JP6537534B2 - 組換え株によるグルコースからのキシリトールの生産 - Google Patents

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Description

本発明は、遺伝子組換え微生物を用いたキシリトールの生産方法、及びＤ−グルコースなどの容易に入手可能な炭素源をキシリトールに１ステップで変換することができる遺伝子組換え微生物を調製する方法に関する。
キシリトールは、式（ＣＨＯＨ）３（ＣＨ２ＯＨ）２のポリアルコール又は糖アルコール（アルジトール）であり、これは、衛生並びに栄養補助食品処方及び製品に適用される。
キシリトールは、糖尿病患者用の甘味料として使用され、クロースとほぼ同様に甘く、カロリーが３３％少ない。他の天然若しくは合成甘味料とは異なり、キシリトールは、常用によりう蝕を３分の１に低減することから、歯の健康に積極的に有益であり、再石灰化に役立つ。
キシリトールは、多くの果物及び野菜の繊維中に低濃度で天然に見出され、様々な液果類、オーツ麦、及びマッシュルーム、並びにトウモロコシの皮やサトウキビバガス、及びカバノキなどの繊維状物質から抽出することができる。
しかし、工業生産は、広葉樹又はトウモロコシの穂軸から抽出されたキシラン（ヘミセルロース）から出発し、これをキシロースに加水分解した後、接触水素化によりキシリトールを得る。
そのため、キシロース、さらにはキシリトールの精製は、大きな問題を呈する。このタイプの多くのプロセスが知られている。例として、米国特許第４，０７５，４０６号明細書及び第４，００８，２８５号明細書を挙げることができる。
Ｄ−キシロースのキシリトールへの還元はまた、天然から単離した酵母株（野生型株）又は遺伝子組換え株のいずれかを用いた微生物学的方法で達成することもできる。
しかし、パルプ及び製紙工程由来の亜硫酸廃液のような安価なキシロース供給源は、酵母の増殖を阻害する不純物を含むことから、基質であるＤ−キシロースを酵母発酵に好適な形態で得ることは、課題である。
キシリトールの生産のための魅力的な代替方法は、Ｄ−グルコースなどの安価で且つ容易に入手可能な基質の発酵によってこれを得るものである。
最新の技術では、Ｄ−キシロース及びＤ−キシルロース以外の任意の一般的な炭素源の１段階発酵の間に、ある程度の量のキシリトールを生産することができるいくつかの組換え微生物が記載されている。
これらの組換え微生物、特に好浸透圧性酵母は、例えば、キシリトールに密接に関係するペンチトール（Ｄ−アラビトールである）をＤ−グルコースから相当量で生産するものとして最初に知られるジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・ポリモルファ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びトルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ）である（Ｌｅｗｉｓ Ｄ．Ｈ．＆ Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｃ．，１９６７，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ
．６６：１４３−１８４）。
したがって、国際公開第９４／１０３２５号パンフレットには、Ｄ−キシルロース又はＤ−キシロース以外、並びにポリマー若しくはオリゴマー又はこれらの混合物以外の炭素源で増殖させるとき、キシリトールを生産することができるこうした組換え宿主を構築する方法が提供される。
本出願において、この目的は、所望の異種遺伝子を導入して、これらを発現させることにより、所望の微生物、好ましくは天然に存在する酵母微生物の代謝を修飾することによって達成される。
この目的はまた、天然状態にあるそのような微生物と相同的な特定の遺伝子の活性若しくは発現を過剰発現させる、及び／又は不活性化させるように、そのような所望の微生物の代謝をさらに修飾することによっても達成される。
本出願には、改変Ｄ−アラビトール生合成経路を利用するキシリトールの生産方法が提供され、この経路は、Ｄ−キシロースを形成するＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１）及びキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．９）をコードする遺伝子をＤ−アラビトール生産微生物に導入して、過剰発現させることにより、既存のＤ−アラビトール経路を拡張することによって特に改変される。
しかし、国際公開第９４／１０３２５号パンフレットに記載された試験におけるキシリトールの収率は、酵母抽出物を含む培地中での４８時間の培養後、約７．７ｇ／ｌに過ぎなかった。
この最初の結果を最適化するために、国際公開第９４／１０３２５号パンフレットには、突然変異誘発又は遺伝子破壊を用いて、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）をコードする遺伝子及び／又はＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）をコードする遺伝子を不活性化すること、さらにまた、このような微生物においてペントース−リン酸経路の酸化分枝酵素、及び特にＤ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）及び／若しくは６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４）をコードする遺伝子、並びに／又はＤ−リブロース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子（ＥＣ５．１．３．１）を過剰発現することがさらに提案されている。
しかし、どの遺伝子組み合わせを使用しても、キシリトール力価が、９ｇ／ｌを超えることはなかった。
従って、キシリトールの生産を最適化し、これにより、商業的に利益を上げるための、キシリトール生産株の遺伝子操作の改善のニーズは依然として満たされていない。
本発明は、キシリトールを生産することができる組換え宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、以下：
基質としてＤ−アラビトールを用い、生産物としてＤ−キシルロースを生産する、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする異種核酸配列；及び
基質としてＤ−キシルロースを用い、生産物としてキシリトールを生産する、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする異種核酸配列
を含む。
宿主細胞は、唯一の炭素源としてＤ−アラビトールを消費しないことが好ましい。より好ましくは、宿主細胞は、細菌、真菌及び酵母から選択される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、好浸透圧性又は耐浸透圧性酵母、特に、ピチア・オウメリ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｈｍｅｒｉ）である。
ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来であるのが好ましい。より好ましくは、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）は、配列番号２若しくは４３の配列又は１〜３つのアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有する配列を含むか、又はそれから構成される。好ましい実施形態では、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする配列は、配列番号３又は４２の配列を含むか、又はそれから構成される。
ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨに補助因子特異性を変化するために突然変異させたピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）又はグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼであるのが好ましい。より好ましくは、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、配列番号５若しくは８の配列又は１〜３つのアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有する配列を含むか、又はそれから構成される。好ましい実施形態では、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列は、配列番号６又は９の配列を含むか、又はそれから構成される。
宿主細胞は、４８時間の培養後の上清中に少なくとも１５ｇ／ｌのキシリトール力価を生産することができるのが好ましい。
宿主細胞は、ＣＮＣＭに寄託されたＩ−４９８２、Ｉ−４９６０及びＩ−４９８１から選択される株であるのが好ましい。
宿主細胞は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする配列のいくつかのコピー及び／又はＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列のいくつかのコピーを含むことが好ましい。
本発明はまた、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を培養する工程と、キシリトールを回収する工程とを含む、キシリトールの生産方法に関する。
本発明は、さらに、配列番号１、３、７及び９からなる群から選択される核酸配列を含むか、又はそれから構成される核酸、前記核酸を含む発現カセット若しくはベクターにも関する。
最後に、本発明は、キシリトールの生産を目的とする、本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
定義
本明細書において、「Ｄ−キシロース及びＤ−キシルロース以外の炭素源」とは、Ｄ−キシロース及びＤ−キシルロース又はそれらのポリマー若しくはオリゴマー又は混合物（例えば、キシラン及びヘミセルロース）以外のキシリトールの生産のための炭素基質を意
味する。この炭素源は、Ｄ−グルコース、並びにＤ−グルコース含有シロップ及びＤ−グルコースと他の糖の混合物を含むことが好ましい。
本明細書において、「遺伝子」とは、タンパク質をコードし得る核酸配列、特にＤＮＡ配列を意味する。
本明細書において、「ベクター」とは、遺伝情報、特にＤＮＡを宿主細胞に運搬することができるプラスミド又は任意のＤＮＡ配列を意味する。ベクターはさらに、ベクターにより形質転換した細胞の同定に使用するのに好適なマーカ又はリポータ、１種又は複数種の原核若しくは真核生物宿主におけるベクターの維持及び複製を可能にする複製起点も含有してよい。「プラスミド」は、ベクターであり、一般的には、少なくとも１つの宿主細胞中で維持され、自動的に複製する環状ＤＮＡである。
本明細書において、「発現ベクター」は、ベクターに類似しているが、宿主への形質転換後に、その中にクローン化された遺伝子又はコード核酸の発現を支持するベクターを意味する。クローン化した遺伝子又はコード核酸は通常、ベクター又はクローン化した遺伝子の組換え体構築物が提供し得るプロモータ配列などの特定の制御配列の制御下に置かれる（すなわち、該配列と作動可能に連結される）。発現制御配列は、ベクターが、原核又は真核生物宿主において作動可能に連結された遺伝子を発現するように設計されているかどうか、そしてエンハンサーエレメント（上流活性化配列）及び終結配列などの転写要素、並びに／又は翻訳開始及び終結部位を追加的に含有し得るかどうかによって変動し得る。
本明細書において、「宿主」とは、組換え体材料の受容体及び担体として使用される原核若しくは真核細胞を意味する。
本明細書において、「ペントース−リン酸経路の酸化分枝（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｂｒａｎｃｈ）」とは、例えば、Ｄ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）及び６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４）で触媒される反応などの酸化反応を触媒して、ヘキソース基質を利用してペントースリン酸を形成するペントース−リン酸分路の部分を含むことを意味する。ペントース−リン酸経路の「非酸化的」部分（これは、Ｄ−グルコースからリボースの正味形成も触媒する）は、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．６）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１）及びトランスアルドラーゼ（ＥＣ２．２．１．２）によって触媒される反応のような非酸化的異性化を特徴とする。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈ．Ｒ．Ｍａｈｌｅｒ ＆ Ｅ．Ｈ．Ｃｏｒｄｅｓ，Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６，ｐｐ．４４８−４５４を参照されたい。
本明細書において、「コード核酸」とは、核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を意味する。コード核酸は、タンパク質をコードすることができ、これは、様々な供給源から調製することができる。こうした供給源として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びこれらの組み合わせが含まれる。
本明細書において、「異種」とは、遺伝子又はコード配列が、遺伝子操作により細胞に導入されていることを意味すると理解される。これは、エピソーム又は染色体の形態で存在し得る。遺伝子又はコード配列は、それが導入される宿主細胞とは異なる供給源に由来するものでもよい。しかし、これは、それが導入される宿主細胞と同じ種に由来するものであってもよいが、その環境が天然ではないために、異種とみなされる。例えば、遺伝子
又はコード配列は、それが、その天然のプロモータではないプロモータの制御下にあり、その天然の位置とは異なる位置に導入されるため、異種と呼ばれる。宿主細胞は、異種遺伝子の導入前に遺伝子の内在性コピーを含有しても、又は内在性コピーを含有しなくてもよい。
発明の目的
本発明によれば、キシリトールの生産以外の目的への炭素の利用を低減又は排除するように、特定の微生物宿主の天然の代謝経路が操作される。
このようにして、そのような遺伝子組換え宿主株は、高収率で、キシリトールを１回の発酵工程で生産することができる。例えば、４８時間の培養後の上清中のキシリトール力価は、１５ｇ／ｌ超であり、好ましくは２５ｇ／ｌ超、より好ましくは５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｇ／ｌ超である。
本発明の実用的態様では、本発明の遺伝子組換え宿主はまた、Ｄ−キシロース及び／又はＤ−キシルロースだけではなく、Ｄ−グルコースなどの構造的に無関係な炭素源からもキシリトールを合成する能力によって特徴づけられる。
本発明の遺伝子組換え宿主は、合成されたキシリトールを培地中に分泌することもできるのが好ましい。
具体的には、例示的かつ好ましい実施形態において、本発明の遺伝子組換え宿主は、アラビトールが、キシリトール形成の中間体である経路によって特徴づけられる。
従って、本発明の組換え宿主株は、以下の遺伝子改変によって特徴づけられる：
（１）ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）活性を有するタンパク質をコードする異種核酸が宿主細胞に導入され、これによって、Ｄ−アラビトールのＤ−キシルロースへの変換を提供すること；及び
（２）ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする異種核酸が宿主細胞に導入され、これによって、Ｄ−キシルロースのキシリトールへの変換を提供すること。
微生物の選択
本発明に好適な微生物又は宿主株は、グルコースからＤ−アラビトールを生産することができる。より詳細には、これらは、高浸透圧培地下でグルコースから相当量のＤ−アラビトールを生産することができる。
「高浸透圧培地」とは、本明細書において、１０〜６０％のＤ−グルコース、好ましくは約２５％Ｄ−グルコースを含む培地を指すものとする。
「相当量のＤ−アラビトール」とは、少なくとも１００ｇ／ＬのＤ−アラビトールを意味する。特に、微生物又は宿主株は、微生物又は宿主株が、バッチ条件にて２５％のＤ−グルコースを含む培地中で１００ｇ／ＬのＤ−アラビトールを生産するとき、相当量のＤ−アラビトールを生産するものとみなされる。
グルコースから相当量のＤ−アラビトールを生産することができる宿主株の例としては、好浸透圧性若しくは耐浸透圧性酵母、特に、以下の種：ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、コダマエア属（Ｋｏｄａｍａｅａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ジゴアッカロマイセス属（Ｚｙｇｏａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）及びハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ）に属するもの；又はＤ−アラビトール生産真菌、特に、以下の種：デンドロフィエラ属（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ）及びシゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するもの、とりわけ、デンドロフィエラ・サリナ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）及びスエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
ピチア属の微生物の例としては、ピチア・オウメリ、ピチア・スチピチス、ピチア・ファリノサ（Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ）、ピチア・ハプロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ）が挙げられる。カンジダ属の微生物の例としては、カンジダ・ポリモルファ及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）が挙げられる。ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の微生物の例としては、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィが挙げられる。他の例として、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ）及びトルラスポラ・ハンセニィ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）が挙げられる。メチニコビア属の微生物の例としては、メチニコビア・パルチェリマ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、メチニコビア・レウカフィ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｒｅｕｋａｕｆｉｉ）、メチニコビア・ビクスピダタ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ）、メチニコビア・ルナタ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｌｕｎａｔａ）及びメチニコビア・ゾベリィ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｏｂｅｌｌｉｉ）が挙げられる。具体的な株として、メチニコビア・パルチェリマ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）ＡＴＣＣ １８４０６、メチニコビア・レウカフィＡＴＣＣ １８４０７、メチニコビア・ビクスピダタＡＴＣＣ ２４１７９、メチニコビア・ルナタＡＴＣＣ ２２０３３、メチニコビア・ソベリィ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｏｂｅｌｌｉｉ）ＡＴＣＣ ２２３０２及びメチニコビア・パルチェリマ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６１を挙げることができる。これらの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、住所：１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａから入手することができる。メチニコビア・パルチェリマ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）ＦＥＲＮ ＢＰ−７１６１は、初め、生命工学工業技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、産業技術総合研究所（Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｄｅ
ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）（郵便番号：３０５−８５６６、日本、茨城県つくば市東１丁目１−３）に１９９８年１月１６日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５９２の寄託番号で寄託されていたが、その後、ブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）に基づき、２０００年５月１５日付けで元の寄託から国際寄託に移され、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６１の寄託番号で寄託されている。具体的態様では、微生物は、アクセッション番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７１６１を有する。さらなる情報については、欧州特許第１０６５２７６号明細書を参照されたい。
微生物は、それがＤ−アラビトール生産能を向上させるために、及び／又はキシリトールの生産以外の目的でそれがＤ−アラビトールを使用する能力を低減するために、遺伝子操作することができる。
本発明のために、宿主株は、以下に挙げるその特殊な代謝特性により有利に選択される：
−宿主株は、特に、高浸透圧培地、例えば、１０〜６０％のＤ−グルコース、好ましくは２５％のＤ−グルコースを含む培地の下で、前述のように、グルコースから相当量のＤ
−アラビトールを生産し得る株である（「通常の」培地は、一般に２〜３％のグルコースしか含有しない）
−宿主株は、唯一の炭素源としてＤ−アラビトールを消費しないことがある；
−その酸素還元バランスによって、対応するケトペントース／ペントースアルコール変換に必要な補助因子の生成を可能にする。
本発明の一実施形態では、好浸透圧性酵母ピチア・オウメリ（及びその突然変異誘導体）は、モデルとして、並びに好ましい宿主として使用されている。ピチア・オウメリは、最初に、塩漬けキュウリから単離され、ピクルス、皮、及び果実の発酵のために食品産業で一般に使用されている。
