ES2733650T3 - Producción de xilitol a partir de glucosa mediante una cepa recombinante - Google Patents

Abstract

Una célula hospedante recombinante capaz de producir xilitol, en donde dicha célula hospedante comprende: una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) que usa D-arabitol como sustrato y que produce D-xilulosa como producto; y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH que usa D-xilulosa como sustrato y que produce xilitol como producto, en donde la célula hospedante produce D-arabitol a partir de D-glucosa, en particular en medio a presión osmótica elevada y no consume D-arabitol como única fuente de carbono.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de xilitol a partir de glucosa mediante una cepa recombinante

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para usar microorganismos genéticamente modificados para la producción de xilitol y a un método para preparar un microorganismo genéticamente modificado que es capaz de convertir en una etapa fuentes de carbono fáciles de conseguir, tales como D-glucosa, en xilitol.

Antecedentes de la invención

El xilitol es un polialcohol o alcohol de azúcar (alditol) de fórmula (CHOH)3(CH2OH)2, que se aplica en formulaciones y productos para higiene y nutracéuticos.

El xilitol se usa como un edulcorante diabético que es casi tan dulce como la sacarosa con 33 % menos de calorías. A diferencia de otros edulcorantes naturales o sintéticos, el xilitol es activamente beneficioso para la salud dental ya que reduce las caries hasta un tercio con su uso regular y ayuda a la remineralización.

El xilitol se encuentra naturalmente en concentraciones bajas en las fibras de muchos frutos y hortalizas, y se puede extraer de varias bayas, avena y setas, así como de materiales fibrosos como vainas de maíz y bagazo de caña de azúcar, y abedul.

Sin embargo, la producción industrial comienza a partir de xilano (una hemicelulosa) extraído de maderas duras o zuros de maíz, que se hidroliza en xilosa y se hidrogena catalíticamente en xilitol.

La purificación de la xilosa y también del xilitol, por lo tanto, presenta un problema significativo. Se conocen diversos procesos de este tipo. Las patentes estadounidenses 4.075.406 y 4.008.285 se pueden mencionar como ejemplos. La reducción de D-xilosa en xilitol también se puede lograr en un proceso microbiológico usando cepas de levadura aisladas a partir de cepas naturales (cepas de tipo natural) o genéticamente manipuladas.

Sin embargo, obtener el sustrato, D-xilosa, en una forma adecuada para la fermentación por levadura es un problema porque las fuentes de xilosa económicas tales como licor de sulfito de procesos de pulpa y papel contienen impurezas que inhiben el crecimiento de la levadura.

Un método alternativo atractivo para la producción de xilitol es obtenerlo por medio de la fermentación de un sustrato económico y fácil de conseguir, tal como D-glucosa.

En el estado de la técnica, existen algunos microorganismos recombinantes descritos capaces de producir xilitol en ciertas cantidades durante una fermentación de una etapa de cualesquiera fuentes de carbono comunes distintas de D-xilosa y D-xilulosa.

Estos microorganismos recombinantes, especialmente levaduras osmófilas, son por ejemplo Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha y Torulopsis candida, conocidas inicialmente como productoras de cantidades significativas de una xilitol estrechamente relacionado con pentitol, que es D-arabitol, a partir de D-glucosa (Lewis D.H. & Smith D.C., 1967, New Phytol. 66:143-184).

Por lo tanto, la solicitud de patente internacional WO 94/10325 proporciona métodos para construir dichos hospedantes recombinantes capaces de producir xilitol cuando se cultivan en fuentes de carbono distintas de D-xilulosa o D-xilosa, y distintas de polímeros u oligómeros o mezclas de estos.

En la presente solicitud de patente, este objetivo se logra a través de la modificación del metabolismo del microorganismo deseado, preferiblemente, un microorganismo que es levadura de origen natural, mediante la introducción y expresión de genes heterólogos deseados.

Este objetivo también se logra mediante la modificación adicional del metabolismo de dicho microorganismo deseado, para sobreexpresar e/o inactivar la actividad o expresión de determinados genes homólogos de dicho microorganismo en su estado natural.

El método proporcionado en la presente solicitud de patente para la producción de xilitol utilizó una vía de biosíntesis de D-arabitol alterada, y dicha vía se alteró notablemente al extender la vía de D-arabitol preexistente mediante la introducción y sobreexpresión de los genes que codifican D-arabitol deshidrogenasa formadora de D-xilulosa (EC 1.1.1.11) y xilitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.9) en un microorganismo productor de D-arabitol.

Sin embargo, el rendimiento de xilitol en los ensayos descritos en WO 94/10325 fue de solo aproximadamente 7,7 g/l después de 48 horas de cultivo en un medio con extracto de levadura.

Para intentar optimizar este primer resultado, se propuso adicionalmente en WO 94/10325 inactivar, usando mutagénesis o interrupción génica, los genes que codifican transcetolasa (EC 2.2.1.1) y/o el gen que codifica Dxilulocinasa (EC 2.7.1.17), y también sobreexpresar los genes que codifican las enzimas de la rama oxidativa de la vía de pentosa-fosfato y, específicamente, el gen de D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49) y/o 6-fosfo-D-gluconato deshidrogenasa (EC 1.1.1.44) y/o D-ribulosa-5-fosfato epimerasa (EC 5.1.3.1) en dichos microorganismos.

Pero, independientemente de la combinación genética empleada, el título de xilitol nunca superó los 9 g/l.

Lafayette et al (2005, Plant Cell Report, 24, 596-602) describe una construcción génica que codifica Arabitol deshidrogenasa a partir de Escherichia coli. El documento US2011/027847 describe un gen para la xilitol deshidrogenasa específica para NADP aislado a partir de Pichia stipitis y levadura modificada.

Por consiguiente, todavía existe una necesidad insatisfecha de una mejor manipulación genética de las cepas productoras de xilitol a efectos de optimizar su producción y, por lo tanto, hacerla comercialmente rentable.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a una célula hospedante recombinante capaz de producir xilitol, en donde dicha célula hospedante comprende:

una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) usando D-arabitol como sustrato y que produce D-xilulosa como producto; y,

una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH que usa D-xilulosa como sustrato y que produce xilitol como producto,

en donde la célula hospedante produce D-arabitol a partir de D-glucosa, en particular en medio a presión osmótica elevada y no consume D-arabitol como única fuente de carbono.

Más preferiblemente, la célula hospedante se selecciona de bacterias, hongos y levadura. En una realización preferida, la célula hospedante es una levadura osmófila u osmotolerante, en particular, Pichia ohmeri.

Preferiblemente, la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) es de E. coli o Ralstonia solanacearum. Más preferiblemente, la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 2 o 43 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos. En una realización preferida, la secuencia que codifica la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 3 o 42.

Preferiblemente, la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH es una xilitol deshidrogenasa de Pichia stipitis o Gluconobacter oxydans mutada para cambiar la especificidad para el cofactor de NADH a NADPH. Más preferiblemente, la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 5 u 8 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos. En una realización preferida, la secuencia que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 6 o 9.

Preferiblemente, la célula hospedante es capaz de producir un título de xilitol de al menos 15 g/l en el sobrenadante después de un cultivo de 48 horas.

Preferiblemente, la célula hospedante es una cepa seleccionada de las cepas I-4982, I-4960 y I-4981 depositados en la CNCM.

Preferiblemente, la célula hospedante comprende varias copias de una secuencia que codifica D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y/o varias copias de una secuencia que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH.

La presente invención también se refiere a un método para producir xilitol que comprende cultivar una célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y recuperar xilitol.

La presente divulgación describe adicionalmente un ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident. 1, 3, 7 y 9, un casete de expresión o vector que comprende dicho ácido nucleico.

Finalmente, la presente invención se refiere al uso de una célula hospedante recombinante según la presente invención para producir xilitol.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “fuente de carbono distinta de D-xilosa y D-xilulosa» un sustrato de carbono para la producción de xilitol distinto de D-xilosa y D-xilulosa o polímeros u oligómeros o mezclas de estos (tales como xilano y hemicelulosa). La fuente de carbono incluye, preferiblemente, D-glucosa, y diversos jarabes que contienen D-glucosa y mezclas de D-glucosa con otros azúcares.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “gen” una secuencia de ácido nucleico que puede codificar una proteína, en particular, una secuencia de ADN.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “vector” un plásmido o cualquier otra secuencia de ADN que es capaz de llevar información genética, específicamente ADN, a una célula hospedante. El vector puede contener, además, un marcador o reportero adecuado para su uso en la identificación de células transformadas con el vector, y orígenes de replicación que permiten el mantenimiento y la replicación del vector en uno o más hospedantes procarióticos o eucarióticos. Un “plásmido” es un vector, generalmente ADN circular, que se mantiene y replica de manera autónoma en al menos una célula hospedante.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “vector de expresión” un vector similar a un vector, pero que respalda la expresión de un gen o ácido nucleico codificante que se ha clonado en este, después de la transformación en un hospedante. El gen o ácido nucleico codificante clonado generalmente se coloca bajo el control de (es decir, ligado funcionalmente a) determinadas secuencias de control tales como secuencias promotoras, que se pueden proporcionar mediante el vector o mediante la construcción recombinante del gen clonado. Las secuencias de control de la expresión variarán dependiendo de si el vector se diseña para expresar el gen ligado funcionalmente en un hospedante procariótico o eucariótico y pueden contener, adicionalmente, elementos transcripcionales tales como elementos potenciadores (secuencias de activación posteriores) y secuencias de terminación y/o sitios de iniciación y terminación de la traducción.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “hospedante” una célula, procariótica o eucariótica, que se utiliza como el receptor y vehículo de material recombinante.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “rama oxidativa de la vía de pentosa-fosfato” que se incluye la parte de la derivación de pentosa-fosfato que cataliza reacciones oxidativas, tales como reacciones catalizadas por D-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49) gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), y 6-fosfo-D-gluconato deshidrogenasa (EC 1.1.1.44) y que utiliza sustratos de hexosa para formar pentosa fosfatos. La parte “no oxidativa” de la vía de pentosa-fosfato (que también cataliza la formación neta de ribosa a partir de D-glucosa) se caracteriza por isomerizaciones no oxidativas tales como las reacciones catalizadas por transcetolasa (EC 2.2.1.1), ribosa-5-fosfato isomerasa (EC 5.3.1.6), D-ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa (EC 5.1.3.1) y transaldolasa (EC 2.2.1.2). Véase Biological Chemistry, H.R. Mahler & E.H.Cordes, Harper & Row, publishers, Nueva York, 1966, págs. 448-454.

Según se usa en la presente memoria, se entiende por “ácido nucleico codificante” una molécula de ácido nucleico (preferiblemente ADN). El ácido nucleico codificante es capaz de codificar una proteína y se puede preparar a partir de una variedad de fuentes. Estas fuentes incluyen ADN genómico, ADNc, ADN sintético y combinaciones de estos.

“Heterólogo/a”, según se usa en la presente memoria, significa que un gen o secuencia codificante se ha introducido en la célula mediante manipulación genética. Puede estar presente en forma episómica o cromosómica. El gen o secuencia codificante puede originarse a partir de una fuente diferente de la célula hospedante en la cual se introduce. Sin embargo, también puede venir de la misma especie que la célula hospedante en la cual se introduce, pero se considera heterólogo debido a que su entorno no es natural. Por ejemplo, se llama heterólogo al gen o secuencia codificante debido a que está bajo el control de un promotor que no es su promotor natural, se introduce en una ubicación que difiere de su ubicación natural. La célula hospedante puede contener una copia endógena del gen antes de la introducción del gen heterólogo o puede no contener una copia endógena.

Objeto de la invención

Según la invención, las vías metabólicas naturales de un hospedante microbiano específico se manipulan para reducir o eliminar la utilización de carbono para propósitos distintos de la producción de xilitol.

Dicha cepa hospedante genéticamente modificada, por lo tanto, es capaz de producir xilitol en una etapa de fermentación con un rendimiento elevado. Por ejemplo, el título de xilitol después 48 horas de cultivo en el sobrenadante es mayor que 15 g/l, preferiblemente mayor que 25 g/l, aún más preferiblemente mayor que 50, 60, 70, 80, 90 o 100 g/l .

En la puesta en práctica de la invención, el hospedante genéticamente modificado de la invención también se caracteriza por su capacidad para sintetizar xilitol a partir de fuentes de carbono no relacionadas estructuralmente tales como D-glucosa, y no solo a partir de D-xilosa y/o D-xilulosa.

Preferiblemente, el hospedante genéticamente modificado de la invención también es capaz de secretar el xilitol sintetizado en el medio.

Específicamente, en las realizaciones ejemplificadas y preferidas, el hospedante genéticamente modificado de la invención se caracteriza por una vía en la que arabitol es un intermediario en la formación de xilitol.

Por consiguiente, la cepa hospedante recombinante de la invención se caracteriza por las siguientes alteraciones genéticas:

(1) un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína que posee actividad de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (formadora de D-xilulosa) se ha introducido en la célula hospedante, proporcionando, de esta manera, la conversión de D-arabitol en D-xilulosa; y

(2) un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína que posee actividad de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH se ha introducido en la célula hospedante, proporcionando, de esta manera, la conversión de D-xilulosa en xilitol,

en donde la célula hospedante produce D-arabitol a partir de D-glucosa, en particular en medio a presión osmótica elevada y no consume D-arabitol como única fuente de carbono.

La elección de los microorganismos

Los microorganismos o cepas hospedantes adecuados para la presente invención son capaces de producir D-arabitol a partir de glucosa. Más específicamente, son capaces de producir cantidades significativas de D-arabitol a partir de glucosa en medio a presión osmótica elevada.

Se entiende por “medio a presión osmótica elevada”, en la presente, un medio que contiene 10-60 % de D-glucosa, preferiblemente, aproximadamente 25 % de D-glucosa.

Se entiende por “cantidades significativas de D-arabitol” al menos 100 g/L de D-arabitol. En particular, se considera que un microorganismo o cepa hospedante produce cantidades significativas de D-arabitol cuando el microorganismo o cepa hospedante produce 100g/L de D-arabitol en un medio que contiene 25 % de D-glucosa en condiciones de lote.

Los ejemplos de cepas hospedantes capaces de producir cantidades significativas de D-arabitol a partir de glucosa incluyen levaduras osmófilas u osmotolerantes, en particular, aquellas que pertenecen a las especies Pichia, Kodamaea, Candida, Zygoaccharomyces, Debaromyces, Metschnikowia y Hansenula; o los hongos productores de D-arabitol, en particular, aquellos que pertenecen a las especies Dendryphiella y Schizophyllum, en particular, Dendryphiella salina y Schizophyllum commune.

