KR102648170B1 - 높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지 상에서의 발효에 의한 개선된 1,3-프로판디올 생산을 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키고 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현하는 재조합 미생물을 글리세린을 포함하는 배지 상에서 배양하는 것을 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산을 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 글리세롤로부터의 1,3 프로판디올의 생산을 위한 재조합 미생물로서, 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키고 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현하는 미생물.

Description

높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지 상에서의 발효에 의한 개선된 1,3-프로판디올 생산을 위한 미생물 및 방법

본 발명은 높은 글리세롤 함량을 갖는 배양 배지로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 위한 새로운 방법 및 미생물에 관한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 글리세롤은 산업용 글리세린이다. 보다 특히, 미생물은 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현한다.

트리메틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로도 지칭되는 1,3-프로판디올 (PDO)은 가장 오래된 공지된 발효 산물 중 하나이다. 이는 원래 클로스트리디움 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum)을 함유하는 글리세롤 발효된 배양물에서 오거스트 프로인트(August Freund)에 의해 1881년도에 일찍 확인되었다. PDO는 글리세롤 발효의 전형적인 산물이지만, 이는 다른 유기 기질의 혐기성 전환에서 발견되었다. 모든 박테리아 중에서 극소수의 유기체가 PDO를 형성할 수 있다. 이들은 클레브시엘라(Klebsiella) 속 (케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae)), 엔테로박터(Enterobacter) 속 (이. 아글로메란스(E. agglomerans)) 및 시트로박터(Citrobacter) 속 (씨. 프레운디이(C. freundii)), 락토바실리(Lactobacilli) 속 (엘. 브레비스(L. brevis) 및 엘. 부흐네리(L. buchneri)) 및 클로스트리디아(Clostridia) 속 (씨. 부티리쿰(C. butyricum), 씨. 파스테우리아눔(C. pasteurianum))의 엔테로박테리아를 포함한다. 이들 중에서, 씨. 부티리쿰은 수율 및 역가 둘 다의 관점에서 PDO의 가장 양호한 "천연 생산자"인 것으로 간주된다.

PDO는, 이관능성 유기 화합물로서, 폴리에스테르, 폴리에테르 및 풀리우레탄, 및 특히 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT)를 생산하기 위한 중축합용 단량체로서를 비롯한 많은 상이한 합성 반응에 잠재적으로 사용될 수 있다. PDO의 구조 및 반응성을 고려하여, 이는 또한 용매, 접착제, 청정제, 화장품, 텍스타일 (예를 들어 의류 섬유 또는 바닥재) 및 플라스틱 (예를 들어 자동차 산업, 패킹에서, 또는 코팅으로서)에서의 구성성분으로서 사용될 수 있다.

다양한 화학적 방법이 PDO를 생산하는데 사용될 수 있지만, 이들은 극도의 오염 물질을 함유하는 폐기물 스트림을 생성함으로써, 화학적으로 생산된 PDO가 석유화학적으로 이용가능한 디올, 예컨대 1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올, 및 1,4-부탄디올과 가격 경쟁력이 되는 것을 방해한다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 사용한 D-글루코스의 PDO로의 생물학적 전환을 위한 보다 환경적으로 친화적인 방법이 기재되었지만, 이러한 방법은 몇몇 주요한 단점을 갖는다. 특히, 배양은 생산 균주의 불안정성으로 인해 불연속적이고, 또한 고가의 보조-인자 비타민 B₁₂의 첨가를 요구한다. 사실, PDO는 이. 콜라이에서 비타민 B₁₂-의존성 경로를 통해 생산될 수 있지만, 이. 콜라이 자체는 이러한 보조-인자를 생산하지 않는다.

바이오디젤 산업에 의해 생산된 글리세롤을 포함하는 다량의 산업용 글리세린의 이용가능성으로 인해, 기질로서 산업용 글리세린을 사용한 보다 높은 탄소 수율을 갖는 연속적인 비타민-B₁₂-무함유 공정이 유리할 것이다.

순수한 글리세롤은 폭넓게 다양한 적용 (예를 들어 식품, 제약, 또는 화장품 첨가제로서)을 갖지만, 바이오디젤 합성 동안 생산된 산업용 글리세린은 일반적으로 염 및 물과 혼합된 80-85%의 글리세롤을 함유하며, 따라서 그것이 첨가제로서 사용될 수 있기 전에 추가의 정제 단계를 요구한다. 그 결과, 산업용 글리세린은 가치있는 상품이라기 보다는 폐기물로서 처리되며, 따라서 다른 탄소 공급원, 예컨대 글루코스 또는 순수한 글리세롤과 비교할 경우, PDO에 대한 풍부하고 저렴한 발효 기질을 대표한다.

클로스트리디아는 PDO의 생산을 위한 매우 유망한 균주를 대표한다. 사실, 씨. 부티리쿰은 배치 및 2-스테이지 연속적 발효에서 B₁₂-비의존성 경로를 통해 PDO의 생산을 위한 단독 탄소 공급원으로서 순수한, 그러나 또한 산업용 글리세린을 사용할 수 있다 (Papanikolaou et al., 2000). 그러나, 가장 높은 글리세롤 농도에서, 수득된 최대 PDO 역가는 0.02h^-1의 희석률에서 48.1 g/L이었으며, 이는 0.96 g/L/h의 생산성에 상응한다. 90 g/L의 공급 배지에서 효모 추출물 (박테리아 바이오매스를 증가시키는 것으로 공지된 유기 질소를 함유하는 고가의 화합물)의 존재 하에 최대 글리세롤 농도로 배양을 수행하였다.

WO 2006/128381은 PDO의 "천연 생산자", 예컨대 클레브시엘라 뉴모니아에, 씨. 부티리쿰 또는 씨. 파스테우리아눔을 이용하는 배치 및 페드-배치 배양에 의해 PDO를 생산하기 위해 산업용 글리세린을 사용하는 것을 개시한다. 그러나, WO 2006/128381에서 사용된 배지는 효모 추출물을 또한 함유한다. 도달한 최대 생산성은 또한 문헌 [Papanikolaou et al., 2000]에 의해 발견된 것과 유사하며, 0.8 내지 1.1 g/L/h에 포함되었다.

씨. 부티리쿰으로부터 비타민 B₁₂-비의존성 글리세롤-데히드라타제 및 PDO-데히드로게나제를 함유하는 재조합 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) 균주 ("씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5"로 지칭됨)의 성능은 문헌 [Gonzalez-Pajuelo et al., 2005]에 기재되었다. 이러한 균주는 원래, 최대 120 g/L의 순수한 글리세롤을 함유하는 공급 배지에서 성장하고 PDO를 생산한다. 또한, 60 g/L의 순수한 또는 산업용 글리세린을 함유하는 공급 배지로의 분석은 어떠한 차이도 제시하지 않았다. 이들 결과는 또한 효모 추출물의 존재 하에 수득되었다. 그러나, 60 g/L 초과의 글리세롤 농도를 포함하는 산업용 글리세린은 시험되지 않았다.

보다 최근, WO 2010/128070은 고농도의 산업용 글리세린 상에서 및 효모 추출물의 부재 하에 성장하도록 추가로 적응된 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주를 개시하였다. 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 생성된 집단은 노반스(Novance) (프랑스 콩피에뉴)로부터 공급된 상대적으로 고품질 산업용 글리세린을 최대 120 g/L의 글리세롤 농도로 함유하는 배양 배지에서 최대 53.5 g/L의 PDO 역가, 최대 0.53 g/g의 수율 및 최대 2.86 g/L/h의 생산성으로 PDO를 생산할 수 있었다.

특허 출원 WO 2012/062832에서, 발명자들은 WO 2010/128070에 기재된 것과 동일한 공정에 의해 수득된 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 집단으로부터의 클론 "c08"의 단리를 기재하였다. 이러한 클론은 대략 105 g/L의 글리세롤 농도를 갖는 노반스 (프랑스 콩피에뉴)로부터 공급된 상대적으로 고품질 산업용 글리세린을 포함하는 배양 배지에서 PDO를 생산할 수 있었다. 최대 50.45 g/L의 PDO 역가, 최대 0.53 g/g의 수율 및 최대 3.18 g/L/h의 생산성이 초기 집단에 대해 관찰된 반면, 단리된 클론 c08은 최대 51.30 g/L의 PDO 역가, 최대 0.50 g/g의 수율 및 최대 3.05 g/L/h의 생산성으로 동일한 조건 하에 증가된 PDO 생산을 제시하였다.

이들 개선에도 불구하고, 글리세롤로부터의, 특히 산업용 글리세린으로부터의 증가된 PDO 생산 (예를 들어 수율, 역가, 및/또는 생산성)에 대한 필요가 남아 있다. 또한, PDO 생산을 억제할 수 있는 보다 많은 양의 불순물을 갖는 산업용 글리세린으로부터, 및/또는 상이한 기원으로부터 수득된 산업용 글리세린으로부터 PDO를 생산하는 방법 및 미생물에 대한 필요가 존재한다. 사실, 산업용 글리세린의 조성은 한 제조자로부터 또 다른 제조자까지 및 심지어 배치 사이에도 다양할 수 있다. 더욱이, 산업용 글리세린은 성장 및/또는 PDO 생산을 억제할 수 있는 지방산 (예를 들어 올레산, 리놀레산), 알콜, 염 및 금속을 비롯한 비-글리세롤 유기물(Matter Organic Non-Glycerol) (MONG)로 지칭되는 불순물의 증가된 수준을 가져 더욱 오염된다. 마지막으로, 감소된 수준의 잔류 글리세롤을 갖는 방법 및 미생물에 대한 필요가 존재한다. 사실, 잔류 글리세롤 수준을 감소시키는 것은 하류 PDO 정제를 용이하게 한다.

본 발명은 특히 산업용 글리세린 기질로부터의 PDO의 개선된 생산을 위한 방법 및 미생물을 제공한다. 사실, 본 발명자들은 놀랍게도 hcpR 및/또는 frdX 유전자의 과다발현이, hcpR 및/또는 frdX 유전자가 과다발현되지 않은 비변형된 균주의 성능과 비교할 경우, PDO의 보다 높은 역가 및 보다 양호한 수율이 관찰되기 때문에, PDO 생산을 추가로 개선시킴을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 보다 적은 잔류 글리세롤이 연속적 배양 동안 존재함을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현하는 균주가 더욱 불순한 산업용 글리세린으로부터, 및 다양한 기원으로부터의 산업용 글리세린으로부터, 산업용 글리세린에 함유된 고동도의 글리세롤 (예를 들어 최대 약 105 g/L)의 존재 하에 이러한 개선된 수준에서 PDO를 생산할 수 있음을 밝혀내었다.

