KR101500827B1 - 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법 - Google Patents

장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시키도록 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산으로부터 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 형질전환체는 효소반응에 의하여, 배지에 포함된 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산을 분해하여 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 효율적으로 생성할 수 있으므로, 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산의 보다 안전하고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법{Process for preparing medium chain fatty acids and ω-hydroxyfatty acids from long chain fatty acids}
본 발명은 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시키도록 형질전환된 형질전환체를 이용하여 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산으로부터 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산 및 중쇄 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
오메가-하이드록시지방산은 지방산의 말단에 하이드록시기(수산화기)를 1개 가지고 있는 지방산의 일종으로(HOCH2(CH2)nCOOH) 폴리에틸렌 계열의 플라스틱 제조 시 모노머로 사용되고 있으며 유화제, 접착제, 코팅제 생산과 화장품이나 의약품의 제조에 널리 이용되고 있다(J. AM. CHEM. SOC., 132:15451-15455, 2010). 또한, 폴리아미드, 폴리에스터 계열의 플라스틱 제조와 화장품, 생활용품 제조에 광범위하게 사용되고 있는 장쇄 디카르복실산 합성의 전구체로도 사용될 수 있다.
중쇄 지방산은 에스터 계열의 향료/향장 물질 합성에 널리 이용되고 있고 또한 항균활성이 우수하여 화장품, 식품, 생활용품 생산에도 광범위하게 이용되고 있다.
이러한 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산은 자연계에 거의 존재하지 않기 때문에 주로 유기합성법을 이용하여 산업적으로 생산되고 있는데, 유기합성법은 고온ㆍ고압, 강산 및/또는 환경에 심각한 문제를 일으킬 수 있는 독성 산화물을 필요로 하는 문제점이 있다. 따라서, 환경 친화적이며 단순화된 공정을 통한 제조방법이 활발히 연구되고 있으며, 이에 생체촉매반응을 이용한 공정이 개발되고 있다. 일례로, 효소를 이용한 장쇄 지방산으로부터 장쇄 오메가-하이드록시지방산의 생산방법이 보고되었고(J. AM. CHEM. SOC., 132:15451-15455, 2010), 석유화합물인 하이드로카본으로부터 장쇄 디카르복실산의 제조방법에 대해서는 보고가 되었으나, 효소를 이용한 재생 가능한 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 제조하는 방법에 대해서는 아직까지 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
또한, 대한민국 특허출원번호 제10-2000-0026158호에는, PHA(폴리하이드록시알칸산) 분해효소를 코딩하는 유전자와 PHA 생합성효소계를 코딩하는 유전자가 함께 도입된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 배양하여 균체 내에서 PHA 합성과 분해가 동시에 이루어지게 함으로써, 광학적으로 순수한 하이드록시지방산을 제조하는 방법을 기재하고 있다.
그러나, 상기와 같은 종래기술은 높은 생산성 및 수율을 갖는 생성물을 획득하기에 어려움이 있으며, 미생물 내에 분해되지 않고 남아있는 효소가 존재할 수 있어 수율 감소 및 기질의 낭비로 인한 생가 단가의 상승을 야기할 수 있다는 문제점이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)가 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산으로부터 유래된 키토 지방산을 에스터 가수분해효소 또는 비효소적 가수분해 반응에 의해 절단될 수 있는 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체의 형태로 전환시킬 수 있음을 새로이 규명하여, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자가 도입된 형질전환 미생물을 이용할 경우 상기 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 오메가-하이드록시지방산을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법은(ⅰ) BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 장쇄 지방산을 포함하는 배지에서 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,(ⅱ) 상기 배양물로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 회수하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 장쇄 지방산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 올레산, 리시놀린산, 12-하이드록시스테아린산, 리놀레인산, 팔미톨레인산 또는 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid) 등이 될 수 있으며; 상기 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 헵탄산(heptanoic acid), 노난산(nanoic acid), 오메가-하이드록시노난산(ω-hydroxynonanoic acid), 오메가-하이드록시운데칸산(ω-hydroxyundecanoic acid) 또는 오메가-하이드록시트리덱-11-데논산(ω-hydroxytridecenoic acid) 등이 될 수 있다.
