WO2013051499A1 - ３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法 - Google Patents

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WO2013051499A1
WO2013051499A1 PCT/JP2012/075352 JP2012075352W WO2013051499A1 WO 2013051499 A1 WO2013051499 A1 WO 2013051499A1 JP 2012075352 W JP2012075352 W JP 2012075352W WO 2013051499 A1 WO2013051499 A1 WO 2013051499A1
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culture
salt
hydroxybutyric acid
halomonas
medium
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PCT/JP2012/075352
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河田　悦和
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof.
  • 3-hydroxybutyric acid is made from acetyl-CoA in the liver and is used as a brain energy source when the blood glucose level is low, and it suppresses the transfer of enteric bacteria into the blood (patented) Reference 1) is used as an infusion. It is also used as a raw material for biodegradable plastics.
  • Non-Patent Document 1 “32 compounds that can be expected as starting intermediates for biorefinery” mentions 3-hydroxybutyric acid as a promising compound as a starting intermediate for biorefinery. It is highly anticipated.
  • the present inventors have studied an efficient culture method for the microalga Spirulina, which is known to have little contamination with other fungi even after commercial outdoor culture. It was observed that certain halophilic bacteria grew as the only contaminating bacteria. The halophilic bacterium itself grows well in a medium containing a high concentration of sodium, usually under a pH of about 5 to 12, so that contamination with other bacteria is extremely difficult even under aerobic fermentation. It was estimated. Then, assimilation of various carbon sources of the halophilic bacteria was examined, it was clarified that a significant amount of polyhydroxyalkanoate (PHAs) was accumulated in the cells of the halophilic bacteria. (Patent Document 3).
  • PHAs polyhydroxyalkanoate
  • Patent Document 4 describes a study specializing in the production of PHAs of the halophilic bacteria, and it is also known that the halophilic bacteria are involved in the production of specific substances such as lactic acid and acetic acid (Patent Documents). 4). There is also a method of producing 3-hydroxybutyric acid at a yield of 117 g / L by culturing cells belonging to a specific genus and then autolyzing the cells under anaerobic conditions over about 6 hours. It has been reported (Non-Patent Document 6).
  • the main object of the present invention is to provide a method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof inexpensively, easily and efficiently.
  • Non-Patent Document 6 discloses a method for producing 3-hydroxybutyric acid using cells, the cell used is Alcaligenes latus, and a method for producing 3-hydroxybutyric acid while dissolving the cells. It is. Therefore, it is necessary to consider that other microbial cells are mixed when cultivating the microbial cells, an expensive medium is required, and there are many contaminants derived from microbial cells such as DNA and proteins. There is a problem that it is necessary to purify 3-hydroxybutyric acid from the dissolved solution.
  • PHB accumulates in bacterial cells when halophilic bacteria belonging to a specific genus are cultured using a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources (patents).
  • PHB is accumulated as an energy source and carbon source in the microbial cells, under aerobic conditions, when the carbon source is depleted and the energy source is insufficient, these are decomposed and undergo a glycolysis and TCA cycle. It was assumed that it was being used. However, there are no reports of how they work under microaerobic or anaerobic conditions.
  • the inventor of the present application as a result of earnest research under such a background, after accumulating PHB in the microbial cells by culturing halophilic bacteria belonging to a specific genus under aerobic conditions, It was found that by changing the culture conditions to microaerobic conditions, PHB was decomposed and decreased in the cells, and 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof was produced in the medium outside the cells.
  • the culture for accumulating the PHB is a culture using biodiesel (hereinafter referred to as BDF (registered trademark) in some cases), a mixed culture with a microalga Spirulina or the like capable of photosynthesis, It has also been found that it is possible to culture in an environment where contamination with other bacteria hardly occurs.
  • BDF biodiesel
  • the present invention has been completed based on these findings, and has been completed.
  • the present invention broadly encompasses the following methods for producing 3-hydroxybutyric acid or salts thereof.
  • Item 1 A process for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof comprising the following steps (1) to (3): (1) Step 1 of aerobic culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas in a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources, (2) Step 2 of culturing the cells by changing the culture condition in Step 1 from aerobic culture to microaerobic culture, and producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture solution; (3) Step 3 for recovering 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof from the culture medium obtained in Step 2.
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein 3 g or more of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is contained per liter of the culture solution obtained in Step 2.
  • Item 3 The method according to any one of Items 1 or 2, wherein the organic carbon source is glycerol or waste glycerol.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the halophilic bacterium is Halomonas sp. KM-1 strain (FERM BP-10995).
  • the production method according to the present invention can accumulate 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the medium in a significant amount, and partly in the cells.
  • the production method according to the present invention includes a step of culturing a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas, and the culturing of the halophilic bacterium can be cultivated in an environment where contamination with other bacteria hardly occurs. It is an excellent manufacturing method because the air supply conditions can be easily changed.
  • the halophilic bacteria used in the production method according to the present invention include, for example, inexpensive inorganic salts, waste glycerol by-produced in biodiesel production, wood saccharified solution produced in the process of ethanol fermentation, etc. as an organic carbon source. It can be used alone or in combination with other organic carbon sources. Furthermore, pentoses such as xylose and arabinose, which are obtained in ethanol fermentation using yeast cells and are difficult to use, can be effectively used as an organic carbon source.
  • the residue after ethanol fermentation of a wood saccharified solution using yeast cells that have not been genetically modified (mainly containing xylol and arabinose) is used as an organic carbon source to produce 3-hydroxy It is possible to produce butyric acid or a salt thereof.
  • 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof can be produced in a medium. This is an excellent production method because a fraction containing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof can be easily recovered from the culture solution, and even if a purification step is performed, a simple purification method can be applied.