Los ejemplos de los microorganismos del género Pichia incluyen Pichia ohmeri, Pichia stipitis, Pichia farinosa, Pichia haplophila. Los ejemplos de los microorganismos del género Candida incluyen Candida polymorpha y Candida tropicalis. Los ejemplos de los microorganismos del género Zygoaccharomyces incluyen Zygoaccharomyces rouxii. Otros ejemplos incluyen Torulopsis candida y Torulaspora hansenii. Los ejemplos de los microorganismos del género Metschnikowia incluyen Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia bicuspidata, Metschnikowia lunata y Metschnikowia zobellii. Como cepas específicas, se pueden mencionar Metschnikowia pulcherrima ATCC 18406, Metschnikowia reukaufii At Cc 18407, Metschnikowia bicuspidata ATCC 24179, Metschnikowia lunata ATCC 22033, Metschnikowia zobellii ATCC 22302 y Metschnikowia pulcherrima FERM BP-7161. Estas cepas se pueden obtener en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo, dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América. Metschnikowia pulcherrima FERN BP-7161 se depositó originalmente en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (código postal: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japón) el 16 de enero de 1998, con el número de depósito FERM P-16592 y se transfirió del depósito original al depósito internacional en virtud del Tratado de Budapest el 15 de mayo de 2000, y se ha depositado con el número de depósito FERM BP-7161. En un aspecto específico, el microorganismo tiene el número de acceso FERM BP-7161. Por más información, consulte EP1065276.

El microorganismo se puede manipular genéticamente a efectos de mejorar su capacidad de producir D-arabitol y/o reducir su capacidad de usar D-arabitol para un objetivo distinto de la producción de xilitol.

Para la invención, la cepa hospedante se elige ventajosamente por sus atributos metabólicos específicos:

- puede ser una productora de cantidades significativas de D-arabitol a partir de glucosa, según se detalla anteriormente, en particular, en medio a presión osmótica elevada, por ejemplo, medio que contiene 10-60 % de D-glucosa y, preferiblemente, 25 % de D-glucosa (el medio “Normal” habitualmente contiene solo 2-3 % de glucosa);

- puede no consumir D-arabitol como única fuente de carbono;

- su equilibrio de oxidorreducción permite la generación de los cofactores necesarios para la conversión de alcohol cetopentosa / pentosa correspondiente.

En una realización de la invención, la levadura osmófila Pichia ohmeri (y sus derivados mutagenizados) se ha empleado como modelo y como hospedante preferido. Pichia ohmeri se ha aislado inicialmente a partir de encurtido de pepino y usado comúnmente en la industria alimentaria para la fermentación en conservas, cáscaras y frutos.

El experto en la técnica sabe que las especies de levaduras tales como Pichia, Zygosaccharomyces, Debaromyces y Hansenula son capaces de crecer en entornos con baja actividad de agua, a diferencia de Saccharomyces cerevisiae. Estas levaduras osmotolerantes u osmófilas acumulan soluto compatible similar a glicerol, D-arabitol, eritritol y manitol que protegen y estabilizan las enzimas, permitiendo, de esta manera, las funciones celulares en condiciones de crecimiento osmóticas. Los polioles producidos también tienen una función en el equilibrio de la oxidorreducción.

En un aspecto preferido, el microorganismo es Pichia ohmeri. De hecho, la principal característica de la cepa hospedante Pichia ohmeri es producir solo D-arabitol como soluto compatible, a diferencia de Zygosaccharomyces rouxii productora de glicerol y D-arabitol. Además, la vía metabólica de glucosa a D-arabitol se conoce bien en Pichia ohmeri.

Según se describió, en Zygoaccharomyces rouxii (J.M. INGRAM and W.A. WOOD, 1965, Journal of Bacteriology, tomo 89, n.° 5, 1186-1194), el flujo de carbono en Pichia ohmeri pasa a través de la parte oxidativa de la vía de pentosafosfato (PPP, por sus siglas en inglés) para convertir D-Glucosa en D-ribulosa-5-P con la producción concomitante de dos moléculas de NADPH. La D-ribulosa-5-P se desfosforila en D-ribulosa y luego se reduce a D-arabitol. En la cepa hospedante Pichia ohmeri, la vía de pentosa fosfato (PPP) es muy activa y se ha determinado que supera el 50 %.

En una realización preferida, la célula hospedante es una Pichia ohmeri mutante depositada el 7 de marzo de 2012, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección Nacional de las Culturas de Microorganismos] del Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur roux, 75724 PARIS Cedex 15, con el número I-4605.

Reacciones y enzimas de oxidorreducción

Los cofactores NADH y NADPH son esenciales para múltiples funciones biológicas, actuando en las denominadas reacciones de oxidorreducción como vehículos de electrones de una reacción a otra. Las células necesitan mantener el equilibrio metabólico de los dos pares de oxidorreducción NADH/NAD+ y NADPH/NADP+ sabiendo que el par NADPH/NADP+ se mantiene en un estado más reducido que el par NADH/NAD+ para proporcionar una fuerza propulsora termodinámica. NADH, que en su mayoría se encuentra en la forma oxidada NAD+, es el principal cofactor en reacciones catabólicas donde participa en la liberación oxidativa de energía de los nutrientes. A diferencia de NADH, NADPH se reoxida exclusivamente en reacciones anabólicas o en momentos de estrés oxidativo.

Cualquier estrategia de manipulación metabólica que implique reacciones de oxidorreducción debe funcionar según estas limitaciones celulares. Esto se ha hecho en la cepa genéticamente modificada que es objeto de la invención.

Según halló la inventora, y se describe notablemente en su tesis de doctorado titulada “Contribution a l'étude du metabolisme des pentitols chez Pichia ohmeri” (Sophie Huchette, University of Sciences and Technics of Lille, 1992), se ha demostrado que las reacciones que participan en la oxidorreducción de cetopentosas se catalizan mediante dos enzimas diferentes.

Por lo tanto, la cepa hospedante tiene una enzima definida como D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADPH, formadora de D-arabitol a partir de D-ribulosa y formadora de xilitol a partir de D-xilulosa. La cepa hospedante también posee una D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADH, formadora de ribitol y xilitol, respectivamente, a partir de D-ribulosa y D-xilulosa. Esta enzima es próxima a la conocida xilitol deshidrogenasa específica para NAD+ E.C 1.1.1.9 de Pichia stipitis (XYL2). Dado que solo hay D-ribulosa intracelular disponible con respecto a D-xilulosa, la cepa hospedante equilibra el par de oxidorreducción NADPH/NADP+ directamente con la reoxidación de NADPH a través de la formación citosólica de D-arabitol a partir de D-ribulosa. A continuación, se secreta D-arabitol en el caldo a través de una difusión pasiva.

Los inventores hallaron que la falta de D-xilulosa intracelular sería la principal razón para la no producción de xilitol por parte de la cepa hospedante, incluso si Pichia ohmeri posee todas las herramientas enzimáticas para producir este poliol a través de D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADH o NADPH.

De hecho, se eligió clonar en la cepa hospedante natural Pichia ohmeri un gen codificante de una proteína que posee actividad de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica de NAD+ (formadora de D-xilulosa) (E.C.1.1.1.11) permitiendo que el D-arabitol citosólico se convirtiera en D-xilulosa y NADH.

Por lo tanto, la D-xilulosa intracelular se vuelve disponible en la cepa genéticamente modificada y podría reducirse mediante la D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADH y NADPH intrínseca. Sin embargo, la cepa carece de las enzimas endógenas capaces de transformar de manera eficaz D-xilulosa en xilitol. Por consiguiente, es necesario manipular genéticamente la cepa para introducir una xilitol deshidrogenasa heteróloga.

En la patente WO 94/10325, se eligió clonar la xilitol deshidrogenasa específica para NAD+ (E.C 1.1.1.9) de Pichia stipitis (XYL2) permitiendo la producción de xilitol y equilibrando el par de oxidorreducción NADH/NAD+ con la oxidación de NADH producido por la etapa metabólica previa. Pero como se mencionó antes, los resultados no son realmente convincentes.

Los inventores hallaron que, al clonar un gen que codifica una proteína mutada que posee xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, la D-xilulosa se convierte en xilitol para equilibrar el par de oxidorreducción NADPH/NADP+ tal como se hace mediante la producción intrínseca de D-arabitol a partir de D-ribulosa.

Debido a su baja afinidad de la D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADPH con D-arabitol, la cepa hospedante natural Pichia ohmeri no consume el D-arabitol extracelular.

Debido a la introducción de una actividad de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (formadora de D-xilulosa) en la cepa genéticamente modificada, el D-arabitol producido en el caldo podría ser consumido por la cepa modificada de la misma forma que el D-arabitol citosólico.

En consecuencia, el xilitol se produce al mismo tiempo a partir del D-arabitol intracelular y extracelular.

Su producción se podría mejorar al potenciar la eficacia de la extensión de la vía del xilitol para evitar completamente la exportación del D-arabitol intermediario.

Por lo tanto, se produciría solo xilitol a partir de D-glucosa con el mismo efecto fisiológico que D-arabitol. Esta mejora podría resultar de las modificaciones genéticas, pero también de la adaptación de las condiciones de cultivo.

La elección de las dos actividades enzimáticas que se clonarán en la cepa hospedante

La elección de estas dos actividades enzimáticas se fundamenta por su especificidad de cofactor, según se describe anteriormente.

La primera enzima oxida D-arabitol en D-xilulosa.

Se conocen dos tipos de D-arabitol deshidrogenasas: Formadora de D-xilulosa (EC 1.1.1.11) (D-arabinitol:4-oxidorreductasa NAD+) y formadora de D-ribulosa (EC 1.1.1.250). A menos que se indique de cualquier otra manera, en la presente memoria se pretende usar la deshidrogenasa formadora D-xilulosa y se denomina en la presente memoria arabitol deshidrogenasa. Las deshidrogenasas formadoras de D-ribulosa se encuentran en levaduras y hongos naturales.

Las arabitol deshidrogenasas formadoras de D-xilulosa se conocen principalmente en bacterias. Por ejemplo, se han identificado en Enterobacteriaceae, en particular E. coli, Klebsiella aerogenes, y Aerobacter aerogenes cepa PRL-R3, en Gluconobacter oxydans y adicionalmente también en Pichia stipitis. En particular, se mencionan diversas enzimas en la base de datos UniprotKB, tales como, Klebsiella pneumoniae (n.° 052720), Ralstonia solanacearum (n.° P58708), Yersinia pestis (n.° P58709), Aerobacter aerogenes (n.° L8BEF0), E. coli (n.° K3EX35, I2ZSJ5, W1BYD6, W1H8N7, E7U4R7).

A los efectos de la presente invención, Escherichia coli es la fuente preferida del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (formadora de D-xilulosa). Más específicamente, su secuencia de aminoácidos se describe en la sec. con núm. de ident. 2. En particular, las secs. con núms. de ident. 1 y 3 describen ácidos nucleicos que codifican D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de Escherichia coli. La secuencia codificante se ha optimizado para Pichia ohmeri al tomar en cuenta su especificidad codónica.

Además, Ralstonia solanacearum es también una fuente preferida del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (formadora de D-xilulosa). Más específicamente, su secuencia de aminoácidos se describe en la sec. con núm. de ident. 43. En particular, la sec. con núm. de ident. 42 describe ácidos nucleicos que codifican D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de Ralstonia solanacearum. La secuencia codificante se ha optimizado para Pichia ohmeri al tomar en cuenta su especificidad codónica.

La segunda enzima convierte D-xilulosa en xilitol.

Aunque la mayoría de las levaduras y hongos poseen un gen endógeno de xilitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.9), el cambio de su especificidad de cofactor de NADH a NADPH es necesario para la implementación de la presente invención. De hecho, un aspecto esencial de la presente invención es el uso de una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. Además, esta enzima preferiblemente se sobreexpresa en el hospedante.

Se conocen numerosas xilitol deshidrogenasas y diversos artículos científicos enseñan cómo cambiar la especificidad de cofactor de NADH a NADPH. Watanabe et al (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10340-10345) describen una xilitol deshidrogenasa mutada de Pichia stipitis con una especificidad de cofactor modificada, especialmente el mutante triple (D207A/I208R/F209S) y el mutante cuádruple (D207A/I208R/F209S/N211R). La secuencia de aminoácidos del mutante cuádruple se describe en la sec. con núm. de ident. 5. Un mutante doble de xilitol deshidrogenasa de Gluconobacter oxydans (D38S/M39R) con una especificidad de cofactor para NADPH se describe en Ehrensberger et al (2006, Structure, 14, 567-575). La secuencia de aminoácidos del mutante doble se describe en la sec. con núm. de ident. 8.

Los inventores han preparado la mutación y la clonación de la secuencia de ácido nucleico de Pichia stipitis XYL2 que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. En particular, las secs. con núms. de ident. 4 y 6 describen ácidos nucleicos que codifican xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis.

Alternativamente, los inventores también han llevado a cabo la mutación y la clonación de la secuencia de ácido nucleico de Gluconobacter oxydans que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. En particular, las secs. con núms. de ident. 7 y 9 describen ácidos nucleicos que codifican xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans. La secuencia codificante se ha optimizado para Pichia ohmeri al tomar en cuenta su especificidad codónica.

Casete de expresión, vector y célula hospedante recombinante

En un aspecto específico, la presente descripción se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante optimizada para Pichia ohmeri seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident. 1, 3, 7, 9 y 42.

También se refiere a un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante optimizada para Pichia ohmeri seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident. 1, 3, 7, 9 y 42.

Se refiere, además, a la construcción de ácido nucleico de la sec. con núm. de ident. 4 y un ácido nucleico que comprende dicha construcción de ácido nucleico.

Además, se refiere a un vector recombinante, en particular un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico o casete de expresión. Generalmente, un casete de expresión comprende todos los elementos necesarios para la transcripción y traducción del gen en una proteína. En particular, comprende un promotor, opcionalmente un potenciador, un terminador de la transcripción y los elementos para la traducción. Más particularmente, el promotor que se usa para controlar la expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH se selecciona para accionar una expresión intensa. De hecho, esta enzima preferiblemente se sobreexpresa en la célula hospedante. Dichos promotores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el promotor podría ser el promotor de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) o el fosfoglicerato cinasa de P. ohmeri (poPGK1).

Se refiere a un vector recombinante, en particular un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y un ácido nucleico que codifica xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. También se refiere a un kit que comprende un vector recombinante, en particular un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y un vector recombinante, en particular un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica xilitol deshidrogenasa específica para NADPH.