또한, 상기 배양은 장쇄 지방산을 포함하는 배지를 사용하여 수행하거나 또는 형질전환체 배양용 배지에 포함된 탄소원이 고갈된 후에 장쇄 지방산을 배지에 추가하여 수행할 수도 있고, 배지에 포함되는 상기 장쇄 지방산의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 100g/L의 최종농도가 되도록 배지에 가할 수 있다.
본 발명의 용어 "BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)"란, 케톤을 산화시켜서 락톤이나 에스터화합물을 생성하는 Baeyer-Villiger 산화반응을 포함하는 다양한 산화반응을 촉매할 수 있는 효소인 monooxygenase의 일종을 의미한다. 본 발명의 목적상, 형질전환체에서 발현되어 키토 지방산(10-키토스테아르산 등)으로부터 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 생산하는 반응을 촉매하는 활성을 나타내는 한, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 슈도모나스속 균주(Pseudomonas sp.), 로도코커스속 균주(Rhodococcus sp). 브레비박테리움속 균주(Brevibacterium sp.), 코마노나스속 균주(Comanonas sp.), 아시네토박터속 균주(Acinetobacter sp.), 아트로박터속 균주(Arthrobacter sp.), 브라키모나스속 균주(Brachymonas sp.) 등의 미생물로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii), 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) 또는 슈도모나스속 균주 HI-70(Pseudomonas sp. strain HI-70)으로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 슈도모나스 푸티다로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)가 될 수 있다.
아울러, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)는 키토 지방산으로부터 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 생산하는 반응을 촉매하는 활성을 나타내는 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 형질전환체에서 발현시킬 수 있는 한, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 구성하는 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 다수개(단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 폴리펩티드가 갖는 활성을 나타내는 효소의 아미노산 서열에 차이가 있을 수 있기 때문에 특별히 이에 제한되지는 않으며, 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 서로 다른 두 아미노산 서열 또는 염기서열 사이의 동일성을 의미하는데, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "형질전환체"란, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터를 이용하여 숙주의 내부로 도입된 후, 상기 목적 단백질을 발현시키도록 변이된 세포 또는 미생물을 의미한다. 이때, 상기 숙주세포에 도입되는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 한, 어떠한 형태라도 무방하다.
본 발명의 형질전환체는 배지에 포함된 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산을 분해하여 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시지방산을 생산하는데 사용될 수 있으며, 이를 위하여, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자 이외에 수화효소(hydratase)나 리폭시지나제(lipoxygenase)를 코딩하는 유전자, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 에스터 가수분해효소(esterase)를 코딩하는 유전자 등이 추가로 도입될 수도 있다.
본 발명의 용어 "수화효소(hydratase)"란, 탄소이중결합에 물을 가하여 하이드록시 화합물을 가역적으로 생성하는 효소를 의미하는데, 역반응에 의하여 하이드록시 화합물로부터 물을 제거할 수도 있으므로 "탈수효소(dehydratase)"라고 할 수도 있다. 상기 수화효소는 바람직하게는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 리시니바실러스 후시포르미스(Lysinibacillus fusiformis), 마크로코코스 카제올리티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 등의 균주로부터 유래된 것을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상 상기 수화효소는 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산에 하이드록시기를 가하여 하이드록시지방산을 생성하려는 목적으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "리폭시지나제(lipoxygenase)"란, 불포화지방산에 분자상 산소를 첨가하는 산소첨가효소로서, 불포화지방산의 cis,cis-1,4-펜타디엔 구조를 인식하여 메틸렌의 수소원자를 입체특이적으로 추출하여 반대측(antarafacial)에서 산소를 첨가하여 히드로퍼옥시드를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 리폭시지나제는 상술한 수화효소와 마찬가지로 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산에 하이드록시기를 가하여 하이드록시지방산을 생성하려는 목적으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)"란, 알코올에서 수소를 제거하여 알데하이드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 알코올 탈수소효소는 상기 수화효소 또는 리폭시지나제에 의하여 생성된 하이드록시지방산으로부터 수소를 제거하여 키토 지방산을 생성하려는 목적으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "에스터 가수분해효소(esterase)"란, 에스터 화합물의 에스터 결합을 가수분해하는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 에스터 가수분해효소는 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)에 의해 생성된 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산으로 분해하려는 목적으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈와 같은 당, 지방, 지방산, 글리세롤이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산과 같은 아미노산 및 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 중쇄 디카르복실산과 알코올의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다. 대체로 중쇄 디카르복실산과 알코올은 배양 배지 중으로 배출되지만, 경우에 따라서는 세포내에 포함되어 있을 수도 있다.
