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からCytb-GDHタンパク質を単離することにより製造すればよい。
本発明のCytb-GDH中のGDH部分は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。これを便宜上、GDH活性と呼ぶことがある。
(反応1) D-グルコ−ス + PMS(酸化型)
→ D-グルコノ−δ−ラクトン + PMS(還元型)
(反応2) PMS(還元型) + DCIP(酸化型)
→ PMS(酸化型) + DCIP(還元型)
ある実施形態において本発明は、本発明のCytb-GDHを含むグルコースアッセイキットを提供する。このキットを用いることにより、本発明のCytb-GDHを用いて血中のグルコース(血糖値)を測定することができる。測定は連続的に行ってもよい。
ある実施形態において本発明は、本発明のCytb-GDHを用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のCytb-GDH酵素を塗布または固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のCytb-GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
ある実施形態において、本発明の測定方法、キット、装置及びセンサーには、遊離型メディエーター(人工電子メディエーター、人工電子アクセプター、電子メディエーターともいう)を用いることもできる。遊離型メディエーターは、本発明のCytb-GDHから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。遊離型メディエーターとしては遊離型の、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類(例えば、Cytb、Cytc)、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体、およびその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばPMS、メトキシPMSが挙げられるがこれに限定されない。なお、本明細書にいう「遊離型メディエーター」とは、Cytb-GDHに含まれる融合型Cytbと対比した便宜上の用語に過ぎない。あるメディエーターが、GDHに融合又は連結されていなければ、当該メディエーターが膜に包埋されていても、又は電極に固定化されていても、それは本明細書にいう「遊離型メディエーター」に包含されるものとする。また遊離型メディエーターを非融合型メディエーターということがある。
1.Mucor属由来GDH遺伝子の宿主への導入とGDH活性の確認
まずMucor属由来GDH(MpGDH、配列番号1)にN66Y/N68G/C88A/Q233R/T387C/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH(以下、本明細書においてMpGDH-M1ということがある)をコードする遺伝子を取得した。MpGDH-M1のアミノ酸配列は配列番号10に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号11に示す。プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH-M1遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。具体的には、pUC19は、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)に付属されているpUC19 linearized Vectorを用いた。pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M1遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19−MpGDH-M1)を得た。
MpGDH-M1もしくはMtCytb-MpGDH-M1、CtCytb-MpGDH-M1、AsCytb-L1-MpGDH-M1、AsCytbx2-MpGDH-M1、AsCytb-L2-MpGDH-M1、MpGDH-M1-CtCytbの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、グラッシーカーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、DEP Chip電極(丸形・カーボン・ダムリング付き;バイオデバイステクノロジー社製)上に、終濃度約100mMのリン酸緩衝液(pH7.0)及び130μgの精製酵素MpGDH-M1液または80μgの精製酵素MtCytb-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素CtCytb-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytb-L1-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytbx2-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytb-L2-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素MpGDH-M1-CtCytb液を10μLに溶解した液を載せた。その後、DEP Chip専用コネクターを用いて、オートマチック ポラリゼーションシステム HSV-100(北斗電工社製)に接続した。そして、+300mVもしくは+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加して、100mMグルコース溶液5μLを電極上に載せて反応を行い、40秒間の電流値を測定した。
Mucor DR056860由来GDH(MdrGDH)をコードする遺伝子を取得した(国際公開第2013/118798号参照)。MdrGDHのアミノ酸配列は配列番号4に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号112に示す。
カーボンの作用電極、銀の参照電極が印刷されてなる、SCREEN-PRINTED ELECTRODES(Drop Sense社製、DRP-110)の作用極上に、MtCytb-MpGDH-M1を875μg塗布し、37℃で乾燥させた。その後、37℃で溶解させた3wt%のAgarose L(株式会社ニッポンジーン製)を25μL塗布し、室温で冷却することで包括固定した。続いて、酵素固定化印刷電極を、専用コネクター(Drop Sense社製、DRP-CAC)を用いて、ALS 電気化学アナライザー 814D(BAS社製)に作用極として接続した。さらに、参照極として飽和KCl銀塩化銀参照電極(BAS社製)、対極として白金電極(BAS社製)を用い、それぞれALS 電気化学アナライザー 814Dに接続した。3極を30mLの100mMリン酸カリウム溶液(pH7.0)に入れ、スターラーにより攪拌しながら、1Mグルコースを適宜添加し、+500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧での応答電流を計測した。グルコース添加後、一定の応答電流値となってから、その値を記録し、グルコースを再添加するというサイクルを繰り返した。その結果、0.1mMから50mMグルコースにおいて、遊離型メディエーターを溶液中に添加することなく、応答電流の増加を示すことができた。
配列番号1 Mucor prainii由来GDH(MpGDH)のアミノ酸配列
配列番号2 MpGDH遺伝子の塩基配列
配列番号3 Mucor hiemalis由来GDH(MhGDH)のアミノ酸配列
配列番号4 Mucor DR056860由来GDH(MdrGDH)のアミノ酸配列
配列番号5 Mucor subtilissimus由来GDH(MsGDH)のアミノ酸配列
配列番号6 Mucor guilliermondii由来GDH(MgGDH)のアミノ酸配列
配列番号7 Circinella simplex由来GDH(CsGDH)のアミノ酸配列
配列番号8 Circinella属由来GDH(CrGDH)のアミノ酸配列
配列番号9 Mucor circinelloides由来GDH(McGDH)のアミノ酸配列
配列番号10 MpGDH-M1グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号11 MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号12 Mt Cytbのアミノ酸配列
配列番号13 配列番号12のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号14 Ct Cytbのアミノ酸配列
配列番号15 配列番号14のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号16 As Cytbの推定アミノ酸配列
配列番号17 配列番号16のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号18 Hypoxylon haematostroma由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号19 Chaetomium attrobruneum由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号20 Neurospora crassa由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号21 Humicola insolens由来のアミノ酸配列
配列番号22 Thielavia terrestris由来のアミノ酸配列
配列番号23 リンカー配列 Mt
配列番号24 リンカー配列 Mt塩基配列