Preferiblemente, dichas D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y xilitol deshidrogenasa específica para NADPH se seleccionan entre las enzimas descritas anteriormente. En particular, dicha D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 2 o 42 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos. En particular, dicha xilitol deshidrogenasa específica para NADPH comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 5 u 8 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos.

Un vector preferido es un plásmido. Los plásmidos adecuados son conocidos para el experto en la técnica y, por ejemplo, se pueden seleccionar entre aquellos descritos específicamente en los Ejemplos.

El hospedante genéticamente modificado de la invención se produce primero mediante la clonación de los genes que codifican la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH bajo el control de promotores adecuados en un vector recombinante y se introduce en la célula hospedante del organismo productor de D-arabitol mediante transformación.

La presente divulgación se refiere a una célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. La D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ usa D-arabitol como sustrato y produce D-xilulosa como producto. La xilitol deshidrogenasa específica para NADPH usa D-xilulosa como sustrato y produce xilitol. La secuencia codificante de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ puede ser episómica o se puede integrar en el cromosoma de la célula hospedante. De hecho, los transformantes genéticamente estables se construyen preferiblemente a través de sistemas de transformación que usan un vector, por medio del cual se integra un ADN deseado en el cromosoma hospedante. Dicha integración se produce de novo dentro de la célula o puede ser asistida por transformación con un vector que se inserta funcionalmente en el cromosoma hospedante, con elementos de ADN que promueven la integración de secuencias de ADN en los cromosomas.

La célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada puede comprender varias copias de una secuencia que codifica una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y/o varias copias de una secuencia que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, preferiblemente, integrada en el cromosoma de la célula hospedante. En particular, la célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada puede comprender dos, tres o cuatro secuencias que codifican una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y/o dos, tres o cuatro secuencias que codifican la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. Por ejemplo, la célula hospedante puede comprender dos o tres D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ de E. coli y/o una o dos D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ de R. solanacearum, más específicamente, dos o tres D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ de E. coli y/o una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum. Las D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes. Los xilitoles deshidrogenasas específicas para NADPH pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes. Por ejemplo, la célula hospedante puede comprender uno, dos o tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH de P. stipitis y/o uno, dos o tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH de G. oxydans, más específicamente, una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y/o tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH de G. oxydans.

En un aspecto particular de la descripción, la célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada es una cepa de Pichia ohmeri que comprende:

- dos D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ y dos xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH; o

- dos D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ de E. coli y dos xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH, una de P. stipitis y la otra de G. oxydans; o

- dos D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ y tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH; o

- dos D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ de E. coli y tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH, una de P. stipitis y dos de G. oxydans; o

- tres D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ y tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH; o

- tres D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+, dos de E. coli y una de R. solanacearum, y tres xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH, una de P. stipitis y dos de G. oxydans; o

- cuatro D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+ y cuatro xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH; o

- cuatro D-arabitol 4-oxidorreductasas específicas para NAD+, tres de E. coli y una de R. solanacearum, y cuatro xilitol deshidrogenasas específicas para NADPH, una de P. stipitis y tres de G. oxydans.

La célula hospedante se selecciona entre los microorganismos detallados anteriormente. En una realización preferida, la célula hospedante es Pichia ohmeri. La célula hospedante de partida preferiblemente es la Pichia ohmeri mutante depositada en la CNCM con el número 1-4605.

En un aspecto específico de la invención, la célula hospedante es una cepa seleccionada de las cepas I-4982, I-4960 e I-4981 depositadas en la CNCM.

La presente invención se refiere a un método para producir xilitol que comprende cultivar la célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada en un medio de cultivo y recuperar el xilitol producido. Preferiblemente, el medio de cultivo proporciona al microorganismo la fuente de carbono conveniente. La fuente de carbono incluye, preferiblemente, D-glucosa, y diversos jarabes que contienen D-glucosa y mezclas de D-glucosa con otros azúcares. El método puede comprender, además, una etapa de purificación del xilitol.

La presente invención se refiere al uso de una célula hospedante recombinante o genéticamente manipulada como se describe en la presente memoria para producir xilitol.

El xilitol producido por dichas cepas genéticamente modificadas se puede purificar del medio de los hospedantes de la invención según cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, US 5.081.026 describe la separación cromatográfica de xilitol de los cultivos de levadura. Por lo tanto, a partir de la etapa de fermentación, se puede purificar el xilitol del medio de cultivo usando etapas cromatográficas según se describe en US 5.081.026, seguido de cristalización.

Otros rasgos característicos y ventajas de la invención serán evidentes tras la lectura de los siguientes Ejemplos. Sin embargo, se proporcionan en la presente solo como ejemplo y no son limitantes.

Figuras y secuencias

Figura 1: 12 ABYWMP: Mapa de restricción de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ sintetizada a partir de E. coli flanqueada por los sitios de restricción AscI y SphI.

Figura 2a: lig7.78: Mapa de restricción de la xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis.

Figura 2b: 12AALQTP: Mapa de restricción de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH sintetizada a partir de Pichia stipitis flanqueada por los sitios de restricción HindIII y SacII.

Figura 3: 13AAYSYP: Mapa de restricción de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH sintetizada a partir de Gluconobacter oxydans flanqueada por los sitios de restricción AscI y SphI.

Figura 4: Construcción de un casete de expresión que consiste en un marco de lectura abierto flanqueado por un promotor y terminador poRR usando PCR de superposición.

Figura 5: 12 AAMCJP: Mapa de restricción de la tagatosa-3-epimerasa sintetizada de Pseudomonas cichorii flanqueada por los sitios de restricción HindIII y SacII.

Figura 6: Construcción de vectores versátiles de P. ohmeri con marcadores de selección poLEU2 y poURA3.

Figura 7: pEVE2523: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri poURA3 pEVE2523, con un casete de expresión clonado que contiene el marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 8: pEVE2560: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri poLEU2 pEVE2560, con un casete de expresión clonado que contiene el marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 9: Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans.

Figura 10: pEVE3284: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE3284, con un casete de expresión clonado que contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 11: Construcción de vectores de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis.

Figura 12: pEVE2562/pEVE2564: Mapa de restricción de los vectores de expresión de P. ohmeri pEVE2562/pEVE2564, con un casete de expresión clonado que contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri con ya sea un marcador de selección poURA3 o poLEU2, respectivamente.

Figura 13: Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis.

Figura 14: pEVE2563: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE2563, con un casete de expresión clonado que contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 15: Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri usando un marcador de selección poURA3.

Figura 16: pEVE2839: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE2839, con un casete de expresión clonado que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 17: Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri usando un marcador de selección poURA3.

Figura 18: pEVE3102: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE3102, con un casete de expresión clonado que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli flanqueado por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 19: pEVE3123: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE3123, con un casete de expresión clonado que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli flanqueado por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGKI) y un terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohm eriy un marcador de selección poURA3.

Figura 20: Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri usando un marcador de selección poLEU2.

Figura 21: pEVE3157: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE3157, con un casete de expresión clonado que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli flanqueado por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y un terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri y un marcador de selección poLEU2.

Figura 22: Construcción de un vector loxP de P. ohmeri con un marcador de selección poLEU2

Figura 23: pEVE2787: Mapa de restricción del vector de integración pEVE2787 de P. ohmeri, con un marcador de selección LEU2 de P. ohmeri clonado bajo el control del promotor y terminador endógenos, flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 24: 12ABTV4P: Mapa de restricción del gen n a tl sintetizado a partir de Streptomyces noursei flanqueado por los sitios de restricción AscI y SphI.

Figura 25: pEVE2798: Mapa de restricción del vector de expresión pEVE2798 de P. ohmeri, con un marcador nat1 clonado bajo el control de un promotor de ribulosa reductasa (poRR) y un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3).

Figura 26: Construcción de un vector loxP de P. ohmeri con un marcador de selección nat1.

Figura 27: pEVE2852: Mapa de restricción del vector de integración pEVE2852 de P. ohmeri, con un marcador nat1 clonado bajo el control de un promotor de ribulosa reductasa (poRR) y un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3), flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 28: pEVE2855: Mapa de restricción del vector de integración pEVE2855 de P. ohmeri, con un fragmento clonado homólogo a la región hacia 5' anterior al marco de lectura abierto de LEU2 y un marcador de selección nat1 flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 29: Construcción de un vector loxP de P. ohmeri para la eliminación del marco de lectura abierto de LEU2. Figura 30: pEVE2864: Mapa de restricción del vector de integración pEVE2864 de P. ohmeri, con un fragmento clonado homólogo a la región hacia 5' anterior al marco de lectura abierto de LEU2 y fragmento homólogo a la región hacia 3' posterior al marco de lectura abierto de LEU2 y un marcador de selección nat1 flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 31: Construcción de plásmidos de doble expresión que comprenden la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Figura 32: pEVE3318: Mapa de restricción del vector de expresión pEVE3318 de P. ohmeri, que contiene la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Figura 33: pEVE2862: Mapa de restricción del vector de expresión pEVE2862 de P. ohmeri, que contiene el marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por un promotor de ribulosa reductasa (poRR) y un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3) de P. ohmeri.

Figura 34: Construcción de un vector integrador para la expresión genómica del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis en P. ohmeri. Figura 35: pEVE2865: Mapa de restricción del vector de integración pEVE2865 de P. ohmeri, que contiene el marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 36: pEVE3387: Mapa de restricción del vector de integración pEVE3387 de P. ohmeri, que contiene la construcción de doble expresión del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli con un marcador de selección LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 37: Construcción de plásmidos de doble/triple expresión que comprenden la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Figura 38: pEVE3322/pEVE3324: Mapa de restricción de los vectores de expresión pEVE3322/pEVE3324 de P. ohmeri, que contienen la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G.

oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli o la construcción de triple expresión de dos genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y uno de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Figura 39: Construcción de un vector integrador para la expresión genómica del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans en P. ohmeri.

Figura 40: pEVE3390/pEVE3392: Mapa de restricción de los vectores de integración pEVE3390/pEVE3392 de P. ohmeri, que contienen la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli o la construcción de triple expresión de dos genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y uno de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli con un marcador de selección LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 41: Construcción de un vector integrador para la expresión genómica del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans en P. ohmeri.

Figura 42: pEVE4390: Mapa de restricción del vector de expresión pEVE4390 de P. ohmeri, que contiene la construcción de doble expresión de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans con un marcador de selección LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Figura 43: 13AB2EGF: Mapa de restricción de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ sintetizada a partir de R. solanacearum flanqueada por los sitios de restricción AscI y SphI.

Figura 44: Construcción de un vector integrador para la expresión genómica del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans en P. ohmeri

Figura 45: pEVE3898: Mapa de restricción del vector de expresión de P. ohmeri pEVE3898, con un casete de expresión clonado que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de Ralstonia solanacearum flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri.

Figura 46: pEVE4077: Mapa de restricción del vector de expresión pEVE4077 de P. ohmeri, con una construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum.

Figura 47: pEVE4377: Mapa de restricción del vector de integración pEVE4377 de P. ohmeri, con una construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum y el marcador de selección poLEU2 flanqueado por dos sitios loxP.

LISTADO DE SECUENCIAS

Ejemplos

Ejemplo 1. Elección de una cepa de Pichia ohmeri como hospedante preferida para la manipulación genética Como cepa hospedante elegida, Pichia ohmeri:

- es una productora de cantidades significativas de arabitol a partir de glucosa, en medio a presión osmótica elevada, por ejemplo, medio que contiene 10-60 % de D-glucosa y, preferiblemente, 25 % de D-glucosa (el medio “Normal” habitualmente contiene solo 2-3 % de glucosa).

- tiene un equilibrio de oxidorreducción que permite la generación de los cofactores necesarios.

Como ilustración de sus rendimientos, las siguientes tablas indican las actividades enzimáticas que participan en la vía metabólica del arabitol de Pichia ohmeri (Sophie HUCHETTE Thesis, 1992)

La vía de hexosa monofosfato: de glucosa-6-P a D-ribulosa-5-P y D-xilulosa-5-P

La parte oxidativa de la PPP, también denominada vía de hexosa monofosfato (HMP, por sus siglas en inglés), es una vía productora de NADPH. Las dos enzimas dependientes de NADP+ que son glucosa-6-P deshidrogenasa (E.C.1.1.1.49) y 6-P-gluconato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.44) participan en la oxidación de 1 mol de glucosa-6-P en 1 mol de D-ribulosa-5-P y generan 2 moles de NADPH.

Tabla 1

Vía de hexosa monofosfato en P. ohmeri ATCC 20209

Enzimas Actividad específica U/mg

G6P deshidrogenasa NADP+ 1,5

6PG deshidrogenasa NADP+ 0,55

Una unidad de actividad enzimática se definió como el consumo de 1 pmol de NAD(P)H o NAD(P)+ por minuto por mL de extracto bruto. Una unidad de actividad específica se definió como una unidad de actividad enzimática por mg de proteínas en el extracto bruto.

Se determinaron los parámetros cinéticos de las siguientes enzimas: D-ribulosa-5-P 3-epimerasa (E.C 5.1.3.1), D-ribosa-5-P ceto-isomerasa (E.C.5.3.1.6), transcetolasa (E.C.2.2.1.1) y fosfatasas ácidas (E.C. 3.1.3.2).

Tabla 2

Parámetros cinéticos de enzimas usando D-Ribulosa-5-P como sustrato en P. ohmeri ATCC 20209 Enzimas K^m mM V^m U/mg D-Ribulosa-5-P 3-epimerasa 6,3 3

D-Ribosa-5-P ceto-isomerasa 0,35 1,8 Fosfatasa ácida 4,3 0,65 Una unidad de actividad enzimática se definió como el consumo de 1 pmol de NAD(P)H o NAD(P)+ por minuto por mL de extracto bruto. Una unidad de actividad específica se definió como una unidad de actividad enzimática por mg de proteínas en el extracto bruto.

Tabla 3

In vivo, D-xilulosa-5-P, sintetizada a partir de la epimerización de D-ribulosa-5-P, ingresa de manera eficaz en la parte no oxidativa de la PPP a través de la transcetolización. En consecuencia, D-xilulosa-5-P no está disponible para su desfosforilación en D-xilulosa.

D-cetopentosa-oxidorreductasas específicas para NADH y NADPH

D-ribulosa y D-xilulosa se producen por la desfosforilación de D-ribulosa-5-P y D-xilulosa-5-P.

