JP2009207452A - Bacilluscoagulansに属する菌株を用いたメリビオースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】グルコースとガラクトースを原料とするメリビオースの製造方法において、メリビオースを選択的に合成可能なBacillus coagulansに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを用いる。
【選択図】なし
Description
[1] Bacillus coagulansに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
[2] α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する[1]に記載のメリビオースの製造方法。
(1)作用:本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
[4] 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Bacillus coagulansに属する微生物に由来するものであり、当該微生物としては、Bacillus coagulansに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Bacillus coagulans AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Bacillus coagulansに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。
AKC-003株(FERM P−21091)
AKC-004株(FERM P−21092;FERM−ABP10948;FERM−BP10948)
AKC-005株(FERM P−21093)
AKC-006株(FERM P−21094)
(1)作用:作用:本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000
基質特異性:p-ニトロフェニル-α-D-ガラクトピラノシドを基質とした場合、分解活性は最も高く、次いでメリビオース、次いでラフィノースの順である。一方、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド、ラクトース、スクロースは分解しない。
金属イオンの影響:カリウム、カルシウム、マグネシウム、クロム、マンガン、コバルト、鉄(II)、鉄(III)イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下は見られない。一方、ニッケル、亜鉛イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下が見られ、銅イオンを添加した場合に最も活性が低下する。
(5)(正反応の)至適温度範囲:35〜50℃
(6)安定温度範囲:45℃まで安定である。
上記のようにして得られた菌体についてリゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いた菌体の破砕を行い、染色体DNAを単離する。
上記のようにして得られた染色体DNAを種々の制限酵素で消化し、DNA断片を得る。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列:
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法]
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を25倍希釈して、99℃で10分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を20倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度%(w/v)を算出した。また、反応停止後の糖合成液を2倍希釈して、HPLC分析を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Carbpac PA1カラム(ダイオネクス社製)を用い、カラム温度35℃、流量1mL/min.で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、100mM水酸化ナトリウム水溶液、500mM酢酸ナトリウム水溶液を利用し、0−20分、20−40分、40−45分の各々の段階で水、100mM水酸化ナトリウム水溶液、500mM酢酸ナトリウム水溶液の比率が49/50/1、30/50/20、0/100/0となるようなグラジエント条件で行った。HPLC分析には、Shodex Sugar SCLGガードカラム(昭和電工社製)、Shodex Sugar SC1011カラム(昭和電工社製)、Shodex Sugar SP0810カラム(昭和電工社製)を連結して使用し、カラム温度80℃、流量0.6mL/min.、RI検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率(%)はメリビオース蓄積濃度/全二糖蓄積濃度×100により算出した。
Bacillus coagulans AKC−004株(受託番号FERM P−21092(FERM BP−10948に移管):寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させた。
実施例1で得られた精製α−ガラクトシダーゼを用いて、その作用に関する実験を行った。
各pHの100mM緩衝液に溶解させた6mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド150μLに、100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で5分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図1に示す。なお、使用した緩衝液は、グリシン−HCl緩衝液(pH2.5〜3.5)、酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.5〜6.0)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0〜8.5)、グリシン−NaOH緩衝液(pH8.5〜10.0)である。
pH4.0〜10.0の範囲で10mMの緩衝液を用いて、各pHで45℃、140分間の加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図2に示す。なお、使用した各pHの緩衝液の種類は前記のものと同様である。
pH4.5の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた4.7mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド190μLに、20倍希釈した本発明の精製酵素液10μLを混合し、20〜60℃の範囲で5分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図3に示す。
pH4.5の100mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、30〜55℃の各温度で20分間加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図4に示す。
分離ゲル濃度が10%の「レディーゲルJ」(日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)を用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めた。この結果を図5に示す。分子量は約80,000であり、アミノ酸配列から推定される分子量83,122とほぼ一致した。
10mMの各種基質を含むpH4.5の100mM酢酸ナトリウム緩衝液150μLに100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で20分間反応させた。ただし、p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドを基質に用いた反応では、反応時間を5分間とした。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールの定量、あるいは「Shodex SUGAR」(昭和電工株式会社)カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる分析から分解された基質の定量を行い、最大活性を100とした各基質に対する相対活性を求めた。この結果を表2に示す。また、そのなかで基質となり得たものについて、反応速度を測定した結果を表3に示す。