配列番号25 リンカー配列 Ct
配列番号26 リンカー配列 Ct塩基配列
配列番号27 リンカー配列 AsL1
配列番号28 リンカー配列 AsL1塩基配列
配列番号29 リンカー配列 AsL2
配列番号30 リンカー配列 AsL2塩基配列
配列番号31 リンカー配列 C末端Ct
配列番号32 リンカー配列 C末端Ct塩基配列
配列番号33 MtCytb-MpGDH-M1のアミノ酸配列
配列番号34 MtCytb-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号35 CtCytb-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号36 CtCytb-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号37 AsCytb-L1-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号38 AsCytb-L1-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号39 AsCytbx2-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号40 AsCytbx2-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号41 AsCytb-L2-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号42 AsCytb-L2-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号43 MpGDH-M1-CtCytbのアミノ酸配列
配列番号44 MpGDH-M1-CtCytb遺伝子の塩基配列
配列番号45〜48 MtCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号49〜52 CtCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号53〜56 AsCytb-L1-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号57〜60 AsCytbx2-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号61〜62 AsCytb-L2-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号63〜66 MpGDH-M1-CtCytb作製用プライマー
配列番号67 Aspergillus terreus由来のCDHのリンカー配列GDCSGDGGGGSGPEPVPVPDG
配列番号68 HSP70由来のリンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS
配列番号69 鶏卵リゾチーム由来リンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS
配列番号70 ヘマグルチニンHAペプチド由来リンカー配列GGSGGGGG
配列番号71−111 リンカー
配列番号112 配列番号4のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号113 配列番号21のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号114 HiCytb-MpGDH-M1のアミノ酸配列
配列番号115 配列番号114のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号116 MtCytb-MdrGDHのアミノ酸配列
配列番号117 配列番号116のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号118 CtCytb-MdrGDHのアミノ酸配列
配列番号119 配列番号118のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号120 リンカー配列 Hi
配列番号121 リンカー配列 Hi塩基配列
配列番号122 リンカー配列 Mt-Mdr
配列番号123 リンカー配列 Mt-Mdr塩基配列
配列番号124 リンカー配列 Ct-Mdr
配列番号125 リンカー配列 Ct-Mdr塩基配列
配列番号126〜129 HiCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号130〜133 MtCytb-MdrGDH作製用プライマー
配列番号134〜137 CtCytb-MdrGDH作製用プライマー
Claims (14)
- (i)天然においてシトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼに由来するグルコースデヒドロゲナーゼ部分と、(ii)シトクロムb部分とを融合させた、電子移動特性が改変され、酵素から電極への直接電子移動が可能な、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。
- 前記シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1300と比較して、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2300が1.5倍以上増大している、すなわちA2300/A1300が1.5以上であるか、または
前記シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1500と比較して、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2500が1.5倍以上増大している、すなわちA2500/A1500が1.5以上であり、
ここで、前記応答電流A1300、A2300、A1500、又はA2500は、試料添加後であって電圧印加による測定開始から40秒後における応答電流であり、前記応答電流はシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼタンパク質80μgを用いた場合における応答電流であり、遊離型メディエーター不在下及びグルコース存在下でのシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値から遊離型メディエーター不在下及びグルコース不在下でのシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値を減算した値である、請求項1に記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。 - (i) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分の全長アミノ酸配列が配列番号1又は配列番号4のアミノ酸配列と70%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1の32〜34位、58〜62位、106〜109位、111〜116位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜574位、584〜586位、592〜594位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質、
(ii) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号12のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号12の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質、
(iii) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号14のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号14の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質、
(iv) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分の全長アミノ酸配列が配列番号16のアミノ酸配列と45%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号12の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質、
(v) 上記の(ii)、(iii)または(iv)に記載の該シトクロムb部分について、配列番号12のアミノ酸配列における第95位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第197位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号12のアミノ酸配列における93−95位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met(Xaaは任意のアミノ酸)であり、配列番号12のアミノ酸配列における120−123位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro(Xaaは任意のアミノ酸)であり、配列番号12のアミノ酸配列における150−153位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys(Xaaは任意のアミノ酸)である、請求項1または2に記載の融合タンパク質、あるいは