Las constantes de Michaelis-Menten destacan las afinidades de las D-cetopentosa-oxidorreductasas con NADH y NADPH para cada sustrato y las velocidades máximas correspondientes.

Tabla 4

La D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADH, formadora de ribitol y xilitol, respectivamente, a partir de D-ribulosa y D-xilulosa, exhibe una afinidad más alta con D-xilulosa que con D-ribulosa. La reacción inversa muestra una buena afinidad con xilitol y ribitol, lo que explica el buen crecimiento de la cepa hospedante en estos dos polioles.

Tabla 5

Parámetros cinéticos de D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADPH de P. ohmeri ATCC 20209

Sustrato Km mM Vm U/mg

D-ribulosa 72 3,4

D-Arabitol 1300 0,8

D-xilulosa 262 1,5

Xilitol 200 0,15

Una unidad de actividad enzimática se definió como el consumo de 1 pmol de NAD(P)H o NAD(P)+ por minuto por mL de extracto bruto. Una unidad de actividad específica se definió como una unidad de actividad enzimática por mg de proteínas en el extracto bruto.

La D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADPH, formadora de D-arabitol a partir de D-ribulosa y formadora de xilitol a partir de D-xilulosa exhibe una afinidad más alta con D-ribulosa que con D-xilulosa. La reacción inversa muestra una afinidad muy baja con D-arabitol, lo que explica el no crecimiento de la cepa hospedante en este poliol.

Las dos cetopentosa-oxidorreductasas de la cepa hospedante se caracterizaron como diferentes de las enzimas previas descritas en Saccharomyces rouxii por Ingram and Wood, 1965 (Journal of Bacteriology, tomo 89, n.° 5, 1186­ 1194). De hecho, en Saccharomyces rouxii, no se detectó reacción directa en D-ribulosa y NADH y se detectó una reacción inversa en D-arabitol con NADPH.

La relación de Haldane predice las conductas cinéticas enzimáticas in vivo.

Tabla 6

Las dos enzimas favorecen la reacción directa (oxidación de D-cetopentosa) con respecto a la reacción inversa (reducción de pentitol).

La PPP en la cepa hospedante es extremadamente eficaz y se generan 2 moles de NADPH a partir de 1 mol de glucosa consumido. En consecuencia, habría un exceso de NADPH disponible para reacciones anabólicas y reacciones de mantenimiento. La cepa hospedante debe producir D-arabitol a partir de D-ribulosa o xilitol a partir de D-xilulosa para equilibrar el par de oxidorreducción NADPH/NADP+.

El efecto inhibidor de NADP+ sobre la D-cetopentosa-oxidorreductasa específica para NADPH se ha determinado in vitro. La actividad es 80 % menor cuando se agrega un exceso de NADP+. Incluso si esta concentración no es compatible con la concentración de NADP+ intracelular, este resultado proporciona una perspectiva sobre la función de la D-cetopentosa oxidorreductasa específica para NADPH en el equilibrio del par de oxidorreducción NADPH/NADP+.

La cepa hospedante produce solo D-arabitol a partir de D-ribulosa dado que D-xilulosa no está disponible debido al ingreso de D-xilulosa-5-P en la parte no oxidativa de la PPP.

La relación entre la producción de D-arabitol y el equilibrio de oxidorreducción de NADPH/NADP+ se ha demostrado en la cepa hospedante al evaluar el impacto de la sobreexpresión de Glucosa-6-P deshidrogenasa sobre la producción de D-arabitol. Por consiguiente, la cepa obtenida alberga una actividad de G6PDH 1,5 veces más alta y produce 10 % más de D-arabitol en comparación con la cepa hospedante (FR2772788).

Ejemplo 2. Uso de codones de Pichia ohmeri

El uso de codones de P. ohmeri se determinó a partir del ADN disponible y la secuencia de aminoácidos correspondiente de cinco genes de P. ohmeri: transcetolasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (FR 2772788), ribulosa reductasa, beta-isopropilmalato deshidrogenasa - LEU2 (Piredda and Gaillardin, Yeast, tomo 10:1601-1612 (1994) y orotidina-5'-fosfato descarboxilasa - URA3 (Piredda and Gaillardin, 1994, supra).

Cada gen individual se dividió en tripletes nucleotídicos que codifican un único aminoácido. Los cinco genes consistían en un total de 2091 codones.

Para cada aminoácido, se contó la cantidad de cada codón presente en los cinco genes, dividida entre 2091 y multiplicada por 1000. De este modo, se estimó la frecuencia de un codón específico en 1000 codones.

El uso de codones preliminar de P. ohmeri se representa en la Tabla 7.

Todos los genes heterólogos expresados en P. ohmeri, excepto la xilitol deshidrogenasa de P. stipitis, se optimizaron por codón usando esta tabla y el programa Optimizer obtenido de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

La secuencia obtenida se envió para síntesis génica después de la adición manual de sitios de reconocimiento para enzimas de restricción en los respectivos extremos 5' y 3' de la secuencia codificante de la enzima.

Tabla 7. Tabla de uso de codones de P. ohmeri derivada de 5 secuencias codificantes (CDS, por sus siglas en inglés)

Ejemplo 3. Clonación del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (formadora de D-xilulosa) bacteriano de E. coli

Un fragmento de ADN que codifica el altD de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli se sintetizó químicamente (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Alemania), según la secuencia enviada de la secuencia enviada de la sec. con núm. de ident.: 1.

Los nucleótidos 1441 a 2808 de la secuencia AF378082.1 (obtenido de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF378082) que codifica el gen altD se usaron como plantilla y se sometieron a optimización por codón para su uso en P. ohmeri ATCC 20209 según la Tabla 7 del ejemplo 2, usando el programa Optimizer obtenido de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

En los extremos 5' y 3' de la secuencia resultante, se agregaron nucleótidos que codifican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción ^scI (GGCGCGCC) y SphI (GCATGC), respectivamente, para facilitar la clonación adicional.

Además, se incluyó un triplete de adenosina adelante del ATG inicial para compensar una adenosina en la posición -3 en la secuencia de levaduras similares a Kozak.

A continuación, la secuencia final (sec. con núm. de ident.: 1) se envió para su síntesis (GeneArt, Regensburg, Alemania).

El fragmento de ADN sintetizado que codificaba la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli se suministró como 5 pg de ADN plasmídico liofilizado en un vector derivado de pMK-RQ (12ABYWMP, Figura 1). Para la subclonación adicional, el gen se liberó mediante corte de restricción con las enzimas AscI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Ejemplo 4. Mutagénesis y clonación de xilitol deshidrogenasa específica para NADH y NADPH de Pichia stipitis Clonación de xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis

La secuencia de nucleótidos conocida del gen de levadura XYL2 (Pichia stipitis), que codifica xilitol deshidrogenasa (Kotter et al., Curr. Genet. 18:493-500 (1990)) se clonó en el vector plasmídico lig 7.78 siguiendo las instrucciones de FR 2765 589 (véase el ejemplo 4 y la Figura 7 de la presente patente). El mapa de restricción del vector se presenta en la Figura 2a.

Mutagénesis y clonación de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis

Un fragmento de ADN que codifica el XYL2 de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis se sintetizó químicamente (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Alemania) según la secuencia de la sec. con núm. de ident. 4).

Los nucleótidos 319 a 1410 de la secuencia X55392.1 (obtenida de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X55392.1) que codifica el gen XYL2 se usaron como plantilla.

Según el artículo de Watanabe et al. (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10340-10345), la preferencia de cofactor de la xilitol deshidrogenasa se podría cambiar de NADH a NADPH mediante la introducción de cuatro mutaciones de aminoácido publicadas: D207A/I208R/F209S/N211R (numeración basada en la secuencia proteica P22144 obtenida de http://www.uniprot.org/uniprot/P22144).

Por consiguiente, los codones que codifican D207, I208, F209 y N211 se reemplazaron manualmente por GCT, AGA, TCA y AGA en la secuencia correspondiente, respectivamente.

Además, los nucleótidos que codifican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción HindIII (AAGCTT) y SacII (CCGCGG) se incluyeron manualmente en los respectivos extremos 5' y 3' para facilitar la clonación adicional. Adicionalmente, se incluyó un triplete de adenosina adelante del ATG inicial para compensar una adenosina en la posición -3 en la secuencia de levaduras similares a Kozak. La secuencia final (sec. con núm. de ident.: 4) se envió para su síntesis (GeneArt, Regensburg, Alemania).

El fragmento de ADN sintetizado que codificaba la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis se suministró como 5 pg de ADN plasmídico liofilizado en un vector derivado de pMA-T (12AALQTP, Figura 2b).

Ejemplo 5. Mutagénesis y clonación de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans Un fragmento de ADN que codifica el Xdh de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans se sintetizó químicamente (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Alemania) según la secuencia enviada de la sec. con núm. de ident.: 7.

Los nucleótidos 1063 a 1851 de la secuencia AB091690.1 (obtenida de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB091690.1) que codifica el gen Xdh se usaron como plantilla y se sometieron a optimización por codón para su uso en P. ohmeri ATCC 20209 según la Tabla 7 (Ejemplo 2), usando el programa Optimizer obtenido de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

Basada en la publicación de Ehrensberger et al. (Structure, 2006, 14, 567-575), la especificidad de cofactor de la enzima se podría cambiar de NADH a NADPH mediante la introducción de dos mutaciones de aminoácido publicadas: D38S/M39R (numeración basada en la secuencia proteica Q8GR61 obtenida de http://www.uniprot.org/uniprot/Q8GR61).

Por tanto, los codones que codifican D38 y M39 se reemplazaron manualmente por TCT y AGA en la secuencia correspondiente, respectivamente. Además, los nucleótidos que codifican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción AscI (GGCGCGCC) y SphI (GCATGC) se incluyeron manualmente en los respectivos extremos 5' y 3' para facilitar la clonación adicional.

Adicionalmente, se incluyó un triplete de adenosina adelante del ATG inicial para compensar una adenosina en la posición -3 en la secuencia de levaduras similares a Kozak. La secuencia final (sec. con núm. de ident.: 7) se envió para su síntesis (GeneArt, Regensburg, Alemania).

El fragmento de ADN sintetizado que codificaba la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans se suministró como 5 pg de ADN plasmídico liofilizado en un vector derivado de pMA-T (13AAYSYP, Figura 3) . Para la subclonación adicional, el gen se liberó mediante corte de restricción con las enzimas AscI y Sph\ (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Ejemplo 6. Construcción de un vector de P. ohmeri para la expresión génica heteróloga usando el marcador de selección poURA3

La clonación de un vector con:

- promotor,

- marco de lectura abierto y

- elementos terminadores

reemplazables se llevó a cabo mediante dos PCR de superposición sucesivas de tres fragmentos individuales (Figura 4) .

El vector se planificó originalmente como un modelo de expresión para evaluar la clonación y la sobreexpresión del gen de tagatosa 3-epimerasa en la cepa de Pichia ohmeri recombinante.

Según se describirá más adelante, el gen de tagatosa 3-epimerasa se clonó en un casete con sitios de restricción AscI - Sphl específicos, permitiendo la clonación de cualquier gen de interés al usar estos mismos sitios de inserción. La clonación se concibió de la siguiente manera.

En una primera PCR (PCR1), se amplificó un fragmento del promotor de ribulosa reductasa de 490 bp de longitud de P. ohmeri flanqueado por los sitios Spel y AscI (subrayados en la secuencia del cebador) usando:

- cebador EV2960:

GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG (sec. con núm. de ident. 12) y

- cebador EV2961:

CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG (sec. con núm. de ident. 13).

Además, en el extremo 5' del cebador inverso EV2961, se agregó un fragmento de 13 nucleótidos de longitud que representaba el extremo 5' del gen de tagatosa-3-epimerasa.

Este fragmento junto con los 8 nucleótidos del sitio AscI y los siguientes 10 nucleótidos del extremo 3' del promotor de ribulosa reductasa eran necesarios como superposición para fusionar el fragmento de PCR1 con el fragmento de PCR2 descrito más adelante. El ADN genómico de P. ohmeri ATCC 20209 se usó como plantilla.

Con este fin, una colonia de P. ohmeri recientemente sembrada en estrías se resuspendió en 30 pl de SDS al 0,2 % y se calentó durante 4 min a 95 °C. Después de una centrifugación a velocidad máxima, se usaron 0,5 pl del sobrenadante para la PCR.

La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 50 °C / 15 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California).

En una segunda PCR (PCR2), se amplificó un fragmento de 911 bp de longitud de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii s T24 flanqueado por los sitios AscI y SphI (subrayados en la secuencia del cebador) usando: - cebador EV2962:

AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG (sec. con núm. de ident. 14) y

- cebador EV2963:

TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG (sec. con núm. de ident. 15).

El extremo 5' del cebador EV2962 contiene un fragmento de 9 nucleótidos de longitud que representaba el extremo 3' del promotor de ribulosa reductasa.

Este fragmento junto con los 8 nucleótidos del sitio Asci y los siguientes 12 nucleótidos del marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa, se usa para la PCR de superposición para fusionar el producto de PCR2 con el producto de PCR1 descrito anteriormente.

Además, el extremo 5' del cebador inverso EV2963 contiene un fragmento de 12 nucleótidos de longitud que representa el extremo 5' del terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri.

Este fragmento junto con los 6 nucleótidos del sitio Sphi y los siguientes 12 nucleótidos del extremo 3' del marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa son necesarios como superposición para fusionar PCR2 con el fragmento de PCR de PCR3 descrito más adelante.

Como plantilla, se usaron 25 ng del vector 12AAMCJP (Figura 5) (GeneArt, Regensburg, Alemania) que contenía una copia sintetizada del gen de tagatosa-3-epimareasa de Pseudomonas cichorii ST24 (nucleótidos 719 a 1591 de AB000361.1, de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB000361) - sec. con núm. de ident.: 11.

La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 48 °C / 30 seg a 72 °C y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C.

En una tercera PCR (PCR3), se amplificó un fragmento del terminador de ribulosa reductasa de 380 bp de longitud de P. ohmeri flanqueado por los sitios Sphi y Sacii (subrayados en la secuencia del cebador) usando:

- cebador EV2964

AAGCTGGCCTGAGCATGCTCTCGAAGAGAATCTAG (sec. con núm. de ident. 16) y

- cebador EV2965

GTTCCGCGGAGAATGACACGGCCGAC (sec. con núm. de ident. 17).

