CN106661540B - 通过重组菌株从葡萄糖生产木糖醇 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产木糖醇的重组微生物宿主，该重组微生物宿主含有编码使用D‑阿糖醇作为底物且产生D‑木酮糖作为产物的NAD+特异性D‑阿糖醇4‑氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的核酸序列和编码使用D‑木酮糖作为底物且产生木糖醇作为产物的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的核酸序列。

Description

通过重组菌株从葡萄糖生产木糖醇
发明领城
本发明涉及使用基因修饰的微生物生产木糖醇的方法、以及制备能够将易得碳源(如D-葡萄糖)一步转化为木糖醇的基因修饰的微生物的方法。
发明背景
木糖醇是具有化学式(CHOH)3(CH2OH)2的在保健学与营养配制品和产品中具有应用的多元醇或糖醇(醛糖醇)。
木糖醇被用作大致像蔗糖一样甜、少33％卡路里的糖尿病甜味剂。不像其他天然或合成甜味剂，木糖醇通过在规律使用中将龋齿减少至三分之一而对牙齿健康有积极益处并且有助于再矿化。
木糖醇以低浓度天然存在于许多水果和蔬菜的纤维中，并且可以从各种浆果、燕麦、和蘑菇、以及纤维材料(如玉米壳和甘蔗渣)与桦木中提取。
然而，工业生产以从硬木或玉米芯中提取的木聚糖(一种半纤维素)开始，木聚糖被水解成木糖并被催化氢化成木糖醇。
因此，木糖以及还有木糖醇的纯化呈现显著问题。许多这种类型的工艺是已知的。美国专利4,075,406和4,008,285可以作为实例提及。
D-木糖还原为木糖醇也可以在微生物过程中使用从自然界中分离的酵母菌株(野生型菌株)或基因工程化的菌株来实现。
然而，获得呈适于酵母发酵形式的底物D-木糖是个问题，因为廉价的木糖来源(如来自制浆和造纸工艺的亚硫酸盐溶液)含有抑制酵母生长的杂质。
生产木糖醇的有吸引力的替代方法是通过发酵便宜且易得的底物(如D-葡萄糖)来获得它。
在现有技术中，存在一些被描述为能够在不同于D-木糖和D-木酮糖的任何常见碳源的一步发酵期间产生一定量木糖醇的重组微生物。
这些重组微生物(尤其是嗜渗酵母)是例如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、多形假丝酵母(Candida polymorpha)、和念珠球拟酵母(Torulopsis candida)，它们最初作为从D-葡萄糖生产显著量的木糖醇密切相关戊糖醇(其是D-阿糖醇)的生产者而已知(路易斯(Lewis)D.H.&史密斯(Smith)D.C.，1967，新植物学家(New Phytol.)66:143-184)。
因此，国际专利申请WO 94/10325提供了用于构建这样的当在不同于D-木酮糖或D-木糖且不同于其聚合物或寡聚物或混合物的碳源上生长时能够产生木糖醇的重组宿主的方法。
在当前专利申请中，这个目标是通过引入并表达希望的异源基因而对希望的微生物(优选天然存在的酵母微生物)的代谢进行修饰来实现的。
这个目标还通过以下方式来实现：进一步修饰这样的希望的微生物的代谢，以便过表达某些对处于其天然状态的这样的微生物而言同源的基因和/或使其活性或表达失活。
在这个专利申请中提供的用于生产木糖醇的方法利用改变的D-阿糖醇生物合成途径，并且这样的途径尤其通过向D-阿糖醇生产微生物中引入编码D-木酮糖形成型D-阿糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.11)和木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)的基因并使其过表达来延伸预先存在的D-阿糖醇途径而进行改变。
然而，描述于WO 94/10325中的试验中的木糖醇产率在具有酵母提取物的培养基中培养48小时之后仅为大约7.7g/l。
为了尝试优化这个第一结果，在WO 94/10325中进一步提出使用诱变或基因破坏使编码转酮醇酶(EC 2.2.1.1)的基因和/或编码D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的基因失活，并且还在此类微生物中过表达编码戊糖磷酸途径的氧化分支的酶的基因并且具体是D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)和/或6-磷酸-D-葡糖酸脱氢酶(EC 1.1.1.44)和/或D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶(EC 5.1.3.1)基因。
但是，无论使用什么遗传组合，木糖醇滴度从未多于9g/l。
因此对木糖醇生产菌株进行更好遗传操纵以便优化其生产并且因此使得它具备商业利润仍存在未满足的需求。
发明概述
本发明涉及能够产生木糖醇的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含：
编码使用D-阿糖醇作为底物并且产生D-木酮糖作为产物的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的异源核酸序列；和，
编码使用D-木酮糖作为底物并且产生木糖醇作为产物的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的异源核酸序列。
优选地，宿主细胞不消耗作为唯一碳源的D-阿糖醇。更优选地，宿主细胞选自细菌、真菌和酵母。在优选实施例中，宿主细胞是嗜渗的或耐渗的酵母，特别是奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)。
优选地，NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)来自大肠杆菌或青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。更优选地，NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC1.1.1.11)包含SEQ ID No 2或43的序列或具有1-3个氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其组成。在优选实施例中，编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的序列包含SEQ ID No 3或42的序列或由其组成。
优选地，NADPH特异性木糖醇脱氢酶是来自被突变以改变从NADH到NADPH的辅因子特异性的树干毕赤酵母或氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的木糖醇脱氢酶。更优选地，NADPH特异性木糖醇脱氢酶包含SEQ ID No 5或8的序列或具有1-3个氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其组成。在优选实施例中，编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列包含SEQ ID No 6或9的序列或由其组成。
优选地，宿主细胞能够在48h培养之后在上清液中产生至少15g/l的木糖醇滴度。
优选地，宿主细胞是选自保藏在CNCM的菌株I-4982、I-4960和I-4981的菌株。
优选地，宿主细胞包含编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列的若干拷贝和/或编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列的若干拷贝。
本发明还涉及用于生产木糖醇的方法，该方法包括培养根据权利要求1-13中任一项所述的重组宿主细胞，并且回收木糖醇。
本发明另外涉及包含选自由SEQ ID No 1、3、7和9组成的组的核酸序列或由其组成的核酸，包含所述核酸的表达盒或载体。
最后，本发明涉及根据本发明的重组宿主细胞用于生产木糖醇的用途。
发明详细说明
定义
如在此使用的，“不同于D-木糖和D-木酮糖的碳源”意指不同于D-木糖和D-木酮糖或其聚合物或寡聚物或混合物(如木聚糖和半纤维素)的用于木糖醇生产的碳底物。碳源优选地包括D-葡萄糖、以及各种含有D-葡萄糖的糖浆和D-葡萄糖与其他糖的混合物。
如在此使用的，“基因”意指可以编码蛋白质的核酸序列，特别是DNA序列。
如在此使用的，“载体”意指能够将遗传信息(确切地是DNA)带进宿主细胞的质粒或任何其他DNA序列。载体可以进一步含有适于在鉴定用该载体转化的细胞中使用的标记或报告子、以及允许在一个或多个原核或真核宿主中维持并复制该载体的复制起点。“质粒”是在至少一个宿主细胞中维持并自主复制的载体，通常是环状DNA。
如在此使用的，“表达载体”意指类似于载体但在转化进宿主之后支持已经被克隆进其中的基因或编码核酸的表达的载体。经克隆的基因或编码核酸通常被置于某些控制序列(如启动子序列)的控制之下(即，与其可操作地连接)，这些控制序列可以由载体或通过经克隆的基因的重组构建来提供。表达控制序列将取决于载体是否被设计成在原核或真核宿主中表达可操作地连接的基因而变化，并且可以另外含有转录元件如增强子元件(上游激活序列)和终止序列、和/或翻译起始和终止位点。
如在此使用的，“宿主”意指被用作重组材料的受体和载体的原核的或真核的细胞。
如在此使用的，“戊糖磷酸途径的氧化分支”意在包括催化氧化反应(如由D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)、葡糖酸内酯酶(EC 3.1.1.17)、和6-磷酸-D-葡糖酸脱氢酶(EC 1.1.1.44)催化的反应)，且利用己糖底物形成戊糖磷酸的戊糖磷酸旁路部分。戊糖磷酸途径的“非氧化”部分(其也催化从D-葡萄糖净形成核糖)由非氧化异构化(如由转酮醇酶(EC 2.2.1.1)、核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、D-核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(EC5.1.3.1)和转醛醇酶(EC 2.2.1.2)催化的反应)表征。参见生物化学(BiologicalChemistry)，H.R.马勒(Mahler)&E.H.科德斯(Cordes)，哈珀与罗出版公司(Harper&Row,publishers)，纽约，1966，第448-454页。
如在此使用的，“编码核酸”意指核酸分子(优选DNA)。编码核酸能够编码蛋白质并且可以制备自多种来源。这些来源包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、及其组合。
如在此使用的，“异源的”被理解为意指基因或编码序列已经通过基因工程被引入细胞中。它能以附加体或染色体形式存在。基因或编码序列可以源于与它所引入的宿主细胞不同的来源。然而，它也可以来自与它所引入的宿主细胞相同的物种，但是由于其非天然的环境它被认为是异源的。例如，基因或编码序列被称为异源的，因为它处于作为其非天然启动子的启动子的控制之下，它被引入在不同于其天然位置的位置处。宿主细胞在引入异源基因之前可以含有该基因的内源拷贝，或者它可以不含有内源拷贝。
发明目的
根据本发明，操纵具体微生物宿主的天然代谢途径，以便降低或消除用于不同于木糖醇生产目的的碳利用。
这样一种基因修饰的宿主菌株因此能够在一个发酵步骤中以高产率产生木糖醇。例如，在48h培养之后上清液中的木糖醇滴度多于15g/l，优选地多于25g/l，仍更优选地多于50、60、70、80、90或100g/l。
在本发明的实际实现中，本发明的基因修饰的宿主还由其从结构无关的碳源(如D-葡萄糖)而非仅从D-木糖和/或D-木酮糖合成木糖醇的能力表征。
优选地，本发明的基因修饰的宿主还能够将合成的木糖醇分泌到培养基中。
具体地，在示例且优选的实施例中，本发明的基因修饰的宿主由其中阿糖醇作为木糖醇形成中的中间体的途径表征。
因此，本发明的重组宿主菌株由以下遗传改变表征：
(1)编码具有NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成)活性的蛋白质的异源核酸已被引入该宿主细胞中-因此提供D-阿糖醇向D-木酮糖的转化；和
(2)编码具有NADPH特异性木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的异源核酸已被引入该宿主细胞中-因此提供D-木酮糖向木糖醇的转化。
微生物的选择
适于本发明的微生物或宿主菌株能够从葡萄糖生产D-阿糖醇。更具体地，它们能够在高渗透压培养基下从葡萄糖生产显著量的D-阿糖醇。
“高渗透压培养基”在此旨在指代含有10％-60％D-葡萄糖、优选约25％D-葡萄糖的培养基。
“显著量的D-阿糖醇”旨在是至少100g/L的D-阿糖醇。具体而言，当微生物或宿主菌株在分批条件下在含有25％D-葡萄糖的培养基中产生100g/L D-阿糖醇时，该微生物或宿主菌株被认为产生显著量的D-阿糖醇。
能够从葡萄糖生产显著量的D-阿糖醇的宿主菌株的实例包括嗜渗的或耐渗的酵母，特别是属于毕赤酵母属、柯达酵母属(Kodamaea)、假丝酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschnikowia)和汉逊酵母属的种的那些；或D-阿糖醇生产真菌，特别是属于小树状霉属(Dendryphiella)和裂褶菌属的种的那些，特别是盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)和裂褶菌(Schizophyllum commune)。
毕赤酵母属的微生物的实例包括奥默毕赤酵母、树干毕赤酵母、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、嗜盐毕赤酵母(Pichia haplophila)。假丝酵母属的微生物的实例包括多形假丝酵母和热带假丝酵母。接合酵母属的微生物的实例包括鲁氏接合酵母。其他实例包括念珠球拟酵母和汉逊有孢圆酵母(Torulaspora hansenii)。梅奇酵母属的微生物的实例包括美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、鲁考弗梅奇酵母(Metschnikowiareukaufii)、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、新月梅奇酵母(Metschnikowialunata)和佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)。作为具体菌株，可以提及美极梅奇酵母ATCC 18406、鲁考弗梅奇酵母ATCC 18407、二尖梅奇酵母ATCC 24179、新月梅奇酵母ATCC 22033、佐贝尔梅奇酵母ATCC 22302和美极梅奇酵母FERM BP-7161。这些菌株可以从美国典型培养物保藏中心获得，地址：12301Parklawn Drive，罗克维尔市，马里兰州20852，美国。美极梅奇酵母FERN BP-7161最初在1998年1月16日在FERM P-16592保藏号下保藏在国际贸易与工业部的工业科学技术院的国家生物科学和人类技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science andTechnology,Ministry of International Trade and Industry)(邮政编码：305-8566，1-3东村(Higashi)1-丁目(Chome)，筑波(Tsukuba-shi)，茨城县(Ibaraki-ken)，日本)并且在2000年5月15日基于布达佩斯条约(Budapest Treaty)从原始保藏中心转移到国际保藏中心，并且已经作为FERM BP-7161的保藏号进行保藏。在具体方面中，该微生物具有登录号FERM BP-7161。关于更多信息，参考EP 1065276。
该微生物可以被基因工程化，以便改进其产生D-阿糖醇的能力和/或对于不同于木糖醇生产的目的而言降低其使用D-阿糖醇的能力。
对于本发明，通过其具体代谢属性来有利地对宿主菌株进行选择：
-它可以是如上详细描述的特别是在高渗透压培养基例如含有10％-60％D-葡萄糖且优选25％D-葡萄糖的培养基(“正常”培养基通常仅含有2％-3％葡萄糖)下从葡萄糖生产显著量的D-阿糖醇的生产者。
-它可以不消耗作为唯一碳源的D-阿糖醇；
-其氧化还原平衡允许生成对应的戊酮糖/戊糖醇转化所需的辅因子。
在本发明的一个实施例中，嗜渗酵母奥默毕赤酵母(及其经诱变的衍生物)已被用作模型并被用作优选宿主。奥默毕赤酵母最初已从黄瓜盐水中分离并且在食品工业中常用于泡菜、外皮、和水果中的发酵。
本领域技术人员已知，与酿酒酵母相反，酵母种(如毕赤酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属和汉逊酵母属)能够在低水活度环境中生长。这些耐渗的或嗜渗的酵母积累保护并使酶稳定化的相容性溶质(像甘油、D-阿糖醇、赤藓醇和甘露醇)，从而允许在渗透生长条件下的细胞功能。产生的多元醇在氧化还原平衡中也发挥作用。
在优选方面中，微生物是奥默毕赤酵母。确实，宿主菌株奥默毕赤酵母的主要特征在于与产生甘油和D-阿糖醇的鲁氏接合酵母相反，仅产生D-阿糖醇作为相容性溶质。另外，从葡萄糖到D-阿糖醇的代谢途径在奥默毕赤酵母中是熟知的。
如在鲁氏接合酵母中描述的(J.M.英格拉姆(INGRAM)和W.A.伍德(WOOD)，1965，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第89卷，第5期，1186-1194)，奥默毕赤酵母中的碳通量经过戊糖磷酸途径(PPP)的氧化部分，以将D-葡萄糖转化成D-核酮糖-5-P，同时伴随两个分子的NADPH的产生。D-核酮糖-5-P脱磷酸成D-核酮糖并且然后还原成D-阿糖醇。在奥默毕赤酵母宿主菌株中，戊糖磷酸途径(PPP)非常具活性并且已被确定为高于50％。
在优选实施例中，宿主细胞是在2012年3月7日在编号I-4605下保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur)的国家微生物培养物保藏中心[Collection Nationale deCultures de Microorganismes，National Collection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)的突变型奥默毕赤酵母。
氧化还原反应和酶
辅因子NADH和NADPH是众多生物功能所必需的，在所谓的氧化还原反应中作为从一个反应到另一个反应的电子载体起作用。细胞需要维持两个氧化还原对NADH/NAD+和NADPH/NADP+的代谢平衡，已知NADPH/NADP+对被维持为比NADH/NAD+对更具还原态，以提供热力学驱动力。主要以氧化形式NAD+存在的NADH是分解代谢反应中的主要辅因子，在分解代谢反应中它参与从营养素氧化释放能量。与NADH相比之下，NADPH在合成代谢反应中或在氧化应激的时间期间被排他地再氧化。
涉及氧化还原反应的任何代谢工程策略都必须在这些细胞约束下发挥作用。它已经在作为本发明的目的的基因修饰的菌株中进行。
如本发明人所发现的，尤其是在标题为“对奥默毕赤酵母中戊糖醇代谢研究的贡献(Contributionàl’étude du metabolisme des pentitols chez Pichia ohmeri)”的博士论文(苏菲·胡谢(Sophie Huchette)，里尔科技大学(University of Sciences andTechnics of Lille)，1992)中所描述的，已经证明戊酮糖的氧化还原中所涉及的反应由两种不同的酶催化。
因此，宿主菌株具有从D-核酮糖形成D-阿糖醇和从D-木酮糖形成木糖醇的被定义为NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶的酶。宿主菌株还具有分别从D-核酮糖和D-木酮糖形成核糖醇和木糖醇的NADH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶。这种酶接近于熟知的来自树干毕赤酵母(XYL2)的NAD+特异性木糖醇脱氢酶E.C 1.1.1.9。由于与D-木酮糖形成对照，仅细胞内D-核酮糖可用，宿主菌株通过从D-核酮糖在胞质形成D-阿糖醇，通过NADPH的再氧化直接地平衡NADPH/NADP+氧化还原对。然后，D-阿糖醇经由被动扩散分泌到培养液中。
诸位发明人发现，细胞内D-木酮糖的缺乏应是宿主菌株不产生木糖醇的主要原因，即使奥默毕赤酵母具有经由NADH或NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶生产这种多元醇的所有酶工具。
确实，选择将编码具有NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成)活性的蛋白质(E.C.1.1.1.11)的基因克隆进野生型宿主菌株奥默毕赤酵母中允许将胞质D-阿糖醇转化为D-木酮糖和NADH。
所以，细胞内D-木酮糖变得在基因修饰的菌株中可用并且可以被固有NADH和NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶还原。然而，菌株缺乏能够将D-木酮糖有效地转化成木糖醇的内源酶。因此，有必要遗传改造菌株，以便引入异源木糖醇脱氢酶。
在专利WO 94/10325中，选择从树干毕赤酵母(XYL2)克隆NAD+特异性木糖醇脱氢酶(E.C 1.1.1.9)允许生产木糖醇并且通过氧化由先前的代谢步骤产生的NADH平衡NADH/NAD+氧化还原对。但是如前面所提及的，结果不是真正令人信服的。
诸位发明人发现，通过克隆编码具有NADPH特异性木糖醇脱氢酶的经突变的蛋白质的基因，D-木酮糖被转化为木糖醇以平衡NADPH/NADP+氧化还原对，如通过从D-核酮糖固有地生产D-阿糖醇所进行的。
由于NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶对D-阿糖醇的亲和力较低，奥默毕赤酵母野生型宿主菌株不消耗细胞外D-阿糖醇。
由于向基因修饰的菌株中引入NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成)活性，产生进培养液中的D-阿糖醇可以被修饰的菌株按照与胞质D-阿糖醇相同的方式很好地消耗。
因此，木糖醇同时地从细胞内和细胞外D-阿糖醇产生。
其生产可以通过增强木糖醇途径延伸的效率以完全避免中间D-阿糖醇的输出来改进。
因此，仅从D-葡萄糖生产具有与D-阿糖醇相同的生理效应的木糖醇。这种改进可能是遗传修饰的结果，但也可能是适应培养条件的结果。
有待克隆进宿主菌株中的两种酶活性的选择
这两种酶活性的选择得到其辅因子特异性的支持，如上文所描述的。
第一种酶将D-阿糖醇氧化成D-木酮糖。
已知两种类型的D-阿糖醇脱氢酶：D-木酮糖形成型(EC 1.1.1.11)(D-阿拉伯糖醇NAD+4-氧化还原酶)和D-核酮糖形成型(EC1.1.1.250)。除非另有说明，否则它是D-木酮糖形成型阿糖醇脱氢酶，它是本文的意图所在并且在此称为阿糖醇脱氢酶。D-核酮糖形成型脱氢酶存在于野生型酵母和真菌中。
D-木酮糖形成型阿糖醇脱氢酶主要在细菌中已知。例如，已经在肠杆菌科(特别是大肠杆菌)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、和产气气杆菌菌株PRL-R3中，在氧化葡糖杆菌，并且另外还在树干毕赤酵母中鉴定了它们。具体而言，在UniprotKB数据库中提及了若干种酶，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(#O52720)、青枯雷尔氏菌(#P58708)、鼠疫耶尔森菌(#P58709)、产气气杆菌(#L8BEF0)、大肠杆菌(#K3EX35、I2ZSJ5、W1BYD6、W1H8N7、E7U4R7)。
出于本发明的目的，大肠杆菌是NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成型)基因的优选来源。更确切地，其氨基酸序列披露于SEQ ID No 2中。具体而言，SEQ IDNo 1和3披露了编码大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的核酸。通过考虑其密码子特异性已经针对奥默毕赤酵母对编码序列进行了优化。
另外，青枯雷尔氏菌也是NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成型)基因的优选来源。更确切地，其氨基酸序列披露于SEQ ID No 43中。具体而言，SEQ ID No 42披露了编码青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的核酸。通过考虑其密码子特异性已经针对奥默毕赤酵母对编码序列进行了优化。
第二种酶将D-木酮糖转化成木糖醇。
尽管大多数酵母和真菌具有内源木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)基因，但是将其辅因子特异性从NADH变为NADPH是实施本发明所必需的。确实，本发明的关键方面在于使用NADPH特异性木糖醇脱氢酶。另外，这种酶优选地在宿主中过表达。
已知许多木糖醇脱氢酶并且若干科学论文教导了如何将辅因子特异性从NADH变为NADPH。渡边(Watanabe)等人(生物化学杂志(J；Biol.Chem.)，2005，280，10340-10345)披露了树干毕赤酵母的具有修饰的辅因子特异性的经突变的木糖醇脱氢酶，尤其是三重突变体(D207A/I208R/F209S)和四重突变体(D207A/I208R/F209S/N211R)。四重突变体的氨基酸序列披露于SEQ ID No 5中。具有NADPH辅因子特异性的氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶的双重突变体(D38S/M39R)披露于埃伦斯伯格(Ehrensberger)等人(2006，结构(Structure)，14，567-575)中。双重突变体的氨基酸序列披露于SEQ ID No 8中。
编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母XYL2核酸序列的突变和克隆已经由诸位发明人进行了制备。具体而言，SEQ ID No 4和6披露了编码树干毕赤酵母的特异性NADPH木糖醇脱氢酶的核酸。
可替代地，诸位发明人还已经对编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的氧化葡糖杆菌核酸序列进行了突变和克隆。具体而言，SEQ ID No 7和9披露了编码氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的核酸。通过考虑其密码子特异性已经针对奥默毕赤酵母对编码序列进行了优化。
表达盒、载体和重组宿主细胞
在具体方面中，本发明涉及包含选自下组的针对奥默毕赤酵母进行优化的编码序列的核酸，该组由以下各项组成：SEQ ID No 1、3、7、9和42。
本发明进一步涉及包含以下核酸的表达盒，该核酸包含选自下组的针对奥默毕赤酵母进行优化的编码序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No 1、3、7、9和42。
本发明还涉及SEQ ID No 4的核酸构建体和包含所述核酸构建体的核酸。
另外，本发明涉及包含所述核酸或表达盒的重组载体，特别是表达载体。通常，表达盒包含将基因转录并翻译成蛋白质所需的所有元件。具体而言，它包含启动子、任选地增强子、转录终止子和用于翻译的元件。更具体地，对用于控制NADPH特异性木糖醇脱氢酶表达的启动子进行选择，以便驱动强表达。确实，这种酶优选地在宿主细胞中过表达。此类启动子在本领域是熟知的。例如，启动子可以是奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子(poRR)或奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)。
本发明涉及包含编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的核酸和编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的核酸的重组载体，特别是表达载体。本发明还涉及包含含有编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的核酸的重组载体(特别是表达载体)、和含有编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的核酸的重组载体(特别是表达载体)的试剂盒。