(vi) シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が上記の(i)に記載したものであり、かつ、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムb部分が上記の(ii)、(iii)、(iv)または(v)に記載したものである、請求項1または2に記載の融合タンパク質、あるいは
(vii) 前記(vi)の融合タンパク質について、前記(v)に規定された位置以外の位置において、グルコースデヒドロゲナーゼ部分及び/又はシトクロムb部分の1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。 - 融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分とシトクロムb部分とがリンカーにより連結されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、カラクサケカビ(Circinella)属、ムコール・プライニ(Mucor prainii)、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、ムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)、ムコール・サブチリスマス(Mucor subtilissimus)、ムコール・ギリエルモンディ(Mucor guilliermondii)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus)、ムコール・ダイモルフォスポラス(Mucor dimorphosporus)、アブシジア・シリンドロスポラ(Absidia cylindrospora)、アブシジア・ヒアロスポラ(Absidia hyalospora)、アクチノムコール・エレガンス(Actinomucor elegans)、シルシネラ・シンプレックス(Circinella simplex)、シルシネラ属種(Circinella sp.)、シルシネラ・アンガレンシス(Circinella angarensis)、シルシネラ・シネンシス(Circinella chinensis)、シルシネラ・ラクリミスポラ(Circinella lacrymispora)、シルシネラ・マイナー(Circinella minor)、シルシネラ・ムコロイデス(Circinella mucoroides)、シルシネラ・リジダ(Circinella rigida)、シルシネラ・アンベラータ(Circinella umbellata)又はシルシネラ・ムスカエ(Circinella muscae)由来である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質中のシトクロムb部分が、Myriococcum属由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ(CDH)が有するCytbドメイン、Myriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud属由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus属由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメイン又はAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon属由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon haematostroma由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium属由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium attrobruneum由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora属由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora crassa由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola属由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola insolens由来のCDHが有するCytbドメイン、Thielavia属由来のCDHが有するCytbドメイン、又はThielavia terrestris由来のCDHが有するCytbドメインに由来するものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、以下の特性、
作用:グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約70kDaであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約80kDaである、
基質特異性:D−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びD−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性:フラビン結合型である、
を備える、請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - (a) 請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号33、35、37、39、41、43、114、116または118に示すアミノ酸配列をコードするDNA、
(c) 配列番号34、36、38、40、42、44、115、117または119に示す塩基配列を有するDNA、或いは
(d) 配列番号34、36、38、40、42、44、115、117または119に示す塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、遊離型メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質をコードするDNA、
からなる電子移動特性が改変されたシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子。 - 請求項8に記載の遺伝子を含む、ベクター。
- 請求項9記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 以下の工程:
請求項10に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を回収する工程
を含む、シトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を製造する方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコース測定キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のシトクロムb―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコースセンサー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015233983 | 2015-11-30 | ||
JP2015233983 | 2015-11-30 | ||
PCT/JP2016/085556 WO2017094776A1 (ja) | 2015-11-30 | 2016-11-30 | シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017094776A1 true JPWO2017094776A1 (ja) | 2018-09-27 |
JP7042085B2 JP7042085B2 (ja) | 2022-03-29 |
Family
ID=58796960
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017554142A Active JP7042085B2 (ja) | 2015-11-30 | 2016-11-30 | シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11208466B2 (ja) |
JP (1) | JP7042085B2 (ja) |
WO (1) | WO2017094776A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3456823A4 (en) | 2016-05-09 | 2019-11-13 | Kikkoman Corporation | FLAVIN BINDING GLUCOSE DEHYDROGENASE VARIANT |
IL253801A0 (en) * | 2017-08-02 | 2017-09-28 | B G Negev Technologies And Applications Ltd At Ben Gurion Univ | Recombinant flavin-adenine dinuclease glucose dehydrogenase and its uses |
JPWO2019069977A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2020-12-24 | キッコーマン株式会社 | アルカリホスファターゼの製造方法及びそれを用いて得られるアルカリホスファターゼ、並びにその製造のためのベクター及び形質転換体 |
JP2021078354A (ja) * | 2018-03-08 | 2021-05-27 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質 |
