KR20160042254A

KR20160042254A - 피키아 파스토리스 균주를 이용한 캔디다 앤탁티카 균주 유래 리파제의 생산방법

Info

Publication number: KR20160042254A
Application number: KR1020140135172A
Authority: KR
Inventors: 송재광; 오준영; 엄경태; 양택호; 권민아; 송봉근; 최지은; 임혜진
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2016-04-19

Abstract

본 발명은 캔디다 앤탁티카 균주로부터 유래된 리파제를 변이시킨 변이된 리파제, 상기 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 변이된 리파제를 생산하는 방법 및 상기 변이된 리파제를 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 변이된 리파제 유전자를 이용하면, 피키아 파스토리스 균주로부터 유래된 형질전환체로부터 우수한 효율로 리파제를 생산할 수 있으므로, 바이오디젤의 생산방법을 비롯한 리파제를 이용한 다양한 화합물의 생물학적 생산공정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

피키아 파스토리스 균주를 이용한 캔디다 앤탁티카 균주 유래 리파제의 생산방법{Process for preparing lipase derived from Candida antarctica using Pichia pastoris}

본 발명은 피키아 파스토리스 균주를 이용한 캔디다 앤탁티카 균주 유래 리파제의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 캔디다 앤탁티카 균주로부터 유래된 리파제를 변이시킨 변이된 리파제, 상기 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 변이된 리파제를 생산하는 방법 및 상기 변이된 리파제를 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법에 관한 것이다.

바이오촉매용 효소시장은 다양한 산업분야에 파급효과를 보이면서도 빠른 성장수준을 보이고 있다. 산업용 효소과 신기능 효소류는 약 130여 종이 있으나, 실제 효소시장에서 공급 및 이용되는 효소는 30개 미만의 효소가 90% 이상을 차지하고 있다. 따라서 생촉매의 고효율성, 초정밀성, 고선택성의 장점을 이용하기 위해 공해유발 및 고에너지 요구성의 화학합성반응을 대체할 수 있는 청정 생물전환기술의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

이러한 바이오촉매용 효소 중의 하나인 리파제(lipase, glycerol ester hydrolases)는 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르(carboxylic acid ester)나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 의미하는데, 가수분해(hydrolysis), 알콜분해(alcoholysis), 산분해(acidolysis), 에스테르화(esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하고, 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지할 수 있으며, 촉매반응 과정에 별도의 보조인자(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내며, 광학이성질체중 어느 한쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있다는 다양한 특성을 나타내어, 산업적이 유용성이 입증되고 있다. 또한, 에스테르 결합의 가수분해 뿐만이 아니고 그 역반응인 에스테르 합성작용 기능 또한 가지고 있어, 트리글리세리드를 이용한 식품, 의약품, 화장품 등의 원료 및 첨가물과 에스테르 결합으로 이루어진 여러 화학합성물질을 제조하기 위한 생촉매로서 다양한 활용성이 개발되고 있다.

예를 들어, 상기 리파아제는 생체 내에서 지방대사의 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 치즈 풍미 증진, 야채 발효시 유리지방산 증가, 육류 숙성시 향기 증진 및 어류 지방 분해에도 작용하고, 고가의 순수광학 이성질체 합성에도 사용될 수 있는 등의 폭넓은 활용범위를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 산업적으로도 널리 활용되고 있는데, 구체적으로, 낙농산업 분야에서는 유지방 분해를 통한 치즈의 제조, 버터나 크림의 지방분해를 위해 사용되고, 세제산업 분야에서는 세탁 또는 세척세제의 제조, 환경오염 폐수 감소, 반응온도 감소 등에 사용되며, 유화학산업분야에서는 불포화 지방산 생산, 비누제조, 싼 팜유를 이용한 코코아 버터의 생산 등에 활용되고, 제지산업 분야에서는 나무의 송진 또는 수지 제거, 폐지의 잉크제거 등에 활용되며, 제약산업 분야에서는 R, S- 광학이성질체 구분 합성, 라세믹 혼합물의 분리, 약제조 등에 이용되고, 화장품산업 분야에서는 왁스를 비롯한 피부용품, 선탠크림, 목욕용품 등의 제조에 이용되며, 에너지산업 분야에서는 식물성 기름으로부터 바이오디젤의 생산에 활용되고 있다.