아울러, 배양물로부터 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 수화효소를 코딩하는 유전자, 알코올 탈수소효소를 코딩하는 유전자, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자 및 에스터 가수분해효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 배지에 존재하는 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산(올레산, 리시놀린산, 12-히드록시스테아린산, 리놀레인산, lesquerolic acid 등)으로부터 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 생성할 수 있다(도 1a, 도 1b 및 도 1c).
도 1a는 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(18개의 탄소수를 가지는 올레산)으로부터 중쇄 지방산(9개의 탄소수를 가지는 노난산)과 중쇄 오메가-하이드록시지방산(9개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시노난산)을 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
도 1b는 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(18개의 탄소수를 가지는 12-하이드록시스테아릭산)으로부터 중쇄 지방산(7개의 탄소수를 가지는 헵탄산)과 중쇄 오메가-하이드록시지방산(11개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시운데칸산)을 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
또한, 도 1c는 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(레스쿠에롤린산)으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시트리덱-11-에논산을 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c에서 나타난 바와 같이, 형질전환체의 내부로 배지에 존재하는 장쇄 지방산이 도입되면 상기 형질전환체에서 발현된 수화효소가 상기 지방산을 기질로 사용하여 하이드록시지방산을 생성한다. 그리고, 상기 하이드록시지방산이 생성되면 상기 형질전환체에서 발현된 알코올 탈수소효소가 상기 하이드록시지방산을 기질로 사용하여 키토 지방산을 생성한다. 세 번째로, 상기 키토 지방산이 생성되면 상기 형질전환체에서 발현된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)가 상기 키토 지방산을 기질로 사용하여 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 생성한다. 마지막으로, 상기 지방산 유도체가 생성되면 상기 형질전환체에서 발현된 에스터 가수분해효소가 상기 지방산 유도체를 기질로 사용한 에스터 가수분해 반응을 수행하여 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시지방산을 생성한다. 이때, 에스터 가수분해반응은 상기 형질전환체에 도입된 에스터 가수분해효소 이외에도 숙주세포에 내재된 에스터 가수분해효소에 의해 수행될 수도 있고, 비효소적 가수분해반응에 의해 수행될 수도 있다.
상기 형질전환체에 의하여 생성된 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시지방산은 상기 형질전환체에서 배지로 분비되므로, 상기 형질전환체를 고정화 담체에 고정시키거나, 상기 형질전환체를 유가식 또는 연속식으로 배양할 경우, 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시지방산을 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소 유전자, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 알코올 탈수소효소 유전자를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 수화효소 및 알코올 탈수소효소를 발현하는 형질전환체를 제작하고, 상기 형질전환체에 슈도모나스 푸티다 유래의 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자를 도입하여 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현하는 형질전환체를 제작하였다(실시예 1). 또한, 수화효소 및 알코올 탈수소효소를 발현하는 형질전환체를 배양하고, 탄소원이 고갈된 후에 올레산을 배지에 가하고 추가로 배양한 결과, 10-하이드록시스테아르산, 10-키토스테아르산, 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산, nonanoic acid 및 ω-hydroxynonanoic acid를 생산할 수 있었다(도 2).
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 알코올 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 알코올 탈수소효소를 발현하는 형질전환체를 제작하고, 상기 형질전환체에 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 BVMO(Baeyer-Villager monooxygenase)를 코딩하는 유전자를 도입하여 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villager monooxygenase)를 발현하는 형질전환체를 제작하였다. 최종적으로, 상기 형질전환체에 슈도모나스 프로레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 에스터 가수분해 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villager monooxygenase) 및 에스터 가수분해 효소를 발현하는 형질전환체를 제작하였다. 또한, 상기 형질전환체 현탁액 반응 배지에 lesquerolic acid를 첨가하고 배양하여 최종적으로 오메가-hydroxytridec-11-enoic acid 배양물을 수득하였으며, 이를 GC/MS 분석하여 구조를 확인하였다(실시예 3 및 실험예 1).