본 발명은 글리세롤을 PDO로 전환시키고 산화질소-반응성 전사 조절제 및/또는 페레독신-3 유사 단백질을 과다발현하는 재조합 미생물을 글리세롤을 포함하는 배지 상에서 배양하는 것을 포함하는, PDO의 발효적 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 hcpR 및 frdX 유전자이다. 바람직하게는, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 과다발현된다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 유전자 변형에 의해, 예컨대, 임의의 제한 없이, hcpR 및/또는 frdX 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 돌연변이시킴으로써, hcpR 및 frdX 유전자 사이의 유전자간 영역을 돌연변이시킴으로써, 유전자 중복에 의해, 또는 플라스미드로부터 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현시킴으로써 과다발현된다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, hcpR 및/또는 frdX 유전자는 2개의 유전자 사이의 유전자간 영역을 바람직하게는 삽입을 통해, 보다 바람직하게는 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 삽입을 통해 돌연변이시킴으로써 재조합 미생물에서 과다발현되며, 여기서 상기 적어도 1개의 뉴클레오티드는 바람직하게는 'A' 뉴클레오티드이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 유전자간 영역은 단일 염기 삽입, 바람직하게는 'A' 뉴클레오티드에 의해 돌연변이된다. 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 삽입은 반복된 'A' 뉴클레오티드를 포함하는, 바람직하게는 적어도 7개의 'A' 뉴클레오티드를 포함하는 영역에서 일어난다. 바람직하게는, 적어도 1개의 'A' 뉴클레오티드 삽입은 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈 (NCBI 참조 서열: NC_003030.1)의 위치 1014234 및 1014240 사이에 혼입된다.

본 발명의 방법의 특정한 실시양태에서, 재조합 미생물은 고농도의 글리세롤의, 구체적으로 산업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 적응된다. 바람직하게는, 산업용 글리세린 중 글리세롤 농도는 90 내지 120 g/L에 포함되며, 바람직하게는 약 105 g/L이다. 바람직하게는, 산업용 글리세린은 적어도 5% 지방산을 포함한다. 산업용 글리세린은 바람직하게는 바이오디젤 생산의 부산물이다. 궁극적으로, PDO는 바람직하게는 정제된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 재조합 미생물은 바람직하게는 클로스트리디움 또는 클레브시엘라 속의 종으로부터 선택되는, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 부티리쿰, 클로스트리디움 파스테우리아눔, 및 클레브시엘라 뉴모니아에로부터 선택되는 박테리아이다.

본 방법의 특정한 실시양태에 따르면, 재조합 미생물은 미생물 컨소시엄에서의 적어도 1종의 다른 미생물과, 바람직하게는 클로스트리디움 속의 적어도 1종의 다른 미생물과, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes) 또는 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides)와, 보다 더 바람직하게는 클로스트리디움 스포로게네스 및 클로스트리디움 스페노이데스 둘 다와 공동-배양된다.

본 발명은 또한 글리세롤로부터의 PDO의 생산을 위한 재조합 미생물로서, 글리세롤을 PDO로 전환시키고 산화질소-반응성 전사 조절제 및/또는 페레독신-3 유사 단백질을 과다발현하는 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 재조합 미생물에서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 hcpR 및 frdX 유전자이다. 바람직하게는, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 과다발현된다. 바람직하게는, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 유전자 변형에 의해, 예컨대, 임의의 제한 없이, hcpR 및/또는 frdX 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 돌연변이시킴으로써, hcpR 및 frdX 유전자 사이의 유전자간 영역을 돌연변이시킴으로써, 유전자 중복에 의해, 또는 플라스미드로부터 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현시킴으로써 과다발현된다.

바람직한 실시양태에서, hcpR 및/또는 frdX 유전자는 2개의 유전자 사이의 유전자간 영역을 바람직하게는 삽입을 통해, 보다 바람직하게는 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 삽입을 통해 돌연변이시킴으로써 재조합 미생물에서 과다발현되며, 여기서 상기 적어도 1개의 뉴클레오티드는 바람직하게는 'A' 뉴클레오티드이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 유전자간 영역은 단일 염기 삽입, 바람직하게는 'A' 뉴클레오티드에 의해 돌연변이된다. 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 삽입은 반복된 'A' 뉴클레오티드를 포함하는, 바람직하게는 적어도 7개의 'A' 뉴클레오티드를 포함하는 영역에서 일어난다. 바람직하게는, 적어도 1개의 'A' 뉴클레오티드 삽입은 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈 (NCBI 참조 서열: NC_003030.1)의 위치 1014234 및 1014240 사이에 혼입된다.

특히, 본 발명은 고농도의 산업용 글리세린을 갖는 배양 배지 상에서 성장하도록 적응된 재조합 미생물에 관한 것이며, 바람직하게는 산업용 글리세린 중 글리세롤 농도는 90 내지 120 g/L에 포함된다. 산업용 글리세린은 불순물을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 산업용 글리세린은 적어도 5% 지방산을 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 바람직하게는 클로스트리디움 또는 클레브시엘라 속의 종으로부터 선택되는, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 부티리쿰, 클로스트리디움 파스테우리아눔, 및 클레브시엘라 뉴모니아에로부터 선택되는 박테리아이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물 컨소시엄에서의 적어도 1종의 다른 미생물과, 바람직하게는 클로스트리디움 속의 적어도 1종의 다른 미생물과, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 스포로게네스 또는 클로스트리디움 스페노이데스와, 보다 더 바람직하게는 클로스트리디움 스포로게네스 및 클로스트리디움 스페노이데스 둘 다와 공동-배양된다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 따른 재조합 미생물에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특히 예시된 방법에 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정한 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이고, 제한인 것으로 의도되지 않으며, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 상기에 있든 하기에 있든, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원에 언급된 간행물은 간행물에 보고되고, 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기재하고 개시하는 목적을 위하여 인용된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 선행하는 것으로 자격부여되지 않는다는 허용으로서 해석되지 않아야 한다.

더욱이, 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 미생물학적 및 분자 생물학적 기법을 채용한다. 이러한 기법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Prescott et al. (1999)] 및 [Sambrook et al. (1989) (2001)]을 참조한다.

본원에 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수 지시대상을 포함함이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "미생물"에 대한 언급은 복수의 이러한 미생물을 포함하고, "내인성 유전자"에 대한 언급은 1종 이상의 내인성 유전자에 대한 언급을 포함하는 등이다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 이제 기재된다. 본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 청구범위 및 명세서의 해석에 사용될 수 있다.

이어지는 청구범위에서 및 선행하는 발명의 설명에서, 표현 언어 또는 필요한 암시로 인해 맥락이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 단어 "포함하다" 또는 변형어, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 포함적 의미로, 즉, 언급된 특색의 존재를 명시하기 위해, 그러나 본 발명의 다양한 실시양태에서 추가의 특색의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않기 위해 사용된다.

본 발명은 PDO의 발효적 생산을 위한 새로운 방법 및 미생물에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "미생물"은 일반적으로 자연에서 발견될 수 있는, 박테리아와 같은 원핵생물 유기체, 및 효모 및 진균과 같은 진핵생물 유기체를 비롯한 모든 유형의 단세포 유기체를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 미생물은 바람직하게는 박테리아이며, 보다 바람직하게는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 용어 "에스케리키아(Escherichia)", "클레브시엘라(Klebsiella)", "바실루스(Bacillus)", "클로스트리디움(Clostridium)", "클로스트리디아(Clostridia)" 및 "코리네박테리움(Corynebacterium)"은 이들 과 또는 속에 속하는 모든 박테리아 종을 지칭한다. 비제한적 예로서, 박테리아 종은 에스케리키아 종 (바람직하게는 에스케리키아 콜라이), 클레브시엘라 종 (바람직하게는 클레브시엘라 뉴모니아에), 바실루스 종 (바람직하게는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 클로스트리디움 종 (바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 부티리쿰, 및 클로스트리디움 파스테우리아눔) 및 코리네박테리움 종 (바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum))으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형된 미생물"은 예를 들어 적응에 의해 유전자 변형되거나 유전자 조작된 미생물 또는 미생물의 균주를 지칭한다. 이는 이들 용어의 통상적인 의미에 따르면, 본 발명의 미생물이 자연에서 발견되지 않으며, 그것이 유래된 "모" 미생물과 비교할 경우에 유전자 변형됨을 의미한다. "모" 미생물은 자연에서 발생할 수 있거나 (즉, 야생형 미생물), 사전에 변형되었을 수 있지만, 본 발명의 1종 이상의 단백질 (즉, HcdR 및/또는 FrdX)을 발현하거나 과다-발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 모 미생물에서 발현되거나 과다-발현되지 않은 적어도 HcdR 및/또는 FrdX 단백질을 발현하거나 과다-발현하도록 변형되었다.

바람직하게는, 모 미생물은 본원에 열거된 미생물로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 모 미생물은 클로스트리디움 종 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 부티리쿰, 클로스트리디움 파스테우리아눔, 및 관련된 단리물로부터, 또는 클레브시엘라 종, 예컨대 케이. 뉴모니아에 및 관련된 단리물로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 모 미생물은 문헌 [Gonzalez-Pajuelo et al., 2005]에 또는 PCT 특허 출원 번호 WO 2010/128070 또는 WO 2012/062832에 기재된 씨. 아세토부틸리쿰 균주로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 모 미생물은 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주, 예컨대 DG1 pSPD5 PD0001VE05 균주로부터 선택된다.

다양한 유전자 변형은 본 발명의 재조합 미생물에 대해 이루어질 수 있다. 비제한적 예로서, 내인성 유전자는 재조합 미생물에서 약독화되거나, 결실되거나, 과다-발현될 수 있는 반면, 외인성 유전자는 세포 내에서의 발현을 위해, 도입되거나, 플라스미드에 의해 운반되거나, 균주의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 유전자 조작에 의해, 미생물이 미생물에 대한 특이적 스트레스를 가하고, 돌연변이유발을 유도한다는 점에서 배양되는 적응에 의해, 또는 지정된 돌연변이유발 및 진화를 특이적 선택 압력 하에 조합함으로써 새로운 대사 경로의 발달 및 진화를 강제함으로서 수행될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, PDO의 발효적 생산을 위한 방법은 글리세롤을 PDO로 전환시키고 산화질소-반응성 전사 조절제 및/또는 페레독신-3 유사 단백질을 과다발현하는 미생물을 글리세롤을 포함하는 배지 상에서 배양하는 것을 포함한다.

달리 HcpR로 공지된, 본원에 기재된 산화질소-반응성 전사 조절제는 데이터베이스 http://regprecise.lbl.gov/RegPrecise/에 Crp 패밀리의 전사 조절제로서 기재되어 있다. 이는 cAMP 결합 도메인 및 cAMP-의존성 단백질 키나제의 조절 서브유닛을 포함한다. 이는 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰의 유전자 CA_C0884에 의해 코딩된다. 예시적인 유전자 및 아미노산 서열은 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 및 2에 제시되어 있다.

달리 FrdX로 공지된, 본원에 기재된 페레독신 3-유사 단백질은 특히 4Fe-4S 페레독신 철-황 결합 도메인을 포함한다. 이는 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰의 유전자 CA_C0885에 의해 코딩된다. 예시적인 유전자 및 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 3 및 4에 제시되어 있다.