ピチア属、ジゴサッカロマイセス属、デバリオマイセス属及びハンゼヌラ属などの酵母種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とは反対に、低水分活性環境で増殖することができることが当業者に知られている。これらの浸透圧耐性又は好浸透圧性酵母は、グリセロール、Ｄ−アラビトール、エリスリトール及びマンニトールなどの適合溶質を蓄積し、これらは、酵素を保護及び安定化し、これにより、浸透圧条件下での細胞機能を付与する。生産されるポリオールも酸化還元均衡において役割を果たす。
好ましい態様では、微生物は、ピチア・オウメリである。実際に、宿主株ピチア・オウメリの主な特徴は、グリセロール及びＤ−アラビトールを生産するジゴサッカロマイセス・ルーキシィとは対照的に、適合溶質としてＤ−アラビトールのみを生産することである。加えて、グルコースからＤ−アラビトールへの代謝経路は、ピチア・オウメリにおいてよく知られている。
ジゴサッカロマイセス・ルーキシィについて記載されている（Ｊ．Ｍ．ＩＮＧＲＡＭ ａｎｄ Ｗ．Ａ．ＷＯＯＤ， １９６５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８９，Ｎ°５，１１８６−１１９４）ように、ピチア・オウメリにおける炭素フラックスは、ペントース−リン酸経路（ＰＰＰ）の酸化部分を通って、Ｄ−グルコースをＤ−リブロース−５−Ｐに変換して、ＮＡＤＰＨの２つの分子を同時に生産する。Ｄ−リブロース−５−Ｐは、脱リン酸化してＤ−リブロースになった後、Ｄ−アラビトールに還元される。ピチア・オウメリ宿主株では、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）は、非常に活性があり、５０％を超えることが判明している。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、２０１２年３月７日に、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４６０５で寄託された変異体ピチア・オウメリである。
酸化還元反応及び酵素
補助因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、多数の生物学的機能に不可欠であり、いわゆる酸化還元反応において、１つの反応から別の反応への電子のキャリアとして作用する。ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋対は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋対より還元された状態で維持されて、熱力学的駆動力を提供することがわかっているため、細胞は、２つのレドックス対ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋の代謝平衡を維持する必要がある。大部分が酸化型ＮＡＤ＋で見出されるＮＡＤＨは、異化反応における主要な補助因子であり、この反応において、これは、栄養素からのエネルギーの酸化的放出に関与する。ＮＡＤＨとは対照的
に、ＮＡＤＰＨは、同化反応において、又は酸化ストレスの間のみ再酸化される。
酸化還元反応を伴うあらゆる代謝工学的戦略は、これらの細胞の制約の下で機能しなければならない。これは、本発明の目的である遺伝子組換え株において達成されている。
本発明者により見出され、特に、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａ ｌ’ｅｔｕｄｅ ｄｕ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｅ ｄｅｓ ｐｅｎｔｉｔｏｌｓ ｃｈｅｚ Ｐｉｃｈｉａ
ｏｈｍｅｒｉ」（Ｓｏｐｈｉｅ Ｈｕｃｈｅｔｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｌｌｅ，１９９２）と題する博士論文に記載されているように、ケトペントースの酸化還元に関与する反応は、２つの異なる酵素により触媒される。
従って、宿主株は、Ｄ−リブロースからＤ−アラビトールを形成して、Ｄ−キシルロースからキシロースを形成するＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼとして定義される酵素を有する。宿主株はまた、Ｄ−リブロース及びＤ−キシルロースから、それぞれリビトール及びキシリトールを形成するＮＡＤＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼも有する。この酵素は、ピチア・スチピチス（ＸＹＬ２）からの公知のＮＡＤ＋特異的キシリトールデヒドロゲナーゼＥ．Ｃ１．１．１．９と密接に関係している。Ｄ−キシルロースとは対照的に、細胞内Ｄ−リブロースのみが入手可能であるため、宿主株は、Ｄ−リブロースからのＤ−アラビトールの細胞質形成によるＮＡＤＰＨの再酸化を用いて、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋レドックス対を直接均衡させる。その後、受動拡散によりＤ−アラビトールをブロス中に分泌させる。
本発明者らは、細胞内Ｄ−キシルロースの不足が、たとえピチア・オウメリが、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼによるこのポリオールを生産する酵素的ツールを全て備えていたとしても、宿主株によってキシリトールが生産されない主な理由であることを見出した。
実際、細胞質Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロース及びＮＡＤＨに変換することを可能にするＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）活性（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１１）を有するタンパク質をコードする遺伝子を野生型株ピチア・オウメリにクローン化することが選択された。
したがって、細胞内Ｄ−キシルロースは、遺伝子組換え株において入手可能となり、内因性ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼにより還元することができる。しかし、その株には、Ｄ−キシルロースをキシリトールに効率的に変換することができる内在性酵素がない。そのため、異種キシリトールデヒドロゲナーゼを導入するために、株を遺伝子操作する必要がある。
国際公開第９４／１０３２５号パンフレットには、キシリトールの生産を可能にすると共に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋レドックス対を事前の代謝工程により生産されたＮＡＤＨの酸化と均衡させるピチア・スチピチス（ＸＹＬ２）由来のＮＡＤ＋特異的キシリトール−デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ１．１．１．９）をクローン化することが選択されている。しかし、前述したように、結果はそれほど納得できるものではない。
本発明者らは、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを有する突然変異タンパク質をコードする遺伝子をクローン化することにより、Ｄ−キシルロースをキシリトールに変換して、Ｄ−リブロースからのＤ−アラビトールの内因性生産によって為されるように、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋レドックス対を均衡させることを見出した。
Ｄ−アラビトールに対するＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼの低親和性のために、ピチア・オウメリ野生型株は、細胞外Ｄ−アラビトールを消費しない。
遺伝子組換え株へのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）活性の導入によって、ブロス中に生産されるＤ−アラビトールは、細胞質Ｄ−アラビトールと同様に、遺伝子組換え株により良好に消費され得る。
その結果、キシリトールは、細胞内及び細胞外Ｄ−アラビトールから同時に生産される。
その生産は、中間Ｄ−アラビトールの拝出を完全に回避するようにキシリトール経路拡張の効率を増強することによって、改善することができる。
従って、Ｄ−アラビトールと同じ生理学的作用によってＤ−グルコースからキシリトールだけが生産されることになる。この改善は、遺伝子修飾だけではなく、培養条件の改変の結果でもあると考えられる。
宿主株にクローン化しようとする２つの酵素活性の選択
これら２つの酵素活性の選択は、前述したように、それらの補助因子によって支持される。
第１の酵素は、Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに酸化する。
２つのタイプのＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼとしては、Ｄ−キシルロース形成（ＥＣ１．１．１．１１）（Ｄ−アラビトールＮＡＤ＋４−オキシドレダクターゼ）及びＤ−リブロース形成（ＥＣ１．１．１．２５０）が知られている。別に記載のない限り、本明細書で意図されるのは、Ｄ−キシルロース形成アラビトールデヒドロゲナーゼであり、本明細書においてアラビトールデヒドロゲナーゼと呼ぶ。Ｄ−リブロース形成デヒドロゲナーゼは、野生型酵母及び真菌に見出される。
Ｄ−キシルロース形成アラビトールデヒドロゲナーゼは、主として細菌において知られている。例えば、これらは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、特に、大腸菌、クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、アエロバクター・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）株ＰＲＬ−Ｒ３、グルコノバクター・オキシダンスにおいて、さらにまた、ピチア・スチピチスでも同定されている。特に、数種の酵素、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（＃Ｏ５２７２０）、ラルストニア・ソラナケアルム（＃Ｐ５８７０８）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（＃Ｐ５８７０９）、アエロバクター・アエロゲネス（＃Ｌ８ＢＥＦ０）、大腸菌（＃Ｋ３ＥＸ３５、Ｉ２ＺＳＪ５、Ｗ１ＢＹＤ６、Ｗ１Ｈ８Ｎ７、Ｅ７Ｕ４Ｒ７）が、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢデータベースに掲載されている。
本発明の目的のために、大腸菌は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）遺伝子の好ましい供給源である。より具体的には、そのアミノ酸配列は、配列番号２に開示されている。特に、配列番号１及び３は、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする核酸を開示する。コード配列は、そのコドン特異性を考慮に入れることによって、ピチア・オウメリについて最適化されている。
さらに、ラルストニア・ソラナケアルムもまた、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）遺伝子の好ましい供給源である。より具体的には、そのアミノ酸配列は、配列番号４３に開示されている。特に、配列番号４２は、ラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする核酸を開示する。コード配列は、そのコドン特異性を考慮に入れることによって、ピチア・オウメリについて最適化されている。
第２の酵素は、Ｄ−キシルロースをキシリトールに変換する。
酵母及び真菌の大部分は、内在性のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．９）遺伝子を有するが、本発明の実施のためには、ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへのそれらの補助因子特異性の変化が必要である。実際に、本発明の重要な態様は、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを使用するものである。さらに、この酵素を宿主に過剰発現させることが好ましい。
多数のキシリトールデヒドロゲナーゼが知られており、いくつかの科学論文では、どのようにして補助因子特異性をＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへと変化するかを教示している。Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ（Ｊ；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０，１０３４０−１０３４５）は、修飾された補助因子特異性を備えるピチア・スチピチスの突然変異キシリトールデヒドロゲナーゼ、特に、三重変異体（Ｄ２０７Ａ／Ｉ２０８Ｒ／Ｆ２０９Ｓ）及び四重変異体（Ｄ２０７Ａ／Ｉ２０８Ｒ／Ｆ２０９Ｓ／Ｎ２１１Ｒ）を開示している。四重変異体のアミノ酸配列は、配列番号５に開示されている。ＮＡＤＰＨ補助因子特異性を備えたグルコノバクター・オキシダンス（Ｄ３８Ｓ／Ｍ３９Ｒ）のキシリトールデヒドロゲナーゼの二重変異体が、Ｅｈｒｅｎｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４，５６７−５７５）に開示されている。二重変異体のアミノ酸配列は、配列番号８に開示されている。
ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするピチア・スチピチスＸＹＬ２核酸配列の突然変異及びクローン化は、本発明者らによって調製されている。特に、配列番号４及び６は、ピチア・スチピチスの特異的ＮＡＤＰＨキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を開示する。
これ以外にも、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするグルコノバクター・オキシダンス核酸配列の突然変異及びクローン化も実施した。特に、配列番号７及び９は、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を開示する。コード配列は、そのコドン特異性を考慮に入れることによって、ピチア・オウメリについて最適化されている。
発現カセット、ベクター及び組換え宿主細胞
特定の態様において、本発明は、配列番号１、３、７、９及び４２からなる群から選択されるピチア・オウメリについて最適化されたコード配列を含む核酸に関する。
本発明はさらに、配列番号１、３、７、９及び４２からなる群から選択される、ピチア・オウメリについて最適化されたコード配列を含む核酸を含む発現カセットに関する。
本発明はまた、配列番号４の核酸構築物及び前記核酸構築物を含む核酸にも関する。
さらに、本発明は、前記核酸又は発現カセットを含む組換えベクター、特に、発現ベクターに関する。一般に、発現カセットは、タンパク質中への遺伝子転写及び翻訳に必要な全ての要素を含む。特に、上記カセットは、プロモータ、任意選択でエンハンサー、転写
終結因子及び翻訳のための要素を含む。より具体的には、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの発現を制御するために用いられるプロモータは、強力な発現を駆動するために選択される。実際に、この酵素は、宿主細胞に過剰発現させるのが好ましい。こうしたプロモータは、当技術分野では周知である。例えば、プロモータは、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ（ｐｏＲＲ）又はピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）であってよい。
本発明は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする核酸、及びＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む組換えベクター、特に、発現ベクターに関する。本発明はまた、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする核酸を含む組換えベクター、特に発現ベクターと、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む組換えベクター、特に発現ベクターとを含むキットにも関する。
前記ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、上に開示した酵素から選択されることが好ましい。特に、前記ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼは、配列番号２若しくは４２のアミノ酸配列、又は１〜３のアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有する配列を含むか、又はそれから構成される。とりわけ、前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、配列番号５若しくは８のアミノ酸配列、又は１〜３のアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有する配列を含むか、又はそれから構成される。
好ましいベクターは、プラスミドである。好適なプラスミドは、当業者には周知であり、例えば、実施例に具体的に開示されるものから選択することができる。
まず、好適なプロモータの制御下でＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換えベクター中にクローン化することによって、本発明の遺伝子組換え宿主を作製した後、形質転換によりＤ−アラビトール生産生物の宿主細胞に導入する。
本発明は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする異種核酸配列と、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする異種核酸配列とを含む組換え又は遺伝子操作宿主細胞に関する。ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼは、基質としてＤ−アラビトールを使用し、生産物としてＤ−キシルロースを生産する。ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、基質としてＤ−キシルロースを使用し、キシリトールを生産する。ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする配列は、エピソームであってもよいし、又は宿主細胞の染色体に組み込んでもよい。実際に、ベクターを用いた形質転換系によって遺伝子的に安定な形質転換体を構築し、これにより、所望のＤＮＡを宿主染色体に組み込むことが好ましい。こうした組み込みは、細胞内にｄｅ ｎｏｖｏで実施するか、又は染色体内へのＤＮＡ配列の組み込みを促進するＤＮＡ要素と一緒に、それ自体が宿主染色体に機能的に挿入されるベクターを用いた形質転換によって補助することができる。
組換え又は遺伝子操作宿主細胞は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする配列のいくつかのコピー及び／又はＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列のいくつかのコピーを含むことができ、宿主細胞染色体に組み込むことが好ましい。特に、組換え又は遺伝子操作宿主細胞は、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする２つ、３つ若しくは４つの配列及び／又はＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする２つ、３つ若し
くは４つの配列を含むことができる。例えば、宿主細胞は、大腸菌由来の２つ又は３つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及び／又はラルストニア・ソラナケアルム由来の１つ又は２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ、より具体的には、大腸菌由来の２つ又は３つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及び／又はラルストニア・ソラナケアルム由来の１つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含んでもよい。ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼは、同じ生物由来又は異なる生物由来のいずれであってもよい。ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼは、同じ生物由来又は異なる生物由来のいずれであってもよい。例えば、宿主細胞は、ピチア・スチピチス由来の１つ、２つ若しくは３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び／又はグルコノバクター・オキシダンス由来の１つ、２つ若しくは３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ、より具体的には、ピチア・スチピチス由来の１つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び／又はグルコノバクター・オキシダンス由来の３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含んでもよい。
本発明の具体的態様では、組換え又は遺伝子操作宿主細胞は、以下：
−２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ；又は
−大腸菌由来の２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ（１つはピチア・スチピチス由来で、他方はグルコノバクター・オキシダンス由来）；又は
−２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ；又は
−大腸菌由来の２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ（１つはピチア・スチピチス由来で、２つはグルコノバクター・オキシダンス由来）；又は
−３つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ；又は
−３つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（２つは、大腸菌由来で、１つは、ラルストニア・ソラナケアルム由来）と、３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ（１つはピチア・スチピチス由来で、２つはグルコノバクター・オキシダンス由来）；又は
−４つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、４つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ；又は
