KR20210143750A - 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 - Google Patents

글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 Download PDF

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Abstract

글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 것을 과제로 한다. 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 이용하는, 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 제공한다.

Description

글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제
본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제에 관한 것이다.
글루코오스 측정은 당뇨병 환자의 혈당치 모니터링 등에 이용된다. 글루코오스의 정량에는 통상 글루코오스 옥시다아제(이하, GOD라고도 함)나 글루코오스 디히드로게나아제(이하, GDH라고도 함)가 이용된다.
글루코오스 옥시다아제는 β-D-글루코오스를 D-글루코노-1,5-락톤(글루코노락톤)으로 산화하는 반응을 촉매하는 산화 환원 효소이다. 글루코오스 옥시다아제는 산소를 전자 수용체로 하고, 또한 보조 인자로서 플라빈아데닌디뉴클레오티드(FAD)를 이용한다.
글루코오스 디히드로게나아제는 산화 환원 효소로 분류되며, 글루코오스 및 전자 억셉터를 기질로 하여 글루코노락톤 및 환원형 억셉터를 생성하는 반응을 촉매한다. 글루코오스 디히드로게나아제로서는 니코틴아미드디뉴클레오티드 의존성 GDH, 니코틴아미드디뉴클레오티드인산 의존성 GDH, 피로로퀴놀린퀴논(PQQ) 의존성 GDH, FAD 의존성 GDH(플라빈 결합형 GDH) 등을 들 수 있다.
글루코오스를 기질로 하는 효소를 이용하여 혈중 글루코오스를 측정하는 경우, 이러한 효소의 기질 특이성이 문제가 되는 경우가 있다. 특히 말토오스에 대한 반응성이 문제가 되는 경우가 있었다. 예를 들어 야생형 PQQ-GDH는 글루코오스 특이적이지 않고 말토오스, 갈락토오스 및 크실로오스 등의 다른 당과도 반응한다. 비특허문헌 1은 PQQ-GDH를 이용한 글루코오스 측정에서 계에 존재하는 말토오스 등에 기인하여 실제보다 증대한 글루코오스 값이 잘못 얻어지고, 이것이 저혈당의 원인이 되는 문제에 대해 기재하고 있다. 따라서, 효소를 이용한 글루코오스 측정에서는 글루코오스에의 특이성이 높고 말토오스와 같은 다른 당에 대한 반응성이 낮은 측정 시약이 요구되고 있었다.
글루코오스에 대한 기질 특이성을 높이기 위해 혹은 말토오스에 대한 반응성을 저감하기 위해 기질 특이성이 우수한 글루코오스 디히드로게나아제(GDH)를 탐색하는 어프로치가 시도되고 여러 가지의 FAD 의존성 GDH가 발견되었다(비특허문헌 2, 3 참조). 또한, 분리된 GDH에 대해 그 유전자를 취득하고 유전자 공학적으로 개변하여 기질 특이성을 개변하는 어프로치도 시도되어 있다.
한편, 글루코오스에 대한 특이성과는 별도로 효소의 안정성이 문제가 되는 경우가 있다. 특허문헌 1(일본공개특허 2015-139376)은 광물인 스멕타이트를 첨가하여 글루코오스 디히드로게나아제의 안정성을 높이는 방법을 기재하고 있다.
특허문헌 2(국제공개 제2005/054840호 팜플렛)는 헤마토크리트값을 고정밀도 및 고신뢰성으로 측정함으로써 혈액 성분량을 충분히 정확하게 보정 가능한 혈액 성분의 측정 방법 및 이에 이용하는 센서 및 장치를 제공하는 것을 목적으로 하며, 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 장치를 기재하고 있다. 단락 0027에는 효소 안정화제로서 당 알코올이 열거되며 말티톨이 바람직하다고 되어 있다. 또한, 실시예에서는 말티톨이 이용되고 있다.
특허문헌 3(일본공개특허 2005-114359)은 복잡한 보정 공정을 필요로 하지 않고 성분의 측정 방법 및 센서를 제공하는 것을 목적으로 하며, 혈액 중의 글루코오스의 측정 방법 및 이에 이용하는 센서를 기재하고 있다. 단락 0016에는 효소 안정화제로서 당 알코올이 열거되며 말티톨이 바람직하다고 되어 있다. 실시예에서는 말티톨이 이용되고 있다.
특허문헌 4(국제공개 제2001/025776호 팜플렛)는 PQQ-GDH를 이용한 글루코오스 센서를 기재하고 있다. 제8페이지에는 바이오 센서의 반응층에 안정화제를 첨가해도 되는 것의 기재가 있고, 안정화제로서 당의 개시가 있다. 또한, 당이 열거되어 있고 글루코오스 및 말토오스의 기재가 있다. 실시예에 안정화제로서 당을 이용한 것의 기재는 눈에 띄지 않는다.
특허문헌 5(일본공개특허 2009-195250)는 가용성 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법을 기재하고 있고, 아스페르길루스 오리재 또는 아스페르길루스 테레우스 유래 FAD-GDH 재조합체 및 트레할로스를 포함하는 조성물을 기재하고 있다.
특허문헌 6(일본공개특허 2014-018096)은 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법을 기재하고 있다.
특허문헌 1: 일본공개특허 2015-139376(일본특허 제6402887호) 특허문헌 2: 국제공개 제2005/054840호 팜플렛 특허문헌 3: 일본공개특허 2005-114359 특허문헌 4: 국제공개 제2001/025776호 팜플렛 특허문헌 5: 일본공개특허 2009-195250(일본특허 제5176045호) 특허문헌 6: 일본공개특허 2014-018096(일본특허 제6101011호)
비특허문헌 1: Frias, et. al., Diabetes Care, Vol. 33, No. 4, April 2010, pp. 728-729 비특허문헌 2: Tsujimura S, et. al., Biosci Biotechnol Biochem., Vol. 70, 2006, pp. 654-659 비특허문헌 3: Satake R, et. al., J Biosci Bioeng., Vol. 120, 2015, pp. 498-503
본 개시는 글루코오스 아날로그인 저분자 화합물을 이용함으로써 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법 및 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기의 문제를 감안하여 새로운 GDH 효소를 탐색하는 어프로치나 기존의 GDH에 변이를 도입하여 그 기질 특이성을 개변하는 어프로치와는 다른 방법에 의해 말토오스 등의 글루코오스가 아닌 당류에의 반응을 개변시키는 방법에 대해 면밀히 검토하였다. 그 결과, 특정의 글루코오스 아날로그인 저분자 화합물이 놀랍게도 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 글루코오스가 아닌 당류(예를 들어 말토오스)에의 반응성을 개변시키는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉 본 개시는 이하의 실시형태를 포함한다.
[1] 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 이용함으로써 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법으로서, FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 이용하여 글루코오스 측정을 행할 때에 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 공존시키는 것을 포함하고, 상기 개변제의 부재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)와 비교하여, 상기 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)가 개변되는, 상기 방법.
[2] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 실시형태 1에 기재된 방법.
[3] 글루코오스 디히드로게나아제가 무코르속 또는 아스페르길루스속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제인, 실시형태 1 또는 2에 기재된 방법.
[4] 글루코오스 디히드로게나아제가 고상 표면에 고정화되어 있는, 실시형태 1~3 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 글루코오스 디히드로게나아제가 고상 표면에 고정화되지 않은, 실시형태 1~3 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제로서, 상기 개변제는 글루코오스의 아날로그인 저분자 화합물이며, 상기 개변제의 부재하에서의 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)와 비교하여, 상기 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)가 개변되는, 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제.
[7] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 실시형태 6에 기재된 개변제.
[8] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, D-만니톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 실시형태 6에 기재된 개변제.
[9] 글루코오스 디히드로게나아제가 무코르속 또는 아스페르길루스속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제인, 실시형태 6~8 중 어느 하나에 기재된 개변제.
[10] 실시형태 6~9 중 어느 하나에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 고상 표면에 고정화된 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 시스템.
[11] 실시형태 6~9 중 어느 하나에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 고상 표면에 고정화되지 않은 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 시스템.
[12] 실시형태 6~9 중 어느 하나에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
[13] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 개별 시약으로서 포함하는, 실시형태 12에 기재된 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
[14] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 동일 시약 중에 포함하는, 실시형태 12에 기재된 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
[15] 실시형태 6~9 중 어느 하나에 기재된 개변제 또는 실시형태 10 혹은 11에 기재된 시스템 또는 실시형태 12~14 중 어느 하나에 기재된 조성물 혹은 시약을 이용한, 글루코오스 측정 방법.
[16] 이하의 공정을 포함하는, 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 스크리닝 방법,
i) 글루코오스 디히드로게나아제를 마련하는 공정,
ii) 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
iii) 상기 i)의 글루코오스 디히드로게나아제와 글루코오스의 아날로그인 저분자 화합물인 후보 물질을 접촉시키고, 그 후 후보 물질의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
iv) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)와 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)를 비교하는 공정 및
v) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)보다 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)가 개변되어 있는 경우에는 상기 후보 물질을 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제로 하는 공정.
[17] 실시형태 16에 기재된 방법에 의해 동정(同定)된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물에 배합하는 것을 포함하는, 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물의 제조 방법.
[18] 실시형태 16에 기재된 방법에 의해 동정된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정 시약.
[19] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 포함하는 전극, 여기서 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 상기 전극.
[20] 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 포함하는 전지, 여기서 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 상기 전지.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본특허출원번호 2019-058223호 및 일본특허출원번호 2019-182592호의 개시 내용을 포함한다.
본 개시에 의해 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변할 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 제공한다. 본 개시의 기질 특이성 개변제는 글루코오스의 아날로그(유사체)일 수 있다. 본 명세서에서 글루코오스의 아날로그란 글루코오스와 화학 구조가 유사하지만 글루코오스 디히드로게나아제에 의해 기질로 인식되지 않는 당 화합물 또는 당 알코올 화합물을 말한다. 글루코오스 아날로그는 저분자 화합물일 수 있다. 여기서 말하는 저분자 화합물이란 분자량(g/mol)이 약 90~약 380인 화합물, 예를 들어 약 150~약 380인 화합물을 말한다. 또한, 글루코오스 디히드로게나아제에 의해 기질로 인식되지 않는다는 것은 글루코오스 디히드로게나아제에 의해 기질로서 전혀 인식되지 않거나 또는 실질적으로 기질로서 인식되지 않는 것을 말한다. 실질적으로 기질로서 인식되지 않는다는 것은 구체적으로는 글루코오스를 기질로 한 경우의 활성(반응성)을 100%로 하면 글루코오스 아날로그에 대한 활성이 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.01% 이하, 0.005% 이하, 0.001% 이하, 예를 들어 0.0005% 이하인 것을 말한다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 L-굴로오스, D-이디톨, L-이디톨, 소르비톨, 리비톨(CAS no. 488-81-3, 아도니톨이라고도 함), 트레할로스 및 D-글루칼, 및 D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서 본 개시의 기질 특이성 개변제는 L-굴로오스, D-이디톨, L-이디톨, 소르비톨, 리비톨, 트레할로스, D-글루칼, D-만니톨, 크실리톨, 글리세롤 또는 그 하나 이상의 조합이다.
본 개시의 기질 특이성 개변제가 L-굴로오스(CAS No. 6027-89-0)를 포함하는 경우, 이는 L체 및 D체의 혼합물, 예를 들어 라세미체로서 제공되어도 되고, 또는 L체로서 제공되어도 된다. 본 명세서에서 어떤 광학 활성의 화합물에 대해 L체란 예를 들어 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee에서 L체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어 L-굴로오스는 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee의 것일 수 있다.
본 개시의 기질 특이성 개변제가 D-이디톨(CAS no. 25878-23-3)을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 D체로서 제공된다. 본 명세서에서 어떤 광학 활성의 화합물에 대해 D체란 예를 들어 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee에서 D체가 존재하는 것을 말한다. 예를 들어 D-이디톨은 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee의 것일 수 있다.
본 개시의 기질 특이성 개변제가 L-이디톨(CAS no. 488-45-9)을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 L체로서 제공된다. 예를 들어 L-이디톨은 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee의 것일 수 있다.
본 개시의 기질 특이성 개변제가 D-글루칼(CAS no. 13265-84-4)을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 D체로서 제공된다. 예를 들어 D-글루칼은 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee의 것일 수 있다.
본 개시의 기질 특이성 개변제가 D-만니톨(CAS no. 69-65-8)을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 D체로서 제공된다. 예를 들어 D-만니톨은 광학 순도 90~100%ee, 예를 들어 95~100%ee, 예를 들어 97~100%ee의 것일 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 스멕타이트를 포함하지 않는다.