  • 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof can be recovered from the culture solution under conditions that do not involve lysis of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas.
  • purifying hydroxybutyric acid or a salt thereof there is an effect that a purification process for removing contaminant molecules such as nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid and the like accompanying lysis becomes very simple.
  • 3-Hydroxybutyric acid or a salt thereof obtained by the production method according to the present invention is not only added to a medical infusion solution or polymerized as it is, but also has optical activity such as cosmetics, pharmaceuticals, and functional foods. It is useful as a raw material and refinery.
  • FIG. 3 is a graph showing the turbidity OD600 (vertical axis) and culture time (horizontal axis: h) of halophilic bacteria Halomonas sp. KM-1 strain cultured at 33 ° C. using glucose and glycerol. All “%” shown in the legend indicates “w / v%” (the same applies to FIGS. 2 to 7).
  • 5% of the carbon source is obtained at the initial stage of growth and 24 hours after the culture. The source was supplied.
  • the cells were cultured at 200 rpm under aerobic conditions, and changed to microaerobic conditions at 50 rpm at 36 hours.
  • the following conditions show the analysis values during the same culture in a graph.
  • the dry cell weight (vertical axis: g / L) and culture time (horizontal axis: h) accumulated when the halophilic bacterium Halomonas sp. KM-1 strain was cultured at 33 ° C. using glucose and glycerol. It is the shown graph.
  • the proportion of PHB accumulated when the halophilic bacterium Halomonas sp. KM-1 strain was cultured at 33 ° C. using glucose and glycerol (vertical axis: PHB / dry cells (%)) and culture time (horizontal axis) : H).
  • glucose and glycerol vertical axis: g (PHB) / L (culture solution)
  • culture time The horizontal axis is a graph showing h).
  • vertical axis: 3 is a graph showing the examination of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof (g) / culture supernatant (L) and culture time (horizontal axis: h).
  • Bacterial turbidity OD600 when halophilic bacteria Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas pantherariensis (ATCC 700273), and Halomonas campisaris (ATCC 70000597) were cultured at 33 ° C. with 10% glycerol.
  • KM-1 strain, Halomonas pantherariensis (ATCC 700273), and Halomonas campisalis (ATCC 70000597) were cultured at 33 ° C. with 10% glycerol. It is the graph which showed (vertical axis: g (PHB) / L (culture solution)) and culture time (horizontal axis: h).
  • the halophilic bacteria Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas pantherariensis (ATCC 700273), and Halomonas campisalis (ATCC 70000597) accumulate in the supernatant when cultured at 33 ° C. with 10% glycerol.
  • FIG 3 is a graph showing the ratio of 3-hydroxybutyric acid or its salt in the supernatant (vertical axis: 3-hydroxybutyric acid (g) / culture supernatant (L) and culture time (horizontal axis: h)).
  • the method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof according to the present invention is a method comprising the following steps (1) to (3) using a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas.
  • Step 1 of aerobic culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas in a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources (2) Step 2 of culturing the cells by changing the culture condition in Step 1 from aerobic culture to microaerobic culture, and producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture solution; (3) Step 3 for recovering 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof from the culture medium obtained in Step 2.
  • the 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof produced by the production method according to the present invention is a compound having normal optical activity in vivo and is D-form.
  • the salt of 3-hydroxybutyric acid is a salt formed by a cation derived from a component contained in a medium of a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas used at the time of manufacture.
  • a cation derived from a component contained in a medium of a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas used at the time of manufacture For example, sodium salt, potassium salt, calcium Examples thereof include magnesium salt, cobalt salt, zinc salt, iron salt, copper salt and the like.
  • Step 1 in the method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof according to the present invention comprises aerobic culture of a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas in a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources. It is a process.
  • the halophilic bacterium used in the production method step 1 of the present invention may be a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas represented by either (i) or (ii) below.
  • inorganic salt and “organic carbon source” will be described later in the section ⁇ Medium>.
  • microaerobic conditions will be described in detail in the section ⁇ Culture method> in step 2 below.
  • Halomonas can use both oxidative metabolism and anaerobic metabolism, can survive regardless of the presence of free oxygen, and grow in the presence of free oxygen. It is a microbial cell having the property of a so-called facultative anaerobic bacterium that tends to be easy.
  • halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas are bacteria that have a halophilic property with a suitable salt concentration of 0.1 to 1.0 M and sometimes grow even in a medium containing no salt.
  • the halophilic bacteria belonging to the above genus Halomonas usually grow in a medium having a pH of about 5-12.
  • Halomonas sp. KM-1 strain examples include the Halomonas sp. KM-1 strain.
  • Halomonas SP KM-1 stock was commissioned on July 10, 2007 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Central 1-1, Higashi 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki 305-8586) Deposited under the number FERM P-21316.
  • This strain has now been transferred to an international deposit and its deposit number is FERM BP-10995.
  • the 16S rRNA gene of the Halomonas sp. KM-1 strain is registered with DDBJ as Accession Number AB477015.
  • Halomonas pantheraliensis there may also be mentioned Halomonas panteleriensis (ATCC 700033), Halomonas campisalis (ATCC 70000597) and the like.
  • halophilic bacteria belonging to the above-mentioned genus Halomonas but also halomonas nitritofilus, halomonas amentalia and the like are belonging to the genus Halomonas used in the production method according to the present invention. It may be used as a fungus.
  • a gene may be introduced into the halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas described above.
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it can express the function of improving the production efficiency of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the production method according to the present invention.