优选地，所述NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和NADPH特异性木糖醇脱氢酶选自上文披露的酶。具体而言，所述NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶包含SEQ ID No 2或42的氨基酸序列或具有1-3个氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其组成。具体而言，所述NADPH特异性木糖醇脱氢酶包含SEQ ID No 5或8的氨基酸序列或具有1-3个氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其组成。
优选载体是质粒。适合的质粒是本领域技术人员熟知的并且可以例如选自在实例中具体披露的那些。
首先通过将处于适合启动子的控制之下的编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的基因克隆进重组载体中并且通过转化引入D-阿糖醇生产有机体的宿主细胞中来产生本发明的基因修饰的宿主。
本发明涉及重组的或基因工程化的宿主细胞，该宿主细胞包含编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的异源核酸序列和编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的异源核酸序列。NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶使用D-阿糖醇作为底物并且产生D-木酮糖作为产物。NADPH特异性木糖醇脱氢酶使用D-木酮糖作为底物并且产生木糖醇。编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶和NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列可以是附加型的或可以整合到宿主细胞的染色体中。确实，优选地使用载体通过转化系统来构建遗传稳定的转化体，由此将希望的DNA整合到宿主染色体中。这样的整合从头在细胞内发生或可以通过用载体进行转化来协助，该载体在功能上将其自身连同促进DNA序列整合到染色体中的DNA元件插入到宿主染色体中。
重组的或基因工程化的宿主细胞可以包含编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列的若干拷贝和/或编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列的若干拷贝，这些拷贝优选地整合到宿主细胞染色体中。具体而言，重组的或基因工程化的宿主细胞可以包含两个、三个或四个编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列和/或两个、三个或四个编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列。例如，宿主细胞可以包含两种或三种来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和/或一种或两种来自青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，更具体地两种或三种来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和/或一种来自青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶可以来自相同有机体或来自不同有机体。NADPH特异性木糖醇脱氢酶可以来自相同有机体或来自不同有机体。例如，宿主细胞可以包含一种、两种或三种来自树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和/或一种、两种或三种来自氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶，更具体地一种来自树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和/或三种来自氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶。
在本发明的具体方面中，重组的或基因工程化的宿主细胞是包含以下项的奥默毕赤酵母菌株：
-两种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和两种NADPH特异性木糖醇脱氢酶；或
-两种来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和两种NADPH特异性木糖醇脱氢酶(一种来自树干毕赤酵母且另一种来自氧化葡糖杆菌)；或
-两种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和三种NADPH特异性木糖醇脱氢酶；或
-两种来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和三种NADPH特异性木糖醇脱氢酶(一种来自树干毕赤酵母且两种来自氧化葡糖杆菌)；或
-三种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和三种NADPH特异性木糖醇脱氢酶；或
-三种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(两种来自大肠杆菌且一种来自青枯雷尔氏菌)和三种NADPH特异性木糖醇脱氢酶(一种来自树干毕赤酵母且两种来自氧化葡糖杆菌)；或
-四种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和四种NADPH特异性木糖醇脱氢酶；或
-四种NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(三种来自大肠杆菌且一种来自青枯雷尔氏菌)和四种NADPH特异性木糖醇脱氢酶(一种来自树干毕赤酵母且三种来自氧化葡糖杆菌)。
宿主细胞选自上文详细描述的微生物。在优选实施例中，宿主细胞是奥默毕赤酵母。起始宿主细胞优选地是在编号I-4605下保藏在CNCM的突变型奥默毕赤酵母。
在本发明的具体方面中，宿主细胞是选自保藏在CNCM的菌株I-4982、I-4960和I-4981的菌株。
本发明涉及用于生产木糖醇的方法，该方法包括在培养基中培养重组的或基因工程化的宿主细胞并且回收产生的木糖醇。优选地，培养基为微生物提供了便利的碳源。碳源优选地包括D-葡萄糖、以及各种含有D-葡萄糖的糖浆和D-葡萄糖与其他糖的混合物。该方法可以进一步包括纯化木糖醇的步骤。
本发明涉及如在此披露的重组的或基因工程化的宿主细胞用于生产木糖醇的用途。
由此类基因修饰的菌株产生的木糖醇可以根据本领域已知的任何技术从本发明的宿主的培养基中纯化。例如，US 5,081,026(通过引用结合在此)描述了从酵母培养物中层析分离木糖醇。因此，从发酵步骤，可以使用如描述于US 5,081,026中的层析步骤、随后结晶来从培养基中纯化木糖醇。
本发明的其他特征特色和优点在阅读下面的实例时将清楚。然而，在此给出这些实例仅用于说明而非限定。
附图与序列
图1：12ABYWMP：来自大肠杆菌的侧翼为AscI和SphI限制位点的所合成的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的限制性图谱。
图2a：lig7.78：来自树干毕赤酵母的NADH特异性木糖醇脱氢酶的限制性图谱。
图2b：12AALQTP：来自树干毕赤酵母的侧翼为HindIII和SacII限制位点的所合成的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的限制性图谱。
图3：13AAYSYP：来自氧化葡糖杆菌的侧翼为AscI和SphI限制位点的所合成的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的限制性图谱。
图4：使用重叠PCR构建由侧翼为poRR启动子和终止子的开放阅读框组成的表达盒。
图5：12AAMCJP：菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的侧翼为HindIII和SacII限制位点的所合成的塔格糖-3-差向异构酶的限制性图谱。
图6：具有poLEU2和poURA3选择标记的奥默毕赤酵母穿梭载体的构建。
图7：pEVE2523：奥默毕赤酵母poURA3表达载体pEVE2523的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有菊苣假单胞菌的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的开放阅读框。
图8：pEVE2560：奥默毕赤酵母poLEU2表达载体pEVE2560的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有菊苣假单胞菌的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的开放阅读框。
图9：用于过表达氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体的构建。
图10：pEVE3284：奥默毕赤酵母pEVE3284表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶。
图11：用于过表达树干毕赤酵母NADPH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体的构建。
图12：pEVE2562/pEVE2564：分别具有poURA3或poLEU2选择标记的奥默毕赤酵母pEVE2562/pEVE2564表达载体的限制性图谱，这些表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶。
图13：用于过表达树干毕赤酵母NADH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体的构建。
图14：pEVE2563：奥默毕赤酵母pEVE2563表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的树干毕赤酵母的NADH特异性木糖醇脱氢酶。
图15：使用poURA3选择标记构建用于在奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的控制之下过表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的奥默毕赤酵母载体。
图16：pEVE2839：奥默毕赤酵母pEVE2839表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
图17：使用poURA3选择标记构建用于在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下过表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的奥默毕赤酵母载体。
图18：pEVE3102：奥默毕赤酵母pEVE3102表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和核酮糖还原酶(poRR)终止子的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
图19：pEVE3123：奥默毕赤酵母pEVE3123表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子及poURA3选择标记的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
图20：使用poLEU2选择标记构建用于在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下过表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的奥默毕赤酵母载体。
图21：pEVE3157：奥默毕赤酵母pEVE3157表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子及poLEU2选择标记的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
图22：具有poLEU2选择标记的奥默毕赤酵母loxP载体的构建。
图23：pEVE2787：奥默毕赤酵母pEVE2787整合载体的限制性图谱，该整合载体具有在内源启动子和终止子的控制之下的侧翼为两个loxP位点的经克隆的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。
图24：12ABTV4P：来自诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)的侧翼为AscI和SphI限制位点的所合成的nat1基因的限制性图谱。
图25：pEVE2798：奥默毕赤酵母pEVE2798表达载体的限制性图谱，该表达载体具有在核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的控制之下的经克隆的nat1标记。
图26：具有nat1选择标记的奥默毕赤酵母loxP载体的构建。
图27：pEVE2852：奥默毕赤酵母pEVE2852整合载体的限制性图谱，该整合载体具有在核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的控制之下的侧翼为两个loxP位点的经克隆的nat1标记。
图28：pEVE2855：奥默毕赤酵母pEVE2855整合载体的限制性图谱，该整合载体具有与LEU2开放阅读框上游的5’区域同源的经克隆的片段和侧翼为两个loxP位点的nat1选择标记。
图29：用于缺失LEU2开放阅读框的奥默毕赤酵母loxP载体的构建。
图30：pEVE2864：奥默毕赤酵母pEVE2864整合载体的限制性图谱，该整合载体具有与LEU2开放阅读框上游的5’区域同源的经克隆的片段和与LEU2开放阅读框下游的3’区域同源的片段、及侧翼为两个loxP位点的nat1选择标记。
图31：包含树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达质粒的构建。
图32：pEVE3318：奥默毕赤酵母pEVE3318表达载体的限制性图谱，该表达载体含有树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体。
图33：pEVE2862：奥默毕赤酵母pEVE2862表达载体的限制性图谱，该表达载体含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的奥默毕赤酵母LEU2标记。
图34：用于在奥默毕赤酵母中基因组表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和树干毕赤酵母NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建。
图35：pEVE2865：奥默毕赤酵母pEVE2865整合载体的限制性图谱，该整合载体含有侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2标记。
图36：pEVE3387：奥默毕赤酵母pEVE3387整合载体的限制性图谱，该整合载体含有树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体与侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。
图37：包含氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双/三表达质粒的构建。
图38：pEVE3322/pEVE3324：奥默毕赤酵母pEVE3322/pEVE3324表达载体的限制性图谱，这些表达载体含有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体或氧化葡糖杆菌的两个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的一个NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的三表达构建体。
图39：用于在奥默毕赤酵母中基因组表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建。
图40：pEVE3390/pEVE3392：奥默毕赤酵母pEVE3390/pEVE3392整合载体的限制性图谱，这些整合载体含有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体或氧化葡糖杆菌的两个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的一个NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的三表达构建体与侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。
图41：用于在奥默毕赤酵母中基因组表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建。
图42：pEVE4390：奥默毕赤酵母pEVE4390表达载体的限制性图谱，该表达载体含有大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的双表达构建体与侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。
图43：13AB2EGF：来自青枯雷尔氏菌的侧翼为AscI和SphI限制位点的所合成的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的限制性图谱。
图44：用于在奥默毕赤酵母中基因组表达青枯雷尔氏菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建。
图45：pEVE3898：奥默毕赤酵母pEVE3898表达载体的限制性图谱，该表达载体具有经克隆的表达盒，该表达盒含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
图46：pEVE4077：奥默毕赤酵母pEVE4077表达载体的限制性图谱，该表达载体具有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体。
图47：pEVE4377：奥默毕赤酵母pEVE4377整合载体的限制性图谱，该整合载体具有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体及侧翼为两个loxP位点的poLEU2选择标记。
序列表
Figure BDA0001182833390000241
实例
实例1.选择奥默毕赤酵母菌株作为用于基因工程化的优选宿主
作为所选择的宿主菌株，奥默毕赤酵母：
-是在高渗透压培养基例如含有10％-60％D-葡萄糖，且优选25％D-葡萄糖的培养基(“正常”培养基通常仅含有2％-3％葡萄糖)下从葡萄糖生产显著量的阿糖醇的生产者。
-具有允许生成所需的辅因子的氧化还原平衡。
作为其性能的说明，以下表格指示了在奥默毕赤酵母的阿糖醇代谢途径中所涉及的酶活性(苏菲·胡谢论文(Sophie HUCHETTE Thesis)，1992)
己糖单磷酸途径：从葡萄糖-6-P到D-核酮糖-5-P和D-木酮糖-5-P
PPP的氧化部分(亦称己糖单磷酸途径(HMP))是NADPH生产途径。作为葡萄糖-6-P脱氢酶(E.C.1.1.1.49)和6-P-葡糖酸脱氢酶(E.C.1.1.1.44)的两种NADP+依赖性酶在1摩尔的D-核酮糖-5-P中参与1摩尔的葡萄糖-6-P的氧化并生成2摩尔的NADPH。
表1
Figure BDA0001182833390000251
一个单位的酶活性被定义为每mL的粗提取物每分钟消耗1微摩尔的NAD(P)H或NAD(P)+。一个单位的比活性被定义为在粗提取物中每mg的蛋白质的一个单位的酶活性。
测定了以下酶的动力学参数：D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶(E.C 5.1.3.1)、D-核糖-5-P酮基-异构酶(E.C.5.3.1.6)、转酮醇酶(E.C.2.2.1.1)和酸性磷酸酶(E.C.3.1.3.2)。
表2
Figure BDA0001182833390000252
一个单位的酶活性被定义为每mL的粗提取物每分钟消耗1微摩尔的NAD(P)H或NAD(P)+。一个单位的比活性被定义为在粗提取物中每mg的蛋白质的一个单位的酶活性。
表3
Figure BDA0001182833390000261
一个单位的酶活性被定义为每mL的粗提取物每分钟消耗1微摩尔的NAD(P)H或NAD(P)+。一个单位的比活性被定义为在粗提取物中每mg的蛋白质的一个单位的酶活性。
在体内，通过D-核酮糖-5-P的差向异构化合成的D-木酮糖-5-P经由转酮醇作用(transketolization)有效地进入PPP的非氧化部分。因此，D-木酮糖-5-P因其脱磷酸成D-木酮糖而不可用。
NADH和NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶
D-核酮糖和D-木酮糖通过D-核酮糖-5-P和D-木酮糖-5-P的脱磷酸化来产生。
米氏常数突出了NADH和NADPH-D-戊酮糖-氧化还原酶对每种底物的亲和力和对应的最大速度。
表4
Figure BDA0001182833390000271
一个单位的酶活性被定义为每mL的粗提取物每分钟消耗1微摩尔的NAD(P)H或NAD(P)+。一个单位的比活性被定义为在粗提取物中每mg的蛋白质的一个单位的酶活性。
分别从D-核酮糖和D-木酮糖形成核糖醇和木糖醇的NADH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶对D-木酮糖显示出比D-核酮糖高的亲和力。逆反应显示出对木糖醇和核糖醇的良好的亲和力，解释了宿主菌株在这两种多元醇上生长良好。
表5
Figure BDA0001182833390000272
一个单位的酶活性被定义为每mL的粗提取物每分钟消耗1微摩尔的NAD(P)H或NAD(P)+。一个单位的比活性被定义为在粗提取物中每mg的蛋白质的一个单位的酶活性。
从D-核酮糖形成D-阿糖醇且从D-木酮糖形成木糖醇的NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶对D-核酮糖显示出比D-木酮糖高的亲和力。逆反应显示出对D-阿糖醇非常低的亲和力，解释了宿主菌株在这种多元醇上不生长。
来自宿主菌株的这两种戊酮糖-氧化还原酶被表征为不同于由英格拉姆(Ingram)和伍德(Wood)在1965年描述于鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)中的先前的酶(细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第89卷，第5期，1186-1194)。确实，在鲁氏酵母中，在D-核酮糖和NADH上没有检测到正向反应，并且在D-阿糖醇与NADPH上检测到了逆向反应。
霍尔丹(Haldane)关系预测了体内酶动力学行为。
表6
Figure BDA0001182833390000281
这两种酶相对于逆向反应(戊糖醇还原)更有利于正向反应(D-戊酮糖氧化)。
宿主菌株中的PPP极其高效，并且从1摩尔消耗的葡萄糖生成2摩尔的NADPH。因此，NADPH对于合成代谢反应和维持反应两者而言过量地可用。宿主菌株必须从D-核酮糖生产D-阿糖醇或从D-木酮糖生产木糖醇，以平衡NADPH/NADP+氧化还原对。
已经在体外确定了NADP+对NADPH特异性D-戊酮糖-氧化还原酶的抑制作用。当过量地添加NADP+时，活性少80％。即使这个浓度与细胞内NADP+浓度不相配，这个结果仍给出NADPH特异性D-戊酮糖氧化还原酶在NADPH/NADP+氧化还原对平衡中的作用的一些概述。
宿主菌株仅从D-核酮糖生产D-阿糖醇，因为D-木酮糖不可用，这是由于D-木酮糖-5-P进入了PPP的非氧化部分。
D-阿糖醇生产与NADPH/NADP+氧化还原平衡之间的联系已经通过评价葡萄糖-6-P脱氢酶的过表达对D-阿糖醇生产的影响在宿主菌株中进行了证明。所以，与宿主菌株(FR2772788)相比，所获得的菌株具有高1.5倍的G6PDH活性且产生了多10％的D-阿糖醇。
实例2.奥默毕赤酵母密码子使用
从五个奥默毕赤酵母基因的可用DNA和对应的氨基酸序列确定了奥默毕赤酵母的密码子使用：转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(FR2772788)、核酮糖还原酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶-LEU2(佩里达(Piredda)和盖拉丁(Gaillardin)，酵母(Yeast)，第10卷:1601-1612(1994))和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶-URA3(佩里达(Piredda)和盖拉丁(Gaillardin)，1994，同上)。
将每个单独的基因分为编码单个氨基酸的核苷酸三联体。这五个基因由总共2091个密码子组成。
对于每个氨基酸，对存在于这五个基因中的每个密码子的数目计数，除以2091并乘以1000。以此方式，估计出特定密码子在1000个密码子中的频率。
奥默毕赤酵母的初步密码子使用描绘于表7中。
使用这个表和从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的Optimizer程序对奥默毕赤酵母中表达的所有异源基因(来自树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶除外)进行密码子优化。
在编码酶的序列的对应的5’和3’端手动添加限制酶的识别位点之后，将所获得的序列用于基因合成。
表7.奥默毕赤酵母的来源于5个编码序列(CDS)的密码子使用表
奥默毕赤酵母[gbpln]：5个CDS(2091个密码子)
字段：[三字母][频率：每千]([数目])
Figure BDA0001182833390000301
Figure BDA0001182833390000311
实例3.大肠杆菌细菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(D-木酮糖形成型)基因 的克隆
根据SEQ ID NO:1的提交序列，用化学方法合成编码来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶altD的DNA片段(
Figure BDA0001182833390000312
Gene Synthesis，生命科技公司(LifeTechnologies)，雷根斯堡，德国)。
编码altD基因的序列AF378082.1(从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF378082获得)的核苷酸1441至2808被用作模板并且根据实例2的表7，使用从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的Optimizer程序使其经受密码子优化用于在奥默毕赤酵母ATCC 20209中使用。
在所得序列的5’和3’端，添加分别编码限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的识别位点的核苷酸，以便有助于进一步克隆。
另外，腺苷三联体被包括在起始ATG之前，以将酵母的Kozak样序列的-3位处的腺苷考虑在内。
然后提交最终序列(SEQ ID NO:1)进行合成(GeneArt，雷根斯堡，德国)。
将所合成的编码来自大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的DNA片段作为5μg冻干的质粒DNA在pMK-RQ衍生的载体(12ABYWMP，图1)中递送。
为了进一步亚克隆，将基因通过用AscI和SphI酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性切割来释放。
实例4.树干毕赤酵母NADH和NADPH特异性木糖醇脱氢酶的诱变和克隆