본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 글루코오스 측정시에서의 측정 용액 중에서의 최종농도가 0.1mM~1000mM, 예를 들어 0.1mM~500mM, 0.1mM~300mM, 0.1mM~100mM, 0.1mM~80mM, 0.1mM~70mM, 0.1mM~60mM, 0.1mM~50mM, 0.2mM~20mM, 0.25mM~10mM, 예를 들어 5mM가 되도록 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물에 배합될 수 있다. 어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 수용액을 전극에 도포하여 건조시킬 수 있다. 이 경우, 건조시에 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 농축되어 건조 전의 최종농도보다 높은 농도가 되는 것이 예상된다. 이러한 건조 후의 고농도에서의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 이 개변제가 도포된 전극도 본 개시에 포함된다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약을 제공한다. 어떤 실시형태에서 글루코오스 측정 시약은 용액 형태 또는 건조 형태일 수 있다. 어떤 실시형태에서 글루코오스 측정 시약 중의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제는 개별 시약으로서 포함될 수 있다. 다른 실시형태에서는 글루코오스 측정 시약 중의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제는 동일 시약 중에 포함될 수 있다. 추가적인 실시형태에서는 글루코오스 측정 시약은 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하지 않고, 이 경우 글루코오스 디히드로게나아제는 글루코오스 측정시에 측정 용액에 첨가될 수 있다. 다른 실시형태에서는 글루코오스 측정 시약은 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 포함하지 않고, 이 경우 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 글루코오스 측정시에 측정 용액에 첨가될 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 이용한 글루코오스 측정 방법을 제공한다. 글루코오스 측정 방법은 글루코오스의 농도를 측정하는 방법일 수 있다. 글루코오스 측정 방법은 글루코오스의 농도를 정량하는 방법일 수 있다. 측정되는 시료는 글루코오스를 포함하는 것일 수 있다. 측정되는 시료는 말토오스를 포함하는 것일 수 있다. 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 글루코오스 측정 시약에 미리 포함되어도 되고, 또는 글루코오스 측정시에 측정 용액에 첨가되어도 된다.
본 개시의 글루코오스 측정법에서는 측정시에 있어서 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 0.1mM~1000mM, 예를 들어 0.1mM~500mM, 0.1mM~300mM, 0.1mM~100mM, 0.1mM~80mM, 0.1mM~70mM, 0.1mM~60mM, 0.1mM~50mM, 0.2mM~20mM, 0.25mM~10mM, 예를 들어 5mM의 최종농도로 측정 용액에 포함될 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정법에서는 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 글루코오스 측정 용액에 포함되어 있어도 된다. 이 경우, 상기 글루코오스 측정 용액에 글루코오스 디히드로게나아제 및 시료를 첨가하여 측정을 개시해도 된다. 혹은 글루코오스 디히드로게나아제를 전극에 고정화하고, 상기 글루코오스 측정 용액 및 시료를 전극에 접촉시켜 글루코오스 측정을 행해도 된다.
다른 실시형태에서는 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 미리 글루코오스 측정 시약에 포함되어 있어도 된다. 이 측정 시약은 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 것이어도 되고, 또는 포함하지 않는 것일 수 있다. 측정 시약이 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 경우, 여기에 시료를 첨가하여 글루코오스 측정을 개시할 수 있다. 측정 시약이 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하지 않는 경우, 여기에 시료 및 글루코오스 디히드로게나아제를 (임의의 순으로) 첨가하여 글루코오스 측정을 개시할 수 있다. 혹은 글루코오스 디히드로게나아제를 전극에 고정화하고, 상기 측정 시약 및 시료를 전극에 접촉시켜 글루코오스 측정을 행해도 된다.
본 명세서에서는 특별히 언급하지 않는 한 글루코오스 디히드로게나아제란 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 말한다. 글루코오스 디히드로게나아제로서 공지의 FAD-GDH를 이용할 수 있다. 공지의 FAD-GDH의 유래 미생물의 적합한 예로서는 털곰팡이아문, 바람직하게는 털곰팡이강, 보다 바람직하게는 털곰팡이목, 더욱 바람직하게는 털곰팡이과로 분류되는 미생물을 들 수 있다. 구체적으로는 무코르(Mucor)속, 아브시디아(Absidia)속, 악티노뮤코르(Actinomucor)속, 시르시넬라(Circinella)속 유래의 FAD-GDH 등을 들 수 있다.
Mucor속으로 분류되는 미생물로서, 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는 Mucor prainii, Mucor javanicus, Mucor circinelloides f. circinelloides, Mucor guilliermondii, Mucor hiemalis f. silvaticus, Mucor subtilissimus, Mucor dimorphosporus 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 Mucor prainii, Mucor javanicus, Mucor circinelloides f. circinelloides, Mucor guilliermondii NBRC9403, Mucor hiemalis, Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754, Mucor subtilissimus NBRC6338, Mucor RD056860, Mucor dimorphosporus NBRC5395 등을 들 수 있다. Absidia속으로 분류되는 미생물로서, 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는 Absidia cylindrospora, Absidia hyalospora를 들 수 있다. Actinomucor속으로 분류되는 미생물로서, 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는 Actinomucor elegans를 들 수 있다. Circinella속으로 분류되는 미생물로서, 구체적인 바람직한 미생물의 예로서는 Circinella minor, Circinella mucoroides, Circinella muscae, Circinella rigida, Circinella simplex, Circinella umbellata를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 Circinella minor NBRC6448, Circinella mucoroides NBRC4453, Circinella muscae NBRC6410, Circinella rigida NBRC6411, Circinella simplex NBRC6412, Circinella umbellata NBRC4452, Circinella umbellata NBRC5842, Circinella RD055423 및 Circinella RD055422를 들 수 있다. 또, NBRC 균주 및 RD 균주는 NBRC(독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 바이오테크놀로지 센터)의 보관 균주이다. 이들 FAD-GDH에는 그 변이체도 포함된다.
다른 공지의 FAD-GDH로서는 아스페르길루스속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 아스페르길루스 오리재 유래 GDH, 아스페르길루스 아와모리 유래 GDH, 아스페르길루스 아우레우스 유래 GDH, 아스페르길루스 니거 유래 GDH, 아스페르길루스 포에티두스 유래 GDH, 아스페르길루스 이이즈카에 유래 GDH, 아스페르길루스 버시컬러 유래 GDH, 아스페르길루스 포에닉스 유래 GDH, 아스페르길루스 비스포러스 유래 GDH, Aspergillus brunneo-uniseriatus 유래 GDH, Aspergillus carneus 유래 GDH, Aspergillus malignus 유래 GDH 및 아스페르길루스 테레우스 유래 GDH를 들 수 있다. 이들 FAD-GDH에는 그 변이체도 포함된다.
다른 공지의 FAD-GDH로서는 글로메라속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 Glomerella fructigena 유래 GDH, 예를 들어 Glomerella fructigena NBRC5951주 유래 GDH, Glomerella cingulata 유래 GDH, 예를 들어 Glomerella cingulata NBRC107000주 유래 GDH, 콜레토트리쿰속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 Colletotrichum gloeosporioides 유래 GDH, Colletotrichum chlorophyti 유래 GDH, Colletotrichum orbiculare 유래 GDH, 보트리오스페리아속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 Botryosphaeria parva 유래 GDH를 들 수 있다. 또한, 부르크홀데리아속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 막단백질인 Burkhorderia cepacia 유래 GDH, Burkhorderia cepacia KS1주 유래 GDH를 들 수 있다. 예를 들어 일본공개특허 2019-000020(일본특허 제6453385호), 국제공개 제2017/002896호, 국제공개 제2002/036779호(일본특허 제4107386호) 등을 참조할 것. 이들 FAD-GDH에는 그 변이체도 포함된다.
(FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 취득)
FAD-GDH를 코딩하는 유전자는 유전자 공학적 수법에 의해 취득할 수 있다. FAD-GDH 유전자를 취득하려면 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법을 이용하면 된다. 예를 들어 FAD-GDH 생산능을 갖는 공지의 미생물 균체나 여러 가지의 세포로부터 통상의 방법에 의해 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989)에 기재된 방법에 의해 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 나아가 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.
다음으로 공지의 FAD-GDH의 아미노산 서열 정보에 기초하여 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 기질 특이성이 높은 FAD-GDH 유전자를 선발하는 방법, 혹은 상기 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프라이머 DNA를 제작하고, 5'RACE법이나 3'RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR법)에 의해 기질 특이성이 높은 FAD-GDH를 코딩하는 목적의 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시키고, 이들 DNA 단편을 연결시켜 목적의 FAD-GDH 유전자의 전체길이를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.
취득된 FAD-GDH 유전자에 변이를 도입하여 각종 변이 유전자로부터 발현되는 FAD-GDH의 효소 과학적 성질을 지표로 선택을 행하는 방법을 채용할 수 있다.
출발 물질인 FAD-GDH 유전자의 변이 처리는 기도하는 변이 형태에 따른 공지의 임의의 방법으로 행할 수 있다. 즉, FAD-GDH 유전자 혹은 이 유전자가 도입된 재조합체 DNA와 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법; 자외선 조사법; 유전자 공학적 수법; 또는 단백질 공학적 수법을 구사하는 방법 등을 널리 이용할 수 있다.
상기 변이 처리에 이용되는 변이원이 되는 약제로서는 예를 들어 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 아질산, 아황산, 히드라진, 포름산 혹은 5-브로모우라실 등을 들 수 있다.
이 접촉·작용의 여러 가지 조건은 이용하는 약제의 종류 등에 따른 조건을 채용하는 것이 가능하고, 현실적으로 원하는 변이를 FAD-GDH 유전자에서 야기할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 통상 바람직하게는 0.5~12M의 상기 약제 농도에서 20~80℃의 반응 온도하에서 10분간 이상, 바람직하게는 10~180분간 접촉·작용시킴으로써 원하는 변이를 야기 가능하다. 자외선 조사를 행하는 경우에서도 상기와 같이 통상의 방법에 따라 행할 수 있다(현대화학, p24~30, 1989년 6월호).
단백질 공학적 수법을 구사하는 방법으로서는 일반적으로 Site-Specific Mutagenesis로서 알려진 수법을 이용할 수 있다. 예를 들어 Kramer법(Nucleic Acids Res., 12, 9441(1984): Methods Enzymol., 154, 350(1987): Gene, 37, 73(1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13, 8749(1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765(1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679(1986)), Kunkel법(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488(1985): Methods Enzymol., 154, 367(1987)) 등을 들 수 있다. DNA 중의 염기 서열을 변환하는 구체적인 방법으로서는 예를 들어 시판의 키트(Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech사, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 제품, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene 제품 등)의 이용을 들 수 있다.
또한, 일반적인 폴리메라아제 체인 리액션(Polymerase Chain Reaction)으로서 알려진 수법을 이용할 수도 있다(Technique, 1, 11(1989)). 또, 상기 유전자 개변법 외에 유기 합성법 또는 효소 합성법에 의해 직접 원하는 FAD-GDH 유전자를 합성할 수도 있다.
상기와 같은 임의의 방법에 의해 선택된 FAD-GDH 유전자의 DNA 염기 서열의 결정 또는 확인을 행하는 경우에는 예를 들어 멀티캐필러리 DNA 해석 시스템 CEQ2000(벡크만-쿨터사 제품) 등을 이용하면 된다.
(FAD-GDH 유전자가 삽입된 벡터 및 숙주 세포)
상술한 바와 같이 얻어진 FAD-GDH 유전자를 통상의 방법에 의해 박테리오파지, 코스미드, 또는 원핵 세포 혹은 진핵 세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 등의 벡터에 도입하고, 각각의 벡터에 대응하는 숙주 세포를 통상의 방법에 의해 형질 전환 또는 형질 도입을 할 수 있다.
원핵 숙주 세포의 일례로서는 에쉐리히아속에 속하는 미생물, 예를 들어 대장균 K-12주, 에쉐리히아 콜리 BL21(DE3), 에쉐리히아 콜리 JM109, 에쉐리히아 콜리 DH5α, 에쉐리히아 콜리 W3110, 에쉐리히아 콜리 C600 등(모두 다카라 바이오사 제품)을 들 수 있다. 이들을 형질 전환하거나 또는 이들에 형질 도입하여 DNA가 도입된 숙주 세포(형질전환체)를 얻는다. 이러한 숙주 세포에 재조합 벡터를 이입하는 방법으로서는 예를 들어 숙주 세포가 에쉐리히아 콜리에 속하는 미생물인 경우에는 칼슘 이온의 존재하에서 재조합 DNA의 이입을 행하는 방법 등을 채용할 수 있다. 나아가 일렉트로포레이션법을 이용해도 된다. 더욱이 시판의 컴피턴트 세포(예를 들어 ECOS Competent 에쉐리히아 콜리 BL21(DE3); 니폰 진 제품)를 이용해도 된다.
진핵 숙주 세포의 일례로서는 효모를 들 수 있다. 효모로 분류되는 미생물로서는 예를 들어 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 삽입 유전자에는 형질 전환된 세포를 선택하는 것을 가능하게 하기 위한 마커 유전자가 포함되어 있어도 된다. 마커 유전자로서는 예를 들어 URA3, TRP1과 같은, 숙주의 영양 요구성을 상보하는 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 삽입 유전자는 숙주 세포 중에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 프로모터 또는 그 밖의 제어 서열(예를 들어 인핸서 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열 등)을 포함하는 것이 바람직하다. 프로모터로서는 구체적으로 예를 들어 GAL1 프로모터, ADH1 프로모터 등을 들 수 있다. 효모로의 형질 전환 방법으로서는 공지의 방법, 예를 들어 아세트산 리튬을 이용하는 방법(MethodsMol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))이나 일렉트로포레이션(J Microbiol Methods 55 (2003) 481-484) 등을 적합하게 이용할 수 있지만, 이에 한정되지 않고, 스페로플라스트법이나 글라스비즈법 등을 포함하는 각종 임의의 수법을 이용하여 형질 전환을 행하면 된다.
또한, 예를 들어 진핵 숙주 세포의 다른 예로서는 아스페르길루스(Aspergillus)속이나 트리코데르마(Tricoderma)속과 같은 곰팡이 세포를 들 수 있다. 곰팡이 세포의 형질전환체의 제작 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 통상의 방법에 따라 FAD-GDH를 코딩하는 유전자가 발현하는 형태로 숙주 사상균에 삽입하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 발현 유도 프로모터 및 터미네이터의 사이에 삽입한 DNA 컨스트럭트(construct)를 제작하고, 다음으로 FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 컨스트럭트에서 숙주 사상균을 형질 전환함으로써 FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 과잉 발현하는 형질전환체를 얻을 수 있다. 본 명세서에서는 숙주 사상균을 형질 전환하기 위해 제작된, 발현 유도 프로모터-FAD-GDH를 코딩하는 유전자-터미네이터로 이루어지는 DNA 단편 및 이 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 DNA 컨스트럭트라고 총칭하여 부른다.
FAD-GDH를 코딩하는 유전자가 발현하는 형태로 숙주 사상균에 삽입하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상동 재조합을 이용함으로써 숙주 생물의 염색체 상에 직접적으로 삽입하는 수법; 플라스미드 벡터 상에 연결함으로써 숙주 사상균 내에 도입하는 수법 등을 들 수 있다.
상동 재조합을 이용하는 방법에서는 염색체 상의 재조합 부위의 상류 영역 및 하류 영역과 상동인 서열의 사이에 DNA 컨스트럭트를 연결하여 숙주 사상균의 게놈 중에 삽입할 수 있다. 자신의 고발현 프로모터 제어하에서 숙주 사상균 내에서 과잉 발현함으로써 셀프 클로닝에 의한 형질전환체를 얻을 수 있다. 고발현 프로모터는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 번역 신장 인자인 TEF1 유전자(tef1)의 프로모터 영역, α-아밀라아제 유전자(amy)의 프로모터 영역, 알칼리 프로테아제 유전자(alp) 프로모터 영역 등을 들 수 있다.
벡터를 이용하는 방법에서는 DNA 컨스트럭트를 통상의 방법에 의해 사상균의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 벡터에 도입하고 대응하는 숙주 사상균을 통상의 방법에 의해 형질 전환할 수 있다.
이러한 적합한 벡터-숙주계로서는 숙주 사상균 중에서 FAD-GDH를 생산시킬 수 있는 계이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 pUC19 및 사상균의 계, pSTA14(Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989) 및 사상균의 계 등을 들 수 있다.
DNA 컨스트럭트는 숙주 사상균의 염색체에 도입하여 이용하는 것이 바람직하지만, 그 밖의 방법으로서 자율 복제형 벡터(Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133(1995))에 DNA 컨스트럭트를 도입함으로써 염색체에 도입하지 않는 형태로 이용할 수도 있다.
DNA 컨스트럭트에는 형질 전환된 세포를 선택하는 것을 가능하게 하기 위한 마커 유전자가 포함되어 있어도 된다. 마커 유전자는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 pyrG, niaD, adeA와 같은, 숙주의 영양 요구성을 상보하는 유전자; 피리티아민, 하이그로마이신 B 올리고마이신 등의 약제에 대한 약제 내성 유전자 등을 들 수 있다. 또한, DNA 컨스트럭트는 숙주 세포 중에서 FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 과잉 발현하는 것을 가능하게 하는 프로모터, 터미네이터 그 밖의 제어 서열(예를 들어 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등)을 포함하는 것이 바람직하다. 프로모터는 특별히 한정되지 않지만 적당한 발현 유도 프로모터나 구성적 프로모터를 들 수 있고, 예를 들어 tef1 프로모터, alp 프로모터, amy 프로모터 등을 들 수 있다. 터미네이터도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 alp 터미네이터, amy 터미네이터, tef1 터미네이터 등을 들 수 있다.
DNA 컨스트럭트에서 FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 발현 제어 서열은 삽입하는 FAD-GDH를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 발현 제어 기능을 가지고 있는 서열을 포함하는 경우는 반드시 필요하지 않다. 또한, 공형질 전환법에 의해 형질 전환을 행하는 경우에는 DNA 컨스트럭트는 마커 유전자를 가지지 않아도 되는 경우가 있다.
DNA 컨스트럭트의 일 실시형태는 예를 들어 pUC19의 멀티 클로닝 사이트에 있는 In-Fusion Cloning Site에 tef1 유전자 프로모터, FAD-GDH를 코딩하는 유전자, alp 유전자 터미네이터 및 pyrG 마커 유전자를 연결시킨 DNA 컨스트럭트이다.
사상균으로의 형질 전환 방법으로서는 당업자에게 알려진 방법을 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어 숙주 사상균의 프로토플라스트를 조제한 후에 폴리에틸렌글리콜 및 염화칼슘을 이용하는 프로토플라스트 PEG법(예를 들어 Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, 일본공개특허 2007-222055호 공보 등을 참조)을 이용할 수 있다. 형질 전환 사상균을 재생시키기 위한 배지는 이용하는 숙주 사상균과 형질 전환 마커 유전자에 따라 적절한 것을 이용한다. 예를 들어 숙주 사상균으로서 아스페르길루스 소야를 이용하고 형질 전환 마커 유전자로서 pyrG 유전자를 이용한 경우는 형질 전환 사상균의 재생은 예를 들어 0.5% 한천 및 1.2M 소르비톨을 포함하는 Czapek-Dox 최소 배지(디프코사)에서 행할 수 있다.
또한, 예를 들어 형질 전환 사상균을 얻기 위해 상동 재조합을 이용하여 숙주 사상균이 본래 염색체 상에 갖는 FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 프로모터를 tef1 등의 고발현 프로모터로 치환해도 된다. 이 때도 고발현 프로모터에 더하여 pyrG 등의 형질 전환 마커 유전자를 삽입하는 것이 바람직하다. 예를 들어 이 목적을 위해 일본공개특허 2011-239681에 기재된 실시예 1이나 도 1을 참조하여 FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 상류 영역-형질 전환 마커 유전자-고발현 프로모터-FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 전부 또는 부분으로 이루어지는 형질 전환용 카세트 등을 이용할 수 있다. 이 경우, FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 상류 영역 및 FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 전부 또는 부분이 상동 재조합을 위해 이용된다. FAD-GDH를 코딩하는 유전자의 전부 또는 부분은 개시 코돈으로부터 도중의 영역을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 상동 재조합에 적합한 영역의 길이는 0.5kb 이상인 것이 바람직하다.
형질 전환 사상균이 제작되었음의 확인은 FAD-GDH의 효소 활성이 인정되는 조건하에서 형질 전환 사상균을 배양하고, 다음으로 배양 후에 얻어진 배양물에서의 FAD-GDH의 활성을 확인함으로써 행할 수 있다.
또한, 형질 전환 사상균이 제작되었음의 확인은 형질 전환 사상균으로부터 염색체 DNA를 추출하고 이를 주형으로 하여 PCR을 행하여 형질 전환이 일어난 경우에 증폭이 가능한 PCR 산물이 발생하는 것을 확인함으로써 행해도 된다.
예를 들어 이용한 프로모터의 염기 서열에 대한 포워드 프라이머와, 형질 전환 마커 유전자의 염기 서열에 대한 리버스 프라이머의 조합으로 PCR을 행하여 예상(想定)한 길이의 산물이 발생하는 것을 확인한다.
(FAD-GDH 효소의 제조 방법)
FAD-GDH 효소는 상술한 바와 같이 취득한 FAD-GDH를 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포 중에 포함되는 FAD-GDH 유전자를 발현시키며, 다음으로 상기 배양물로부터 FAD-GDH를 분리함으로써 제조하면 된다.
상기 숙주 세포를 배양하는 배지로서는 예를 들어 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 고기 엑기스, 콘 스티프 리쿼 혹은 대두 혹은 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에 염화나트륨, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 혹은 황산 망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 추가로 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것이 이용된다.
배지의 초발 pH는 한정되지 않지만, 예를 들어 pH 6~9로 조정할 수 있다. 배양은 10~42℃의 배양 온도, 바람직하게는 25℃ 전후의 배양 온도에서 4시간~1주간, 더욱 바람직하게는 25℃ 전후의 배양 온도에서 4시간~5일간 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시하면 된다.
배양 종료 후 이 배양물로부터 FAD-GDH 효소를 채취한다. 이에는 통상적인 공지의 효소 채취 수단을 이용하면 된다. 예를 들어 통상의 방법에 의해 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나 혹은 리소자임이나 야탈라제 등의 용균 효소를 이용하여 본 효소를 추출하거나 또는 톨루엔 등의 존재하에서 진탕 혹은 방치하여 용균을 행하게 하여 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고 이 용액을 여과, 원심분리 등을 하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염 혹은 황산 망간 등에 의해 핵산을 제거한 후 이에 유안, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고 침전물을 채취하여 FAD-GDH의 조효소를 얻는다.
FAD-GDH의 조효소를 공지의 임의의 수단을 이용하여 더욱 정제할 수도 있다. 정제된 효소 표품을 얻으려면 예를 들어 세파덱스, 울트로겔 혹은 바이오겔 등을 이용하는 겔 여과법; 이온 교환체를 이용하는 흡착 용출법; 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법; 히드록시 아파타이트를 이용하는 흡착 용출법; 자당 밀도 구배 원심법 등의 침강법; 어피니티 크로마토그래피법; 분자체막 혹은 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 또는 이들을 조합하여 실시함으로써 정제된 FAD-GDH 효소 표품을 얻을 수 있다.
어떤 실시형태에서 글루코오스 디히드로게나아제는 고상에 고정화되어 있어도 된다. 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제가 고정화된 고상을 포함하는, 글루코오스 측정 키트 또는 글루코오스 측정 시스템(장치)을 제공한다. 고상으로서는 비즈나 입자, 폴리머, 전극 표면 등을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 어떤 실시형태에서 글루코오스 디히드로게나아제는 전극에 고정화되어 있어도 된다. 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제가 고정화된 전극을 포함하는, 글루코오스 측정 시스템(장치)을 제공한다.
(글루코오스 디히드로게나아제의 고정화 방법)
글루코오스 디히드로게나아제는 임의의 공지의 방법에 의해 고상에 고정화될 수 있다. 글루코오스 디히드로게나아제를 비즈나 막, 탄소 입자, 금 입자, 백금 입자, 폴리머, 전극 표면에 고정화해도 된다. 고정화 방법으로서는 가교 시약을 이용하는 방법, 고분자 매트릭스 중에 봉입하는 방법, 투석막으로 피복하는 방법, 광가교성 폴리머, 도전성 폴리머, 산화 환원 폴리머 등이 있고 글루코오스 디히드로게나아제를 폴리머 중에 고정 혹은 전극 상에 흡착 고정해도 되고, 또한 이들을 조합하여 이용해도 된다. 전형적으로는 글루타르알데히드를 이용하여 글루코오스 디히드로게나아제를 카본 전극 상에 고정화한 후 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹한다. 어떤 실시형태에서는 글루코오스 디히드로게나아제를 고상 표면에 고정화할 때에 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 존재시켜도 된다.
어떤 실시형태에서는 글루코오스 디히드로게나아제를 전극에 고정화하여 이용하는 경우, 또는 글루코오스 디히드로게나아제를 고정화하지 않고 이용하는 경우, 메디에이터로서 공지의 메디에이터, 예를 들어 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트(mPMS), 5-메틸페나지늄메틸설페이트(PMS), 5-에틸페나지늄메틸설페이트(PES) 등의 페나진계 화합물, 페노티아진계 화합물, 페리시안화 칼륨 등의 페리시안화물, 페로센, 디메틸페로센, 페로센카르본산 등의 페로센계 화합물, 나프토퀴논, 안트라퀴논, 히드로퀴논, 피로로퀴놀린퀴논 등의 퀴논계 화합물, 시토크롬계 화합물, 벤질비올로겐이나 메틸비올로겐 등의 비올로겐계 화합물, 디클로로페놀인도페놀 등의 인도페놀계 화합물, 염화 헥사암민루테늄 등의 루테늄 착체, 오스뮴-2,2'-비피리딘 등의 오스뮴 착체, p-페닐렌디아민, N-이소프로필-N'-페닐-p-페닐렌디아민(IPPD), N',N-디페닐-p-페닐렌디아민(DPPD), N-(1,3-디메틸부틸)-N'-페닐-p-페닐렌디아민, N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-페닐렌디아민 등의 페닐렌디아민계 화합물을 이용할 수 있다. 또한, 이들 메디에이터는 폴리비닐이미다졸, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산 등의 폴리머에 수식되어 이용할 수도 있다. 또한, 이들 메디에이터는 GDH에 가교 시약 등을 이용하여 고정화할 수도 있다. 또한, 이들 메디에이터는 일본특허 제6484741호 및 일본특허 6484742호를 참조하여 소수성 상호작용에 의해 전극에 고정화할 수도 있다. 참조에 의해 이들 모든 내용을 본 명세서에 도입한다. 또한, 이들 메디에이터는 전극 표면을 산처리 등을 하여 활성화시킨 후에 전극에 고정화할 수도 있다. 전극은 탄소, 금, 백금 등의 소재 등을 이용할 수 있다.
시료 용액에 첨가하는 메디에이터의 최종농도는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 1pM~1M, 1pM~100mM, 1pM~20mM, 1pM~10mM, 1pM~5mM, 2pM~1mM, 3pM~800μM, 4pM~600μM, 5pM~500μM, 6pM~400μM, 7pM~300μM, 8pM~200μM, 9pM~100μM, 10pM~50μM의 범위일 수 있다. 또, 메디에이터와 다른 시약의 첨가 순서는 제한되지 않고, 동시에도 되고 순차 첨가로도 된다.
어떤 실시형태에서 산화 환원 반응을 행하는 시간 또는 전기 화학적 측정을 행하는 시간은 60분 이하, 30분 이하, 10분 이하, 5분 이하 또는 1분 이하로 할 수 있다. 또는 장기간 측정하는 효소 센서나 전지 등에서는 산화 환원 반응을 행하는 시간은 60분 이상, 120분 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 1주간 이상, 2주간 이상, 3주간 이상으로 할 수 있다.
특별히 언급하지 않는 한 조성물에 포함되는 글루코오스 디히드로게나아제 혹은 전극에 고정화된 글루코오스 디히드로게나아제는 정제된 글루코오스 디히드로게나아제 효소이다.
(글루코오스 디히드로게나아제의 활성 측정)
글루코오스 디히드로게나아제(GDH)의 활성 측정을 설명한다. GDH(EC 1.1.99.10)는 글루코오스의 수산기를 산화하여 글루코노-δ-락톤을 생성하는 반응을 촉매한다. 이 때 전자 수용체가 전자를 수취하여 환원형 전자 수용체가 된다. GDH의 활성은 이 작용 원리를 이용하여, 예를 들어 전자 수용체로서 페나진메토설페이트(PMS) 및 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 이용한 이하의 측정계를 이용하여 측정할 수 있다.
(반응 1) D-글루코오스 + PMS(산화형)
→ D-글루코노-δ-락톤 + PMS(환원형)
(반응 2) PMS(환원형) + DCIP(산화형)
→ PMS(산화형) + DCIP(환원형)
구체적으로 우선 (반응 1)에서 D-글루코오스의 산화에 따라 PMS(환원형)가 생성된다. 이어서 진행되는 (반응 2)에 의해 PMS(환원형)가 산화됨에 따라 DCIP가 환원된다. 이 「DCIP(산화형)」의 소실 정도를 파장 600nm에서의 흡광도의 변화량으로서 검지하고, 이 변화량에 기초하여 효소 활성을 구할 수 있다.
GDH의 활성은 이하의 순서에 따라 측정할 수 있다. 100mM 인산 완충액(pH 7.0) 2.05mL, 1M D-글루코오스 용액 0.6mL 및 2mM DCIP 용액 0.15mL를 혼합하여 37℃에서 5분간 보온한다. 다음으로 15mM PMS 용액 0.1mL 및 효소 샘플 용액 0.1mL를 첨가하여 반응을 개시한다. 반응 개시시 및 경시적인 흡광도를 측정하고, 효소 반응의 진행에 따른 600nm에서의 흡광도의 1분간당 감소량(ΔA600)을 구하여 다음 식에 따라 GDH 활성을 산출한다. 이 때, GDH 활성은 37℃에서 농도 200mM의 D-글루코오스 존재하에서 1분간 1μmol의 DCIP를 환원하는 효소량을 1U로 정의한다.
Figure pct00001
또, 식 중의 3.0은 반응 시약+효소 시약의 액량(mL), 16.3은 본 활성 측정 조건에서의 밀리몰 분자 흡광 계수(㎠/μmol), 0.1은 효소 용액의 액량(mL), 1.0은 셀의 광로 길이(cm), ΔA600blank는 100mM 인산 완충액(pH 7.0)을 효소 샘플 용액 대신에 첨가하여 반응 개시한 경우의 600nm에서의 흡광도의 1분간당 감소량, df는 희석 배수를 나타낸다.
본 개시의 글루코오스 측정용 키트는 적어도 1회의 어세이에 충분한 양의 기질 특이성 개변제를 포함한다. 전형적으로 본 개시의 글루코오스 측정용 키트는 기질 특이성 개변제에 더하여 글루코오스 디히드로게나아제, 어세이에 필요한 완충액, 캘리브레이션 커브 제작을 위한 글루코오스 기질 표준 용액 및 지침을 포함한다. 기질 표준 용액은 글루코오스 표준 용액일 수 있다. 또, 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성을 평가하는 경우에는 농도를 이미 알고 있는 말토오스 기질 표준 용액을 이용할 수도 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정용 키트는 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 동일 시약으로서 포함한다. 다른 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정용 키트는 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 각각의 시약으로서 포함한다. 다른 실시형태에서는 글루코오스 디히드로게나아제는 전극에 고정화되어 있어도 되고, 이러한 전극에 대해 이용하는 본 개시의 글루코오스 측정용 키트는 기질 특이성 개변제를 단일 시약으로서 포함한다. 단 여기서 말하는 단일 시약이란 그 시약이 기질 특이성 개변제 이외의 물질을 포함하지 않는 것을 의미하는 것은 아니다. 기질 특이성 개변제는 용액 상태로도 되고 건조 상태, 예를 들어 분말로도 된다.
비색법을 이용한 일례로서 글루코오스 농도의 측정을 들 수 있다. 글루코오스 농도의 측정은 비색식 측정용의 경우는 예를 들어 이하와 같이 행할 수 있다. 반응층에는 글루코오스 디히드로게나아제(GDH), 그리고 반응 촉진제로서 N-(2-아세트아미드)이미드 2아세트산(ADA), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄(Bis-Tris), 탄산나트륨 및 이미다졸로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 액상 혹은 고체상의 조성물을 보유시켜 둔다. 여기서, 필요에 따라 pH 완충제, 발색 시약(변색 시약)을 첨가한다. 여기에 글루코오스를 포함하는 시료를 더하여 일정 시간 반응시킨다. 이 동안에 GDH로부터 전자를 직접 수취함으로써 중합하여 생성하는 색소 혹은 환원된 색소의 최대 흡수 파장에 상당하는 흡광도를 모니터링한다. 레이트법이면 흡광도의 시간당 변화율로부터, 엔드 포인트법이면 시료 중의 글루코오스가 전부 산화된 시점까지의 흡광도 변화로부터, 미리 표준 농도의 글루코오스 용액을 이용하여 제작한 캘리브레이션 커브를 기초로 하여 시료 중의 글루코오스 농도를 산출할 수 있다.
이 방법에서 사용할 수 있는 발색 시약(변색 시약)으로서는 예를 들어 2,6-디클로로인도페놀(DCIP)을 전자 수용체로서 첨가하여 600nm에서의 흡광도의 감소를 모니터링함으로써 글루코오스의 정량이 가능하다. 또한, 발색 시약으로서 니트로테트라졸륨 블루(NTB)를 더하여 570nm 흡광도를 측정함으로써 생성되는 디포르마잔의 양을 결정하여 글루코오스 농도를 산출하는 것이 가능하다. 또, 말할 필요도 없이 사용하는 발색 시약(변색 시약)은 이들에 한정되지 않는다.
(효소 센서)
어떤 실시형태에서 글루코오스는 효소 센서에 의해 검출 또는 측정될 수 있다. 효소 센서는 글루코오스 디히드로게나아제가 고정화된 전극을 포함할 수 있다. 또한, 전극에는 상기 메디에이터가 흡착되어 있어도 된다. 효소 센서의 전극으로서는 예를 들어 카본 전극, 금 전극, 백금 전극 등을 들 수 있고, 이 전극 상에 글루코오스 디히드로게나아제를 도포 또는 고정화할 수 있다. 나아가 도전성 재료로서 Co, Pd, Rh, Ir, Ru, Os, Re, Ni, Cr, Fe, Mo, Ti, Al, Cu, V, Nb, Zr, Sn, In, Ga, Mg, Pb, Au, Pt, Ag 중 적어도 1종류의 원소를 포함하는 금속 미립자가 포함되어 있어도 되고, 이들은 합금이어도 되고, 도금을 실시한 것이어도 된다. 카본으로서 카본 나노 튜브나 카본 블랙, 그래파이트, 풀러렌 및 그 유도체 등도 포함된다. 어떤 실시형태에서 효소 센서는 글루코오스 센서일 수 있다. 즉, 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 센서를 이용하는 글루코오스의 검출 방법 또는 측정 방법을 제공한다. 상기 글루코오스 센서는 지속 혈당 측정이나 연속 글루코오스 모니터링에 사용 가능하다.
본 개시의 기질 특이성 개변제를 포함하는 조성물 또는 시약은 글루코오스 디히드로게나아제를 고정화한 전극 또는 효소 센서 등과 함께 포텐쇼스탯이나 갈바노스탯 등을 이용하여 여러 가지의 전기 화학적 측정에 이용할 수 있다. 전기 화학적 측정법으로서는 암페로메트리, 예를 들어 크로노암페로메트리, 포텐셜 스텝-크로노암페로메트리, 볼타메트리, 예를 들어 사이클릭볼타메트리, 미분 펄스 볼타메트리, 포텐쇼메트리, 쿨로메트리 등의 다양한 수법을 들 수 있다. 예를 들어 글루코오스 측정에서는 암페로메트리법에 의해 글루코오스가 환원될 때의 전류를 측정함으로써 시료 중의 글루코오스 농도를 산출할 수 있다. 인가전압은 조건이나 장치의 설정에도 따르지만, 예를 들어 -1000mV~+1000mV(vs. Ag/AgCl) 등으로 할 수 있다.
전극으로서 인쇄 전극을 이용할 수도 있다. 이에 의해 측정에 필요한 용액량을 저감할 수 있다. 전극은 절연 기판 상에 형성할 수 있다. 구체적으로 포토리소그래피 기술이나 스크린 인쇄, 그라비아 인쇄, 플렉소 인쇄 등의 인쇄 기술에 의해 전극을 기판 상에 형성시킬 수 있다. 절연 기판의 소재로서는 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등을 들 수 있고, 각종 용매나 약품에 대한 내성이 강한 것을 이용할 수 있다. 또한, 전극의 기반으로서 카본클로스나 카본페이퍼, 버키페이퍼를 이용할 수도 있다. 작용극의 면적은 원하는 응답 전류에 따라 설정할 수 있다. 예를 들어 어떤 실시형태에서는 작용극의 면적을 1㎟ 이상, 1.5㎟ 이상, 2㎟ 이상, 2.5㎟ 이상, 3㎟ 이상, 4㎟ 이상, 5㎟ 이상, 6㎟ 이상, 7㎟ 이상, 8㎟ 이상, 9㎟ 이상, 10㎟ 이상, 12㎟ 이상, 15㎟ 이상, 20㎟ 이상, 30㎟ 이상, 40㎟ 이상, 50㎟ 이상, 1㎠ 이상, 2㎠ 이상, 3㎠ 이상, 4㎠ 이상, 5㎠ 이상, 예를 들어 10㎠ 이상으로 할 수 있다. 어떤 실시형태에서는 작용극의 면적을 10㎠ 이하, 5㎠ 이하, 예를 들어 1㎠ 이하로 할 수 있다. 반대극도 동일할 수 있다. 또한, 작용극 상에 카본 나노 튜브나 그래핀, 케첸 블랙 등을 고정화하여 겉보기의 표면적을 크게 할 수도 있다. 이 경우, 겉보기의 면적은 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 1000배 이상 늘어날 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은
i) 글루코오스 디히드로게나아제를 마련하는 공정,
ii) 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
iii) 상기 i)의 글루코오스 디히드로게나아제와 후보 물질을 접촉시키고, 그 후 후보 물질의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
iv) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)와 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)를 비교하는 공정 및
v) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)보다 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)가 개변되어 있는 경우에는 그 후보 물질을 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제로 하는 공정을 포함한다. 후보 물질은 글루코오스의 아날로그인 저분자 화합물일 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 유효 농도를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은
i) 글루코오스 디히드로게나아제 및 제1 농도, 제2 농도, …제n 농도의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 마련하는 공정(n은 자연수),
ii) 상기 제1 농도, 제2 농도, … 및 제n 농도의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 존재하에서의 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 각각 결정하는 공정,
iii) 각 농도에서의 비(Mal/Glu)를 비교하여 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 유효 농도를 확인하는 공정
을 포함한다. 예를 들어 어떤 실시형태에서 특정의 농도(n)에서의 비(Mal/Glu)가 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 첨가하지 않은 경우의 비(Mal/Glu)와 실질적으로 동일하면 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 유효 농도의 하한값은 상기 특정의 농도(n)로 하거나 그보다 높게 설정할 수 있다. 어떤 실시형태에서 특정의 농도(n)에서의 비(Mal/Glu)가 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 농도(n-1)로 첨가한 경우의 비(Mal/Glu)와 실질적으로 동일하면 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 유효 농도의 상한값은 상기 특정의 농도(n)로 하거나 그보다 낮게 설정할 수 있다. 단, 농도(n)는 농도(n-1)보다 고농도로 한다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 스크리닝 방법에 의해 동정된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물에 배합하는 것을 포함하는, 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물의 제조 방법을 제공한다. 또한, 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 스크리닝 방법에 의해 동정된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는 글루코오스 측정 시약을 제공한다.