El extremo 5' del cebador EV2964 contiene un fragmento de 12 nucleótidos de longitud del extremo 3' del marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa que, junto con los 6 nucleótidos del sitio Sphi y los siguientes 12 nucleótidos del terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri se usan para la fusión de PCR3 con el PCR2 descrito anteriormente. El ADN genómico de P. ohmeri ATCC 20209 se usó como plantilla. Después de una centrifugación a velocidad máxima, se usaron 0,5 pl del sobrenadante en la PCR. Con este fin, una colonia de P. ohmeri recientemente sembrada en estrías se resuspendió en 30 pl de SDS al 0,2 % y se calentó durante 4 min a 95 °C.

La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP, 0,5 pM de cada cebador y 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 50 °C / 15 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, irvine, California). El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, irvine, California).

La fusión de los tres fragmentos de PCR individuales se llevó a cabo de la siguiente manera: 50 ng de cada producto purificado de gel de PCR1 y PCR2 se usaron como plantilla en una reacción de PCR con EV2960 y EV2963.

Un segmento homólogo de 30 nucleótidos de longitud en los dos fragmentos, resultante del diseño del cebador descrito anteriormente, se usó como superposición en la reacción de fusión.

De esta manera, se fusionó un fragmento de 1,4 kb de longitud, que consiste en un promotor de ribulosa reductasa de P. ohmeri flanqueado por los sitios Spei y Asci con el marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii ST24.

Las plantillas se amplificaron en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP, 0,5 pM de cada cebador y 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 62 °C / 45 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, irvine, California).

El fragmento purificado se fusionó en una segunda PCR de superposición con el producto de PCR3. 40 ng de cada fragmento se usaron como plantilla y se amplificaron con EV2960 y EV2965.

Un segmento homólogo de 30 nucleótidos de longitud en los dos fragmentos, resultante del diseño del cebador descrito anteriormente, se usó como superposición en la fusión.

De esta manera, se fusionó un fragmento de 1,8 kb de longitud, que consiste en un promotor de ribulosa reductasa de P. ohmeri flanqueado por los sitios SpeI y AscI y el marco de lectura abierto de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii ST24 flanqueado por los sitios AscI y SphI con el terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri.

Las plantillas se amplificaron en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP, 0,5 pM de cada cebador y 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 65 °C / 55 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California).

El producto de PCR final que consistía en un fragmento de 1,7 kb de longitud de tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii ST24 flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa se digirió con las enzimas de restricción SpeI y Sacll (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), se purificó en gel y se ligó durante toda la noche a 16 °C con un fragmento aislado de 9,8 kb de longitud de SpeI/SacII de una estructura de vector lig7.78 usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 6).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El ADN plasmídico purificado se usó para caracterización adicional mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido de expresión recientemente clonado pEVE2523 (Figura 7) es un vector versátil de E. coli - P. ohmeri que consiste en un origen de replicación y un gen de resistencia a ampicilina bacterianos (E. coli), la secuencia de replicación autónoma de levadura (P. ohmeri), y el gen de poURA3 (P. ohmeri) para la selección en levadura.

Además, contiene un elemento promotor (a través de restricción por SpeI y AscI) y un elemento terminador (a través de SphI y Sacll) intercambiables de ribulosa reductasa de P. ohmeri que flanquean un marco de lectura abierto de la tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii (intercambiable a través de la restricción por AscI y SphI).

Ejemplo 7. Construcción de un vector de P. ohmeri para la expresión génica heteróloga usando el marcador de selección poLEU2

Para la construcción de un segundo vector de expresión de P. ohmeri, el casete de expresión del plásmido pEVE2523 (Figura 7) descrito anteriormente en el Ejemplo 6 se clonó en un vector que contenía el marcador de selección poLEU2 de P. ohmeri (Figura 6).

Un fragmento despuntado de 1,7 kb del vector pEVE2523 (Figura 7) cortado con SpeI y Sacll (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) se usó como inserto. El despuntamiento se llevó a cabo con la Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente y posteriormente mediante inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C.

La estructura del vector se obtuvo de un vector poARS (plig3 - FR 2772788) linealizado con Sa/I (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), despuntado y desfosforilado durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). El inserto y la estructura de vector purificados de gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) se ligaron durante 1 h a TA usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se usó para caracterización adicional mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

Los plásmidos de expresión recientemente clonados pEVE2560 (Figura 8) es un vector versátil de E. coli - P. ohmeri que contiene en un origen de replicación y un gen de resistencia a ampicilina bacterianos (E. coli), la secuencia de replicación autónoma de levadura (P. ohmeri), y el gen de poLEU2 (P. ohmeri) para la selección en levadura.

Además, el marco de lectura abierto de la tagatosa-3-epimerasa de Pseudomonas cichorii flanqueado por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri es intercambiable a través de la restricción por AscI y SphI.

Ejemplo 8. Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans.

Se construyó un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans.

Para la clonación en el vector de expresión, el fragmento de ADN que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans se liberó del vector 13AAYSYP (Figura 3) al cortarlo con las enzimas de restricción AscI y Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

El fragmento de 803 bp se purificó del gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE2523 (Figura 7) de 9,8 kb digerida por AscI/SphI y purificada del gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 9).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3284 (Figura 10) contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans optimizada por codón flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poURA3.

Ejemplo 9. Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis.

Para la subclonación en el vector de expresión, el fragmento de ADN que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis debía estar flanqueado por los sitios de restricción AscI y SphI.

Con este fin:

- el cebador EV3101

AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC (sec. con núm. de ident. 18) que contiene un sitio AscI (subrayado) y

- el cebador EV3102

GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG (sec. con núm. de ident. 19) que contiene un SphI (subrayado) se usaron en una reacción de PCR con 30 ng del vector 12AALQTP (Figura 2b) como plantilla.

La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 55 °C / 30 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C.

El producto de PCR de 1,1 kb se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo, purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se digirió por restricción con AscI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Después de la purificación en columna con el kit DNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research Corporation, Irvine, California), se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE2523 (Figura 7) de 10,6 kb digerida por AscI/SphI y purificada del gel y la estructura de vector de pEVE2560 (Figura 8) de 11,8 kb digerida por AscI/SphI y purificada del gel, respectivamente, usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 11).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

Los plásmidos resultantes pEVE2562 y pEVE2564 (Figura 12) contienen la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis optimizada por codón flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poURA3 o poLEU2, respectivamente.

Ejemplo 10. Construcción de un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis

Para la subclonación en el vector de expresión, el fragmento de ADN que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis debía estar flanqueado por los sitios de restricción AscI y SphI.

Con este fin:

- EV3101 (AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC) (sec. con núm. de ident. 18) que contiene un sitio Asci (subrayado) y el

- EV3102 (GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG) (sec. con núm. de ident. 19) que contiene un Sphi (subrayado)

se usaron en una reacción de PCR con 30 ng del vector lig7.78 (Figura 2a) como plantilla.

La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 seg a 98 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 98 °C / 20 seg a 55 °C / 30 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72 °C.

El producto de PCR de 1,1 kb se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo, purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, irvine, California) y se digirió por restricción con Asci y Sphi (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts).

Después de la purificación en columna con el kit DNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research Corporation, irvine, California), se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE2560 (Figura 8) de 10,5 kb digerida por Asci/Sphi y purificada del gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts) (Figura 13).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2563 (Figura 14) contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADH de Pichia stipitis optimizada por codón flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

Ejemplo 11. Construcción de vectores de P. ohmeri para la sobreexpresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli

Se construyó un vector de P. ohmeri para la sobreexpresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Para la clonación en el vector de expresión, el fragmento de ADN que codifica la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli optimizada por codón se liberó del vector 12ABYWMP (Figura 1) al cortarlo con las enzimas de restricción AscI y Sphi (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts).

El fragmento de 1,4 bp se purificó del gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, irvine, California) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE2523 (Figura 7) de 9,8 kb digerida por Asci/Sphi y purificada del gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts) (Figura 16).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2839 (Figura 15) contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli optimizada por codón flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poURA3.

Además del promotor de ribulosa reductasa de P. ohmeri, la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli también se clonó bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri.

La clonación se llevó a cabo en dos etapas consecutivas, al reemplazar primero el promotor de ribulosa reductasa por el promotor poPGK1, y posteriormente mediante un intercambio del terminador de ribulosa reductasa por el terminador poTKL.

Un fragmento de 611 bp de longitud del promotor poPGK1 de P. ohmeri se amplificó a partir del ADN genómico de P. ohmeri usando:

- el cebador EV3177 (GAAGACTAGTTCACGTGATCTC) (sec. con núm. de ident. 20) que contiene un sitio Spei (subrayado) y

- el cebador EV3178 (CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC) (sec. con núm. de ident. 21) que contiene un sitio AscI (subrayado).

La plantilla de ADN genómico se preparó al resuspender una colonia de P. ohmeri recientemente sembrada en estrías en 30 |jl de SDS al 0,2 % y calentar durante 4 min a 95 °C. Después de una centrifugación a velocidad máxima, se usaron 0,5 j l del sobrenadante para la PCR.

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 jM de cada dNTP y 0,5 jM de cada cebador con 0,02 U /jl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 2 min a 96 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 96 °C / 10 seg a 58 °C / 30 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 2 minutos a 72 °C.

El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California).

El fragmento amplificado del promotor poPGK1 de 610 bp de longitud se digirió por restricción con SpeI y AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE2839 (Figura 16) de 11,5 kb digerida por SpeI/AscI y purificada de gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 17).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3102 (Figura 18) contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli optimizada por codón flanqueada por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y un terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poURA3.

En la siguiente etapa el terminador de ribulosa reductasa de pEVE3102 se intercambió por el terminador de trancetolasa (poTKL) de P. ohmeri.

Un fragmento de 213 bp de longitud del terminador poTKL de P. ohmeri se amplificó a partir del ADN genómico de P. ohmeri usando:

- el cebador EV3817 (TAGCAGCATGCATAGGTTAGTGAATGAGGTATG) (sec. con núm. de ident. 22) que contiene un sitio SphI (subrayado) y

- el cebador EV3818 (TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC) (sec. con núm. de ident. 23) que contiene un sitio SacII (subrayado).

La plantilla de ADN genómico se preparó según se describe anteriormente.

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 jM de cada dNTP y 0,5 jM de cada cebador con 0,02 U /jl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado.

La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 2 min a 96 °C y posteriormente 25 ciclos con 10 seg a 96 °C / 10 seg a 57 °C / 30 seg a 72 °C, y una etapa de extensión final de 2 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California).

El fragmento amplificado del terminador poTKL de 213 bp de longitud se digirió por restricción con SphI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura de vector de pEVE3102 (Figura 18) de 11,5 kb digerida por SphI/SacII y purificada de gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 17).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3123 (Figura 19) contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli optimizada por codón flanqueada por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y un terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri y el marcador de selección poURA3.

Para poder expresar la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli a partir de un plásmido usando otra selección, el marcador poURA3 de pEVE3123 se intercambió por el marcador poiEU2.

Con este fin, el marcador poURA3 se liberó del vector pEVE3123 (Figura 19) mediante digestión por restricción con Psil y AfeI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

La estructura de vector de 9,1 kb se purificó del gel usando el kit de recuperación de ADN de gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California), se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, y posteriormente mediante inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y se desfosforiló durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Como inserto, se usó un fragmento de 3 kb despuntado y purificado de gel del marcador poLEU2 liberado del vector pEVE2560 (Figura 8) mediante digestión por restricción con AseI y AfeI. La ligadura de los fragmentos se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 20).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3157 (Figura 21) contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli optimizada por codón flanqueada por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y un terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

Ejemplo 12. Expresión de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli plasmídica y del gel de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Pichia stipitis plasmídico en la cepa de Pichia ohmeri ATCC 20209

Para la conversión biosintética de arabitol en xilitol, se necesita la expresión simultánea de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y la xilitol deshidrogenasa específica para NADP de P. stipitis.

La primera enzima conduce a la formación de xilulosa y la segunda convierte xilulosa en xilitol.

La cepa de P. ohmeri SRLU (MATh- leu2 ura3) derivada de ATCC 20209 y auxótrofa para leucina y uracilo (Piredda and Gaillardin, 1994, supra) se usó como hospedante para la construcción de una cepa de levadura que secreta xilitol mediante transformación con plásmidos:

- pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli) y

- pEVE2564 (xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis) que conducen a la cepa EYS2755.

Además, como testigo (siguiendo las instrucciones de WO 94/10325) se construyó también una cepa que expresa la xilitol deshidrogenasa específica para NADH natural de P. stipitis mediante transformación con los plásmidos:

- pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli) y

- pEVE2563 (xilitol deshidrogenasa específica para NADH de P. stipitis) en la hospedante SRLU que conduce a la cepa EYS2962.

Como testigo, también se generaron cepas transformadas con plásmidos simples:

- pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli),

- pEVE2563 (xilitol deshidrogenasa específica para NADH de P. stipitis) y

- pEVE2564 (xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis) que conducen a EYS2943, EYS2696 y EYS2697, respectivamente.

La transformación de la levadura se llevó a cabo esencialmente mediante el método por esferoplasto de Green et al. (Green E.D., Hieter, P., y Spencer F. A., capítulo 5 en Genome Analysis: A Laboratory Manual, tomo 3, Cloning Systems, Birren et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1999) con las siguientes modificaciones: En lugar de Lyticase, se usó Zymolyase 100T para la generación de esferoplastos y la incubación con la enzima se llevó a cabo a 37 °C hasta que la DO de la suspensión celular alcanzó el 20-30 % de la DO original antes del tratamiento con Zymolyase.

En resumen, se cultivaron células de P. ohmeri durante toda la noche a 30 °C en medio YPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), Peptona al 2 % (p/v), Dextrosa al 2 % (p/v)) hasta una DO⁶⁰⁰ final de 3-5. Se cosecharon 200 unidades de DO⁶⁰⁰ mediante centrifugación, se lavaron una vez con agua y 1 M sorbitol, y se resuspendieron en tampón SCE (1 M sorbitol, 100 mM de sal dihidratada trisódica de ácido cítrico, 10 mM de e DtA) hasta una concentración final de 70 DO/ml.

Se agregaron DTT y Zymolase (LuBio Science, Lucerna, Suiza) hasta una concentración final de 10 mM y 0,5 U/DO, respectivamente, y la mezcla se incubó a 37 °C con agitación lenta.

Tras la digestión de la pared celular, se procedió a medir la densidad óptica de la disolución diluida en agua. Cuando este valor se redujo hasta un 80 % del original, la digestión se terminó mediante centrifugación cuidadosa y lavado con 1 M sorbitol y tampón STC (0,98 M sorbitol, 10 mM de Tris, pH 7,5, 10 mM de CaCL).