상기 언급된 유전자의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 하기 표 1에, 그들의 수탁 번호 및 데이터베이스에서의 버전에 따라 및/또는 그들의 서열 확인에 따라 기재된다.

표 1: 본 발명의 hcpR 및 frdX 유전자 및 단백질

본원에 사용된 바와 같은 용어 "과다발현하다", "과다발현" 등은 동일한 조건 하에 비변형된 또는 "모" 미생물에서의 발현 수준 단백질에 비해, 상응하는 단백질에서의 발현의 임의의 증가를 포함하도록 폭넓게 취해져야 한다. 이는 단백질이 임의의 특정한 수준으로 발현되는 것을 의미하도록 취해지지 않아야 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 수준"은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예컨대 qRT-PCR, 웨스턴 블롯-이뮤노블롯, 효소-결합 면역흡착 검정 (예를 들어 ELISA), 정량적 단백질체학 접근법 등에 의해 측정가능한, 미생물에서 발현되는 관심의 단백질의 (또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 mRNA의) 양 (예를 들어 상대량, 농도)을 지칭한다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 미생물에서의 관심의 단백질의 과다발현을 용이하게 유도할 수 있다.

비제한적 예로서, 1종 이상의 내인성 유전자, 예컨대 hcpR 및/또는 frdX 유전자는 내인성 조절 요소 외에도 상향조절을 선호하는 이종 서열을 도입함으로써, 또는 그들 내인성 조절 요소를 이러한 이종 서열로 치환함으로써, 또는 내인성 유전자의 1개 이상의 보충적 카피를 미생물 내에서 염색체적으로 (즉, 염색체 내로) 또는 염색체외적으로 (예를 들어 플라스미드 또는 벡터 내로) 도입함으로써 과다발현될 수 있다. 이와 관련하여, 유전자의 몇몇 카피는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예컨대 유전자 재조합에 의해 염색체 상에 도입될 수 있다. 특히, 염색체 변형의 표준 기법은 예를 들어 클로스트리디움에 대해 특허 출원 WO 2008/040387에 기재된 상동성 재조합의 방법에 따라, 씨. 아세토부틸리쿰에서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자의 제2 카피는 염색체에서 도입된다 (즉, 유전자 중복). 대안적으로, 또는 추가적으로, 유전자는 플라스미드 또는 벡터 상에서 미생물 내로 도입되고, 염색체외적으로 발현될 수 있다. 비제한적 예로서, 이는 그들이 복제할 수 있는 미생물에 따라, 그들의 복제 원점에 관하여, 및 세포에서의 그들의 카피 수에 의해 상이할 수 있는 상이한 유형의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드에 의해 형질전환된 미생물은 선택된 플라스미드의 복제 원점의 성질에 따라, 플라스미드의 1 내지 5 카피, 약 20 카피, 또는 심지어 최대 500 카피를 함유할 수 있다. 그들의 복제 원점 및 세포에서의 그들의 카피 수에 관하여 상이한 다양한 플라스미드는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 목적을 위해 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 씨. 아세토부틸리쿰에서 복제할 수 있는 플라스미드의 예로는 제한 없이, pSOS 플라스미드 (Tummala et al. 1999), pSYL 계열의 플라스미드 (Lee, 1992), 및 pMTL 계열의 플라스미드 (Chambers et al. 1988) 등을 들 수 있다.

내인성 유전자를 과다발현시키는 또 다른 방법은 그의 프로모터 (즉, 야생형 프로모터)를 보다 강한 프로모터로 교환하는 것이다. 이러한 목적에 적합한 프로모터는 동종 (동이한 종으로부터 기원함) 또는 이종 (상이한 종으로부터 기원함)일 수 있으며, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 사실, 통상의 기술자는 내인성 유전자, 예컨대 hcpR 및/또는 frdX 유전자의 발현을 유도하기 위한 적절한 프로모터를 용이하게 선택할 수 있다. 유전자 발현 수준을 증가시키는데 가장 편리한 프로모터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다: 이들로는 다른 것들 중에서도, 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 및 람다 프로모터 P_R 및 P_L을 들 수 있다. 이들 프로모터는 특정한 화합물에 의해 또는 특이적 외부 조건, 예컨대 온도 또는 광에 의해 "유도가능"하고/거나, 동종 또는 이종일 수 있다. 유전자의 높은 과다발현을 초래하는 씨. 아세토부틸리쿰 프로모터의 구체적인 예로는 thl, adc, ptb 프로모터를 들 수 있다 (Tummala et al., 1999).

내인성 유전자 발현 수준은 또한 유전자의 코딩 서열 내로 또는 비-코딩 서열 내로 돌연변이를 도입함으로써 증가될 수 있다. 이들 돌연변이는 상응하는 아미노산에서의 변형이 일어나지 않을 경우에 동의성이거나, 상응하는 아미노산이 변경되는 경우에 비-동의성일 수 있다. 동의성 돌연변이는 번역된 단백질의 기능에 임의의 영향을 갖지 않지만, 돌연변이된 서열이 조절 인자에 대해 결합 부위에 위치하는 경우, 상응하는 유전자의 또는 심지어 다른 유전자의 조절에 대한 영향을 가질 수 있다. 비-동의성 돌연변이는 번역된 단백질의 기능에 대해 뿐만 아니라 돌연변이된 서열의 성질에 따라 조절에 대해 영향을 가질 수 있다.

특히, 비-코딩 서열에서의 돌연변이는 코딩 서열의 상류에 (즉, 프로모터 영역에, 인핸서, 사일런서, 또는 인슐레이터 영역에, 특이적 전사 인자 결합 부위에) 또는 코딩 서열의 하류에 위치할 수 있다. 프로모터 영역에 도입된 돌연변이는 코어 프로모터, 근위 프로모터 또는 원위 프로모터에 있을 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR: Polymerase Chain Reaction)을 사용한 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 예를 들어 돌연변이유발제 (자외선 또는 니트로소구아니딘 (NTG) 또는 에틸메탄술포네이트 (EMS)와 같은 화학제) 또는 DNA 셔플링 또는 오류-유발 PCR을 통한 무작위 돌연변이유발 기법에 의해 또는 미생물에 대해 특이적 스트레스를 가하고, 돌연변이유발을 적용하는 배양 조건을 사용하여 도입될 수 있다. 유전자의 상류에 위치한 영역에서의 1개 이상의 보충적 뉴클레오티드의 삽입은 특히 유전자 발현을 조정할 수 있다. 비제한적 예로서, 1종 이상의 돌연변이는 hcpR 및/또는 frdX 유전자 사이에 위치한 유전자간 영역 내로 도입될 수 있다 (hcpR 및 frdX 유전자 및 모 유전자간 영역을 포함하는 전체 서열은 서열식별번호: 15의 서열에 제시되어 있는 반면, 유전자간 영역 단독의 모 서열은 서열식별번호: 16의 서열에 제시되어 있음). 비제한적 예로서, "A" 뉴클레오티드의 삽입은 유전자간 영역에 도입될 수 있다. 이러한 삽입의 예는 서열식별번호: 17의 서열에 제시되어 있다.

본 발명의 맥락에서, 재조합 미생물은 바람직하게는 hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)를 과다발현한다. 바람직하게는, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 적어도 1.5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 2배, 보다 더 바람직하게는 적어도 3배 또는 약 4배 과다발현된다.

제1 바람직한 실시양태에 따르면, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 바람직하게는 삽입을 통해 2개의 유전자 사이의 유전자간 영역을 돌연변이시킴으로써 과다발현된다. 바람직하게는, 상기 유전자간 돌연변이는 hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)의 발현을 조절하는 프로모터 영역을 변형시켜 과다발현을 유도한다. 바람직하게는, 상기 유전자간 돌연변이는 hcpR 및 frdX 유전자 둘 다의 과다발현을 유도한다. 사실, hcpR 및 frdX 유전자는 씨. 아세토부틸리쿰에서 양방향성 유전자 쌍으로서 배열된다. 그러나, 유전자간 돌연변이의 유형에 따라, hcpR 및 frdX 유전자 중 단지 하나만이 과다발현될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자간 돌연변이는 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈의 위치 1014117 및 1014239 사이에 포함된다.

바람직하게는, 유전자간 영역은 'A', 'C', 'T', 및 'G' 뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 1개의 뉴클레오티드의 삽입에 의해 돌연변이된다. 바람직하게는, 유전자간 영역은 적어도 1개의 'A' 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1개의 'A' 뉴클레오티드의 삽입에 의해 돌연변이된다. 바람직하게는, 적어도 1개의 뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드가 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 초과로 반복되는 영역 내로 삽입된다 (예를 들어 'AAAAAA'를 포함하는 뉴클레오티드 스트레치에서 'A' 뉴클레오티드의 삽입). 상기 삽입이 'A' 뉴클레오티드인 경우, 상기 삽입은 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈의 위치 1014240에 추가로 위치할 수 있다. 바람직하게는, 상기 적어도 1개의 'A'는 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈의 위치 1014234 및 1014240 사이에 혼입된다.

제2 바람직한 실시양태에 따르면, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 외인성 벡터 또는 플라스미드 상의 미생물 내로의, 보다 바람직하게는 유도성 프로모터의 제어 하의 상기 유전자(들)의 도입에 의해 과다발현된다.

제3 바람직한 실시양태에 따르면, hcpR 및/또는 frdX 유전자(들)는 염색체에서 상기 유전자의 적어도 1개의 추가의 카피의 도입 (즉, 유전자 중복)에 의해 과다발현된다.

본원에서 제공된 유전자 및 아미노산 서열의 관점에서, 및 데이터베이스, 예컨대 유니프롯(UniProt) (단백질에 대해), 진뱅크(GenBank) (유전자에 대해), 또는 NCBI (단백질 또는 유전자에 대해)에서 이용가능한 정보를 사용하여, 통상의 기술자는 미생물의 특이적 단백질 및/또는 유전자의 서열을 용이하게 측정하고, 다른 미생물에서, 등가의 단백질 또는 유전자, 또는 그의 동족체를 확인할 수 있다. 이러한 통상적인 작업은 예를 들어 유전자 (또는 단백질) 서열을 갖는 미생물의 특이적 유전자 (또는 단백질) 서열 또는 상기 언급된 데이터베이스에서 발견될 수 있는 다른 미생물의 게놈 (또는 프로테옴)의 정렬에 의해 수행될 수 있다. 이러한 서열 정렬은 유리하게는 문헌 [Altschul et al. (1990)]에 의해 개발된 BLAST 알고리듬을 사용하여 수행될 수 있다. 서열 상동성이 서열 사이에 확립되었으면, 관련된 미생물의 상응하는 동족체 유전자 (및 따라서 동족체 단백질)을 클로닝하기 위해 축중성 프로브를 설계하기 위해 컨센서스 서열이 유도되고, 사용될 수 있다. 분자 생물학의 이들 통상적인 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 맥락에서, 관심의 단백질을 코딩하는 외인성 유전자가 특이적 미생물에서 발현되는 경우, 이러한 유전자의 합성 버전은 바람직하게는 비-바람직한 코돈 또는 덜 바람직한 코돈을 동일한 아미노산을 코딩하는 상기 미생물의 바람직한 코돈으로 대체함으로써 구축됨이 추가로 이해될 것이다. 사실, 코돈 사용은 관심의 단백질의 재조합 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 미생물 종 사이에 다양함이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 코돈 최적화 방법이 개발되었으며, 문헌 [Graf et al. (2000)], [Deml et al. (2001)] 및 [Davis & Olsen (2011)]에 광범위하게 기재되어 있다. 몇몇 소프트웨어 프로그램, 예컨대 진옵티마이저(GeneOptimizer)® 소프트웨어 (라이프테크놀로지즈(Lifetechnologies)) 또는 (진스크립트(GenScript))의 옵티멈진(OptimumGene)™ 소프트웨어가 특히 코돈 최적화 측정을 위해 개발되었다. 다시 말해서, 관심의 단백질을 코딩하는 외인성 유전자는 바람직하게는 특이적 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.