US11293921B2 (en) * | 2018-10-03 | 2022-04-05 | Arkray, Inc. | Direct electron transfer-type oxidoreductase-modified molecular recognition element |
CN112501247B (zh) * | 2020-12-21 | 2022-08-12 | 山东大学 | 一种高通量同时测定混培微生物粗酶中多种酶活性的方法 |
CN116042665B (zh) * | 2023-03-10 | 2023-08-11 | 河南大学 | 葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005030807A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Koji Sode | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
WO2010097462A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Universitaet Fuer Bodenkultur Wien | Cellobiose dehydrogenase |
WO2010126139A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 池田食研株式会社 | 蛋白質性電子メディエータ |
WO2012169512A1 (ja) * | 2011-06-07 | 2012-12-13 | キッコーマン株式会社 | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法 |
WO2013065770A1 (ja) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | キッコーマン株式会社 | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2013118798A1 (ja) * | 2012-02-09 | 2013-08-15 | 東洋紡株式会社 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
WO2015099112A1 (ja) * | 2013-12-27 | 2015-07-02 | キッコーマン株式会社 | 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60128824T2 (de) | 2000-10-31 | 2008-02-07 | Koji Sode | Neue glucosedehydrogenase und verfahren zur herstellung der dehydrogenase |
JPWO2002073181A1 (ja) | 2001-03-13 | 2004-07-02 | 早出 広司 | 酵素電極 |
US7497940B2 (en) | 2003-09-02 | 2009-03-03 | Koji Sode | Glucose sensor and glucose level measuring apparatus |
EP3456823A4 (en) | 2016-05-09 | 2019-11-13 | Kikkoman Corporation | FLAVIN BINDING GLUCOSE DEHYDROGENASE VARIANT |
US20190257781A1 (en) | 2016-10-19 | 2019-08-22 | Kikkoman Corporation | Glucose redox reaction and composition for glucose measurement using flavin compound (as amended) |
KR20190135508A (ko) | 2017-03-31 | 2019-12-06 | 기꼬만 가부시키가이샤 | Fad-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법 |
-
2016
- 2016-11-30 WO PCT/JP2016/085556 patent/WO2017094776A1/ja active Application Filing
- 2016-11-30 US US15/778,726 patent/US11208466B2/en active Active
- 2016-11-30 JP JP2017554142A patent/JP7042085B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005030807A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Koji Sode | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
WO2010097462A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Universitaet Fuer Bodenkultur Wien | Cellobiose dehydrogenase |
WO2010126139A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 池田食研株式会社 | 蛋白質性電子メディエータ |
WO2012169512A1 (ja) * | 2011-06-07 | 2012-12-13 | キッコーマン株式会社 | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法 |
WO2013065770A1 (ja) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | キッコーマン株式会社 | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2013118798A1 (ja) * | 2012-02-09 | 2013-08-15 | 東洋紡株式会社 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
WO2015099112A1 (ja) * | 2013-12-27 | 2015-07-02 | キッコーマン株式会社 | 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7042085B2 (ja) | 2022-03-29 |
US20180355022A1 (en) | 2018-12-13 |
WO2017094776A1 (ja) | 2017-06-08 |
US11208466B2 (en) | 2021-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6911066B2 (ja) | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法 | |
WO2017094776A1 (ja) | シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 | |
US8999691B2 (en) | Glucose dehydrogenase | |
JP6184326B2 (ja) | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP7084867B2 (ja) | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
WO2015099112A1 (ja) | 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
KR101766522B1 (ko) | 포도당 탈수소 효소 | |
JP6635913B2 (ja) | 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP7301516B2 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼ変異体 | |
JP6934720B2 (ja) | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6964000B2 (ja) | 電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 | |
CN110494568B (zh) | 使用fad依赖性葡糖脱氢酶的连续葡萄糖监测 | |
JP7165493B2 (ja) | 保存安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ及び持続血糖測定 | |
JP2022173549A (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190925 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201006 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210713 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210913 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211110 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220308 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7042085 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |