KR20190135508A - Fad-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법 - Google Patents

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Abstract

FAD-GDH를 이용하는 것을 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링(Continuous Glucose monitoring, CGM) 방법이 제공된다. 상기 FAD-GDH는 일정 기간 동안 초기 활성을 유지할 수 있다. FAD-GDH를 포함하는 CGM 장치 뿐만 아니라 CGM에 사용하기에 적합한 FAD-GDH 스크리닝 방법도 또한 제공된다.

Description

FAD-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법
본 발명은 FAD-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법에 관한 것이다.
연속 글루코오스 모니터링(CGM, 플래시 글루코오스 모니터링(FGM)이라고도 함) 시스템은 당뇨병을 진단하고 관리하기 위해 중요하다. CGM 시스템은 며칠에서 약 1-2주의 기간에 걸쳐 혈당 수준을 측정할 수 있다. CGM 시스템은 글루코오스 센서를 포함한다.
글루코오스 수준의 측정은 글루코오스 옥시다제(GOD)로 수행할 수 있다. 글루코오스 옥시다제는 글루코오스를 산화시킬 때 산소를 전자 수용체로 사용한다. 이것은 측정 샘플에 존재하는 용존 산소에 의해 영향을 받을 수 있다. 현재 상업적으로 이용 가능한 CGM 장치는 모두 글루코오스 옥시다제(GOD)에 기초하고 있는 것으로 알려져 있다. 아스페르길루스 니이거와 같이 아스페르길루스 속에 속하는 미생물의 GOD와 같은 특정 GOD는 가혹한 열 조건 하에서 놓여져도 효소 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 1: THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 27, 2003년 7월 4일 발행, pp. 24324-24333, 2003). 이러한 이유로 CGM 시스템은 일반적으로 열안정성 GOD를 채택한다.
특허 문헌 1(WO 2015/099112, US20160319246)은 뮤코르속에 속하는 미생물의 GDH를 기재하고 있다.
비특허 문헌 2(Satake, et al., J Biosci Bioeng. 2015년 11월 120(5:498-503)는 뮤코르 프라이니(Mucor prainii)에서 유래한 FAD-GDH를 기재하고 있다. 이 문헌은 "글루코오스 옥시다제(GOD) (EC 1.1.3.4)가 높은 열 안정성 및 높은 글루코오스 선택성에 기반한 간접 전류측정 글루코오스 센서(mediated amperometric glucose sensor)로서 널리 사용되어 왔다"고 기술하고 있다.
특허 문헌 2(WO 2002/036779, US 2004/0023330)는 브르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)에서 유래된 GDH를 기재하고 있다. 개시된 GDH는 막 결합 단백질로 시토크롬 c 도메인을 포함한다. B. cepacia GDH의 아미노산 서열은 뮤코르속에 속하는 미생물 유래의 FAD-의존형 GDH(여기서 FAD-GDH라고도 함)와 유사하지 않다.
특허 문헌 3(WO2013/051682)은 뮤코르 길리어몬디(Mucor Guilliermondiii) 유래의 GDH(MgGDH)를 기재하고 있다.
특허 문헌 4(일본 공개특허공보 제2013-116102호)는 뮤코르 히말리스(Mucor hiemalis) 유래의 GDH(MhGDH)를 기재하고 있다.
특허 문헌 5(WO 2013/022074, US20140154777)는 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex) 유래의 CsGDH와 서시넬라 종 유래의 CRGDH를 기재하고 있다.
특허 문헌 6(일본 공개특허공보 제2013-176363호)은 뮤코르(Mucor) RD056860 유래의 MdrGDH를 기재하고 있다.
특허 문헌 7(일본 공개특허공보 제2013-176364호)은 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus) 유래의 MsGDH를 기재하고 있다.
특허 문헌 8(WO 2012/169512, US20140287445)은 뮤코르 프라이니(M. prainii) 유래의 GDH를 기재하고 있다.
특허 문헌 9(WO 2015/129475, EP3112461)는 뮤코르 프라이니(M. prainii) 유래의 GDH를 기재하고 있다.
특허 문헌 10(일본 공개특허공보 제2014-207911호)은 PQQ 의존형 GDH를 기재하였다. PQQ 의존형 GDH는 말토오스에 대한 활성을 갖는 것으로 보고되었다.
PQQ 의존형 GDH에 기반한 글루코오스 센서를 실행하는 것의 어려움이 보고되어 왔다. 한 가지 이유는 상대적으로 낮은 기질 특이성 즉, PQQ에 의존형 GDH는 글루코오스 외에 말토오스에 반응하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 비특허 문헌 3 참조.
특허문헌 1: WO 2015/099112 (US20160319246) 특허문헌 2: WO 2002/036779 (US 2004/0023330) 특허문헌 3: WO 2013/051682 특허문헌 4: 일본 공개 특허공보 제2013-116102호 (미국 특허번호 제9,260,699호) 특허문헌 5: WO 2013/022074 (US20140154777) 특허문헌 6: 일본 공개 특허공보 제2013-176363호 특허문헌 7: 일본 공개 특허공보 제2013-176364호 특허문헌 8: WO 2012/169512 (US20140287445) 특허문헌 9: WO 2015/129475 (EP3112461) 특허문헌 10: 일본 공개 특허공보 제2014-207911호
비특허문헌 1: THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24324-24333, 2003 비특허문헌 2:Satake, et al, J Biosci Bioeng. 2015 Nov;120(5):498-503 비특허문헌 3: Review of Adverse Events Associated With False Glucose Readings Measured by GDH-PQQ-Based Glucose Test Strips in the Presence of Interfering Sugars", Diabetes Care. 2010 Apr; 33(4): 728-729
개선된 CGM 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
이론적으로 연속적인 글루코오스 모니터링은 글루코오스 탈수소효소(GDH) 또는 글루코오스 옥시다제(GOD)를 포함하는 글루코오스 센서로 수행할 수 있다. 글루코오스 탈수소효소는 글루코오스를 탈수소시킬 때 전자 수용체를 사용한다. 이는 용존 산소에 의해 측정이 영향을 받지 않을 수 있다는 점에서 유리할 수 있다.
그러나 본 발명가가 아는 한 현재 이용가능한 상업용 CGM 장치는 모두 글루코오스 옥시다제(GOD)를 기반으로 한다. 이는 GOD의 열 안정성에 기인한다고 생각된다. 아스페르길루스 니이거와 같이 아스페르길루스 속에 속하는 미생물 유래의 GOD와 같은 특정 GOD는 가혹한 열 조건하에 짧은 시간 동안 놓여져 있어도 효소 활성을 유지하는 것으로 널리 알려져 있다(비특허 문헌 1 참조). GOD는 특히 글루코오스 센서에 적합한 효소의 경우 GDH보다 가혹한 열 조건에 놓였을 때 높은 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다. 이는 GOD가 GDH보다 더 안정적이라는 것을 가리킨다.
그러나 본 발명가는 놀랍게도 FAD 의존형 특정 글루코오스 탈수소효소가 동일한 조건에서 상업적으로 이용 가능한 GOD에 비해 오랜 시간 동안 주위 온도에서 더 높은 효소 활성을 유지한다는 것을 발견했다. 이는 특히 상업적으로 이용 가능한 GOD가 고온에 놓였을 때, 예를 들어 가열 처리를 포함하는 가속 시험 하에서 FAD-의존형 글루코오스 탈수소효소에 비하여 높은 효소 활성을 유지한다는 사실의 측면에서 특히 놀라운 것이었다.
이러한 발견의 관점에서 FAD-GDH를 사용하는 연속 글루코오스 모니터링(CGM)의 방법이 제공된다. FAD-GDH는 일정 기간 동안 초기 활성을 유지할 수 있다. 또한 여기서는 FAD-GDH를 포함하는 CGM 장치뿐만 아니라 CGM에서 사용하기에 적합한 FAD-GDH를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
하기와 같은 예시적 구체예가 제공된다:
구체예 1.
(a) 약 37-40℃에서 유지할 경우 1주일 동안 초기 활성의 약 60% 이상을 유지,
(b) 약 37-40℃에서 유지할 경우 2주일 동안 초기 활성의 약 40% 이상을 유지, 또는
(c) 약 37-40℃에서 유지할 경우 3주일 동안 초기 활성의 약 30% 이상을 유지할 수 있는 GDH를 이용하는 것을 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법으로서, 여기서 상기 GDH는 FAD 의존형 GDH이고 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아니다.
구체예 2.
구체예 1에 있어서, 상기 GDH가 7.4의 pH에서 유지될 경우 구체예 1에서의 (a) 내지 (c)로 특정되는 활성을 유지할 수 있는 것인 방법.
구체예 3.
구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 연속적인 글루코오스 모니터링이 재보정(re-calibration)없이 수행되는 것인 방법.
구체예 4.
연속적인 글루코오스 모니터링에 사용되는 GDH를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법:
(i) 후보 GDH를 준비하는 단계,
(ii) 미리 결정된 주기 동안 상기 후보 GDH를 약 30-40℃에서 유지하는 단계,
(iii) 단계 (ii) 후에 상기 GDH의 잔류 활성을 결정하는 단계,
(iv) 단계 (iii)에서 결정된 잔류 활성을 상기 후보 GDH의 초기 활성과 비교하는 단계,
여기서 잔류 GDH 활성은
(a) 약 30-40℃에서 1주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 60% 이상,
(b) 약 30-40℃에서 2주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 40% 이상, 또는
(c) 약 30-40℃에서 3주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 30% 이상이며, 상기 후보 GDH는 1 내지 3주일 동안 연속적인 글루코오스 모니터링에서 사용될 전위(potential)를 갖는 GDH로서 선택된다.
구체예 5.
구체예 4에 있어서, 단계 (ii)는 약 50-60℃에서 약 5-30분간 가열처리를 포함하는 가속화된 가열처리 단계로 대체되지 않는 것인 방법.
구체예 6.
(a) 약 37-40℃에서 유지할 경우 1주일 동안 초기 활성의 약 60% 이상을 유지,
(b) 약 37-40℃에서 유지할 경우 2주일 동안 초기 활성의 약 40% 이상을 유지, 또는
(c) 약 37-40℃에서 유지할 경우 3주일 동안 초기 활성의 약 30% 이상을 유지할 수 있는 GDH를 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링 장치로서, 여기서 상기 GDH는 FAD 의존형 GDH이고 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아니다.
구체예 7.
구체예 6에 있어서, 상기 GDH가 7.4의 pH에서 유지될 경우 구체예 6에서의 (a) 내지 (c)로 특정되는 활성을 유지할 수 있는 장치.
구체예 8.
구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH는 다음과 같은 특성을 갖는 방법:
(1) 구체예 1의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에서 규정된 활성;
(2) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 말토오스에 대한 반응성이 2%이하;
(3) 최적 활성 pH: 6.5 내지 7.5; 및
(4) SDS-PAGE로 측정시 약 65 내지 약 81 kDa의 분자량인 것인 방법.
구체예 9.
구체예 1 내지 구체예 5 및 구체예 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH가 뮤코르, 압시디아, 악티노트누코르, 서시넬라, 파라시텔라 또는 리조푸스 속에 속하는 미생물에서 유래된 것인 방법.
구체예 10.
구체예 9에 있어서, 상기 GDH는 뮤코르 푸라이니(Mucor prainii), 뮤코르 서시넬로이드(Mucor circinelloides), 뮤코르 서시넬로이드 f. 서시넬로이드(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 디모르포스포러스(Mucor dimorphosporus), 뮤코르 RD056860(Mucor RD056860), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora), 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans), 서시넬라 미노르(Circinella minor), 서시넬라 무코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella rigida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex), 서시넬라 우벨라타(Circinella umbellata), 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica) 또는 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)에서 유래된 GDH인 것인 방법.
구체예 11.
구체예 6 또는 구체예 7에 있어서, 상기 GDH는 다음과 같은 특성을 갖는 장치:
(1) 구체예 6의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에서 규정된 활성;
(2) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 말토오스에 대한 반응성이 2%이하;
(3) 최적 활성 pH: 6.5 내지 7.5; 및
(4) SDS-PAGE로 측정시 약 65 내지 약 81 kDa의 분자량.
구체예 12.
구체예 6, 구체예 7 또는 구체예 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH가 뮤코르, 압시디아, 악티노트누코르, 서시넬라, 파라시텔라 또는 리조푸스 속에 속하는 미생물에서 유래된 것인 장치.
구체예 13.
구체예 12에 있어서, 상기 GDH는 뮤코르 푸라이니(Mucor prainii), 뮤코르 서시넬로이드(Mucor circinelloides), 뮤코르 서시넬로이드 f. 서시넬로이드(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 디모르포스포러스(Mucor dimorphosporus), 뮤코르 RD056860(Mucor RD056860), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora), 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans), 서시넬라 미노르(Circinella minor), 서시넬라 무코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella rigida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex), 서시넬라 우벨라타(Circinella umbellata), 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica) 또는 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)에서 유래된 GDH인 것인 장치.
GOD를 사용하는 재래식 장치에 대한 본 발명의 장점은 GDH가 센서의 수명 동안 그것의 장기간의 안정성으로 인해 핑거스틱 보정을 덜 자주하거나 없이 사용할 수 있다는 것이다. GOD에 기반한 대부분의 시스템은 센서 수명 동안 12시간마다 한 번씩과 같이 특정 기간마다 한 번씩 보정이 필요하다. 그 이유 중 하나는 CGM 장치가 사용되는 온도인 주위 온도(30-40℃)에서 배양하는 동안 GOD 활성이 급격히 감소하기 때문이다. 이와는 대조적으로, GDH는 놀랍게도 1-3주 같은 장기간에 걸쳐 주위 온도(30-40℃)에서 더 높은 안정성(효소 활성)을 유지하고 있으며, 재보정이 없이 또는 재보정을 덜 자주하고 사용할 수 있다는 것을 본 발명가는 밝혀냈다.
도 1은 57℃에서 15분간 가열 처리후 상이한 유형의 GDH 및 GOD의 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 2는 40℃에서 21일까지 유지후 상이한 유형의 GDH 및 GOD의 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 3은 40℃에서 7일까지 유지후 상이한 유형의 GDH 및 GOD의 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 4는 40℃에서 14일까지 유지후 상이한 유형의 GDH의 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 5는 0 내지 4시간에서 PEI 및 PEGDE를 사용하여 GDH-M2 또는 GOD-3가 고정화된 전극에 대한 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 6은 0 내지 4시간에서 PA 및 PEGDE를 사용하여 GDH-M2 또는 GOD-3가 고정화된 전극에 대한 잔류 효소 활성을 나타낸다.
도 7은 GDH-M2의 최적 pH를 나타낸다.
도 8은 GLD3의 최적 pH를 나타낸다.
도 9는 GDH-M2 전극을 사용한 순환전압전류법(cyclic voltammetry)을 나타낸다.
도 10은 응답 전류의 글루코오스 농도 의존성을 나타낸다. 산화 전류값은 0.4V에서 기록되었다.
도 11은 GDH-M2 및 GLD3의 SDS-PAGE를 나타낸다.
1-1. 글루코오스 탈수소효소 활성과 저장 안정성
하나의 구체예에서, 본 발명은 GDH를 사용하는 것을 포함하는 연속 글루코오스 모니터링(CGM) 방법을 제공한다. 이 방법에서는
(a) 약 37-40℃에서 유지할 경우 1주일 동안 초기 활성의 약 60% 이상, 예를 들어 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 예를 들어 약 60-100%, 약 60-99%, 약 70-100%, 75-100%, 또는 80-100%를 유지,
(b) 약 37-40℃에서 유지할 경우 2주일 동안 초기 활성의 약 40% 이상, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 예를 들어 약 40-100%, 약 40-99%, 약 45-100%, 약 50-100%, 약 55-100%, 약 60-100%, 또는 65-100%를 유지, 또는
(c) 약 37-40℃에서 유지할 경우 3주일 동안 초기 활성의 약 30% 이상, 예를 들어 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 예를 들어 약 30-100%, 약 30-99%, 약 40-100%, 45-100%, 50-100%, 55-100%, 또는 60-100%를 유지할 수 있는 GDH가 사용될 수 있다.
위와 같은 GDH 활성을 유지하는 것은 여기에서 "저장 안정성"을 갖는 것으로 언급할 수 있다. 그러나 여기서 "저장"이라는 용어는 편의상 사용되었을 뿐이며, 어떤 제한적인 방법으로 이해하거나 해석해서는 안 된다. 즉 "저장 안정성"이라는 문구는 단지 GDH의 특징을 설명하도록 의도된 것이며, 즉 GDH가 특정 온도에서 특정 기간 동안 활성을 유지하지만, GDH가 물리적으로 저장되거나 보관된다는 것을 의미하는 것을 암시하는 것은 아니다. 위에 설명한 저장 안정성을 갖는 GDH는 전극, 글루코오스 센서 또는 CGM 장치 또는 연속 글루코오스 모니터링을 포함하는 방법에 사용할 수 있다. 하나의 구체예에서 GDH는 FAD-의존형 GDH일 수 있다. 하나의 구체예에서 상기 GDH는 가용성 유형 GDH이거나 가용성 유형 GDH에서 파생된 것일 수 있다. 여기서 "가용성 유형 GDH"라는 문구는 용액에 용해되며 막 결합 단백질(WO 2002/036779, US 2004/0023330에 기재된 B. cepacia GDH같은 것)이 아닌 GDH를 가리킨다. 단, 여기에서 "가용성 유형 GDH"라는 문구는 단지 GDH(또는 GDH의 기원)의 "유형"을 설명할 뿐이며 GDH가 물리적으로 용액속에 있어야 함을 나타내지 않는다는 점에 유의해야 한다. 가용성 유형 GDH는 건조한 상태로 보관하거나 전극에 고정될 수 있다. 그러한 고정된 GDH의 유형은 여기서도 가용성 유형으로 언급될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아니며 시토크롬 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서 상기 GDH는 복합체를 비-공유결합적으로 형성할 수 있는 세 개의 서브유닛으로 구성된 FAD-GDH가 아니다. B. cepacia 유래의 FAD-GDH(WO 2002/036779, US 2004/0023330)는 복합체를 비-공유결합적으로 형성할 수 있는 세 개의 서브유닛으로 구성되며, 이 B. cepacia GDH는 본 발명의 방법과 장치에서 사용되는 GDH에서 제외된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 상기 GDH는 하나 이상의 시토크롬 도메인에 공유적으로 결합될 가능성을 배제하지는 않지만, 하나의 서브유닛으로 구성되어 있다. 또 다른 구체예에서 상기 GDH는 PQQ-의존형 GDH가 아니다. 그러나 또 다른 구체예에서는 상기 GDH는 NAD 의존형 GDH가 아니다. 한 가지 구체예에서는 상기 GDH는 모노머이다. 하나의 구체예에서 상기 GDH는 다이머가 아니다. 하나의 구체예에서 GDH의 저장 안정성은 약 7.0 내지 7.5의 pH, 예컨대 약 pH 7.4에서 평가할 수 있다.
GDH는 약 37-40℃, 예를 들어 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃ 또는 약 40℃의 온도에서 위의 (a) 내지 (c)에서 설명한 활성을 유지할 수 있다.
바람직하게는 가혹한 온도 조건 하에서 상대적으로 안정적인 GDH를 사용할 수 있다. 하나의 구체예에서는 57℃, pH 7.0에서 15분간 가열처리를 한 후 초기 GDH 활성의 약 20%, 예를 들어 약 20-100%를 유지하는 GDH를 사용할 수 있다.
하나의 구체예에서 상기 GDH는 뮤코르, 압시디아, 악티노트누코르 및 서시넬라 속에 속하는 미생물에서 유래된 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서 상기 GDH는 뮤코르 푸라이니(Mucor prainii), 뮤코르 서시넬로이드(Mucor circinelloides), 뮤코르 서시넬로이드 f. 서시넬로이드(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 디모르포스포러스(Mucor dimorphosporus), 뮤코르 RD056860(Mucor RD056860), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora), 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans), 서시넬라 미노르(Circinella minor), 서시넬라 무코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella rigida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex), 서시넬라 우벨라타(Circinella umbellata), 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica) 또는 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)에서 유래된 GDH일 수 있다. 또 다른 구체예에서 상기 GDH는 그들의 특성을 변환시킨 돌연변이를 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 CGM 방법에 사용되는 GDH는 재래의 CGM 시스템에서 현재 사용되고 있는 알려진 GOD에 비해 1-3주 등 장기간에 걸쳐 더 높은 효소 활성을 유지할 수 있다. GDH 또는 GOD 효소의 잔류 활성 비율은 여기에서 다음과 같이 정의된다:
잔류 활성 비율 = (약 37-40℃에서 3주 후 잔류 활성 A)/(초기활성 B) x 100
동일한 효소의 잔류 활성과 초기 활성은 동일한 어세이 조건에서 측정되어야 한다. 하나의 구체예에서 잔류 활성과 초기 활성은 pH 6.9 내지 7.4, 예를 들어 pH 7.0과 같이 CGM에 적합한 pH에서 측정할 수 있다.
CGM 방법의 pH는 약 6.9 내지 7.4, 예를 들어 7.0으로 조정할 수 있다. 이는 혈액의 pH가 약 7.0이기 때문이다. pH는 PBS 또는 재래의 버퍼와 같은 인산염 버퍼를 사용하여 조정할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명에 사용되는 GDH의 잔류 활성 비율은 CGM 시스템에서 사용되는 공지된 GOD 효소보다 바람직하게 더 높다. 그러한 알려진 GOD 효소는 아스페르길루스 니이거 또는 아스페르길루스 sp.과 같은 아스페르길루스 속에 속하는 미생물 유래의 GOD일 수 있다. 이러한 알려진 GOD 효소는 토요보 GOD(카탈로그 번호 GLO-201, 아스페르길루스 sp.유래), 와코순약 GOD(카탈로그 번호 074-02401, 아스페르길루스 니이거 유래), 시그마-알드리치 GOD 유형 VII(아스페르길루스 니이거 유래의 GOD) 및 시그마-알드리치 GOD 유형 X-S(아스페르길루스 니이거 유래의 GOD)로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다.
하나의 구체예에서는 재-보정을 하거나 하지 않고 연속적인 글루코오스 모니터링을 수행할 수 있다. 구체예에서는 드물게 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 마다 한 번씩 재-보정을 하여 연속적인 글루코오스 모니터링을 수행할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 연속적인 글루코오스 모니터링에 사용할 수 있는 GDH를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(i) 후보 GDH를 준비하는 단계,
(ii) 미리 결정된 주기 동안 상기 후보 GDH를 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃에서 유지하는 단계,
(iii) 단계 (ii) 후에 상기 GDH의 잔류 활성을 결정하는 단계,
(iv) 단계 (iii)에서 결정된 잔류 활성을 상기 후보 GDH의 초기 활성과 비교하는 단계.
상기 잔류 GDH 활성은
(a) 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃에서 1주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성에 비교하여 약 60% 이상, 예를 들어 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 예를 들어 약 60-100%, 약 60-99%, 약 70-100%, 75-100%, 또는 80-100%,
(b) 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃에서 2주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성에 비교하여 약 40% 이상, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 예를 들어 약 40-100%, 약 40-99%, 약 45-100%, 약 50-100%, 약 55-100%, 약 60-100%, 또는 약 65-100%, 또는
(c) 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃에서 3주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성에 비교하여 약 30% 이상, 예를 들어 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 예를 들어 약 30-100%, 약 30-99%, 약 40-100%, 45-100%, 50-100%, 55-100%, 또는 약 60-100%이고, 이후 상기 후보 GDH는 연속적인 글루코오스 모니터링에 적합한 GDH로서 또는 CGM에서, 예를 들어 1 내지 3주일 동안 CGM에서 사용될 전위를 갖는 GDH로서 선택될 수 있다.
상기 단계 (ii)에서, 후보 GDH는 스크리닝을 수행할 때 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 12시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 1, 2, 또는 3주 동안 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃로 유지될 수 있다. CGM은 전형적으로 약 30-40℃의 온도에서 수행되는데, 부분적으로 평균 체온이 약 37℃이기 때문이다. 따라서 GDH의 스크리닝은 약 30-40℃, 예를 들어 약 37-40℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 39℃ 또는 40℃에서 수행할 수 있다.
후보 GDH는 뮤코르 속에 속하는 미생물, 혹의 그의 파생체, 변종 혹은 돌연변이 유래의 GDH일 수 있다. 후보 GDH는 말토오스, D-갈락토오스 및/또는 D-자일로오스에 대한 낮은 특이성을 갖는 GDH일 수 있다. 후보 GDH는 열안정성 GDH(열적으로 안정한 GDH)일 수 있지만, 가속 시험 조건하에서 CGM 장치에 사용되는 GOD보다 열안정성이 더 높을 필요는 없다. 하나의 구체예에서 단계(i)의 후보 GDH는 57℃, pH 7.0에서 15분간 가열처리를 한 후 그 초기 GDH 활성의 약 20% 이상, 예를 들어 약 20-100%를 유지하는 것이 바람직하다.
CGM에 사용될 수 있는 전위를 가진 GDH를 스크리닝하기 위해 1-3주와 같이 CGM 의 전체 수명 동안 안정성 시험을 수행하는 대신 후보 GDH 효소에 대해 가속화된 가열처리 단계를 수행하는 것이 재래의 통념에 따라 실현 가능한 것으로 보일 수 있다. 그러나, 본 발명가는 놀랍게도 유사한 조건하에서 상업적으로 이용 가능한 GOD에 비교하여 다수의 GDH가 장기간에 걸쳐 주변 온도에서 더 높은 안정성을 유지한다는 것을 발견했다. 이는 알려진 GOD가 57℃에서 가열 처리를 사용하는 가속화 시험에서 GDH보다 더 높은 활성을 유지한다는 사실의 관점에서 특히 놀라웠다. 따라서 본 발명의 하나의 구체예에서는 약 5-30분에서 약 50-60℃의 온도에서 가열 처리와 같은 가열 처리 단계를 포함하는 가속화 시험으로 위의 단계(ii)를 대체하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은
(a) 약 37-40℃에서 1주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성의 약 60% 이상, 예를 들어 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 예를 들어 약 60-100%, 약 60-99%, 약 70-100%, 75-100%, 또는 80-100%를 유지,
(b) 약 37-40℃에서 2주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성의 약 40% 이상, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 예를 들어 약 40-100%, 약 40-99%, 약 45-100%, 약 50-100%, 약 55-100%, 약 60-100%, 또는 65-100%를 유지, 또는
(c) 약 37-40℃에서 3주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성의 약 30% 이상, 예를 들어 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 예를 들어 약 30-100%, 약 30-99%, 약 40-100%, 45-100%, 50-100%, 55-100%, 또는 약 60-100%를 유지할 수 있는 GDH를 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링 장치를 제공하는데, 여기서 상기 GDH는 FAD 의존형 GDH이고 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아니다. 하나의 구체예에서, 상기 GDH는 PQQ-의존형 GDH가 아니다.
특정 기간에 걸친 글루코오스 모니터링 측면에서, 연속 글루코오스 모니터링(CGM)을 플래시 글루코오스 모니터링(Flash Glucose Monitoring, FGM)이라고도 칭할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 구체예와 관련하여 사용되는 "연속 글루코오스 모니터링"이라는 문구는 명확하게 지시되지 않는 한 플래시 글루코오스 모니터링의 구체예를 포용한다.
하나의 구체예에서 상기 장치는 57℃, pH 7.0에서 15분간 가열처리를 한 후 바람직하게는 초기 GDH 활성의 약 20%, 예를 들어 약 20-100%를 유지하는 GDH를 포함한다.
하나의 구체예에서 CGM 장치는 피하에 배치될 글루코오스 센서를 포함할 수 있다. 상기 센서는 하루에서 약 3주 동안 착용할 수 있다. 센서 부분은 일회용일 수 있다. 센서는 효소와 조직이 직접 접촉하는 것을 방지하기 위해 센서 막층을 포함할 수 있다. 센서는 어플리케이터를 사용하여 복부에 삽입하도록 설계될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 송신기(transmitter) 및 센서로부터 송신기로의 링크를 더 포함하는 CGM 장치를 제공한다. 송신기는 임플란트할 필요가 없다. 바람직하게는 송신기는 무선 수신기와 통신할 수 있다. CGM 장치는 계속해서 글루코오스 수준을 디스플레이할 수 있는 전자 수신기를 더 포함할 수 있다. CGM 장치는 보정을 위한 핑거스틱(핑거 프리크)을 선택적으로 포함할 수 있다. CGM 장치는 사용 설명서를 선택적으로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서 CGM 장치는 스스로 동력이 공급(SPGS)될 수 있으며 기준전극을 생략할 수 있다.
FAD-GDH는 글루코노-δ-락톤을 형성하기 위해 전자 수용체가 존재하는 상태에서 글루코오스의 수산기가 산화되는 반응을 촉매한다.
이 반응은 예를 들어 페나진 메토설페이트(PMS)와 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 전자 수용체로 이용한 하기 시스템을 사용하여 FAD-GDH의 활성을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
D-글루코오스 + PMS (산화된 형태) →D-글루코노-δ-락톤 + PMS (환원된 형태) (FAD-GDH에 의해 촉매) (반응 1)
PMS(환원된 형태) + DCIP(산화된 형태) → PMS(산화된 형태) + DCIP(환원된 형태) (반응 2)
반응 1에서는 글루코오스가 산화되고 환원된 형태인 PMS가 생산된다. 후속 반응 2에서는 환원된 형태의 PMS가 산화되고 DCIP가 환원된다. 산화된 형태 DCIP의 감소 정도를 검출함으로써 600 nm의 파장에서 광 흡수성의 변화에 의해 GDH 효소 활성을 결정할 수 있다.
FAD-GDH의 활성은 다음과 같이 측정할 수 있다. 100 mM 인산염 버퍼 용액(pH 7.0) 2.05mL, 1M D-글루코오스 용액 0.6mL 및 2 mM DCIP 용액 0.15 mL를 혼합한 후 37℃에서 5분간 인큐베이션한다. 그런 다음 15 mM PMS 용액 0.1 mL와 효소 샘플용액 0.1 mL를 첨가하여 반응을 개시한다. 흡광도는 초기 조건에서 측정하여 시간이 경과함에 따라 분당 600nm(ΔA600)의 흡광도 감소가 결정되고, 그에 따라 GDH 활성을 계산할 수 있다. GDH 활성의 1 U는 37℃에서 200 mM의 농도로 D-글루코오스가 존재할 때 1분 동안 DCIP 1μmol을 감소시키는 효소의 양으로 정의할 수 있다..
Figure pct00001
식에서 3.0 값은 반응 시약과 효소 시약(mL)의 양을 나타내며, 16.3은 밀리몰 분자 소멸 계수(cm2/μmol), 0.1은 효소 용액양(mL), 1.0은 세포 길이(cm), Δ600blank는 효소용액을 첨가하는 대신 반응을 개시하기 위해 버퍼만 첨가되어 600nm에서의 분당 흡광도 감소량을 나타내며, df는 희석계수를 나타낸다.
본 방법에 사용되는 GDH는 위에서 설명한 바와 같이 글루코오스 탈수소효소 활성과 저장 안정성을 가질 수 있다. 그것의 균등물도 또한 사용할 수 있다.
1-2. 기질 특이성
본 방법에 사용되는 GDH는 높은 기질 특이성을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서 GDH는 글루코오스(D-글루코오스)에 대한 반응성에 비해 적어도 말토오스에 대한 반응성이 낮을 수 있다. 또 다른 구체예에서 GDH는 글루코오스(D-글루코오스)에 대한 반응성과 비교하여 최소한 말토오스와 자일로스에 대한 반응성이 낮을 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 같은 농도에서 글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 말토오스에 대한 반응성을 예를 들어 2% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 더 바람직하게는 0.7% 이하, 더욱 바람직하게는 0.4% 이하로 갖는다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 같은 농도에서 글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 자일로스에 대한 반응성을 예를 들어 3% 이하, 더 바람직하게는 2% 이하, 더 바람직하게는 1% 이하, 더욱 바람직하게는 0.6% 이하로 갖는다. 또 다른 구체예에서 GDH는 글루코오스(D-글루코오스)에 대한 반응성에 비해 적어도 갈락토스에 대한 반응성이 낮을 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 같은 농도에서 글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 갈락토스에 대한 반응성을 예를 들어 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1 이하로 가질 수 있다.
각 당에 대해 본 방법에서 사용되는 GDH의 반응성은 여기에 설명된 글루코오스 탈수소효소의 활성을 측정하는 방법에서 글루코오스를 자일로오스 또는 말토오스와 같은 다른 당으로 대체하고 측정된 활성을 글루코오스에서 얻은 활성과 비교함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 각 당의 농도는 200 mM으로 설정할 수 있다. 또한 글루코오스에 대한 반응성를 측정할 때 반응액의 최종 효소 농도를 1.4μg/mL로 설정할 수 있으며, 자일로오스 또는 말토오스에 대한 반응성를 측정할 때 반응 액체의 최종 효소 농도를 28μg/mL로 설정할 수 있다. 예를 들어, 샘플이 자일로오스 또는 말토오스와 같이 불순물을 포함하고 있는 경우에도 매우 높은 기질 특이성을 갖는 현재의 방법에 사용되는 GDH는 샘플의 글루코오스 농도를 정확하게 측정하기 위한 효소로서 사용될 수 있다.
1-3. 최적 pH
본 방법에 사용되는 GDH는 광범위한 최적 pH 활성 범위를 가질 수 있다. CGM은 혈액과 간질액상에서 수행되기 때문에 상기 방법에서 사용되는 GDH를 위해서는중성 pH(pH 7.0) 주위의 최적 pH를 갖는 것이 바람직하다. 하나의 구체예에서 본 방법에 사용되는 GDH는 예를 들어, 5.0 내지 7.5, 바람직하게는 5.5에서 7.5까지, 더 바람직하게는 6.0 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH에서 최적의 pH 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 예를 들어, 5.0 내지 8, 바람직하게는 5.5 내지 7.5, 바람직하게는 6.0에서 7.5까지, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH에서 최적의 pH 활성을 가질 수 있다. 그러한 GDH는 실시예에서 나타낸다. 하나의 구체예에서 최적 pH는 최고 활성(100%)에 상대적으로 70% 이상의 상대 활성으로 간주될 수 있다. 또 다른 구체예에서 최적 pH는 최고 활성(100%)에 비해 75% 이상, 예를 들어 80% 이상의 상대 활성으로 간주될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 6.0 내지 7.5의 최적 pH를 가지며, 여기서 최적 활성은 최고 활성(100%)에 상대적으로 70% 이상이다.
흡광도는 개시 조건에서 시간 경과에 따라 측정되는데 분당 520nm(ΔA520)에서의 흡광도 감소를 결정하고 그에 따라 GDH 활성을 계산할 수 있다. 6.8은 밀리몰 분자 소멸 계수(cm2/μmol)를 나타낸다. 600nm에서 DCIP의 몰 흡착계수는 pH에 따라 큰 폭으로 변하는 것으로 알려져 있다. 520nm에서 DCIP의 몰 흡착계수는 pH에 관계없이 상당히 일정하다고 알려져 있다. 이것을 고려하여 520 nm에서 측정할 수 있다.
1-4. 최적 활성 온도
본 방법에 사용되는 GDH는 예를 들어 30 내지 50℃, 30 내지 55℃, 35 내지 50℃, 35 내지 55℃, 35 내지 60℃ 또는 30 내지 60℃의 넓은 범위에 걸쳐서 최적 활성 온도를 가질 수 있다. 여기서 30 내지 60℃의 최적 활성 온도는 일반적으로 온도가 약 30 내지 60℃의 범위 내에 있고 활성이 최적이되 그 범위가 어느 정도 허용 가능한 허용치를 더 포함한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서는 반응액의 최종 효소 농도(1.4μg/mL)에서 인산칼륨 버퍼 용액(pH 7.0) 내에서의 효소 활성을 측정하여 최적의 활성 온도를 계산할 수 있다.
1-5. pH 안정성
본 방법에 사용되는 GDH는 광범위한 pH에 걸쳐 높은 pH 안정성을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 적어도 5.0 내지 7.5의 전체 pH 범위에서 안정적이다. 본 명세서에서는 특정 pH 조건하에서 25℃에서 16시간 동안 처리된 효소 100 U/mL가 처리 전 동일 효소의 초기 효소 활성(100%)과 비교하여 75% 이상의 잔류 효소 활성을 갖고 있는 경우, 그러한 pH 조건 하에서 효소가 안정적이라고 본다.
1-6. 온도 안정성
본 방법에 사용되는 GDH는 온도 안정성이 있을 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 50 ℃ 이하(즉, 0 내지 50 ℃ 온도 범위 이내), 51 ℃ 이하, 52 ℃ 이하, 53 ℃ 이하, 54 ℃ 이하, 55 ℃ 이하, 56 ℃ 이하, 또는 57 ℃ 이하에서 15 분 동안 안정적이다. 현재 규격에서는 특정 온도 조건에서 적절한 버퍼 용액(예: 아세트산 칼륨 버퍼(pH 5.0)에서 15분 동안 처리된 효소 10 U/mL가 열처리 전 동일 효소의 초기 효소 활성(100%)에 비해 20% 이상의 효소 활성이 남아 있을 때 그 효소는 그러한 온도 조건 하에서 안정적이라고 간주된다.
본 방법에 사용되는 GDH는 위에서 설명한 효소 특성 중 적어도 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 모두를 가질 수 있다. 본 방법에 사용되는 GDH는 위에서 설명한 특성의 임의의 조합을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH가 1-1 항목에 기술된 특성을 가질 수 있으며, 나아가 상기 항목 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 및 1-6에서 기술된 특성으로 구성된 군에서 적어도 하나의 특성을 더 가질 수 있다.
1-7. 분자량
하나의 구체예에서, 본 방법에서 사용되는 GDH를 구성하는 폴리펩티드 모이어티는 SDS-PAGE에서 측정한 대로 약 65 내지 81 kDa, 약 65 내지 80 kDa, 약 65 내지 75 kDa, 약 65 내지 70 kDa 또는 약 70 kDa의 분자량을 가질 수 있다. "SDS-PAGE에서 측정한 대로 약 70 kDa"라는 문구는 폴리펩티드의 분자량이 SDS-PAGE로 측정될 때 개별 숙련자가 70 kDa의 위치에 밴드가 존재한다고 일반적으로 판단하는 범위를 포함한다. 숙련된 기술자는 SDS-PAGE 상에 나타나는 밴드가 조건에 따라 기대 값보다 5kD 초과 또는 미만으로 가변적일 수 있다는 점을 안다. "폴리펩티드 모이어티"는 GDH의 폴리펩티드 모이어티를 말하며, 부착된 당 쇄를 포함하지 않는다.
하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH를 구성하는 폴리펩티드 모이어티는 이론적 분자량이 아미노산 서열에서 추론된 대로 약 65 내지 80 kDa, 약 65 내지 75 kDa, 약 65 내지 70 kDa, 약 69 내지 70 kDa 또는 약 70 kDa일 수 있다. "아미노산 서열에서 추론된 대로 약 70 kDa의 이론적 분자량"이라는 문구는 아미노산 서열에서 계산된 GDH의 분자량을 가리킨다. 이것은 부착된 당 쇄를 포함하지 않는다.
특정 미생물을 사용하여 본 방법에 사용되는 GDH를 생성할 때 GDH는 글리코실화된 형태로 발현될 수 있다. 하나의 구체예에서, GDH의 글리코실화 형태와 관련하여 당 쇄를 제거하여 폴리펩티드 모이에티를 제공하기 위해 열 처리 또는 탈글리코실화(deglycosylating) 처리를 수행할 수 있다. 탈글리코실화는 EndoH 엔도글리코시다제와 같은 글리코히드롤라제를 사용하여 수행할 수 있다. 특정 다른 미생물을 사용하여 본 방법에 사용되는 GDH를 생산할 때 그 GDH는 비글리코실화된 형태로 발현될 수 있다. 그러한 형태의 경우, 발현된 GDH는 폴리펩티드 모이에티이다.
GDH의 글리코실화 형태로부터 당 쇄를 제거하는 방법은 여러 가지가 알려져 있다. 한 가지 예로는 100 ℃에서 10분간 열처리를 하여 글리코실화 GDH를 변성(denature)시킨 다음 37 ℃에서 14 시간 동안 엔도글리코다제 Endo H로 처리하는 것일 수 있다. 한 가지 예로는 37℃에서 24시간 동안 엔도글리코다제 Endo H로 처리하여 글리코실화 GDH를 변성시키는 것일 수 있다.
본 방법에 사용되는 GDH가 부착된 당 쇄를 갖는 경우, 글루코오스 탈수소효소 활성, 기질 특이성, 특이 활성 등에 악영향을 미치지 않는 한 그 분자량은 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 방법에 사용되는 GDH가 부착된 당 쇄를 갖는 경우, 그 분자량은 SDS-PAGE로 측정할 때 80 내지 120 kDa가 될 수 있다. 본 방법에 사용되는 GDH는 글리코실화된 형태일 수도 있고 아닐 수도 있다. SDS-PAGE에 의한 분자량 측정은 상업적으로 이용 가능한 분자량 마커를 사용하여 재래식 기법과 장치를 사용하여 수행할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 방법에 사용되는 GDH는 1-1 항목에서 기술된 특성을 가질 수 있으며, 위의 1-2 내지 1-7 항목에서 기술된 특성으로 구성된 군에서 적어도 하나의 특성을 더 가질 수 있다.
1-8. 기원(origin)
본 방법에 사용되는 GDH의 기원은 GDH가 위에서 설명한 특성을 가지고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 방법에 사용되는 GDH는 예를 들어, 뮤에로마이에오티나(Mueoromyeotina) 아문의 구성원, 뮤코로마이세테스(Mucoromycetes) 강의 구성원, 뮤코랄레스(Mucorales) 목의 구성원, 뮤코라세아(Mucoraceae) 과의 구성원에 속하는 미생물에서 유래할 수 있다. 구체적인 예로는 뮤코르종, 압시디아종, 악티노트누코르종, 서시넬라종을 포함한다. 뮤코르 종의 예로는 뮤코르 프라니이(Mucor prainii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 서키넬리오이데스 f. 시리넬로이데스(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 히메말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 섭틸리시무스(Mucor subtilissimus) 및 뮤코르 디모르포스포로스(Mucor dimorphosporous) 등을 포함한다. 압시디아 종의 예로는 압시디아 실로스포라(Absidia cylrospora)와 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora)를 포함한다. 악티노뮤코르 종의 예로는 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans)를 포함한다. 서시넬라(Circineella) 종의 예로는 서시넬라 미노리데(Circineella minoride), 서시넬라 뮤코리데(Circineella mucoride), 서시넬라 무스카에(Circineella muscae), 서시넬라 리비다(Circineella libida), 서시넬라 심플렉스(Circineella simplex) 및 서시넬라 움벨라타(Circineella umbellata)를 포함한다. 추가적인 예로는 WO2010/140431, US 2011/0318810에 기재된 것을 포함한다. 추가적인 예로는 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica)와 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)를 포함한다.
다른 기원은 아르트리니움(Arthrinium) 속과 아피오스포라(Apiospora) 속일 수 있다. 아르트리니움 속의 예로는 아르트리니움 자포니쿰(Arthrinium japonicum), 아르트리니움 파에오스페르뭄(Arthrinium phaeospermum), 아르트리니움 테르미날리스(Arthrinium terminalis), 아르트리니움 사카리콜라(Arthrinium saccharicola), 아르트리니움 사카리(Arthrinium sacchari), 아르트리니움 세렌스(Arthrinium serenense), 아르트리니움 아룬디니스(Arthrinium arundinis), 아르트리니움 유파우비(Arthrinium euphaubie)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아피오스포라 속의 예로는 아피오스포라 몬테그네이(Apiospora montagnei), 아피오스포라 세토사(Apiospora setosa), 아피오스포라 틴티나불라(Apiospora tintinnabula)와 아르트리니움 사카리(Arthriniumsacchari)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아르트리니움 속과 아피오스포라 속의 미생물은 그 전체가 본 문서에 통합된 미국 특허 번호 9,796,963을 참조한다.
다른 기원에는 메타히지움(Metarhizium) 속, 예를 들어 메타히지움 종, 예를 들어 메타히지움 속F2114 (HyphaGenesis Inc.) (그 전체가 여기에 통합된 일본 특허출원번호 제2016-116488호 참조)의 구성원; 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 예를 들어 아스페르길루스 종 RD009469 (그 전체가 여기에 통합된 WO 2015/060150 참조), 아스페르길루스 이주카에(Aspergillus iizukae), 예를 들어 아스페르길루스 이주카에 No.5453주(그 전체가 여기에 통합된 WO 2017/077924 참조), 아스페르길루스 베르시콜로(Aspergillus versicolor), 예를 들어 아스페르길루스 베르시콜로 No.52439주 (그 전체가 여기에 통합된 일본 특허출원공개 제2017-221147호 참조)의 구성원; 아스페르길루스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 예컨대 아스페르길루스 아와모리 No.1731주 (그 전체가 여기에 통합된 일본 특허출원공개 제2017-112860호 참조); 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 예컨대 아스페르길루스 포에티두스 NBRC4312주(NBRC), 아스페르길루스 니이거 CBS 513.88주 (Centraalbureau voor Schimmelcultures: CBS), 아스페르길루스 아와모리 No.1751주, 아스페르길루스 아우레우스(Aspergillus aureus), 예컨대 아스페르길루스 아우레우스 No.2062 주(그 전체가 여기에 통합된 일본 공개특허출원공개 제2017-112858호 참조), 아스페르길루스 비스포루스(Aspergillus bisporus), 예컨대 아스페르길루스 비스포루스 NBRC32017주 (NBRC); 테르모아스쿠스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus), 예를 들어, 테르모아스쿠스 아우란티아쿠스 주 6766, 테르모아스쿠스 아우란티아쿠스 주 9748 (그 전체가 여기에 통합된 일본 특허출원공개 제2015-167506호); 및 탈라로마이세스 에메르소니(Talaromyces emersonii), 예를 들어 탈라로마이세스 에메르소니 31232주 및 9734주, 테르모아스쿠스 크루스타세우스(Thermoascus crustaceus),예를 들어 테르모아스쿠스 크루스타세우스 9129주 및 9816주 그리고 보트리요티니아 푸켈리아나(Botryothinia fuckeliana)(그 전체가 여기에 통합된 WO 2012/0021976 참조)뿐만 아니라 WO 2014/045912 (그 전체가 여기에 통합된 WO 2014/045912 참조)의 표 1에서 개시된 다른 미생물들의 구성원이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
하나의 구체예에서 FAD-GDH는 예를 들어, 특허 문헌 1(2015/099112, US20160319246), 특허 문헌 8(WO2012/169512, US20140287445) 또는 특허 문헌 9(WO2015/129475, EP3112461)에서 기술된 GDH 유전자와 같이 공지된 GDH 유전자를 처음부터 획득하여 수득할 수 있다. 얻은 유전자는 돌연변이일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 돌연변이는 상기 문서에서 기술된 돌연변이나 그에 상응하는 돌연변이와 같은 돌연변이일 수 있다. 하나의 구체예에서, 뮤코르 프라이니(MpGDH, 서열번호 1)는 N66Y/N68G/C88A/Q233R/T387C/E554D/L557V/S559K 돌연변이를 그것에 도입하여 변형될 수 있다.
문헌에 기술된 돌연변이와 같이, 다른 돌연변이도 적용될 수 있다. 아미노산 치환은 본원에서 "aXXXb"라는 약어로 표시할 수 있다(여기서 a는 치환 전의 아미노산이며 XXX는 치환되는 특정 아미노산 서열 내의 위치, b는 치환 후의 아미노산이다). 예를 들어, 서열번호: 1과 관련된 A175C는 서열번호:1의 175 위치에 있는 알라닌이 시스테인으로 대체되는 치환을 나타낸다.
또 다른 구체예에서는 GLD3(후나코시)로 지정된 GDH 또는 그의 균등체를 CGM에 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에서는 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis) GDH에서 파생된 GDH를 CGM에서 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에서는 MpGDH-M2(서열번호: 11)로 지정된 GDH를 CGM에 사용할 수 있다.
표적 아미노산 치환의 도입 방법의 예로는 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법과 지정 위치에 위치-유도(site-directed) 돌연변이를 도입하는 방법이 있다. 무작위 돌연변이 발생 방법의 예로는 에러-용이발생(Error-Prone) PCR법(Techniques, 1, 11-15 (1989)) 및 XL1-레드 수용성 세포(competent cells)를 이용하는 방법을 포함하는데, 이는 플라스미드 복제 중에 오류가 자주 발생하고 세포 증식 중에 변형의 발생을 받기 쉬운 것이다(Stratagene Corp.). 위치-유도 돌연변이 발생 방법의 예로는 표적 효과를 부여할 수 있는 아미노산을 선택하고 상업적으로 이용 가능한 Quick Change Site-Directed Mutagenes Kit (Stratagene Corp.)와 같은 기존의 키트를 사용하여 위치-유도 돌연변이를 도입하는 방법을 포함한다.
FAD-GDH 유전자를 얻기 위해, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience(1989)에서 설명한 것과 같은 기존의 방법을 사용하여 FAD-GDH를 생성할 수 있는 능력을 가진 공지된 미생물 세포나 다양한 다른 세포에서 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 또한, cDNA는 mRNA를 주형으로 사용하여 합성할 수 있다. 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 그렇게 얻은 염색체 DNA 또는 cDNA를 사용하여 제조할 수 있다.
이어서, 높은 기질 특이성을 가진 FAD-GDH를 코딩하는 표적 유전자 단편을 함유하는 DNA가 증폭될 수 있는데, 상기 DNA 단편들은 연결될 수 있으며, 전체 FAD-GDH 유전자를 함유하는 DNA를 수득할 수 있다. DNA 단편들의 연결은 공지된 FAD-GDH의 아미노산 서열 정보를 기반으로 적절한 프로브 DNA를 합성하거나, 프로브 DNA를 사용하여 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리에서 기질 특이성이 높은 FAD-GDH 유전자를 선택하거나, 그 아미노산 염기서열에 기초한 적합한 프라이머 DNA를 준비하고 DNA 단편들을 링크함으로써 5' RACE 또는 3' RACE와 같은 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 출발 물질로 사용할 수 있으며, 돌연변이의 선별은 바람직한 FAD-GDH를 발현하는 클론을 선택함으로써 수행할 수 있다.
돌연변이는 FAD-GDH 유전자나 상기 유전자를 포함하는 세포를 돌연변이제 내지 자외선에 노출시키거나, 돌연변이를 일으키는 유전공학 방법을 수행함으로써 생성할 수 있다.
돌연변이의 예로는 특히 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 히드록실라민, 아질산, 아황산, 하이드라진, 포름산, 및 5-브로모우라실을 포함한다. 자외선으로 조사하는 경우, 그러한 조사는 Chemistry Today, 24-30, Jun. 1989에 기재된 기존의 기법을 사용하여 수행할 수 있다.
위치-특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)의 예로는 쿤켈(Kunkel)법((Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985); Methods Enzymol., 154, 367 (1987)), 엑스타인(Eckstein)법(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985); Nucleic Acids Res., 14, 9679 (1986)), 및 크라머(Kramer)법(Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); Methods Enzymol., 154, 350 (1987); Gene, 37, 73 (1985))을 포함한다. DNA 서열를 형질전환시키기 위해 상업적으로 이용가능한 키트(예를 들어, Transformer Mutagenesis Kit (Clontech Laboratories, Inc.), ExOIII/Mung Bean Deletion Kit (Stratagene Corp.) 또는 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.))를 사용할 수 있다.
또한, FAD-GDH 유전자는 DNA 합성 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 이 유전자는 자연적으로 발생하는 GDH의 유전자 서열을 포함하도록 설계되거나 돌연변이를 가질 수 있다.
GDH 유전자의 DNA 서열은 기존의 시퀀싱 기법을 사용하여 시퀀싱할 수 있으며, 다용도 DNA 분석(Multi-Capillary DNA Analysis) 시스템 CEQ2000 (Beckman Coulter Inc.)과 같은 상업적으로 이용가능한 시스템을 사용할 수 있다.
FAD-GDH는 자연적으로 발생하는 FAD-GDH를 얻거나 알려진 FAD-GDH를 변형하여 수득할 수 있다. FAD-GDH를 포함하는 미생물의 예로는 뮤에로마이에오티나(Mueoromyeotina) 아문의 구성원, 뮤코로마이세테스(Mucoromycetes) 강의 구성원, 뮤코랄레스(Mucorales) 목의 구성원, 뮤코라세아(Mucoraceae) 과의 구성원을 포함한다. 구체적인 예로는 뮤코르(Mucor)종, 압시디아(Absidia)종, 악티노트누코르(Actinotnucor)종, 및 서시넬라종(Circinella)이 있다.
뮤코르 종의 예로는 뮤코르 프라니이(Mucor prainii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 서키넬리오이데스 f. 시리넬로이데스(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비규스(Mucor ambiguus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus) 및 뮤코르 디모르포스포로스(Mucor dimorphosporous)를 포함한다. 압시디아 종의 예로는 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora)와 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora)를 포함한다. 악티노뮤코르 종의 예로는 악티노뮤코르 엘레간스(Apctinomucor elegans)를 포함한다. 서시넬라 종의 예로는 서시넬라 미노르(Circinella minoride), 서시넬라 뮤코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella ligida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex) 및 서시넬라 움벨라타(Circinella umbellata)를 포함한다. 추가적인 예로는 WO2010/140431, US 2011/0318810에 기재된 것을 포함한다. 추가적인 예로는 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica)와 리조푸스 마이크로스포루스(Rhizopus microsporus)를 포함한다. 추가적인 예로는 상기 기재한 것들을 포함한다.
FAD-GDH 유전자는 박테리오파지, 코스미드 또는 플라스미드와 같은 벡터에 통합될 수 있으며, 이것들은 종래의 방법을 사용하여 원핵세포나 진핵세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
원핵형 숙주세포의 예로는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 주 K-12, 에셰리키아 콜라이 BL21(DE3), 에셰리키아 콜라이 JM109, 에셰리키아 콜라이 DH5α, 에셰리키아 콜라이 W3110 또는 에셰리키아 콜라이 C600(Takara Bio Inc.)와 같이 에셰리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물들을 포함한다. 세포는 CaCl2 법 또는 전기천공법을 사용하여 형질전환(transformation)하거나 형질도입(transduction)할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 수용성 세포(ECOS 수용성 에셰리키아 콜라이 BL21(DE3), Nippon Gene Co., Ltd.)를 채용할 수 있다.
진핵 숙주 세포의 예로는 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피키아(Pichia) 속, 및 칸디다(Candida) 속을 포함한다. 마커 유전자는 형질전환된 세포를 식별하는데 사용할 수 있다.
마커 유전자의 예로는 URA3 또는 TRP 1과 같이 숙주의 영양 요구를 보완하는 유전자를 포함한다. 또한 삽입된 유전자는 프로모터 또는 다른 조절 서열(예컨대, 인핸서 서열, 종결자 서열 또는 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 프로모터의 예로는 GAL1 프로모터와 ADH1 프로모터를 포함한다. 효모는 예컨대 아세트산리튬법(Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) 또는 전기천공법(J. Microbiol. Methods, 55, 481-484 (2003))과 같은 종래의 방법을 제한없이 사용하여 형질전환할 수 있다. 대안적으로는, 스페로플라스트법이나 유리 비드법과 같은 방법을 사용할 수 있다.
진핵 숙주 세포의 추가적인 예로는 아스페르길루스(Aspergillus) 종과 트리코더마(Tricoderma) 종과 같은 사상균을 포함한다. 삽입된 유전자는 프로모터, 예를 들어, tef1 프로모터, 및 다른 조절 서열(예컨대, 분비 신호 서열, 인핸서 서열, 종결자 서열 또는 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 또한 삽입된 유전자는 형질전환된 세포를 선택하기 위해 niaD 또는 pyrG와 같은 마커 유전자를 포함할 수도 있다. 또한, 삽입된 유전자는 염색체에 삽입하기 위한 동질성(homologous) 재조합 도메인을 포함할 수 있다. 프로토플라스트 형성 후 폴리에틸렌 글리콜 및 염화칼슘을 사용하는 Unkles et al., (Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)에 기재된 방법과 같은 공지의 방법을 사용하여 사상균을 형질전환할 수 있다.
FAD-GDH는 FAD-GDH를 생산할 수 있는 숙주 세포를 배양하고 FAD-GDH를 배양액으로부터 수집함으로써 생산할 수 있다.
숙주세포를 배양하는 배지의 예로는 하나 이상의 유형의 무기염, 예컨대 염화나트륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화제2철, 황화제2철, 또는 황산망간, 및 하나 이상의 유형의 질소 공급원, 예컨대 효모추출물, 트립톤, 펩톤, 쇠고기 추출물, 옥수수 침지액 또는 콩이나 밀기울 추출물을 포함하는 배지를 포함한다. 상기 배지는 필요한 경우 탄수화물 공급원이나 비타민을 더 포함할 수 있다. 배지의 초기 pH는 6 내지 9의 pH로 조정할 수 있는데 이 범위에 제한되지는 않는다.
배양은 25℃ 또는 37℃와 같이, 10-42℃의 배양 온도에서 1시간 내지 4일 이상 동안 공기 요동 수중 배양(aeration-agitation submerged culturing), 진탕 배양 또는 정적 배양에 의해 수행할 수 있다.
배양 후, FAD-GDH를 배양으로부터 수집할 수 있다. 이것은 종래의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 예로 미생물 세포는 초음파를 이용하여 파쇄하거나 또는 분쇄 또는 마쇄할 수 있고, 효소는 리소자임이나 야탈아제 등의 용해 효소를 이용하여 추출할 수 있으며, 세포에 동요를 일으키거나 세포를 톨루엔에 노출시켜 세포로부터 효소를 방출시킬 수 있다. 그런 다음, 용액을 여과하여 조(crude) FAD-GDH를 수득할 수 있으며, 고형 분획은 원심분리하여 제거할 수 있고, 핵산은 필요한 경우 스트렙토마이신 염산염, 프로토나민 황산염 또는 황산망간으로 제거할 수 있으며, 분리에 황산암모늄, 알코올 또는 아세톤을 사용하여 분획할 수 있으며 침전물을 수집할 수 있다.
조 FAD-GDH 효소는 종래의 수단으로 정제할 수 있다. 정제는 세파덱스(등록 상표), 울트로겔(등록 상표) 또는 바이오겔(등록 상표)과 같은 젤을 사용하는 겔 여과법, 이온 교환 수지를 사용하는 흡착 용리법, 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하는 전기영동법, 히드록시아파타이트를 사용하는 흡착 용리법, 슈크로오스 밀도 구배 원심분리와 같은 침전법, 친화성 크로마토그래피법, 또는 분자 체 막이나 속이 빈 섬유 막, 또는 이들의 조합을 이용하는 분획법을 이용하여 수행할 수 있다.
글루코오스 농도의 측정은 색도측정 글루코오스 어세이 키트를 사용하여 수행할 수 있다. FAD-GDH, 전자 수용체 및 반응 가속제를 함유하는 조성물을 사용할 수 있다. N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산(ADA), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄(Bis-Tris), 탄산나트륨 및 이미다졸로 구성된 군에서 선택된 제제가 글루코오스 어세이 키트의 반응층 내에 유지될 수 있다. 선택적으로 pH 버퍼 또는 착색제를 첨가할 수 있다. 이어서 글루코오스가 함유된 샘플을 추가하고 일정 시간 동안 반응을 허용한다. 반응 중에 흡광도를 모니터한다.
흡광도는 흡수 파장, 바람직하게는 환원에 의해 변색되는 전자 수용체의 최대 흡수 파장, 또는 전자 수용체로부터 전자를 받아들인 결과 중합에 의해 형성된 색소에 해당한다.
샘플의 글루코오스 농도는 알려진 표준 농도의 글루코오스 용액을 사용하여 생성된 검정곡선을 참조하여 계산할 수 있다. 속도 변경법에서는 단위 시간 당 흡광도 변화 속도에 기초하여 농도를 계산할 수 있다. 말단법(endpoint method)에서는 샘플의 모든 글루코오스가 소비(산화)된 시점에 기초하여 농도를 계산할 수 있다.
매개체와 착색제를 사용하는 하나의 실시예에서, 글루코오스는 전자 수용체로서 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 첨가한 다음 600 nm에서의 흡광도 감소를 모니터하여 정량할 수 있다. 또한, 글루코오스 농도는 페나진 메토설페이트(PMS) 형태의 전자 수용체와 니트로테트라졸륨 블루(NTB) 형태의 착색제를 첨가한 후 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 형성되는 디포르마잔의 양을 결정함으로써 계산할 수 있다. 물론 다른 전자 수용체 및 착색제를 사용할 수 있다.
FAD-GDH를 포함하는 글루코오스 센서
하나의 구체예에서 FAD-GDH를 포함하는 글루코오스 센서가 제공된다. 하나의 구체예에서 상기 글루코오스 센서는 FAD-GDH를 포함하는 작업전극, 기준 전극 및 상대 전극을 포함한다. 작업전극에는 탄소 전극, 팔라듐 전극, 금 전극 또는 백금 전극과 같은 전극을 사용할 수 있으며, FAD-GDH가 그 작업전극 상에 고정될 수 있다. 고정시킬 FAD-GDH의 유형은 가용성 형태의 FAD-GDH일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로 작업전극 상에 전자 매개체를 고정시킬 수도 있다. 상대전극은 백금 전극 또는 Pt/C 전극과 같은 종래의 전극일 수 있다. 기준전극은 Ag/AgCl 전극과 같은 종래의 전극일 수 있다.
고정화 방법의 예로는 가교-링커 사용 방법, 폴리머 매트릭스에 끼워넣는 것을 포함하는 방법, 투석 막으로 커버하는 것을 포함하는 방법, 및 광가교가능한 폴리머, 전기적 도체 폴리머 및 산화-환원 폴리머를 이용하는 방법을 포함한다. 대안적으로 FAD-GDH는 페로센이나 그 유도체와 같은 전자 매개체와 함께 폴리머에 고정되거나, 전극에 흡착하여 고정되거나, 이들의 조합으로 고정될 수 있다. 전형적인 방법으로는 글루타르알데히드를 사용하여 탄소 전극에 고정시킨 후 아미노기를 포함하는 시약을 사용하여 글루타르알데히드를 차단하여 FAD-GDH를 고정할 수 있다. 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDE)를 가교-링커로 사용하는 것일 수 있다. PEGDE의 분자량은 제한되지 않으며 어떤 유형도 사용할 수 있다.
글루코오스 센서의 생산방법은 Liu, et. al, Anal. Chem. 2012, 84, 3403-3409 및 Tsujimura, et. al, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14432-14437 (둘 다 그 전체가 참조로서 통합됨)와 같은 문헌에서 찾을 수 있다. 개시된 방법은 GOD 대신에 GDH를 사용하여 변형할 수 있다. 예를 들어, 오스뮴 복합체를 함유한 폴리머와 같은 산화환원 폴리머(redox polymer)는 HEPES와 같은 적합한 버퍼 내에서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 또 다른 폴리머 및 GDH와 혼합되어 글루코오스 감지 시약을 제조할 수 있다. 오스뮴 복합체는 2,2'-비피리딘과 같은 비피리딘 분자, 2,2'-비이미디졸과 같은 비이미다졸 분자, 2-(2-피리딜)이미다졸과 같은 피리딘-이미다졸 화합물 또는 그 조합을 포함하는 하나 이상의 유기 분자로 복합체를 이룰 수 있다. 복합체를 형성하는 유기 분자는 선택적으로, 메틸 또는 에틸기와 같은, C1-C6 알킬과 같은 알킬기로 치환될 수 있다. 하나의 구체예에서 오스뮴 복합체는 다음과 같을 수 있다:
(Os 유기 분자 복합체)-(폴리머)
복합체를 형성하는 유기 분자 중 하나는 선택적으로 링커를 통해 폴리머에 부착될 수 있다. 따라서 또 다른 구체예에서 오스뮴 복합체는 다음과 같을 수 있다:
(Os 유기 분자 복합체)-(링커)-(폴리머)
예시적인 분자는 Ohara, et al, Anal Chem. 1993Dec 1;65(23):3512-7 및 Antiochia et al, Materials Sciences and Applications Vol. 4 No. 7 A2(2013) (둘 다 그 전체가 참조로서 통합됨)과 같은 문헌에 개시되어 있다. 오스뮴 복합체를 함유하는 폴리머의 예로는 오스뮴 비스(2,2'-비피리딘)클로라이드 복합된 폴리(1-비닐이미다졸), 오스뮴 비스(2,2'-비피리딘)클로라이드 복합된 폴리(4-비닐피리딘), 폴리(1-비닐이미다졸)n-[오스뮴(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)2Cl2]2+/+, 및 이들의 유도체를 포함한다.
용액은 탄소 센서에 퇴적되어 산화환원 폴리머 와이어된 GDH를 포함하는 작업전극으로서 작동하는 활성 전극 영역을 형성할 수 있다. 막 폴리머와 가교-링커 용액의 혼합물을 첨가하여 센서 상에 막을 형성할 수 있다. 막은 폴리(1-비닐이미다졸), 폴리(4-비닐피리딘)과 같은 폴리머, 이들의 유도체 또는 조합물을 포함할 수 있다. 상기 오스뮴 복합체를 함유하는 폴리머는 그러한 막 폴리머와 조합하여 하이드로겔 필름을 형성하는 데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서 글루코오스 센서는 인쇄된 전극을 포함할 수 있다. 이 경우 절연 기질 상에 전극을 형성할 수 있다. 구체적으로, 전극은 포토리소그래피 또는 스크린 인쇄, 그라비어 인쇄 또는 플렉소 인쇄(flexography)와 같은 인쇄 기법의 수단에 의해 기판 상에 형성할 수 있다. 절연 기질을 구성하는 물질의 예로는 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리에스테르를 포함한다. 다양한 용매 또는 화학물질에 대한 내성이 높은 재료를 사용할 수 있다.
하나의 구체예에서 FAD-GDH 전극 또는 글루코오스 센서는 이온 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI) , 폴리아크릴산(PA), ε-폴리리신, α-폴리리신 또는 폴리스티렌을 포함할 수 있다. 이들 폴리머의 분자량은 제한되지 않으며 어떤 유형이라도 사용할 수 있다.
글루코오스 측정은 다음과 같이 수행할 수 있다. 버퍼를 자동온도조절 셀에 넣어 일정 온도에서 유지한다. 페리시아나이드 칼륨이나 페나진 메토설페이트를 매개체로 사용할 수 있다. 고정된 FAD-GDH, 상대 전극(예컨대, 백금 전극) 및 기준 전극(예컨대, Ag/AgCl 전극)을 포함하는 작업 전극을 준비한다. 탄소 전극에 일정한 전압을 가하고, 전류가 안정된 후, 글루코오스를 함유하는 샘플을 추가하고 이어서 전류의 증가량을 측정한다. 그런 다음 알려진 표준 농도를 가진 글루코오스 농도로 준비된 검정곡선에 대해 샘플에서의 글루코오스 농도를 계산할 수 있다.
하나의 실시예에서 FAD-GDH 1.5 U를 유리 탄소(GC) 전극 상에 고정시키고 글루코오스 농도에 대한 반응 전류값을 측정한다. 50 mM 칼륨 인산염 버퍼(pH 6.0) 1.8 ml와 헥사시아노페레이트(III) 칼륨(페리시안화 칼륨)의 1 M 수용액 0.2 ml를 전기분해 셀에 첨가한다. GC 전극을 BAS100B/W 정전위기(BAS Co., Ltd.)에 연결하고, 용액을 37℃에서 교반한 후 Ag/AgCl 기준 전극에 +500 mV의 전압을 가한다. 또 다른 실시예에서, Ag/AgCl 기준 전극에 적용되는 전압은 -100 내지 +550의 전압, 예컨대 +400mV에서 선택할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 10mM, 20mM, 30mM 및 40mM의 최종 농도를 가진 글루코오스 용액을 이러한 시스템에 추가하고 각 추가에 대한 정상 상태 전류 값을 측정한다. 이들 전류값은 알려진 글루코오스 농도(예: 1mM, 2mM, 3mM, 4mM 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 및 40mM)에 대해 그래프로 표시하여 검정곡선을 작성한다. 글루코오스 농도는 측정값을 검정곡선과 비교하여 정량할 수 있다.
또 다른 예에서, 주기 전압 측정(cyclic voltammetry)은 본원에서 기재한 고정된 FAD-GDH와 종래의 방법으로 수행할 수 있다. 0 내지 +600mV까지 통틀어 측정할 수 있다. 그런 다음 특정 전압을 선택하여 샘플의 글루코오스 농도를 측정할 수 있다. 이는 상기에서 설명한 대로 검정곡선을 작성하고 모르는 글루코오스 농도의 샘플의 반응전류를 측정함으로써 수행할 수 있다.
하나의 구체예에서 FAD-GDH를 포함하는 글루코오스 센서 또는 FAD-GDH를 포함하는 작업 전극은 보호 필름(보호막)을 포함할 수 있다.
GOD의 효소 활성은 전자를 받아들이기 위해 과량의 매개체가 존재하는 어세이 시스템과 같이, GDH 활성을 평가하기 위한 것과 동일한 어세이 시스템을 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로, GOD의 효소 활성은 산소가 수용체인 어세이 시스템을 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로, GOD의 효소 활성은 제조자의 지시사항에 따라 결정할 수 있다. 잔류 활성비를 계산하기 위해 효소 활성은 초기 활성과 잔류 활성에 동일한 시스템을 사용하여 측정해야 한다.
다음은 GOD 활성을 측정하기 위한 모범적인 어세이 방법이다. 다른 방법들도 사용할 수 있다.
GOD ASSAY 원리:
베타-D-글루코오스 + O2 + H2O → D-글루코노-델타-락톤 + H2O2 (GOD로 촉매)
2H2O2 + 4-AA + EHSPT → 퀴논이민(Quinoneimine) 염료 + 4H2O (POD로 촉매)
(여기서 4-AA는 4-아미노안티피린의 약자, EHSPT는 N-에틸-N(2-히드록시-3-설포프로필)-m-톨루이딘의 약자임)
퀴논이민의 생산은 분광학적으로 측정할 수 있다.
단위의 정의:
GOD 단위는 다음과 같은 조건에서 분 당 1 마이크로몰의 과산화수소(퀴논이민 염료의 1/2 마이크로몰)를 형성할 수 있는 효소 활성으로 정의할 수 있다.
GOD 어세이 방법:
시약 A-F는 다음과 같다.
A. MES-Na 버퍼 pH 5.7: 0.1M (2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산(MW=213.25) 2.13g을 약 60ml H2O에 용해시키고 pH를 1N NaOH로 25℃에서 5.7로 조정하고 H2O로 100ml까지 채운다)
B. 글루코오스 용액: 15% (β-D-글루코오스 1.5g 를 용해시키고 H2O로 10ml까지 채운다) (신선하게 준비할 것)
C. 4-AA 용액: 0.5% (50mg의 4-아미노안티피린 (MW=203.25)/10ml의 H2O)
D. EHSPT 용액: 40mM (118mg의 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘 (MW= 295.3)/10ml의 H2O)
E. 퍼옥시다제 용액: H2O 내에서 500U (푸르푸로갈린 단위로 표현)/ml
F. 효소 희석제: 10mM MES-Na 버퍼, pH 5.7, 0.1% 트리톤 X-100 포함
어세이 혼합물 내 농도:
MES 버퍼: 79 mM
D-글루코오스: 131 mM
4-AA: 0.2mM
EHSPT: 0.3mM
POD: 약 4 U/ml
과정:
단계 1. 다음 작업 용액을 갈색 병 내에 신선하게 준비하고 빙상에서 저장한다.
30 ml 버퍼 용액 (A)
6 ml 기질 용액 (B)
0.3 ml 4-AA 용액 (C)
0.3 ml EHSPT 용액 (D)
0.3 ml POD 용액 (E)
단계 2. 작업 용액 3.0ml을 큐벳 (d=1.0cm)내로 피펫팅하고 약 5분간 평형시킨다.
단계 3. 0.1ml의 효소 용액*을 가하고 뒤집기(inversion)로 온화하게 혼합시킨다. (* 효소 용액을 냉동 효소 희석제 (F)내에 효소 준비물을 용해시키고 어세이 바로 전에 동일한 버퍼로써 0.05-0.2U/ml로 희석시킨다.)
단계 4.
37 ℃에서 온도 조절된 분광 광도계로 2-3 분 동안 물에 대한 555nm에서의 광밀도 증가를 기록하고, 곡선의 초기 선형 부분으로부터 분당 ΔOD를 계산한다 (ΔOD 시험).
또한 효소 용액 대신 효소 희석제 (F)를 첨가 한 경우와 동일한 방법으로 블랭크 속도 (ΔOD 블랭크)를 측정한다.