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 하기 화학식 1로 표시되는 오메가-하이드록시지방산을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112013005136812-pat00001
본 발명의 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 형질전환체는 효소반응에 의하여, 배지에 포함된 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산을 분해하여 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산을 대량으로 생성할 수 있으므로, 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산의 보다 안전하고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는, 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(18개의 탄소수를 가지는 올레산)으로부터 중쇄 지방산(9개의 탄소수를 가지는 노난산)과 중쇄 오메가-하이드록시지방산(9개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시노난산)을 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
도 1b는 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(18개의 탄소수를 가지는 12-하이드록시스테아릭산)으로부터 중쇄 지방산(7개의 탄소수를 가지는 헵탄산)과 중쇄 오메가-하이드록시지방산(11개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시운데칸산)을 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
도 1c는 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소를 발현하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 지방산(21개의 탄소수를 가지는 레스쿠에롤린산)으로부터 오메가-하이드록시지방산(13개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시트리덱-11-데논산)를 생성하는 반응을 순차적으로 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현하는 형질전환체를 이용한 노난산과 오메가-하이드록시노난산의 시간별 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현하는 형질전환체를 이용한 12-하이드록시스테아릭산으로부터 헵탄산과 오메가-하이드록시운데칸산의 시간별 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 오메가-하이드록시트리덱-11-에논산의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 다단계 효소합성을 이용한 nonanoic acid 와 ω- hydroxynonanoic acid 의 생산
1) 유전자 클로닝
올레산 수화효소와 알콜 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하기 위하여, 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소 유전자와 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래의 알콜 탈수소화효소 유전자를 클로닝하였다.
먼저, 올레산 수화효소 유전자는 플라스미드 벡터 pET 28(+)a/올레산 수화효소(J Biotechnol (2012) 158:17-23)를 주형으로 하고, 제한효소인 NheI과 XhoI의 절단부위를 포함하도록 제작된 프라이머(서열번호 1 및 2)를 이용한 PCR을 수행하여 증폭하였다.
정방향 프라이머: 5'-gctagcatgtattacagtaatggtaactatgaa-3'(서열번호 1)
역방향 프라이머: 5'-ggctcgagctatattagtttactttctttca-3'(서열번호 2)
상기 증폭된 PCR 산물을 제한효소인 NheI과 XhoI로 절단하고, 플라스미드 벡터 pACYC (Novagen사 제품)에 삽입하여 pACYC/올레산 수화효소 발현벡터를 제작하였다.
또한, 알콜 탈수소화효소는 마이크로코커스 루테우스로부터 유래한 알콜 탈수소화효소의 DNA 염기서열(Genebank Accession No.ZP_07049769)을 주형으로 하고, 제한효소인 NdeI과 HindIII의 절단부위를 포함하도록 제작된 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용한 PCR을 수행하여 증폭하였다.
정방향 프라이머: 5'-ggggctagcatgtactatagtaatgga-3'(서열번호 3)
역방향 프라이머: 5'-aggctcgagttatatcaaatttgcttc-3'(서열번호 4)
상기 증폭된 PCR 산물을 제한효소인 NdeI과 HindIII로 절단하고, 상기 제작된 pACYC/올레산 수화효소 발현벡터에 삽입하여, pACYC/올레산 수화효소/알콜 탈수소화효소 발현벡터를 제작하였다.
2) 숙주세포의 배양
대장균주 E. coli BL21(DE3)은 플라스미드 유지를 위하여 10 g/ℓ 글루코스 및 적절한 항생제가 함유된 Riesenderg 배지에서 배양하였다. 이때, Riesenberg 배지는 4 g/ℓ N(NH4)2HPO4, 13.5 g/ℓ KH2PO4, 1.7 g/ℓ citric acid, 1.4 g/ℓ MgSO4 및 10 ㎖/ℓ trace metal solution(10 g/ℓ FeSO4, 2.25 g/ℓ ZnSO4, 1.0 g/ℓ CuSO4, 0.5 g/ℓ MnSO4, 0.23 g/ℓ Na2B4O7, 2.0 g/ℓ CaCl2 및 0.1 g/ℓ (NH4)6Mo7O24)가 함유되어 있으며, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) NCTC2665는 LB 배지에서 배양하였다.