  • a gene that increases the expression level of PHB a gene that expresses a function of increasing the accumulation of PHB in the microbial cell; a gene that increases the function of producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in a culture solution; Examples include a gene that increases the production amount of hydroxybutyric acid or a salt thereof; a gene that degrades PHB, and the like.
  • the introduction of these genes into halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas is carried out by preparing a recombinant DNA in which the introduced gene can be expressed in the microbial cells, and introducing this into the microbial cells for transformation.
  • a plasmid vector that can be replicated in the fungus body is used, and a promoter and an SD (Shine and Dalgarno) base sequence upstream of the gene so that the gene can be expressed in the vector, and an initiation codon necessary for initiation of transcription.
  • an expression plasmid provided with (for example, ATG).
  • Various general methods can be adopted as a method for introducing the desired recombinant DNA thus obtained into the cells and a transformation method using the same.
  • the medium used in step 1 is a medium added to an inorganic salt and a single or plural organic carbon sources.
  • the pH of the medium is not particularly limited, but is preferably a pH that satisfies the above-mentioned growth conditions for halophilic bacteria. Specifically, the pH may be about 5 to 12. A medium having a pH of 8.8 to 12 is more preferable. The use of an alkaline medium is preferable because contamination of other bacteria can be more effectively prevented.
  • the inorganic salt to be blended in the medium used in Step 1 is not particularly limited.
  • phosphate, nitrate, carbonate, sulfate, sodium, magnesium, potassium, manganese, iron, zinc, copper, cobalt And metal salts such as
  • NaCl sodium is used as the inorganic salt
  • NaNO 3 sodium nitride
  • NaHCO 3 sodium carbonate
  • Na 2 CO 3 sodium carbonate
  • inorganic salts it is preferable to use a compound that becomes a nitrogen source or a phosphorus source for the halophilic bacteria described above.
  • nitrate, nitrite, ammonium salt, or the like may be used as the nitrogen source, and more specifically, a compound such as NaNO 3 , NaNO 2 , NH 4 Cl may be used.
  • the amount of the nitrogen source used may be appropriately set within the range in which the production objective of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof of the present invention is achieved without affecting the growth of bacterial cells.
  • the nitrate may be about 500 mg or more, more preferably about 1000 mg or more, and still more preferably about 1250 mg or more.
  • phosphate As the phosphorus source, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, or the like may be used, and more specifically, compounds such as K 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 may be used. .
  • the usage amount of the phosphorus source may be appropriately set from the same viewpoint as the usage amount of the nitrogen source, and specifically, it may be usually about 50 to 400 mg per 100 ml of the medium as dihydrogen phosphate, More preferably, it is about 100 to 200 mg.
  • These inorganic salts may be used alone or in combination of two or more.
  • the inorganic salt including other compounds may be used at a concentration that is generally about 0.1 to 2.5 M, preferably about 0.2 to 1.0 M, more preferably 0.2 to 0. About 5M.
  • the organic carbon source to be blended in the medium used in step 1 is not particularly limited.
  • tryptone for example, tryptone, yeast extract, soluble starch, hexose (glucose, fructose), pentose (xylose, arabinose), two Examples thereof include sugar (sucrose), sugar alcohol (mannitol, sorbitol), ethanol, n-propanol, acetic acid, sodium acetate, propionic acid, glycerol, waste glycerol and the like.
  • waste bee sugar, wood saccharified solution, or residue thereof can also be used as the organic carbon source.
  • waste glycerol, waste bees sugar and the like are preferable.
  • These organic carbon sources may be used alone or in combination of two or more.
  • the waste glycerol of the present invention is a fatty acid methyl obtained by adding an alcohol such as methanol and an alkali catalyst such as KOH or NaOH to oils and fats derived from plants, animals, etc., and reacting them at a temperature of about 65 ° C. It is obtained as a by-product during the production of biodiesel based on esters.
  • the composition of the above-mentioned waste glycerol varies depending on the biodiesel production facility and the composition of the oil used as a raw material, and is not particularly limited.
  • waste glycerol having a glycerol concentration of about 30 to 65%, containing the alkali catalyst of about 4 to 7%, and a pH of about 10 to 12 can be mentioned.
  • the waste glycerol contains water used when washing the obtained biodiesel.
  • the amount of the organic carbon source described above varies depending on the type of organic carbon source to be used. Usually, the final concentration of the organic carbon source is usually about 1 to 20% w / v with respect to the medium. Good.
  • the amount used is usually about 1 to 20 w / v%, preferably about 10 to 15 w / v%, based on the medium.
  • halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas are cultured in a medium under conditions where the salt concentration is relatively high, there is almost no fear of contamination with other bacterial cells. There is no need to perform sterilization or the like, and culture can be performed with simple equipment.
  • ⁇ C culture method>
  • the culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas in step 1 employs aerobic culture.
  • the aerobic culture in step 1 is not particularly limited as long as it is aerobic culture that allows the cells to proliferate and accumulate PHB in the cells.
  • the halophilic bacterium is inoculated into the medium, and precultured at about 30 to 37 ° C. with a stirring speed of about 120 to 180 rpm overnight while shaking.
  • the microbial cells obtained by pre-culture are diluted about 100 times in a medium contained in an Erlenmeyer flask, a fermenter, a jar fermenter, etc., and main culture is performed.
  • the main culture is usually possible at about 20 to 45 ° C, but is preferably performed at about 30 to 37 ° C.
  • the stirring speed at this time is usually about 150 to 250 rpm.
  • the culture environment may be an environment where the culture medium is exposed to air, and a method of positively spraying a gas containing oxygen on the surface of the culture solution or a method of blowing expectations related to the culture medium may be employed.
  • halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas may be aerobically cultured under such culture conditions.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution at the time of aerobic culture is not particularly limited, but is usually 2 mg / L or more.
  • Examples of the culture method in Step 1 include a culture method such as batch culture, semi-batch culture, and continuous culture, and are not particularly limited. However, in order to efficiently produce 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof, the method according to the present invention is used. Considering that the possibility that halophilic bacteria used in the method are mixed with other bacteria is extremely low, batch culture or semi-batch culture is preferable.
  • Step 2 In the method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof according to the present invention, after the completion of the above step 1, the cells are microaerobically cultured and 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is cultured in a culture solution. It is a process for producing salt.
  • producing 3-hydroxybutyric acid in the culture medium means that 3-hydroxybutyric acid is secreted into the culture liquid from halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas obtained by culturing in step 1.
  • protoduces a salt of 3-hydroxybutyric acid in the culture solution means that 3-hydroxybutyric acid secreted into the culture solution reacts with the above-mentioned cation component present in the culture solution, It means forming a salt of 3-hydroxybutyric acid.
  • step 2 the culture conditions need only be changed to microaerobic conditions, and halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas that have accumulated PHB obtained in step 1 in the cells are collected and cultured in a new medium. Even if the culture condition is changed to the microaerobic condition without changing the culture medium, a new culture medium may be added at the end of step 1 and cultured.
  • the amount of PHB accumulated in the halobacteria belonging to the genus Halomonas obtained in step 1 is the maximum.
  • the maximum time is not necessarily limited to a single time, and the culture condition is changed to microaerobic culture at a time when the accumulated amount of PHB in the cells is usually 60% or more of the maximum value. Change it.
  • what is necessary is just to employ
  • ⁇ D Culture method>
  • the microaerobic culture in the step 2 is not cultivating the medium or the culture environment completely under anaerobic conditions but cultivating by a method that does not actively aerate oxygen.
  • the culture method under such microaerobic conditions is not particularly limited, and examples thereof include a method of culturing at a stirring speed of 100 rpm or less, preferably 50 rpm or less in a state where the medium surface is in contact with air.
  • stirring is completely stopped because dissolved oxygen in the culture solution disappears quickly.
  • the dissolved oxygen concentration in a culture solution is not specifically limited, Usually, what is necessary is just to be 2 mg / L or less.
  • it is not preferable in step 2 that the halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas are rapidly lysed if there is no oxygen dissolved in the culture solution.
  • step 2 halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas that have accumulated PHB obtained in step 1 in the cells are microaerobically cultured, so that the halophilic bacteria are cultured without being killed.
  • PCR primers specific for the 16S ribosomal RNA sequence of Halomonas bacteria are used (amplification length is 184 bp), and a real-time PCR apparatus is used. It may be confirmed by measuring the genomic DNA concentration in the supernatant.
  • the amount of DNA in the culture medium under the microaerobic condition using the method as described above is usually 0.5 to 2.5 mg / L from the start of the culture under the microaerobic condition until approximately 72 hours. It will be about.
  • halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas may be cultured under conditions such that the amount of DNA in the culture medium is as described above, and the culture conditions for the amount of DNA in such culture medium are as follows: This is one measure for satisfying the microaerobic condition in the present invention.
  • the culture time varies depending on the conditions of the medium such as the inorganic salt used in the medium, the organic carbon source, etc., but the incubation time is sufficient to recover a desired amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof as described below.
  • a purification step for removing nucleic acids, proteins, etc. accompanying lysis of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas released into the culture solution May be determined as appropriate in view of the DNA concentration in the culture solution, the concentration of 3-hydroxybutyric acid or its salt in the culture solution, and the like.
  • Step 3 in the method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof according to the present invention is a step of recovering 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof from the culture solution obtained in Step 2 above.
  • the recovery means that when 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is present in the culture solution obtained in step 2, the culture in the above step 2 is stopped, and a culture solution containing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof It is to isolate the halophilic cells.
  • the culture stopping method is not particularly limited, and for example, a method for sterilizing the halophilic bacteria by a method such as heating or acid treatment, a known solid-liquid separation method such as centrifugation or filtration, and a culture solution. The method etc. which isolate
  • the 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof secreted in the culture is particularly useful in aerobic conditions. Since it is re-incorporated into the halophilic bacteria and used, as a result, 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture solution decreases and eventually disappears from the culture solution. When 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is present in the liquid, it is necessary to stop the culture.
  • the method for confirming the presence of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture solution may vary depending on the bacterial species, medium components, culture conditions, and the like, and therefore is appropriately determined in consideration of these factors.
  • an analysis method such as capillary electrophoresis can be used to determine the time for stopping the culture while performing the culture.
  • 3-hydroxybutyric acid is a compound that exhibits acidity
  • the presence of 3-hydroxybutyric acid may be confirmed based on a decrease in the pH of the medium during culture.
  • the recovered salt of 3-hydroxybutyric acid is recovered as an alkali metal salt that reacts with an alkali metal such as sodium or calcium, an alkaline earth metal cation or the like based on an inorganic salt contained in the culture solution. Therefore, in order to produce 3-hydroxybutyric acid, the collected culture solution may be subjected to a conventional method such as distillation. Moreover, you may use the collect
  • the amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof obtained by the production method according to the present invention without containing the lysate derived from the microbial cells in the medium is usually about 3 g or more, preferably 10 g, per 1 L of the medium. More preferably, it is 15.3 g or more, more preferably about 17.2 g or more, and most preferably about 20 g or more.
  • the culture solution obtained by culturing by the following method was centrifuged to collect only the supernatant, and 50 ⁇ L was dried.