본 발명의 방법 및 미생물의 맥락에서, 재조합 미생물은 모 균주에 관하여 추가의 변형을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 재조합 미생물은 글리세롤을 포함하는 배양 배지로부터의 증가된 PDO 생산을 위해 사전에 적응되었을 수 있다. 글리세롤 대사를 PDO의 생산을 향해 지정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 WO 2006/128381, 문헌 [Gonzalez-Pajuelo & al. 2006] 참조).

바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물이 씨. 아세토부틸리쿰인 경우, 이는 바람직하게는, 보다 바람직하게는 PDO 생산의 증가된 유동을 제공하는, 높은 글리세롤 함량을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 PDO의 생산을 위해 혐기성 연속 공정에 의해 사전에 적응되었다. 균주 씨. 아세토부틸리쿰의 적응은 바람직하게는 통상의 기술자에게 널리 공지된 기법인 혐기성 연속 공정에 의해 수행된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 이러한 공정의 상세 중에서, 예를 들어 공급 배지는 발효기에 연속적으로 첨가되고, 미생물을 갖는 등가의 양의 전환된 영양분 용액은 시스템으로부터 동시에 제거됨이 언급될 수 있다. 영양분 교환의 속도는 희석률로서 표현된다. 따라서, 희석률은 배양 배지에 적용되고, 미생물의 최대 성장 속도를 고려하며, 배지의 흡입 및 배출의 속도에 영향을 미친다.

씨. 아세토부틸리쿰 균주는 비타민 B₁₂-비의존성 PDO 경로에 관여하는 효소를 코딩하는, 씨. 부티리쿰으로부터의 PDO 오페론의 가외의 카피를 도입함으로써 적응될 수 있다. 특히, 씨. 부티리쿰으로부터의 PDO 오페론은 플라스미드에 의해 과다발현되거나, 적응되는 균주 씨. 아세토부틸리쿰의 염색체 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, pSPD5 플라스미드는 씨. 아세토부틸리쿰에서의 PDO 오페론의 과다발현에 사용될 수 있다 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2006).

대안적으로 또는 추가적으로, 상기 재조합 미생물은 WO 2010/128070 (특히 제7면 제10행 내지 제8면 제23행 및 실시예 2, 3, 및 4 참조)에 개시된 바와 같은 선택 압력 배양 공정에 의해, 높은 글리세롤 함량, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 기원한 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지에서 성장하도록 적응될 수 있다.

탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤로부터의 PDO의 생산을 위해 유전자 변형된 씨. 아세토부틸리쿰의 균주는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 특히 출원 WO 2001/04324 및 WO 2010/128070에 개시되어 있다. 마지막으로, 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 WO 2012/062832에 기재된 공정에 의해 사전에 적응될 수 있다.

비제한적 예로서, 적응되는 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 90 내지 120 g/L의 글리세롤 및 바람직하게는 약 105 g/L의 미가공 글리세롤을 함유하는 공급 배지를 사용하여 연속적 배양에서 배양될 수 있다. 생산 미생물의 상기 "적응"은 낮은 희석률로 높은 산업용 글리세린 함량을 포함하는 배양 배지 상에서 미생물을 배양하고, 산업용 글리세린으로부터 기원한 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지 상에서 성장할 수 있는 적응된 미생물을 선택함으로써 수득된다. 0.005 내지 0.02 h^-1의 희석률은 "낮은 희석률"에 상응하는 반면, 0.02 내지 0.1 h^-1의 희석률은 통상적인 희석률에 상응한다. 비제한적 예로서, 적응되는 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 24시간 내지 10일의 범위, 바람직하게는 2일 초과, 보다 바람직하게는 약 8일의 기간에 걸쳐 낮은 희석률로 배양될 수 있다. 희석률은 일반적으로 0.005 내지 0.1 h^-1, 바람직하게는 0.005 내지 0.02 h^-1에 포함된다. 희석률은 적응 방법 동안 변화될 수 있으며, 결국 제1 단계는 0.005 내지 0.02 h^-1에 포함되고, 제2 단계는 희석률이 0.1 h^-1까지, 보다 바람직하게는 0.06 h^-1까지, 보다 더 바람직하게는 0.07 h^-1까지 증가된다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 적응되는 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 0.005 내지 0.02 h^-1에 포함되는, 바람직하게는 0.02 h^-1의 낮은 희석률로, 90 내지 120 g/L의 글리세롤 및 바람직하게는 약 105 g/L의 미가공 글리세롤을 함유하는 공급 배지를 사용하여 연속적 배양에서 배양된다. 최대 10일, 바람직하게는 5 내지 8일의 기간에 걸쳐, 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 공급 배지에 존재하는 높은 글리세린 농도에 적응되며, 희석률은 0.1 h^-1까지, 바람직하게는 0.07 h^-1까지 증가될 수 있다.

"배양 배지"는 재조합 미생물의 성장 및 디올-생산에 적절한 배양 배지를 지칭하며, 상기 배양 배지는 배양 배지에 존재하는 단독 탄소 공급원일 수 있거나, 그렇지 않을 수 있는 글리세롤을 포함한다. 배양 배지는 유기 질소 공급원을 포함하거나, 그렇지 않을 수 있다. 질소는 식물 및 동물 둘 다에서 성장 및 번식에 필수적인 천연 발생 요소이다. 이는 아미노산에서 및 많은 다른 유기 및 무기 화합물에서 발견된다. "유기 질소"는 본 발명에 따르면, 살아있는 유기체로부터 수득된 유기 화합물을 포함하는 질소를 의미한다. 박테리아 배양을 위한 유기 질소의 통상적인 공급원은 효모 추출물을 포함한다.

글리세롤은 배양 배지에 존재하는 단독 탄소 공급원일 수 있다. 대안적으로, 1종 이상의 추가의 탄소 공급원 (예를 들어 글루코스)은 배양 배지에 존재할 수 있다. 배양 배지에 존재하는 글리세롤은 순수한 또는 산업용 글리세린일 수 있다.

바람직하게는, 배양 배지는 효모 추출물을 포함하지 않는다. 보다 더 바람직하게는, 배양 배지는 임의의 유기 질소 공급원을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 글리세롤은 배양 배지에 존재하는 단독 탄소 공급원이다.

용어 "글리세롤"은 본원에서 용어 "글리세린"과 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 순수한 및/또는 산업용 글리세린을 포함할 수 있다. 산업용 글리세린은 바이오디젤 생산으로부터의 (예를 들어 단쇄 알콜로의 글리세롤의 에스테르교환으로부터의) 부산물로서 수득될 수 있다. 대안적으로, 산업용 글리세린은 예를 들어 비누화, 에스테르교환 및/또는 가수분해 반응에 의해 식물성 또는 동물성 오일 및 지방으로부터 수득될 수 있다.

"순수한 글리세롤"은 글리세롤의, 95 중량% 초과의 순도를 갖는 글리세롤 산물을 지칭한다. 일부의 경우, 순수한 글리세롤은 97% 초과, 보다 더 99% 또는 99.2% 초과의 순도를 가질 수 있다. 글리세롤 산물의 나머지는 바람직하게는 물 (예를 들어 약 3 내지 5 중량%)로 구성된다. 순수한 글리세롤은 극소의 잔존 불순물을 갖는다. 순수한 글리세롤은 특히 1종 이상의 공정을 사용한 정제, 예컨대 증류에 의해 수득될 수 있다.

"산업용 글리세린"은 실질적 정제 없이 산업 공정으로부터 수득된 글리세롤 산물을 지칭한다. 산업용 글리세린은 또한 "미가공 글리세린", "미가공 글리세롤", "조 글리세롤", 또는 "산업용 글리세롤"로 지칭될 수 있다. 산업용 글리세린은 일반적으로 5 내지 95 중량%의 글리세롤, 특히 40 내지 90 중량%의 글리세롤, 보다 특히 60 내지 90 중량%의 글리세롤, 보다 더 특히 약 65 내지 85 중량%의 글리세롤 또는 약 70 중량% 내지 85 중량%의 글리세롤을 포함한다. 산업용 글리세린의 잔존 분획은 또한 수분으로 지칭되는 물, 광물 염, 및 다른 비-글리세롤 유기 화합물 및 글리세리드를 포함하는 비-글리세롤 유기물 (MONG)을 포함할 수 있다. 특히, 산업용 글리세린은 불순물, 예컨대 알콜 (예를 들어 메탄올), 광물 염, 비반응된 모노-, 디-, 및 트리-아실글리세롤, 메틸 에스테르 및 1종 이상의 지방산 (예를 들어 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산 및 아라키드산)을 추가로 포함한다.

바람직한 실시양태에 따르면, 산업용 글리세린은 바람직하게는 약 60 중량%, 70 중량% 또는 80 중량% 초과의 글리세롤 및 약 15 중량% 미만의 물 및 불순물을 함유한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 광물 염의 농도는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만이다. 바람직한 실시양태에 따르면, MONG에 포함되는 지방산의 농도는 분석 증명서에서 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 더 바람직하게는 5% 미만이다. 대안적인 바람직한 실시양태에 따르면, 지방산 또는 MONG의 농도는 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%이며, 보다 더 바람직하게는 5 내지 10%에 포함된다.

산업용 글리세린이 부산물로서 수득되는 산업적 공정은 그 중에서도 지방 및 오일, 특히 식물 또는 동물 기원의 지방 및 오일이 산업용 제품, 예컨대 청정제 또는 윤활제로 가공되는 제조 방법이다. 이러한 제조 방법에서, 산업용 글리세린은 부산물로서 간주된다. 산업용 글리세린의 정확한 조성은 초기 글리세롤 공급원 (예를 들어 동물성 지방 또는 식물성 오일, 예컨대 해바라기 오일, 카놀라 오일, 대두 오일, 겨자씨 등), 및 예를 들어, 바이오디젤 생산에서 글리세롤 추출 및 하류 처리에 사용되는 방법 및 조건에 의존할 것이다.