树干毕赤酵母NADH特异性木糖醇脱氢酶基因的克隆
遵循FR 2 765 589(参见这个专利的实例4和图7)的教导，将编码木糖醇脱氢酶(科特
Figure BDA0001182833390000321
等人，当代遗传学(Curr.Genet.)18:493-500(1990))的酵母(树干毕赤酵母)基因XYL2的已知核苷酸序列克隆进质粒载体lig 7.78中。载体的限制性图谱呈现在图2a中。
树干毕赤酵母NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的诱变和克隆
根据SEQ ID NO:4的序列，用化学方法合成编码来自树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶XYL2的DNA片段(
Figure BDA0001182833390000322
Gene Synthesis，生命科技公司，雷根斯堡，德国)。
编码XYL2基因的序列X55392.1(从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X55392.1获得)的核苷酸319至1410被用作模板。
根据来自渡边(Watanabe)等人(生物化学杂志(J；Biol.Chem.)，2005，280，10340-10345)的论文，可以通过引入四个公开的氨基酸突变D207A/I208R/F209S/N211R(基于从http://www.uniprot.org/uniprot/P22144获得的P22144蛋白质序列进行编号)将木糖醇脱氢酶的辅因子偏好从NADH变为NADPH。
因此，编码D207、I208、F209和N211的密码子在对应的序列中分别被GCT、AGA、TCA和AGA手动替换。
另外，在对应的5’和3’端手动地包括编码限制酶HindIII(AAGCTT)和SacII(CCGCGG)的识别位点的核苷酸，以便有助于进一步克隆。
此外，腺苷三联体被包括在起始ATG之前，以将酵母的Kozak样序列的-3位处的腺苷考虑在内。提交最终序列(SEQ ID NO:4)进行合成(GeneArt，雷根斯堡，德国)。
将所合成的编码来自树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的DNA片段作为5μg冻干的质粒DNA在pMA-T衍生的载体(12AALQTP，图2b)中递送。
实例5.氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的诱变和克隆
根据SEQ ID NO:7的提交序列，用化学方法合成编码来自氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶Xdh的DNA片段(
Figure BDA0001182833390000331
Gene Synthesis，生命科技公司，雷根斯堡，德国)。
编码Xdh基因的序列AB091690.1(从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB091690.1获得)的核苷酸1063至1851被用作模板并且根据表7(实例2)，使用从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的Optimizer程序使其经受密码子优化用于在奥默毕赤酵母ATCC 20209中使用。
基于埃伦斯伯格(Ehrensberger)等人(结构(Structure)，2006，14，567-575)的公开，可以通过引入两个公开的氨基酸突变D38S/M39R(基于从http://www.uniprot.org/uniprot/Q8GR61获得的Q8GR61蛋白质序列进行编号)将酶的辅因子特异性从NADH变为NADPH。
因此，编码D38和M39的密码子在对应的序列中分别被TCT和AGA手动替换。另外，在对应的5’和3’端手动地包括编码限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的识别位点的核苷酸，以便允许进一步克隆。
此外，腺苷三联体被包括在起始ATG之前，以将酵母的Kozak样序列的-3位处的腺苷考虑在内。提交最终序列(SEQ ID NO:7)进行合成(GeneArt，雷根斯堡，德国)。
将所合成的编码来自氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的DNA片段作为5μg冻干的质粒DNA在pMA-T衍生的载体(13AAYSYP，图3)中递送。为了进一步亚克隆，将基因通过用AscI和SphI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性切割来释放。
实例6.使用poURA3选择标记构建用于异源基因表达的奥默毕赤酵母载体
具有可替换的以下项的载体的克隆：
-启动子，
-开放阅读框，和
-终止子元件
通过三个单独片段的两次连续重叠PCR来进行(图4)。
载体最初被计划为表达模型，以测试塔格糖3-差向异构酶基因在重组奥默毕赤酵母菌株中的克隆和过表达。
如将在下文描述的，塔格糖3-差向异构酶基因已经克隆进特定AscI–SphI限制位点盒中，允许通过使用这些相同的插入位点来克隆任何感兴趣的基因。
通过以下方式设想克隆。
在第一次PCR(PCR1)中，使用以下项扩增奥默毕赤酵母的侧翼为SpeI和AscI位点(在引物序列中加下划线)的490bp长的核酮糖还原酶启动子片段：
-引物EV2960：
GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG(SEQ ID No 12)
和
-引物EV2961：
CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG(SEQ ID No 13)
另外，在反向引物EV2961的5’端，添加代表塔格糖-3-差向异构酶基因的5’端的13个核苷酸长的片段。
需要这个片段连同AscI位点的8个核苷酸和核酮糖还原酶启动子的3’端的10个后续核苷酸作为重叠物，以便使PCR1的片段与下文描述的PCR2的片段融合。奥默毕赤酵母ATCC 20209的基因组DNA被用作模板。
为此目的，将刚划出的奥默毕赤酵母菌落重悬于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加热4min。全速离心之后，将0.5μl的上清液用于PCR。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司(BIO-RAD)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/50℃下20sec/72℃下15sec的25个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
在第二次PCR(PCR2)中，使用以下项扩增菊苣假单胞菌ST24的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为AscI和SphI位点(在引物序列中加下划线)的911bp长的片段：
-引物EV2962：
AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG(SEQ ID No 14)
和
-引物EV2963：
TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG(SEQ ID No 15)。
引物EV2962的5’端含有代表核酮糖还原酶启动子的3’的9个核苷酸长的片段。
将这个片段连同AscI位点的8个核苷酸和塔格糖-3-差向异构酶开放阅读框的后续12个核苷酸用于重叠PCR，以将PCR2产物融合到先前描述的PCR1产物上。
另外，反向引物EV2963的5’端含有代表奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶终止子的5’端的12个核苷酸长的片段。
需要这个片段连同SphI位点的6个核苷酸和塔格糖-3-差向异构酶开放阅读框的3’端的后续12个核苷酸作为重叠物，以便使PCR2与下文描述的PCR3的PCR片段融合。
作为模板，使用25ng含有所合成的菊苣假单胞菌ST24的塔格糖-3-差向异构酶基因拷贝的载体12AAMCJP(图5)(GeneArt，雷根斯堡，德国)(AB000361.1的核苷酸719至1591，来自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB000361)–SEQ ID No:11。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司(BIO-RAD)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/48℃下20sec/72℃下30sec的25个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。
在第三次PCR(PCR3)中，使用以下项扩增奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶终止子的侧翼为SphI和SacII位点(在引物序列中加下划线)的380bp长的片段：
-引物EV2964
AAGCTGGCCTGAGCATGCTCTCGAAGAGAATCTAG(SEQ ID No 16)
和
-引物EV2965
GTTCCGCGGAGAATGACACGGCCGAC(SEQ ID No 17)
引物EV2964的5’端含有塔格糖-3-差向异构酶开放阅读框的3’端的12个核苷酸长的片段，该开放阅读框连同SphI位点的6个核苷酸和奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶终止子的后续12个核苷酸用于使PCR3融合到先前描述的PCR2上。
奥默毕赤酵母ATCC 20209的基因组DNA被用作模板。全速离心之后，将0.5μl的上清液用于PCR中。为此目的，将刚划出的奥默毕赤酵母菌落重悬于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加热4min。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP、0.5μM的每种引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/50℃下20sec/72℃下15sec的25个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
如下进行这三个单独PCR片段的融合：PCR1和PCR2的50ng的每种凝胶纯化产物在用EV2960和EV2963进行的PCR反应中被用作模板。
由上文描述的引物设计得到的这两个片段中的30个核苷酸长的同源区段在融合反应中被用作重叠物。
以此方式，使1.4kb长的片段(由奥默毕赤酵母的侧翼为SpeI和AscI位点的核酮糖还原酶启动子组成)融合到菊苣假单胞菌ST24的塔格糖-3-差向异构酶的开放阅读框上。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP、0.5μM的每种引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/62℃下20sec/72℃下45sec的30个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
使第二次重叠PCR中的经纯化的片段融合到PCR3的产物上。40ng的每种片段被用作模板并用EV2960和EV2965进行扩增。
由上文描述的引物设计得到的这两个片段中的30个核苷酸长的同源区段在融合中被用作重叠物。
以此方式，使1.8kb长的片段(由奥默毕赤酵母的侧翼为SpeI和AscI的核酮糖还原酶启动子和菊苣假单胞菌ST24的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为AscI和SphI位点的开放阅读框组成)融合到奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶终止子上。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP、0.5μM的每种引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/65℃下20sec/72℃下55sec的30个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
将最终PCR产物(由菊苣假单胞菌ST24的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为核酮糖还原酶启动子和终止子的1.7kb长的片段组成)用限制酶SpeI和SacII(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)消化，凝胶纯化，并且在16℃下使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)与lig7.78载体骨架的9.8kb长的分离的SpeI/SacII片段连接过夜(图6)。
用连接混合物转化XL10 Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(ZyppyTMPlasmid Miniprep Kit)(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA。将经纯化的质粒DNA用于通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进行的进一步表征。
新克隆的表达质粒pEVE2523(图7)是由细菌(大肠杆菌)复制起点和氨比西林抗性基因、酵母(奥默毕赤酵母)自主复制序列、和用于在酵母中进行选择的poURA3(奥默毕赤酵母)基因组成的穿梭大肠杆菌-奥默毕赤酵母载体。
此外，它含有可交换的侧翼于菊苣假单胞菌的塔格糖-3-差向异构酶的开放阅读框(经由AscI和SphI酶切可交换的)的奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子元件(经由SpeI和AscI限制性酶切)和终止子元件(经由SphI和SacII限制性酶切)。
实例7.使用poLEU2选择标记构建用于异源基因表达的奥默毕赤酵母载体
为了构建第二奥默毕赤酵母表达载体，将先前在实例6中描述的质粒pEVE2523(图7)的表达盒克隆进含有奥默毕赤酵母poLEU2选择标记的载体(图6)中。
用SpeI和SacII(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)切割的载体pEVE2523(图7)的平端的1.7kb片段被用作插入物。用平端化酶混合物(Blunting EnzymeMix)(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行15min的平端化，随后使酶在70℃下热失活10min。
载体骨架获得自用SalI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化的poARS载体(plig3–FR 2772788)，将其平端化并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)，将使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化的插入物和载体骨架在室温下连接1h。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且将其用于通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进行的进一步表征。
新克隆的表达质粒pEVE2560(图8)是含有细菌(大肠杆菌)复制起点和氨比西林抗性基因、酵母(奥默毕赤酵母)自主复制序列、和用于在酵母中进行选择的poLEU2(奥默毕赤酵母)基因的穿梭大肠杆菌-奥默毕赤酵母载体。
此外，菊苣假单胞菌的塔格糖-3-差向异构酶的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子的开放阅读框是经由AscI和SphI酶切可交换的。
实例8.用于过表达氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体 的构建
构建了用于过表达氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体。
为了克隆进表达载体中，将编码氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶的DNA片段通过用AscI和SphI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)切割而从载体13AAYSYP(图3)中释放。
将803bp片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2523(图7)的9.8kb AscI/SphI消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图9)。
用连接混合物转化XL10 Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3284(图10)含有氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶启动子和终止子的经密码子优化的NADPH特异性木糖醇脱氢酶，以及poURA3选择标记。
实例9.用于过表达树干毕赤酵母NADPH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体 的构建
为了亚克隆进表达载体中，编码来自树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的DNA片段的侧翼必须为AscI和SphI限制位点。
为此目的：
-EV3101引物
AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC(SEQ ID No 18)，含有AscI位点(加下划线的)和
-EV3102引物
GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG(SEQ ID No 19)，含有SphI(加下划线的)
用于使用30ng的载体12AALQTP(图2b)作为模板的PCR反应中。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/55℃下20sec/72℃下30sec的25个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。
在1％琼脂糖凝胶上分离1.1kb PCR产物，提取，使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化并用AscI和SphI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切。用DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)柱纯化之后，将它在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)分别连接至pEVE2523(图7)的10.6kb AscI/SphI消化且凝胶纯化的载体骨架和pEVE2560(图8)的11.8kb AscI/SphI消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图11)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，分离质粒DNA并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2562和pEVE2564(图12)含有树干毕赤酵母的侧翼为奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶启动子和终止子的经密码子优化的NADPH特异性木糖醇脱氢酶，以及对应的poURA3或poLEU2选择标记。
实例10.用于过表达树干毕赤酵母NADH特异性木糖醇脱氢酶的奥默毕赤酵母载体 的构建
为了亚克隆进表达载体中，编码来自树干毕赤酵母的NADH特异性木糖醇脱氢酶的DNA片段的侧翼必须为AscI和SphI限制位点。
为此目的：
-EV3101(AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC)(SEQ ID No 18)，含有AscI位点(加下划线的)和
-EV3102(GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG)(SEQ ID No 19)，含有SphI(加下划线的)
用于使用30ng的载体lig7.78(图2a)作为模板的PCR反应中。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。
这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/55℃下20sec/72℃下30sec的25个循环，和72℃下10分钟的最终延伸步骤。
在1％琼脂糖凝胶上分离1.1kb PCR产物，提取，使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化并用AscI和SphI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切。
用DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)柱纯化之后，将它在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2560(图8)的10.5kb AscI/SphI消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图13)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，分离质粒DNA并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2563(图14)含有树干毕赤酵母的侧翼为奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶启动子和终止子的经密码子优化的NADH特异性木糖醇脱氢酶，以及poLEU2选择标记。
实例11.用于过表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的奥默毕赤酵母 载体的构建
构建了用于过表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的奥默毕赤酵母载体。
为了克隆进表达载体中，将编码经密码子优化的大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的DNA片段通过用AscI和SphI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)切割而从载体12ABYWMP(图1)中释放。
将1.4kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2523(图7)的9.8kb AscI/SphI消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图15)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2839(图16)含有侧翼为奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶启动子和终止子的经密码子优化的大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，以及poURA3选择标记。
除奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子之外，还克隆了来自大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶。
通过以下方式以两个连续步骤进行克隆：首先用poPGK1启动子替换核酮糖还原酶启动子，随后用poTKL终止子交换核酮糖还原酶终止子。
使用以下项从奥默毕赤酵母的基因组DNA扩增奥默毕赤酵母poPGK1启动子的611bp长的片段：
-引物EV3177(GAAGACTAGTTCACGTGATCTC)(SEQ ID No20)，含有SpeI位点(加下划线的)和
-引物EV3178(CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC)(SEQ ID No 21)，含有AscI位点(加下划线的)。
通过将刚划出的奥默毕赤酵母菌落重悬于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加热4min来制备基因组DNA模板。全速离心之后，将0.5μl的上清液用于PCR。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。
这样完成PCR：96℃下2min的预变性步骤，随后是96℃下10sec/58℃下10sec/72℃下30sec的25个循环，和72℃下2分钟的最终延伸步骤。
在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
将扩增的610bp长的poPGK1启动子片段用SpeI和AscI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2839(图16)的11.5kb SpeI/AscI消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图17)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3102(图18)含有侧翼为奥默毕赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和核酮糖还原酶终止子的经密码子优化的大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，以及poURA3选择标记。
在下一步骤中，用奥默毕赤酵母的转酮醇酶(poTKL)终止子交换pEVE3102的核酮糖还原酶终止子。
使用以下项从奥默毕赤酵母的基因组DNA扩增奥默毕赤酵母poTKL终止子的213bp长的片段：
-引物EV3817(TAGCAGCATGCATAGGTTAGTGAATGAGGTATG)(SEQ ID No 22)，含有SphI位点(加下划线的)和
-引物EV3818(TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC)(SEQ ID No 23)，含有SacII位点(加下划线的)。
如上文描述的制备基因组DNA模板。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。
这样完成PCR：96℃下2min的预变性步骤，随后是96℃下10sec/57℃下10sec/72℃下30sec的25个循环，和72℃下2分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
将扩增的213bp长的poTKL终止子片段用SphI和SacII(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE3102(图18)的11.5kb SphI/SacII消化且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图17)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3123(图19)含有侧翼为奥默毕赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的经密码子优化的大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，以及poURA3选择标记。