이러한 리파제는 다양한 동물, 식물, 미생물 등으로부터 생산되는 것으로 알려져 있는데, 최근에는 유전공학적 기법을 이용한 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 리파제를 대량생산하는 방법이 개발되고 있다. 특히, 박테리오파지를 포함한 세균과 효모 등의 단세포 생물의 세포 표면에 리파제를 발현시키는 방법, 다양한 종류의 리파제를 하나의 미생물로부터 동시에 발현시켜서 산업적으로 유용한 생촉매를 제조하는 방법, 다양한 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법 등이 개발되고 있다. 예를 들어, 한국특허등록 제475133호에는 효모 표면 발현벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제658193호에는 신규한 저온성 지질분해 활성을 나타내는 리파제 및 대장균을 이용하여 이를 대량생산하는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2009-0065673호에는 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하고, 이의 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 방법이 개시되어 있다.

상기 개발된 방법 중에서도, 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법이 주목받고 있다. 종래의 유전공학적 생물반응기의 주된 숙주세포로 사용되어온 대장균은 다양한 동물, 식물, 미생물 유래의 유전자를 비교적 용이하게 발현시킬 수 있고, 균체의 생장속도가 빠르며, 숙주내에서 유전자의 변이확률이 낮다는 장점이 있으나, 도입된 유전자의 발현효율이 낮으며, 해독후 가공공정을 수행하기 어렵고, 도입된 유전자로부터 발현된 단백질을 분비생산하기가 용이하지 않다는 단점이 있어, 산업적인 생산에 적용할 수 없었다. 이에 반하여, 효모는 대장균에 비하여 도입된 유전자의 발현효율이 우수하고, 해독후 가공공정이 수행될 수 있으며, 도입된 유전자로부터 발현된 단백질을 용이하게 분비생산할 수 있다는 장점이 있을 뿐만, 아니라 대장균과 유사한 수준으로 기술수준이 축적되어 있어, 도입된 유전자를 이용한 산업적 생산이 용이하기 때문에, 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법이 주목받고 있다. 다만, 대장균에 비하여, 도입된 외래 유전자를 발현시키는 것이 용이하지 않아, 사용되는 효모 균주에 따라 도입하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 최적화하여야 한다는 단점이 있으나, 산업적이 생산성이 우수하기 때문에, 효모에서 생산성을 최적화시킬 수 있는 도입 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개발하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 효모 균주의 일종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주에서 발현이 최적화 될 수 있는 리파제 유전자를 개발하고자 예의 연구, 노력한 결과 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래된 리파제를 변이시킨 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 경우, 리파제 발현이 최적화됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 캔디다 앤탁티카 균주로부터 유래된 리파제를 변이시킨 변이된 리파제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 변이된 리파제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이된 리파제를 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 효모 균주의 일종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주에서 발현이 최적화 될 수 있는 리파제 유전자를 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래된 리파제를 피키아 파스토리스 균주에서 발현이 최적화되도록 변이시킨 변이된 리파제를 개발하였다. 상기 변이된 리파제는 캔디다 앤탁티카 균주로부터 유래된 리파제에 비하여 2개 부위에서 차이가 있는 아미노산 서열로 구성되는데, 상기 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 야생형 리파제가 피키아 파스토리스 균주에서 발현이 최적화되도록 변이시킨 것으로서, 피키아 파스토리스 균주에서 효과적으로 발현될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하면, 피키아 파스토리스 균주를 이용한 리파제의 효율적인 생산에 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이된 리파제를 제공한다.