특정한 실시양태에서, 산업용 글리세린은 바이오디젤 생산으로부터의 부산물이다. 바람직하게는, 산업용 글리세린은 염, 물 및 화합물, 예컨대 지방산, 예컨대 상기 열거된 바와 같은 것들을 포함하는 일부 다른 유기 화합물 (즉, MONG)을 갖는 약 80 내지 85%의 글리세롤을 포함하는, 바이오디젤 생산으로부터 수득된 글리세린의 공지된 불순물을 포함한다. 바이오디젤 생산으로부터 수득된 산업용 글리세린은 추가의 정제 단계에 처해지지 않았다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "높은 글리세롤 함량" 또는 "높은 글리세롤 농도"는 배양 배지 중 90 g/l 이상의 글리세롤의 글리세롤 농도를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 90 내지 120 g/L에 포함되는, 바람직하게는 105 내지 110 g/L에 포함되는, 보다 바람직하게는 약 105 g/L 또는 109 g/L인 농도로 글리세롤을 포함한다.

일부의 경우, PDO 생산은 적어도 1종의 다른 미생물의 존재 하에, 소위 미생물 컨소시엄에서 재조합 미생물을 공동-배양함으로써 추가로 증가될 수 있고/거나, 잔류 글리세롤 수준이 추가로 감소될 수 있다. 용어 "미생물 컨소시엄" 또는 "공동-배양물"은 발효 공정에서 2종 이상의 미생물 종의 사용을 나타내기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 바람직하게는, 공동-배양에 사용되는 1종 이상의 추가의 균주는 글리세롤을 발효시키거나 PDO를 생산하지 않는다.

비제한적 예로서, 미생물 컨소시엄은 적어도 2종의 클로스트리디움 균주, 예컨대 1종의 씨. 아세토부틸리쿰 균주 및 클로스트리디움 속의 균주 중에서 선택된 적어도 1종의 균주, 예컨대 씨. 스포로게네스의 균주 및/또는 씨. 스페노이데스의 균주를 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 미생물 컨소시엄은 적어도 3종의 클로스트리디움 균주, 예컨대 적어도 1종의 씨. 아세토부틸리쿰 균주, 적어도 1종의 씨. 스포로게네스 및 씨. 스페노이데스의 적어도 1종의 균주를 포함할 수 있다. 상기 기재된 경우 중 어느 하나에서, 미생물 컨소시엄의 대다수는 씨. 아세토부틸리쿰 종에 속할 수 있다. 예를 들어, 미생물 컨소시엄은 배양물에 함유되는 세포의 전체가 100%에 상응한다고 간주하여, 85% 초과의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.2%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.1% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함할 수 있다. 특히, 미생물 컨소시엄은 85% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.15%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2% 내지 15%의 씨. 스페노이데스, 또는 90% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.002% 내지 0.13%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2% 내지 10%의 씨. 스페노이데스를 포함할 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물 컨소시엄에서 공동-배양된다. 상기 미생물 컨소시엄은 바람직하게는 적어도 1종, 바람직하게는 2종의 다른 미생물과 공동-배양물에서, 본원에 개시된, 또는 본원에 개시된 본 발명의 방법에 기재된 바와 같은 재조합 미생물을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 재조합 미생물은 씨. 스페노이데스의 적어도 1종의 균주와, 보다 바람직하게는 씨. 스페노이데스의 적어도 1종의 균주 및 씨. 스포로게네스의 적어도 1종의 균주와 공동-배양된다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 미생물은 씨. 아세토부틸리쿰 균주이며, 보다 더 바람직하게는 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 PDO의 생산을 위해 적응된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄은 배양물에 함유되는 세포의 전체가 100%에 상응한다고 간주하여, 85% 초과의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.2%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.1% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 미생물 컨소시엄은 85 % 내지 99.8 %의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.15 %의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2% 내지 15 %의 씨. 스페노이데스를 포함한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 미생물 컨소시엄은 90 % 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.002% 내지 0.13%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2 % 내지 10 %의 씨. 스페노이데스를 포함한다.

본 발명의 방법에서, PDO의 생산은 바람직하게는 상기 기재된 본 발명의 재조합 미생물, 또는 미생물 컨소시엄을 탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤을 포함하는 배양 배지에서 배양함으로써 혐기성 연속적 발효에 의해 수행되며, 상기 배양 배지는 유기 질소의 첨가가 없는 최소 배지이다.

용어 "최소 배지"는 유기체가 글리세린 용액 없이 성장하는 화학적으로 한정된 조성물을 포함하는 엄격하게 광물성인 배양 배지를 의미한다. 이러한 배양 배지는 관련 기술분야에, 특히 WO 2010/128070 및 WO 2011/042434에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법으로부터 이렇게 수득된 PDO는 추가로 정제된다. 발효 배지로부터 PDO를 회수하고, 궁극적으로 정제하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. PDO는 증류에 의해 단리될 수 있다. 대부분의 실시양태에서, PDO는 부산물, 예컨대 아세테이트를 갖는 발효 배지로부터 증류되고, 그 후 공지된 방법에 의해 추가로 정제된다. 특히 바람직한 정제 방법은 출원 WO 2009/068110 및 WO 2010/037843에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

연속적 발효 공정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 발효 공정은 일반적으로 적어도 산업용 글리세린, 바이오디젤 생산으로부터의 부산물, 및 필요할 경우에 대사물의 생산을 위한 보조-기질을 함유하는, 사용되는 박테리아에 적응된 공지된 한정된 조성의 무기 배양 배지를 갖는 반응기에서 수행된다.

본 발명의 이러한 방법은 바람직하게는 연속적 공정으로 실현된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그의 일반적 지식에 따라 이들 실험 조건의 각각을 관리하고, 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 한정할 수 있다. 특히, 클로스트리디아는 씨. 아세토부틸리쿰에 대해 20℃ 내지 60℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효된다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 유형 130P 또는 유형 008P는 연속적 배양에서 대략 105 g/L 또는 109 g/L의 미가공 글리세롤을 함유하는 공급 배지를 사용하여, 0.035 내지 0.08 h^-1에 포함되는, 바람직하게는 0.07 h^-1의 희석률로 배양된다 (실시예 1 및 2 참조). 상기 방법은, 그의 상이한 실시양태에서, 0.4 내지 0.6 g/g에 포함되는 수율 및 0.7 h^-1의 희석률에 대해 2.9 g/L/h 초과의 생산성으로, 적어도 52 g/L의 PDO의 생산을 초래한다. 바람직하게는, 수율은 0.4 내지 0.5 g/g에 포함되고, 생산성은 3.6 g/L/h 초과, 보다 더 바람직하게는 3.65 g/L/h 초과이다. 본 발명의 방법은, 특정 실시양태에서, 3.7 g/L 미만의 잔류 글리세롤 수준을 추가로 초래한다. 바람직하게는, 잔류 글리세롤 수준은 대략 3.6 g/L이다.

도 1: 미가공 글리세린 상에서의 유형 008P 균주의 적응에 의한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 유형 130P 균주의 수득. 연속적 배양의 OD_620nm (OD 단위 또는 ODU, 정사각형), 잔류 글리세롤 (g/L; 마름모형), PDO 농도 (g/L; 삼각형) 및 공급 유량 (mL/h; 원형)의 역학은 배양 기간 (일: d)의 함수로서 제시되어 있다.
도 2: 씨. 아세토부틸리쿰에서의 hcpR 및 frdX 유전자의 염색체 조직화. 유전자 hcpR 및 frdX는 2개의 유전자 사이에 위치한 123 bp 유전자간 영역을 갖는, 양방향성 유전자 쌍으로서 조직화된다. 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 게놈 (NCBI 참조 서열: NC_003030.1) 내의 뉴클레오티드 위치가 지시된다.
도 3: 정량적 PCR에 의한 hcpR 및 frdX 유전자의 과다발현. hcpR 및 frdX 둘 다는 qRT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 모 균주 유형 008P에 비해 130P 균주에서 과다발현되었다. 흑색 막대: 유형 008P; 회색 막대: 유형 130P.

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 한정된다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시양태를 지시하면서, 단지 예시의 방식으로 주어짐이 이해되어야 한다. 상기 개시내용 및 이들 실시예로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 의미를 변형시키지 않으면서, 이를 다양한 용도 및 조건으로 적응시키는 본 발명의 다양한 변화를 생성할 수 있다.

실시예 1: 미가공 산업용 글리세롤 상에서의 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 (pSPD5) 의 연속적 배양 및 미생물 유형 130P의 수득

박테리아 균주:

- 유형 008P: 특허 출원 WO 2010/128070에 기재된 바와 같은 고농도의 미가공 글리세린 상에 적응된 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5

- 유형 130P: 고농도의 미가공 산업용 글리세린 상에서의 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 유형 008P로부터의 연속적 배양으로부터 공급되고, 본원에 기재된 바와 같이 hcpR 및 frdX 유전자를 과다발현하는 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 유형

클로스트리디아 배치 배양에 사용된 합성 배지는 수돗물 리터당 하기를 함유하였다: 글리세롤, 30g; KH₂PO₄, 0.5g; K₂HPO₄, 0.5g; MgSO₄, 7H₂O, 0.2g; CoCl₂ 6H₂O, 0.01g; H₂SO₄, 0.1ml; NH₄Cl, 1.5g; 비오틴, 0.16mg; p-아미노 벤조산, 32mg; FeSO₄, 7H₂O, 0.028g. 배지의 pH를 NH₄OH 3N으로 6.3으로 조정하였다. 에스디에스 카를로_에르바(SDS Carlo_Erba)로부터 구입한 시판 글리세롤 (순도 99%)을 배치 배양에 사용하였다. 연속적 배양을 위한 공급 배지는 수돗물 리터당 하기를 함유하였다: 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤, 105g; KH₂PO₄, 0.50g; K₂HPO₄, 0.50g; MgSO₄, 7H₂O, 0.2 g; NH₄Cl, 1.5 g; CoCl₂ 6H₂O, 0.026 g; 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg; FeSO₄, 7H₂O, 0.04 g; 소포제, 0.05 ml; ZnSO₄, 7H₂O, 8 mg; CuCl₂, 2H₂O, 4 mg; MnSO₄, H₂O, 0.04 g; H₃BO₃, 2 mg; Na₂MoO₄,2H₂O, 0.8 mg. 배지 pH를 H₂SO₄ 96%로 3.5 내지 4로 조정하였다.

바이오디젤을 위한 에스테르교환 공정으로부터의 미가공 글리세린은 2가지 상이한 공급자에 의해 제공되었으며, 하기 조성을 가졌다:

- ADM (스위스 홀르)으로부터 (식물성 오일을 사용함; 순도 80.9%; 수분 12.6%; MONG 0.39%; 회분 6.2%),

- 그리너지(Greenergy) (영국 런던)로부터 (쿠킹 오일을 사용함; 순도 76.5%; 수분 10.2%; MONG 7.1%; 회분 6.3%).

임의로, 이들 글리세린을 산성화에 의해 사전처리하였다.