글루코오스 디히드로게나아제의, 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)는 이하의 순서로 결정할 수 있다. 카본 인쇄 전극에 N-이소프로필-N'-페닐-p-페닐렌디아민(IPPD)을 흡착 고정하고, 글루코오스 디히드로게나아제, 예를 들어 무코르속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제 또는 아스페르길루스속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제를 글루타르알데히드에 의해 가교 고정한다. 작용 전극, 반대극, 참조극의 3극 전극을 이용하여 +250mV(Ag/AgCl)의 전위를 인가하고 크로노암페로메트리를 행한다. 이 때, 전류값이 충분히 안정된 후, 인산 완충 생리식염수(PBS) 중에서 최종농도 1mM가 되도록 말토오스를 첨가한다(예를 들어 측정 개시로부터 100초 후에 첨가). 다음으로 말토오스 첨가 후 다시 전류값이 충분히 안정된 후, 인산 완충 생리식염수(PBS) 중에서 최종농도 1mM가 되도록 글루코오스를 첨가한다(예를 들어 말토오스 첨가로부터 100초 후에 첨가). 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성은 글루코오스에 대한 반응성을 100%로 하였을 때의 말토오스에 대한 반응성을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 명세서에서 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비를 Mal/Glu로 표기하는 경우가 있다. 반응성을 응답 전류에 의해 평가하는 경우에는 반응성의 비를 응답 전류의 비라고 할 수 있다.
예를 들어 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 부재하에서 어떤 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu가 0.50%인 경우, 동일한 측정 조건으로, 단 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu가 0.50% 미만이면 말토오스에 대한 반응성이 저감되어 있고, 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성이 개변되었다고 할 수 있다. 이러한 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 글루코오스 측정에서의 말토오스의 영향을 저감시킬 수 있다. 또, 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 부재하에서의 어떤 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu라는 상대값을 100%로 규정해도 된다. 이 경우, 동일한 측정 조건으로, 단 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu가 100% 미만이면 말토오스에 대한 반응성이 저감되어 있고, 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성이 개변되었다고 할 수 있다. 또한, 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu가 100% 이상이면 말토오스에 대한 반응성이 증대되어 있고, 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성이 개변되었다고 할 수 있다.
어떤 실시형태에서 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 부재하에서의 어떤 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu를 100%로 한 경우, 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu 비는 99% 이하, 98% 이하, 97% 이하, 96% 이하, 95% 이하, 94% 이하, 93% 이하, 92% 이하, 91% 이하, 90% 이하, 89% 이하, 88% 이하, 87% 이하, 86% 이하, 85% 이하, 84% 이하, 83% 이하, 82% 이하, 81% 이하, 80% 이하, 79% 이하, 78% 이하, 77% 이하, 76% 이하, 75% 이하, 74% 이하, 73% 이하, 72% 이하, 71% 이하, 70% 이하, 69% 이하, 68% 이하, 67% 이하, 66% 이하, 65% 이하, 64% 이하, 63% 이하, 62% 이하, 61% 이하, 60% 이하, 59% 이하, 58% 이하, 57% 이하, 56% 이하, 55% 이하, 54% 이하, 53% 이하, 52% 이하, 51% 이하, 50% 이하, 49% 이하, 48% 이하, 47% 이하, 46% 이하, 45% 이하, 44% 이하, 43% 이하, 42% 이하, 41% 이하, 40% 이하, 39% 이하, 38% 이하, 37% 이하, 36% 이하, 35% 이하, 34% 이하, 33% 이하, 32% 이하, 31% 이하, 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 예를 들어 1% 이하, 예를 들어 실질적으로 0%, 예를 들어 0%, 예를 들어 99%~0%, 99%~1%, 98%~2%, 97%~3%, 96%~4%, 95%~5%, 94%~6%, 93%~7%, 92%~8%, 91%~9%, 90%~10%, 89%~11%, 88%~12%, 87%~13%, 86%~14%, 85%~15%, 84%~16%, 83%~17%, 82%~18%, 81%~19%, 80%~20%, 79%~21%, 78%~22%, 77%~23%, 76%~24%, 75%~25%, 74%~26%, 73%~27%, 72%~28%, 71%~29%, 70%~30%, 69%~31%, 68%~32%, 67%~33%, 66%~34%, 65%~35%, 64%~36%, 63%~37%, 62%~38%, 61%~39%, 60%~40%, 59%~41%, 58%~42%, 57%~43%, 56%~44%, 55%~45%, 54%~46%, 53%~47%, 52%~48%, 51%~49%, 예를 들어 50%일 수 있다.
어떤 실시형태에서 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 부재하에서의 어떤 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu를 100%로 한 경우, 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 Mal/Glu 비는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 220% 이상, 240% 이상, 260% 이상, 280% 이상, 300% 이상, 예를 들어 110%~300%, 120%~280%, 130%~260%, 140%~240%, 150%~220%, 160%~200%, 예를 들어 170%~190%일 수 있다. 특별히 언급하지 않는 한 본 개시에서의 수치 범위는 상한값 및 하한값도 포함하는 것으로 한다(예를 들어 수치 범위 a~b는 a 이상 또한 b 이하를 의미한다). 또한, 본 개시는 수치 범위에 대해 예시되는 상한값과 하한값의 모든 조합을 포함하는 것으로 한다.
특정의 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 GDH의 기질 특이성을 개변할 수 있는 것은 다음 작용 메커니즘에 의한 것으로 생각된다. 즉, 글루코오스 디히드로게나아제는 그 기질 포켓에 의해 글루코오스를 인식하여 작용하는 것이 알려져 있는데, 글루코오스와 유사한 화학 구조를 갖는 화합물(글루코오스 아날로그)이 먼저 기질 포켓에 들어가 그 기질 포켓에 글루코오스 이외의 협잡당, 예를 들어 말토오스가 들어가는 것을 방해하는 것으로 생각된다. 또, 글루코오스는 C6 화합물이며, 글리세롤은 C3 화합물이지만 글리세롤은 글루코오스의 일부분과 구조가 일치한다고 볼 수도 있고, 또한 글리세롤에 대해서도 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 작용을 볼 수 있었기 때문에 글리세롤이 기질 포켓에 들어가 있거나 또는 기질 포켓과 상호작용하고 있는 것으로 생각된다.
본 개시에 의해 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변할 수 있다. 또한, 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 다른 방법과 조합하는 것도 가능하다. 예를 들어 기질 특이성이 높은 글루코오스 디히드로게나아제를 탐색하여 발견한 새로운 글루코오스 디히드로게나아제를 본 개시의 GDH 기질 특이성 개변제와 조합하여 이용할 수 있다. 또한, 예를 들어 GDH의 기질 특이성을 개변하여 개변된 GDH 변이체를 본 개시의 GDH 기질 특이성 개변제와 조합하여 이용할 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정법에 이용되는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 L-굴로오스, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 소르비톨, 리비톨 및 트레할로스, 및 D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함해도 되고, 글루코오스 디히드로게나아제는 무코르속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 Mucor prainii 유래 GDH(MpGDH)이어도 되고, 이 FAD-GDH는 전극에 고정화되어 있어도 되고 또는 고정화되지 않아도 된다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정법에 이용되는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 L-굴로오스, D-이디톨, D-글루칼, 소르비톨, 리비톨 및 트레할로스, 및 D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함해도 되고, 글루코오스 디히드로게나아제는 무코르속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 Mucor RD056860 GDH(MrdGDH)이어도 되고, 이 FAD-GDH는 전극에 고정화되어 있어도 되고 또는 고정화되지 않아도 된다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 글루코오스 측정법에 이용되는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 L-굴로오스, D-이디톨, D-글루칼, 리비톨 및 트레할로스, 및 D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함해도 되고, 글루코오스 디히드로게나아제는 아스페르길루스속 유래의 FAD-GDH, 예를 들어 아스페르길루스 오리재 또는 아스페르길루스 테레우스 유래 FAD-GDH 혹은 GLD1이어도 되고, 이 FAD-GDH는 전극에 고정화되어 있어도 되고 또는 고정화되지 않아도 된다.
본 개시의 기질 특이성 개변제를 이용함으로써 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변할 수 있다. 이에 의해 글루코오스 디히드로게나아제를 이용하여 시료의 글루코오스 농도를 측정할 때에 말토오스에 의한 영향을 저감할 수 있고 보다 정확한 글루코오스 농도 측정이 가능해진다. 이는 당뇨병 환자의 혈당치 관리 등에 유용할 수 있다.
(본 개시의 전극)
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 포함하는 전극을 제공한다. 어떤 실시형태에서 전극은 애노드 전극일 수 있다. 어떤 실시형태에서 본 개시의 애노드 전극은 글루코오스 디히드로게나아제를 가진다. 어떤 실시형태에서 글루코오스 디히드로게나아제는 전지가 갖는 전극에 고정화되어 있어도 된다. 어떤 실시형태에서 본 개시의 애노드 전극은 캐소드 전극과 저항을 조합하여 전지를 제공할 수 있다. 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 전지를 이용하는 발전 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서는 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 포함하는 전지가 제공된다.
(본 개시의 연료 전지)
어떤 실시형태에서 본 개시는 연료 전지용 애노드 또는 캐소드 및 이 애노드 또는 캐소드를 구비한 연료 전지를 제공한다. 이 연료 전지는 본 개시의 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 포함한다. 어떤 실시형태에서 본 개시는 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 포함하는 전지를 사용한 발전 방법, 및 글루코오스 디히드로게나아제를 애노드 전극에 고정화하고, 글루코오스 디히드로게나아제에 대응한 기질, 예를 들어 글루코오스를 연료로 하여 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 존재하에서 발전을 행하는 방법을 제공한다.
어떤 실시형태에서 본 개시의 연료 전지는 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제, 애노드 또는 캐소드, 연료조, 캐소드, 글루코오스 디히드로게나아제를 갖는 애노드 및 전해질을 구비하고 있다. 애노드 또는 캐소드에는 인공 전자 메디에이터를 흡착시켜도 된다. 인공 전자 메디에이터로서는 상기에 기재된 공지의 메디에이터나 일본특허 제6484741호 및 일본특허 6484742호에 기재된 페닐렌디아민계 화합물을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 개시의 연료 전지는 필요에 따라 애노드와 캐소드의 사이에 부하 저항을 배치할 수 있고 이를 위한 배선을 구비할 수 있다. 어떤 실시형태에서 부하 저항은 본 개시의 연료 전지의 일부이다. 어떤 실시형태에서 부하 저항은 본 개시의 연료 전지의 일부가 아니며, 본 개시의 연료 전지는 적당한 부하 저항에 접속할 수 있도록 구성되어 있다. 본 개시의 연료 전지에서 산화 환원 효소(GDH)는 애노드의 일부를 구성한다. 예를 들어 산화 환원 효소는 애노드에 근접 혹은 접촉하고 있어도 되고, 고정화되어 있어도 되고, 또는 흡착되어 있어도 된다. 연료조는 전극에 고정화된 산화 환원 효소의 기질이 되는 화합물을 포함한다. 예를 들어 글루코오스 디히드로게나아제를 전극에 고정화한 경우, 연료는 글루코오스일 수 있다. 어떤 실시형태에서 본 개시의 연료 전지는 애노드와 캐소드를 분리하는 이온 교환막을 가질 수 있다. 이온 교환막은 1nm~20nm의 구멍을 가질 수 있다. 애노드는 탄소 전극과 같은 일반적인 전극일 수 있다. 예를 들어 카본 블랙, 그래파이트, 활성탄 등의 도전성 탄소질로 이루어지는 전극이나 금, 백금 등의 금속으로 이루어지는 전극을 이용할 수 있다. 구체적으로 카본페이퍼, 카본클로스, 글래시카본, 카본 나노 튜브, HOPG(고배향성 열분해 그래파이트) 등을 들 수 있다. 쌍을 이루는 캐소드로서는 예를 들어 백금이나 백금 합금 등 연료 전지에서 일반적으로 이용되고 있는 전극 촉매를 카본 블랙, 그래파이트, 활성탄과 같은 탄소질 재료 또는 금, 백금 등으로 이루어지는 도전체에 담지시킨 전극이나 백금이나 백금 합금 등의 전극 촉매 그 자체로 이루어지는 도전체를 캐소드 전극으로서 이용하여 산화제(캐소드측 기질, 산소 등)를 전극 촉매에 공급하는 것과 같은 형태로 할 수 있다.