Los esferoplastos se resuspendieron cuidadosamente en tampón STC que contenía 50 pg/ml de ADN de timo de ternero (Calbiochem/VWR, Dietikon, Suiza) hasta una concentración final de 200 DO/ml. Se mezclaron alícuotas de 100 pl con 100-200 ng de ADN plasmídico y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente.

Se agregó 1 ml de disolución de PEG (19,6% de PEG 8000 p/v, 10 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de CaCh) a la suspensión, se incubaron durante 10 minutos y se granularon. Los esferoplastos se regeneraron a 30 °C durante 1-2 h en 1 ml de una disolución de 1 M sorbitol que contenía YPD al 25 % y 7 mM de CaCL.

A las células regeneradas se agregaron 7 ml de agar superior caliente a 50 °C (base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos al 0,67 %, polvo de desactivación sin leucina/uracilo/histidina/triptófano/metionina al 0,13 %, 0,086 %% del aminoácido faltante requerido, glucosa al 2 %, 1 M sorbitol, pH 5,8 y agar Noble al 2,5 %) y la mezcla se vertió uniformemente sobre placas selectivas que contenían sorbitol precalentadas (base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos al 0,67 %, polvo de desactivación sin leucina/uracilo/histidina/triptófano/metionina al 0,13 %, 0,086 % del aminoácido faltante requerido, glucosa al 2 %, 1 M sorbitol, pH 5,8).

Las placas se incubaron durante 3-5 días a 30 °C. Los transformantes se reseleccionaron en las placas selectivas adecuadas.

Cada cepa generada se evaluó por triplicado para determinar la producción de arabitol, xilitol y ribitol.

Con este fin, los clones primero se cultivaron a 30 °C durante toda la noche en medios de siembra (base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos al 0,67 %; polvo de desactivación sin leucina/uracilo/histidina/triptófano/metionina al 0,13 %; 0,086 % del aminoácido faltante requerido, glucosa al 5 %; pH 5,7).

De este cultivo durante toda la noche, se inoculó un cultivo principal en medios de producción (base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos al 0,67 %; polvo de desactivación sin leucina/uracilo/histidina/triptófano/metionina al 0,13 %; 0,086 % del aminoácido faltante requerido; glucosa al 15 %; pH 5,7) a una DO600 de partida de 0,2.

Este cultivo se cultivó a 37 °C durante 48 horas y se determinaron las concentraciones de arabitol, xilitol y ribitol de los sobrenadantes mediante HPLC/MS usando una columna Aminex® HPX-87 (Bio-Rad, Hercules, California) y un Waters® TQ-Detector (Acquity® UPLC enlazado a un detector triple cuadrupolo, Waters, Milford, Massachusetts) y condiciones isocráticas con agua al 100 % como fase móvil.

Los títulos de poliol de todas las cepas evaluadas se representan en la Tabla 8.

Tabla 8

El uso de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis conduce a un aumento significativo en los títulos de xilitol, en comparación con la enzima específica para NADH natural.

Ejemplo 13. Expresión del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de Gluconobacter oxydans plasmídico en Pichia ohmeri

Además de una cepa productora de xilitol que usa la xilitol deshidrogenasa específica para NADP de P. stipitis, se manipuló una segunda cepa que expresa la xilitol deshidrogenasa específica para NADP de G. oxydans.

La cepa de P. ohmeri SRLU (MATh- leu2 ura3) derivada de ATCC 20209 y auxótrofa para leucina y uracilo (Piredda and Gaillardin, 1994, supra) se usó como hospedante para la construcción de una cepa de levadura que secreta xilitol mediante transformación con los plásmidos pEVE3157 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli) y pEVE3284 (xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans) que condujo a la cepa EYS3324.

Como testigo, también se generaron cepas transformadas con plásmidos simples:

- pEVE3157 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli) y

- pEVE3284 (xilitol deshidrogenasa específica para NADH de G. oxydans) que conducen a EYS3067 y EYS3323, respectivamente.

La D-arabitol 4-oxidorreductasa de E. coli usada para la construcción de las cepas mencionadas anteriormente se controla mediante el promotor poPGK1 a diferencia del promotor poRR usado en las cepas que expresan la xilitol deshidrogenasa de P. stipitis.

Sin embargo, para excluir una influencia del promotor y, por lo tanto, ser capaces de comparar los niveles de poliol en cepas que expresan la xilitol deshidrogenasa de G. oxydans con aquellas que expresan la enzima correspondiente de P. stipitis, se generó una cepa adicional.

Esta cepa EYS2963 se obtuvo mediante la transformación del hospedante SRLU con

- pEVE3123 (D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli) y

- pEVE2564 (xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis).

La transformación de la levadura se llevó a cabo según se describe en el Ejemplo 12. Cada cepa generada se evaluó por triplicado para determinar la producción de arabitol, xilitol y ribitol, según se describe en el Ejemplo 12.

Los títulos de poliol de todas las cepas evaluadas se representan en la Tabla 9.

Tabla 9

Los títulos de xilitol en cepas que expresan la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans (EYS3324) son similares a los de las cepas que expresan la enzima correspondiente de P. stipitis (EYS2963). Sin embargo, la enzima de G. oxydans conduce a títulos de ribitol mucho más bajos, por lo tanto, exhibe una especificidad de sustrato más alta para xilulosa.

Ejemplo 14. Generación de una cepa de P. ohmeri mutante con secreción de arabitol aumentada

Se ha seleccionado un mutante con producción más alta de arabitol a partir de una suspensión irradiada con UV de P. ohmeri ATCC 20209.

El sistema de irradiación con UV (Vilber Lourmat, Francia) se equipó con un radiómetro RMX-3 W controlado por microprocesador. Se cultivó P.ohmeri sobre YPD agar (Dextrosa 20 g/L) a 37 °C durante toda la noche.

Se preparó una suspensión hasta alcanzar 106 ufc/mL (OD620=0,4) y se colocaron 5 mL en una placa de Petri estéril. La suspensión se irradió después de quitar la cubierta de la placa. La longitud de onda UV fue 254 nm y la energía de irradiación fue 1,8 10-2 J/cm2. Se obtuvo 90 % de mortalidad de las células de levadura. Después de detener la irradiación y recolocar la tapa sobre la placa, la suspensión se transfirió a un tubo estéril ubicado en un baño helado. Se inocularon 20 mL de medio líquido YPD con la suspensión mutada y se incubaron durante 12 horas a 37 °C, 250 rpm.

Después de la incubación, el cultivo mutado se diluyó con glicerol al 40 % estéril (V/V). Se distribuyeron alícuotas en viales de 5 mL y se congelaron a -80 °C.

El barrido se basó en la propiedad osmófila de Pichia ohmeri que es capaz de crecer en concentraciones muy altas de Dextrosa (hasta 600 g/L).

Nuestro objetivo fue seleccionar mutantes capaces de crecer más rápido que la cepa madre sobre YPD agar que contiene Dextrosa 600 g/L o 700 g/L.

Las alícuotas descongeladas se esparcieron sobre YPD⁶⁰⁰ y YPD⁷⁰⁰ y las colonias que aparecieron primero se seleccionaron y evaluaron para la producción de arabitol en matraces de agitación.

El subcultivo y el medio de producción se elaboraron con glucosa 50g/L o 100 g/L, respectivamente, extracto de levadura 3g/L, MgSO41 g/L y KH²PO⁴2 g/L, pH 5,7. El subcultivo (10 mL en un matraz de 100 mL) se incubó durante 24 h a 37 °C, 250 rpm. La producción (40 mL en un matraz de 500 mL) se incubó mediante 5 mL de subcultivo y se incubaron durante 64 horas a 37 °C, 250 rpm.

La cepa de P. ohmeri mutante se seleccionó por su consumo más rápido de glucosa y su producción más alta de arabitol y se depositó en Francia el 7 de marzo de 2012, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección nacional de cultivos de microorganismos] del Instituto Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARÍS Cedex 15, con el número I-4605.

Ejemplo 15. Construcción de un plásmido de eliminación de LEU2

Para poder usar la cepa CNCM I-4605 recientemente generada para selección plasmídica e integraciones génicas, se construyó un plásmido para la eliminación del marco de lectura abierto de LEU2.

En una primera etapa, un vector de integración general que se puede usar en P. ohmeri se adaptó a partir del sistema CRE/loxP de S. cerevisiae. Se aisló la estructura principal del vector a partir de pUG73 (Gueldener et al., 2002, Nucleic Acid Res, 30, e23) mediante corte por restricción con las enzimas PstI y EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Como inserto se usó un fragmento de PCR que contenía un marcador de selección LEU2 de P. ohmeri flanqueado por sitios loxP, generado con el par de cebadores:

- EV3043

ÍCACTGGCGCGCCCACTGCATGCGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTA T AATGTATGCT AT ACG AAG TT ATT AGGTCT AGACACAT CGTGG AT CCAAG CTATCAACGAGAGAGTC) (SEQ ID No 24) y

- EV3044

l AGT GGCT AGCAGTGCCAT GGCCT AAT AACTTCGT AT AGCAT AC ATT AT AC GAAGTTATATTAAGGGTTCTCGAGACGCGTCATCTAGCATCTCATCTACCA

_ ACTC) (SEQ ID No 25) y

- poARS (plig3 - FR 2772788 - véase la Figura 6) como plantilla.

El cebador directo EV3043 contiene un sitio Asci (subrayado) que precede a un sitio Sphi (subrayado), con un fragmento de loxP de 48 bp de longitud posterior (en negrita) y un sitio Draiii (subrayado). El extremo 3' de EV3043 contiene un fragmento adicional de 25 bp de longitud para la amplificación del gen de LEU2 de P. ohmeri. El cebador inverso EV3044, por otro lado, contiene un sitio Nhei (subrayado) que precede a un sitio Ncoi (subrayado), con un fragmento de loxP de 48 bp de longitud posterior (en negrita) y un sitio Mlui (subrayado). El extremo 3' de EV3044 contiene un fragmento adicional de 25 bp de longitud para la amplificación del gen de LEU2 de P. ohmeri. La plantilla se amplificó en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se llevó a cabo con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 65 °C / 50 s a 72 °C y una etapa de extensión final de 7 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, irvine, California).

El fragmento amplificado se flanqueó con un sitio Psti y EcoRVen una segunda reacción de PCR para subclonación adicional. La amplificación se llevó a cabo con:

- el cebador EV3056 (CACTCTGCAGCACTGGCGCGCCCACTGCAT) (SEQ iD No. 26) que contiene el sitio Psti (subrayado) y

- el cebador EV3057 (CACTGATATCAGTGGCTAGCAGTGCCATGG) (SEQ iD No. 27) que contiene el sitio EcoRV (subrayado)

en una mezcla de reacción que consiste en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BiO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 45 s a 72 °C y una etapa de extensión final de 7 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, irvine, California).

El marcador LEU2 de 2,5 kb amplificado se digirió por restricción con las enzimas Psti y EcoRV (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts), se purificó en gel con el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, irvine, California) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal Psti/EcoRV de 2,4 kb (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts), purificada en gel (kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, irvine, California) del vector pUG73 (Gueldener et al., 2002 Nucleic Acid Res, 30, e23) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, ipswich, Massachusetts) - (Figura 22). Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2787 (Figura 23) contiene el marcador de selección LEU2 de P. ohmeri bajo el control del promotor y terminador endógenos, flanqueado por dos sitios loxP. Además, se había introducido un sitio Asci y Sphi antes del primer loxP y un sitio Nhei y Ncoi después del segundo loxP, para auxiliar en la clonación de regiones homólogas a los sitios de integración en el genoma.

El marcador LEU2 del vector de integración después se reemplazó por el gen de resistencia nat1 de Streptomyces noursei, en una segunda etapa de clonación, dado que se apuntaba a una eliminación del marco de lectura abierto de LEU2 endógeno.

Un fragmento de ADN que codifica el gen nat1 de Streptomyces noursei se sintetizó químicamente mediante síntesis de genes GeneArt® (Life Technologies, Regensburg, Alemania) según la secuencia enviada de la SEQ iD No.: 28.

Los nucleótidos 204 a 776 de la secuencia S60706.1 (obtenida de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/S60706.1) que codifica el gen nat1 se usaron como plantilla y se sometieron a optimización por codón para su uso en P. ohmeri ATCc 20209 según la Tabla 7 (más arriba), usando el programa Optimizer obtenido de http://genomes.urv.es/OPTiMiZER/.

En los extremos 5' y 3' de la secuencia resultante, se agregaron manualmente en el fichero de texto nucleótidos que codifican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Asci (GGCGCGCC) y Sphi (GCATGC), respectivamente, para facilitar la clonación adicional. Además, se incluyó un triplete de adenosina adelante del ATG inicial para compensar una adenosina en la posición -3 en la secuencia de levaduras similares a Kozak.

A continuación, la secuencia final (SEQ ID No.: 28) se envió para su síntesis a GeneArt (Regensburg, Alemania). El fragmento de ADN sintetizado que codifica el gen n a tl se suministró como 5 pg de ADN plasmídico liofilizado en un vector derivado de pMA-T (12ABTV4P, Figura 24).

Para la clonación del gen n a tl se usó un vector que contenía un promotor y terminador de ribulosa reductasa (poRR). El terminador se intercambió por un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3) y el gen n a tl se introdujo entre las secuencias del promotor y terminador.

Con este fin, se generó el terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3) mediante PCR con:

- el cebador EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEQ ID No. 29) que contiene un sitio Sphl (subrayado) y

- el cebador EV3394 (GGACCGCGGAAAGGTGAGGAAGTATATGAAC) (SEQ ID No. 30) que contiene un sitio Sacll (subrayado) y

- pEVE2523 (Figura 7) como plantilla.

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 59 °C / 10 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El terminador poURA3 de 239 bp se digirió por restricción con las enzimas SphI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal de vector de 11 kb de pEVE2681 linealizada con las enzimas de restricción SphI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel con el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

En una segunda etapa de clonación, el gen n a tl se liberó de 12ABTV4P (Figura 24) mediante corte de restricción con las enzimas SphI y AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Además, se llevó a cabo un despuntamiento del sitio SphI con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente y una inactivación térmica posterior de las enzimas durante 10 min a 70 °C entre la digestión de SphI y AscI. El fragmento de 587 bp se purificó en gel (kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se ligó después con la estructura de vector purificada en gel de 10,5 kb del vector descrito anteriormente cortado con las enzimas de restricción SphI y AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

También se despuntó el sitio SphI del vector durante 15 min a temperatura ambiente con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), y después se sometió a una etapa de inactivación térmica de 10 min a 70 °C antes de llevar a cabo la digestión con AscI. Además, el vector se desfosforiló durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2798 (Figura 25) que contiene el marcador de resistencia a fármaco n a tl flanqueado por un promotor de ribulosa reductasa (poRR) y un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3) de P. ohmeri.