순도 및 MONG 조성은 미생물에 대한 글리세린의 독성에 대한 발생을 갖는다. 그리너지 (영국 런던) 글리세린은 고농도의 MONG 때문에 ADM (스위스 홀르) 글리세린보다 덜 순수하고 더 더러우며, 따라서 미생물에 대해 더 독성이다. 사실, 그리너지 (영국 런던) 글리세린에서의 MONG 농도는 5% 초과이다.

하기 실시예는 덜 정제된 산업용 글리세린 상에서 성장하고 PDO를 생산할 수 있는 유형 130P로 명명된 새로운 균주를 얻기 위한 보다 조성 글리세린 상에서의 균주 유형 008P의 적응 (ADM에서 그리너지로)을 제시한다. 이러한 적응은 덜 정제된 산업용 글리세린이 발효 공정을 위한 보다 저렴한 원료이기 때문에 매우 유리하다.

실험 셋-업:

연속적 배양을 2000 ml의 작업 부피를 갖는 5l 트리톤(Tryton) 생물반응기 (피에르 게렝(Pierre Guerin), 프랑스)에서 수행하였다. 배양 부피를 배양 수준의 자동 조절에 의해 2000 ml에서 일정하게 유지하였다. 배양물을 200 RPM에서 교반하고, 온도를 35℃로 설정하고, pH를 NH₄OH 5.5N의 자동 첨가에 의해 6.5에서 일정하게 유지하였다. 혐기성 조건을 생성하기 위해, 용기 중의 멸균된 배지를 멸균 O₂-무함유 질소로 60℃에서 1시간 동안 플러싱하고, 35℃가 얻어질 때까지 다시 플러싱하였다 (2시간 동안 플러싱). 생물반응기 기체 배출구를 피로갈롤 배열에 의해 산소로부터 보호하였다 (Vasconcelos et al., 1994). 멸균 후, 공급 배지를 또한 멸균 O₂-무함유 질소로 실온이 도달될 때까지 플러싱하고, 질소 하에서 유지하여 O₂ 유입을 회피하였다.

분석 절차:

세포 농도를 620nm에서 탁도계로 측정하고 (OD_620nm), 직접적으로 측정된 세포 건조 중량과 상관시켰다. 글리세롤, PDO, 에탄올, 락테이트, 아세트산 및 부티르산 농도를 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 분리를 바이오라드 아미넥스(Biorad Aminex) HPX-87H 칼럼 상에서 수행하고, 검출을 굴절 지수에 의해 달성하였다. 조작 조건은 하기와 같았다: 이동상 황산 0.5mM; 유량 0.5ml/분, 온도, 25℃.

배치 및 연속적 배양 공정 및 결과:

지수적 성장 단계의 종료 시에 취해진 합성 배지 (아세트산, 2.2 g/L 및 MOPS, 23.03 g/L의 첨가를 제외하고는 배치 배양을 위해 상기 기재된 것과 동일함) 상의 100 ml 플라스크에서 성장하는 배양물을 접종물 (5% v/v)로서 사용하였다.

배양물을 먼저 배치 방식으로 성장시켰다. 초기 지수적 성장 단계에서, 본 발명자들은 공급 배지 (공급 배양물에 기재된 것과 동일함)로의 글리세롤의 펄스를 수행하였다. 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤을 3시간 동안 정적 유량으로 첨가하였다 (즉, 18 g/L의 글리세롤의 첨가). 그 후, 성장은 배치 방식으로 계속되었으며, 지수적 성장 단계의 종료 전에 연속적 공급이 단지 ADM (스위스 홀르)에 의해 제공된 미가공 글리세린으로부터의 105 g/L의 글리세롤을 함유하는 공급 배지의 0.035 h^-1의 희석률로 시작되었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 0.035 h^-1의 희석률로 3일 후에, 글리세롤 축적이 시작되었고, 6.5 체류 시간 (RT, 하기 제시된 식에 따라 계산됨)에서 46.6 g/L에 도달하였으며, 이는 잔류 글리세린의 제1 피크에 상응한다. 이러한 축적은 PDO 생산 (52 g/L 대신 최대 31 g/L) 및 바이오매스 생산 (5.6 ODU 대신 1.8 ODU)의 감소와 연관되었다. 이러한 축적에 이어, 빠른 재-소비가 이어졌으며, D=0.035h^-1의 희석률에서 9 RT 후에, 잔류 글리세롤은 2.9 g/L에서 강하하였다. 이 때 (접종 후 12일), 희석률은 5일에 0.035 h^-1에서 0.070 h^-1로 증가하였다. D=0.07h^-1의 희석률에서 9 RT 후에, 성능은 5.5 ± 1.1 g/L의 글리세롤 및 51.6 ± 0.7 g/L의 PDO에서 안정화하였다.

이 안정화 후, (접종 후 28일) (도 1 참조), 공급물의 미가공 글리세린을 ADM (50%; 스위스 홀르)에 의해 및 그리너지 (50%; 영국 런던)에 의해 제공된 미가공 글리세린의 블렌드로 교환함으로써, MONG의 수준, 및 미생물에 대한 글리세린 독성을 증가시켰다.

공급 조성물의 이러한 변형은 13일 동안 글리세롤 축적의 사이클 (35.1 g/L에서 최대) 및 PDO 생산의 강하 (37.4 g/L에서 최소)를 유도하였다. 배양물을 핵심적 인자 (OD, 잔류 글리세롤 및 PDO 농도)를 통해 안정화에 대해 모니터링하고, 새로운 적응된 균주 130P를 제45일에 저장을 위해 확인하였다 (도 1 참조).

이 단계에서, 새로운 균주를 시퀀싱하고, 008P의 서열과 비교하였다. 본 발명자들은 하기 실시예 3에 기재된 유전자간 돌연변이를 확인하였다.

생성된 균주 유형 130P의 성능은 하기 표 2에 제시된다.

희석률로부터 체류 시간의 계산을 위한 식

RT: 체류 시간 (h)

DR: 희석률 (h^-1)

표 2: 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주 유형 130P의 성능. 공급 배지는 0.070 h ^-1 의 희석률에서 ADM (스위스 홀르) 및 그리너지 (영국 런던)에 의해 제공된 미가공 글리세린으로부터의 105 g/L의 글리세롤을 함유하였다.

YPDO: PDO 수율 (관여된 글리세롤의 g/g)

QPDO: PDO 부피측정 생산성

실시예 2: 고농도의 미가공 글리세린으로의 연속적 배양에 의한 케모스타트에서의 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주 유형 008P 및 130P의 PDO 생산 성능

클로스트리디아 배치 배양에 사용된 합성 배지는 수돗물 리터당 하기를 함유하였다: 글리세롤, 30g; KH₂PO₄, 0.5g; K₂HPO₄, 0.5g; MgSO₄, 7H2O, 0.2g; CoCl₂ 6H₂O, 0.01g; H₂SO₄, 0.1ml; NH₄Cl, 1.5g; 비오틴, 0.16mg; p-아미노 벤조산, 32mg 및 FeSO₄, 7H₂O, 0.028g. 배지의 pH를 NH₄OH 3N으로 6.3으로 조정하였다. 에스디에스 카를로_에르바로부터 구입한 시판 글리세롤 (순도 99%)을 배치 배양에 사용하였다. 연속적 배양을 위한 공급 배지는 수돗물 리터당 하기를 함유하였다: 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤, 105g; KH₂PO₄, 0.50g; K₂HPO₄, 0.50g; MgSO₄, 7H₂O, 0.2 g; NH₄Cl, 0 내지 1.5 g; CoCl₂ 6H₂O, 0.013 내지 0.026 g; 비오틴, 0.08 내지 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 16 내지 32 mg; FeSO₄, 7H₂O, 0.04 g; 소포제, 0.05 ml; ZnSO₄, 7H₂O, 8 mg; CuCl₂, 2H₂O, 4 mg; MnSO₄, H₂O, 0.02 g 내지 0.04 g; H₃BO₃ 0 내지 2 mg; Na₂MoO₄,2H₂O, 0 내지 0.8 mg. 배지 pH를 H₂SO₄ 96%로 3.5 내지 4로 조정하였다.

바이오디젤을 위한 에스테르교환 공정으로부터의 미가공 글리세린은 몇몇 상이한 공급원으로부터 수득하였으며, 하기 조성을 가졌다:

- 노반스 (프랑스 콩피에뉴) (식물유를 사용하여; 순도 82 내지 85%; 수분 8 내지 13%; MONG 0.1 내지 0.3%; 회분 1.4%)

- 그리너지 글리세린과의 블렌드에서 사용된 ADM (스위스 홀르) (식물유를 사용하여; 순도 80.9%; 수분 12.6%; MONG 0.39%; 회분 6.2%)

- ADM 글리세린과의 블렌드에서 사용된 그리너지 (영국 런던) (요리유를 사용하여; 순도 76.5%; 수분 10.2%; MONG 7.1%; 회분 6.3%)

임의로, 이들 글리세린을 산성화에 의해 사전처리하였다.

상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 순도 및 MONG 조성은 미생물에 대한 글리세린의 독성에 대한 발생을 갖는다.

실험 셋-업은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같다.

배치 및 연속적 배양 공정:

지수적 성장 단계의 종료 시에 취해진 합성 배지 (아세트산, 2.2 g/L 및 MOPS, 23.03 g/L의 첨가를 제외하고는 배치 배양에 대해 상기 기재된 것과 동일함) 상의 100 ml 플라스크에서 성장하는 배양물을 접종물 (5% v/v)로서 사용하였다.

배양물을 먼저 배치 방식으로 성장시켰다. 초기 지수적 성장 단계에서 본 발명자들은 공급 배지 (공급 배양물에 대해 기재된 것과 동일함)로의 글리세롤의 펄스를 수행하였다. 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤을 3시간 동안 정적 유량으로 첨가하였다 (즉, 18 g/L의 글리세롤의 첨가). 그 후, 성장은 배치 방식으로 계속되었으며, 지수적 성장 단계의 종료 전에 연속적 공급이 0.035 h^-1의 희석률로 시작되었다. 생물반응기의 접종 후 5 내지 8일에, 희석률은 5일에 0.035 h^-1에서 0.070 h^-1로 증가되었다. 그 후, 배양물의 안정화에 이어, 실시예 1에서 분석 절차에서 기재된 HPLC 프로토콜을 사용한 PDO 생산 및 글리세롤 소비가 이어졌다.

표 3: 연속적 배양에서 씨. 아세토부틸리쿰 유형 008P의 및 유형 130P 균주의 성능.

공급 배지는 0.070 h^-1의 희석률에서 미가공 글리세린으로부터의 105 g/L의 글리세롤을 함유하였다. 각각의 8 및 17개의 케모스타트로부터의 평균 데이터. 배양에 사용된 글리세린의 공급자는 각각의 균주에 대해 지시된다. 노반스 (프랑스 콩피에뉴)는 상대적으로 깨끗하고 순수한 글리세린에 상응하는 반면, ADM (스위스 홀르) 및 그리너지 (영국 런던)는 보다 많은 오염물을 갖고, 따라서 미생물에 대해 보다 독성인 보다 덜 순수한 글리세린을 제공한다.