다른 실시형태에서는 상기와 같은 기질 산화형 효소 전극으로 이루어지는 애노드와 쌍을 이루는 캐소드로서 기질 환원형 효소 전극을 사용할 수 있다. 산화제를 환원하는 산화 환원 효소로서는 라카아제나 빌리루빈 옥시다아제 등 공지의 효소를 들 수 있다. 산화제를 환원하는 촉매로서 산화 환원 효소를 이용하는 경우에는 필요에 따라 공지의 전자 전달 메디에이터를 이용해도 된다. 산화제로서는 산소 등을 들 수 있다.
어떤 실시형태에서 캐소드에서의 전극 반응을 방해하는 불순물(아스코르빈산이나 요산 등)에 의한 영향을 회피하기 위해 산소 선택성의 막(예를 들어 디메틸폴리실록산의 막)을 캐소드 전극의 주위에 배치할 수 있다.
본 개시의 발전 방법은 산화 환원 효소를 갖는 애노드에 연료가 되는 산화 환원 효소의 기질이 되는 화합물을 공급하는 공정을 포함한다. 산화 환원 효소를 갖는 애노드에 연료가 공급되면 기질이 산화되고, 동시에 생성된 전자를 산화 환원 효소는 이 산화 효소와 전극 사이의 전자 전달을 중개하는 전자 전달 메디에이터, 예를 들어 페닐렌디아민계 화합물로 건네주고, 이 전자 전달 메디에이터에 의해 도전성 기재(애노드 전극)에 전자가 주어진다. 애노드 전극으로부터 배선(외부 회로)을 지나 전자가 캐소드 전극에 도달함으로써 전류가 발생한다.
상기 과정에서 발생하는 프로톤(H+)은 전해질 용액 내를 캐소드 전극까지 이동한다. 그리고 캐소드 전극에서는 전해질 용액 내를 애노드로부터 이동해 온 프로톤과, 외부 회로를 거쳐 애노드측으로부터 이동해 온 전자와, 산소나 과산화수소 등의 산화제(캐소드측 기질)가 반응하여 물이 생성된다. 이를 이용하여 발전을 행할 수 있다.
어떤 실시형태에서 애노드의 연료로서 생체 내의 글루코오스를 이용할 수 있다. 이 경우, 생체 내의 말토오스와 반응해 버리면 예상 이상의 전류가 흐르는 경우도 있을 수 있고, 전류를 제어하기 위해서는 글루코오스에만 작용하는 기질 특이성이 글루코오스 디히드로게나아제에 요구된다고 생각된다. 본 개시의 기질 특이성 개변제는 이러한 용도에도 이용할 수 있다.
본 개시의 몇 가지 설명에서는 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성과 글루코오스에 대한 반응성의 비(Mal/Glu)를 「개변할」 수 있다고 표현하였다. 여기서 말하는 「개변」은 「증대」 및 「저감」을 포함할 수 있다. 예를 들어 글루코오스 농도를 측정함에 있어서 말토오스의 영향을 저감하고 싶은 경우는 비(Mal/Glu)를 저감하는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들어 글루코오스와 말토오스의 혼합물을 연료로 하는 연료 전지에 글루코오스 디히드로게나아제를 이용하는 경우, 보다 높은 전류값을 얻기 위해 비(Mal/Glu)를 증대시키는 것이 바람직하다. 따라서, 어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제의 비(Mal/Glu)를 저감하는 방법뿐만 아니라 비(Mal/Glu)를 증대시키는 방법 및 이를 위한 기질 특이성 개변제를 제공한다. 이들 실시형태에서는 각 설명에서의 「개변」을 「저감」 또는 「증대」로 바꾸어 읽는 것으로 한다. 본 개시에 의하면 글루코오스 디히드로게나아제를 유전자 조작에 의해 개변하지 않고 상기 기질 특이성 개변제를 이용하여 GDH의 기질 특이성을 용도에 따라 변화시킬 수 있다.
어떤 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 이용함으로써 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하기 위한, 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 사용을 제공한다. 다른 실시형태에서 본 개시는 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성의 개변에 사용하기 위한, 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 제공한다. 어떤 실시형태에서 본 개시의 방법은 의료 행위를 포함하지 않는다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 예증한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] Mucor속 유래 GDH 유전자의 숙주에의 도입과 GDH 활성의 확인
일본특허 제4648993호에 기재된 Mucor속 유래 GDH(MpGDH)의 아미노산 서열을 서열번호 1에, 염기 서열을 서열번호 2에 나타낸다. 일본공개특허 2013-176363호의 개시를 참고로 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 MrdGDH를 코딩하는 염기 서열을 전체합성하였다(서열번호 4). 플라스미드 pUC19의 멀티 클로닝 사이트에 대상 유전자인 MpGDH 유전자 또는 MrdGDH 유전자를 통상의 방법에 의해 삽입시킨 DNA 컨스트럭트를 제작하였다. 구체적으로 pUC19는 In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크사)에 부속되어 있는 pUC19 linearized Vector를 이용하였다. pUC19의 멀티 클로닝 사이트에 있는 In-Fusion Cloning Site에서 MpGDH 유전자 또는 MrdGDH 유전자를 상기한 In-Fusion HD Cloning Kit를 사용하여 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 연결하여 컨스트럭트용 플라스미드(pUC19-MpGDH, pUC19-MrdGDH)를 얻었다.
이들 유전자를 누룩곰팡이(Aspergillus sojae; 아스페르길루스 소야)에서 발현시켜 그 GDH 활성을 평가하였다.
구체적으로 MpGDH 또는 MrdGDH를 취득하는 것을 목적으로 하여 GDH 유전자를 이용하여 Double-joint PCR(Fungal Genetics and Biology, 2004년, 제41권, p. 973-981)을 행하여 5'아암 영역-pyrG 유전자-TEF1 프로모터 유전자-플라빈 결합형 GDH 유전자-3'아암 영역으로 이루어지는 카세트를 구축하고, 하기의 순서로 아스페르길루스 소야 NBRC4239주 유래 pyrG 파괴주(pyrG 유전자의 상류 48bp, 코드 영역 896bp, 하류 240bp 결손주)의 형질 전환에 이용하였다. 또, pyrG 유전자는 우라실 영양 요구성 마커이다. 500ml용 삼각 플라스크 중의 20mM 우리딘을 포함하는 폴리펩톤덱스트린 액체 배지 100ml에 아스페르길루스 소야 NBRC4239주 유래 pyrG 파괴주의 분생자를 접종하고 30℃에서 약 20시간 진탕 배양을 행한 후 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 프로토플라스트를 조제하였다. 얻어진 프로토플라스트 및 20μg의 대상 유전자 삽입 DNA 컨스트럭트를 이용하여 프로토플라스트 PEG법에 의해 형질 전환을 행하고, 다음으로 0.5%(w/v) 한천 및 1.2M 소르비톨을 포함하는 Czapek-Dox 최소 배지(디프코사; pH 6)를 이용하여 30℃, 5일간 이상 인큐베이트하여 콜로니 형성능이 있는 것으로서 형질 전환 아스페르길루스 소야를 얻었다.
얻어진 형질 전환 아스페르길루스 소야는 우리딘 요구성을 상보하는 유전자인 pyrG가 도입됨으로써 우리딘 무첨가 배지에 생육할 수 있게 됨으로써 목적의 유전자가 도입된 주로서 선택할 수 있었다. 얻어진 균주 중에서 목적의 형질전환체를 PCR로 확인하여 선발하였다.
MpGDH 또는 MrdGDH의 유전자에 의해 형질 전환된 형질 전환 아스페르길루스 소야를 이용하여 각각의 GDH 생산을 행하였다.
200ml용 삼각 플라스크 중의 DPY 액체 배지(1%(w/v) 폴리펩톤, 2%(w/v) 덱스트린, 0.5%(w/v) 효모 엑기스, 0.5%(w/v) KH2PO4, 0.05%(w/v) MgSO4·7H20; pH 미조정) 40ml에 각 균주의 분생자를 접종하고 30℃에서 4일간 160rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 다음으로 배양 후의 배양물로부터 균체를 여과하여 얻어진 배지 상청 분획을 Amicon Ultra-15, 30K NMWL(밀리포어사 제품)에서 10mL까지 농축·탈염하여 150mM NaCl을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)으로 치환하였다. 이어서 150mM NaCl을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)으로 평형화한 HiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE 헬스케어사 제품)에 어플라이하여 이 완충액에서 용출시키며 GDH 활성을 나타내는 분획을 회수하여 MpGDH의 정제 표품을 얻었다. 마찬가지로 하여 MrdGDH의 정제 표품을 얻었다. 또, 이들 효소는 그 FAD 결합 부위를 통해 FAD와 결합되어 있는 상태의 것이다(홀로효소).
[실시예 2] 고정화 효소를 이용하였을 때의 기질 특이성 개변제의 효과
12mg/ml의 MpGDH 정제 표품을 10μL, 15mM의 각 글루코오스 아날로그를 10μL, 20mM 인산 K완충액을 10μL 혼합하여 2시간 이상 정치하였다. SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens사 제품, 제품번호 DRP-C110) 상에 N-이소프로필-N'-페닐-p-페닐렌디아민(IPPD)을 흡착 고정시키고, 각 MpGDH를 12μg분을 도포하여 실온 건조시켰다. 마지막으로 25%의 글루타르알데히드 증기 중에 전극을 넣어 얻어진 전극을 순수로 세정하여 IPPD·MpGDH 고정화 전극으로 하였다. 다음으로 전용 커넥터(DRP-CAC)를 이용하여 ALS 전기 화학 애널라이저 814D에 접속하고, PBS 중에 IPPD·GDH 고정화 전극과 Ag/AgCl 참조극, 백금 반대극을 침지시켜 크로노암페로메트리 측정을 행하였다. 인가전압은 +250mV(Ag/AgCl)로 하였다. 이 때, 전류값이 충분히 안정된 후(측정 개시로부터 약 100초 후), PBS 중에서 최종농도 1mM가 되도록 말토오스를 첨가하였다. 다음으로 말토오스 용액 첨가 후 다시 전류값이 충분히 안정된 후(말토오스 첨가로부터 약 100초 후), 최종농도 1mM가 되도록 글루코오스 용액을 첨가하였다. 말토오스 첨가 전후의 응답 전류의 차이를 말토오스의 응답 전류값으로 기록하고, 글루코오스 첨가 전후의 응답 전류의 차이를 글루코오스의 응답 전류값으로 기록하였다. 말토오스의 응답 전류값을 글루코오스의 응답 전류값으로 나눈 값을 말토오스/글루코오스(%)로서 산출하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 소르비톨, 리비톨, L-굴로오스, D-이디톨은 기질 특이성을 개변시켰다. 나아가 기질 특이성 개변제를 첨가하지 않은 MpGDH의 말토오스/글루코오스를 100%로 한 경우, D-글루칼을 첨가한 경우는 69%가 되며 기질 특이성을 개변시켰다.
Figure pct00002
마찬가지로 하여 Glucose Dehydrogenase(FAD-dependent)(BBI사 제품, Product Code: GLD1, 이하 GLD1로 표기함)를 이용하여 기질 특이성 개변제의 효과를 검증하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. L-굴로오스, D-이디톨, L-이디톨, 트레할로스, D-글루칼은 기질 특이성을 개변시켰다.
Figure pct00003
마찬가지로 하여 MrdGDH를 이용하여 기질 특이성 개변제의 효과를 검증하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 소르비톨, D-이디톨, 트레할로스, D-글루칼은 기질 특이성을 개변시켰다.