  • 0.50 ml of methanol containing 3 vol% H 2 SO 4 was added and heated at 105 ° C. for 1 hour to convert all 3-hydroxybutyric acid or its salt into methyl 3-hydroxybutyrate.
  • 0.50 ml of chloroform and 0.25 ml of distilled water were added and vigorously stirred.
  • 1 ⁇ l of the chloroform layer was collected, and 3-hydroxybutyric acid was analyzed using a gas chromatograph.
  • the cultured medium was centrifuged and only the cells were collected, washed several times with distilled water, and dried.
  • 0.50 ml of methanol containing 3 vol% H 2 SO 4 was added and heated at 105 ° C. for 3 hours.
  • 0.50 ml of chloroform and 0.25 ml of distilled water were added and stirred vigorously.
  • 1 ⁇ l of the chloroform layer was collected and analyzed for PHAs using a gas chromatograph.
  • the PHB preparation was treated and analyzed in the same manner as dry cells, and based on this, the PHB accumulation rate per dry cell (PHB (g) / dry cell weight (g)) was determined.
  • a medium based on SOT modified 5 (Spirulina platendium Medium modified 5) shown in Table 1 was used.
  • This medium is Spirulina platensis Medium (HP NIES), to adjust the amount of NaHCO 3, Na 2 CO 3, the NaNO 3 nitrogen source 5 times, K 2 HPO 4 phosphorus source 4 Adjusted to increase by a factor of two.
  • the pH after adjusting the above medium was 9.4 ⁇ 0.1, and it was used as it was without sterilization operation such as autoclave.
  • halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas A halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas (Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas panterariensis [ATCC 7000027] and Halomonas campisalis [ATCC 70000597]) was added to a 16.5 mm diameter test tube from a plate culture with 5 ml.
  • the above SOT5 modified medium in this case, a medium containing 1 w / v% glucose or the like as a carbon source was used was added and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
  • the culture was performed under aerobic conditions with a stirring speed of 200 rpm, and the stirring speed was changed to 50 rpm with a stirring speed of 50 rpm at 36 hours. After sampling, the culture broth was re-silicosed, continued shaking culture at 33 ° C., and batch-cultured.
  • FIGS. 1 and 2 show the growth of the Halomonas sp. KM-1 strain cultured at 33 ° C. using glucose or glycerol as a carbon source.
  • 3 and 4 show the amount of PHB produced when cultured under the same conditions.
  • FIG. 5 shows the production amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture supernatant when the Halomonas sp. KM-1 strain is cultured under the same conditions.
  • Halomonas sp. KM-1 strain can produce 15.3 g or more per liter of the medium with a yield of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof. It was clarified that when the amount of accumulated PHB was increased, especially in the case of glycerol, most of it was decomposed, and it was shown that most can be secreted into the medium as 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof.
  • halophilic bacteria Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas panterariensis (ATCC 700273) and Halomonas campisalis (Halomonas campisalis: ATCC 700597) were added with 10% glycerol.
  • the growth situation when used and cultured at 33 ° C. is shown.
  • 8 and 9 show the amount of PHB produced when cultured under the same conditions.
  • FIG. 10 shows the production amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in the culture supernatant when cultured under the same conditions.
  • the growth situation differs depending on each of the halophilic bacteria Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas pantherariensis, and Halomonas campyris.
  • the halophilic bacterium Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas pantellaiensis, and Halomonas campyzaris are each 16.0 g / Accumulation of PH, L, 5.8 g / L, and 7.3 g / L was observed.
  • KM-1 strain, Halomonas pantherariensis, and Halomonas campycharis are decomposed by 98%, 46%, and 41% of PHB, respectively, and 3-hydroxybutyric acid is 16 g. Produced in 2.6 g, 3.0 g medium.
  • Halomonas sp. KM-1 strain can produce 14 g or more per liter of the medium in yield of 3-hydroxybutyric acid. It was shown that when PHB accumulation was increased, most of the glycerol was decomposed, and most of it could be produced as 3-hydroxybutyric acid in the culture solution.
  • Patent Documents 3 and 5 there is no difference in PHB accumulation when the nitrogen source during culture is in a certain concentration range.
  • halophilic bacteria belonging to another genus Halomonas exhibit the same tendency.
  • the amount of dissolved oxygen in the medium was also measured with a HORIBA D-55 dissolved oxygen meter.
  • the dissolved oxygen amount was 0.2 to 0.4 mg / ml at 200 rpm and 0.11 to 0.21 mg / ml at 50 rpm.
  • the amount of DNA in the medium when the Halomonas sp. KM-1 strain was cultured for 72 hours under slightly aerobic conditions was 2.31 mg / L, and 0.25 mg / L when cultured under aerobic conditions. Although it is more than that, it was revealed that it was suppressed to about 0.6% compared with 384 mg / L when cultured under anaerobic conditions.