−４つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（３つは、大腸菌由来で、１つは、ラルストニア・ソラナケアルム由来）と、４つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ（１つはピチア・スチピチス由来で、３つはグルコノバクター・オキシダンス由来）
を含む、ピチア・オウメリ株である。
宿主細胞は、上に詳述した微生物から選択される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ピチア・オウメリである。出発宿主細胞は、番号Ｉ−４６０５でＣＮＣＭに寄託されている変異体ピチア・オウメリであることが好ましい。
本発明の特定の態様において、宿主細胞は、ＣＮＣＭに寄託されている株Ｉ−４９８２、Ｉ−４９６０及びＩ−４９８１から選択される株である。
本発明は、培地中で組換え又は遺伝子操作宿主細胞を培養する工程と、生産されたキシリトールを回収する工程とを含む、キシリトールの生産方法に関する。培地は、好都合な炭素源を微生物に供給するのが好ましい。炭素源は、Ｄ−グルコース、及び様々なＤ−グ
ルコース含有シロップ、並びに他の糖とＤ−グルコースの混合物を含むことが好ましい。この方法は、キシリトールを精製する工程をさらに含んでもよい。
本発明は、キシリトールを生産するための本明細書に開示する組換え又は遺伝子操作宿主細胞の使用に関する。
こうした遺伝子組換え株により生産されたキシリトールは、当技術分野で公知の任意の技術により本発明の宿主の培地から精製することができる。例えば、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，０８１，０２６号明細書は、酵母培地からキシリトールのクロマトグラフ分離を記載している。従って、発酵工程から、米国特許第５，０８１，０２６号明細書に記載のクロマトグラフ工程を用いて、キシリトールを培地から精製した後、結晶化に付することができる。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例を読めば明らかであろう。しかし、これらは、例示として記載されているに過ぎず、限定的ではない。
ＡＢＹＷＭＰ：ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位によりフランキングされる、大腸菌由来の合成ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの制限マップである。 ｌｉｇ７．７８：ピチア・スチピチス由来の１つのＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの制限マップである。 １２ＡＡＬＱＴＰ：ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩＩ制限部位によりフランキングされる、ピチア・スチピチス由来の合成ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの制限マップである。 １３ＡＡＹＳＹＰ：ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位によりフランキングされる、グルコノバクター・オキシダンス由来の合成ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの制限マップである。 オーバーラップＰＣＲを用いた、ｐｏＲＲプロモータ及びターミネータによりフランキングされるオープンリーディングフレームから構成される発現カセットの構築を示す図である。 １２ＡＡＭＣＪＰ：ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩＩ制限部位によりフランキングされる、シュードモナス・チコリィ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）の合成タガトース−３−エピメラーゼの制限マップである。 ｐｏＬＥＵ２及びｐｏＵＲＡ３選択マーカを含むピチア・オウメリシャトルベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２５２３：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされるシュードモナス・チコリィのタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレームを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐｏＵＲＡ３発現ベクターｐＥＶＥ２５２３の制限マップである。 ｐＥＶＥ２５６０：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされるシュードモナス・チコリィのタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレームを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐｏＬＥＵ２発現ベクターｐＥＶＥ２５６０の制限マップである。 グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３２８４：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３２８４発現ベクターの制限マップである。 ピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２５６２／ｐＥＶＥ２５６４：それぞれｐｏＵＲＡ３又はｐｏＬＥＵ２選択マーカのいずれかと共に、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされるピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２５６２／ｐＥＶＥ２５６４発現ベクターの制限マップである。 ピチア・スチピチスＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２５６３：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされるピチア・スチピチスのＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２５６３発現ベクターの制限マップである。 ｐｏＵＲＡ３選択マーカを用いた、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータの制御下にある、大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２８３９：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされる大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８３９発現ベクターの制限マップである。 ｐｏＵＲＡ３選択マーカを用いた、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある、大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３１０２：ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）ターミネータによりフランキングされる大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３１０２発現ベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ３１２３：ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータによりフランキングされる大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＵＲＡ３選択マーカを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３１２３発現ベクターの制限マップである。 ｐｏＬＥＵ２選択マーカを用い、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある、大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３１５７：ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータによりフランキングされる大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＬＥＵ２選択マーカを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３１５７発現ベクターの制限マップである。 ｐｏＬＥＵ２選択マーカを含むピチア・オウメリｌｏｘＰベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２７８７：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされ、内在性プロモータ及びターミネータの制御下にあるクローン化ピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２７８７組み込みベクターの制限マップである。 １２ＡＢＴＶ４Ｐ：ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位によりフランキングされるストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）由来の合成ｎａｔ１遺伝子の制限マップである。 ｐＥＶＥ２７９８：リブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータの制御下にあるクローン化ｎａｔ１マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２７９８発現ベクターの制限マップである。 ｎａｔ１選択マーカを含むピチア・オウメリｌｏｘＰベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２８５２：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされ、リブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータの制御下にあるクローン化ｎａｔ１マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８５２組み込みベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ２８５５：ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム上流の５’領域と相同のクローン化断片と、２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｎａｔ１選択マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８５５組み込みベクターの制限マップである。 ＬＥＵ２オープンリーディングフレームの欠失のためのピチア・オウメリｌｏｘＰベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２８６４：ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム上流の５’領域と相同のクローン化断片及びＬＥＵ２オープンリーディングフレーム下流の３’領域と相同のクローン化断片、並びに２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｎａｔ１選択マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８６４組み込みベクターの制限マップである。 ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む、二重発現プラスミドの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３３１８：ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの二重発現構築物を含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３３１８発現ベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ２８６２：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータによりフランキングされる、ピチア・オウメリＬＥＵ２マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８６２発現ベクターの制限マップである。 ピチア・オウメリにおける大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子と、ピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノム発現のための組み込みベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ２８６５：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ２８６５組み込みベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ３３８７：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカと共に、ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの二重発現構築物を含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３３８７組み込みベクターの制限マップである。 グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む、二重／三重発現プラスミドの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３３２２／ｐＥＶＥ３３２４：グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、又はグルコノバクター・オキシダンスの２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と、大腸菌の１つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの三重発現構築物をそれぞれ含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３３２２／ｐＥＶＥ３３２４発現ベクターの制限マップである。 ピチア・オウメリにおける大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子とグルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノム発現のための組み込みベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３３９０／ｐＥＶＥ３３９２：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２マーカと共に、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、又はグルコノバクター・オキシダンスの２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と、大腸菌の１つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの三重発現構築物をそれぞれ含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３３９０／ｐＥＶＥ３３９２組み込みベクターの制限マップである。 ピチア・オウメリにおける大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子と、グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノム発現のための組み込みベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ４３９０：２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカと共に、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子との二重発現構築物を含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ４３９０発現ベクターの制限マップである。 １３ＡＢ２ＥＧＦ：ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位によりフランキングされる、ラルストニア・ソラナケアルム由来の合成ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子の制限マップである。 ピチア・オウメリにおけるラルストニア・ソラナケアルムＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子と、グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノム発現のための組み込みベクターの構築を示す図である。 ｐＥＶＥ３８９８：ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータによりフランキングされる、ラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含むクローン化発現カセットを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ３８９８発現ベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ４０７７：グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物を含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ４０７７発現ベクターの制限マップである。 ｐＥＶＥ４３７７：グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼとラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、並びに２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む、ピチア・オウメリｐＥＶＥ４３７７組み込みベクターの制限マップである。
実施例１．遺伝子操作のための好ましい宿主としてのピチア・オウメリ株の選択
最適な宿主株として、ピチア・オウメリは、
−高浸透圧培地、例えば、１０〜６０％のＤ−グルコース、好ましくは２５％のＤ−グルコースを含む培地の下で、グルコースから相当量のアラビトールの生産株である（「通常の」培地は、一般に２〜３％のグルコースしか含まない）
−必要な補助因子の生成を可能にする酸化還元バランスを有する。
その性能の例示として、以下の表に、ピチア・オウメリのアラビトール代謝経路に関与する酵素活性（Ｓｏｐｈｉｅ ＨＵＣＨＥＴＴＥ Ｔｈｅｓｉｓ，１９９２）を示す。
ヘキソース一リン酸経路：グルコース−６−ＰからＤ−リブロース−５−Ｐ及びＤ−キシルロース−５−Ｐへ
ヘキソース一リン酸経路（ＨＭＰ）とも称するＰＰＰの酸化部分は、ＮＡＤＰＨ生成経路である。２つのＮＡＤＰ＋依存性酵素、すなわち、グルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４９）及び６−Ｐ−グルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４４）は、１モルのＤ−リブロース−５−Ｐにつき１モルのグルコース−６−Ｐの酸化に参加して、２モルのＮＡＤＰＨを生成する。
下記の酵素の動態パラメータを決定した：Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ（Ｅ．Ｃ５．１．３．１）、Ｄ−リブロース−５−Ｐケト−イソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．１．６）、トランスケトラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．２．１．１）及び酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）。
ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｄ−リブロース−５−Ｐのエピメリ化から合成されたＤ−キシルロース−５−Ｐは、ケトール基転移によりＰＰＰの非酸化部分に効率的に入る。その結果、Ｄ−キシルロース−５−Ｐは、Ｄ−キシロースをへの脱リン酸化のために利用できなくなる。
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼ
Ｄ−リブロース及びＤ−キシルロースは、Ｄ−リブロース−５−Ｐ及びＤ−キシルロース−５−Ｐの脱リン酸化により生産される。
ミカエリス・メンテ定数は、各基質に対するＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ−Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼの親和性並びに対応する最大速度を明らかにする。
ＮＡＤＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼは、Ｄ−リブロース及びＤ−キシロースからそれぞれリビトール及びキシリトールを形成し、Ｄ−リブロースよりＤ−キシロースに対して高い親和性を示す。逆反応は、キシリトール及びリブロースに対する良好な親和性を示し、これは、これら２つのポリオールでの宿主株の良好な増殖を説明している。
ＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼは、Ｄ−リブロースからＤ−アラビトールを、Ｄ−キシロースからキシリトールを形成し、Ｄ−キシロースよりＤ−リブロースに対して高い親和性を示す。逆反応は、Ｄ−アラビトールに対する非常に低い親和性を示し、これは、このポリオールでの宿主株の非増殖を説明している。
宿主株からの２つのケトペントース−オキシドレダクターゼは、Ｉｎｇｒａｍ ａｎｄ
Ｗｏｏｄ，１９６５（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８９，ｎ°５，１１８６−１１９４）により、サッカロマイセス・ルキシィ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）に記載されている以前の酵素とは異なるものとして特性決定された。実際に、サッカロマイセス・ルキシィでは、Ｄ−リブロースとＮＡＤＨに正反応は検出されず、Ｄ−アラビトールとＮＡＤＰＨに逆反応が検出された。