본 발명의 용어 "리파제(lipase)"란, 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 의미하는데, 가수분해(hydrolysis), 알콜분해(alcoholysis), 산분해(acidolysis), 에스테르화(esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기 리파제는 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지하고, 촉매반응 과정에 별도의 보조인자(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내며, 광학이성질체 중 어느 한 쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있어 산업적 응용성이 높은 효소 중의 하나이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려졌으며, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구, 리파제 유전자를 확보하기 위한 연구가 진행되고 있다. 특히, 식품, 세제, 정밀화학, 화장품 및 대체에너지산업 등 산업 전반에 걸쳐서 리파제를 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 의약품을 비롯한 부가가치가 높은 선도물질을 합성하는 정밀화학분야에서 리파제가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는데, 산업에 널리 쓰이는 키랄 소재에 에스테르 결합이 많이 포함되어 있기 때문이다. 키랄성(chirality)을 지닌 대부분의 의약품이나 농약들은 특정 에난티오머(enantiomer)만 약리활성을 가지고 다른 에난티오머는 활성이 없거나 심지어 독성을 보이기도 하므로 활성 에난티오머만을 생산하는 것이 중요한데, 최고 700 psi의 고압과 250℃ 이상의 고온 등의 극단적인 조건이 요구되는 비대칭 화학 합성법에 비하여 리파제를 사용할 경우에는 극단적인 조건이 요구되지 않아, 생산성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서는, 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 야생형 리파제에 있어서, 2개의 아미노산을 변이시킨 아미노산 서열(서열번호 3)을 포함하는 변이된 리파제를 제공한다. 상기 야생형 리파제의 아미노산 서열(서열번호 1)과 변이된 리파제의 아미노산 서열(서열번호 3)을 비교하면, 총 317개의 아미노산 중에서 2개의 아미노산(A57T, T89A)이 상이하여 전체적으로 99.4%의 동일성을 나타내며, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이된 리파제는 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이라 할 수 있다.

아울러, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제는 종래의 리파제 보다도 피키아 파스토리스 균주에서 보다 효율적으로 발현될 수 있는 한, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 종래의 리파제 보다도 피키아 파스토리스 균주에서 보다 효율적으로 발현될 수 있다면, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제의 범주에 포함될 수 있다.

특히, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제는 서열번호 3의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이된 리파제를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 야생형 리파제의 아미노산 서열(서열번호 1)을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 염기서열(서열번호 2)을 피키아 파스토리스 균주에서 효과적으로 발현되도록 최적화시킨 염기서열(서열번호 4) 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 염기서열(서열번호 4)의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 4의 염기서열 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 4의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

상기 서열번호 4의 염기서열을 야생형 리파제를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열과 비교하면, 대폭적으로 변화되었으나, 이에 의하여 변화된 아미노산 서열은 총 317개 중에 2개에 불과하고, 나머지 변이된 염기서열은 아미노산의 변화없이, 상기 뉴클레오티드가 피키아 파스토리스 균주에서 보다 효과적으로 발현할 수 있도록 최적화된 것으로 예상되었다.

본 발명에서 제공하는 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 지금까지 알려진 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 비교하여, 자연계에서는 이와 동일한 염기서열의 폴리뉴클레오티드가 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이라 할 수 있다.

또한, 종래의 리파제 보다도 피키아 파스토리스 균주에서 보다 효율적으로 발현될 수 있는 변이된 리파제를 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 염기서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여, 상기 피키아 파스토리스 균주가 변이된 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체가 되도록 변이시키는 역할을 수행할 수 있다.

이를 위하여, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 변이된 리파제의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 변이된 리파제를 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 피키아 파스토리스 등의 효모 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 바람직하게는 피키아 파스토리스 균주가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주"란, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 함께 재조합 단백질 생산에 가장 널리 활용되는 효모균주를 의미하는데, 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다는 장점을 갖는다. 뿐만 아니라 인체단백질과 같은 고등세포 유래의 단백질을 재조합 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능과 당쇄부가 등과 같은 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification) 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 재조합 단백질의 분비 생산은 단백질 분비시그날과 목표단백질을 인위적으로 융합(fusion)함으로써 세포외 분비가 가능한 것으로, 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행되며 따라서 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한, 생물학적 활성을 갖는 단백질을 배지로부터 직접 얻을 수 있기 때문에 경제적으로 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다.