Abstract

本発明は安価に、簡便で、且つ高効率な、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を提供することを主な目的とする。　下記の工程（１）～（３）を含む、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を解決手段とする： （１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、 （２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する工程２、 （３）工程２で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。

Description

３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法に関する。
　近年ピークオイルが叫ばれ、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が、焦眉の課題となっている。
　３－ヒドロキシ酪酸は、人間では肝臓でアセチルＣｏＡから作られ、血中グルコース濃度が少ない時に脳のエネルギー源として使われること、また、腸内細菌の血中への転移を抑制することから（特許文献１）、輸液としての利用がなされている。また、生分解性プラスチックの原料にも使われている。
　非特許文献１の「バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる３２化合物」には、３－ヒドロキシ酪酸
が、バイオリファイナリーの出発中間体の有望な化合物として挙げられており、今後その利用の拡大が大いに見込まれている。
　３－ヒドロキシ酪酸の製造方法として、例えば本化合物がポリ－３－ヒドロキシブチレート（以下、本明細書においてＰＨＢと呼ぶことがある。）のモノマーであることから、ＰＨＢを各種菌体で製造した後、別途調整したリパーゼ等で分解し、モノマーである３－ヒドロキシ酪酸を得る方法（特許文献２）、突然変異体を用い、８．７ｇ／Ｌの３－ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献２）、遺伝子組換え手法を用い１２ｇ／Ｌの収量にて３－ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献３）等が知られている。
　本発明者らは、商業的な屋外培養を行っても、他の菌の混入がほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一の混入する菌として生育することを認めた。当該好塩菌そのものは、通常はｐＨ５～１２程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等の混入が極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）が蓄積していること明らかにしている（特許文献３）。
　さらに、特許文献４では当該好塩菌のＰＨＡｓの産生について特化した調査が記載され、当該好塩菌が乳酸、酢酸等といった特定の物質の産生に関与することも知られている（特許文献４）。また、特定の属に属する菌体を培養し、その後、嫌気的な条件で菌体を約６時間かけて自己融解させることで、１１７ｇ／Ｌの収量にて３－ヒドロキシ酪酸を産生する方法も報告されている（非特許文献６）。
特開平７－６１９２４号公報 特開２０１０－１６８５９５号公報 国際公開第２００９／０４１５３１号パンフレット 特開２０１０－２７３５８２号公報
第１５回地球環境産業技術動向調査報告会資料－持続可能な発展を求めて－バイオリファイナリー産業の早期構築へ向けて（財）地球環境産業技術研究機構（ＲＩＴＥ）微生物研究グループ　湯川英明　平成１８年１月３１日 Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕｍｅ　１０２，　Ｉｓｓｕｅ　１２，　Ｊｕｎｅ　２０１１，　Ｐａｇｅｓ　６７６６－６７６８　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｕ．　Ｕｇｗｕ，　，　，　Ｙｕｔａｋａ　Ｔｏｋｉｗａ　ａｎｄ　Ｔｏｓｈｉｏ　Ｉｃｈｉｂａ Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２００７）　７６：８１１－８１８　Ｑｉａｎ　Ｌｉｕ，　Ｓｈａｏ－Ｐｉｎｇ　Ｏｕｙａｎｇ，　Ａｈｌｅｕｍ　Ｃｈｕｎｇ，　Ｑｉｏｎｇ　Ｗｕ　ａｎｄ　Ｇｕｏ－Ｑｉａｎｇ　Ｃｈｅｎ 三重保環研年報　第９号（通巻第５２号），２７－３２頁　２００７年 Ｍｏｎｔｅｉｌ－Ｒｉｖｅｒａ　Ｆら．２００７　Ｊｕｎ　２２；１１５４（１－２）：３４－４１　Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　６５，　３６３－３６８．　（１９９９）　Ｌｅｅ，　Ｓ．Ｙ．，　Ｌｅｅ，　Ｙ．，　Ｗａｎｇ，　Ｆ．
　本発明は安価に、簡便で、且つ、高効率な３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を提供することを主な目的とする。上記非特許文献６では、菌体を用いた３－ヒドロキシ酪酸の製造方法が開示されているものの、用いる菌体はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓであり、当該菌体を溶解しながら３－ヒドロキシ酪酸を産生する方法である。従って、当該菌体の培養時に他の菌体が混入することに配慮をする必要があること、高価な培地を必要とすること、さらに、ＤＮＡやタンパク質などといった菌体由来の夾雑物が多く含まれる溶解液から、３－ヒドロキシ酪酸を精製する必要が有るという問題点を有している。
　本願発明者は、特定の属に属する好塩菌を、無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む培地を用いて培養すれば、菌体内にＰＨＢを蓄積することを見いだしている（特許文献３）。ＰＨＢは、菌体内にエネルギー源や炭素源として蓄積されているため、好気条件においては、炭素源が枯渇し、エネルギー源が不足した場合、これらが分解され、解糖系、ＴＣＡサイクルを経て利用されていると想定された。しかしながら、微好気条件又は嫌気条件においては、これらがどのように作用しているかの報告は認められない。
　本願発明者は、斯様な背景のもとで鋭意研究を進めた結果、特定の属に属する好塩菌を、好気的な条件で培養することによって菌体内にＰＨＢを蓄積させた後、培養条件を微好気条件に変更することにより、菌体内でＰＨＢが分解して減少し、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が、菌体外の培地中にて産生することを見いだした。
　上記のＰＨＢを蓄積するための培養は、バイオディーゼル（以下、本明細書でＢＤＦ（登録商標）と呼ぶことがある。）廃液等を用いた培養、光合成できる微細藻類スピルリナ等との混合培養、及び他の細菌の混入が起こりにくい環境での培養が可能であることも見出した。
　さらに、ＰＨＢから３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生は、特定の属に属する好塩菌体の一連の増殖と共に行われるため、培地の変更を伴わず、同じ培養槽を用い、培養条件を変更することだけで、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造が可能であることも明らかとなった。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下に示す３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を広く包含するものである。
　項１
　下記の工程（１）～（３）を含む、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程２、
（３）工程２で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
　項２　工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、３ｇ以上の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする上記項１に記載の方法。
　項３　有機炭素源がグリセロールまたは廃グリセロールである上記項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
　項４　
前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＫＭ－１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９９５）である、上記項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　以下に、本発明に係る製造方法の効果を示すが、下記のすべての効果を発揮する発明が本願発明にかかる製造方法ではなく、１以上の効果を有していればよい。
　本発明に係る製造方法は、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を、培地中に著量、一部は菌体中に蓄積することができる。
　本発明に係る製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養する工程が含まれるが、斯かる好塩菌の培養は、他の細菌の混入が起こりにくい環境で培養することが可能であり、供気条件を変更も容易であることから優れた製造方法である。
　本発明に係る製造方法において用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。
　これらのことから、例えば現状の遺伝子組換えをしていない酵母細胞を用いた木材糖化液のエタノール発酵後の残渣（主にキシロールやアラビノースを含む）を有機炭素源として利用して、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産を行うことが可能である。