YPDO: PDO 수율 (관여된 글리세롤의 g/g)

QPDO: PDO 부피측정 생산성

^*균주 유형 130P에 대한 성능은 상이한 글리세린 유형이 사용된 경우 (즉, 노반스 또는 ADM/그리너지 블렌드) 유의하게 변화하지 않았다.

이들 결과는 hcpR 및 frdX 유전자의 과다발현을 유도하는 유전자간 돌연변이 (이 경우에 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824에 따른 염색체 상의 위치 1014234 내지 1014240에서의 뉴클레오티드 사이)를 함유하는 유형 130P 균주가 놀랍게도 그의 모 균주, 008P보다 더 높은 역가 및 수율 및 더 적은 잔류 글리세린으로 더 양호한 PDO 생산을 나타냄을 제시한다.

이들 결과는 또한 유전자 변형을 갖지 않는 모 균주 유형 008P보다 성장하고 훨씬 더 많은 PDO를 생산한 균주 유형 130P의 큰 이점을 입증한다 (표 3). 사실, 모든 핵심적인 산업적 파라미터 (PDO의 보다 높은 역가 및 수율 및 보다 적은 잔류 글리세롤)는 유형 008P 균주로 통상적으로 사용된 것보다 더 독성인 산업용 글리세린으로의 배양 조건에서 008P과 비교할 경우에 130P에 대해 개선되었다.

따라서, hcpR 및 frdX 유전자의 과다발현 시, 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주는 보다 많은 PDO를 생산하고, 보다 강력하며, 따라서 산업적 공정에 보다 적합하다.

실시예 3: 유전자간 돌연변이 설명

예상치 않게, CA_C0884 및 CA_C0885 유전자 사이의 유전자간 영역 (도 2에 예시됨, 서열식별번호: 15)에서의 단일 뉴클레오티드 삽입은 PDO의 생산 및 글리세린에 존재하는 불순물 MONG에 대한 저항성을 개선시키는 효과를 갖는다.

뉴클레오티드 삽입을 올리고뉴클레오티드 유전자간 영역 정방향 프라이머 (서열식별번호: 18) 및 유전자간 영역 역방향 프라이머 (서열식별번호: 19)를 사용하여 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 유형 130P의 DNA에 비해 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 유형 008P의 DNA 상에서 증폭된 PCR 단편의 핵산 시퀀싱에 의해 검출하였다. 'A' 삽입 돌연변이는 모 유형 서열 (서열식별번호: 16)에 비해 서열식별번호: 17에서 언급된 바와 같은 반복 'A' 뉴클레오티드의 영역에서 CA_C0884 및 CA_C0885 유전자 사이의 유전자간 영역에서 확인되었다. 유전자 CA_C0884 hcpR (서열식별번호: 1)은 산화질소-반응성 전사 조절제 (서열식별번호: 2)를 코딩하고, 유전자 CA_C0885 frdX (서열식별번호: 3)는 페레독신 3-유사 단백질 (서열식별번호: 4)을 코딩한다.

실시예 4: 유전자간 뉴클레오티드 삽입을 갖거나 갖지 않는 CA_C0884 및 CA_C0885 유전자 발현

RNA 단리

RNA를 2 ml의 플라스크 배양물로부터 추출하고, 페놀 (5%) / 에탄올 (95%)의 6 ml 혼합물 내로 옮기고, 3000 g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 100 μL 리소자임 100 mg/mL에서 균질화시키고, 37℃에서 30분 인큐베이션하고, RNA를 맥스웰(Maxwell) RSC 기기 (프로메가(Promega))에서 맥스웰 RSC 심플리 RNA 티슈 (Maxwell RSC Simply RNA Tissue) 키트 (프로메가)를 사용하여 추출하였다.

정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의한 특이적 리보핵산 서열의 정량화

RNA는 PCR 주형으로서 기능할 수 없기 때문에, qRT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링에서 첫번째 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사, 이어서 PCR 반응에서 그의 지수적 증폭이다.

역전사를 0.2 μg의 총 RNA로 수행하고, 랜덤 프라이머 및 올리고 dT 프라이머의 존재 하에 슈퍼스크립트 빌로IV(SuperScript ViloIV) (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 cDNA로 역전사하였다.

역전사효소 반응을 20 μl의 총 부피에서 수행하였다. 반응의 완료 후, 혼합물을 85℃에서 유지하였다.

샘플에서의 상대적 정량화를 쏘어드밴스드 유니버셜 SYBR 그린 슈퍼믹스(SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix) (바이오-라드 미트리 모리(Bio-rad Mitry Mory), 프랑스)를 사용한 정량적 PCR에 의해 측정하였다. 정량적 PCR을 CFX96™ 실시간 시스템 (바이오-라드(Bio-Rad))을 구비한 바이오-라드 C1000™ 써멀 사이클러(Thermal Cycler) 상에서 수행하였다.

PCR 반응 혼합물은 1x 쏘 어드밴스드 유니버셜 SYBR 그린 슈퍼믹스 (바이오-라드), 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머의 6 μL의 믹스 (1 μM), 2 μL의 희석된 샘플 및 20 μL의 최종 부피에 도달하는 뉴클레아제 무함유수로 이루어졌다. 증폭을 하기 열 사이클링 프로그램에 따라 달성하였다: 98℃에서 2분 동안 초기 용융 (1 사이클), 이어서 98℃에서 10초 동안 40 사이클의 용융, 60℃에서 30초 동안 프라이머의 어닐링 및 신장. (용융 곡선 65 내지 95℃, 증분 5초마다 0,5℃). 각각의 실험에 대해, 역치 수준 (Ct)을 CFX 매니저(CFX Manager)™ 3.1 소프트웨어 (바이오-라드)를 사용하여 qPCR 반응의 지수적 단계 동안 설정하였다.

각각의 유전자의 발현 수준을 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 측정하였다. 사용된 CA_C0884 유전자 기반 프라이머는 CA_C0884 유전자 기반 정방향 프라이머 (서열식별번호: 20) 및 CA_C0884 유전자 기반 역방향 프라이머 (서열식별번호: 21)이고, 사용된 CA_C0885 유전자 기반 프라이머는 CA_C0885 유전자 기반 정방향 프라이머 (서열식별번호: 22) 및 CA_C0885 유전자 기반 역방향 프라이머 (서열식별번호: 23)였다. 하우스키핑 유전자 DNA 기라제 서브유닛 A (gyrA: CA_C1628), 사용된 프라이머 CA_C1628 유전자 기반 정방향 프라이머 (서열식별번호: 24) 및 CA_C1628 유전자 기반 역방향 프라이머 (서열식별번호: 25)에 대한 각각의 표적 유전자의 양을 각각의 실험에 대해 교정자로서 사용된 공지된 농도에서 ATCC 824 게놈 DNA의 계열 희석으로, 비교용 역치 사이클 (Ct) 방법을 사용하여 각각의 샘플에 대해 측정하였다. 프라이머의 대략 동등한 효율이 비교용 Ct 방법을 사용하기 위한 ATCC 824 게놈 DNA 주형의 계열 희석을 사용하여 확인되었다.

둘 다의 유전자 CA_C0884 및 CA_C0885의 상대적 발현 수준은 모 유형 유전자간 영역을 갖는 균주 유형 008P에 비해 유전자간 돌연변이를 운반하는 균주 유형 130P에서 유의하게 더 높았다 (도 3).