为了能够使用另一选择从质粒表达大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，用poLEU2标记交换pEVE3123的poURA3标记。
为此目的，将poURA3标记通过用PsiI和AfeI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切而从载体pEVE3123(图19)中释放。
将9.1kb载体骨架使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化，用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。
作为插入物，使用通过AseI和AfeI进行限制性酶切而从载体pEVE2560(图8)中释放的poLEU2标记的3kb平端的且凝胶纯化的片段。使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的片段连接(图20)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3157(图21)含有侧翼为奥默毕赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的经密码子优化的大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，以及poLEU2选择标记。
实例12.质粒大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和质粒树干毕赤酵母 NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因在奥默毕赤酵母菌株ATCC 20209中的表达
为了将阿糖醇生物合成地转化成木糖醇，需要同时表达NAD+特异性大肠杆菌D-阿糖醇4-氧化还原酶和树干毕赤酵母的NADP特异性木糖醇脱氢酶。
第一种酶导致木酮糖的形成并且第二种酶将木酮糖转化成木糖醇。
衍生自ATCC 20209并且是亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的奥默毕赤酵母菌株SRLU(MATh-leu2 ura3)(佩里达(Piredda)和盖拉丁(Gaillardin)，1994，同上)被用作用于通过用以下质粒进行转化来构建分泌木糖醇的酵母菌株的宿主：
-pEVE2839(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)和
-pEVE2564(树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶)
得到菌株EYS2755
另外，作为对照(遵循WO 94/10325的传授)，还通过以下方式构建了表达树干毕赤酵母的NADH特异性野生型木糖醇脱氢酶的菌株：用以下质粒
-pEVE2839(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)和
-pEVE2563(树干毕赤酵母的NADH特异性木糖醇脱氢酶)
转化到SRLU宿主中，得到菌株EYS2962。
作为对照，还产生了用以下单个质粒转化的菌株：
-pEVE2839(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)，
-pEVE2563(树干毕赤酵母的NADH特异性木糖醇脱氢酶)，和
-pEVE2564(树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶)分别得到EYS2943、EYS2696和EYS2697。
酵母转化基本上通过进行具有以下修改的格林(Green)等人(格林(Green)E.D.、希特尔(Hieter)，P.和斯彭切尔(Spencer)F.A，基因组分析：实验手册(Genome Analysis:ALaboratory Manual)中的第5章，第3卷，克隆系统(Cloning Systems)，比伦(Birren)等人(编辑)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约，1999)的原生质球法来进行：取代Lyticase，使用Zymolyase 100T以产生原生质球，并且在Zymolyase处理之前在37℃下用酶进行孵育直到细胞悬浮液的OD达到原始OD的20％-30％。
简言之，使奥默毕赤酵母细胞在YPD培养基(酵母提取物1％(w/v)，蛋白胨2％(w/v)，右旋糖2％(w/v))中在30℃下生长过夜，至最终OD600为3-5。
通过离心收获200个OD600单位，用水和1M山梨醇洗涤一次，并重悬于SCE缓冲液(1M山梨醇，100mM柠檬酸三钠盐二水合物，10mM EDTA)中，至最终浓度为70OD/ml。
添加DTT和Zymolase(LuBio Science，卢塞恩，瑞士)至最终浓度分别为10mM和0.5U/OD，并且将混合物伴随缓慢振荡在37℃下进行孵育。
细胞壁消化之后测量稀释于水中的溶液的光密度。当此值降至原始值的80％时，通过小心离心并用1M山梨醇和STC缓冲液(0.98M山梨醇，10mM Tris pH 7.5，10mM CaCl2)洗涤来使消化终止。
将原生质球小心地重悬于含有50μg/ml小牛胸腺DNA(Calbiochem/VWR，迪蒂孔，瑞士)的STC缓冲液中，至最终浓度为200OD/ml。将100μl的等分部分与100-200ng的质粒DNA混合并在室温下孵育10min。
向悬浮液中添加1ml PEG溶液(19.6％PEG 8000w/v，10mM Tris pH 7.5，10mMCaCl2)，孵育10分钟并沉淀。使原生质球在1ml含有25％YPD和7mM CaCl2的1M山梨醇溶液中在30℃下再生1-2h。
向再生的细胞中添加7ml的50℃的温顶层琼脂(0.67％酵母氮基w/o氨基酸，0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/组氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉(drop-out powder)，0.086‰的必需缺失氨基酸，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH 5.8和2.5％诺布尔琼脂)，并且将混合物均匀地倒在预温的含有山梨醇的选择板(0.67％酵母氮基w/o氨基酸，0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/组氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉，0.086‰的必需缺失氨基酸，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH 5.8)上。
将板在30℃下孵育3-5天。在适当的选择板上对转化体进行重新选择。
针对阿糖醇、木糖醇和核糖醇生产对每个产生的菌株一式三份地进行测试。
为此目的，使克隆首先在种子培养基(0.67％不含氨基酸的酵母氮源；0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/组氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉；0.086‰的必需缺失氨基酸；5％葡萄糖；pH 5.7)中在30℃下生长过夜。
将来自这种过夜培养物的主培养物以0.2的起始OD600接种在生产培养基(0.67％不含氨基酸的酵母氮源；0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/组氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉；0.086‰的必需缺失氨基酸；15％葡萄糖；pH 5.7)中。
使这种培养物在37℃下生长48小时，并且使用
Figure BDA0001182833390000532
HPX-87柱(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)和
Figure BDA0001182833390000533
TQ-检测器(连接至三重四极杆检测器上的
Figure BDA0001182833390000534
UPLC，沃特斯公司(Waters)，米尔福德市，马萨诸塞州)及用100％水作为流动相的等度条件通过HPLC/MS测定上清液的阿糖醇、木糖醇和核糖醇浓度。
所有测试的菌株的多元醇滴度描绘于表8中。
表8
Figure BDA0001182833390000531
nd–未检测到
与野生型NADH特异性酶相比，树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的使用使得木糖醇滴度显著增加。
实例13.质粒氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因在奥默毕赤酵母中的 表达
除使用树干毕赤酵母的NADP特异性木糖醇脱氢酶的木糖醇生产菌株之外，还对表达氧化葡糖杆菌的NADP特异性木糖醇脱氢酶的第二菌株进行了工程化。
衍生自ATCC 20209并且是亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的奥默毕赤酵母菌株SRLU(MATh-leu2ura3)(佩里达(Piredda)和盖拉丁(Gaillardin)，1994，同上)被用作用于通过用质粒pEVE3157(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)和pEVE3284(氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶)进行转化来构建分泌木糖醇的酵母菌株的宿主，得到菌株EYS3324。
作为对照，还产生了用以下单个质粒转化的菌株：
-pEVE3157(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)和
-pEVE3284(氧化葡糖杆菌的NADH特异性木糖醇脱氢酶)，分别得到EYS3067和EYS3323。
与在表达树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶的菌株中使用的poRR启动子形成对照，用于构建以上菌株的大肠杆菌D-阿糖醇4-氧化还原酶受poPGK1启动子的控制。
然而，为了排除启动子影响并且因此能够将表达来自氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶的菌株中的多元醇水平与表达来自树干毕赤酵母的对应酶的那些进行比较，已经产生了另外的菌株。
通过用以下项转化SRLU宿主来获得这个菌株EYS2963
-pEVE3123(大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶)和
-pEVE2564(树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶)。
酵母转化如在实例12中所描述的进行。如在实例12中所描述的，针对阿糖醇、木糖醇和核糖醇生产对每个产生的菌株一式三份地进行测试。
所有测试的菌株的多元醇滴度描绘于表9中。
表9
Figure BDA0001182833390000551
nd–未检测到
表达来自氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的菌株(EYS3324)中的木糖醇滴度类似于表达来自树干毕赤酵母的对应酶的菌株(EYS2963)的那些。然而，氧化葡糖杆菌酶导致低得多的核糖醇滴度，因而显示出对木酮糖较高的底物特异性。
实例14.具有增加的阿糖醇分泌的突变型奥默毕赤酵母菌株的产生
已经从奥默毕赤酵母ATCC 20209的UV辐射的悬浮液中选择了较高阿糖醇生产者突变体。
UV辐射系统(Vilber Lourmat，法国)配备有微处理器控制的RMX-3W辐射计。使奥默毕赤酵母在YPD琼脂(右旋糖20g/L)上在37℃下生长过夜。
制备悬浮液达到106cfu/mL(OD620＝0.4)并且将5mL放入无菌培养皿中。将盖从培养皿取下之后，对悬浮液进行辐射处理。UV波长是254nm并且辐射能是1.8 10-2J/cm2。获得90％死亡率的酵母细胞。停止辐射并且替换培养皿上的盖子之后，将悬浮液转移到位于冰浴中的无菌管中。
用经突变的悬浮液接种20mL的YPD液体培养基并在37℃、250rpm下孵育12小时。
孵育之后，将经突变的培养物用无菌40％甘油(V/V)稀释。将等分部分分配到5mL小瓶中并在-80℃下冷冻。
筛选是基于奥默毕赤酵母能够在非常高浓度的右旋糖(高达600g/L)上生长的嗜渗特性。
我们的目的在于选择能够在含有600g/L或700g/L右旋糖的YPD琼脂上生长地比母株快的突变体。
将除霜的等分部分涂布在YPD600和YPD700上，并且选择首先出现的菌落并针对在摇瓶中的阿糖醇生产对其进行测试。
继代培养基和生产培养基由葡萄糖(分别为50g/L或100g/L)、酵母提取物3g/L、MgSO4 1g/L和KH2PO4 2g/L(pH 5.7)制成。将继代培养物(10mL，在100mL烧瓶中)在37℃、250rpm下孵育24h。将生产培养基(40mL，在500mL烧瓶中)用5mL的继代培养物接种并在37℃、250rpm下孵育64小时。
葡萄糖g/L 64h 阿糖醇g/L 64h
奥默毕赤酵母ATCC 20209 6.0 52.7
奥默毕赤酵母CNCM I-4605 0 58.6
针对其较快地消耗葡萄糖及其较高的阿糖醇产量对突变型奥默毕赤酵母菌株进行选择并且将其在2012年3月7日在编号I-4605下保藏在法国的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)。
实例15.LEU2缺失质粒的构建
为了能够使用新产生的CNCM I-4605菌株进行质粒选择和基因整合，构建了用于缺失LEU2开放阅读框的质粒。
在第一步中，根据酿酒酵母CRE/loxP系统对可以用于奥默毕赤酵母中的通用整合载体进行改变。将载体骨架通过用PstI和EcoRV酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而从pUG73(盖尔德内尔(Gueldener)等人，2002，核酸研究(Nucleic Acid Res)，30，e23)中分离。
用以下引物对产生了充当含有奥默毕赤酵母的侧翼为loxP位点的LEU2选择标记的PCR片段的插入物：
-EV3043
(CACTGGCGCGCCCACTGCATGCGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGACACATCGTGGATCCAAGCTATCAACGAGAGAGTC)(SEQ ID No 24)和
-EV3044
(AGTGGCTAGCAGTGCCATGGCCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCTCGAGACGCGTCATCTAGCATCTCATCTACCAACTC)(SEQ ID No 25)和
-作为模板的poARS(plig3-FR 2772788-参见图6)。
正向引物EV3043含有在SphI位点(加下划线的)之前的AscI(加下划线的)位点，后面是48bp长的loxP片段(粗体)和DraIII位点(加下划线的)。EV3043的3’端含有另外的25bp长的用于扩增奥默毕赤酵母LEU2基因的片段。另一方面，反向引物EV3044含有在NcoI位点(加下划线的)之前的NheI(加下划线的)位点，后面是48bp长的loxP片段(粗体)和MluI位点(加下划线的)。EV3044的3’端含有另外的25bp长的用于扩增奥默毕赤酵母LEU2基因的片段。在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中扩增模板。这样进行PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/65℃下10sec/72℃下50sec的30个循环，和72℃下7分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
第二次PCR反应中的经扩增的片段的侧翼为用于进一步亚克隆的PstI和EcoRV位点。用以下项：
-引物EV3056(CACTCTGCAGCACTGGCGCGCCCACTGCAT)(SEQ ID No 26)，含有PstI位点(加下划线的)和
-引物EV3057(CACTGATATCAGTGGCTAGCAGTGCCATGG)(SEQ ID No 27)，含有EcoRV位点(加下划线的)
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/72℃下45sec的30个循环，和72℃下7分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
将经扩增的2.5kb LEU2标记用PstI和EcoRV酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至载体pUG73(盖尔德内尔(Gueldener)等人，2002，核酸研究(NucleicAcid Res)，30，e23)的2.4kb PstI/EcoRV(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)、凝胶纯化的(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)的骨架上持续2h–(图22)。用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2787(图23)含有在内源启动子和终止子的控制之下、侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。另外，已经在第一个loxP的上游引入了AscI和SphI位点并且在第二个loxP的下游引入了NheI和NcoI位点，以便帮助与基因组中的整合位点同源的区域的克隆。
然后，在第二克隆步骤中，用诺尔斯链霉菌的nat1抗性基因替换整合载体的LEU2标记，因为目的是使内源LEU2开放阅读框缺失。
根据SEQ ID No 28的提交序列，用化学方法由
Figure BDA0001182833390000591
Gene Synthesis(生命科技公司，雷根斯堡，德国)合成编码诺尔斯链霉菌的nat1基因的DNA片段。
编码nat1基因的序列S60706.1(从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/S60706.1获得)的核苷酸204至776被用作模板并且根据表7(上文)，使用从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的Optimizer程序使其经受密码子优化以用于在奥默毕赤酵母ATCC 20209中使用。
在所得序列的5’和3’端，在文本文件中手动添加分别编码限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的识别位点的核苷酸，以便有助于进一步克隆。另外，腺苷三联体被包括在起始ATG之前，以将酵母的Kozak样序列的-3位处的腺苷考虑在内。
然后将最终序列(SEQ ID No 28)提交给GeneArt(雷根斯堡，德国)进行合成。将所合成的编码nat1基因的DNA片段作为5μg冻干的质粒DNA在pMA-T衍生的载体(12ABTV4P，图24)中递送。
为了克隆nat1基因，使用含有核酮糖还原酶(poRR)启动子和终止子的载体。用乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子交换该终止子，并且在启动子与终止子序列之间引入nat1基因。
为此目的，通过用以下项进行的PCR产生乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子：
-引物EV3393(CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG)(SEQ ID No 29)，含有SphI位点(加下划线的)和
-引物EV3394(GGACCGCGGAAAGGTGAGGAAGTATATGAAC)(SEQ ID No30)，含有SacII位点(加下划线的)和
-作为模板的pEVE2523(图7)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/59℃下10sec/72℃下10sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。将239bppoURA3终止子用SphI和SacII酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至用SphI和SacII限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化且用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化的pEVE2681的11kb载体骨架上持续2h。用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
在第二克隆步骤中，将nat1基因通过用SphI和AscI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而从12ABTV4P(图24)中释放。另外，在SphI与AscI消化之间，用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将SphI位点在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。然后将587bp凝胶纯化的片段(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)连接至上文描述的用SphI和AscI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)切割的载体的凝胶纯化的10.5kb载体骨架上。
并且在室温下用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将载体的SphI位点平端化15min，随后在用AscI消化之前在70℃下进行10min的热失活步骤。另外，使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)使载体在37℃下脱磷酸1h。使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的连接。
用连接混合物转化XL10 Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2798(图25)含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的nat1抗药标记。
nat1表达盒用于替换整合型载体中的奥默毕赤酵母LEU2选择标记。为了有助于进一步克隆，通过用以下项进行的PCR，nat1盒的侧翼必须为XbaI(在引物EV3643中加下划线的)和MluI(在引物EV3644中加下划线的)位点：
-引物EV3643
(CACTTCTAGACACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG)(SEQ ID No 31)和
-引物EV3644(CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG)(SEQ ID No 32)。
引物EV3643在XbaI位点之后含有另外的ClaI位点(点划线)。pEVE2798充当模板(图25)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/54℃下10sec/72℃下25sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。将1.3kbnat1表达盒用MluI和XbaI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至用MluI和XbaI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化且用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化的pEVE2787(图23)的2.6kb载体骨架上持续2h(图26)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2852(图27)含有在核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的控制之下且侧翼为两个loxP位点的nat1选择标记。
到目前为止，整合质粒不含有位点特异性整合进基因组中所需的任何奥默毕赤酵母同源片段。在下一步骤中附接上这些位点。
用以下项从50ng poARS载体(图6)扩增LEU2开放阅读框上游的5’同源区域：
-引物EV3548(CACTCTGCAGGATCCAAGCTATCAACGAGA)(SEQ ID No 33)，含有PstI位点(加下划线的)和
-引物EV3549(CACTGCATGCGTTGCGGAAAAAACAGCC)(SEQ ID No 34)，含有SphI位点(加下划线的)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行PCR。这样完成扩增：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/61℃下10sec/72℃下15sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。将567bp片段用PstI和SphI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至用PstI和SphI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化且用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化的pEVE2852(图27)的3.9kb载体骨架上持续2h(图29)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2855(图28)含有与LEU2开放阅读框上游的5’区域同源的片段和侧翼为两个loxP位点的nat1标记。
用以下项从50ng poARS载体(图6)扩增LEU2开放阅读框下游的3’同源区域：
-引物EV3550(CACTCCATGGAGTAGGTATATAAAAATATAAGAG)(SEQ ID No35)，含有NcoI位点(加下划线的)和
-引物EV3551(CACTGCTAGCGTCGACAACAGCAACTAG)(SEQ ID No 36)，含有NheI位点(加下划线的)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行PCR。这样完成扩增：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/51℃下10sec/72℃下25sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。将1.3kb片段用NcoI和NheI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至用NcoI和NheI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化且用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)凝胶纯化的pEVE2855(图28)的4.4kb载体骨架上持续2h(图29)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得最终LEU2缺失质粒pEVE2864(图30)含有与LEU2开放阅读框上游的5’区域同源的片段和与LEU2开放阅读框下游的3’区域同源的片段及侧翼为两个loxP位点的nat1标记。
实例16.亮氨酸营养缺陷型的突变型奥默毕赤酵母菌株的产生
由于到目前为止所产生的奥默毕赤酵母CNCM I-4605菌株并未展示出任何营养缺陷现象，进行LEU2开放阅读框缺失，以便能够使用LEU2选择标记进行基因整合。
为此目的，将质粒pEVE2864(图30)用EcoRV和PstI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下进行限制性酶切2.5h，并且根据实例12中描述的程序将混合物用于转化Mut165菌株。
向再生的细胞中添加7ml具有25μg/ml纳他霉素的50℃的温顶层琼脂(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH 5.8和2.5％诺布尔琼脂)，并且将混合物均匀地倒在具有25μg/ml纳他霉素的预温的含有山梨醇的选择板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH 5.8和2％琼脂)上。将板在30℃下孵育4天。通过在不含亮氨酸的选择板上的不生长，对LEU2开放阅读框的缺失进行验证并且通过使用以下项的菌落PCR进行证实：
-引物EV3393(CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG)(SEQ ID No 29)和
-引物EV3795(CAAGTCGTGGAGATTCTGC)(SEQ ID No 37)。
这样扩增1.6kb片段：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/51℃下10sec/72℃下25sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。
所得菌株含有CNCM I-4605背景下的LEU2基因的完全开放阅读框缺失并且将其在2015年2月5日在编号I-4955下保藏在法国的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)cedex 15)。
实例17.包含树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异 性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达质粒的构建
为了能够在仅是亮氨酸营养缺陷型的突变型奥默毕赤酵母菌株中表达树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，需要构建双表达质粒。
将含有树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的表达盒通过用SpeI和SacII酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而从pEVE2562(图12)中释放。将1.9kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。然后使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将插入物在室温下连接至含有大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的12.1kb SpeI线性化、平端化、脱磷酸(在37℃下1h，使用南极磷酸酶-新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)且凝胶纯化的pEVE3157骨架(图21)上持续2h(图31)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3318(图32)含有树干毕赤酵母的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和核酮糖还原酶(poRR)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体,以及poLEU2选择标记。
实例18.用于在奥默毕赤酵母中表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶 基因和树干毕赤酵母NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建
大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因应该最终成为奥默毕赤酵母基因组的组成部分。因此，必须通过替换pEVE2852的nat1选择标记并掺入阿糖醇氧化还原酶和木糖醇脱氢酶的双表达构建体来构建具有LEU2选择标记的整合型载体。
为此目的，通过用以下项进行的PCR产生侧翼为AscI和SphI位点的奥默毕赤酵母LEU2开放阅读框：
-引物EV3645(CAAGGCGCGCCAAAATGTCTACCAAAACCATTAC)(SEQ ID No38)和
-引物EV3646(GGAGCATGCCTACTTTCCCTCAGCCAAG)(SEQ ID No 39)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中用50ng的poARS(图6)模板进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/57℃下10sec/72℃下20sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。随后将经扩增的LEU2开放阅读框用AscI和SphI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切。
另外，在SphI与AscI消化之间，用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将SphI位点在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。然后将1.1kb凝胶纯化的片段连接至用SphI和AscI限制酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)切割的pEVE2811的凝胶纯化的11kb载体骨架上。并且在室温下用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将载体的SphI位点平端化15min，随后在用AscI消化之前在70℃下进行10min的热失活步骤。另外，使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)使载体在37℃下脱磷酸1h。使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的LEU2开放阅读框和载体骨架的连接。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2862(图33)含有侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶(poRR)启动子和乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(poURA3)终止子的奥默毕赤酵母LEU2标记。
随后，通过使用以下项进行的PCR来扩增LEU2标记：
-引物EV3643(CACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG)(SEQ ID No 31)，含有ClaI位点，和
-引物EV3644(CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG)(SEQ ID No 32)，含有MluI位点(加下划线)，以及作为模板的pEVE2862(图33)。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/54℃下10sec/72℃下30sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。将扩增的1.8kb长的LEU2片段用ClaI和MluI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2852(图27)的2.6kb ClaI和MluI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性酶切的且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图34)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE2865(图35)含有侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2标记。
为了克隆整合载体，将pEVE2865用SalI酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。
载体骨架的4.5kb凝胶纯化的片段用于连接。通过用NdeI和SacII酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而从pEVE3318(图32)中释放的树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体充当插入物。
将4.4kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min，随后是另外的凝胶纯化。将pEVE2865的载体骨架和pEVE3318的插入物在室温下使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接2h(图34)。
用连接混合物转化XL10 Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3387(图36)含有树干毕赤酵母的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体。侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2基因充当选择标记。
实例19.将木糖醇分泌进培养基中的第一代整合型奥默毕赤酵母菌株的构建
先前描述的载体用于将大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因随机整合到奥默毕赤酵母的基因组中。
为此目的，根据实例12中描述的程序，将亮氨酸营养缺陷型的菌株CNCM I-4955(实例16)用被NotI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性酶切的pEVE3387(图36)在37℃下转化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上对转化体进行选择。
所得菌株含有随机整合到奥默毕赤酵母基因组中的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因，并且将其在2015年5月20日在编号I-4982下保藏在法国的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724Cedex 15)。
实例20.包含氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异 性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双/三表达质粒的构建
为了能够在仅是亮氨酸营养缺陷型的突变型奥默毕赤酵母菌株中表达氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，需要构建双表达质粒。
将含有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的表达盒通过用SpeI和SacII酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性切割而从pEVE3284(图10)中释放。将1.6kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。所使用的载体骨架由含有大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的12.1kb SpeI线性化(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)且凝胶纯化的(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)pEVE3157骨架(图21)组成。
骨架另外已经在室温下用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的连接(图37)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3322和pEVE3324(图38)含有氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体，或氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的两个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的三表达构建体，并且均含poLEU2选择标记。
实例21.用于在奥默毕赤酵母中表达大肠杆菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶 基因和氧化葡糖杆菌NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的整合型载体的构建
除含有树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因的整合型载体之外，还产生了含有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的质粒。
为此目的，将含有氧化葡糖杆菌的一种或两种NADPH特异性木糖醇脱氢酶和大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达盒和三表达盒通过用NdeI和SacII酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而分别从pEVE3322和pEVE3324(图38)中释放。
将4.1kb和5.7kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。凝胶纯化的(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)5.7kb SalI线性化的pEVE2865(图35)充当载体。
载体骨架另外已经在室温下用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的载体和插入物的连接(图39)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3390和pEVE3392(图40)含有氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的一个或两个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因和大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体或三表达构建体。侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2基因充当选择标记。
实例22.能够分泌多于100g/L木糖醇的第二代整合型菌株的构建
含有大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和树干毕赤酵母的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的随机整合拷贝的第一代菌株CNCM I-4982用于进一步整合这两种异源酶的另外拷贝。
然而，为了能够整合以上构建体，必须去除LEU2选择标记。为此目的，根据实例12中描述的程序，用载体pEVE3163转化第一代菌株CNCM I-4982。载体pEVE3163含有噬菌体P1的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的CRE重组酶(根据表7进行密码子优化)。通过在不含亮氨酸的板上克隆的不生长来证实去除了LEU2选择标记。
根据实例12中描述的程序，将所得菌株EYS3842用被NotI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性酶切的pEVE3390或pEVE3392(图40)在37℃下转化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上对转化体进行选择。
所得第二代菌株EYS3929含有随机整合到基因组中的大肠杆菌的两个NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和两个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因(一个来自氧化葡糖杆菌且另一个来自树干毕赤酵母)。另一方面，菌株EYS3930含有氧化葡糖杆菌的另外的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因。
实例23.用于整合大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和氧化葡糖杆菌 的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的另外基因拷贝的另外载体的构建
为了构建另外的整合载体，通过使用以下项进行的PCR扩增大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的双表达盒：
-引物EV4904(ATATCCCGGGCACCGTCATCACCGAAACGC)(SEQ ID No 40)，含有SmaI位点，和
-引物EV4905(ATATCCCGGGCACGACCACGCTGATGAGC)(SEQ ID No 41)，含有SmaI位点(加下划线的)和
作为模板的pEVE3321。
在适当的1X缓冲液中，在由200μM的每种dNTP和0.5μM的每种引物与0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)组成的反应混合物中进行扩增。这样完成PCR：98℃下30sec的预变性步骤，随后是98℃下10sec/68℃下10sec/72℃下75sec的30个循环，和72℃下5分钟的最终延伸步骤。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，提取并使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)纯化。
将扩增的3.9kb长的片段用SmaI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切，并在室温下使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)连接至pEVE2865(图35)的4.4kb PvuII(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化、南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)脱磷酸且凝胶纯化的载体骨架上持续2h(图41)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE4390(图42)含有大肠杆菌的在奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)启动子和转酮醇酶(poTKL)终止子的控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶和氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因的双表达构建体。侧翼为两个loxP位点的奥默毕赤酵母LEU2基因充当选择标记。
实例24.用于整合氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的 NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的载体的构建
如下构建用于表达氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的另外的整合型载体：在第一步中，产生了含有以上两个基因的双表达载体。将这个双表达盒克隆进整合型loxP载体中。
根据序列SEQ ID No 42的提交序列，由
Figure BDA0001182833390000771
Gene Synthesis(生命科技公司，雷根斯堡，德国)用化学方法合成编码青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因的DNA片段。
编码dalD基因的序列AL646052.1(从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL646052获得)的核苷酸2310548至2309151被用作模板并且根据表7(上文)，使用从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的Optimizer程序使其经受密码子优化以用于在奥默毕赤酵母ATCC 20209中使用。在所得序列的5’和3’端，在文本文件中手动添加分别编码限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的识别位点的核苷酸，以便有助于进一步克隆。另外，腺苷三联体被包括在起始ATG之前，以将酵母的Kozak样序列的-3位处的腺苷考虑在内。
然后将最终序列(SEQ ID No 42)提交给GeneArt(雷根斯堡，德国)进行合成。将所合成的编码dalD基因的DNA片段作为5μg冻干的质粒DNA在pMA-RQ衍生的载体(13AB2EGP，图43)中递送。
将来自青枯雷尔氏菌的D-阿糖醇4-氧化还原酶的1.4kb片段通过用AscI和SphI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切而从载体13AB2EGP(图43)中释放，并用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化。然后使用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)将插入物与用AscI和SphI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)线性化且凝胶纯化的pEVE2560(图8)的11.8kb骨架连接(图44)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE3898(图45)含有侧翼为奥默毕赤酵母的核酮糖还原酶启动子和终止子的经密码子优化的青枯雷尔氏菌NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶，以及poLEU2选择标记。
在下一步骤中，将含有氧化葡糖杆菌的侧翼为磷酸甘油酸激酶启动子(poPGK)和核酮糖还原酶终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的表达盒通过用SpeI和SacII(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性酶切而从pEVE3960中释放。将1.8kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。凝胶纯化的(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)13.2kb SalI线性化的pEVE3898充当载体。载体骨架另外已经在室温下用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min并使用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h。使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的载体和插入物的连接(图44)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE4077(图46)含有氧化葡糖杆菌的侧翼为奥默毕赤酵母磷酸甘油酸激酶启动子(poPGK)和核酮糖还原酶终止子(poRR)的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的在奥默毕赤酵母核酮糖还原酶启动子和(poRR)终止子控制之下的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体，以及poLEU2选择标记。
最后，将氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达盒通过用SapI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)进行限制性切割而从pEVE4077(图46)中释放。将5.9kb片段使用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)进行凝胶纯化并用平端化酶混合物试剂盒(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下平端化15min，随后使酶在70℃下热失活10min。用南极磷酸酶(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下脱磷酸1h的凝胶纯化的(ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒-Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)4.4kb EcoRV线性化的pEVE2865(图35)充当载体。使用T4DNA连接酶(英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在室温下进行2h的载体和插入物的连接(图44)。
用连接混合物转化XL10Gold超感受态细胞(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)之后，使用ZyppyTM质粒小量制备试剂盒(Zymo研究公司，欧文市，加利福尼亚州)分离质粒DNA，并且通过限制性酶切和测序(Microsynth，巴尔加赫，瑞士)进一步表征。
所得质粒pEVE4377(图47)含有氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的双表达构建体及侧翼为两个loxP位点的poLEU2选择标记。
实例25.具有增加的木糖醇生产力的第三代整合型菌株的构建
如在实例18中所描述的，使用载体pEVE3163以lox方式剔除第二代菌株EYS3929和EYS3930(实例22)的LEU2标记。用pEVE4377(图47)和pEVE4390(图42)分别转化所得菌株EYS4118和EYS4119。根据实例12中描述的程序，将载体用NotI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)在37℃下限制性酶切3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上对转化体进行选择。
所得第三代菌株EYS4353含有随机整合到基因组中的三个NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因(两个来自大肠杆菌且一个来自青枯雷尔氏菌)和三个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因(两个来自氧化葡糖杆菌且一个来自树干毕赤酵母)。