아울러, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 변이된 리파제를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 발현벡터를 숙주세포인 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작되는데, 상기 제작된 형질전환체 중에서 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제의 생산효율을 증대된 형질전환체를 스크리닝 하는 단계를 추가로 수행하고, 이로부터 얻어진 형질전환체가 될 수 있다. 발현 벡터가 독립된 유전자로 존재하여 각 세포가 동일하게 도입된 유전자를 발현시키는 박테리아와는 달리, 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주는 동일한 발현벡터를 도입한다 하여도, 각 형질전환체마다 도입된 유전자의 발현수준이 상이하게 될 수 있다. 이에 따라, 상기 형질전환체 중에서 CalB-OPT를 가장 효율적으로 생산하는 형질전환체를 선발하기 위한 스크리닝을 수행함으로써, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제의 생산효율을 증대된 형질전환체를 수득할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주에, 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래되고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 리파제를 코딩하는 유전자를 도입한 형질전환체를 제작하고, 이를 "피키아 파스토리스 KCM-AT(Pichia pastoris KCM-AT)"라 명명하였으며, 이를 2014년 9월 29일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 수탁번호 KCTC18326P로 기탁하였다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 효소활성측정결과, 리파제의 생산량측정결과 등을 기준으로 수행될 수 있는데, 보다 효과적으로 변이된 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체를 수득하기 위하여는 효소활성측정결과 및 리파제의 생산량측정결과를 함께 측정기준으로 사용하여 스크리닝을 수행함이 바람직하다.

예를 들어, 상기 효소활성측정결과를 확인하기 위하여는, 상기 형질전환체에서 생산된 변이된 리파제를 포함하는 배양액에 트리글리세리드, pNP-에스터 등의 리파제 기질을 가하고, 상기 기질내의 에스테르 결합을 분해하는 활성을 측정하는 방법을 사용할 수 있고; 상기 변이된 리파제의 생산량측정결과를 확인하기 위하여는 상기 형질전환체로부터 생산된 변이된 리파제를 정제하여 단위 배양액당 생산된 변이된 리파제의 양을 비교하는 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 본 발명의 변이된 리파제를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 변이된 리파제를 제조하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제를 회수하는 단계를 포함한다.

또 다른 방법으로서, 본 발명의 변이된 리파제를 제조하는 방법은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이된 리파제를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 변이된 리파제를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 변이된 리파제의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 변이된 리파제를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 변이된 리파제를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 배양에 사용되는 배지는 통상의 효모 또는 균주의 배양에 필요한 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 비-이온성 계면활성제, 폴리소르베이트(Polysorbate)(상표명 tween20) 또는 폴록사머(poloxamer)(상표명 폴록사머 188)를 포함하고, 통상의 효모 또는 균주의 배양에 필요한 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지가 될 수 있다.

아울러, 본 발명에서 제공하는 변이된 리파제의 제조방법은 상기 회수된 변이된 리파제를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정제단계는 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질이어서 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 인식하여 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래된 리파제(Candida antarctica Lipase B, CalB)를 코딩하는 CalB 유전자를 수득하고, 상기 수득한 CalB 유전자가 피키아 파스토리스 균주에서 효율적으로 생산되도록 상기 CalB 유전자의 염기서열을 최적화하여, 변이된 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였으며, 상기 제작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터(도 1)를 피키아 파스토리스에 도입하여 형질전환체를 제작한 다음, 상기 제작된 형질전환체를 대상으로 스크리닝을 수행하여, 상기 형질전환체 중에서 리파제 발현효율이 우수한 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체는 순도 90%이상의 CalB를 배양액 1ℓ당 1g 이상의 수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이된 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 바이오디젤의 생산방법은 (a) 본 발명의 변이된 리파제를 발현시키는 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리한 변이된 리파제를 유지 및 알코올과 반응시켜서 반응물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 반응물로부터 바이오디젤을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 바이오디젤의 제조에 사용되는 형질전환체, 배양물 또는 변이된 리파제는 자유로운 형태 또는 고정화된 형태로 사용할 수 있는데, 고정화된 형태로 사용할 경우, 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용하여 고정화시킬 수 있다. 상기 고정화 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 흡착법, 포괄법 등의 물질적인 방법 및 공유결합법, 가교연결방법 등의 화학적인 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 바이오디젤의 제조방법에 사용되는 유지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 천연유지, 가공유지, 폐유지 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 대두유, 채종유, 팜유 등이 될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 바이오디젤의 제조방법에 사용되는 알코올 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 8개인 알코올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 4개인 알코올을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 이소-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올, 테르-부탄올 등을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 당업계에 공지된 다양한 공급 방식을 이용하여 공급할 수 있으며, 여러 단계에 걸쳐서 공급하거나 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있다.