GOD 활성은 다음과 같이 계산한다:
ΔOD/분 (ΔOD 시험 - ΔOD 블랭크) ×Vt × df
Figure pct00002
질량 활성 (U/mg)=(U/ml)×1/C
Vt : 총 부피 (3.1ml)
Vs : 샘플 부피 (0.1ml)
32.8 : 어세이 조건 하에서 퀴논이민 염료의 밀리몰 흡광 계수 (cm2/마이크로몰)
1/2 : 1 몰의 H2O2 가 1 몰의 퀴논이민 염료의 절반을 생성한다는 사실에 근거한 인자.
1.0 : 광로 길이 (cm)
df : 희석 인자
C : 용해액 내 효소 농도 (c mg/ml).
다음 실시예들은 현재 발명의 측면들을 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 기술적 범위는 하기 실시예에 따라 해석되거나 제한되어서는 안된다. 여기에 개시된 개념의 선택적 특징, 변형 및 변경은 관련 분야 통상의 기술자에 의해 수행할 수 있으며, 그러한 변형과 변경은 본 기술의 범위 내에서 고려된다.
실시예 1
달리 명시되지 않은 한, GDH 및 GOD의 열 안정성과 저장 안정성에 대한 평가는 하기 시험 방법에 따라 수행하였다.
시험 방법
(1) 뮤코르 속(genus Mucor)에 속하는 미생물로부터의 GDH 유전자의 도입 및 형질전환체 내에서 GDH 활성의 확인
간단히 말해서, 뮤코르 속에 속하는 미생물로부터의 GDH (MpGDH, 서열번호: 1)에 돌연변이 N66Y/N68G/C88A/Q233R/T387C/E554D/L557V/S559K를 도입하여 변형시켜 변형된 GDH(여기서 MpGDH-M1, 또는 GDH-M1라고 칭할 수 있음)를 코딩하는 유전자를 수득하였다. MpGDH-M1의 아미노산 서열은 서열번호: 3로 표시되며, 염기 서열은 서열번호: 4로 표시된다. 플라스미드 pUC19의 다중 클로닝 부위에 MpGDH-M1 유전자를 도입하여 DNA 구조체를 얻었다. 더 구체적으로는, 인-퓨전(In-Fusion) HD Cloning Kit (Clontech) 내에서 pUC19를 선형으로 한 벡터가 pUC19 벡터로서 사용되었다. 키트의 지침에 따라 상기 인-퓨전 HD 클로닝 키트를 사용하여 pUC19의 다중 클로닝 부위의 인-퓨전 클로닝 부위에 플라스미드(pUC19-MpGDH-M1)를 연결하여 MpGDH-M1 유전자는 구조체 얻었다.
얻어진 재조합 플라스미드 pUC19-MpGDH-M1을 주형으로 사용하였고, 서열번호 5 내지 10의 합성 올리고뉴클레오티드 및 KOD-Plus-(토요보사 제품)를 이용하여 PCR반응을 하기 조건으로 수행하였다. 10x KOD-Plus-버퍼 5 μl, 2 mM의 각각의 dNTP , 25 mM의 MgSO4 용액 2 μl, 연결된 주형 MpGDH-M1 유전자를 포함하는 DNA 구조체 50ng, 상기 각각의 합성 올리고뉴클레오티드 15 pmol, 및 KOD-Plus-의 1 단위를 가하고 멸균수로 총 부피를 50 μl로 조정하였다. 제조한 반응용액을 열 싸이클러(Eppendorf사 제품)에 적용하고 94 ℃에서 2분간 인큐베이션 후, "15초간 94 ℃" - "30초간 50 ℃" - "8분간 68 ℃" 사이클을 30회 반복하였다. 반응용액의 일부를 1.0% 아가로스 겔에 적용하고 전기영동을 실시하여 약 8,000bp의 DNA 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인하였다.
수득한 DNA를 제한효소 DpnI(NEW England BIOLABS사 제품)로 소화시키고 남은 주형 DNA를 절단한 후, E coli. 주 JM 109를 형질전환하여 LB-amp 아가 배지에 스프레드하였다. 배양한 콜로니를 LB-amp 배지(1%(W/V) 박토트립톤, 0.5%(W/V) 펩톤, 0.5%(W/V) NaCl, 50μg/ml 암피실린 함유) 2.5mL에 접종하고 20시간 동안 37℃에서 진탕배양하여 배양물을 수득하였다. 5분 동안 7,000 rpm의 원심분리를 수행하여 박테리아 세포를 수득하였다. 그리고 나서, QIAGEN tip-100 (QIAGEN)을 이용하여 상기 박테리아 세포를 재조합 플라스미드 추출에 적용하여 재조합 플라스미드를 추출하고 정제하여 2.5 μg의 DNA를 얻었다. multi-capillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies)를 사용하여 상기 플라스미드 내에서 MpGDH-M1를 코딩하는 DNA 염기서열을 결정하고, 결과적으로 돌연변이 MpGDH-M1/A175C/N214C/G466D (서열번호: 12)를 코딩하는 DNA 구조체 (서열번호: 11)을 수득하였다(본원에서는 MpGDH-M2, 또는 GDH-M2라고도 칭함). 이 유전자를 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae) 내에서 발현시켰고 그것의 GDH 활성을 확인하였다.
더 구체적으로는, 뮤코르 속에 속하는 미생물로부터의 GDH 유전자가 출발 물질로서 사용되었고, 변형된 GDH 유전자를 설계하여 아스페르길루스 소자에에서 재조합 발현에 적합한 GDH를 얻었다. 더 구체적으로는 서열번호: 1의 GDH 유전자 서열에 기초하여 숙주 내 발현을 위해 적응된 코돈 빈도를 가진 코돈 최적화 유전자 서열을 설계하고 전체 유전자를 합성하였다. 이러한 전체적으로 합성된 DNA 서열은 서열번호: 2로 표시되어 있다.
Double-joint PCR (Fungal Genetics and Biology, 2004, volume no.41, pp. 973-981)을 수행하여 5' 팔 영역 - PyrG 유전자(우라실 영양요구(auxotrophy) 마커) -TEF1 프로모터 유전자 - 플라빈 결합 GDH 유전자 - 3' 팔 영역으로 구성된 카세트를 제작하였다.
이 카세트는 다음과 같이 아스페르길루스 소자에 주(strain) NBRC 4239(pyrG 유전자의 상류 48개 염기쌍, 코딩 영역 896 염기쌍 및 하류 240개 염기쌍이 결실된 주)로부터의 pyrG 결핍 주의 형질전환을 위한 것이었다. 500ml 얼렌마이어 플라스크 내에 20mM 유리딘을 포함하는 폴리펩톤 덱스트린 액체 배지 100ml에, 아스페르길루스 소자에 주 NBRC 4239로부터의 pyrG-방해 주(disrupted strain)의 분생자(Conidia)를 접종하고 30℃에서 약 20시간 동안 배양액을 진탕한 후 세포를 회수하였다. 상기 회수된 세포들에서 프로토플라스트를 준비하였다. 수득된 프로토플라스트 및 20μg의 표적 유전자-삽입된 DNA 구조체와 함께 프로토플라트 PEG법을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 후속적으로, 0.5%(w/v) 아가와 1.2 M 소르비톨을 함유한 Czapek-Dox 최소배지 (Difco Co, pH6)로 30 ℃에서 5일 이상 상기 세포를 인큐베이트하여, 콜로니 형성능을 갖는, 형질전환된 아스페르길루스 소자에를 수득하였다.
그 결과 형질전환된 아스페르길루스 소자에에서는 유리딘 영양요구성을 보완할 수 있는 유전자인 pyrG가 도입되어 유리딘이 없는 배지에서 형질전환체가 자랄 수 있고, 따라서 관심 유전자가 도입되어 있는 주들로서 선택될 수 있다. 수득된 주들로부터, PCR로 확인함으로써 원하는 형질전환체를 선택하였다. MpGDH-M2 유전자로 형질전환된 아스페르길루스 소자에가 사용되었고 GDH가 생산되었다.
200ml 얼렌마이어 플라스크 내에 40mL의 DPY 액체 배지 (1% (w/v) 폴리펩톤, 2% (w/v) 덱스트린, 0.5% (w/v) 효모 추출물, 0.5% (w/v) KH2PO4, 0.05% (w/v) MgSO4ㆍ7H2O; pH는 미조정)에, 각각의 주의 분생자를 접종하고 30℃에서 4일간 160rpm으로 진탕배양을 실시하였다. 다음으로, 배양 후 배양물로부터 세포를 여과하고 결과 배지의 상청 분획을, 아미콘 울트라-15, 30K NMWL(밀리포어사 제품)로써 10mL로 농축하였다. 그런 다음, 이를 150 mM NaCl을 함유한 20 mM 인산 칼륨 버퍼(pH 6.5)로 평형시킨 HiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE Healthcare사 제품) 컬럼에 적용하고 동일한 버퍼로 용리하였다. GDH 활성을 보이는 분획물을 수집하여 MpGDH-M2의 정제 산물을 수득하였다.
(2) GDH 및 GOD의 열안정성 평가
아스페르길루스 니이거(Aspergillus niger)로부터의 GOD는 Sigma-Aldrich (Type X-S, 여기에서 GOD-1이라고 칭함)에서 구입하였다. 아스페르길루스 종의 또 다른 GOD는 토요보 (카탈로그 번호 GLO-201, 여기에서 GOD-2로 칭함)에서 구매하였다. 아스페르길루스 니이거로부터의 GOD는 와코 퓨어 화학공업(카탈로그 번호 074-02401, 여기에서 GOD-3로 칭함)에서 구매하였다. 아스페르길루스 니이거의 또 다른 GOD는 Sigma-Aldrich (여기에서 GOD-4로 지칭되는 VII 형)로부터 구매하였다. GLD3으로 지정된 GDH는 Funakoshi에서 구매하였다(이 효소의 아미노 말단은 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis)의 GDH의 그것과 동일한 것으로 밝혀졌으며 이 효소가 뮤코르 속에 속하는 미생물인 뮤코르 히에말리스에서 유래한 것으로 강하게 추정된다) (GLD3은 본원에서 GDH-GLD3으로 지칭 될 수도 있음). GLD3을 사용할 때, 저 분자량 성분을 제거하기 위해 Amicon ultra 0.5ml 필터 (Merck, cutoff 30kDa)를 사용하여 초여과를 수행하고, 그 용액을 PBS (pH 7.4)로 대체하였다. MpGDH-M2는 상기와 같이 제조하였다. 효소를 희석하여 약 1U/ml (100 mM 인산 칼륨 버퍼, pH 7.0)의 희석된 효소 용액을 회수하였다. 각각 0.1 mL를 갖는 한 쌍의 이러한 효소 용액을 제조하고 하나는 4 ℃에서 보존하고 다른 하나는 57 ℃, pH 7에서 15 분 동안 열처리하였다.
열처리 후, 각 효소의 활성을 결정하고, "잔류 활성 비율(residual activity ration)(%)"은 4 ℃ 에서 보존된 효소의 효소 활성(100%)에 대비하여 57 ℃, pH 7 (%)에서 15분간 열처리 후 잔류 활성의 백분율로서 계산하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. GOD는 GDH에 비해 뛰어난 열 안정성을 나타냈고 가혹한 온도 조건 하에서 안정적이었다.
(3) GDH 및 GOD의 저장 안정성 평가
GDH와 GOD 각각의 1 mg/ml 용액을 PBS 용액으로 대체하여 40 ℃에서 장기간 저장하였다. 하루, 4일, 1주, 2주, 및 3주 후에 각 효소의 GDH 활성 또는 GOD 활성을 측정하였다. "잔존 활성 비율(remaining activity rate)(%)"은 40℃에서 저장 전 활성 값을 100%로 설정함으로써 40℃에서 저장 후 활성 값으로서 계산하였다. 결과는 도 2 내지 4에 나타나 있다.
그 결과 1주일 후 GOD-3의 잔류 활성 비율은 22%, GOD-4는 22%, GOD-2는 30%, 그리고 GOD-1은 41% 이었다. 즉, 40℃에서 1주일이 지난 후 모든 GOD는 유의한 활성 감소를 보였다. 또한, 2주 후 GOD-3의 잔존 활성 비율은 9%, GOD-4는 8%, GOD-2는 13%, 그리고 GOD-1은 30%이었고 재차 모든 GOD의 활성이 유의미하게 감소했음을 보여주었다.
한편, 1주일 후, MpGDH-M2의 잔류 활성 비율은 80%, GLD3의 잔류 활성 비율은 88% 이었다. 즉, GDH들은 그들의 활성을 장기간에 걸쳐 유지했다. 2주 후, MpGDH-M2의 잔류 활성 비율은 72%이었으며, GLD3의 잔류 활성 비율은 83%이었고, 장기간에 걸쳐 재차 GDH는 활성을 유지했다. MpGDH-M2는 3주 후에도 초기 활성의 약 73%를 유지한 반면, GOD-2는 같은 기간 동안 대부분의 활성을 상실했다(4%). 도 2 참조.
57℃, pH 7에서 15분 동안 처리 후의 잔류 활성을 비교할 때 각각의 GOD는 MpGDH-M2 및 GLD3보다 높은 잔류 활성 및 높은 안정성 둘다를 모두 가진다. 그러나 놀랍게도 40 ℃ 저장 시험에서 GOD의 안정성이 상기 GDH에 비해 낮았고, GOD는 가혹한 온도 조건 하에서 탁월한 열 안정성에도 불구하고 CGM에서 사용하기에 최적이 아닐 수 있다는 것이 밝혀졌다. 오히려, GDH는 CGM과 같이 장기간 동안 사용하기에 적합하다는 것이 입증되었다.
GDH는 40 ℃ 저장 시험에서도 비교적 높은 활성을 유지했기 때문에 37 ℃에 저장했을 때에도 상기 GDH는 비교적 높은 활성도를 유지할 가능성이 높다.
실시예 2
GDH/GOD 고정 전극의 저장 안정성 시험
GDH/GOD 고정 전극을 제작하고 다음과 같이 저장 안정성을 시험하였다.
전극 제작 방법
양이온성 폴리머로서, 3 μl의 5% PEI(폴리에틸렌이민)(카탈로그 번호 164-17821, 평균 분자량 10000, 와코 사 제품)를 스크린 인쇄된 탄소계 전극에 가한 후 건조시킨다. 그 다음 1시간 동안 98 ℃에서 처리한 0.5 μl의 오스뮴 폴리머(카탈로그 번호 002096, BAS)를 가한 후 건조시킨다. 그 다음 3 μl의 35 mg/ml GDH/GOD 를 가한 후 건조시킨다. 다음으로 2% 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDE, 평균 분자량 500, 시그마-알드리치 사 제조)의 3 μl를 가하여 4 ℃에서 밤새 저장한다.