另一方面，第二种第三代菌株含有三个拷贝的大肠杆菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶、三个拷贝的氧化葡糖杆菌的NADPH特异性木糖醇脱氢酶和一个来自树干毕赤酵母的拷贝背景，并且将其在2015年3月5日在编号I-4960下保藏在法国的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)。
实例26.第四代整合型菌株的构建
如在实例18中所描述的，使用载体pEVE3163以lox方式剔除第三代菌株CNCM I-4960(实例25)的LEU2标记。根据实例12中描述的程序，将所得菌株EYS4955用被NotI(新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，马萨诸塞州)限制性酶切的pEVE4377(图47)在37℃下转化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上对转化体进行选择。
所得第四代菌株含有随机整合到基因组中的四个NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶基因(三个来自大肠杆菌且一个来自青枯雷尔氏菌)和四个NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因(三个来自氧化葡糖杆菌且一个来自树干毕赤酵母)，并且将其在2015年5月20日在编号I-4981下保藏在法国的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心[NationalCollection of Microorganism Cultures](CNCM)(多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)。
实例27.用奥默毕赤酵母菌株进行的多元醇生产(合成培养基)
根据以下方案发酵如上文所述构建的酵母菌株CNCM I-4605、CNCM I-4982、CNCMI-4960和CNCM I-4981。
发酵过程在限氮下运行且可以分为生长期和生产期。在生长期过程中，培养基中的氨被完全消耗以产生生物质，一旦生物质形成停止，则生产期开始且多元醇水平增加。用于所描述发酵过程的平台是来自INFORS HT的使用具有1L工作体积的容器的Multifors 2。发酵罐配备有两个Rushton六叶片圆盘涡轮。使用空气以便为发酵罐鼓泡。
在整个培养过程中控制温度、pH、搅拌和通气速率。将温度维持在36℃。将pH通过自动添加5M KOH保持在3。
通气速率保持在1.0vvm并且将初始搅拌器速度设为300rpm。为了防止溶解氧(DO)降至低于20％，应用自动搅拌级联。在发酵过程中使用的操作条件总结于表10中。
表10：用于多元醇生产发酵的操作条件
Figure BDA0001182833390000811
为了接种发酵罐，使用1阶段繁殖培养物。所使用的繁殖培养基的组成描述于表11中。通过接种具有4个挡板(锯齿形缺口)的500-ml摇瓶中的100ml培养基来制备繁殖培养物。将摇瓶在摇床上在30℃和150rpm下进行孵育。使细胞生长约24小时至对数生长期中期。
表11：繁殖培养基组成。
Figure BDA0001182833390000821
接种之前，去除发酵罐中的等于接种物量的培养基量并且将繁殖培养物的等分部分用于接种发酵罐，至最终体积为1L且初始OD600为大约0.2(CDW大约0.03g/L)。发酵罐中使用的培养基的组成描述于表12中。
表12：发酵培养基组成。
Figure BDA0001182833390000822
Figure BDA0001182833390000831
定期取样并且针对葡萄糖消耗和细胞外多元醇(木糖醇、阿糖醇和核糖醇)形成对总发酵液进行分析。此外，对常见发酵代谢物(甘油、乙酸盐、乙醇、丙酮酸盐、苹果酸盐、富马酸盐和琥珀酸盐)进行了测定。生物质增加之后一方面是OD600测定并且另一方面是细胞干重(CDW)测定。上文提及的测量值用于确定多元醇生产、阿糖醇或木糖醇产率和生产力；结果示于表13中。
表13：用奥默毕赤酵母菌株进行的多元醇生产(合成培养基)。
Figure BDA0001182833390000832
奥默毕赤酵母CNCM I-4605仅产生阿糖醇。
奥默毕赤酵母CNCM I-4982产生阿糖醇、木糖醇和核糖醇。在这个菌株中，已经整合了一个拷贝的NAD+-D-阿糖醇4-氧化还原酶基因和一个拷贝的NADPH特异性木糖醇脱氢酶基因。经修饰的菌株现在能够消耗阿糖醇。因此，在完全消耗葡萄糖之后，CNCM I-4982再消耗阿糖醇和核糖醇从而产生更多的木糖醇。
奥默毕赤酵母CNCM I-4960(第三代)和CNCM I-4981(第四代)产生木糖醇和核糖醇，但是不产生更多的阿糖醇。阿糖醇向木酮糖和木糖醇的细胞内转化足够有效以避免阿糖醇分泌到培养液中。
向奥默毕赤酵母中引入越多拷贝的编码NAD+特异性D-阿糖醇氧化还原酶和NADPH特异性木糖醇脱氢酶的基因，木糖醇的滴度、产率和生产力越高。
序列表
<110> 罗盖特兄弟公司（ROQUETTE FRERES）
<120> 通过重组菌株从葡萄糖生产木糖醇
<130> SCT166540-20
<160> 43
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NAD特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的侧翼为限制位点的序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(8)
<223> AscI识别位点
<220>
<221> CDS
<222> (12)..(1379)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1380)..(1385)
<223> SphI识别位点
<400> 1
ggcgcgccaa a atg aac gag cag ttc acc tgg ttg cac atc ggt ttg ggt 50
Met Asn Glu Gln Phe Thr Trp Leu His Ile Gly Leu Gly
1 5 10
tct ttc cac aga gct cac cag gct tgg tac ttg cac aga ttg cag gtt 98
Ser Phe His Arg Ala His Gln Ala Trp Tyr Leu His Arg Leu Gln Val
15 20 25
atg ggt gac aag aga tgg tct atc gct gct ggt aac atc aga aac gac 146
Met Gly Asp Lys Arg Trp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Ile Arg Asn Asp
30 35 40 45
gct gag cac gtt gtt cag gct ttg tct gct cag aag ggt aga tac gtt 194
Ala Glu His Val Val Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Gly Arg Tyr Val
50 55 60
ttg gag acc gtt tct cca gag ggt gtt tct gag tac gag gag atc acc 242
Leu Glu Thr Val Ser Pro Glu Gly Val Ser Glu Tyr Glu Glu Ile Thr
65 70 75
tct atc cag aag ttg atc cca tgg cag gct gac ttg cag cca ttg atc 290
Ser Ile Gln Lys Leu Ile Pro Trp Gln Ala Asp Leu Gln Pro Leu Ile
80 85 90
gct gag ggt gct gac cca aag acc aag gtt atc gct ttc acc gtt acc 338
Ala Glu Gly Ala Asp Pro Lys Thr Lys Val Ile Ala Phe Thr Val Thr
95 100 105
gag ggt ggt tac tac ttg aac acc tct cac aag ttg gag gtt aac aac 386
Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Asn Thr Ser His Lys Leu Glu Val Asn Asn
110 115 120 125
cca gac ttg gct gct gac ttg aag ggt ggt tgt aag acc atc tac ggt 434
Pro Asp Leu Ala Ala Asp Leu Lys Gly Gly Cys Lys Thr Ile Tyr Gly
130 135 140
gtt atc acc aga atc ttg gag gct aga atg gct aac aac gct ggt cca 482
Val Ile Thr Arg Ile Leu Glu Ala Arg Met Ala Asn Asn Ala Gly Pro
145 150 155
ttg acc ttg ttg aac tgt gac aac gtt aga cac aac ggt gag aga ttc 530
Leu Thr Leu Leu Asn Cys Asp Asn Val Arg His Asn Gly Glu Arg Phe
160 165 170
cac gac ggt ttg gtt gag ttc ttg cag ttg acc ggt aag cag gac gtt 578
His Asp Gly Leu Val Glu Phe Leu Gln Leu Thr Gly Lys Gln Asp Val
175 180 185
atc gac tgg ttg tct acc aac acc acc tgt cca aac acc atg gtt gac 626
Ile Asp Trp Leu Ser Thr Asn Thr Thr Cys Pro Asn Thr Met Val Asp
190 195 200 205
aga atc acc cca aga cca gct gct gag ttg cca gct aga atc aag gct 674
Arg Ile Thr Pro Arg Pro Ala Ala Glu Leu Pro Ala Arg Ile Lys Ala
210 215 220
cag acc ggt atc gct gac aag gct cca gtt atg ggt gag acc ttc atc 722
Gln Thr Gly Ile Ala Asp Lys Ala Pro Val Met Gly Glu Thr Phe Ile
225 230 235
cag tgg gtt gtt gag gac aac ttc aga gac gtt aga cca gct ttg gag 770
Gln Trp Val Val Glu Asp Asn Phe Arg Asp Val Arg Pro Ala Leu Glu
240 245 250
aag gtt ggt gtt gag ttg gtt gct tct gtt atc cca tac gag gag gct 818
Lys Val Gly Val Glu Leu Val Ala Ser Val Ile Pro Tyr Glu Glu Ala
255 260 265
aag atc aga atc ttg aac tct tct cac tct tgt atc gct tgg gct ggt 866
Lys Ile Arg Ile Leu Asn Ser Ser His Ser Cys Ile Ala Trp Ala Gly
270 275 280 285
acc ttg atc ggt cag aag tac atc cac gag tct acc atg acc gac ttc 914
Thr Leu Ile Gly Gln Lys Tyr Ile His Glu Ser Thr Met Thr Asp Phe
290 295 300
atc tac cag atc gct gac aga tac gtt acc gag gac gtt atc cca tgt 962
Ile Tyr Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Val Thr Glu Asp Val Ile Pro Cys
305 310 315
ttg ggt gac aac ggt atc gac ttg cca acc tac aga gac gtt gtt ttg 1010
Leu Gly Asp Asn Gly Ile Asp Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Val Val Leu
320 325 330
aag aga ttc acc aac cca cac atc cag gac acc aac cag aga gtt gct 1058
Lys Arg Phe Thr Asn Pro His Ile Gln Asp Thr Asn Gln Arg Val Ala
335 340 345
gct gac ggt ttc tct aag atc cca gct atg atc gct cca acc ttg aga 1106
Ala Asp Gly Phe Ser Lys Ile Pro Ala Met Ile Ala Pro Thr Leu Arg
350 355 360 365
gag tgt tac cag aga ggt gtt aga cca aac gct acc gct atg ttg cca 1154
Glu Cys Tyr Gln Arg Gly Val Arg Pro Asn Ala Thr Ala Met Leu Pro
370 375 380
gct ttg ttc tac gtt ttc atg gag cag tgg cac cac ggt aag ttg cca 1202
Ala Leu Phe Tyr Val Phe Met Glu Gln Trp His His Gly Lys Leu Pro
385 390 395
tac gag tac cag gac ggt atc ttg gac gct cca gct gtt cac gct atg 1250
Tyr Glu Tyr Gln Asp Gly Ile Leu Asp Ala Pro Ala Val His Ala Met
400 405 410
ttg cag tct gct gac cca gtt gct gtt tac gct tct gac aag gct ttg 1298
Leu Gln Ser Ala Asp Pro Val Ala Val Tyr Ala Ser Asp Lys Ala Leu
415 420 425
ttc ggt gac ttg acc gag aga gag gac ttc gct gct ttg ttg aga gag 1346
Phe Gly Asp Leu Thr Glu Arg Glu Asp Phe Ala Ala Leu Leu Arg Glu
430 435 440 445
aag atc gct gac gtt tac gct ttg atc aac taa gcatgc 1385
Lys Ile Ala Asp Val Tyr Ala Leu Ile Asn
450 455
<210> 2
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Asn Glu Gln Phe Thr Trp Leu His Ile Gly Leu Gly Ser Phe His
1 5 10 15
Arg Ala His Gln Ala Trp Tyr Leu His Arg Leu Gln Val Met Gly Asp
20 25 30
Lys Arg Trp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Ile Arg Asn Asp Ala Glu His
35 40 45
Val Val Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Gly Arg Tyr Val Leu Glu Thr
50 55 60
Val Ser Pro Glu Gly Val Ser Glu Tyr Glu Glu Ile Thr Ser Ile Gln
65 70 75 80
Lys Leu Ile Pro Trp Gln Ala Asp Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu Gly
85 90 95
Ala Asp Pro Lys Thr Lys Val Ile Ala Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Asn Thr Ser His Lys Leu Glu Val Asn Asn Pro Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Asp Leu Lys Gly Gly Cys Lys Thr Ile Tyr Gly Val Ile Thr
130 135 140
Arg Ile Leu Glu Ala Arg Met Ala Asn Asn Ala Gly Pro Leu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Asn Cys Asp Asn Val Arg His Asn Gly Glu Arg Phe His Asp Gly
165 170 175
Leu Val Glu Phe Leu Gln Leu Thr Gly Lys Gln Asp Val Ile Asp Trp
180 185 190
Leu Ser Thr Asn Thr Thr Cys Pro Asn Thr Met Val Asp Arg Ile Thr
195 200 205
Pro Arg Pro Ala Ala Glu Leu Pro Ala Arg Ile Lys Ala Gln Thr Gly
210 215 220
Ile Ala Asp Lys Ala Pro Val Met Gly Glu Thr Phe Ile Gln Trp Val
225 230 235 240
Val Glu Asp Asn Phe Arg Asp Val Arg Pro Ala Leu Glu Lys Val Gly
245 250 255
Val Glu Leu Val Ala Ser Val Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Lys Ile Arg
260 265 270
Ile Leu Asn Ser Ser His Ser Cys Ile Ala Trp Ala Gly Thr Leu Ile
275 280 285
Gly Gln Lys Tyr Ile His Glu Ser Thr Met Thr Asp Phe Ile Tyr Gln
290 295 300
Ile Ala Asp Arg Tyr Val Thr Glu Asp Val Ile Pro Cys Leu Gly Asp
305 310 315 320
Asn Gly Ile Asp Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Val Val Leu Lys Arg Phe
325 330 335
Thr Asn Pro His Ile Gln Asp Thr Asn Gln Arg Val Ala Ala Asp Gly
340 345 350
Phe Ser Lys Ile Pro Ala Met Ile Ala Pro Thr Leu Arg Glu Cys Tyr
355 360 365
Gln Arg Gly Val Arg Pro Asn Ala Thr Ala Met Leu Pro Ala Leu Phe
370 375 380
Tyr Val Phe Met Glu Gln Trp His His Gly Lys Leu Pro Tyr Glu Tyr
385 390 395 400
Gln Asp Gly Ile Leu Asp Ala Pro Ala Val His Ala Met Leu Gln Ser
405 410 415
Ala Asp Pro Val Ala Val Tyr Ala Ser Asp Lys Ala Leu Phe Gly Asp
420 425 430
Leu Thr Glu Arg Glu Asp Phe Ala Ala Leu Leu Arg Glu Lys Ile Ala
435 440 445
Asp Val Tyr Ala Leu Ile Asn
450 455
<210> 3
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶编码序列
<400> 3
atgaacgagc agttcacctg gttgcacatc ggtttgggtt ctttccacag agctcaccag 60
gcttggtact tgcacagatt gcaggttatg ggtgacaaga gatggtctat cgctgctggt 120
aacatcagaa acgacgctga gcacgttgtt caggctttgt ctgctcagaa gggtagatac 180
gttttggaga ccgtttctcc agagggtgtt tctgagtacg aggagatcac ctctatccag 240
aagttgatcc catggcaggc tgacttgcag ccattgatcg ctgagggtgc tgacccaaag 300
accaaggtta tcgctttcac cgttaccgag ggtggttact acttgaacac ctctcacaag 360
ttggaggtta acaacccaga cttggctgct gacttgaagg gtggttgtaa gaccatctac 420
ggtgttatca ccagaatctt ggaggctaga atggctaaca acgctggtcc attgaccttg 480
ttgaactgtg acaacgttag acacaacggt gagagattcc acgacggttt ggttgagttc 540
ttgcagttga ccggtaagca ggacgttatc gactggttgt ctaccaacac cacctgtcca 600
aacaccatgg ttgacagaat caccccaaga ccagctgctg agttgccagc tagaatcaag 660
gctcagaccg gtatcgctga caaggctcca gttatgggtg agaccttcat ccagtgggtt 720
gttgaggaca acttcagaga cgttagacca gctttggaga aggttggtgt tgagttggtt 780
gcttctgtta tcccatacga ggaggctaag atcagaatct tgaactcttc tcactcttgt 840
atcgcttggg ctggtacctt gatcggtcag aagtacatcc acgagtctac catgaccgac 900
ttcatctacc agatcgctga cagatacgtt accgaggacg ttatcccatg tttgggtgac 960
aacggtatcg acttgccaac ctacagagac gttgttttga agagattcac caacccacac 1020
atccaggaca ccaaccagag agttgctgct gacggtttct ctaagatccc agctatgatc 1080
gctccaacct tgagagagtg ttaccagaga ggtgttagac caaacgctac cgctatgttg 1140
ccagctttgt tctacgtttt catggagcag tggcaccacg gtaagttgcc atacgagtac 1200
caggacggta tcttggacgc tccagctgtt cacgctatgt tgcagtctgc tgacccagtt 1260
gctgtttacg cttctgacaa ggctttgttc ggtgacttga ccgagagaga ggacttcgct 1320
gctttgttga gagagaagat cgctgacgtt tacgctttga tcaactaa 1368
<210> 4
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的侧翼为限制位点的序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(6)
<223> HindIII识别位点
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(1101)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1102)..(1107)
<223> SacII识别位点
<400> 4
aagcttaaa atg act gct aac cct tcc ttg gtg ttg aac aag atc gac gac 51
Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp
1 5 10
att tcg ttc gaa act tac gat gcc cca gaa atc tct gaa cct acc gat 99
Ile Ser Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp
15 20 25 30
gtc ctc gtc cag gtc aag aaa acc ggt atc tgt ggt tcc gac atc cac 147
Val Leu Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His
35 40 45
ttc tac gcc cat ggt aga atc ggt aac ttc gtt ttg acc aag cca atg 195
Phe Tyr Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met
50 55 60
gtc ttg ggt cac gaa tcc gcc ggt act gtt gtc cag gtt ggt aag ggt 243
Val Leu Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly
65 70 75
gtc acc tct ctt aag gtt ggt gac aac gtc gct atc gaa cca ggt att 291
Val Thr Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile
80 85 90
cca tcc aga ttc tcc gac gaa tac aag agc ggt cac tac aac ttg tgt 339
Pro Ser Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys
95 100 105 110
cct cac atg gcc ttc gcc gct act cct aac tcc aag gaa ggc gaa cca 387
Pro His Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro
115 120 125
aac cca cca ggt acc tta tgt aag tac ttc aag tcg cca gaa gac ttc 435
Asn Pro Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe
130 135 140
ttg gtc aag ttg cca gac cac gtc agc ttg gaa ctc ggt gct ctt gtt 483
Leu Val Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val
145 150 155
gag cca ttg tct gtt ggt gtc cac gcc tcc aag ttg ggt tcc gtt gct 531
Glu Pro Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala
160 165 170
ttc ggc gac tac gtt gcc gtc ttt ggt gct ggt cct gtt ggt ctt ttg 579
Phe Gly Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu
175 180 185 190
gct gct gct gtc gcc aag acc ttc ggt gct aag ggt gtc atc gtc gtt 627
Ala Ala Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val
195 200 205
gct aga tca gac aga aag ttg aag atg gcc aag gac att ggt gct gct 675
Ala Arg Ser Asp Arg Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala
210 215 220
act cac acc ttc aac tcc aag acc ggt ggt tct gaa gaa ttg atc aag 723
Thr His Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys
225 230 235
gct ttc ggt ggt aac gtg cca aac gtc gtt ttg gaa tgt act ggt gct 771
Ala Phe Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala
240 245 250
gaa cct tgt atc aag ttg ggt gtt gac gcc att gcc cca ggt ggt cgt 819
Glu Pro Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg
255 260 265 270
ttc gtt caa gtt ggt aac gct gct ggt cca gtc agc ttc cca atc acc 867
Phe Val Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr
275 280 285
gtt ttc gcc atg aag gaa ttg act ttg ttc ggt tct ttc aga tac gga 915
Val Phe Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly
290 295 300
ttc aac gac tac aag act gct gtt gga atc ttt gac act aac tac caa 963
Phe Asn Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln
305 310 315
aac ggt aga gaa aat gct cca att gac ttt gaa caa ttg atc acc cac 1011
Asn Gly Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His
320 325 330
aga tac aag ttc aag gac gct att gaa gcc tac gac ttg gtc aga gcc 1059
Arg Tyr Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala
335 340 345 350
ggt aag ggt gct gtc aag tgt ctc att gac ggc cct gag taa ccgcgg 1107
Gly Lys Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 5
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp Ile Ser
1 5 10 15
Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Phe Tyr
35 40 45
Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser
85 90 95
Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala Phe Gly
165 170 175
Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val Ala Arg
195 200 205
Ser Asp Arg Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Pro
245 250 255
Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg Phe Val
260 265 270
Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr Val Phe
275 280 285
Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe Asn
290 295 300
Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Gly
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg Tyr
325 330 335
Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly Lys
340 345 350
Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 6
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列
<400> 6
atgactgcta acccttcctt ggtgttgaac aagatcgacg acatttcgtt cgaaacttac 60
gatgccccag aaatctctga acctaccgat gtcctcgtcc aggtcaagaa aaccggtatc 120
tgtggttccg acatccactt ctacgcccat ggtagaatcg gtaacttcgt tttgaccaag 180
ccaatggtct tgggtcacga atccgccggt actgttgtcc aggttggtaa gggtgtcacc 240
tctcttaagg ttggtgacaa cgtcgctatc gaaccaggta ttccatccag attctccgac 300
gaatacaaga gcggtcacta caacttgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcctaac 360
tccaaggaag gcgaaccaaa cccaccaggt accttatgta agtacttcaa gtcgccagaa 420
gacttcttgg tcaagttgcc agaccacgtc agcttggaac tcggtgctct tgttgagcca 480
ttgtctgttg gtgtccacgc ctccaagttg ggttccgttg ctttcggcga ctacgttgcc 540
gtctttggtg ctggtcctgt tggtcttttg gctgctgctg tcgccaagac cttcggtgct 600
aagggtgtca tcgtcgttgc tagatcagac agaaagttga agatggccaa ggacattggt 660
gctgctactc acaccttcaa ctccaagacc ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720
ggtggtaacg tgccaaacgt cgttttggaa tgtactggtg ctgaaccttg tatcaagttg 780
ggtgttgacg ccattgcccc aggtggtcgt ttcgttcaag ttggtaacgc tgctggtcca 840
gtcagcttcc caatcaccgt tttcgccatg aaggaattga ctttgttcgg ttctttcaga 900
tacggattca acgactacaa gactgctgtt ggaatctttg acactaacta ccaaaacggt 960
agagaaaatg ctccaattga ctttgaacaa ttgatcaccc acagatacaa gttcaaggac 1020
gctattgaag cctacgactt ggtcagagcc ggtaagggtg ctgtcaagtg tctcattgac 1080
ggccctgagt aa 1092
<210> 7
<211> 806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的侧翼为限制位点的序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(8)
<223> AscI识别位点
<220>
<221> CDS
<222> (12)..(800)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (801)..(806)
<223> SphI识别位点
<400> 7
ggcgcgccaa a atg tct aag aag ttc aac ggt aag gtt tgt ttg gtt acc 50
Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr
1 5 10
ggt gct ggt ggt aac atc ggt ttg gct acc gct ttg aga ttg gct gag 98
Gly Ala Gly Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu
15 20 25
gag ggt acc gct atc gct ttg ttg tct aga aac aga gag gct ttg gag 146
Glu Gly Thr Ala Ile Ala Leu Leu Ser Arg Asn Arg Glu Ala Leu Glu
30 35 40 45
aag gct gag gct tct gtt aga gag aag ggt gtt gag gct aga tct tac 194
Lys Ala Glu Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr
50 55 60
gtt tgt gac gtt acc tct gag gag gct gtt atc ggt acc gtt gac tct 242
Val Cys Asp Val Thr Ser Glu Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser
65 70 75
gtt gtt aga gac ttc ggt aag atc gac ttc ttg ttc aac aac gct ggt 290
Val Val Arg Asp Phe Gly Lys Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly
80 85 90
tac cag ggt gct ttc gct cca gtt cag gac tac cca tct gac gac ttc 338
Tyr Gln Gly Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe
95 100 105
gct aga gtt ttg acc atc aac gtt acc ggt gct ttc cac gtt ttg aag 386
Ala Arg Val Leu Thr Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys
110 115 120 125
gct gtt tct aga cag atg atc acc cag aac tac ggt aga atc gtt aac 434
Ala Val Ser Arg Gln Met Ile Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn
130 135 140
acc gct tct atg gct ggt gtt aag ggt cca cca aac atg gct gct tac 482
Thr Ala Ser Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr
145 150 155
ggt acc tct aag ggt gct atc atc gct ttg acc gag acc gct gct ttg 530
Gly Thr Ser Lys Gly Ala Ile Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu
160 165 170
gac ttg gct cca tac aac atc aga gtt aac gct atc tct cca ggt tac 578
Asp Leu Ala Pro Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr
175 180 185
atg ggt cca ggt ttc atg tgg gag aga cag gtt gag ttg cag gct aag 626
Met Gly Pro Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys
190 195 200 205
gtt ggt tct cag tac ttc tct acc gac cca aag gtt gtt gct cag cag 674
Val Gly Ser Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln
210 215 220
atg atc ggt tct gtt cca atg aga aga tac ggt gac atc aac gag atc 722
Met Ile Gly Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asn Glu Ile
225 230 235
cca ggt gtt gtt gct ttc ttg ttg ggt gac gac tct tct ttc atg acc 770
Pro Gly Val Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr
240 245 250
ggt gtt aac ttg cca atc gct ggt ggt tga gcatgc 806
Gly Val Asn Leu Pro Ile Ala Gly Gly
255 260
<210> 8
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr
20 25 30
Ala Ile Ala Leu Leu Ser Arg Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu
35 40 45
Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp
50 55 60
Val Thr Ser Glu Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg
65 70 75 80
Asp Phe Gly Lys Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly
85 90 95
Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val
100 105 110
Leu Thr Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser
115 120 125
Arg Gln Met Ile Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Thr Ser
145 150 155 160
Lys Gly Ala Ile Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala
165 170 175
Pro Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro
180 185 190
Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser
195 200 205
Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met Ile Gly
210 215 220
Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asn Glu Ile Pro Gly Val
225 230 235 240
Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn
245 250 255
Leu Pro Ile Ala Gly Gly
260
<210> 9
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列
<400> 9
atgtctaaga agttcaacgg taaggtttgt ttggttaccg gtgctggtgg taacatcggt 60
ttggctaccg ctttgagatt ggctgaggag ggtaccgcta tcgctttgtt gtctagaaac 120
agagaggctt tggagaaggc tgaggcttct gttagagaga agggtgttga ggctagatct 180
tacgtttgtg acgttacctc tgaggaggct gttatcggta ccgttgactc tgttgttaga 240
gacttcggta agatcgactt cttgttcaac aacgctggtt accagggtgc tttcgctcca 300
gttcaggact acccatctga cgacttcgct agagttttga ccatcaacgt taccggtgct 360
ttccacgttt tgaaggctgt ttctagacag atgatcaccc agaactacgg tagaatcgtt 420
aacaccgctt ctatggctgg tgttaagggt ccaccaaaca tggctgctta cggtacctct 480
aagggtgcta tcatcgcttt gaccgagacc gctgctttgg acttggctcc atacaacatc 540
agagttaacg ctatctctcc aggttacatg ggtccaggtt tcatgtggga gagacaggtt 600
gagttgcagg ctaaggttgg ttctcagtac ttctctaccg acccaaaggt tgttgctcag 660
cagatgatcg gttctgttcc aatgagaaga tacggtgaca tcaacgagat cccaggtgtt 720
gttgctttct tgttgggtga cgactcttct ttcatgaccg gtgttaactt gccaatcgct 780
ggtggttga 789
<210> 10
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码塔格糖-3-差向异构酶的序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(873)
<400> 10
atg aac aaa gtt ggc atg ttc tac acc tac tgg tcg act gag tgg atg 48
Met Asn Lys Val Gly Met Phe Tyr Thr Tyr Trp Ser Thr Glu Trp Met
1 5 10 15
gtc gac ttt ccg gcg act gcg aag cgc att gcc ggg ctc ggc ttc gac 96
Val Asp Phe Pro Ala Thr Ala Lys Arg Ile Ala Gly Leu Gly Phe Asp
20 25 30
tta atg gaa atc tcg ctc ggc gag ttt cac aat ctt tcc gac gcg aag 144
Leu Met Glu Ile Ser Leu Gly Glu Phe His Asn Leu Ser Asp Ala Lys
35 40 45
aag cgt gag cta aaa gcc gtg gct gat gat ctg ggg ctc acg gtg atg 192
Lys Arg Glu Leu Lys Ala Val Ala Asp Asp Leu Gly Leu Thr Val Met
50 55 60
tgc tgt atc gga ctg aag tct gag tac gac ttt gcc tcg ccg gac aag 240
Cys Cys Ile Gly Leu Lys Ser Glu Tyr Asp Phe Ala Ser Pro Asp Lys
65 70 75 80
agc gtt cgt gat gcc ggc acg gaa tat gtg aag cgc ttg ctc gac gac 288
Ser Val Arg Asp Ala Gly Thr Glu Tyr Val Lys Arg Leu Leu Asp Asp
85 90 95
tgt cac ctc ctc ggt gcg ccg gtc ttt gct ggc ctt acg ttc tgc gcg 336
Cys His Leu Leu Gly Ala Pro Val Phe Ala Gly Leu Thr Phe Cys Ala
100 105 110
tgg ccc caa tct ccg ccg ctg gac atg aag gat aag cgc cct tac gtc 384
Trp Pro Gln Ser Pro Pro Leu Asp Met Lys Asp Lys Arg Pro Tyr Val
115 120 125
gac cgt gca atc gaa agc gtt cgt cgt gtt atc aag gta gct gaa gac 432
Asp Arg Ala Ile Glu Ser Val Arg Arg Val Ile Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
tac ggc att att tat gca ctg gaa gtg gtg aac cga ttc gag cag tgg 480
Tyr Gly Ile Ile Tyr Ala Leu Glu Val Val Asn Arg Phe Glu Gln Trp
145 150 155 160
ctt tgc aat gac gcc aag gaa gca att gcg ttt gcc gac gcg gtt gac 528
Leu Cys Asn Asp Ala Lys Glu Ala Ile Ala Phe Ala Asp Ala Val Asp
165 170 175
agt ccg gcg tgc aag gtc cag ctc gac aca ttc cac atg aat atc gaa 576
Ser Pro Ala Cys Lys Val Gln Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
gag act tcc ttc cgc gat gca atc ctt gcc tgc aag ggc aag atg ggc 624
Glu Thr Ser Phe Arg Asp Ala Ile Leu Ala Cys Lys Gly Lys Met Gly
195 200 205
cat ttc cat ttg ggc gaa gcg aac cgt ctg ccg ccg ggc gag ggt cgc 672
His Phe His Leu Gly Glu Ala Asn Arg Leu Pro Pro Gly Glu Gly Arg
210 215 220
ctg ccg tgg gat gaa ata ttc ggg gcg ctg aag gaa atc gga tat gac 720
Leu Pro Trp Asp Glu Ile Phe Gly Ala Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Asp
225 230 235 240
ggc acc atc gtt atg gaa ccg ttc atg cgc aag ggc ggc tcg gtc agc 768
Gly Thr Ile Val Met Glu Pro Phe Met Arg Lys Gly Gly Ser Val Ser
245 250 255
cgc gcg gtg ggc gta tgg cgg gat atg tcg aac ggt gcg acg gac gaa 816
Arg Ala Val Gly Val Trp Arg Asp Met Ser Asn Gly Ala Thr Asp Glu
260 265 270
gag atg gac gag cgc gct cgc cgc tcg ttg cag ttt gtt cgt gac aag 864
Glu Met Asp Glu Arg Ala Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Arg Asp Lys
275 280 285
ctg gcc tga 873
Leu Ala
290
<210> 11
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Met Asn Lys Val Gly Met Phe Tyr Thr Tyr Trp Ser Thr Glu Trp Met
1 5 10 15
Val Asp Phe Pro Ala Thr Ala Lys Arg Ile Ala Gly Leu Gly Phe Asp
20 25 30
Leu Met Glu Ile Ser Leu Gly Glu Phe His Asn Leu Ser Asp Ala Lys
35 40 45
Lys Arg Glu Leu Lys Ala Val Ala Asp Asp Leu Gly Leu Thr Val Met
50 55 60
Cys Cys Ile Gly Leu Lys Ser Glu Tyr Asp Phe Ala Ser Pro Asp Lys
65 70 75 80
Ser Val Arg Asp Ala Gly Thr Glu Tyr Val Lys Arg Leu Leu Asp Asp
85 90 95
Cys His Leu Leu Gly Ala Pro Val Phe Ala Gly Leu Thr Phe Cys Ala
100 105 110
Trp Pro Gln Ser Pro Pro Leu Asp Met Lys Asp Lys Arg Pro Tyr Val
115 120 125
Asp Arg Ala Ile Glu Ser Val Arg Arg Val Ile Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Tyr Gly Ile Ile Tyr Ala Leu Glu Val Val Asn Arg Phe Glu Gln Trp
145 150 155 160
Leu Cys Asn Asp Ala Lys Glu Ala Ile Ala Phe Ala Asp Ala Val Asp
165 170 175