　本発明に係る製造方法では、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を培地中にて生産することが可能である。培養液から３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む画分を簡便に回収することが可能であり、精製工程を行ったとしても、簡易な精製方法が適用できるため、優れた製造方法である。
　この点に関して、本発明に係る製造方法では、ハロモナス属に属する好塩菌体の溶菌を伴わない条件にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩をその培養液中から回収することができるので、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を精製する際に、溶菌に伴う核酸、タンパク質、糖質、脂質等といった夾雑分子を除去するための精製工程が非常に簡便になるといった効果を有する。
　本発明に係る製造方法によって得られる３－ヒドロキシ酪酸又はその塩は、医療用の輸液に添加したり、そのまま重合してプラスチックとするだけでなく、化粧品、医薬品、機能性食品等光学活性を持った原料、リファイナリーとして有用である。
好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときの菌体濁度ＯＤ６００（縦軸）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。凡例に示す「％」はすべて、「ｗ／ｖ％」を示す（図２～７においても同じ）。グルコース、グリセロールともに計１０％の場合は、生育初期と培養後２４時間にそれぞれ５％の炭素源を、計１５％の場合は、生育初期と培養後２４時間、３６時間後にそれぞれ５％の炭素源を供給した。培養当初は、２００ｒｐｍで、好気的な条件で培養し、３６時間目に５０ｒｐｍの微好気条件に変更した。以下の条件は同じ培養時の分析値をグラフに示したものである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量（縦軸：ｇ／L）と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの割合（縦軸：ＰＨＢ／乾燥菌体（％））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの総量（縦軸：ｇ（ＰＨＢ）／Ｌ（培養液））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積された３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の上清中の割合（縦軸：３－ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ　７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときの菌体濁度ＯＤ６００（縦軸）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。凡例に示す「％」はすべて、「ｗ／ｖ％」を示す（図２～７においても同じ）。培養当初は、２００ｒｐｍで、好気的な条件で培養し、４８時間目に５０ｒｐｍの微好気に変更した。以下の条件は同じ培養時の分析値をグラフに示したものである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ　７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量（縦軸：ｇ／L）と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ　７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの割合（縦軸：ＰＨＢ／乾燥菌体（％））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ　７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの総量（縦軸：ｇ（ＰＨＢ）／Ｌ（培養液））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。 好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ　７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積された３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の上清中の割合（縦軸：３－ヒドロキシ酪酸（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。
　本発明に係る３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた下記の工程（１）～（３）を含む製造方法である。
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程２、
（３）工程２で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
　本発明に係る製造方法によって製造される３－ヒドロキシ酪酸又はその塩とは、生体内にて通常の光学活性を持った化合物であり、Ｄ体である。
　また、３－ヒドロキシ酪酸の塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオンによって形成される塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩等が挙げられる。
　工程１について
　本発明に係る３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程１は、ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程である。
　＜A：好塩菌＞
　本発明の製造方法工程１にて用いる好塩菌は、下記の（i）又は（ii）のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
（i）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ii）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、微好気条件下で３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培養液にて生産することを特徴とする好塩菌。
　なお、「無機塩」及び「有機炭素源」については、＜培地＞の欄にて後述する。また、「微好気条件」については、下記工程２の＜培養方法＞の欄にて詳述する。
　このようなハロモナス属に属する好塩菌は、酸化的代謝も嫌気的代謝も使い分けることができ、遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向となる、所謂、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。
　上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１～１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５～１２程度の培地にて生育する。
　上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＫＭ－１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ－１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ－１株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ４７７０１５として登録されている。
　また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ　７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ　７００５９７）等も挙げることができる。
　さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。
　なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＨＢの発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＢの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子；３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液にて生産する機能を増大させる遺伝子；３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生量を増大させる遺伝子；ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。
　これらの遺伝子のハロモナス属に属する好塩菌へ導入は、導入される遺伝子が当該菌体内で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを当該菌体に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば当該菌体内で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に転写開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
＜Ｂ：培地＞
　工程１にて用いる培地は、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源に追加した培地である。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５～１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８～１２の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができるので好ましい。