ホールデンの関係は、ｉｎ ｖｉｖｏでの酵素の速度論的挙動を予測する。
２つの酵素は、逆反応（ペンチトール還元）よりも正反応（Ｄ−ケトペントース酸化）を好む。
宿主株におけるＰＰＰは、極めて効率的であり、１モルの消費グルコースから２モルのＮＡＤＰＨが生産される。その結果、ＮＡＤＰＨは、同化反応及び維持反応の両方について過剰に利用可能となる。宿主株は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋レドックス対を均衡させるために、Ｄ−リブロースからＤ−アラビトールを、又はＤ−キシロースからキシリトールを生産するに違いない。
ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼに対するＮＡＤＰ＋の阻害作用がｉｎ
ｖｉｔｒｏで判明している。この活性は、ＮＡＤＰ＋を過剰に添加すると、８０％少ない。たとえこの濃度が細胞内ＮＡＤＰ＋濃度と適合性でなくても、この結果は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋レドックス対の均衡へのＮＡＤＰＨ特異的Ｄ−ケトペントース−オキシドレダクターゼの役割のある程度の概観をもたらすものである。
ＰＰＰの非酸化部分にＤ−キシルロース−５−Ｐが入ることによって、Ｄ−キシルロースが利用可能ではないとき、宿主株は、Ｄ−リブロースからＤ−アラビトールしか生産しない。
Ｄ−アラビトールの生産とＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋レドックス対の均衡との関係は、Ｄ
−アラビトール生産に対するグルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼの過剰発現の影響を評価することにより、宿主株において証明されている。従って、得られた株は、宿主株と比較して、１．５倍高いＧ６ＰＤＨ活性を保有し、１０％多いＤ−アラビトールを生産する（仏国特許第２７７２７８８号明細書）。
実施例２．ピチア・オウメリコドン使用頻度
ピチア・オウメリのコドン使用頻度は、入手可能なＤＮＡ並びに５つのピチア・オウメリ遺伝子：トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（仏国特許第２７７２７８８号）、リブロースレダクターゼ、βイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼＬＥＵ２（Ｐｉｒｅｄｄａ ａｎｄ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．１０：１６０１−１６１２（１９９４）及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ−ＵＲＡ３（Ｐｉｒｅｄｄａ ａｎｄ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，１９９４，前掲）の対応するアミノ酸配列から決定した。
全ての個別の遺伝子を、単一のアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットに区分した。５つの遺伝子は、合計２０９１のコドンから構成された。
各アミノ酸について、５つの遺伝子に存在する全てのコドンの数を計数し、２０９１で割ってから、１０００を掛けた。このようにして、１０００コドン中の特定のコドンの頻度を推定した。
ピチア・オウメリの暫定コドン使用頻度を表７に記載する。
ピチア・スチピチス由来のキシリトールデヒドロゲナーゼを除き、ピチア・オウメリに発現された異種遺伝子は全て、この表及びｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／から入手したオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）プログラムを用いて、コドン最適化した。
酵素をコードする配列それぞれの５’及び３’末端に、制限酵素のための認識部位を手で付加した後、得られた配列を遺伝子合成のために提出した。
実施例３．大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（Ｄ−キシルロース形成）遺伝子のクローン化
配列番号１の登録配列に従って、大腸菌由来のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼａｌｔＤをコードするＤＮＡ断片を化学的に合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
ａｌｔＤ遺伝子をコードする配列ＡＦ３７８０８２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ３７８０８２から入手）のヌクレオチド１４４１〜２８０８を鋳型として使用した後、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／から入手したオプティマイザープログラムを用いて、実施例２の表７に記載のピチア・オウメリＡＴＣＣ２０２０９での使用のためのコドン最適化に付した。
さらなるクローン化を促進するために、得られた配列の５’及び３’末端に、制限酵素ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）の認識部位をコードするヌクレオチドを付加した。
加えて、酵母のコザック（Ｋｏｚａｋ）様配列における３位のアデノシンを構成するために、開始ＡＴＧの前にアデノシントリプレットを含有させた。
その後、最終配列（配列番号１）を合成のために提出した（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅ
ｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
大腸菌由来のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする合成ＤＮＡ断片をｐＭＫ−ＲＱ由来のベクターに５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡとして送達した（１２ＡＢＹＷＭＰ、図１）。
さらなるサブクローン化のために、ＡｓｃＩ及びｓｐｈＩ酵素による制限切断により、遺伝子を放出させた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
実施例４．ピチア・スチピチスＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの突然変異誘発及びクローン化
ピチア・スチピチスＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローン化
キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、酵母（ピチア・スチピチス）遺伝子の既知ヌクレオチド配列（Ｋｏｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４９３−５００（１９９０））を、仏国特許第２７６５５８９号明細書の教示に従って、プラスミドベクターｌｉｇ７．７８にクローン化した（本特許の実施例４及び図７を参照されたい）。ベクターの制限マップを図２ａに示す。
ピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の突然変異及びクローン化
配列番号４の配列に従って、ピチア・スチピチス由来のＮＡＰＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼＸＹＬ２をコードするＤＮＡ断片を化学的に合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
ＸＹＬ２遺伝子をコードする配列Ｘ５５３９２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｘ５５３９２．１から入手）のヌクレオチド３１９〜１４１０を鋳型として使用した。
Ｗａｔａｎａｂｅら（Ｊ；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０，１０３４０−１０３４５）の論文に従い、公開された４つのアミノ酸突然変異：Ｄ２０７Ａ／Ｉ２０８Ｒ／Ｆ２０９Ｓ／Ｎ２１１Ｒ（番号付与は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２２１４４から入手したｐ２２１４４タンパク質配列に基づく）を導入することによって、キシリトールデヒドロゲナーゼの補助因子優先傾向をＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへと変化することができた。
従って、Ｄ２０７、Ｉ２０８、Ｆ２０９及びＮ２１１をコードするコドンを、対応する配列においてそれぞれＧＣＴ、ＡＧＡ、ＴＣＡ及びＡＧＡにより手作業で置換した。
加えて、さらなるクローン化を促進するために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）及びＳａｃＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）の認識部位をコードするヌクレオチドをそれぞれ５’及び３’末端に手作業で含ませた。
さらに、酵母のコザック（Ｋｏｚａｋ）様配列において３位のアデノシンを構成するために、開始ＡＴＧの前にアデノシントリプレットを含ませた。最終配列（配列番号４）を合成のために提出した（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
ピチア・スチピチス由来のＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする合成ＤＮＡ断片をｐＭＡ−Ｔ由来のベクターに５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡとし
て送達した（１２ＡＡＬＱＴＰ、図２ｂ）。
実施例５．グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの突然変異及びクローン化
配列番号７の登録配列に従って、グルコノバクター・オキシダンス由来のＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼＸｄｈをコードするＤＮＡ断片を化学的に合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｘｄｈ遺伝子をコードする配列ＡＢ０９１６９０．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＢ０９１６９０．１から入手）のヌクレオチド１０６３〜１８５１を鋳型として使用した後、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／から入手したオプティマイザープログラムを用いて、表７（実施例２）に記載のピチア・オウメリＡＴＣＣ２０２０９での使用のためのコドン最適化に付した。
Ｅｈｒｅｎｓｂｅｒｇｅｒら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２００６，１４，５６７−５７５）による論文に基づき、公開された２つのアミノ酸突然変異：Ｄ３８Ｓ／Ｍ３９Ｒ（番号付与は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＧＲ６１から入手したＱ８ＧＲ６１タンパク質配列に基づく）を導入することによって、上記酵素の補助因子特異性をＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへと変化することができた。
このように、Ｄ３８及びＭ３９をコードするコドンを、対応する配列においてＴＣＴ及びＡＧＡにより手作業でそれぞれ置換した。加えて、さらなるクローン化を可能にするために、制限酵素ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）の認識部位をコードするヌクレオチドを、それぞれ５’及び３’末端に手作業で含ませた。
さらに、酵母のコザック（Ｋｏｚａｋ）様配列における３位のアデノシンを構成するために、開始ＡＴＧの前にアデノシントリプレットを含有させた。最終配列（配列番号７）を合成のために提出した（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
グルコノバクター・オキシダンス由来のＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする合成ＤＮＡ断片をｐＭＡ−Ｔ由来のベクターに５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡとして送達した（１３ＡＡＹＳＹＰ、図３）。さらなるサブクローン化のために、ＡｓｃＩ及びｓｐｈＩ酵素による制限切断により、遺伝子を放出させた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
実施例６．ｐｏＵＲＡ３選択マーカを用いた異種遺伝子発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
置換可能な以下：
−プロモータ、
−オープンリーディング、及び
−ターミネータエレメント
を含むベクターのクローン化を、３つの個別の断片の２回の連続的オーバーラップＰＣＲにより実施した（図４）。
組換えピチア・オウメリ株におけるタガトース３−エピメラーゼ遺伝子のクローン化及び過剰発現を試験するために、ベクターは初め、発現モデルとして計画した。
以下に説明するように、タガトース３−エピメラーゼ遺伝子は、特定のＡｓｃＩ−Ｓｐ
ｈＩ制限部位カセットにクローン化されており、これらの同じ挿入部位を用いることにより、目的とするいずれの遺伝子のクローン化も可能になる。
クローン化は、以下の方法により構想した。
第１ＰＣＲ（ＰＣＲ１）において、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位（プライマー配列に下線で示す）によりフランキングされるピチア・オウメリの長さ４９０ｂｐのリブロースレダクターゼプロモータ断片を以下：
−プライマーＥＶ２９６０：
及び
−プライマーＥＶ２９６１：
を用いて増幅した。
加えて、逆プライマーＥＶ２９６１の５’末端に、タガトース３−エピメラーゼ遺伝子の５’末端を呈示する長さ１３ヌクレオチドの断片を付加した。
この断片は、ＡｓｃＩ部位の８ヌクレオチド及びこれに続くリブロースレダクターゼプロモータの３’末端の１０ヌクレオチドと一緒に、ＰＣＲ１の断片を後述するＰＣＲ２の断片と融合するためのオーバーラップとして必要であった。ピチア・オウメリＡＴＣＣ２０２０９のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。
この目的のために、新しく条斑として生成されたピチア・オウメリコロニーを３０μｌの０．２％ＳＤＳに再懸濁させ、９５℃で４分間加熱した。最高速度の遠心分離の後、０．５μｌの上清をＰＣＲのために使用した。
適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５０℃で２０秒／７２℃で１５秒を２５サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
第２ＰＣＲ（ＰＣＲ２）では、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ部位（プライマー配列に下線で示す）によりフランキングされるシュードモナス・チコリィＳＴ２４のタガトース−３−エピメラーゼの長さ９１１ｂｐの断片を以下：
−プライマーＥＶ２９６２：
及び
−プライマーＥＶ２９６３：
を用いて増幅した。
プライマーＥＶ２９６２の５’末端は、リブロースレダクターゼプロモータの３’を呈示する長さ９ヌクレオチドの断片を含む。
この断片を、ＡｓｃＩ部位の８ヌクレオチド及びこれに続くタガトース３−エピメラーゼオープンリーディングフレームの１２ヌクレオチドと一緒に、ＰＣＲ２産物を前述したＰＣＲ１産物と融合するためのオーバーラップＰＣＲのために使用した。
加えて、逆プライマーＥＶ２９６３の５’末端は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼターミネータの５’末端を呈示する長さ１２ヌクレオチドの断片を含む。
この断片は、ＳｐｈＩ部位の６ヌクレオチド及びこれに続くタガトース３−エピメラーゼオープンリーディングフレームの３’末端の１２ヌクレオチドと一緒に、ＰＣＲ２を後述するＰＣＲ３のＰＣＲ断片と融合するためのオーバーラップとして必要である。
シュードモナス・チコリィＳＴ２４のタガトース−３−エピメラーゼ遺伝子の合成コピーを含むベクター１２ＡＡＭＣＪＰ（図５）（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の鋳型２５ｎｇを使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＢ０００３６１からのＡＢ０００３６１．１のヌクレオチド７１９〜１５９１）−配列番号１１。
適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／４８℃で２０秒／７２℃で３０秒を２５サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。
第３ＰＣＲ（ＰＣＲ３）では、ＳｐｈＩ及びＳａｃＩ部位（プライマー配列に下線で示す）によりフランキングされるピチア・オウメリのリブロースレダクターゼターミネータの長さ３８０ｂｐ断片を以下：
−プライマーＥＶ２９６４
及び
−プライマーＥＶ２９６５
を用いて増幅した。
プライマーＥＶ２９６４の５’末端は、タガトース３−エピメラーゼオープンリーディングフレームの３’末端の長さ１２ヌクレオチド断片を含有し、この断片を、ＳｐｈＩ部位の６ヌクレオチド及びこれに続くピチア・オウメリのリブロースレダクターゼターミネ
ータの１２ヌクレオチドと一緒に、ＰＣＲ３と前述のＰＣＲ２の融合のために使用した。
ピチア・オウメリＡＴＣＣ２０２０９のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。最高速度の遠心分離の後、０．５μｌの上清をＰＣＲに使用した。この目的のために、新しく条斑として生成されたピチア・オウメリコロニーを３０μｌの０．２％ＳＤＳに再懸濁させ、９５℃で４分間加熱した。
適切な１×バッファー中の２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー及び０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５０℃で２０秒／７２℃で１５秒を２５サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ
ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
３つの個別のＰＣＲ断片の融合は、次のように実施した：ＰＣＲ１及びＰＣＲ２のゲル精製産物の各々５０ｎｇを、ＥＶ２９６０及びＥＶ２９６３を用いたＰＣＲ反応での鋳型として使用した。
前述したプライマー設計から得られる２つの断片における長さ３０ヌクレオチドの相同セグメントを融合反応におけるオーバーラップとして使用した。
このようにして、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位によりフランキングされるピチア・オウメリのリブロースレダクターゼからなる長さ１．４ｋｂの断片をシュードモナス・チコリィＳＴ２４のタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレームに融合させた。
適切な１×バッファー中の２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー及び０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／６２℃で２０秒／７２℃で４５秒を３０サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
２回目のオーバーラップＰＣＲで、精製断片をＰＣＲ３の生産物と融合させた。４０ｎｇの各断片を鋳型として使用して、ＥＶ２９６０及びＥＶ２９６５で増幅した。
前述したプライマー設計から得られる２つの断片中の長さ３０ヌクレオチドの相同セグメントを融合反応におけるオーバーラップとして使用した。
このようにして、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩによりフランキングされるピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータと、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ部位によりフランキングさ
れるシュードモナス・チコリィＳＴ２４のタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレームとから構成される長さ１．８ｋｂの断片をピチア・オウメリのリブロースレダクターゼターミネータと融合させた。
適切な１×バッファー中の２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー及び０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／６５℃で２０秒／７２℃で５５秒を３０サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
リブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるシュードモナス・チコリィＳＴ２４のタガトース−３−エピメラーゼの長さ１．７ｋｂの断片からなる最終ＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩ及びＳａｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で消化し、ゲル精製した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｌｉｇ７．７８ベクターバックボーンの長さ９．８ｋｂの単離ＳｐｅＩ／ＳａｃＩＩ断片と、１６℃で一晩連結させた（図６）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。精製したプラスミドＤＮＡは、制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるさらなる特性決定のために使用した。
新たにクローン化した発現プラスミドｐＥＶＥ２５２３（図７）は、細菌（大腸菌）複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子、酵素（ピチア・オウメリ）自己複製配列、並びに酵母での選択のためのｐｏＵＲＡ３（ピチア・オウメリ）遺伝子から構成されるシャトル大腸菌−ピチア・オウメリベクターである。