Ser Pro Ala Cys Lys Val Gln Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Thr Ser Phe Arg Asp Ala Ile Leu Ala Cys Lys Gly Lys Met Gly
195 200 205
His Phe His Leu Gly Glu Ala Asn Arg Leu Pro Pro Gly Glu Gly Arg
210 215 220
Leu Pro Trp Asp Glu Ile Phe Gly Ala Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Asp
225 230 235 240
Gly Thr Ile Val Met Glu Pro Phe Met Arg Lys Gly Gly Ser Val Ser
245 250 255
Arg Ala Val Gly Val Trp Arg Asp Met Ser Asn Gly Ala Thr Asp Glu
260 265 270
Glu Met Asp Glu Arg Ala Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Arg Asp Lys
275 280 285
Leu Ala
290
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gaactagtgg atccgtagaa atcttg 26
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctttgttcat tttggcgcgc cttttagttt aataagggtc cgtg 44
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
aaactaaaag gcgcgccaaa atgaacaaag ttggcatg 38
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ttctcttcga gagcatgctc aggccagctt gtcacg 36
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
aagctggcct gagcatgctc tcgaagagaa tctag 35
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gttccgcgga gaatgacacg gccgac 26
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
aaggcgcgcc aaaatgactg ctaacccttc c 31
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
gagcatgctt actcagggcc gtcaatg 27
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gaagactagt tcacgtgatc tc 22
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cactggcgcg ccttttgtgt ggtggtgtcc 30
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tagcagcatg cataggttag tgaatgaggt atg 33
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
taggtccgcg ggagcttcgt taaagggc 28
<210> 24
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
cactggcgcg cccactgcat gcgtcgacaa cccttaatat aacttcgtat aatgtatgct 60
atacgaagtt attaggtcta gacacatcgt ggatccaagc tatcaacgag agagtc 116
<210> 25
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
agtggctagc agtgccatgg cctaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatat 60
taagggttct cgagacgcgt catctagcat ctcatctacc aactc 105
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cactctgcag cactggcgcg cccactgcat 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cactgatatc agtggctagc agtgccatgg 30
<210> 28
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码诺尔斯链霉菌的nat1基因的序列
<400> 28
ggcgcgccaa aatgggtacc actttggacg acactgctta cagatacaga acctctgtcc 60
caggtgacgc cgaggccatc gaggctttgg atggttcctt caccaccgac accgtcttca 120
gagtcaccgc caccggtgac ggtttcacct tgagagaggt tccagttgac ccacctttga 180
ccaaggtttt cccagacgac gaatctgacg acgaatctga cgacggtgag gacggtgacc 240
cagactccag aactttcgtc gcctacggtg acgacggtga cttggctggt ttcgttgtcg 300
tctcttactc cggttggaac agaagattga ccgtcgagga catcgaggtc gccccagagc 360
acagaggtca cggtgtcggt agagctttga tgggtttggc tactgagttc gccagagaga 420
gaggtgccgg tcacttgtgg ttggaggtca ccaacgtcaa cgctccagct atccacgctt 480
acagaagaat gggtttcacc ttgtgtggtt tggacaccgc cttgtacgac ggtaccgcct 540
ccgacggtga gcaggctttg tacatgtcca tgccatgtcc ataagcatgc 590
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
caagcatgcg ggaatgataa gagactttg 29
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggaccgcgga aaggtgagga agtatatgaa c 31
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
cacttctaga cactatcgat ggatccgtag aaatcttg 38
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
cactacgcgt aaaggtgagg aagtatatg 29
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cactctgcag gatccaagct atcaacgaga 30
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cactgcatgc gttgcggaaa aaacagcc 28
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
cactccatgg agtaggtata taaaaatata agag 34
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
cactgctagc gtcgacaaca gcaactag 28
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
caagtcgtgg agattctgc 19
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
caaggcgcgc caaaatgtct accaaaacca ttac 34
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ggagcatgcc tactttccct cagccaag 28
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
atatcccggg caccgtcatc accgaaacgc 30
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
atatcccggg cacgaccacg ctgatgagc 29
<210> 42
<211> 1415
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码来自青枯雷尔氏菌的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列
<220>
<221> CDS
<222> (12)..(1409)
<400> 42
ggcgcgccaa a atg acc aga tct tct ttg gct aga gct cca gtt ttg ttg 50
Met Thr Arg Ser Ser Leu Ala Arg Ala Pro Val Leu Leu
1 5 10
cac atc ggt gct ggt tct ttc cac aga gct cac cag gct tgg tac ttg 98
His Ile Gly Ala Gly Ser Phe His Arg Ala His Gln Ala Trp Tyr Leu
15 20 25
cac aga gtt aac gct gct gtt cca cca ggt gag aga tgg acc ttg acc 146
His Arg Val Asn Ala Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Trp Thr Leu Thr
30 35 40 45
gtt ggt aac atc aga gac gac atg cac gct acc ttg gct gct ttg gct 194
Val Gly Asn Ile Arg Asp Asp Met His Ala Thr Leu Ala Ala Leu Ala
50 55 60
gct cag cag ggt gct tac acc ttg gag acc gtt acc cca cag ggt gag 242
Ala Gln Gln Gly Ala Tyr Thr Leu Glu Thr Val Thr Pro Gln Gly Glu
65 70 75
aga gct tac gag acc atc aga tct atc gct aga gtt ttg cct tgg tct 290
Arg Ala Tyr Glu Thr Ile Arg Ser Ile Ala Arg Val Leu Pro Trp Ser
80 85 90
gct gac ttg gct gct ttg atc aac acc ggt gct gac cca gct tgt aga 338
Ala Asp Leu Ala Ala Leu Ile Asn Thr Gly Ala Asp Pro Ala Cys Arg
95 100 105
atc gtt tct ttc acc gtt acc gag ggt ggt tac tac ttg gac gag cac 386
Ile Val Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu His
110 115 120 125
gac aga ttg gac gtt acc cac cca gac ttg gct gct gac ttg aga ggt 434
Asp Arg Leu Asp Val Thr His Pro Asp Leu Ala Ala Asp Leu Arg Gly
130 135 140
gct aga tct acc ttg tac ggt gct ttg gct gct ttg ttg gct gag aga 482
Ala Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Arg
145 150 155
aga cag aga ggt gct ggt cca ttg acc ttg cag tct tgt gac aac ttg 530
Arg Gln Arg Gly Ala Gly Pro Leu Thr Leu Gln Ser Cys Asp Asn Leu
160 165 170
aga tct aac ggt gct aga ttc aga gct ggt atg aga gct ttc ttg gct 578
Arg Ser Asn Gly Ala Arg Phe Arg Ala Gly Met Arg Ala Phe Leu Ala
175 180 185
ttg aga ggt gac gct gct ttg ttg gct tgg ttc gac gct aac gtt tct 626
Leu Arg Gly Asp Ala Ala Leu Leu Ala Trp Phe Asp Ala Asn Val Ser
190 195 200 205
tgt cca tct gct atg gtt gac aga atc acc cca aga cca acc gac gac 674
Cys Pro Ser Ala Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Arg Pro Thr Asp Asp
210 215 220
gtt aga acc aga gtt cac gct gct acc ggt gtt gac gac aga tgt cca 722
Val Arg Thr Arg Val His Ala Ala Thr Gly Val Asp Asp Arg Cys Pro
225 230 235
gtt atg ggt gag tct ttc atc cag tgg gtt atc gag gac aac ttc atc 770
Val Met Gly Glu Ser Phe Ile Gln Trp Val Ile Glu Asp Asn Phe Ile
240 245 250
gct ggt aga cca gct tgg gag atc gct ggt gct gag atc gtt gct gac 818
Ala Gly Arg Pro Ala Trp Glu Ile Ala Gly Ala Glu Ile Val Ala Asp
255 260 265
gtt cac cca tac gag gag gct aag atc aga atc ttg aac gct acc cac 866
Val His Pro Tyr Glu Glu Ala Lys Ile Arg Ile Leu Asn Ala Thr His
270 275 280 285
tct tgt atc gct tgg gct ggt acc ttg gct ggt ttg acc tac atc cac 914
Ser Cys Ile Ala Trp Ala Gly Thr Leu Ala Gly Leu Thr Tyr Ile His
290 295 300
gag ggt atg aga gac gct gct atc tac aga ttc gct tac gac tac gtt 962
Glu Gly Met Arg Asp Ala Ala Ile Tyr Arg Phe Ala Tyr Asp Tyr Val
305 310 315
acc gac gac gtt atc cca tgt ttg acc cca tct cca ttg gac ttg gag 1010
Thr Asp Asp Val Ile Pro Cys Leu Thr Pro Ser Pro Leu Asp Leu Glu
320 325 330
aga tac aga gac gtt gtt ttg gag aga ttc ggt aac cca tac gtt ttg 1058
Arg Tyr Arg Asp Val Val Leu Glu Arg Phe Gly Asn Pro Tyr Val Leu
335 340 345
gac acc aac cag aga gtt gct gct gac ggt ttc tct aag atc cca ggt 1106
Asp Thr Asn Gln Arg Val Ala Ala Asp Gly Phe Ser Lys Ile Pro Gly
350 355 360 365
ttc atc gct cca acc ttg gct gag tgt ttc gct aga ggt gct gac cca 1154
Phe Ile Ala Pro Thr Leu Ala Glu Cys Phe Ala Arg Gly Ala Asp Pro
370 375 380
gtt gct acc gct gtt ttg cca gct ttg ttc ttg ggt ttc ttg gag ggt 1202
Val Ala Thr Ala Val Leu Pro Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Glu Gly
385 390 395
tgg gct aga ggt acc ttg cca tac gtt tac cag gac ggt gtt atg gac 1250
Trp Ala Arg Gly Thr Leu Pro Tyr Val Tyr Gln Asp Gly Val Met Asp
400 405 410
ggt gct gct gct aga tct atc gtt gag gct cca gac tct gtt gct gct 1298
Gly Ala Ala Ala Arg Ser Ile Val Glu Ala Pro Asp Ser Val Ala Ala
415 420 425
ttc tgt tct gac aga cag ttg tgg ggt tct ttg gct ggt aga gac gct 1346
Phe Cys Ser Asp Arg Gln Leu Trp Gly Ser Leu Ala Gly Arg Asp Ala
430 435 440 445
ttg gtt cag gct gtt aga gct ggt aga gct aga gtt gag gct tgg aga 1394
Leu Val Gln Ala Val Arg Ala Gly Arg Ala Arg Val Glu Ala Trp Arg
450 455 460
gct gct aga aga tga gcatgc 1415
Ala Ala Arg Arg
465
<210> 43
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Met Thr Arg Ser Ser Leu Ala Arg Ala Pro Val Leu Leu His Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ser Phe His Arg Ala His Gln Ala Trp Tyr Leu His Arg Val
20 25 30
Asn Ala Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Trp Thr Leu Thr Val Gly Asn
35 40 45
Ile Arg Asp Asp Met His Ala Thr Leu Ala Ala Leu Ala Ala Gln Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Thr Leu Glu Thr Val Thr Pro Gln Gly Glu Arg Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Ile Arg Ser Ile Ala Arg Val Leu Pro Trp Ser Ala Asp Leu
85 90 95
Ala Ala Leu Ile Asn Thr Gly Ala Asp Pro Ala Cys Arg Ile Val Ser
100 105 110
Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu His Asp Arg Leu
115 120 125
Asp Val Thr His Pro Asp Leu Ala Ala Asp Leu Arg Gly Ala Arg Ser
130 135 140
Thr Leu Tyr Gly Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Gln Arg
145 150 155 160
Gly Ala Gly Pro Leu Thr Leu Gln Ser Cys Asp Asn Leu Arg Ser Asn
165 170 175
Gly Ala Arg Phe Arg Ala Gly Met Arg Ala Phe Leu Ala Leu Arg Gly
180 185 190
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Trp Phe Asp Ala Asn Val Ser Cys Pro Ser
195 200 205
Ala Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Arg Pro Thr Asp Asp Val Arg Thr
210 215 220
Arg Val His Ala Ala Thr Gly Val Asp Asp Arg Cys Pro Val Met Gly
225 230 235 240
Glu Ser Phe Ile Gln Trp Val Ile Glu Asp Asn Phe Ile Ala Gly Arg
245 250 255
Pro Ala Trp Glu Ile Ala Gly Ala Glu Ile Val Ala Asp Val His Pro
260 265 270
Tyr Glu Glu Ala Lys Ile Arg Ile Leu Asn Ala Thr His Ser Cys Ile
275 280 285
Ala Trp Ala Gly Thr Leu Ala Gly Leu Thr Tyr Ile His Glu Gly Met
290 295 300
Arg Asp Ala Ala Ile Tyr Arg Phe Ala Tyr Asp Tyr Val Thr Asp Asp
305 310 315 320
Val Ile Pro Cys Leu Thr Pro Ser Pro Leu Asp Leu Glu Arg Tyr Arg
325 330 335
Asp Val Val Leu Glu Arg Phe Gly Asn Pro Tyr Val Leu Asp Thr Asn
340 345 350
Gln Arg Val Ala Ala Asp Gly Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Ile Ala
355 360 365
Pro Thr Leu Ala Glu Cys Phe Ala Arg Gly Ala Asp Pro Val Ala Thr
370 375 380
Ala Val Leu Pro Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Glu Gly Trp Ala Arg
385 390 395 400
Gly Thr Leu Pro Tyr Val Tyr Gln Asp Gly Val Met Asp Gly Ala Ala
405 410 415
Ala Arg Ser Ile Val Glu Ala Pro Asp Ser Val Ala Ala Phe Cys Ser
420 425 430
Asp Arg Gln Leu Trp Gly Ser Leu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Val Gln
435 440 445
Ala Val Arg Ala Gly Arg Ala Arg Val Glu Ala Trp Arg Ala Ala Arg
450 455 460
Arg
465

Claims (11)

1.一种能够在48小时培养之后在上清液中产生至少15g/l的木糖醇滴度的重组奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)，其中所述奥默毕赤酵母包含：
编码使用D-阿糖醇作为底物并且产生D-木酮糖作为产物的来自大肠杆菌(E.coli)的SEQ ID NO:2或来自青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的SEQ ID NO:43的NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的异源核酸序列；和，
编码使用D-木酮糖作为底物并且产生木糖醇作为产物的来自树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的SEQ ID NO:5或来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的SEQ ID NO:8的NADPH特异性木糖醇脱氢酶的异源核酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组奥默毕赤酵母，其中该奥默毕赤酵母从D-葡萄糖生产D-阿糖醇。
3.根据权利要求2所述的重组奥默毕赤酵母，其中在高渗透压培养基下，该奥默毕赤酵母从D-葡萄糖生产D-阿糖醇。
4.根据权利要求2所述的重组奥默毕赤酵母，其中该奥默毕赤酵母不消耗作为唯一碳源的D-阿糖醇。
5.根据权利要求1所述的重组奥默毕赤酵母，其中该奥默毕赤酵母是嗜渗的或耐渗的酵母。
6.根据权利要求1所述的重组奥默毕赤酵母，其中编码该NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶(EC 1.1.1.11)的序列由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:42的序列组成。
7.根据权利要求1所述的重组奥默毕赤酵母，其中编码该NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列由SEQ ID No 6或9的序列组成。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组奥默毕赤酵母，其中该奥默毕赤酵母是选自保藏在CNCM的菌株I-4982、I-4960和I-4981的菌株。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的重组奥默毕赤酵母，其中该奥默毕赤酵母包含编码NAD+特异性D-阿糖醇4-氧化还原酶的序列的若干拷贝和/或编码NADPH特异性木糖醇脱氢酶的序列的若干拷贝。
10.一种用于生产木糖醇的方法，该方法包括培养根据权利要求1-9中任一项所述的重组奥默毕赤酵母，并且回收木糖醇。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的重组奥默毕赤酵母用于生产木糖醇的用途。
CN201580032606.6A 2014-06-18 2015-06-17 通过重组菌株从葡萄糖生产木糖醇 Active CN106661540B (zh)

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