pH4.5の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた6mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドに各種金属イオンを終濃度1mMとなるように添加して150μLとし、100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で20分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を表4に示す。
(1)染色体DNAの調製
常法に従ってBacillus coagulans AKC−004株の染色体DNAを調製した。実施例1記載の方法で取得したBacillus coagulans AKC−004株の培養液60mLを、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体をLysisバッファー(50mM Tris−HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、50mM グルコース)に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Lysisバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え37℃で45分間インキュベートした。次いでSDSとRNaseを添加し、37℃で45分間インキュベートした。その後Proteinase Kを添加し、50℃で60分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を70%エタノールで洗浄後、乾燥し、TEに再溶解した。この操作により、約1mgの染色体DNAを調製した。
上記(1)において調製した染色体DNAから、α−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を増幅するためのPCRプライマーを設計、合成した。プライマーの設計は公知の数種の微生物由来α−ガラクトシダーゼ遺伝子のアライメント結果を基に行い、センスプライマーは5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'(配列番号3)の配列を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3' (配列番号4)の配列を有するオリゴDNAをそれぞれ合成した。なお、配列中、Iはイノシン、YはC又はT、RはA又はGを示す。ここで得られたPCRプライマーを用い、上記(1)において調製した染色体DNAを鋳型としてPCR法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の増幅を行い、380塩基対からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を取得した。ここで得られた遺伝子断片の塩基配列を、DNAシークエンサーを用いて解析した。
DNAシークエンサーを用いて、(2)で得られたPCR産物からα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号2に示す5’末端からのDNA塩基配列を有する2190塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見出されていない新規な遺伝子であった。また、このDNA塩基配列より類推されるBacillus coagulans AKC−004株が生産するα−ガラクトシダーゼは730個のアミノ酸からなり、配列番号2に示すようなN末端からのアミノ酸配列を有していた。データベース検索の結果、このアミノ酸配列はGeobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaN)と57%、Geobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaA)と56%、Geobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaB)と56%、Lactococcus raffinolactis由来α−ガラクトシダーゼと56%の相同性を有し、新規なα−ガラクトシダーゼをコードしていることが明らかになった。
(3)で得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を基に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のSD配列、構造遺伝子、終始コドンを含む領域を増幅するためのPCRプライマーを設計・合成した。PCRプライマーの設計は(2)で得られた4500塩基対からなるPCR産物の塩基配列を基に行い、センスプライマーは5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3' (配列番号7)の配列を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3' (配列番号8)の配列を有するオリゴDNAをそれぞれ合成した。(2)で得られた4500塩基対からなるPCR産物を鋳型として、合成したPCRプライマーを用いてPCR法による増幅を行い、2325塩基対からなるPCR産物を取得した。ここで得られたPCR産物を平滑末端化、リン酸化した。
(4)で作製した組換え大腸菌JM109−pBlue/agaAを100mg/Lのアンピシリンを含む30mLのLB培地で37℃で24時間、振盪培養した。培養後、組換え大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。この破砕液のα−ガラクトシダーゼ活性を、前記の方法で測定したところ、19.9U/培養液(mL)であった。
Bacillus coagulans AKC−004株(受託番号FERM P−21253:寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (DIFCO)で、55℃、24時間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を表1に示した培地 100mLを500mL容三角フラスコに分注したものに接種して、50℃、150rpmで28時間培養した。
実施例3記載の組換え体培養液10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10,000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer(pH5)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液(pH5.0の100mM酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース80.0%、ガラクトース10%を含む)を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始4時間後に、反応液40μLを回収し、蒸留水960μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析およびHPLC分析した結果、メリビオース糖蓄積濃度は3.24%(w/v)であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は76.4%であった。
Claims (5)
- Bacillus coagulansに属する菌株由来のα-ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
- α−ガラクトシダーゼが下記の特性を有する請求項1に記載のメリビオースの製造方法。
(1)作用:本酵素は、正反応としてα−ガラクトシダーゼの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000 - 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列: - 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトース及びグルコースを含む原料からメリビオースを製造するメリビオースの製造方法。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列: - α−ガラクトシダーゼが、Bacillus coagulans AKC−003株(受託番号FERM P−21091)、AKC−004株(受託番号FERM P−21092、FERM BP−10948)、AKC−005株(受託番号FERM P−21093)、又はAKC−006株(受託番号FERM P−21094)、あるいはAKC−003株(受託番号FERM P−21091)、AKC−004株(受託番号FERM P−21092、FERM BP−10948)、AKC−005株(受託番号FERM P−21093)、又はAKC−006株(受託番号FERM P−21094)を親株として得られる変異株由来のものである、請求項1から4の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
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