さらに、これは、シュードモナス・チコリィのタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限により交換可能）をフランキングする交換可能なピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータエレメント（ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限により）並びにターミネータエレメント（ＳｐｈＩ及びＳａｃＩＩを介して）も含む。
実施例７．ｐｏＬＥＵ２選択マーカを用いた異種遺伝子発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
第２ピチア・オウメリ発現ベクターの構築のために、実施例６に記載したプラスミドｐＥＶＥ２５２３の発現カセット（図７）をピチア・オウメリｐｏＬＥＵ２選択マーカを含むベクターにクローン化した（図６）。
ＳｐｅＩ及びＳａｃＩＩで切断したベクターｐＥＶＥ２５２３（図７）の平滑化１．７ｋｂ断片を挿入片として使用した。Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用
いて、室温で１５分間平滑化を実施した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間実施した。
ベクターバックボーンは、ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化したｐｏＡＲＳベクター（ｐｌｉｇ３−仏国特許第２７７２７８８号明細書）から取得して、平滑化した後、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化した。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてゲル精製した挿入片及びベクターバックボーンを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて室温で１時間にわたり連結させた。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるさらなる特性決定のために使用した。
新たにクローン化した発現プラスミドｐＥＶＥ２５６０（図８）は、細菌（大腸菌）複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子、酵素（ピチア・オウメリ）自己複製配列、並びに酵母での選択のためのｐｏＬＥＵ２（ピチア・オウメリ）遺伝子を含むシャトル大腸菌−ピチア・オウメリベクターである。
さらに、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるシュードモナス・チコリィのタガトース−３−エピメラーゼのオープンリーディングフレームは、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限により交換可能である。
実施例８．グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターを構築した。
発現ベクターにクローン化するために、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で切断することによって、グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片をベクター１３ＡＡＹＳＹＰ（図３）から放出させた。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、８０３ｂｐの断片をゲル精製した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２５２３（図７）の９．８ｋｂ ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間連結させた（図９）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌ
ｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３２８４（図１０）は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのコドン最適化ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ｐｏＵＲＡ３選択マーカを含む。
実施例９．ピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
発現ベクターへのサブクローン化のために、ピチア・スチピチス由来のＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片をＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位とフランキングさせなければならなかった。
この目的のために、以下：
−ＥＶ３１０１プライマー
ＡｓｃＩ部位（下線部）を含む
と、
−ＥＶ３１０２プライマー
ＳｐｈＩ（下線部）を含む
を、３０ｎｇのベクター１２ＡＡＬＱＴＰ（図２ｂ）とのＰＣＲ反応に、鋳型として使用した。
適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５５℃で２０秒／７２℃で３０秒を２５サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。
１．１ｋｂのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製してから、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたカラム精製の後、これを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２５２３（図７）の１０．６ｋｂ Ａｓｃ
Ｉ／ＳｐｈＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーン、並びにｐＥＶＥ２５６０（図８）の１１．８ｋｂ ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間連結させた（図１１）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２５６２及びｐＥＶＥ２５６４（図１２）は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるピチア・スチピチスのコドン最適化ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ｐｏＵＲＡ３又はｐｏＬＥＵ２選択マーカのいずれかをそれぞれ含む。
実施例１０．ピチア・スチピチスＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
発現ベクターへのサブクローン化のために、ピチア・スチピチス由来のＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片をＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限部位とフランキングさせなければならなかった。
この目的のために、以下：
−ＡｓｃＩ部位（下線部）を含むＥＶ３１０１
と、
−ＳｐｈＩ（下線部）を含むＥＶ３１０２
を鋳型として３０ｎｇのベクターｌｉｇ７．７８（図２ａ）とのＰＣＲ反応に使用した。
適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で鋳型を増幅した。
ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５５℃で２０秒／７２℃で３０秒を２５サイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長工程により実施した。
１．１ｋｂのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製してから、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した。
ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたカラム精製の後、これを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２５６０（図８）の１０．５ｋｂ ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間連結させた（図１３）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２５６３（図１４）は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるピチア・スチピチスのコドン最適化ＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む。
実施例１１．大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターの構築
大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの過剰発現のためのピチア・オウメリベクターを構築した。
発現ベクターへのクローン化のために、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で切断することによって、コドン最適化大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片をベクター１２ＡＢＹＷＭＰ（図１）から放出させた。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、１．４ｋｂの断片をゲル精製した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２５２３（図７）の９．８ｋｂ ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間かけて連結させた（図１５）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２８３９（図１６）は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされるコドン最適化大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＵＲＡ３選択マーカを含む。
ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータに加えて、大腸菌由来のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼも、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下でクローン化した。
クローン化は、初めに、ｐｏＰＧＫ１プロモータによりリブロースレダクターゼプロモータを置換した後、リブロースレダクターゼターミネータをｐｏＴＫＬターミネータに交換する２つの連続した工程で実施した。
ピチア・オウメリｐｏＰＧＫ１プロモータの長さ６１１ｂｐ断片をピチア・オウメリのゲノムＤＮＡから、以下：
−ＳｐｅＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３１７７
及び
−ＡｓｃＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３１７８
を用いて増幅した。
新しく条斑として生成されたピチア・オウメリコロニーを３０μｌの０．２％ＳＤＳに再懸濁させてから、９５℃で４分間加熱することにより、ゲノムＤＮＡ鋳型を調製した。最高速度の遠心分離の後、０．５μｌの上清をＰＣＲのために使用した。
適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で増幅した。
ＰＣＲは、９６℃で２分の最初の変性工程に続いて、９６℃で１０秒／５８℃で１０秒／７２℃で３０秒を２５サイクルの後、７２℃で２分の最終伸長工程により達成した。
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
増幅した長さ６１０ｂｐのｐｏＰＧＫ１プロモータ断片をＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２８３９（図１６）の１１．５ｋｂ ＳｐｅＩ／ＡｓｃＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間かけて連結させた（図１７）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３１０２（図１８）は、ピチア・オウメリのホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びリブロースレダクターゼターミネータによりフランキングされるコドン最適化大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシ
ドレダクターゼと、ｐｏＵＲＡ３選択マーカを含む。
次の工程では、ｐＥＶＥ３１０２のリブロースレダクターゼターミネータをピチア・オウメリのトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータに換えた。
ピチア・オウメリｐｏＴＫＬターミネータの長さ２１３ｂｐ断片をピチア・オウメリのゲノムＤＮＡから、以下：
−ＳｐｈＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３８１７
及び
−ＳａｃＩＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３８１８
を用いて増幅した。
ゲノムＤＮＡは、前述したように調製した。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。
ＰＣＲは、９６℃で２分の最初の変性工程に続いて、９６℃で１０秒／５７℃で１０秒／７２℃で３０秒を２５サイクルの後、７２℃で２分の最終伸長工程により達成した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
増幅した長さ２１３ｂｐのｐｏＴＫＬターミネータ断片をＳｐｈＩ及びＳａｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ３１０２（図１８）の１１．５ｋｂ ＳｐｈＩ／ＳａｃＩＩ消化及びゲル精製ベクターバックボーンに室温で２時間連結させた（図１７）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３１２３（図１９）は、ピチア・オウメリのホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータによりフランキングされるコドン最適化大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＵＲＡ３選択マーカを含む。
別の選択を用いて、あるプラスミドから大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを発現することを可能にするために、ｐＥＶＥ３１２３のｐｏＵＲＡマーカをｐｏＬＥＵ２マーカに換えた。
この目的のために、ＰｓｉＩ及びＡｆｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）での制限消化により、ｐｏＵＲＡ３マーカをベクターｐＥＶＥ３１２３（図１９）から放出させた。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、９．１ｋｂのベクターバックボーンをゲル精製し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で１５分間平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間実施してから、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化した。
挿入片として、ＡｓｅＩ及びＡｆｅＩ制限消化によりベクターｐＥＶＥ２５６０（図８）から放出されたｐｏＬＥＵ２マーカの３ｋｂの平滑化及びゲル精製断片を使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、断片の連結反応を室温で２時間実施した（図２０）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３１５７（図２１）は、ピチア・オウメリのホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータによりフランキングされるコドン最適化大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む。
実施例１２．ピチア・オウメリ株ＡＴＣＣ２０２０９におけるプラスミド性大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びプラスミド性ピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現
アラビトールからキシリトールへの生合成変換のためには、ＮＡＤ＋特異的大腸菌Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びピチア・スチピチスのＮＡＤＰ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの同時発現が必要である。
第１の酵素は、キシルロースの形成をもたらし、第２の酵素は、キシルロースをキシリトールに変換する。
以下のプラスミド：
−ｐＥＶＥ２８３９（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）及び
−ｐＥＶＥ２５６４（ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）
での形質転換によるキシリトール分泌酵母株の構築のために、ＡＴＣＣ２０２０９に由来し、且つロイシン及びウラシルについて栄養要求性のピチア・オウメリ株ＳＲＬＵ（ＭＡＴｈ− ＬＥＵ２ ｕｒａ３）（Ｐｉｒｅｄｄａ ａｎｄ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，１９９４，前掲）を宿主として使用し、これにより株ＥＹＳ２７５５を取得した。
加えて、対照（国際公開第９４／１０３２５号パンフレットの教示に従う）として、ピチア・スチピチスのＮＡＤＨ特異的野生型キシリトールデヒドロゲナーゼを発現する株も、ＳＲＬＵ宿主への以下のプラスミド：
−ｐＥＶＥ２８３９（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）及び
−ｐＥＶＥ２５６３（ピチア・スチピチスのＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）
での形質転換により構築して、株ＥＹＳ２９６２を取得した。
対照として、以下の単一プラスミド：
−ｐＥＶＥ２８３９（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）、
−ｐＥＶＥ２５６３（ピチア・スチピチスのＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）及び
−ｐＥＶＥ２５６４（ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）
で形質転換した株も作製し、これにより、それぞれＥＹＳ２９４３、ＥＹＳ２６９６及びＥＹＳ２６９７が得られた。
酵母形質転換は、主としてＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｒｅｅｎ Ｅ．Ｄ．，Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｆ．Ａ．，ｃｈａｐｔｅｒ ５ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）のスフェロイプラスト化法により実施したが、以下の改変を加えた：スフェロプラストの生成のために、リチカーゼ（）の代わりに、ザイモリアーゼ１００Ｔを使用し、酵素と一緒に行うインキュベーションは、細胞懸濁液のＯＤが、ザイモリアーゼ処理の前に初期ＯＤの２０〜３０％に達するまで３７℃で実施した。
手短には、ピチア・オウメリ細胞は、ＹＰＤ培地（酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）、ペプトン２％（ｗ／ｖ）、デキストロース２％（ｗ／ｖ））において、３〜５の最終ＯＤ６００まで３０℃で一晩増殖させた。
２００ＯＤ６００単位を遠心分離により採取し、水及び１Ｍソルビトールで１回洗浄してから、７０ＯＤ／ｍｌの最終濃度まで、ＳＣＥバッファー（１Ｍソルビトール、１００ｍＭクエン酸三ナトリウム塩二水和物、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。
ＤＴＴ及びザイモリアーゼ（ＬｕＢｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｕｚｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をそれぞれ１０ｍＭ及び０．５Ｕ／ＯＤの最終濃度まで添加した後、混合物を低速で振盪しながら３７℃でインキュベートした。
細胞壁消化の後、水で希釈した溶液の光学密度を測定した。この値が初期値の８０％まで低下したら、慎重な遠心分離、続いて、１Ｍソルビトール及びＳＴＣバッファー（０．９８Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭＣａＣｌ２）での洗浄によって消化を終了した。
スフェロプラストを、５０μｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＶＷＲ，Ｄｉｅｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＳＴＣバッファー中に２００ＯＤ／ｍｌの最終濃度まで注意深く再懸濁させた。１００μｌのアリコートを１００〜２００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合した後、室温で１０分間インキュベートした。
１ｍｌのＰＥＧ溶液（１９．６％ＰＥＧ８０００ｗ／Ｖ、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）を懸濁液に添加し、１０分間インキュベートした後、ペレット化した。スフェロプラストは、２５％ＹＰＤ及び７ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１Ｍソルビトール溶液１ｍｌ中、３０℃で１〜２時間再生させた。
再生した細胞に、７ｍｌの５０℃の温かい上層寒天（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、ロイシン／ウラシル／ヒスチジン／トリプトファン／メチオニンを含まない０．１３％ドロップアウトパウダー（ｄｒｏｐ−ｏｕｔ ｐｏｗｄｅｒ）、０．０８６‰の必要な欠損アミノ酸、２％グルコース、１Ｍソルビトール、ｐＨ５．８及び２．５％ノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天）を添加してから、混合物を予め温めたソルビトール含有選択プレート（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、ロイシン／ウラシル／ヒスチジン／トリプトファン／メチオニンを含まない０．１３％ドロップアウトパウダー、０．０８６‰の必要な欠損アミノ酸、２％グルコース、１Ｍソルビトール、ｐＨ５．８）上に均等に注いだ。