3) 형질전환체 및 다단계 효소합성을 이용한 nonanoic acid와 ω-hydroxynonanoic acid의 생산
먼저, 상기 실시예 1-1)의 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소 유전자와 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 알코올 탈수소효소 유전자가 삽입된 pACYC/올레산 수화효소/알코올 탈수소효소 발현벡터를 상기 실시예 1-2)에서 배양된 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 1차 형질전환체를 제작하였다.
다음으로, 상기 1차 형질전환체에 슈도모나스 푸티다 유래의 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자를 발현하도록 제작된 발현벡터 pJOE-KT2440(Baeyer-Villiger monooxygenase)(BIOTECHNOL. LETT., 29:1393-1398, 2007)를 도입하여, 올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 2차 형질전환체를 제작하였다.
이어, 상기 2차 형질전환체를 리젠버그 미네랄배지에서 30℃ 및 200rpm의 조건으로 배양하면서, IPTG와 람노스를 처리하여 올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시켰고, 상기 배지에 포함된 포도당이 모두 고갈된 후에, 올레산을 10 mM의 농도가 되도록 가함으로써, nonanoic acid와 ω-hydroxynonanoic acid을 생산하였다(도 2). 도 2는 상기 2차 형질전환체를 이용하여 생산된 nonanoic acid와 ω-hydroxynonanoic acid의 시간의 경과에 따른 생산량의 변화를 나타낸 그래프로서, (●)는 올레산의 농도를 나타내고, (△)는 10-하이드록시스테아르산의 농도를 나타내며, (■)는 10-키토스테아르산의 농도를 나타내고, (□)는 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산의 농도를 나타내며, (◆)는 nonanoic acid와 ω-hydroxynonanoic acid의 농도를 각각 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 10-하이드록시스테아르산, 10-키토스테아르산 및 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산이 먼저 생산되고 연이어 nonanoic acid와 ω-hydroxynonanoic acid가 생산되었다.
실시예 2: 다단계 효소합성을 이용한 heptanoic acid 와 ω-hydroxyundecanoic acid 의 생산
실시예 1에서 제작한 형질전환체를 이용하여 기질인 12-하이드록시스테아르산으로부터 heptanoic acid와 ω-hydroxyundecanoic acid을 생산하였다.
즉, 올레산 대신에 1 mM의 12-하이드록시스테아르산을 가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-3)과 동일한 방법을 이용하여, heptanoic acid와 ω-hydroxyundecanoic acid을 생산하였다(도 3). 도 3은 상기 형질전환체를 이용하여 12-hydroxystearic acid로부터 생산된 heptanoic acid와 ω-hydroxyundecanoic acid의 시간의 경과에 따른 생산량의 변화를 나타낸 그래프로서, (△)는 12-하이드록시스테아르산의 농도를, (■)는 12-키토스테아르산의 농도를, (□)는 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산의 농도를, (◆)는 heptanoic acid와 ω-hydroxyundecanoic acid의 농도를 각각 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산이 먼저 생산되고 연이어 heptanoic acid와 ω-hydroxyundecanoic acid가 생산되었다.
실시예 3: 다단계 효소합성을 이용한 heptanoic acid 와 오메가-hydroxytridec-11-enoic acid 의 생성
1) 형질전환체의 제작 및 유전자 발현유도
상기 실시예 1-3)의 pACYC/올레산 수화효소/알코올 탈수소효소 발현벡터를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 1차 형질전환체를 제작하고, 상기 제작된 1차 형질전환체에 슈도모나스 푸티다 유래의 BVMO 유전자를 발현하도록 제작된 발현벡터 pJOE-KT2440를 도입하여, 올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 발현시킬 수 있는 2차 형질전환체를 제작하였다.
그 후, 슈도모나스 플로레센스 유래의 에스터 가수분해 효소 유전자를 발현하도록 제작된 발현벡터 pGaston-PFEI를 상기 2차 형질전환에에 도입하여 , 올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해 효소를 발현시킬 수 있는 3차 형질전환체를 제작하였다. 이어, 상기 제작된 3차 형질전환체를 Riesenberg 배지에서 30℃로 배양하고 0.1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 및/또는 2.0 g/ℓ rhamnos를 처리하여 타겟 유전자(올레산 수화효소, 알코올 탈수소효소 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 발현을 유도하였다.