Figure pct00004
[실시예 3] 고정화되지 않은 효소를 이용하였을 때의 기질 특이성 개변제의 효과
12mg/ml의 MpGDH 정제 표품을 10μL, 15mM의 각 글루코오스 아날로그를 10μL, 20mM 인산 K완충액을 10μL 혼합하여 2시간 이상 정치하였다. SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens사 제품, 제품번호 DRP-C110) 상에 PBS를 80μL, 각 MpGDH 용액을 5μL, 2mg/ml의 mPMS 용액을 10μL 도포·혼합시켰다. 인가전압은 +100mV(Ag/Ag+)로 하여 크로노암페로메트리 측정을 행하였다. 전류값이 충분히 안정된 후(측정 개시로부터 약 100초 후), 최종농도 5mM가 되도록 말토오스 용액을 첨가하고 피펫팅에 의해 혼합하였다. 전류값이 충분히 안정된 곳에서 측정을 멈추고 말토오스 첨가 전후의 차이를 말토오스의 응답 전류값으로 하였다. 또, 말토오스 용액 대신에 순수를 등량 첨가한 바, 응답 전류의 증가는 볼 수 없었다. 사용한 인쇄 전극을 초순수로 충분히 세정하여 건조시켜 상기와 같이 크로노암페로메트리 측정을 행하였다. 말토오스 용액 대신에 글루코오스 용액을 첨가하여 글루코오스의 응답 전류값을 계측하였다. 말토오스의 응답 전류값을 글루코오스의 응답 전류값으로 나눈 값을 말토오스/글루코오스(%)로서 산출하였다. MpGDH의 말토오스/글루코오스를 100%로 한 경우, 소르비톨을 첨가한 경우는 67%가 되며, 리비톨을 첨가한 경우는 58%가 되며, L-굴로오스을 첨가한 경우는 56%가 되며, D-이디톨을 첨가한 경우는 84%가 되며, L-이디톨을 첨가한 경우는 68%가 되며, 트레할로스를 첨가한 경우는 72%가 되며 기질 특이성을 개변시켰다. 효소를 고정화하지 않은 경우에는 L-이디톨은 기질 특이성 개변제로서 작용하는 것을 알 수 있었다.
마찬가지로 하여 GLD1을 이용하여 기질 특이성 개변제의 효과를 검증하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 리비톨, L-굴로오스, L-이디톨, 트레할로스, D-글루칼은 기질 특이성을 개변시켰다.
Figure pct00005
마찬가지로 하여 MrdGDH를 이용하여 기질 특이성 개변제의 효과를 검증하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 소르비톨, 리비톨, L-굴로오스, D-이디톨, 트레할로스는 기질 특이성을 개변시켰다.
Figure pct00006
[실시예 4] 카본클로스 전극을 이용하였을 때의 기질 특이성 개변제의 효과
80μl의 N'N-디페닐-p-페닐렌디아민(DPPD)을 흡착 고정한 다층 카본 나노 튜브 용액(1.4wt%, MWCNT 용액)을 가로세로 5mm의 카본클로스(토요 테크니카사 제품)에 복수회로 나누어 도포하였다. 이를 충분히 건조시킨 후 초순수를 이용하여 세정을 행하였다. 이어서 40mg/ml 야생형 MpGDH와 초순수에 용해한 100mM 각종 글루코오스 아날로그 20μl를 등량 혼합한 용액을 MWCNT/DPPD 고정화 전극에 20μl 도포하고 실온에서 건조시킨 후 25% 글루타르알데히드 증기 중에 20분간 넣음으로써 MpGDH를 가교 고정하였다. 그 후, 상기와 같이 초순수로 세정을 행하여 MWCNT/DPPD/MpGDH 고정화 전극으로 하였다. 다음으로 이를 ALS 전기 화학 애널라이저 814D에 접속하고, PBS 중에 MWCNT/DPPD/MpGDH 고정화 전극, Ag/AgCl 참조극 및 백금 반대극을 침지시켜 크로노암페로메트리 측정을 행하였다. 인가전압은 +250mV(Ag/AgCl)로 하였다. 이 때, 전류값이 충분히 안정된 후(측정 개시로부터 약 100초 후), PBS 중에서 최종농도 1mM가 되도록 말토오스를 첨가하였다. 다음으로 말토오스 용액 첨가 후 다시 전류값이 충분히 안정된 후(말토오스 첨가로부터 약 50초 후), 최종농도 1mM가 되도록 글루코오스 용액을 첨가하였다. 말토오스 첨가 전후의 응답 전류의 차이를 말토오스의 응답 전류값으로서 기록하고, 글루코오스 첨가 전후의 응답 전류의 차이를 글루코오스의 응답 전류값으로서 기록하였다. 말토오스의 응답 전류값을 글루코오스의 응답 전류값으로 나눈 값을 말토오스/글루코오스(%)로서 산출하였다. 이들 결과를 하기의 표에 나타낸다. L-굴로오스, L-이디톨, D-만니톨, 글리세롤 및 크실리톨은 GDH의 기질 특이성을 개변시켰다. 또한, 전극의 형상에 관계없이 각종 글루코오스 아날로그는 GDH의 기질 특이성을 개변할 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00007
[실시예 5] 카본클로스 전극에서의 기질 특이성 개변제의 조합에 의한 효과
실시예 4와 같이 MWCNT/DPPD/MpGDH 고정화 전극을 제작하였다. 단, 40mg/ml 야생형 MpGDH 20μl와 초순수에 용해한 100mM 글리세롤 및 100mM L-이디톨을 각각 10μl 혼합한 용액을 MWCNT/DPPD 고정화 전극에 20μl 도포하는 공정만 바꾸어 제작하였다. 그 후, 실시예 4에 기재된 방법으로 크로노암페로메트리 측정을 행하여 말토오스/글루코오스(%)를 산출하였다. 그 결과, 기질 특이성 개변제를 첨가하지 않은 MpGDH의 말토오스/글루코오스 응답 전류비를 100%로 한 경우, 글리세롤과 L-이디톨을 모두 첨가한 경우는 8%가 되며 기질 특이성을 개변시켰다. 따라서, 25mM의 L-이디톨 및 글리세롤을 모두 첨가한 경우, 50mM의 각 물질을 단독으로 이용한 경우와 비교하여 기질 특이성 개변 효과가 크고, 다른 글루코오스 아날로그를 조합함으로써 기질 특이성 개변 효과는 상승적으로 개변할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 6] 연료 전지의 구축
실시예 4에서 제작한, 정제 GDH와 D-만니톨을 포함하는 용액을 이용한 카본클로스 전극을 애노드 전극으로 하였다. 단 이 때, 메디에이터로서 DPPD 대신에 IPPD를 이용하였다. 또한, 다층 카본 나노 튜브 용액(1.4wt%, MWCNT 용액)을 흡착시킨 카본클로스에 10mg/ml의 빌리루빈 옥시다아제(BOD, 시그마사 제품)를 흡착 고정함으로써 캐소드 전극을 제작하였다. 애노드 전극과 캐소드 전극을 연결하는 배선의 사이에 가변 저항을 접속하고, 나아가 ALS 전기 화학 애널라이저 814D 접속하였다. 연료조는 PBS(pH 7.4)와 200mM D-글루코오스를 포함하는 전해질 용액을 이용하며 상기 애노드 전극과 캐소드 전극을 침지시켰다. 실온에서 포텐쇼스탯의 테크닉인 오픈 서킷 포텐셜을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 10kΩ 접속시에 0.125mA/㎠의 전류값을 얻었다.
특정의 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 개시의 연료 전지에 대해 이하와 같이 고찰된다. 즉, 실시예 4에서 각종 글루코오스 아날로그의 존재하에 GDH를 고정화한 전극을 이용함으로써 높은 기질 특이성을 가지고 글루코오스와 반응할 수 있었다. 따라서 예를 들어 본 개시의 애노드 전극을 이용한 연료 전지이면, 말토오스와 글루코오스가 공존하는 것과 같은 생체 내의 성분을 연료로 하는 경우, 예를 들어 식사나 수액 등을 섭취하여 일시적으로 말토오스 농도가 상승한 경우에서도 일정한 전류를 흘려보내는 것을 가능하게 하는 것이 기대된다. 기질 특이성을 개변하기 위해 유전자 조작을 거쳐 효소를 개변하는 경우가 있을 수 있지만 시간이 걸리고 번잡하다. 본 개시에 의하면 용도에 맞추어 GDH의 기질 특이성을 개변할 수 있다. 이는 여러 가지의 용도에서 유리해진다.
본 개시에 의해 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변할 수 있다. 이에 의해 글루코오스 디히드로게나아제를 이용하여 시료의 글루코오스 농도를 측정할 때에 말토오스에 의한 영향을 저감할 수 있고 보다 정확한 글루코오스 농도 측정이 가능해진다. 이는 당뇨병 환자의 혈당치 관리 등에 유용할 수 있다. 또한, 말토오스에의 반응성을 증대시키도록 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하면 글루코오스와 말토오스의 혼합물을 연료에 포함시킨 연료 전지를 이용할 때에 보다 높은 전류값을 얻는 것이 가능해진다.
본 명세서에서 언급된 문헌은 모두 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 Mucor prainii 유래 GDH(MpGDH) aa
서열번호 2 MpGDH 유전자 DNA
서열번호 3 Mucor RD056860 GDH(MrdGDH) aa
서열번호 4 MrdGDH 유전자 DNA
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> A Method for modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase and glucose dehydrogenase substrate specificity modifying agent <130> PH-8345-PCT <150> JP 2019-182592 <151> 2019-10-03 <150> JP 2019-058223 <151> 2019-03-26 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 641 <212> PRT <213> Mucor prainii <400> 1 Met Lys Ile Thr Ala Ala Ile Ile Thr Val Ala Thr Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ala Gln Gln Asp Thr Asn Ser Ser Ser Thr Asp Thr Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser 35 40 45 Arg Ile Ser Glu Asn Lys Asp Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Pro Asn Ala Asn Asp Arg Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Ala Val Gly Thr Asp Leu Cys Pro Leu Ile Pro Thr Thr Pro Gln 85 90 95 Glu Asn Met Gly Asn Arg Ser Leu Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Ala Ile Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Gly Leu 115 120 125 Lys Asp Tyr Asp Ala Trp Glu Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly 130 135 140 Ala Asn Leu Phe Lys Tyr Phe Lys Lys Val Glu Asn Phe Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Ile Glu Tyr Gly Ala Thr Tyr Gln Lys Ser Ala His 165 170 175 Gly Lys Lys Gly Pro Ile Asp Val Ser Phe Thr Asn Tyr Glu Phe Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Ser Trp Asn Ala Ser Leu Glu Thr Leu Asp Phe Thr Ala 195 200 205 Leu Pro Asp Ile Leu Asn Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Pro 210 215 220 Asn Ile Leu Asp Pro Glu Thr Val Gln Arg Val Asp Ser Tyr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asn Leu Asn Val Leu Ala Asn 245 250 255 His Thr Val Ser Arg Ile Gln Phe Ala Pro Lys Asn Gly Ser Glu Pro 260 265 270 Leu Lys Ala Thr Gly Val Glu Trp Tyr Pro Thr Gly Asn Lys Asn Gln 275 280 285 Lys Gln Ile Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala 290 295 300 Ile Gly Ser Pro Lys Leu Leu Glu Ile Ser Gly Ile Gly Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ile Val Ser Ala Ala Gly Val Glu Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val 325 330 335 Gly Ser Asn Met Gln Asp His Val His Ala Ile Thr Val Ser Thr Thr 340 345 350 Asn Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Val Asn Glu Thr Leu 355 360 365 Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Tyr Glu Ala Asn Lys Thr Gly Ile Trp 370 375 380 Ala Thr Thr Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400 Asn Gly Thr Glu Phe Val Ser Gly Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Thr Asp Glu Trp Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Thr Asn Ala Ser 420 425 430 Asn Val Glu Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ile Val Ala Ser Arg Tyr 435 440 445 Glu Glu Asn Tyr Leu Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr 450 455 460 Glu Gly Ser Gly Asn Val Asp Leu Gln Asn Asn Lys Tyr Gln Thr Val 465 470 475 480 Asn His Val Leu Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn 485 490 495 Ser Ser Asp Val Glu Asp His Ser Val Ile Asn Pro Gln Tyr Tyr Ser 500 505 510 His Pro Met Asp Ile Asp Val His Ile Ala Ser Thr Lys Leu Ala Arg 515 520 525 Glu Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ile Asn Ser Gly Glu 530 535 540 Ile Glu Pro Gly Met Asn Ile Thr Ser Glu Asp Asp Leu Arg Ser Trp 545 550 555 560 Leu Ser Asn Asn Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala 565 570 575 Met Leu Pro Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Ser Pro Ala Leu Met Val 580 585 590 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Ile Met Pro Leu 595 600 605 Glu Val Ser Ser His Leu Met Gln Pro Thr Tyr Gly Ile Ala Glu Lys 610 615 620 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Thr Gln His Lys Asn Gln 625 630 635 640 Asn <210> 2 <211> 1926 <212> DNA <213> Mucor prainii <400> 2 atgaagatca cagctgccat tatcactgtt gccacagcat ttgcttcttt tgcttctgct 60 caacaagaca caaattcttc ctcaactgat acttatgatt atgttatcgt tggcggcggt 120 gtagctggtt tggctttggc tagtcgtatc tctgaaaaca aggatgtcac tgttgctgtt 180 ctcgagtccg gtcctaatgc caatgataga tttgttgttt atgctcctgg catgtatggc 240 caagctgttg gcactgatct ctgtcctctc attcctacta ctcctcaaga aaatatgggc 300 aacagaagtc tcacaatcgc tactggtaga ttgctcggtg gtggcagtgc tattaatggt 360 ctcgtttgga cccgtggtgg cttgaaggat tacgatgctt gggaggagct cggtaaccct 420 ggatggaacg gtgccaactt 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gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320 tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380 actcctggtt atgagggtag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440 aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500 gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560 atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620 aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg aagacgacct tagatcttgg 1680 ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740 gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800 gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860 attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920 aattag 1926 <210> 3 <211> 631 <212> PRT <213> Mucor RD056860 <400> 3 Met Arg Leu Ser Val Ala Ile Leu Thr Leu Thr Ser Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Val Thr Ser Ala Gln Gln Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Asp Tyr Val Ile 20 25 30 Val Gly Gly Gly Val Gly Gly Leu Ala Leu Ala Ser Arg Leu Ser Glu 35 40 45 Asp Lys Asn Val Thr Val Ala Val Leu Glu Ser Gly Pro Tyr Ala Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Val Val Tyr Ala Pro Gly Met Tyr Gly Gln Ala Val Gly 65 70 75 80 Thr Asp Leu Cys Pro Leu Leu Pro Thr Val Pro Gln Pro Ser Met Asn 85 90 95 Asn Arg Thr Ile Thr Ile Ala Thr Gly Arg Leu Leu Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Ala Val Asn Gly Leu Val Trp Thr Arg Gly Ala Met Lys Asp Phe Asp 115 120 125 Ala Trp Gln Glu Leu Gly Asn Pro Gly Trp Asn Gly Thr Thr Met Phe 130 135 140 Lys Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Asn Phe His Pro Pro Thr Glu Glu Gln 145 150 155 160 Ile Gln Tyr Gly Ala Thr Tyr Asn Lys Ser Val His Gly Phe Asn Gly 165 170 175 Pro Ile Asp Ile Ala Phe Pro Val Phe Glu Phe Pro Gln Ser Ala Asn 180 185 190 Trp Asn Ala Ser Leu Ala His Leu Asn Phe Thr Arg Arg Gln Asp Leu 195 200 205 Leu Asp Gly Ser Leu His Gly Tyr Ser Thr Thr Pro Asn Thr Leu Asn 210 215 220 Pro Gln Thr Ala Arg Arg Ala Asp Ala Tyr Ala Gly Tyr Ile Gln Pro 225 230 235 240 Asn Val Asn Arg Thr Asn Leu Ala Val Leu Ala Asn His Thr Val Ser 245 250 255 Arg Ile Gln Phe Glu Ala Arg Asn Gly Ser Gln Pro Leu Lys Ala Ile 260 265 270 Gly Val Glu Trp Tyr Thr Thr Gly Gly Asp Lys Thr Ser Lys Gln Thr 275 280 285 Ile Lys Ala Arg Arg Glu Ile Ile Leu Ser Ser Gly Ala Ile Gly Ser 290 295 300 Pro Lys Leu Leu Glu Val Ser Gly Ile Gly Asn Lys Ala Ile Val Thr 305 310 315 320 Ala Ala Gly Val Gln Ser Leu Ile Asp Leu Pro Gly Val Gly Ser Asn 325 330 335 Met Gln Asp His Val His Ala Val Thr Val Ser Thr Thr Asn Ile Asp 340 345 350 Gly Tyr Thr Thr Asn Ser Val Phe Thr Asn Glu Thr Leu Ala Gln Glu 355 360 365 Gln Lys Asp Leu Tyr Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Ile Trp Thr Thr Thr 370 375 380 Pro Asn Asn Leu Gly Tyr Pro Ser Pro Ser Gln Leu Phe Thr Asn Thr 385 390 395 400 Thr Phe Lys Ser Gly Lys Glu Phe Ala Ala Met Ile Arg Asn Ser Thr 405 410 415 Asp Lys Tyr Ala Gln Tyr Tyr Ala Ala Asn Asn Ala Thr Asn Val Glu 420 425 430 Leu Leu Lys Lys Gln Tyr Ser Ile Val Ala Arg Arg Tyr Glu Glu Asn 435 440 445 Tyr Ile Ser Pro Ile Glu Ile Asn Phe Thr Pro Gly Tyr Gly Gly Thr 450 455 460 Gly Met Ala Asp Leu Gln Asn Lys Lys Tyr Gln Thr Val Asn His Val 465 470 475 480 Leu Val Ala Pro Leu Ser Arg Gly Tyr Thr His Ile Asn Ser Ser Asp 485 490 495 Ile Glu Asp Pro Val Val Ile Asp Pro Gln Tyr Tyr Ser His Pro Leu 500 505 510 Asp Val Asp Val His Val Ala Ser Thr Gln Leu Ala Arg Ser Ile Leu 515 520 525 Asn Ala Pro Gly Leu Ala Ser Ile Asn Ser Gly Glu Val Glu Pro Gly 530 535 540 Glu Lys Val Gln Ser Asp Glu Asp Val Arg Lys Trp Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Val Arg Ser Asp Trp His Pro Val Gly Thr Cys Ala Met Leu Pro Arg 565 570 575 Lys Leu Gly Gly Val Val Asp Ser Lys Leu Lys Val Tyr Gly Thr Ala 580 585 590 Asn Leu Arg Ile Val Asp Ala Ser Ile Ile Pro Leu Glu Ile Ser Ser 595 600 605 His Leu Met Gln Pro Val Tyr Ala Val Ser Glu Arg Ala Ala Asp Ile 610 615 620 Ile Lys Ser Ser Ser Lys Lys 625 630 <210> 4 <211> 1896 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 4 atgcgtctct ctgtggcgat cctcactctc acttcggctc tggcttcggt tacctcggcc 60 caacaaaaca atactgatac ttatgactac gtgatcgtcg gaggaggagt gggtggactg 120 gctctcgctt cgcgcctctc cgaggataag aacgttaccg tggctgtcct ggaatcgggc 180 ccttatgcgg atgacaaatt cgtggtctac gccccaggga tgtatggtca ggctgtcgga 240 actgacctgt gtcctctgct cccaacggtt cctcaaccat ctatgaacaa tcgaaccatc 300 actattgcta cgggacgtct gctcggagga ggttcagctg tgaacggact ggtctggacc 360 cgtggagcta tgaaggattt cgacgcttgg caggagctgg gaaacccagg atggaatggg 420 accactatgt tcaagtactt caagaaaatc gaaaacttcc atcccccgac cgaggaacag 480 attcaatacg gcgctactta taacaagtct gtccacggtt tcaatggccc gatcgatatt 540 gcctttcccg tgttcgagtt tccgcagtct gctaactgga atgcgtcact ggcccatctc 600 aacttcaccc gccggcaaga tctgctcgac ggtagtctcc acggctacag cacgacccct 660 aacaccctga atccacagac tgcccgacgt gcggatgcct acgctggata tatccaacct 720 aacgtcaatc gaacgaacct ggctgtcctc gcgaatcata ccgttagtcg catccagttt 780 gaggcgcgga acggtagcca accactgaag gccattggcg tggaatggta tactacgggc 840 ggagacaaga ctagtaaaca gacgatcaag gcgcgccggg agatcattct gagtagcgga 900 gccattgggt cgcctaagct gctcgaagtg tccgggatcg gtaacaaagc cattgttacc 960 gccgctggag tgcagtctct gatcgatctc ccaggcgttg gatcaaacat gcaagaccat 1020 gtgcacgctg ttaccgtgtc gaccactaat atcgatgggt acacgaccaa ctccgtgttc 1080 acgaatgaga ccctcgccca ggaacaaaag gacctgtact acaacaacaa gactggaatc 1140 tggactacga cccctaacaa tctcgggtat cccagtccga gccagctgtt caccaacact 1200 acgtttaagt ctggcaaaga gtttgcggcc atgatccgca acagtactga taagtacgcc 1260 cagtactatg ctgcgaacaa tgctacgaac gtcgagctgc tcaagaaaca atatagtatc 1320 gtggcccgac gttacgagga aaactacatc agccctatcg aaatcaactt cacgccagga 1380 tacgggggta ccgggatggc tgatctgcag aacaagaaat atcaaaccgt gaatcatgtc 1440 ctggttgccc ccctcagtcg gggctacact cacatcaact cgtccgatat tgaggacccc 1500 gttgtgatcg acccgcagta ctatagccat ccgctggatg tggacgtcca cgttgcgagt 1560 acccaactgg cccgaagcat cctcaacgcc cccggactgg cttctattaa ttcaggcgag 1620 gtggaaccgg gcgagaaggt ccagagcgat gaagacgttc gcaaatggct gtcggataac 1680 gtgcgttccg actggcatcc agtcggaacc tgcgctatgc tgccacgaaa gctcggagga 1740 gtcgttgatt cgaagctcaa agtctacggc accgcgaatc tgcgtatcgt tgacgcctcc 1800 atcattccgc tcgagatttc ttcacacctg atgcaaccag tctatgcggt ctccgaacgg 1860 gctgccgaca tcatcaaatc ctcctctaaa aaataa 1896

Claims (20)

  1. 글루코오스 아날로그이며 저분자 화합물인 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 이용함으로써 글루코오스 디히드로게나아제의 기질 특이성을 개변하는 방법으로서, FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 이용하여 글루코오스 측정을 행할 때에 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 공존시키는 것을 포함하고, 상기 개변제의 부재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)와 비교하여, 상기 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)가 개변되는, 상기 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제가 무코르속 또는 아스페르길루스속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제가 고상 표면에 고정화되어 있는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제가 고상 표면에 고정화되지 않은, 방법.
  6. 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제로서, 상기 개변제는 글루코오스의 아날로그인 저분자 화합물이며, 상기 개변제의 부재하에서의 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)와 비교하여, 상기 개변제의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)가 개변되는, 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제.
  7. 청구항 6에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 개변제.
  8. 청구항 6에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제가 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, D-만니톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 개변제.
  9. 청구항 6 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제가 무코르속 또는 아스페르길루스속 유래의 글루코오스 디히드로게나아제인, 개변제.
  10. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 고상 표면에 고정화된 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 시스템.
  11. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 고상 표면에 고정화되지 않은 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 시스템.
  12. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
  13. 청구항 12에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 개별 시약으로서 포함하는, 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
  14. 청구항 12에 있어서,
    글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제와 글루코오스 디히드로게나아제를 동일 시약 중에 포함하는, 글루코오스 측정용 조성물 또는 글루코오스 측정 시약.
  15. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 개변제 또는 청구항 10 혹은 청구항 11에 기재된 시스템 또는 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 조성물 혹은 시약을 이용한, 글루코오스 측정 방법.
  16. 이하의 공정을 포함하는, 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제의 스크리닝 방법,
    i) 글루코오스 디히드로게나아제를 마련하는 공정,
    ii) 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
    iii) 상기 i)의 글루코오스 디히드로게나아제와 글루코오스의 아날로그인 저분자 화합물인 후보 물질을 접촉시키고, 그 후 후보 물질의 존재하에서의 상기 글루코오스 디히드로게나아제의 말토오스에 대한 반응성(Mal)과 글루코오스에 대한 반응성(Glu)의 비(Mal/Glu)를 결정하는 공정,
    iv) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)와 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)를 비교하는 공정 및
    v) 상기 ii)에서의 비(Mal/Glu)보다 iii)에서의 후보 물질의 존재하에서의 비(Mal/Glu)가 개변되어 있는 경우에는 상기 후보 물질을 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제로 하는 공정.
  17. 청구항 16에 기재된 방법에 의해 동정(同定)된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제를 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물에 배합하는 것을 포함하는, 글루코오스 측정 시약 또는 글루코오스 측정 조성물의 제조 방법.
  18. 청구항 16에 기재된 방법에 의해 동정된 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 글루코오스 디히드로게나아제를 포함하는, 글루코오스 측정 시약.
  19. 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 포함하는 전극, 여기서 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 상기 전극.
  20. 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제 및 FAD 의존성 글루코오스 디히드로게나아제(FAD-GDH)를 포함하는 전지, 여기서 상기 글루코오스 디히드로게나아제 기질 특이성 개변제는 소르비톨, D-이디톨, L-이디톨, D-글루칼, 리비톨, L-굴로오스, 트레할로스, D-만니톨, 크실리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 상기 전지.
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