プレートを３０℃で３〜５日間インキュベートした。形質転換体を適切な選択プレート上で再選択した。
作製した株の各々をアラビトール、キシリトール及びリビトール生産について３回試験した。
この目的のために、クローンをまず種培地（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基；ロイシン／ウラシル／ヒスチジン／トリプトファン／メチオニンを含まない０．１３％ドロップアウトパウダー；０．０８６‰の必要な欠損アミノ酸；５％グルコース；ｐＨ５．７）中に３０℃で一晩増殖させた。
この一晩の培養物から、０．２の出発ＯＤ６００で生産培地（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基；ロイシン／ウラシル／ヒスチジン／トリプトファン／メチオニンを含まない０．１３％ドロップアウトパウダー；０．０８６‰の必要な欠損アミノ酸；１５％グルコース；ｐＨ５．７）中の主要培養物に接種した。
この培養物を３７℃で４８時間増殖させた後、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＷａｔｅｒｓ（登録商標）ＴＱ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（トリプル四重極型検出器（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ（登録商標）ＵＰＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）並びに移動相として１００％水を用いるアイソクラチック条件を用いたＨＰＬＣ／ＭＳにより、上清中のアラビトール、キシリトール及びリビトール濃度を決定した。
試験した株全てのポリオール力価を表８に記載する。
ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの使用により、野生型ＮＡＤＨ特異的酵素と比較して、キシリトール力価の有意な増加がもたらされる。
実施例１３．ピチア・オウメリにおけるプラスミド性グルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現
ピチア・スチピチスのＮＡＤＰ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを用いたキシリトール生産株以外に、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを発現する第２株を作製した。
プラスミドｐＥＶＥ３１５７（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）及びｐＥＶＥ３２８４（グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）での形質転換によるキシリトール分泌酵母株の構築のために、ＡＴＣＣ２０２０９に由来し、且つロイシン及びウラシルについて栄養要求性のピチア・オウメリ株ＳＲＬＵ（ＭＡＴｈ− ｌｅｕ２ ｕｒａ３）（Ｐｉｒｅｄｄａ ａｎｄ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，１９９４，前掲）を宿主として使用し、これにより株ＥＹＳ３３２４を得た。
コントロールとして、以下の単一プラスミド：
−ｐＥＶＥ３１５７（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）及び
−ｐＥＶＥ３２８４（グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）
で形質転換した株も作製し、これにより、それぞれＥＹＳ３０６７及びＥＹＳ３３２３が得られた。
上記株の構築のために用いた大腸菌Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼは、ｐｏＰＧＫ１プロモータにより制御したのに対し、ピチア・スチピチスのキシリトールデヒ
ドロゲナーゼを発現する株にはｐｏＲＲを使用した。
しかし、プロモータの影響を排除するために、従って、グルコノバクター・オキシダンス由来のキシリトールデヒドロゲナーゼを発現する株におけるポリオールレベルと、ピチア・スチピチス由来の対応する酵素を発現するものとの比較を可能にするために、別の株を作製した。
この株ＥＹＳ２９６３は、以下のプラスミド：
−ｐＥＶＥ３１２３（大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ）及び
−ｐＥＶＥ２５６４（ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ）
で、ＳＲＬＵ宿主を形質転換することにより得た。
酵母形質転換は、実施例１２に記載したように実施した。作製した株は各々、実施例１２に記載のように、アラビトール、キシリトール及びリビトール生産について試験した。
全ての試験した株のポリオール力価を表９に記載する。
グルコノバクター・オキシダンス由来のＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを発現する株（ＥＹＳ３３２４）のキシリトール力価は、ピチア・スチピチス由来の対応する酵素を発現する株（ＥＹＳ２９６３）に類似している。しかし、グルコノバクター・オキシダンス酵素は、はるかに低いリビトール力価をもたらすため、キシルロースに対し、より高い基質特異性を示す。
実施例１４．アラビトールの分泌増加を有する変異体ピチア・オウメリ株の作製
より多くのアラビトールを生産する変異体をピチア・オウメリＡＴＣＣ ２０２０９の
ＵＶ照射懸濁液から選択した。
ＵＶ照射系（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ，Ｆｒａｎｃｅ）は、マイクロプロセッサ制御ＲＭＸ−３Ｗ放射計を備えた。ピチア・オウメリを３７℃のＹＰＤ寒天（デキストロース２０ｇ／Ｌ）上で一晩増殖させた。
１０６ｃｆｕ／ｍＬ（ＯＤ６２０＝０．４）に達するように懸濁液を調製した後、５ｍＬを滅菌ペトリ皿に導入した。皿から蓋を外した後、懸濁液を照射した。ＵＶ波長は、２５４ｎｍであり、照射エネルギーは、１．８ １０−２Ｊ／ｃｍ２であった。酵母細胞の９０％の致死率が得られた。放射を停止し、蓋を再度かぶせた後、懸濁液を氷冷浴中に配置した滅菌チューブ中に移した。
２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に突然変異懸濁液を接種してから、３７℃、２５０ｒｐｍで１２時間インキュベートした。
インキュベーション後、突然変異した培養物を滅菌４０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）で希釈した。アリコートを５ｍＬバイアルに分配し、−８０℃で凍結した。
スクリーニングは、非常に高濃度のデキストロース（最大６００ｇ／Ｌ）で増殖することができるピチア・オウメリの浸透圧特性に基づいて実施した。
本発明者らの目的は、デキストロース６００ｇ／Ｌ又は７００ｇ／Ｌを含むＹＰＤ寒天上で母株より速く増殖することができる変異体を選択することであった。
解凍したアリコートをＹＰＤ６００及びＹＰＤ７００上に延ばしてから、最初に出現したコロニーを選択して、振盪フラスコ中のアラビトールの生産について試験した。
継代培養及び生産培地は、それぞれグルコース５０ｇ／Ｌ又は１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４１ｇ／Ｌ及びＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ｐＨ５．７から調製した。継代培養（１００ｍＬフラスコ中１０ｍＬ）を３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。生産培地は、５ｍＬの継代培養物を接種してから、３７℃、２５０ｒｐｍで６４時間インキュベートした。
変異体ピチア・オウメリ株が、その高速なグルコース消費及び高いアラビトール生産のために選択され、２０１２年３月７日フランスで、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４６０５で寄託された。
実施例１５．ＬＥＵ２欠失プラスミドの構築
プラスミド選択及び遺伝子組み込みの目的で、新しく作製したＣＮＣＭ Ｉ−４６０５株を用いることを可能にするために、ＬＥＵ２オープンリーディングフレームの欠失のためのプラスミドを構築した。
第１工程では、ピチア・オウメリに使用することができる一般的組み込みベクターは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＥ／ｌｏｘＰ系から改変した。ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＶ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断によって、ベクターバックボーンをｐＵＧ７３（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，３０，ｅ２３）から単離した。
挿入片として、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリのＬＥＵ２選択マーカを含むＰＣＲ断片を使用したが、これは、以下のプライマー対：
−ＥＶ３０４３
及び
−ＥＶ３０４４
並びに
−鋳型としてのｐｏＡＲＳ（ｐｌｉｇ３−仏国特許第２７７２７８８号明細書−図６を参照）
を用いて作製した。
フォワードプライマーＥＶ３０４３は、ＡｓｃＩ（下線部）部位の次にＳｐｈＩ部位（下線部）、続いて、長さ４８ｂｐのｌｏｘＰ断片（太字）及びＤｒａＩＩＩ部位（下線部）を含む。ＥＶ３０４３の３’末端は、ピチア・オウメリのＬＥＵ２遺伝子の増幅のための長さ２５ｂｐの追加断片を含む。これに対し、リバースプライマーＥＶ３０４４は、ＮｈｅＩ部位（下線部）の次にＮｃｏＩ部位（下線部）、続いて、長さ４８ｂｐのｌｏｘＰ断片（太字）及びＭｌｕＩ部位（下線部）を含む。ＥＶ３０４４の３’末端は、ピチア・オウメリＬＥＵ２遺伝子の増幅のための長さ２５ｂｐの追加断片を含む。適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で鋳型を増幅した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／６５℃で１０秒／７２℃で５０秒を３０サイクルの後、７２℃で７分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
増幅した断片は、さらなるサブクローン化のための第２ＰＣＲ反応において、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＶ部位によりフランキングさせた。増幅は、以下：
−ＰｓｔＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３０５６
及び
−ＥｃｏＲＶ部位（下線部）を含むＥＶ３０５７
を用いて、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／７２℃で４５秒を３０サイクルの後、７２℃で７分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
増幅した２．５ｋｂＬＥＵ２マーカは、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＶ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてゲル精製した後、これを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターｐＵＧ７３の２．４ｋｂ ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ゲル精製済（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ − Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）バックボーンに室温で２時間かけて連結させた（図２２）。ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２７８７（図２３）は、内在性プロモータ及びターミネータの制御下のピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカを含有し、これは２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされている。さらに、ゲノム内の組み込み部位と相同性の領域のクローン化を助けるために、第１ｌｏｘＰの上流にＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ部位を導入し、第２ｌｏｘＰの下流にＮｈｅＩ及びＮｃｏＩ部位を導入した。
次に、内在性ＬＥＵ２オープンリーディングフレームの欠失が意図されたことから、組み込みベクターのＬＥＵ２マーカをストレプトマイセス・ノウルセイのｎａｔ１耐性遺伝子で置換した。
ストレプトマイセス・ノウルセイのｎａｔ１遺伝子をコードするＤＮＡ断片は、配列番号２８の登録配列に従って、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により化学的に合成した。
ｎａｔ１遺伝子をコードする配列Ｓ６０７０６．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｓ６０７０６．１から入手）のヌクレオチド２０４〜７７６を鋳型として使用して、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／から入手したオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）プログラムを用いて、表７（前出）に記載のピチア・オウメリＡＴＣＣ２０２０９での使用のためのコドン最適化に付した。
さらなるクローン化を促進するために、得られた配列の５’及び３’末端に、制限酵素ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）の認識部位をそれぞれコードするヌクレオチドを手作業でテキストファイルに付加した。加えて、酵母のコザック（Ｋｏｚａｋ）様配列における３位のアデノシンを構成するために、開始ＡＴＧの前にアデノシントリプレットを含有させた。
その後、最終配列（配列番号２８）を合成のためにＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に提出した。ｎａｔ１遺伝子をコードする合成ＤＮＡ断片をｐＭＡ−Ｔ由来のベクターに５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡとして送達した（１２ＡＢＴＶ４Ｐ、図２４）。
ｎａｔ１遺伝子のクローン化のために、リブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びターミネータを含むベクターを使用した。ターミネータをオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータにより交換してから、ｎａｔ１遺伝子をプロモータ及びターミネータ配列の間に導入した。
この目的のために、以下：
−ＳｐｈＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３３９３
及び
−ＳａｃＩＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３３９４
並びに
−鋳型としてのｐＥＶＥ２５２３（図７）
を用いたＰＣＲにより、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼターミネータを作製した。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５９℃で１０秒／７２℃で１０秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。２３９ｂｐ ｐｏＵＲＡ３ターミネータは、ＳｐｈＩ及びＳａｃＩＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、ＳｐｈＩ及びＳａｃＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化され、且つＺｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてゲル精製されたｐＥＶＥ２４８１の１１ｋｂベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた。ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
２回目のクローン化工程では、ＳｐｈＩ及びＡｓｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断によって、ｎａｔ１遺伝子を１２ＡＢＴＶ４Ｐ（図２４）から放出させた。さらに、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたＳｐｈＩ部位の平滑化を室温で１５分間実施した後、ＳｐｈＩ及びＡｓｃＩ消化の間に酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。次に、ＳｐｈＩ及びＡｓｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で切断した前述のゲル精製済１０．５ｋｂベクターバックボーンに、５８７ｂｐゲル精製済断片（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ − Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を連結させた。
Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターのＳｐｈＩ部位を室温で１５分間にわたり平滑化した後、ＡｓｃＩでの消化の前に７０℃で１０分間の熱不活性化工程を行った。さらに、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターを３７℃で１時間脱リン酸化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて連結反応を室温で２時間実施した。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２７９８（図２５）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータによりフランキングされるｎａｔ１薬剤耐性マーカを含む。
ｎａｔ１発現カセットを用いて、組み込みベクター内のピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカを置換した。さらなるクローン化を促進するために、ｎａｔ１カセットは、以下：
−プライマーＥＶ３６４３
及び
−プライマーＥＶ３６４４
を用いたＰＣＲにより、ＸｂａＩ（プライマーＥＶ３６４３中の下線部）及びＭｌｕＩ（プライマーＥＶ３６４４中の下線部）部位とフランキングさせなければならなかった。
プライマーＥＶ３６４３は、ＸｂａＩ部位の後に追加ＣｌａＩ部位（点線部）を含む。ｐＥＶＥ２７９８は、鋳型として使用した（図２５）。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５４℃で１０秒／７２℃で２５秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。１．３ｋｂ ｎａｔ１発現カセットをＭｌｕＩ及びＸｂａＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、ＭｌｕＩ及びＸｂａＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化され、且つＺｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製されたｐＥＶＥ２７８７（図２３）の２．６ｋｂベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた（図２６）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２８５２（図２７）は、リブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータの制御下にあり、且つ２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｎａｔ１選択マーカを含む。
組み込みプラスミドは、これまでのところ、ゲノム中への部位特異的組み込みに必要なピチア・オウメリ相同断片を全く含まない。これらの部位は、次の工程で結合させた。
ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム上流の５’相同領域を以下：
−ＰｓｔＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３５４８
及び
−ＳｐｈＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３５４９
を用いて、５０ｎｇのｐｏＡＲＳベクターから増幅した（図６）。
ＰＣＲは、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。増幅は、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／６１℃で１０秒／７２℃で１５秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により達成した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。５６７ｂｐ断片をＰｓｔＩ及びＳｐｈＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化され、且つＺｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製されたｐＥＶＥ２８５２（図２７）の３．９ｋｂベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた（図２９）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２８５５（図２８）は、ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム上流の５’領域と相同性の断片、及び２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｎａｔ１マーカを含む。
ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム下流の３’相同領域を以下：
−ＮｃｏＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３５５０
及び
−ＮｈｅＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３５５１
を用いて、５０ｎｇのｐｏＡＲＳベクターから増幅した（図６）。
ＰＣＲは、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。増幅は、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５１℃で１０秒／７２℃で２５秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により達成した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。１．３ｋｂ断片をＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化され、且つＺｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製されたｐＥＶＥ２８５５（図２８）の４．４ｋｂベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた（図２９）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってさらに特性決定した。
得られた最終ＬＥＵ２欠失プラスミドｐＥＶＥ２８６４（図３０）は、ＬＥＵ２オープンリーディングフレーム上流の５’領域と相同性の断片及び下流の３’領域と相同性の断片、並びに２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｎａｔ１マーカを含む。
実施例１６．ロイシンに対して栄養要求性の変異体ピチア・オウメリ株の作製
作製したピチア・オウメリＣＮＣＭ Ｉ−４６０５株は、これまでのところ、いずれの栄養要求性も呈示しなかったことから、遺伝子組み込みのためにＬＥＵ２選択マーカを使用することができるように、ＬＥＵ２オープンリーディングフレームの欠失を実施した。
この目的のために、プラスミドｐＥＶＥ２８６４（図３０）をＥｃｏＲＶ及びＰｓｔＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で、３７℃にて２．５時間にわたり制限消化した後、混合物を用いて、実施例１２に記載の手順に従って、Ｍｕｔ１６５株を形質転換した。
再生した細胞に、２５μｇ／ｍｌナタマイシンと一緒に、７ｍｌの５０℃の温かい上層寒天（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、１Ｍソルビトール、ｐＨ５．８及び２．５％ノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天）を添加してから、この混合物を、２５μｇ／ｍｌナタマイシンと一緒に、予め温めたソルビトール含有選択プレート（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、１Ｍソルビトール、ｐＨ５．８及び２％寒天）上に均
等に注いだ。プレートを３０℃で４日間インキュベートした。ＬＥＵ２オープンリーディングフレームの欠失を、ロイシンを含まない選択プレート上での増殖しないことにより検証した後、以下：
−プライマーＥＶ３３９３（ＣＡＡＧＣＡＴＧＣＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧ）（配列番号２９）及び
−プライマーＥＶ３７９５（ＣＡＡＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣ）（配列番号３７）
を用いたコロニーＰＣＲにより確認した。
１．６ｋｂの断片を、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５１℃で１０秒／７２℃で２５秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により増幅した。
得られた株は、ＣＮＣＭ Ｉ−４６０５バックグラウンドにおけるＬＥＵ２遺伝子の全オープンリーディングフレーム欠失を含み、これは、２０１５年２月５日にフランスで、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ｏｆ ｔｈｅ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４９５５で寄託された。
実施例１７．ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む二重発現プラスミドの構築
ロイシンだけに対して栄養要求性の変異体ピチア・オウメリ株において、ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの発現を可能にするためには、二重発現プラスミドの構築が必要であった。
ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含む発現カセットを、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断によって、ｐＥＶＥ２５６２（図１２）から放出させた。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、１．９ｋｂ断片をゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で室温にて１５分間平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。次に、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む、１２．１ｋｂのＳｐｅＩ線状化、平滑化、脱リン酸化（アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて３７℃で１時間）及びゲル精製済ｐＥＶＥ３１５７バックボーン（図２１）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で２時間かけて上記の挿入片を連結させた（図３１）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍ
ｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３３１８（図３２）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、並びにｐｏＬＥＵ選択マーカを含む。
実施例１８．ピチア・オウメリにおける大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子及びピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現のための組み込みベクターの構築
大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子及びピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、最終的にピチア・オウメリゲノムの必須部分になる必要がある。そのため、ｐＥＶＥ２８５２のｎａｔ１選択マーカを置換して、アラビトールオキシドレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼの二重発現構築物を組み込むことにより、ＬＥＵ２選択マーカを含む組み込みベクターを構築しなければならなかった。
この目的のために、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２オープンリーディングフレームを、以下：
−プライマーＥＶ３６４５
及び
−プライマーＥＶ３６４６
を用いたＰＣＲにより作製した。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で５０ｎｇのｐｏＡＲＳ（図６）と共に実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５７℃で１０秒／７２℃で２０秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。続いて、増幅したＬＥＵ２オープンリーディングフレームは、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した。
さらに、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたＳｐｈＩ部位の平滑化を室温で１５分間実施した後、ＳｐｈＩ及びＡｓｃＩ消化の間に酵素の熱不活性
化を７０℃で１０分間行った。次に、ＳｐｈＩ及びＡｓｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で切断したｐＥＶＥ２８１１のゲル精製済１１ｋｂベクターバックボーンに、１．１ｋｂゲル精製済断片を連結させた。また、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターのＳｐｈＩ部位を室温で１５分間にわたり平滑化した後、ＡｓｃＩでの消化の前に７０℃で１０分間の熱不活性化工程を行った。さらに、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターを３７℃で１時間脱リン酸化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ＬＥＵ２オープンリーディングフレームとベクターバックボーンの連結反応を室温で２時間にわたり実施した。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２８６２（図３３）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼ（ｐｏＲＲ）プロモータ及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｏＵＲＡ３）ターミネータによりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２選択マーカを含む。
続いて、以下：
−ＣｌａＩ部位を含むプライマーＥＶ３６４３
及び
−ＭｌｕＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ３６４４
並びに鋳型としてのｐＥＶＥ２８６２（図３３）
を用いたＰＣＲにより、ＬＥＵ２選択マーカを増幅した。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／５４℃で１０秒／７２℃で３０秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。増幅した長さ１．８ｋｂのＬＥＵ２断片を、ＣｌａＩ及びＭｌｕＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、ｐＥＶＥ２８５
２（図２７）の２．６ｋｂのＣｌａＩ及びＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）制限消化及びゲル精製済ベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた（図３４）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ２８６５（図３５）は、２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２マーカを含む。
組み込みベクターのクローン化のために、ｐＥＶＥ２８６５をＳａｌＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で１５分間にわたり平滑化した後、７０℃で１０分間にわたる酵素の熱不活性化を行ってから、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、３７℃で１時間かけて脱リン酸化した。
ベクターバックボーンの４．５ｋｂのゲル精製済断片を結合に使用した。挿入片として、ＮｄｅＩ及びＳａｃＩＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）での制限切断によりｐＥＶＥ３３１８（図３２）から放出させたピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの二重発現構築物を使用した。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、４．４ｋｂ断片をゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で室温にて１５分間平滑化した後、７０℃で１０分間の酵素の熱不活性化に続き、さらなるゲル精製を行った。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ｐＥＶＥ２８６５のベクターバックボーン及びｐＥＶＥ３３１８の挿入片を室温で２時間かけて連結させた（図３４）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３３８７（図３６）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物を含む。
実施例１９．培地中にキシリトールを分泌する第１世代組み込みピチア・オウメリ株の構築
大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子とピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子をピチア・オウメリのゲノム中にランダムに組み込むために、以前記載したベクターを使用した。
この目的のために、実施例１２に記載の手順に従って、ロイシンについて栄養要求性の株ＣＮＣＭ Ｉ−４９５５（実施例１６）をＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化したｐＥＶＥ３３８７（図３６）で、３７℃で３時間にわたり形質転換した。ロイシンを一切含まないソルビトールプレート上で、形質転換体を選択した。
得られた株は、ピチア・オウメリゲノム中にランダムに組み込まれた大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子とピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有しており、２０１５年５月２０日フランスで、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ
Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４９８２で寄託された。
実施例２０．グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む二重／三重発現プラスミドの構築
ロイシンだけに対して栄養要求性の変異体ピチア・オウメリ株において、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及び大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの発を可能にするためには、二重発現プラスミドの構築が必要であった。
グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含む発現カセットは、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断によって、ｐＥＶＥ３２８４（図１０）から放出させた。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、１．６ｋｂ断片をゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で室温にて１５分間平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。使用したベクターバックボーンは、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼを含む、１２．１ｋｂのＳｐｅＩ線状化（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及びゲル精製済（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒ
ｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ − Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ｐＥＶＥ３１５７から構成された。
このバックボーンを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で室温にて１５分間平滑化してから、７０℃で１０分間の酵素の熱不活性化の後、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、３７℃で１時間脱リン酸化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で２時間にわたり連結反応を実施した（図３７）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３３２２及びｐＥＶＥ３３２４（図３８）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、又はピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスの２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの三重発現構築物のいずれか、並びにｐｏＬＥＵ選択マーカを含む。
実施例２１．ピチア・オウメリにおける大腸菌ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子及びグルコノバクター・オキシダンスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現のための組み込みベクターの構築
ピチア・スチピチスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子を含む組み込みベクター以外に、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含むプラスミドも作製した。
この目的のために、ＮｄｅＩ及びＳａｃＩＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断によって、グルコノバクター・オキシダンスの１つ又は２ついずれかのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとを含む二重及び三重発現カセットを、ｐＥＶＥ３３２２及びｐＥＶＥ３３２４（図３８）からそれぞれ放出させた。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を
用いて、４．１ｋｂ及び５．７ｋｂ断片をゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で室温にて１５分間にわたり平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。ベクターとして、ゲル精製済（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ−Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の５．７ｋｂ ＳａｌＩ／線状化ｐＥＶＥ２８６５を使用した（図３５）。
さらに、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）でベクターバックボーンを室温にて１５分間平滑化してから、７０℃で１０分間にわたり酵素を熱不活性化した後、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、３７℃で１時間脱リン酸化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で２時間にわたり、ベクターと挿入片の連結反応を実施した（図３９）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３３９０及びｐＥＶＥ３３９２（図４０）は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスの１つ又は２ついずれかのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重若しくは三重発現構築物を含む。選択マーカとして、２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２遺伝子を使用する。
実施例２２．１００ｇ／Ｌ超のキシリトールを分泌することができる第２世代組み込み株の構築
大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子及びピチア・スチピチスＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のランダムに組み込まれたコピーを含む第１世代株ＣＮＣＭ Ｉ−４９８２を用いて、２つの異種酵素のさらなるコピーを組み込んだ。
しかし、上記の構築物の組み込みを可能にするためには、ＬＥＵ２選択マーカを除去しなければならなかった。この目的のために、実施例１２に記載の手順に従って、第１世代株ＣＮＣＭ Ｉ−４９８２をベクターｐＥＶＥ３１６３で形質転換した。ベクターｐＥＶＥ３１６３は、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるバクテリオファージＰ１のＣＲＥリコンビナーゼ（表７に従いコドン最適化）を含む。ＬＥＵ２選択マーカの除去は、ロイシンを含まないプレート上でのクローンが増殖ないことにより確認した。
得られた株ＥＹＳ３８４２は、実施例１２に記載の手順に従って、ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化したｐＥＶＥ３３９０又はｐＥＶＥ３３９２（図４０）で形質転換した。形質転換体は、ロイシンを一切含まないソルビトール上で選択した。
得られた第２世代株ＥＹＳ３９２９は、ゲノム中にランダムに組み込まれた、大腸菌の２つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子と、２つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（１つは、グルコノバクター・オキシダンス由来で、２つ目は、ピチア・スチピチス由来）を含む。これに対し、株ＥＹＥ３９３０は、グルコノバクター・オキシダンスの追加ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
実施例２３．大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの追加遺伝子コピーの組み込みのために用いられるさらなるベクターの構築
さらなる組み込みベクターを構築するために、以下：
−ＳｍａＩ部位を含むプライマーＥＶ４９０４
及び
−ＳｍａＩ部位（下線部）を含むプライマーＥＶ４９０５
並びに
鋳型としてのｐＥＶＥ３３２１