그 후, 배양 온도를 16℃로 낮추고, 상기 배양물을 4℃에서 5분 동안 2,600 ×g으로 원심분리하여 타겟 유전자의 발현이 유도된 3차 형질전환체를 수집하고, 이를 0.5 g/ℓ Tween80이 함유된 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 3.6 g dry cells/ℓ의 농도로 재현탁하여 형질전환체 현탁액 반응 배지를 수득하였다.
2) 다단계 효소합성을 이용한 heptanoic acid와 오메가-hydroxytridec-11-enoic acid의 생성
상기 실시예 3-1)에서 수득한 형질전환체 현탁액 반응 배지에 1.0 mM lesquerolic acid를 첨가하고 35℃에서 200 rpm의 조건으로 다시 배양하여 최종적으로 14-ketoicos-11-enoic acid 및 사늘내에 에스터기가 도입된 지방산이 연이어 생산되었으며, 최종적으로 50% 이상의 수율로 오메가-hydroxytridec-11-enoic acid 배양물을 수득하였다.
실험예 : GC / MS 분석
상기 실시예 3-2)에서 수득한 오메가-hydroxytridec-11-enoic acid 배양물 내에 남아있는 지방산 및 축적된 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시지방산의 농도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 분획물을 0.1 g/ℓ 또는 0.5 g/ℓ 메틸 팔미테이트(내부 표준 물질)를 함유하는 동일 부피의 에틸아세테이트와 함께 혼합하였다. 강하게 교반한 후 유기상을 수집하여 TMS(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)로 유도체화하였다. TMS 유도체를 ion trap mass detector(Thermo ITQ1100GC-ion Trap MS, Thermo Scientific)가 연결된 Thermo Ultra GC system으로 분석하였다. 유도체는 비극성 capillary 컬럼(30 m 길이, 0.25 ㎛ 박막 두께, HP-5MS, Agilent)으로 분리하였다. 선형 온도 구배(변화도)는 90℃-280℃, 5 ℃/min으로 프로그램하였으며, 주입 포트 온도는 230℃이었다. 질량 스펙트럼은 70 eV에서 electron impact ionization으로 얻었다. 스캔 스팩트럼은 100-600 m/z 범위에서 었었으며, SIM(selected ion monitoring)은 생성물의 검출 및 단편화 분석을 위하여 사용하였다. 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 오메가-하이드록시트리덱-11-에논산의 GC/MS 분석 결과 그래프를 얻었으며, 오메가-하이드록시운덱-9-에논산을 기반으로 하여 구조를 확인하였다.

Claims (14)

  1. (ⅰ) 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii), 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) 또는 슈도모나스속 균주 HI-70(Pseudomonas sp. strain HI-70)으로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환미생물을 장쇄 지방산을 포함하는 배지에서 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (ⅱ) 상기 배양물로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 회수하는 단계를 포함하는, 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 지방산은 16 내지 20개의 탄소수를 갖는 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 지방산은 올레산, 리시놀린산, 12-하이드록시스테아릭산, 리놀레인산, 팔미톨레인산, 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 지방산은 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환미생물에 수화효소(hydratase)를 코딩하는 유전자, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 에스터 가수분해효소(esterase)를 코딩하는 유전자 또는 이들의 조합이 추가로 도입되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 배지에 포함된 탄소원이 고갈된 후에 장쇄 지방산을 배지에 추가하여 수행하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 지방산은 최종농도 0.1 내지 100g/L가 되도록 배지에 추가하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 지방산은 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 지방산인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 지방산은 헵탄산(heptanoic acid), 노난산(nonanoic acid) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 오메가-하이드록시지방산은 5 내지 14개의 탄소수를 가지는 오메가-하이드록시지방산인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 오메가-하이드록시지방산은 오메가-하이드록시노난산(ω-hydroxynonanoic acid), 오메가-하이드록시운데칸산(ω-hydroxyundecanoic acid), 오메가-하이드록시트리덱-11-에논산(ω-hydroxytridec-11-enoic acid) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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