El casete de expresión de n a tl se usó para reemplazar el marcador de selección LEU2 de P. ohmeri en el vector integrador. Para facilitar la clonación adicional, el casete de nat1 tenía que estar flanqueado con los sitios XbaI (subrayado en el cebador EV3643) y M luI (subrayado en el cebador EV3644) mediante PCR con:

- el cebador EV3643 (CACTTCTAGACACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEQ ID No. 31) y

- el cebador EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEQ ID No. 32).

El cebador EV3643 contiene un sitio ClaI adicional (línea punteada) después del sitio Xba\. pEVE2798 sirvió como plantilla (Figura 25).

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 54 °C / 25 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El casete de expresión de n a tl de 1,3 kb se digirió por restricción con las enzimas MluI y Xba\ (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal de vector de 2,6 kb de pEVE2787 (Figura 23) linealizada con las enzimas de restricción MluI y XbaI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel con el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 26).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2852 (Figura 27) contiene el marcador de selección n a tl bajo el control del promotor de ribulosa reductasa (poRR) y el terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3), y flanqueado por dos sitios loxP.

El plásmido de integración no contiene ningún fragmento homólogo de P. ohmeri necesario para la integración específica en un sitio en el genoma, hasta este punto. Estos sitios se acoplaron en las siguientes etapas.

La región homóloga hacia 5' antes del marco de lectura abierto de LEU2 se amplificó a partir del vector poARS de 50 ng (Figura 6) con:

- el cebador EV3548 (CACTCTGCAGGATCCAAGCTATCAACGAGA) (SEQ ID No. 33) que contiene un sitio PstI (subrayado) y

- el cebador EV3549 (CACTGCATGCGTTGCGGAAAAAACAGCC) (SEQ ID No. 34) que contiene un sitio SphI (subrayado).

La PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La amplificación se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 61 °C / 15 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El fragmento de 567 bp se digirió por restricción con las enzimas PstI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal del vector de 3,9 kb de pEVE2852 (Figura 27) linealizada con las enzimas de restricción PstI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel con el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 29).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2855 (Figura 28) contiene un fragmento homólogo a la región hacia 5' antes del marco de lectura abierto de LEU2 y un marcador nat1 flanqueado por dos sitios loxP.

La región homóloga hacia 3' después del marco de lectura abierto de LEU2 se amplificó a partir del vector poARS de 50 ng (Figura 6) con:

- el cebador EV3550 (CACT CCATGG AGTAGGTATATAAAAATATAAGAG) (SEQ ID No. 35) que contiene un sitio NcoI (subrayado) y

- el cebador EV3551 (CACTGCTAGCGTCGACAACAGCAACTAG) (SEQ ID No. 36) que contiene un sitio NheI (subrayado).

La PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La amplificación se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 51 °C / 25 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El fragmento de 1,3 kb se digirió por restricción con las enzimas NcoI y NheI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal del vector de 4,4 kb de pEVE2855 (Figura 28) linealizada con las enzimas de restricción NcoI y NheI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel con el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 29).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido de eliminación de LEU2 final resultante pEVE2864 (Figura 30) contiene un fragmento homólogo a la región hacia 5' anterior y un fragmento homólogo a la región hacia 3' posterior al marco de lectura abierto de LEU2 y un marcador n a tl flanqueado por dos sitios loxP.

Ejemplo 16. Generación de una cepa de P. ohmeri mutante auxótrofa para leucina

Dado que la cepa CNCM I-4605 de P. ohmeri generada no exhibió ninguna auxotrofía hasta el momento, se llevó a cabo una eliminación del marco de lectura abierto de LEU2, para poder usar el marcador de selección LEU2 para integraciones génicas.

Con este fin, el plásmido pEVE2864 (Figura 30) se digirió por restricción con las enzimas EcoRV y PstI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 2,5 h a 37 °C y la mezcla usada para transformar la cepa Mut165 según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12.

A las células regeneradas se agregaron 7 ml de agar superior caliente a 50 °C (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, glucosa al 2%, 1 M sorbitol, pH 5,8 y agar Noble al 2,5 %) con 25 pg/ml de natamicina y la mezcla se vertió uniformemente sobre placas de selección que contenían sorbitol precalentadas (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, glucosa al 2%, 1 M sorbitol, pH 5,8 y agar al 2 %) con 25 pg/ml de natamicina. Las placas se incubaron durante 4 días a 30 °C. La eliminación del marco de lectura abierto de LEU2 se verificó por la ausencia de crecimiento en las placas selectivas sin leucina y se confirmó por PCR de colonias usando:

- el cebador EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEQ ID No. 29) y

- el cebador EV3795 (CAAGTCGTGGAGATTCTGC) (SEQ ID No. 37).

El fragmento de 1,6 kb se amplificó con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 51 °C / 25 s a 72 °C y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C.

La cepa resultante contiene la eliminación total del marco de lectura abierto del gen LEU2 en un fondo de CNCM I-4605 y se depositó en Francia el 5 de febrero de 2015, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección nacional de cultivos de microorganismos] del Instituto Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARÍS Cedex 15, con el número I-4955.

Ejemplo 17. Construcción de plásmidos de doble expresión que comprenden la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli

Para poder expresar la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli en la cepa de P. ohmeri mutante solo auxótrofa para leucina, fue necesaria la construcción de un plásmido de expresión doble.

El casete de expresión que contenía la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis se liberó de pEVE2562 (Figura 12) mediante corte de restricción con las enzimas SpeI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). El fragmento de 1,9 kb se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C. Después, el inserto se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal de pEVE3157 de 12,1 kb linealizada por Spel, despuntada, desfosforilada (1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic - New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) purificada en gel (Figura 21) que contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 31).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3318 (Figura 32) contiene la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

Ejemplo 18. Construcción de vectores integradores para la expresión del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis en P. ohmeri

El gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis deberían básicamente convertirse en parte integral del genoma de P. ohmeri. Por lo tanto, se debió construir un vector integrador con un marcador de selección LEU2, al reemplazar el marcador de selección n a tl de pEVE2852 e incorporar la construcción de doble expresión de arabitol oxidorreductasa y xilitol deshidrogenasa.

Con este fin, se generó el marco de lectura abierto de LEU2 de P. ohmeri, flanqueado por sitios /4scI y SphI, mediante PCR con:

- el cebador EV3645 (CAAGGCGCGCCAAAATGTCTACCAAAACCATTAC) (SEQ ID No. 38) y

- el cebador EV3646 (GGAGCATGCCTACTTTCCCTCAGCCAAG) (SEQ ID No. 39).

La amplificación se llevó a cabo con 50 ng de plantilla poARS (Figura 6) en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProofTM (BIO-Ra D, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 57 °C / 20 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El marco de lectura abierto de LEU2 amplificado posteriormente se digirió por restricción con las enzimas ^scI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Además, se llevó a cabo un despuntamiento del sitio SphI con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente y posteriormente mediante inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C entre la digestión de SphI y ^scI. Después, el fragmento de 1,1 kb purificado en gel se ligó con la estructura principal de vector purificada en gel de 11 kb de pEVE2811 cortada con las enzimas de restricción SphI y ^scI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). También se despuntó el sitio SphI del vector durante 15 min a temperatura ambiente con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), y después se sometió a una etapa de inactivación térmica de 10 min a 70 °C antes de llevar a cabo la digestión con ^scI. Además, el vector se desfosforiló durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura del marco de lectura abierto de LEU2 y la estructura principal del vector se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2862 (Figura 33) contiene el marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por un promotor de ribulosa reductasa (poRR) y un terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (poURA3) de P. ohmeri.

Posteriormente, el marcador LEU2 se amplificó mediante PCR usando:

- el cebador EV3643 (CACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEQ ID No. 31) que contiene un sitio ClaI y

- el cebador EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEQ ID No. 32) que contiene un sitio MluI (subrayado) y pEVE2862 (Figura 33) como plantilla.

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 54 °C / 30 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California). El fragmento de LEU2 de 1,8 kb de longitud amplificado se digirió por restricción con las enzimas ClaI y MluI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal de vector de pEVE2852 (Figura 27) de 2,6 kb digerida por restricción con ClaI y MluI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 34).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE2865 (Figura 35) contiene el marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Para la clonación del vector de integración, pEVE2865 se digirió por restricción con la enzima SalI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y se desfosforiló durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

El fragmento de 4,5 kb purificado en gel de la estructura principal del vector se usó para ligadura. Como inserto, se usó una construcción de expresión doble de genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli liberada de pEVE3318 (Figura 32) mediante corte por restricción con las enzimas NdeI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

El fragmento de 4,4 kb se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y después una purificación en gel adicional. La estructura principal de vector de pEVE2865 y el inserto de pEVE3318 se ligaron durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 34).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3387 (Figura 36) contiene la construcción de doble expresión del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri. Como marcador de selección se usó un gen de LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Ejemplo 19. Construcción de una cepa de P. ohmeri integradora de primera generación que secreta xilitol en los medios

El vector descrito anteriormente se usó para integrar aleatoriamente el gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis en el genoma de P. ohmeri.

Con este fin, la cepa CNCM I-4955 (Ejemplo 16) auxótrofa para leucina se transformó con pEVE3387 (Figura 36) digerido por restricción con NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 3 h a 37 °C según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de sorbitol sin ninguna leucina.

La cepa resultante contiene el gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis integrados aleatoriamente en el genoma de P. ohmeri y se depositó en Francia el 20 de mayo de 2015, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección nacional de cultivos de microorganismos] del Instituto Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARÍS Cedex 15, con el número I-4982.

Ejemplo 20. Construcción de un plásmido de doble/triple expresión que comprenden la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

Para poder expresar la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli en la cepa de P. ohmeri mutante solo auxótrofa para leucina, fue necesaria la construcción de un plásmido de expresión doble.

El casete de expresión que contenía la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans se liberó de pEVE3284 (Figura 10) mediante corte de restricción con las enzimas SpeI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). El fragmento de 1,6 kb se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C. La estructura principal de vector consistía en la estructura principal de pEVE3157 (Figura 21) de 12,1 kb linealizada por SpeI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel (kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ - Zymo Research Corporation, Irvine, California) que contenía la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli.

La estructura principal se había despuntado adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), posteriormente se había sometido a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y se había desfosforilado durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 37).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

Los plásmidos resultantes pEVE3322 y pEVE3324 (Figura 38) contienen la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para nA d PH de G. oxydans flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri o la construcción de triple expresión de dos genes de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

Ejemplo 21. Construcción de vectores integradores para la expresión del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y el gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans en P. ohmeri.

Además del vector integrador que contiene la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis y el gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli también se generaron plásmidos que contenían la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans.

Con este fin, los casetes de expresión doble y triple que contenían uno o dos xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli se liberaron de pEVE3322 y pEVE3324 (Figura 38), respectivamente, mediante corte por restricción con las enzimas NdeI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Los fragmentos de 4,1 kb y 5,7 kb se purificaron en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntaron con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometieron a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C. Como vector se usó pEVE2865 (Figura 35) purificado en gel (kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ - Zymo Research Corporation, Irvine, California) de 5,7 kb linealizado por Salí.

La estructura principal de vector se había despuntado adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), posteriormente se había sometido a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y se había desfosforilado durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura del vector y el inserto se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 39).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

Los plásmidos resultantes pEVE3390 y pEVE3392 (Figura 40) contienen las construcciones de doble o triple expresión de uno o dos genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri. Como marcador de selección se usó un gen de LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Ejemplo 22. Construcción de cepas integradoras de segunda generación capaces de secretar más de 100 g/L de xilitol

Se usó la cepa CNCM I-4982 de primera generación que contenía una copia integrada aleatoriamente del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de P. stipitis para integrar además copias adicionales de las dos enzimas heterólogas.

Sin embargo, para poder integrar las construcciones indicadas anteriormente, se debía eliminar el marcador de selección LEU2. Con este fin, la cepa CNCM I-4982 de primera generación se transformó con el vector pEVE3163 según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. El vector pEVE3163 contiene la CRE recombinasa del bacteriófago P1 (optimizado por codón según la Tabla 7) flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR). La eliminación del marcador de selección LEU2 se confirmó por la ausencia de crecimiento de clones sobre las placas sin leucina.

La cepa resultante EYS3842 se transformó con pEVE3390 o pEVE3392 (Figura 40) digerido por restricción con NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 3 h a 37 °C según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de sorbitol sin ninguna leucina.

La cepa EYS3929 de segunda generación resultante contiene dos genes de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y dos genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, uno de G. oxydans y un segundo de P. stipitis integrados aleatoriamente en el genoma. La cepa EYS3930, por otro lado, contiene un gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans adicional.

Ejemplo 23. Construcción de un vector adicional usado para la integración de copias de genes adicionales de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans

Para construir un vector de integración adicional, se amplificó un casete de doble expresión de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli y la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans mediante PCR usando:

- el cebador EV4904 (ATATCCCGGGCACCGTCATCACCGAAACGC) (SEQ ID No. 40) que contiene un sitio SmaI y

- el cebador EV4905 (ATATCCCGGGCACGACCACGCTGATGAGC) (SEQ ID No. 41) que contiene un sitio SmaI (subrayado) y

pEVE3321 como plantilla.

La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que consistía en 200 pM de cada dNTP y 0,5 pM de cada cebador con 0,02 U/pl de polimerasa iProof™ (BIO-RAD, Hercules, California) en 1X del tampón adecuado. La PCR se logró con una etapa de desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C y posteriormente 30 ciclos con 10 s a 98 °C / 10 s a 68 °C / 75 s a 72 °C, y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72 °C. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 1 %, se extrajo y purificó usando el kit de recuperación de ADN en gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, California).

El fragmento de 3,9 kb de longitud amplificado se digirió por restricción con SmaI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se ligó durante 2 h a temperatura ambiente con la estructura principal de vector de pEVE2865 (Figura 35) de 4,4 kb linealizada con PvuII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), desfosforilada con fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 41).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

Los plásmidos resultantes pEVE4390 (Figura 42) contiene la construcción de doble expresión de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK1) y el terminador de transcetolasa (poTKL) de P. ohmeri y del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR). Como marcador de selección se usó un gen de LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dos sitios loxP.