이들 데이터는 PDO를 생산하는 재조합 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 psPD5 균주의 CA_C0884 및 CA_C0885 사이의 유전자간 영역에서 일어난 뉴클레오티드 삽입이 2개의 상기 유전자 hcpR 및 frdX의 과다발현을 허용함을 입증한다. 이러한 돌연변이의 존재 하에, PDO 생산 성능 특색은 개선되며, 균주는 산업용 글리세린에 존재하는 더러운 고함량 MONG 화합물에 대해 훨씬 더 저항성이다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> Microorganism and method for improved 1,3-propanediol production by fermentation on a culture medium with high glycerine content <130> B374950PCT D37437 <150> EP17306044.3 <151> 2017-08-04 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <220> <221> misc_feature <223> CA_C0884 gene sequence <400> 1 atggataaaa aaattttaac cgtattaaaa cattgtatct tattttcaaa aattgaaact 60 caggaaattg atcatttatt ttcatctata aattactcaa taaaagaata ctataaagat 120 gaaactatcg caattgaagg cgatacgtgc aataaaattg gaatagtatt aagcggttgt 180 gttgaaatac agaaaattta cgaatctggt aaaagtctta caataacaac actagaagaa 240 agcaagatat ttggtgaagc aataatattc tccaataaaa caagctatcc ttctacaata 300 atagcatgta ctaaaagtac tataattttt attcccaaag cctcaatatc taaattatgc 360 agcgacaatt cccttttcct taatggcttt atgtctcttc tatctaataa gatattgatg 420 ttgaataaaa aattaaaaaa tatgtcttat catactataa gagagaaaat atcaaactat 480 atacttgaac agtacgaagc tcaaaataac ttaactttta 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tttagaatag 690 <210> 12 <211> 229 <212> PRT <213> Clostridium butyricum <220> <221> MISC_FEATURE <223> AT697_RS15885 protein sequence : WP_046057470.1 <400> 12 Met Lys Asn Val Asn Glu Ile Ile Asp Lys Ile Lys Gln Asn Glu Phe 1 5 10 15 Phe Lys Gly Ile Asp Asp Lys Lys Ile Glu Met Ile Ile Ser Glu Leu 20 25 30 Ser His Ile Tyr Lys Glu Tyr Ser Lys Gly Gln Val Ile Ala Asn Glu 35 40 45 Gly Glu Val Cys Lys Asn Leu Gly Leu Val Val Asp Gly Ile Val Glu 50 55 60 Ile Gln Arg Ile Tyr Ser Ser Gly Lys His Ile Val Leu Lys Arg Met 65 70 75 80 Gly Ala Gly Glu Val Phe Gly Glu Ala Ile Ile Phe Ser Asp Lys Asn 85 90 95 Lys Tyr Pro Ala Thr Ile Ile Ala Ser Ser Asp Cys Ile Ile Ser Tyr 100 105 110 Leu Lys Lys Glu Asp Ile Ile Lys Leu Cys Leu Asn Glu Glu Ile Ile 115 120 125 Leu Lys Asn Phe Ile Thr Leu Leu Ser Asn Lys Ile Phe Ile Leu Asn 130 135 140 Arg Lys Ile Lys Thr Ile Ser Phe Lys Thr Ile Arg Gln Lys Val Val 145 150 155 160 Asn Phe Ile Leu Glu Gln Ser Lys Ser Gln Asn Asn Lys Thr Val Ile 165 170 175 Leu Lys Ile Ser Lys Glu Gln Ile Ala Ser Leu Leu Gly Ile Pro Arg 180 185 190 Pro Ser Leu Ser Arg Glu Leu Met Lys Leu Arg Asp Asp Gly Leu Ile 195 200 205 Glu Phe Asp Arg Asn Lys Ile Ser Ile Ile Asn Ile Glu Arg Leu Glu 210 215 220 Glu Glu Leu Leu Glu 225 <210> 13 <211> 711 <212> DNA <213> Clostridium pasteurianum <220> <221> misc_feature <223> BEE63_RS05090 gene sequence <400> 13 atgaaaagaa aaatagtgaa tatagataaa gaaaaatgta atggatgtgg actttgtagt 60 aaggcatgcc atgaaaatgc tatagaaata attgatggaa aagcagaact tgtttcggat 120 gaatattgtg atggacttgg agattgcctt ccacattgtc cagaaaacgc tataactata 180 atagaaagag aaagtaaaga atacgatgaa gaagctgtaa aaagaagaat tgaaagtaaa 240 gaaaagaaaa tgccatgtgg atgtccaggt tcaatggcaa aaaagataac tagagtttct 300 aaaaaagtag aagttaaaca tgaagatacg ggtgcagcat cagaacttat gcagtggcct 360 gtacaattgc aattagtaaa tccaaatgca agctattttg aaggcgcaaa tcttttagtt 420 gcagcggatt gtacagctta tgcttatggt aactttcatc aagattttat aaaaaatcat 480 ataactgtaa taggttgtcc taaacttgac gatgttgagt actataagaa taaaatcaaa 540 gaaattatag aaaataataa tcttaaaagt attacagtta ccagaatgga agtaccatgc 600 tgtggcggta tagtgtcagc tgtaaagaat gctatgcttg aggcacaggt tatattacct 660 tatagagaag tagttatagg aactaatgga gaagtgaagg aagcgaagta a 711 <210> 14 <211> 236 <212> PRT <213> Clostridium pasteurianum <220> <221> MISC_FEATURE <223> BEE63_RS05090 protein sequence : WP_066020349.1 <400> 14 Met Lys Arg Lys Ile Val Asn Ile Asp Lys Glu Lys Cys Asn Gly Cys 1 5 10 15 Gly Leu Cys Ser Lys Ala Cys His Glu Asn Ala Ile Glu Ile Ile Asp 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Leu Val Ser Asp Glu Tyr Cys Asp Gly Leu Gly Asp 35 40 45 Cys Leu Pro His Cys Pro Glu Asn Ala Ile Thr Ile Ile Glu Arg Glu 50 55 60 Ser Lys Glu Tyr Asp Glu Glu Ala Val Lys Arg Arg Ile Glu Ser Lys 65 70 75 80 Glu Lys Lys Met Pro Cys Gly Cys Pro Gly Ser Met Ala Lys Lys Ile 85 90 95 Thr Arg Val Ser Lys Lys Val Glu Val Lys His Glu Asp Thr Gly Ala 100 105 110 Ala Ser Glu Leu Met Gln Trp Pro Val Gln Leu Gln Leu Val Asn Pro 115 120 125 Asn Ala Ser Tyr Phe Glu Gly Ala Asn Leu Leu Val Ala Ala Asp Cys 130 135 140 Thr Ala Tyr Ala Tyr Gly Asn Phe His Gln Asp Phe Ile Lys Asn His 145 150 155 160 Ile Thr Val Ile Gly Cys Pro Lys Leu Asp Asp Val Glu Tyr Tyr Lys 165 170 175 Asn Lys Ile Lys Glu Ile Ile Glu Asn Asn Asn Leu Lys Ser Ile Thr 180 185 190 Val Thr Arg Met Glu Val Pro Cys Cys Gly Gly Ile Val Ser Ala Val 195 200 205 Lys Asn Ala Met Leu Glu Ala Gln Val Ile Leu Pro Tyr Arg Glu Val 210 215 220 Val Ile Gly Thr Asn Gly Glu Val Lys Glu Ala Lys 225 230 235 <210> 15 <211> 1524 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <220> <221> misc_feature <223> Full sequence comprising CA_C0884, the intergenic region, and CA_C0885 <400> 15 ttattctgca gcttctaaaa tttcttttaa agagttaata tctaatattg taatagatgt 60 tctatcaaag tctataattc cttcttcacg taggtttatg aattctctag ataatgatgg 120 ccttggaatt ccaagcattt cagacaactg tttttttgac ttattcattt taaaagttaa 180 gttattttga gcttcgtact gttcaagtat atagtttgat attttctctc ttatagtatg 240 ataagacata ttttttaatt ttttattcaa catcaatatc ttattagata gaagagacat 300 aaagccatta aggaaaaggg aattgtcgct gcataattta gatattgagg ctttgggaat 360 aaaaattata gtacttttag tacatgctat tattgtagaa ggatagcttg ttttattgga 420 gaatattatt gcttcaccaa atatcttgct ttcttctagt gttgttattg taagactttt 480 accagattcg taaattttct gtatttcaac acaaccgctt aatactattc caattttatt 540 gcacgtatcg ccttcaattg cgatagtttc atctttatag tattctttta ttgagtaatt 600 tatagatgaa aataaatgat caatttcctg agtttcaatt tttgaaaata agatacaatg 660 ttttaatacg gttaaaattt ttttatccat gtttttctcc caatactttt ttgtgtaaca 720 tatgttactg atatatttat ataattttaa tataatttaa tcataaagac aagtaatttt 780 attttgcgga actttatatt taggaggaaa aaaatgaaaa gaaaaatagt aaacatagat 840 aaagataaat gtaatggatg tggactttgt agtgaagcat gtcatgaaaa tgcaattgaa 900 ataattaatg gaaaagcaga gcttttatct gatgaatatt gtgatggttt aggagattgt 960 ttacctcatt gtccagttga tgcaataact ataatagaga gagaaagtaa ggaatatgat 1020 gaagaggcag ttcagagaag aattgaagaa aagaaaaaat caaagttagc taaaccctgt 1080 ggatgtccag gagctatggc taaaaaaata gaaagagtag ctaagccttt agctaaagta 1140 aaggaagata ggtcttctgt ttcagagtta atgcagtggc cagttcagtt aaggcttgta 1200 agtccaggag ctccatattt taaaaatgct aatcttttag tagctgcaga ttgtacagcc 1260 tatgcttatg gtgactttca caatgatttt ataaagaatc atataacagt aataggatgt 1320 ccaaaacttg atgatgttac atattacaaa gataagttga aagaaattat agaacttaat 1380 gaccttaaga gtataacagt tgttagaatg gaggtacctt gctgttcagg catagtttca 1440 gcagtaaaga ctgctatgct tgaagcaaaa gttatagtac cttttagaga agttattata 1500 ggaactaatg gtgaaattag ataa 1524 <210> 16 <211> 123 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <220> <221> misc_feature <223> Intergenic region between positions 1014117 and 1014239 of the C. acetobutylicum ATCC 824 genome <400> 16 gtttttctcc caatactttt ttgtgtaaca tatgttactg atatatttat ataattttaa 60 tataatttaa tcataaagac aagtaatttt attttgcgga actttatatt taggaggaaa 120 aaa 123 <210> 17 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Intergenic region comprising a single nucleotide insertion <400> 17 gtttttctcc caatactttt ttgtgtaaca tatgttactg atatatttat ataattttaa 60 tataatttaa tcataaagac aagtaatttt attttgcgga actttatatt taggaggaaa 120 aaaa 124 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Intergenic region forward primer <400> 18 gccattaagg aaaaggg 17 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Intergenic region reverse primer <400> 19 gctcctggac ttacaagcc 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C0884 gene based forward primer <400> 20 gaagagacat aaagccatta 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C0884 gene based reverse primer <400> 21 acaataacaa cactagaaga a 21 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C0885 gene based forward primer <400> 22 gctaaaccct gtggatgtc 19 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C0885 gene based reverse primer <400> 23 ggacttacaa gccttaactg aa 22 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C1628 gene based forward primer <400> 24 cccttagagg aggctatg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CA_C1628 gene based reverse primer <400> 25 gccatctctt acatctgg 18

Claims (20)

1. 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키고 hcpR 및 frdX 유전자를 과다발현하는 재조합 클로스트리디움(Clostridium) 미생물을 산업용 글리세린을 포함하는 배지 상에서 배양하는, 1,3-프로판디올의 발효적 생산을 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, hcpR 및 frdX 유전자가 유전자 변형에 의해 재조합 클로스트리디움 미생물에서 과다발현되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, hcpR 및 frdX 유전자가, hcpR 및/또는 frdX 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 돌연변이시키는 것, hcpR 및 frdX 유전자 사이의 유전자간 영역을 돌연변이시키는 것, 유전자 중복, 및 플라스미드로부터 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 변형에 의해 재조합 클로스트리디움 미생물에서 과다발현되는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, hcpR 및 frdX 유전자가 삽입에 의한 hcpR 및 frdX 유전자 사이의 유전자간 돌연변이에 의해 재조합 클로스트리디움 미생물에서 과다발현되는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 삽입이 반복 A 뉴클레오티드의 영역에서 일어나는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 재조합 클로스트리디움 미생물이 고농도의 산업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 적응되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 산업용 글리세린 중 글리세롤 농도가 90 내지 120 g/L에 포함되는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 산업용 글리세린 중 글리세롤 농도가 105 g/L인 방법.
9. 제6항에 있어서, 산업용 글리세린이 적어도 5% 지방산을 포함하는 것인 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 산업용 글리세린이 바이오디젤 생산의 부산물인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 클로스트리디움 미생물이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 또는 클로스트리디움 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum)인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 재조합 클로스트리디움 미생물이 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides)와 공동-배양되는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 1,3 프로판디올이 추가로 정제되는 것인 방법.
14. 글리세롤로부터의 1,3 프로판디올의 생산을 위한 재조합 클로스트리디움 미생물로서, 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키고 hcpR 및 frdX 유전자를 과다발현하는 미생물.
15. 제14항에 있어서, hcpR 및 frdX 유전자가 유전자 변형에 의해 과다발현되는 것인 재조합 클로스트리디움 미생물.
16. 제15항에 있어서, hcpR 및 frdX 유전자가, hcpR 및/또는 frdX 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 돌연변이시키는 것, hcpR 및 frdX 유전자 사이의 유전자간 영역을 돌연변이시키는 것, 유전자 중복, 및 플라스미드로부터 hcpR 및/또는 frdX 유전자를 과다발현시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 변형에 의해 재조합 미생물에서 과다발현되는 것인 재조합 클로스트리디움 미생물.
17. 제14항에 있어서, 90 내지 120 g/L에 포함되는 산업용 글리세린 중 글리세롤 농도를 갖는 배양 배지 상에서 성장하도록 적응되고/거나 산업용 글리세린이 적어도 5% 지방산을 포함하는 재조합 클로스트리디움 미생물.
18. 제14항에 있어서, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 부티리쿰, 및 클로스트리디움 파스테우리아눔으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 클로스트리디움 미생물.
19. 제18항에 있어서, 클로스트리디움 스포로게네스 및 클로스트리디움 스페노이데스와 공동-배양되는 재조합 클로스트리디움 미생물.
20. 삭제

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