본 발명의 변이된 리파제 유전자를 이용하면, 피키아 파스토리스 균주로부터 유래된 형질전환체로부터 우수한 효율로 리파제를 생산할 수 있으므로, 바이오디젤의 생산방법을 비롯한 리파제를 이용한 다양한 화합물의 생물학적 생산공정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제작한 CalB 유전자를 발현시키기 위한 재조합 발현벡터 pPICZαA/CalB-wt 및 pPICZαA/CalB-OPT의 벡터맵을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: CalB 유전자의 수득

캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 수행함으로써, 캔디다 앤탁티카로부터 유래된 리파제(Candida antarctica Lipase B, CalB)(서열번호 1)를 코딩하는 CalB-wt 유전자(서열번호 2)를 수득하였다. 이때, PCR 조건은 95℃ 5분, 30회 반복(95℃ 30초, 56℃ 30초 및 72℃ 1분) 및 72℃ 7분으로 설정하였다.

Forward primer: 5'-GAATTCAAGCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG-3'(서열번호 5)

(GAATTC : restriction enzyme 1 EcoR I)

Reverse primer: 5'-GCGGCCGCTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAG-3'(서열번호 6)

(GCGGCCGC : restriction enzyme 2 Not I)

상기 수득한 CalB-wt 유전자(서열번호 2)가 피키아 파스토리스 균주에서 효율적으로 생산되도록 상기 CalB-wt 유전자의 코돈최적화(codon optimization)를 수행하여, 피키아 파스토리스 균주에서 리파제를 효율적으로 생산할 수 있는 변이된 유전자인 CalB-OPT 유전자(서열번호 4)를 수득하였다. 이때, 코돈최적화는 미국 DNA2.0사(www.dna20.com)의 codon optimization algorithm을 이용하여 CalB-WT유전자를 피키아 파스토리스 균주에서 발현하기 위한 최적 형태로 코돈을 변환하였고, 변환된 유전자를 토대로 CalB-OPT유전자를 합성하여 수행하였다.

상기 서열번호 4의 유전자는 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 변이된 CalB(서열번호 3)를 발현시킬 수 있을 것으로 예상되었다.

실시예 2: 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제작

상기 실시예 1에서 수득한 CalB-wt 유전자 및 CalB-OPT 유전자에 제한효소인 EcoR I/Not I을 처리하여 각각의 DNA 단편을 수득하고, 상기 수득한 각 DNA 단편을 벡터 pPICZαA의 다클론부위에 삽입하여 재조합 발현벡터(pPICZαA/CalB-wt 및 pPICZαA/CalB-OPT)를 제작하였다(도 1). 이때, 재조합 발현 벡터 제작을 위한 숙주 세포로는 대장균을 사용하였다.

도 1은 본 발명에서 제작한 CalB-wt 유전자 및 CalB-OPT 유전자를 발현시키기 위한 재조합 발현벡터 pPICZαA/CalB-wt 및 pPICZαA/CalB-OPT의 벡터맵을 나타낸다.

한편, 상기 제작된 각 재조합 발현벡터(pPICZαA/CalB-wt 및 pPICZαA/CalB-OPT)를 전기충격(electroporation transformation) 방법으로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris X-33) 균주에 도입하여 각각의 형질전환체를 제작하였다.

상기 제작된 형질전환체를 "피키아 파스토리스 KCM-AT(Pichia pastoris KCM-AT)"라 명명하였으며, 이를 2014년 9월 29일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 수탁번호 KCTC18326P로 기탁하였다.

실시예 3: 변이된 CalB 를 생산하기 위한 최적 형질전환체 스크리닝

발현 벡터가 독립된 유전자로 존재하여 각 세포가 동일하게 도입된 유전자를 발현시키는 박테리아와는 달리, 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주는 동일한 발현벡터를 도입한다 하여도, 각 형질전환체마다 도입된 유전자의 발현수준이 상이하게 될 수 있다. 이에 따라, 상기 형질전환체 중에서 변이된 리파제(CalB-OPT)를 가장 효율적으로 생산하는 형질전환체를 선발하기 위한 스크리닝을 수행하였다.