Ejemplo 24. Construcción de un vector usado para la integración de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxvdans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum

Se construyó un vector integrador adicional para la expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y de la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum de la siguiente manera: En una primera etapa, se generó un vector de expresión doble que contenía los dos genes mencionados anteriormente. Este casete de expresión doble se clonó en un vector loxP integrador.

Un fragmento de ADN que codifica el gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de Ralstonia solanacearum se sintetizó químicamente mediante síntesis de genes GeneArt® (Life Technologies, Regensburg, Alemania) según la secuencia enviada de la SEQ ID No.: 42.

Los nucleótidos 2310548 a 2309151 de la secuencia AL646052.1 (obtenida de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL646052) que codifica el gen dalD se usaron como plantilla y se sometieron a optimización por codón para su uso en P. ohmeri ATCC 20209 según la Tabla 7 (más arriba), usando el programa Optimizer obtenido de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/. En los extremos 5' y 3' de la secuencia resultante, se agregaron manualmente en el fichero de texto nucleótidos que codifican los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción AscI (GGCGCGCC) y SphI (GCATGC), respectivamente, para facilitar la clonación adicional. Además, se incluyó un triplete de adenosina adelante del ATG inicial para compensar una adenosina en la posición -3 en la secuencia de levaduras similares a Kozak.

A continuación, la secuencia final (SEQ ID No.: 42) se envió para su síntesis a GeneArt (Regensburg, Alemania). El fragmento de ADN sintetizado que codifica el gen dalD se suministró como 5 pg de ADN plasmídico liofilizado en un vector derivado de pMA-RQ (13AB2EGP, Figura 43).

El fragmento de 1,4 kb de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para de R. solanacearum se liberó del vector 13AB2EGP (Figura 43) mediante digestión por restricción con AscI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California). Después, el inserto se ligó con la estructura principal de pEVE2560 (Figura 8) de 11,8 kb linealizada con AscI y SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) y purificada en gel usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 44).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE3898 (Figura 45) contiene la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum optimizada por codón flanqueada por un promotor y terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

En una siguiente etapa, el casete de expresión que contenía la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK) y un terminador de ribulosa reductasa (poRR) se liberó de pEVE3960 mediante digestión por restricción con SpeI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). El fragmento de 1,8 kb se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C. Como vector se usó pEVE3898 purificado en gel (kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ - Zymo Research Corporation, Irvine, California) de 13,2 kb linealizado por SalI. La estructura principal de vector se había despuntado adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), posteriormente se había sometido a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C y se había desfosforilado durante 1 h a 37 °C usando fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura del vector y el inserto se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 44).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Plasmid Miniprep Zyppy™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE4077 (Figura 46) contiene la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por un promotor de fosfoglicerato cinasa (poPGK) y un terminador de ribulosa reductasa de P. ohmeri (poRR) y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum bajo el control del promotor y el terminador de ribulosa reductasa (poRR) de P. ohmeri y el marcador de selección poLEU2.

Finalmente, el casete de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum se liberó de pEVE4077 (Figura 46) mediante corte de restricción con SapI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). El fragmento de 5,9 kb se purificó en gel usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se despuntó con el kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a inactivación térmica de las enzimas durante 10 min a 70 °C. Como vector se usó pEVE2865 (Figura 35) purificado en gel (kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ - Zymo Research Corporation, Irvine, California) de 4,4 kb linealizado por ÉcoRV, desfosforilado durante 1 h a 37 °C con fosfatasa Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). La ligadura del vector y el inserto se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts)

(Figura 44).

Después de la transformación de las células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con la mezcla de ligadura, se aisló el ADN plasmídico usando el kit Zyppy™ Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, California) y se caracterizó adicionalmente mediante digestión por restricción y secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza).

El plásmido resultante pEVE4377 (Figura 47) contiene la construcción de doble expresión de la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de R. solanacearum y el marcador de selección poLEU2 flanqueado por dos sitios loxP.

Ejemplo 25. Construcción de cepas integradores de tercera generación con productividad aumentada de xilitol

El marcador LEU2 de las cepas EYS3929 y EYS3930 de segunda generación (Ejemplo 22) se retiró con oxígeno líquido según se describe en el Ejemplo 18 usando el vector pEVE3163. Las cepas resultantes EYS4118 y EYS4119 se transformaron con pEVE4377 (Figura 47) y pEVE4390 (Figura 42), respectivamente. Los vectores se digirieron por restricción con NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 3 h a 37 °C según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de sorbitol sin ninguna leucina.

La cepa de tercera generación resultante EYS4353 contiene tres genes de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+, dos de E. coli y una de R. solanacearum, y tres genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, dos de G. oxydans y una de P. stipitis integrados aleatoriamente en el genoma.

La segunda cepa de tercera generación, por otro lado, contiene tres copias de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ de E. coli, tres copias de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH de G. oxydans y una copia de P. stipitis en el fondo y se depositó en Francia el 5 de marzo de 2015, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección nacional de cultivos de microorganismos] del Instituto Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARÍS Cedex 15, con el número I-4960.

Ejemplo 26. Construcción de cepas integradoras de cuarta generación

El marcador LEU2 de las cepas CNCM I-4960 de segunda generación (Ejemplo 25) se retiró con oxígeno líquido según se describe en el Ejemplo 18 usando el vector pEVE3163. La cepa resultante EYS4955 se transformó con pEVE4377 (Figura 47) digerido por restricción con NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 3 h a 37 °C según el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de sorbitol sin ninguna leucina.

La cepa resultante de cuarta generación contiene cuatro genes de D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+, tres de E. coli y una de R. solanacearum y cuatro genes de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, tres de G. oxydans y uno de P. stipitis integrados aleatoriamente en el genoma y se depositó en Francia el 20 de mayo de 2015, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección nacional de cultivos de microorganismos] del Instituto Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 pA r ÍS Cedex 15, con el número I-4981.

Ejemplo 27. Producción de poliol con cepas de Pichia ohmeri (medio sintético)

Las cepas de levadura CNCM I-4605, CNCM I-4982, CNCM I-4960 y CNCM I-4981 construidas según se describió anteriormente, se fermentaron según el siguiente protocolo.

El proceso de fermentación se lleva a cabo con limitación de Nitrógeno y se puede separar en una fase de crecimiento y una fase de producción. Durante la fase de crecimiento, el amoníaco en el medio se consume completamente para producir biomasa, después de que se detiene la formación de biomasa se inicia la fase de producción y aumentan los niveles de Poliol. La plataforma usada para el proceso de fermentación descrito fue una Multifors 2 de INFORS HT, usando recipientes con un volumen de trabajo de 1 L. Los fermentadores se equiparon con dos turbinas de disco de seis palas Rushton. Se usó aire para lavar los fermentadores.

La temperatura, el pH, la agitación y la velocidad de aireación se controlaron a lo largo del cultivo. La temperatura se mantuvo a 36 °C. El pH se mantuvo a 3 mediante adición automática de 5M KOH.

La velocidad de aireación se mantuvo a 1,0 vvm y la velocidad inicial del agitador se fijó en 300 rpm. Para evitar que el oxígeno disuelto (DO, por sus siglas en inglés) cayera por debajo de 20 %, se empleó una cascada de agitación automática. Las condiciones de funcionamiento usadas en el proceso de fermentación se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10: Condiciones de funcionamiento para las fermentaciones de producción de Poliol

Parámetro Punto de ajuste

Volumen de líquido [L] 1

Temperatura [° C] 36

pH 3

Parámetro Punto de ajuste

Velocidad de agitación [rpm] Inicialmente 300, después el punto de ajuste de DO

(20 %) se controló por la cascada del agitador Velocidad de flujo 1

de aire [vvm]

Para la inoculación de los fermentadores, se usó un cultivo de propagación de 1 fase. La composición del medio de cultivo de propagación usado se describe en la Tabla 11. Los cultivos de propagación se prepararon al inocular 100 ml de medio en un matraz de agitación de 500 ml con 4 deflectores (muesca). Los matraces de agitación se incubaron en una mesa vibratoria a 30 °C y 150 rpm. Las células se cultivaron durante ~24 h en fase media exponencial.

Tabla 11: Composición del medio de cultivo de propagación

Materia prima Concentración [g/L] Monohidrato de glucosa C6H12O6*H2O 46

Antiespumante Erol 18 1 gota Dihidrogenofosfato de potasio KH₂PO₄ 6

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4*7H2O 2,4

Sulfato de amonio (NH4)2SO4 0,16

Sulfato de hierro(II) amonio hexahidratado Fe(SO4)2(NH4)2*6H2O 0,012

Sulfato de manganeso (II) monohidratado MnSO4*H2O 0,0007

Sulfato de zinc heptahidratado ZnSO4*7H2O 0,00007

Biotina C10H16N2O3S 0,0004

Fosfato sódico Na²HPO⁴ 0,292

Ácido cítrico monohidratado C6H8O7*H2O 0,835

Antes de la inoculación, se retiró una cantidad del medio en el fermentador equivalente a la cantidad de inóculo y se usó una alícuota del cultivo de propagación para la inoculación del fermentador hasta un volumen final de 1 L y una OD⁶⁰⁰ en el inicio de aprox. 0,2 (CDW aprox. 0,03 g/L). La composición del medio usado en el fermentador se describe en la Tabla 12.

Tabla 12: Composición del medio de fermentación.

Materia prima Concentración [g/L] Monohidrato de glucosa C6H12O6*H2O 250 Antiespumante Erol 18 0,67 Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 6

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4*7H2O 2,4

Materia prima Concentración [g/L] Sulfato de amonio (NH4)2SO4 4

Sulfato de hierro(II) amonio Fe(SO4)2(NH4)2*6

hexahidratado _H2O 0,012

Sulfato de manganeso (II)

_{monohidratado} MnSO4*H2O 0,0007

Sulfato de zinc heptahidratado ZnSO4*7H2O 0,00007

Biotina C¹⁰H¹⁶N²O³S 0,0004

Se tomaron muestras en intervalos regulares y el caldo de fermentación total se analizó para determinar el consumo de Glucosa y la formación de Poliol extracelular (Xilitol, Arabitol y Ribitol). Además, se determinaron los metabolitos de fermentación comunes (Glicerol, Acetato, Etanol, Piruvato, Malato, Fumarato y Succinato). El aumento de la biomasa se monitorizó, por un lado, por la OD⁶⁰⁰ y, por otro lado, por la determinación del peso seco celular (CDW, por sus siglas en inglés). Las mediciones mencionadas anteriormente se usaron para determinar la producción de Poliol, rendimiento y productividad de Arabitol o Xilitol; los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13: Producción de poliol con cepas de Pichia ohmeri (medio sintético).

CNCM I-4605 CNCM I-4982 CNCM I-4960 CNCM I-4981 Tiempo de fermentación transcurrido (EFT) 6 _[h] 7 79 146 64 66

Glucosa [g/L] 0 0 0 0 0

Arabitol [g/L] 118 74 0 0 0

Ribitol [g/L] 0 6 2 7 5

Xilitol [g/L] 0 28 60 110 120 Rendimiento de Arabitol [%] 52 - - - -Rendimiento de Xilitol [%] - 12 26 44 48 Productividad [g/L/h] 1,76 0,35 0,41 1,71 1,81

CNCM I-4605 de Pichia ohmeri produce solo arabitol.

CNCM I-4982 de Pichia ohmeri produce arabitol, xilitol y ribitol. En esta cepa, se había integrado una copia del gen de D-arabitol 4-oxidorreductasa para NAD+ y una copia del gen de xilitol deshidrogenasa específica para NADPH. La cepa modificada ahora es capaz de consumir arabitol. En consecuencia, después del consumo total de la glucosa, CNCM I-4982 reconsume arabitol y ribitol para producir más xilitol.

CNCM I-4960 (tercera generación) y CNCM I-4981 (cuarta generación) de Pichia ohmeri producen xilitol y ribitol, pero no más arabitol. La conversión intracelular de arabitol en xilulosa y xilitol es suficientemente eficaz para evitar la excreción de arabitol en el caldo.

Cuantas más copias introducidas en P. ohmeri de los genes que codifican D-arabitol oxidorreductasa específica para NAD+ y xilitol deshidrogenasa específica para NADPH, mayor es la titulación, rendimiento y productividad de xilitol.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedante recombinante capaz de producir xilitol, en donde dicha célula hospedante comprende: una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) que usa D-arabitol como sustrato y que produce D-xilulosa como producto; y

una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una xilitol deshidrogenasa específica para NADPH que usa D-xilulosa como sustrato y que produce xilitol como producto,

en donde la célula hospedante produce D-arabitol a partir de D-glucosa, en particular en medio a presión osmótica elevada y no consume D-arabitol como única fuente de carbono.

2. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 1, en donde la célula hospedante se selecciona de bacterias, hongos y levadura.

3. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 2, en donde la célula hospedante es una levadura osmófila u osmotolerante.

4. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 2, en donde la célula hospedante es Pichia ohmeri.

5. La célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) es de E. coli o Ralstonia solanacearum.

6. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 5, en donde la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) comprende o consiste en la secuencia seleccionada del grupo de la sec. con núm. de ident.

2 o 43 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos.

7. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 6, en donde la secuencia que codifica la D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ (EC 1.1.1.11) comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 3 o la sec. con núm. de ident. 42.

8. La célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH es una xilitol deshidrogenasa de Pichia stipitis o Gluconobacter oxydans mutada para cambiar la especificidad para el cofactor de NADH a NADPH.

9. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 8, en donde la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 5 u 8 o una secuencia con 1-3 adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos.

10. La célula hospedante recombinante según la reivindicación 9, en donde la secuencia que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH comprende o consiste en la secuencia de la sec. con núm. de ident. 6 o 9.

11. La célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la célula hospedante es capaz de producir un título de xilitol de al menos 15 g/l en el sobrenadante después de un cultivo de 48 horas.

12. La célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la célula hospedante es una cepa seleccionada de las cepas I-4982, I-4960 y I-4981 depositadas en la CNCM.

13. La célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la célula hospedante comprende varias copias de una secuencia que codifica D-arabitol 4-oxidorreductasa específica para NAD+ y/o varias copias de una secuencia que codifica la xilitol deshidrogenasa específica para NADPH.

14. Un método para producir xilitol que comprende cultivar una célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y recuperar xilitol.

15. Uso de una célula hospedante recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para producir xilitol.