を用いたＰＣＲにより、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ及びグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの二重発現カセットを増幅した。
増幅は、適切な１×バッファー中の０．０２Ｕ／μｌのｉＰｒｏｏｆ（商標）ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に２００μＭの各ｄＮＴＰ及び０．５μＭの各プライマーからなる反応混合物中で実施した。ＰＣＲは、９８℃で３０秒の最初の変性工程に続いて、９８℃で１０秒／６８℃で１０秒／７２℃７５秒を３０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長工程により実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離して、抽出した後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。
増幅した長さ３．９ｋｂの断片を、ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で制限消化した後、線状化された４．４ｋｂのＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で脱リン酸化され、且つゲル精製されたｐＥＶＥ２８６５（図３５）のベクターバックボーンに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、室温で２時間かけて連結させた（図４１）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌ
ｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ４３９０（図４２）は、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｏＰＧＫ１）プロモータ及びトランスケトラーゼ（ｐｏＴＫＬ）ターミネータの制御下にある大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子との二重発現構築物を含む。選択マーカとして、２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるピチア・オウメリＬＥＵ２遺伝子を使用する。
実施例２４．グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及びラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの組み込みのために用いられるベクターの構築
グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及びラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの発現のための追加組み込みベクターを以下のように構築した：第１工程において、２つの上記遺伝子を含む二重発現ベクターを作製した。二重発現カセットを組み込みｌｏｘＰベクターにクローン化した。
ラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を、配列番号４２の登録配列に従って、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により化学的に合成した。
ｄａｌＤ遺伝子をコードする配列ＡＬ６４６０５２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＬ６４６０５２から入手）のヌクレオチド２３１０５４８〜２３０９１５１を鋳型として使用した後、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／から入手したオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）プログラムを用いて、表７（上）に記載のピチア・オウメリＡＴＣＣ ２０２０９での使用のためのコドン最適化に付した。さらなるクローン化を促進するために、得られた配列の５’及び３’末端に、制限酵素ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）の認識部位をコードするヌクレオチドを手作業でテキストファイルに付加した。加えて、酵母のコザック（Ｋｏｚａｋ）様配列における３位のアデノシンを構成するために、開始ＡＴＧの前にアデノシントリプレットを含有させた。
その後、最終配列（配列番号４２）を合成のため、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に提出した。ｄａｌＤ遺伝子をコードする合成ＤＮＡ断片を、ｐＭＡ−ＲＱ由来のベクターに５μｇの凍結乾燥プラスミドＤＮＡとして送達した（１３ＡＢ２ＥＧＰ、図４３）。
ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）での制限消化により、ラルストニア・ソラナケアルム由来のＤ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの１．４ｋｂ断片を放出させた後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でゲル精製
した。次に、ＡｓｃＩ及びＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状化され、且つゲル精製されたｐＥＶＥ２５６０（図８）の１１．８ｋｂバックボーンと、その挿入片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて連結させた（図４４）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ３８９８（図４５）は、ピチア・オウメリのリブロースレダクターゼプロモータ及びターミネータによりフランキングされる、コドン最適化ラルストニア・ソラナケアルムＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼと、ｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む。
次の工程において、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ（ｐｏＰＧＫ）及びリブロースレダクターゼターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼを含む発現カセットを、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）による制限消化により、ｐＥＶＥ３９６０から放出させた。１．８ｋｂ断片を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で１５分間平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。ベクターとして、ゲル精製済（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ−Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の１３．２ｋｂ ＳａｌＩ線状化ｐＥＶＥ３８９８を使用した。さらに、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターバックボーンを室温で１５分間平滑化した後、７０℃で１０分間の酵素の熱不活性化、続いて、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた脱リン酸化を３７℃で１時間実施した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターと挿入片の連結反応を室温で２時間にわたり実施した（図４４）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ４０７７（図４６）は、ピチア・オウメリホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ（ｐｏＰＧＫ）及びリブロースレダクターゼターミネータ（ｐｏＲＲ）によりフランキングされるグルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ピチア・オウメリリブロースレダクターゼプロモータ及び（ｐｏＲＲ）ターミネータの制御下にあるラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの二重発現構築物、並びにｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む。
最後に、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ及びラルストニア・ソラナケアルムのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの二重発現カセットを、ＳａｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた制限切断により、ｐＥＶＥ４０７７から放出させた。５．９ｋｂ断片を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてゲル精製してから、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用い、室温で１５分間平滑化した後、酵素の熱不活性化を７０℃で１０分間行った。ベクターとして、ゲル精製済（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ−Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により３７℃で１時間脱リン酸化した、４．４ｋｂ ＥｃｏＲＶ線状化ｐＥＶＥ２８６５を使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ベクターと挿入片の連結反応を室温で２時間にわたり実施した（図４４）。
ライゲーション混合物によるＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の形質転換後、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した後、これを制限消化及びシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりさらに特性決定した。
得られたプラスミドｐＥＶＥ４３７７（図４７）は、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼと、ラルストニア・ソラナケアルムＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼとの二重発現構築物、並びに２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされるｐｏＬＥＵ２選択マーカを含む。
実施例２５．キシリトールの生産性が増加した第３世代株の構築
第２世代株ＥＹＳ３９２９及びＥＹＳ３９３０（実施例２２）のＬＥＵ２マーカを、実施例１８に記載したようにベクターｐＥＶＥ３１３６を用いてロックスアウトした（ｌｏｘｅｄ ｏｕｔ）。得られた株ＥＹＳ４１１８及びＥＹＳ４１１９をｐＥＶＥ４３７７（図４７）及びｐＥＶＥ４３９０（図４２）でそれぞれ形質転換した。実施例１２に記載の手順に従って、ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で、３７℃にて３時間ベクターを制限消化した。ロイシンを一切含まないソルビトールプレート上で、形質転換体を選択した。
得られた第３世代株ＥＹＳ４３５３は、ランダムにゲノム中に組み込まれた、３つのＮ
ＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子（２つは大腸菌由来で、１つは、ラルストニア・ソラナケアルム由来）と、３つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（２つはグルコノバクター・オキシダンス由来で、１つは、ピチア・スチピチス由来）を含む。
これに対し、２つ目の第３世代株は、大腸菌のＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼの３つのコピーと、グルコノバクター・オキシダンスのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼの３つのコピーと、バックグラウンドであるピチア・スチピチス由来の１つのコピーとを含有し、２０１５年３月５日にフランスで、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４９６０で寄託された。
実施例２６．第４世代株の構築
第３世代株ＣＮＣＭ Ｉ−４９６０（実施例２５）のＬＥＵ２マーカを、ベクターｐＥＶＥ３１６３を用いて、実施例１８に記載のようにロックスアウトした（ｌｏｘｅｄ ｏｕｔ）。得られた株ＥＹＳ４９５５は、実施例１２に記載の手順に従いＮｏｔＩ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で３７℃にて３時間制限消化したｐＥＶＥ４３７７（図４７）で形質転換した。ロイシンを一切含まないソルビトールプレート上で、形質転換体を選択した。
得られた第４世代株は、ゲノム中にランダムに組み込まれた、４つのＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子（３つは大腸菌由来で、１つは、ラルストニア・ソラナケアルム由来）と、４つのＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（３つはグルコノバクター・オキシダンス由来で、１つは、ピチア・スチピチス由来）を含有し、これは、２０１５年５月２０日にフランスで、パスツール国立微生物保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ １５）に番号Ｉ−４９８１で寄託された。
実施例２７．ピチア・オウメリ株を用いたポリオール生産（合成培地）
前述したように構築した酵母株ＣＮＣＭ Ｉ−４６０５、ＣＮＣＭ Ｉ−４９８２、ＣＮＣＭ Ｉ−４９６０及びＣＮＣＭ Ｉ−４９８１を、以下のプロトコルに従って発酵させた。
発酵プロセスは、窒素制限下で実施し、増殖段階と生産成段階に分けることができる。増殖段階において、培地中のアンモニアは、バイオマスを生産するために完全に消費され、バイオマス形成が停止すると、生産段階が開始して、ポリオールレベルが増加する。記載する発酵工程に使用されるプラットフォームは、作業用量１Ｌの容器を用いた、ＩＮＦＯＲＳ ＨＴからのＭｕｌｔｉｆｏｒｓ２であった。発酵槽は、２つのＲｕｓｈｔｏｎ ６−ブレードディスクタービンを備えていた。発酵槽のスパージングのために空気を使用した。
培養全体を通して、温度、ｐＨ、攪拌、及び通気速度を制御した。温度は３６℃に維持した。ｐＨは、５Ｍ ＫＯＨの自動添加によって３に維持した。
通気速度は、１．０ｖｍに維持し、初期撹拌機速度は、３００ｒｐｍに設定した。溶存酸素（ＤＯ）が２０％未満に降下しないように、自動攪拌カスケードを使用した。発酵工程に使用する運転条件を表１０にまとめる。
発酵槽の接種のために、１段階増殖培養物を使用した。使用した増殖培地の組成を表１１に掲載する。増殖培養物は、４つのバッフル（インデント）を備える５００ｍｌ振盪フラスコ中の１００ｍｌの培地を接種することにより調製した。振盪フラスコは、３０℃及び１５０ｒｐｍの振盪テーブル上でインキュベートした。細胞を約２４時間にわたり増殖させて、中間指数増殖期に到らせた。
接種の前に、接種材料の量に相当する量の発酵槽中の培地を取り出し、発酵槽の接種のために、増殖培養物のアリコートを、１Ｌの最終量及び約０．２の開始時ＯＤ６００（Ｏ
Ｄ６００−ａｔ−ｓｔａｒｔ）（ＣＤＷ約０．０３ｇ／Ｌ）まで使用した。発酵槽に使用した培地の組成を表１２に記載する。
サンプルを一定の間隔で採取し、全発酵ブロスをグルコース消費及び細胞外ポリオール（キシリトール、アラビトール及びリビトール）形成について分析した。さらに、一般的発酵代謝物（グリセロール、酢酸塩、エタノール、ピルビン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩及びコハク酸塩）を決定した。バイオマスの増加は、一方で、ＯＤ６００により、他方で、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）決定によって追跡した。前述した測定値は、ポリオール生産、アラビトール又はキシリトール収率及び生産性を決定するために使用し；結果を表１３に示す。
ピチア・オウメリＣＮＣＭ Ｉ−４６０５は、アラビトールのみを生産する。
ピチア・オウメリＣＮＣＭ Ｉ−４９８２は、アラビトール、キシリトール及びリビトールを生産する。この株に、ＮＡＤ＋Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ遺伝子の１つのコピーと、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の１つのコピーを組み込んだ。このとき、修飾株は、アラビトールを消費することができるようになる。その結果、グルコースの完全な消費の後、アラビトール及びリビトールは、ＣＮＣＭ Ｉ−４９８２により再消費されて、より多くのキシリトールを生産する。
ピチア・オウメリＣＮＣＭ Ｉ−４９６０（第３世代）及びＣＮＣＭ Ｉ−４９８１（第４世代）は、キシリトール及びリビトールを生産するが、もはやアラビトールは生産しない。アラビトールのキシルロース及びキシリトールへの細胞内変換は、ブロス中へのアラビトールの排出を回避する上で十分効率的である。
ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール−オキシドレダクターゼ、及びＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピーがピチア・オウメリにより多く導入されるほど、キシリトールの力価、収率及び生産性は高くなる。

Claims (14)

  1. キシリトールを生産することができる組換え宿主細胞であって、
    前記宿主細胞が、ピチア・オウメリ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｈｍｅｒｉ）であり、
    前記宿主細胞が、以下：
    基質としてＤ−アラビトールを用い、生産物としてＤ−キシルロースを生産する、ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする異種核酸配列；及び
    基質としてＤ−キシルロースを用い、生産物としてキシリトールを生産する、ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする異種核酸配列
    を含み、
    前記ＮＡＤ ＋ 特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び／又はラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来であり、配列番号２若しくは４３の群から選択される配列を含み、
    前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨに補助因子特異性を変化させるために突然変異させたピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）又はグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼであり、配列番号５若しくは８の配列を含む、組換え宿主細胞。
  2. 前記宿主細胞が、Ｄ−グルコースからＤ−アラビトールを生産する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
  3. 前記宿主細胞が、唯一の炭素源としてＤ−アラビトールを消費しない、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
  4. 前記宿主細胞が、好浸透圧性又は耐浸透圧性酵母である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  5. 前記ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする配列は、配列番号３又は４２の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  6. 前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列は、配列番号６又は９の配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞が、４８時間の培養後の上清中に少なくとも１５ｇ／ｌのキシリトール力価を生産することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  8. 前記宿主細胞が、ＣＮＣＭに寄託されたＩ−４９８２、Ｉ−４９６０及びＩ−４９８１から選択される株である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  9. 前記宿主細胞が、前記ＮＡＤ＋特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼをコードする配列のいくつかのコピー及び／又は前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列のいくつかのコピーを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  10. 前記宿主細胞が、高浸透圧培地の下で、Ｄ−グルコースからＤ−アラビトールを生産する、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
  11. 前記宿主細胞が、前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列は、コドン特異性を考慮に入れることによって、ピチア・オウメリについて最適化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  12. 前記ＮＡＤ ＋ 特異的Ｄ−アラビトール４−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１１）をコードする配列は、配列番号１、配列番号３又は配列番号４２を含み、
    前記ＮＡＤＰＨ特異的キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号７又は配列番号９を含む、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を培養する工程と、キシリトールを回収する工程とを含む、キシリトールの生産方法。
  14. キシリトールを生産するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞の使用。
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