구체적으로, BMMY 아가배지(1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate, 1.34% YNB, 4x 10^-5% biotin, 0.5% methanol, 2% agar, pH 6.0)에 0.8 %(v/v)가 되도록 트리부티린(tributyrin)을 가하고 초음파처리하여 불투명한 고체배지를 제작하였다. 상기 제작된 고체배지에 상기 실시예 2에서 제작된 형질전환체를 접종하고, 30℃에서 48시간동안 배양하였다. 상기 접종된 형질전환체가 증식하면서 CalB-OPT를 발현시키면, 발현된 CalB-OPT에 의해 배지에 포함된 트리부티린이 분해되어 투명환이 형성되는데, CalB-OPT의 발현량 또는 활성에 비례하여 상기 투명환의 면적 또는 반경이 증가하므로, 투명환의 면적 또는 반경을 기준으로 우수한 CalB-OPT 발현량 또는 활성을 나타내는 20개의 균주를 1차 스크리닝하였다.

상기 1차 스크리닝을 통해 선별된 20여개의 형질전환체를 1㎖ BMMY액체배지(1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate, 1.34% YNB, 4x 10^-5% biotin, 0.5% methanol, pH 6.0)에 접종하고, 30℃ 및 200rpm 배양기에서 48시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였다. 상기 수득한 배양물을 4000rpm으로 10분간 원심분리를 하여 배양 상등액을 수득하고, 상기 배양 상등액에 pNPB(para-nitrophenyl butyrate) 용액(100μM pNPB in 50 mM tris-HCl, pH 8.0)을 가하고, 10분간 반응시켰다. 상기 pNPB는 CalB-OPT에 의해 분해되어 노란색을 나타내는 pNP(para-nitrophenol)를 분해산물로 생성하고, CalB-OPT의 발현량 또는 활성이 증가할 수록 pNP의 생성량이 증가하므로, 상기 반응이 종료된 후, 반응산물을 대상으로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 가장 높은 흡광도를 나타내는 CalB-OPT를 발현시키는 형질전환체를 2차 스크리닝하였다.

상기 2차 스크리닝을 통해 선별된 형질전환체를 실험실적 규모(2ℓ 배양) 또는 산업적 규모(30ℓ 및 300ℓ 배양)로 배양하고, 상기 배양물에 포함된 CalB-OPT의 함량을 측정한 결과, 순도 90%이상의 CalB-OPT가 배양액 1ℓ당 1g 이상의 수율로 생산됨을 확인하였다.