* 전극도 1%의 폴리아크릴산(PA) (카탈로그 번호 416037-100ML, 평균 분자량 15000, Sigma-Aldrich)를 사용하여 생산되었는데 이는 PEI 대신 음이온성 폴리머이다.
저장 안정성 시험
위와 같이 생산된 전극을 초순수로 세척하고 30 ℃에서 1시간 동안 건조하였다. 다음으로, 매 2시간마다 전극을 취하여 전기화학적 측정을 실시하였다. 전기화학적 측정 후, 전극을 건조 상태에서 30 ℃의 인큐베이터 내에 재차 보관하였다.
전기화학적 측정
기준 전극 Ag/AgCl, 상대 전극(백금) 및 작업 전극으로서 GDH 또는 GOD계 스크린 인쇄된 전극을 100mM 인산칼륨 버퍼(pH 7)에 두었다. 그런 다음 0 내지 + 600mV를 통틀어 주기 전압 측정을 수행했다.
글루코오스가 추가되지 않은 조건과 5mM 글루코오스가 추가된 조건에 대한 +500mV의 산화 전류 값을 비교하고 그 차이를 반응 전류 값으로 삼았다. 측정은 0, 2 및 4시간에 수행하였으며, 상대값은 0hr에 100%로서 응답 전류 값을 취하여 기록하였다.
결과
PEI를 사용하여 생산된 전극의 경우 GDH-M2 전극의 반응 전류가 2시간 후에 67.3% 이었다. 이에 비해 GOD-3는 많은 활성을 잃었고 GOD-3 전극의 잔류 반응 전류는 2시간에 30.8%에 불과했다. 4시간의 저장 후 유사한 결과가 관찰되었으며 GOD-3의 상대 반응 전류 값이 GDH-M2보다 낮았다. 도 5 참조.
PA를 사용하여 생성된 전극의 경우, GOD-3 고정 전극으로 0시간에도 반응 전류를 관찰할 수 없었다. 이에 대조적으로, PA를 사용하여 GDH-M2 고정 전극에 대해서는 반응 전류를 관찰할 수 있었다. 2시간 저장 후 68.3%의 활성을 유지하였고, 4시간 후에는 초기 활성의 47.1%를 유지하여 PEI를 사용하여 고정시킨 전극보다 높은 안정성을 보여주었다. 도 6 참조.
이 실험에서 평가된 전극에는 보호막이 없으므로 실제 CGM의 조건보다 조건이 더 가혹하고 심각하다는 점에 유의해야 한다. 현재의 CGM 장치에 사용되는 글루코오스 옥시다제를 갖는 센서보다 높은 저장 안정성을 보여주는 글루코오스 탈수소효소를 갖는 센서는 장시간 측정에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 3
최적 pH
글루코오스 탈수소효소 GDH-M2 및 GLD3의 최적 pH를 평가했다.
활성 어세이는 다음과 같이 수행되었다. 2,6-디클로로-인도페놀(DCIP) 어세이는 520nm(300mM DCIP/1mM PMS/400mM 글루코오스)에서 DCIP의 시간 의존적 환원을 측정함으로써 수행하였다. pH 5.5 내지 6.0에는 시트레이트-나트륨 버퍼가 사용되었고 pH 6 내지 8에는 인산-칼륨 버퍼가 사용되었다. 도 7(GDH-M2) 및 도 8(GLD3) 참조.
비교를 통해 GOD-3의 최적 pH는 제조업체의 카탈로그에 따라 pH 5.6으로 보고된다.
실시예 4
글루코오스 농도 의존성
고정 효소를 가진 전극의 글루코오스 농도 의존도를 다음과 같이 평가하였다.
상기 센서는 위의 실시예 2에서와 같이 PEI, GDH-M2, Os 폴리머, 및 PEGDE를 사용하여 제작하였다. 다음으로, 전극을 100 mM 인산칼륨 버퍼 용액(pH 7) 10ml에 넣고 Ag/AgCl 기준 전극과 백금 상대 전극(보조 전극)을 함께 넣어 3-전극 시스템으로 구성하였다. 측정은 이 3-전극 시스템으로 수행하였다.
350rpm으로 교반하는 동안, 미리 결정된 농도의 글루코오스가 더해졌다. 그런 다음 0 내지 600mV를 통틀어 주기 전압측정의 측정을 수행하고 +400mV에서의 산화 전류 값을 기록하였다. 결과는 도 9 및 도 10에 나타나 있다.
반응 전류의 글루코오스 농도 의존도는 1 내지 30.1 mM 글루코오스에서 확인할 수 있었음이 입증되었다.
실시예 5
분자량
효소의 분자량은 다음과 같이 SDS-PAGE로 평가되었다. EndoH 엔도글리코시다제(New England Biolabs사 제품) 처리는 37 ℃에서 24시간 동안 수행하였다. 그런 다음 SDS-PAGE를 5-20% 농도 구배 젤로 수행하였다. M2의 분자량은 약 70kDa, GLD3의 분자량은 약 65 내지 80kDa이었다. 도 11 참조.
실시예 6
기질 특이성
GDH-M2의 기질 특이성을 다음과 같이 평가하였다. 더 구체적으로는 기질 당(sugar)의 농도가 200mM이었다. 글루코오스에 대한 활성은 100%로 설정되었고 다른 기질에 대한 상대적 활성은 백분율로 표현된다.
Figure pct00003
*GLD3의 값은 제조업체가 제공한 카탈로그에 따른 값이다.
본원에서 언급된 각 특허, 특허 출원, 발행물 및 문헌은 그 전체가 참조로 통합된다. 상기 특허, 특허 출원, 발행물 및 문헌의 인용 또는 참조는 전술한 어떤 것도 관련 선행기술이라는 것을 인정하는 것이 아니며, 또한 이러한 발행물이나 문헌의 내용이나 날짜에 대한 어떠한 승인도 구성하지 않는다. 본 명세서에 기술된 설명과 정의는 참조에 의해 본원에 통합되어 있는 문헌의 설명보다 우세하다. 본원에 기재된 기술은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소가 없을 경우 적절하게 실행될 수 있다. 사용된 용어와 표현은 제한사항이 아니고 설명의 용어로 사용된다. 이러한 용어와 표현의 사용은 표시 및 설명된 특징 또는 그 일부의 임의의 균등물을 배제하지 않으며, 청구된 기술의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다. "한" 또는 "하나의"라는 용어는 문맥상 하나 또는 둘 이상의 요소가 설명된 경우를 제외하고 그것이 변형하는 하나 또는 복수의 요소(예컨대 "하나의 시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있음)를 지칭할 수 있다. 본원에서 각각의 경우에 "포함하는", "필수적으로 구성된", 및 "구성된"이란 용어중 어느 것이라도 다른 두 용어와 대체될 수 있다.
어떤 구체예에서는 본 방법은 예컨대 연속적인 글루코오스 모니터링을 위해 사용될 수 있다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1: 뮤코르 프라이니(Mucor prainii) wt GDH aa
서열번호 2: 뮤코르 프라이니(Mucor prainii) wt GDH DNA
서열번호 3: MpGDH-M1 aa
서열번호 4: MpGDH-M1 DNA
서열번호 5 내지 10: 프라이머들
서열번호 11: MpGDH-M2 aa
서열번호 12: MpGDH-M2 DNA
서열번호 13: MhGDH aa
서열번호 14: MhGDH DNA
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> Continuous glucose monitoring using an FAD-Dependent glucose dehydrogenase <130> PH-6896-PCT <150> US 62/479442 <151> 2017-03-31 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 1 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Pro Asn Ala Asn Asp Arg Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Ala Val Gly Thr Asp Leu Cys Pro Leu Ile Pro Thr Thr Pro Gln 85 90 95 Glu Asn Met Gly Asn Arg Ser Leu Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Gly Leu 115 120 125 Lys Asp Tyr Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly 130 135 140 Ala Asn Leu Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Ile Glu Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Ser Ala His 165 170 175 Gly Lys Lys Gly Pro Ile Asp Val Ser Phe Thr Asn Tyr Glu Phe Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Ser Trp Asn Ala Ser Leu Glu Thr Leu Asp Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Pro Asp Ile Leu Asn Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Pro 210 215 220 Asn Ile Leu Asp Pro Glu Thr Val Gln Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asn Leu Asn Val Leu Ala Asn 245 250 255 His Thr Val Ser Arg Ile Gln Phe Ala Pro Lys Asn Gly Ser Glu Pro 260 265 270 Leu Lys Ala Thr Gly Val Glu Trp Tyr Pro Thr Gly Asn Lys Asn Gln 275 280 285 Lys Gln Ile Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala 290 295 300 Ile Gly Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ile Val Ser Ala Ala Gly Val Glu Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val 325 330 335 Gly Ser Asn Met Gln Asp His Val His Ala Ile Thr Val Ser Thr Thr 340 345 350 Asn Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Val Asn Glu Thr Leu 355 360 365 Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Thr Gly Ile Trp 370 375 380 Ala Thr Thr Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400 Asn Gly Thr Glu Phe Val Ser Gly Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Ser 420 425 430 Asn Val Glu Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr 435 440 445 Glu Glu Asn Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr 450 455 460 Glu Gly Ser Gly Asn Val Asp Leu Gln Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val 465 470 475 480 Asn His Val Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn 485 490 495 Ser Ser Asp Val Glu Asp His Ser Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Ser 500 505 510 His Pro Met Asp Ile Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg 515 520 525 Glu Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ile Asn Ser Gly Glu 530 535 540 Ile Glu Pro Gly Met Asn Ile Thr Ser Glu Asp Asp Leu Arg Ser Trp 545 550 555 560 Leu Ser Asn Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala 565 570 575 Met Leu Pro Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Ser Pro Ala Leu Met Val 580 585 590 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu 595 600 605 Glu Val Ser Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Ile Ala Glu Lys 610 615 620 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Thr Gln His Lys Asn Gln 625 630 635 640 Asn <210> 2 <211> 1926 <212> DNA <213> Mucor prainii <400> 2 atgaagatca cagctgccat tatcactgtt gccacagcat ttgcttcttt tgcttctgct 60 caacaagaca caaattcttc ctcaactgat acttatgatt atgttatcgt tggcggcggt 120 gtagctggtt tggctttggc tagtcgtatc tctgaaaaca aggatgtcac tgttgctgtt 180 ctcgagtccg gtcctaatgc caatgataga tttgttgttt atgctcctgg catgtatggc 240 caagctgttg gcactgatct ctgtcctctc attcctacta ctcctcaaga aaatatgggc 300 aacagaagtc tcacaatcgc tactggtaga ttgctcggtg gtggcagtgc tattaatggt 360 ctcgtttgga cccgtggtgg cttgaaggat tacgatgctt gggaggagct cggtaaccct 420 ggatggaacg gtgccaactt gttcaagtac tttaagaagg tcgaaaactt cactcctcct 480 actcctgccc aaattgaata cggcgctact tatcagaaaa gtgctcatgg 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1380 actcctggtt atgagggtag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg aagacgacct tagatcttgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 3 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 3 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 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ctggcgttgg ttccaacatg 1020 caagatcacg ttcatgctat cactgtctct actaccaata ttactggcta tactaccaac 1080 agcgtctttg tcaatgaaac ccttgcccaa gaacaaagag aagaatatga agccaacaag 1140 actggtatct gggctacttg tcccaacaac ctcggttatc ctacgcccga acaactcttc 1200 aatggcaccg aattcgtttc tggaaaggag tttgctgaca agattcgtaa ctctactgat 1260 gaatgggcca actattatgc ttccaccaac gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320 tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380 actcctggtt atgagggtag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg acgacgacgt tagaaaatgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 tatcagaaaa gttgtcatgg caagaaggga 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 agagacatca ataggtccct tcttgccatg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 cctgatatct tgtgcggtac tttggccggt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 gggagtggta gagtaaccgg ccaaagtacc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 cctggttatg aggacagcgg taatgtcgat 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 cttgttgttt tgcaaatcga cattaccgct 30 <210> 11 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 11 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Pro Tyr Ala Gly Asp Arg Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Ala Val Gly Thr Asp Leu Ala Pro Leu Ile Pro Thr Thr Pro Gln 85 90 95 Glu Asn Met Gly Asn Arg Ser Leu Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Gly Leu 115 120 125 Lys Asp Tyr Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly 130 135 140 Ala Asn Leu Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Ile Glu Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Ser Cys His 165 170 175 Gly Lys Lys Gly Pro Ile Asp Val Ser Phe Thr Asn Tyr Glu Phe Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Ser Trp Asn Ala Ser Leu Glu Thr Leu Asp Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Pro Asp Ile Leu Cys Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Pro 210 215 220 Asn Ile Leu Asp Pro Glu Thr Val Arg Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asn Leu Asn Val Leu Ala Asn 245 250 255 His Thr Val Ser Arg Ile Gln Phe Ala Pro Lys Asn Gly Ser Glu Pro 260 265 270 Leu Lys Ala Thr Gly Val Glu Trp Tyr Pro Thr Gly Asn Lys Asn Gln 275 280 285 Lys Gln Ile Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala 290 295 300 Ile Gly Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ile Val Ser Ala Ala Gly Val Glu Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val 325 330 335 Gly Ser Asn Met Gln Asp His Val His Ala Ile Thr Val Ser Thr Thr 340 345 350 Asn Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Val Asn Glu Thr Leu 355 360 365 Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Thr Gly Ile Trp 370 375 380 Ala Thr Cys Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400 Asn Gly Thr Glu Phe Val Ser Gly Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Ser 420 425 430 Asn Val Glu Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr 435 440 445 Glu Glu Asn Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr 450 455 460 Glu Asp Ser Gly Asn Val Asp Leu Gln Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val 465 470 475 480 Asn His Val Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn 485 490 495 Ser Ser Asp Val Glu Asp His Ser Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Ser 500 505 510 His Pro Met Asp Ile Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg 515 520 525 Glu Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ile Asn Ser Gly Glu 530 535 540 Ile Glu Pro Gly Met Asn Ile Thr Ser Asp Asp Asp Val Arg Lys Trp 545 550 555 560 Leu Ser Asn Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala 565 570 575 Met Leu Pro Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Ser Pro Ala Leu Met Val 580 585 590 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu 595 600 605 Glu Val Ser Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Ile Ala Glu Lys 610 615 620 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Thr Gln His Lys Asn Gln 625 630 635 640 Asn <210> 12 <211> 1926 <212> DNA <213> Mucor prainii <400> 12 atgaagatca cagctgccat tatcactgtt gccacagcat ttgcttcttt tgcttctgct 60 caacaagaca caaattcttc ctcaactgat acttatgatt atgttatcgt tggcggcggt 120 gtagctggtt tggctttggc tagtcgtatc tctgaaaaca aggatgtcac tgttgctgtt 