미생물자원센터

KCTC18326P

20140929

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Process for preparing lipase derived from Candida antarctica using Pichia pastoris <130> KPA140720-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant lypase <400> 1 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 2 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide <400> 2 ctgccttccg gttcggaccc tgccttttcg cagcccaagt cggtgctcga tgcgggtctg 60 acctgccagg gtgcttcgcc atcctcggtc tccaaaccca tccttctcgt ccccggaacc 120 ggcaccacag gtccacagtc gttcgactcg aactggatcc ccctctctgc gcagctgggt 180 tacacaccct gctggatctc acccccgccg ttcatgctca acgacaccca ggtcaacacg 240 gagtacatgg tcaacgccat caccacgctc tacgctggtt cgggcaacaa caagcttccc 300 gtgctcacct ggtcccaggg tggtctggtt gcacagtggg gtctgacctt cttccccagt 360 atcaggtcca aggtcgatcg acttatggcc tttgcgcccg actacaaggg caccgtcctc 420 gccggccctc tcgatgcact cgcggttagt gcaccctccg tatggcagca aaccaccggt 480 tcggcactca ctaccgcact ccgaaacgca ggtggtctga cccagatcgt gcccaccacc 540 aacctctact cggcgaccga cgagatcgtt cagcctcagg tgtccaactc gccactcgac 600 tcatcctacc tcttcaacgg aaagaacgtc caggcacagg ctgtgtgtgg gccgctgttc 660 gtcatcgacc atgcaggctc gctcacctcg cagttctcct acgtcgtcgg tcgatccgcc 720 ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gcagactatg gcattacgga ctgcaaccct 780 cttcccgcca atgatctgac tcccgagcaa aaggtcgccg cggctgcgct cctggcgccg 840 gcggctgcag ccatcgtggc gggtccaaag cagaactgcg agcccgacct catgccctac 900 gcccgcccct ttgcagtagg caaaaggacc tgctccggca tcgtcacccc ctga 954 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated lypase <400> 3 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized nucleotide <400> 4 ctgccgtcag gttctgaccc ggcctttagc cagccgaagt ctgttctgga tgctggcctg 60 acatgtcagg gtgcaagccc gtcgtccgta agcaaaccaa ttctgcttgt accaggcacg 120 ggcactacgg gcccgcagag ctttgattct aattggattc ccctgtctac ccagcttggg 180 tacacccctt gttggattag cccgcctccc ttcatgctga acgatacaca agtgaatact 240 gagtacatgg tcaacgcaat taccgccctt tatgcgggaa gtggtaacaa taaacttccc 300 gtgctgacat ggagtcaggg gggcctggtg gcacagtggg gattgacgtt tttcccatcg 360 atccgctcga aagttgatcg tctgatggca tttgcgcctg attataaagg cacagtgctc 420 gcggggccat tagatgccct ggctgtgtca gcacctagtg tctggcaaca gacgaccggt 480 tccgcgctga cgaccgccct ccggaacgca ggtggactga cccaaattgt gccgacaacc 540 aacttgtata gcgccaccga cgaaattgtt cagccgcagg tctccaattc gcctctcgat 600 tcaagctatc tgtttaacgg caaaaatgta caggcacagg ctgtttgcgg gccattattc 660 gtcatcgacc atgccggtag cttaacctcc cagttcagtt acgtggttgg tcgctctgcc 720 ctgcgtagta ccacgggcca agcgcgctca gcggactacg gtatcactga ttgcaatccg 780 ttaccggcga atgacctgac tccggaacaa aaggtagcgg ctgcggcttt gttagcgccg 840 gccgctgccg cgattgtggc aggtcctaaa caaaactgtg aaccggatct gatgccctat 900 gcccgtccgt ttgcggtcgg caaacgtact tgctcaggta tcgttacgcc atga 954 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaattcaagc tgccttccgg ttcggaccct g 31 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcggccgctc agggggtgac gatgccggag cag 33

Claims

서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이된 리파제(lipase).
제1항에 있어서,
상기 변이된 리파제는 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 균주로부터 유래된 리파제를 변이시킨 것인 리파제.
제1항의 변이된 리파제를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서,
서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제5항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어, 변이된 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체.
제6항에 있어서,
상기 숙주세포에 발현벡터를 도입하여 제작된 형질전환체를 대상으로 스크리닝하는 단계를 추가로 수행하여 수득한 것인 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 스크리닝은 변이된 리파제의 효소활성측정, 변이된 리파제의 생산량 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 기준에 의하여 수행되는 것인 형질전환체.
제8항에 있어서,
상기 변이된 리파제의 효소활성측정은 트리글리세리드 또는 pNP-에스터에 대한 에스테르결합 분해활성을 측정하여 수행되는 것인 형질전환체.
제6항에 있어서,
상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주인 것인 형질전환체.
제6항에 있어서,
상기 형질전환체는 수탁번호 KCTC18326P로 기탁된 피키아 파스토리스 KCM-AT(Pichia pastoris KCM-AT)인 것인 형질전환체.
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;
(c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
(d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 변이된 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이된 리파제의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서,
(d) 단계에서 회수된 변이된 리파제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서,
상기 정제는 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것인 방법.
(a) 제1항의 변이된 리파제, 제6항의 변이된 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체의 배양물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 유지 및 알코올과 반응시켜서 반응물을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 반응물로부터 바이오디젤을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오디젤의 생산방법.
제16항에 있어서,
상기 변이된 리파제, 형질전환체 또는 배양물은 고정화된 것인 방법.
제16항에 있어서,
상기 유지는 천연유지, 가공유지 또는 폐유지인 것인 방법.
제16항에 있어서,
상기 알코올은 탄소수 2개 내지 8개의 알코올인 것인 방법.