180 ctcgagtccg gtccttatgc cggtgataga tttgttgttt atgctcctgg catgtatggc 240 caagctgttg gcactgatct cgctcctctc attcctacta ctcctcaaga aaatatgggc 300 aacagaagtc tcacaatcgc tactggtaga ttgctcggtg gtggcagtgc tattaatggt 360 ctcgtttgga cccgtggtgg cttgaaggat tacgatgctt gggaggagct cggtaaccct 420 ggatggaacg gtgccaactt gttcaagtac tttaagaagg tcgaaaactt cactcctcct 480 actcctgccc aaattgaata cggcgctact tatcagaaaa gttgtcatgg caagaaggga 540 cctattgatg tctctttcac gaactacgag ttctctcaat ctgctagctg gaacgcctca 600 ctcgaaaccc ttgatttcac tgcacttcct gatatcttgt gcggtacttt ggccggttac 660 tctaccactc ccaacatttt ggaccctgag actgttcgac gtgttgattc ctatactggt 720 tacattgctc cttacactag ccgtaacaac ctcaatgttt tggccaacca taccgtctcc 780 cgcattcaat ttgctcccaa gaatggtagc gaacctctca aggctaccgg tgttgaatgg 840 tatcccactg gcaacaagaa tcaaaagcaa attatcaagg cccgttatga agttatcatc 900 tcatctggtg ccattggtag tcctaagctt ttggaaatct ctggtatcgg taataaggat 960 atcgtctctg ctgctggtgt cgagtccttg attgacttgc ctggcgttgg ttccaacatg 1020 caagatcacg ttcatgctat cactgtctct actaccaata ttactggcta tactaccaac 1080 agcgtctttg tcaatgaaac ccttgcccaa gaacaaagag aagaatatga agccaacaag 1140 actggtatct gggctacttg tcccaacaac ctcggttatc ctacgcccga acaactcttc 1200 aatggcaccg aattcgtttc tggaaaggag tttgctgaca agattcgtaa ctctactgat 1260 gaatgggcca actattatgc ttccaccaac gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320 tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380 actcctggtt atgaggacag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg acgacgacgt tagaaaatgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 13 <211> 635 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 13 Met Lys Ile Ser Val Ala Ile Val Thr Ile Ala Ala Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Asn Ala Gln Lys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Tyr Asp Tyr Val 20 25 30 Ile Val Gly Gly Gly Val Gly Gly Leu Ala Leu Ala Ser Arg Leu Ser 35 40 45 Glu Asp Lys Ser Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ala Gly Pro Asn Ala 50 55 60 Asp Glu Gln Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly Gln Ala Val 65 70 75 80 Gly Thr Asp Leu Cys Pro Leu Arg Pro Thr Val Pro Gln Glu Ala Met 85 90 95 Asn Asn Arg Thr Leu Thr Ile Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Ala Leu Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly Arg Thr Met 130 135 140 Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Arg Phe His Pro Pro Thr Lys Ala 145 150 155 160 Gln Val Gln Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Gly Val His Gly Lys Asn 165 170 175 Gly Arg Ile Asp Ile Ser Phe Pro Glu Phe Gln Phe Pro Gln Ser Ala 180 185 190 Asn Trp Asn Ala Ser Leu Ala Thr Leu Asp Phe Thr His Gln Gln Asp 195 200 205 Leu Leu Asn Gly Ser Leu His Gly Tyr Ser Thr Thr Pro Asn Thr Leu 210 215 220 Asp Pro Lys Thr Ala Arg Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly Tyr Ile Ala 225 230 235 240 Pro Phe Val Ser Arg Lys Asn Leu Phe Val Leu Ala Asn His Thr Val 245 250 255 Ser Arg Ile Gln Phe Lys Pro Lys Asn Gly Thr Glu Leu Leu Lys Ala 260 265 270 Val Gly Val Glu Trp Tyr Thr Thr Gly Asp Asn Ser Asn Lys Gln Thr 275 280 285 Ile Lys Ala Arg Arg Glu Val Ile Val Ser Ser Gly Ser Ile Gly Ser 290 295 300 Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp Ile Val Thr 305 310 315 320 Ala Ala Gly Val Gln Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val Gly Ser Asn 325 330 335 Met Gln Asp His Val His Ala Val Thr Val Ser Thr Thr Asn Ile Thr 340 345 350 Gly Phe Thr Thr Asp Ser Val Phe Gln Asn Glu Thr Leu Ala Glu Glu 355 360 365 Gln Arg Gln Gln Tyr Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Ile Trp Thr Thr Thr 370 375 380 Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Ser Pro Ser Gln Leu Phe Asp Gly Thr 385 390 395 400 Ser Phe Glu Ser Gly Gln Ala Phe Ala Asn Arg Ile Arg Asn Ser Thr 405 410 415 Asp Gln Trp Ala Glu Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Thr Asn Ile Glu 420 425 430 Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr Glu Glu Asn 435 440 445 Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr Gly Gly Thr 450 455 460 Thr Asp Val Asp Leu Lys Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val Asn His Val 465 470 475 480 Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn Ser Ser Asn 485 490 495 Ile Glu Asp Pro Val Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Thr His Pro Met 500 505 510 Asp Val Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg Arg Ile Leu 515 520 525 Gly Ala Glu Pro Gly Leu Ala Ser Ile Asn Ser Gly Glu Ile Gln Pro 530 535 540 Gly Ser Asn Ile Thr Ser Asp Glu Asp Val Lys Gln Trp Leu Ala Asp 545 550 555 560 Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala Met Leu Pro 565 570 575 Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Pro Asn Leu Leu Val Tyr Gly Thr 580 585 590 Ala Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu Glu Ile Ser 595 600 605 Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Val Ala Glu Lys Ala Ala Asp 610 615 620 Ile Ile Lys Met Ser Arg Lys Asn Asn Asn Asn 625 630 635 <210> 14 <211> 1908 <212> DNA <213> Mucor hiemalis <400> 14 atgaaaatct cagtagccat tgtcactatc gccgccgcct tcgcttcctt cgccaacgcc 60 caaaagaccg caaccagtaa tacctatgat tatgtaattg ttggtggtgg tgttggtggt 120 ttggcattag cctctagatt gtcagaagat aaatctgtca cagtagctgt tttagaagca 180 ggtcctaatg ccgacgaaca atttgttgtc tatgccccag gcatgtacgg tcaagctgtt 240 ggtaccgatt tgtgtccatt aagacctact gtcccacaag aagctatgaa taacagaaca 300 ttgaccatag caaccggtaa attgttaggt ggtggttcag ctatcaatgg tttggtttgg 360 actagaggtg cattaaagga ttttgacgcc tgggaagaat taggtaatcc aggttggaac 420 ggtagaacta tgttcaagta cttcaaaaag gttgaaagat tccatccacc tacaaaggct 480 caagtccaat atggtgcaac ctaccaaaaa ggtgtacacg gtaaaaatgg tagaatcgat 540 atttcttttc ctgaatttca attcccacaa tctgctaatt ggaacgcctc attggctacc 600 ttagatttca ctcatcaaca agacttgtta aatggttcct tgcacggtta tagtactaca 660 cctaacacat tagatccaaa aaccgccaga agagttgact cctatacagg ttacattgct 720 cctttcgtta gtagaaagaa tttgttcgtc ttagcaaacc atactgtatc tagaatacaa 780 ttcaaaccaa agaatggtac agaattgttg aaggctgtcg gtgtagaatg gtacaccact 840 ggtgacaact caaacaaaca aacaattaag gcaagaagag aagttatcgt ctcttcaggt 900 tccattggta gtcctaaatt gttggaaata tccggtatcg gtaataagga tatcgtaact 960 gctgcaggtg ttcaatcttt gattgatttg ccaggtgtag gttcaaacat gcaagaccat 1020 gttcacgctg taactgtttc cacaaccaac ataacaggtt ttactacaga tagtgttttc 1080 caaaacgaaa cattggcaga agaacaaaga caacaatact acaacaacaa aaccggtatc 1140 tggaccacta caccaaataa cttgggttat ccatccccta gtcaattatt tgatggtaca 1200 tctttcgaat caggtcaagc atttgcaaac agaattagaa actctaccga ccaatgggct 1260 gaatattacg catcaactaa tgccacaaac atcgaattgt tgaagaaaca atacgcaatc 1320 gttgcctcca gatacgaaga aaactacttg agtcctatcg aaatcaactt cactccaggt 1380 tatggtggta ccactgatgt tgatttgaaa aataacaagt accaaactgt taatcatgtc 1440 ttgatcgctc ctttatcaag aggttataca cacatcaatt ccagtaacat agaagatcct 1500 gtagttataa atccacaata ctacacccat ccaatggatg tcgacgtaca cattgcttct 1560 actaaattgg caagaagaat attaggtgcc gaacctggtt tggcttccat aaatagtggt 1620 gaaatccaac caggttctaa cattacatca gatgaagacg ttaagcaatg gttagcagat 1680 aatgttagat ctgactggca tcctgtcggt acatgcgcca tgttgccaag agaattaggt 1740 ggtgtcgtag atccaaattt gttggtttac ggtactgcaa acttaagagt tgtcgacgcc 1800 tctataatgc ctttggaaat ctcttcacat ttgatgcaac caacttacgg tgttgctgaa 1860 aaagccgctg atattattaa gatgtctaga aagaataaca ataactaa 1908

Claims (13)

  1. (a) 약 37-40℃에서 유지할 경우 1주일 동안 초기 활성의 약 60% 이상을 유지,
    (b) 약 37-40℃에서 유지할 경우 2주일 동안 초기 활성의 약 40% 이상을 유지, 또는
    (c) 약 37-40℃에서 유지할 경우 3주일 동안 초기 활성의 약 30% 이상을 유지할 수 있는 글루코오스 탈수소효소(GDH)를 이용하는 것을 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법으로서, 상기 GDH는 FAD 의존형 GDH이고 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아닌 것인, 연속적인 글루코오스 모니터링 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 GDH가 7.4의 pH에서 유지될 경우 청구항 1에서의 (a) 내지 (c)에서 특정된 활성을 유지할 수 있는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 연속적인 글루코오스 모니터링을 재보정(re-calibration)없이 수행하는 것인 방법.
  4. 연속적인 글루코오스 모니터링에 사용되는 GDH를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법:
    (i) 후보 GDH를 준비하는 단계,
    (ii) 미리 결정된 주기 동안 상기 후보 GDH를 약 30-40℃에서 유지하는 단계,
    (iii) 단계 (ii) 후에 상기 GDH의 잔류 활성을 결정하는 단계,
    (iv) 단계 (iii)에서 결정된 잔류 활성을 상기 후보 GDH의 초기 활성과 비교하는 단계,
    여기서 잔류 GDH 활성은
    (a) 약 30-40℃에서 1주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 60% 이상,
    (b) 약 30-40℃에서 2주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 40% 이상, 또는
    (c) 약 30-40℃에서 3주일 동안 유지할 경우 초기 GDH 활성과 비교하여 약 30% 이상이며, 상기 후보 GDH는 1 내지 3주일 동안 연속적인 글루코오스 모니터링에서 사용될 전위를 갖는 GDH로서 선택되는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 단계 (ii)는 약 50-60℃에서 약 5-30분간 가열처리를 포함하는 가속화된 가열처리 단계로 대체되지 않는 것인 방법.
  6. (a) 약 37-40℃에서 유지할 경우 1주일 동안 초기 활성의 약 60% 이상을 유지,
    (b) 약 37-40℃에서 유지할 경우 2주일 동안 초기 활성의 약 40% 이상을 유지, 또는
    (c) 약 37-40℃에서 유지할 경우 3주일 동안 초기 활성의 약 30% 이상을 유지할 수 있는 GDH를 포함하는 연속적인 글루코오스 모니터링 장치로서, 상기 GDH는 FAD 의존형 GDH이고 상기 GDH는 막 결합 단백질이 아닌 것인 연속적인 글루코오스 모니터링 장치.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 GDH를 7.4의 pH에서 유지할 경우 청구항 6에서의 (a) 내지 (c)에서 특정된 활성을 유지할 수 있는 것인 장치.
  8. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH는 다음과 같은 특성을 갖는 방법:
    (1) 청구항 1의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에서 규정된 활성;
    (2) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 말토오스에 대한 반응성이 2%이하;
    (3) 최적 활성 pH: 6.5 내지 7.5; 및
    (4) SDS-PAGE로 측정시 약 65 내지 약 81 kDa의 분자량.
  9. 청구항 1 내지 청구항 5 및 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH가 뮤코르(Mucor), 압시디아(Absidia), 악티노트누코르(Actinotnucor), 서시넬라(Circinella), 파라시텔라(Parasitella) 또는 리조푸스(Rhizopus) 속에 속하는 미생물에서 유래된 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 GDH는 뮤코르 푸라이니(Mucor prainii), 뮤코르 서시넬로이드(Mucor circinelloides), 뮤코르 서시넬로이드 f. 서시넬로이드(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 디모르포스포러스(Mucor dimorphosporus), 뮤코르 RD056860(Mucor RD056860), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), 압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora), 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans), 서시넬라 미노르(Circinella minor), 서시넬라 무코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella rigida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex), 서시넬라 우벨라타(Circinella umbellata), 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica) 또는 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)에서 유래된 GDH인 것인 방법.
  11. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 상기 GDH는 하기 특성을 갖는 장치:
    (1) 청구항 6의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에서 규정된 활성;
    (2) 기질 특이성: D-글루코오스에 대한 반응성(100%)에 상대적으로 말토오스에 대한 반응성이 2%이하;
    (3) 최적 활성 pH: 6.5 내지 7.5; 및
    (4) SDS-PAGE로 측정시 약 65 내지 약 81 kDa의 분자량.
  12. 청구항 6, 청구항 7 또는 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDH가 뮤코르, 압시디아, 악티노트누코르, 서시넬라, 파라시텔라 또는 리조푸스 속에 속하는 미생물에서 유래된 것인 장치.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 GDH는 뮤코르 푸라이니(Mucor prainii), 뮤코르 서시넬로이드(Mucor circinelloides), 뮤코르 서시넬로이드 f. 서시넬로이드(Mucor circinelioides f. cirinelloides), 뮤코르 암비구스(Mucor ambiguus), 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 뮤코르 히에말리스 f. 실바티쿠스(Mucor hiemalis f. silvaticus), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 뮤코르 길리어몬디(Mucor guilliermondii), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 뮤코르 디모르포스포러스(Mucor dimorphosporus), 뮤코르 RD056860(Mucor RD056860), 뮤코르 서브틸리씨무스(Mucor subtilissimus), 압시디아 실린드로스포라(Absidia cylindrospora), ㅇ아압시디아 히알로스포라(Absidia hyalospora), 악티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans), 서시넬라 미노르(Circinella minor), 서시넬라 무코로이데스(Circinella mucoroides), 서시넬라 무스카에(Circinella muscae), 서시넬라 리기다(Circinella rigida), 서시넬라 심플렉스(Circinella simplex), 서시넬라 우벨라타(Circinella umbellata), 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica) 또는 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus)에서 유래된 GDH인 것인 장치.
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