　工程１にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。
　例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等を用いればよい。
　これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。
　例えば、窒素源として、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩等を用いればよく、より具体的には、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ等の化合物が用いればよい。
　窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培地１００ｍｌあたり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
　また、リン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、より具体的には、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いればよい。
　リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌあたり通常は５０～４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００～２００ｍｇ程度である。
　これらの無機塩は単一で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１～２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２～１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２～０．５Ｍ程度である。
　工程１にて用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えば、トリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、六炭糖（グルコース、フラクトース）、五炭糖（キシロース、アラビノース）、二糖（スクロース）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール）、エタノール、ｎ－プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、グリセロール、廃グリセロール等が挙げられる。
　また、廃蜜糖、木材糖化液、若しくはその残渣も、上述の有機炭素源として用いることができる。中でも、製造方法にかかるコストを低減する観点から、廃グリセロール、廃蜜糖等が好ましい。これらの有機炭素源は、単一で使用してもよい、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の廃グリセロールとは、植物、動物等に由来する油脂に、メタノール等のアルコールと、ＫＯＨ、ＮａＯＨ等のアルカリ触媒を添加し、６５℃程度の温度にて反応させて得られる、脂肪酸メチルエステルを主体とするバイオディーゼルの製造時に、副産物として得られるものである。
　上記の廃グリセロールの組成は、バイオディーゼルの製造設備や、原料として用いる油脂の組成により異なり、特に限定されるものではない。例えば、非特許文献４に示されるように、グリセロール濃度がおよそ３０～６５％程度で、上記のアルカリ触媒をおよそ４～７％程度含有し、ｐＨは１０～１２程度の廃グリセロールが挙げられる。また、上記の廃グリセロールには、得られるバイオディーゼルを洗浄する際に用いられる水が含まれている。
　上述の有機炭素源の使用量は、使用する有機炭素源の種類により区々ではあるが、通常は培地に対して終濃度が、通常１～２０％ｗ／ｖ程度となる量で使用すればよい。
　中でも、有機炭素源として廃グリセロールを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常１～２０ｗ／ｖ％程度とすればよく、好ましくは１０～１５ｗ／ｖ％程度である。
　本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するため、他の菌体の混入の恐れがほとんどないので、上述の培地に対して滅菌処理等を行う必要も無く、簡便な設備で培養することも可能である。
＜Ｃ：培養方法＞
　工程１における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程１における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされないが、例えば、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常３０～３７℃程度、攪拌速度は１２０～１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。
　続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。本培養は通常２０～４５℃程度で可能であるが、３０～３７℃程度で行うことが好ましい。この際の攪拌速度は通常は１５０～２５０ｒｐｍ程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培養液表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る期待を吹き込む方法を採用してもよい。
　工程１では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以上とすればよい。
工程１での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮すれば、回分培養又は半回分培養が好ましい。
工程２について
　本発明に係る３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程２は、上記工程１の終了後、前記菌体を微好気培養して、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程である。
　ここで、「培養液にて３－ヒドロキシ酪酸を生産する」とは、工程１にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、培養液に３－ヒドロキシ酪酸を分泌することを意味し、「培養液にて３－ヒドロキシ酪酸の塩を生産する」とは、培養液に分泌された３－ヒドロキシ酪酸が、培養液中に存在する上述の陽イオン成分と反応して、３－ヒドロキシ酪酸の塩を形成することを意味する。
　工程２では、培養条件を微好気条件に変更しさえすればよく、工程１にて得られるＰＨＢを菌体内に蓄積したハロモナス属に属する好塩菌を回収して、新たな培地にて培養しても、培地を変更せずにそのまま培養条件を微好気条件に変更しても、工程１の終了時に新たな培地を追加して、培養してもよい。
　工程１の好気培養を終了し、工程２の微好気培養に培養条件を変更する時期は、工程１にて得られるハロモナス属に属する好塩菌体内に蓄積されるＰＨＢの量が最大となる時期が好ましい。ここで、最大となる時期とは必ずしも一点の時期に限定されることは無く、当該菌体内におけるＰＨＢの蓄積量が最大値の通常６０％以上となる時期に、培養条件を微好気培養に変更すればよい。なお、当該菌体内のＰＨＢの量は、後述する実施例に記載の方法を採用すればよい。
＜Ｄ：培養方法＞
　工程２における微好気培養とは、培地中又は培養環境を完全に嫌気条件下にするのではなく、積極的に酸素の通気を行わない方法で培養することである。
　このような微好気条件での培養方法は、特に限定はされないが、例えば培地表面が空気に触れる状態で、攪拌速度を１００ｒｐｍ以下、望ましくは５０ｒｐｍ以下にて培養する方法が挙げられる。なお、撹拌を完全に止めてしまうことは、培養液中の溶存酸素が速やかに消失してしまうことから、工程２において好ましくない。このとき、培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以下とすればよい。ここで、培養液中に溶存する酸素が全く存在しない条件とすれば、ハロモナス属に属する好塩菌がすみやかに溶菌するので、工程２において好ましくない。
　工程２において、工程１によって得られるＰＨＢを菌体内に著量蓄積したハロモナス属に属する好塩菌を微好気培養することによって、当該好塩菌は死滅すること無く培養される。
　なお、当該好塩菌の死滅を確認するには、当該菌体の死滅に基づく菌体から培養液に溶出するＤＮＡの有無を判断すればよく、例えば、当該抗塩菌の培養液上清を分光光度計で測定することにより、ＤＮＡに基づく２６０ｎｍ付近に吸光の顕著なピークが存在しないことによって確認すればよい。
　また、他の手法としては、ハロモナス菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ配列に特異的なＰＣＲプライマー（例えば８３２Ｆ：配列番号１；１０１６Ｒ：配列番号２）を用い（増幅長さは１８４ｂｐ）、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて上清中のゲノムＤＮＡ濃度を測定することにより確認してもよい。
　上述のような方法を用いた微好気条件における培養液中のＤＮＡ量は、微好気条件での培養の開始から、おおよそ７２時間までの間では、通常０．５～２．５ｍｇ／Ｌ程度となる。
　即ち、工程２では上述のような培養液中におけるＤＮＡ量となるような条件にてハロモナス属に属する好塩菌を培養すればよく、このような培養液中におけるＤＮＡ量となる培養条件を、本発明における微好気条件を満たすことの、ひとつの目安となる。
　培養時間は、培地に用いる無機塩、有機炭素源などといった培地の条件により異なるが、後述するような所望の量の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が回収できるのに十分な時間の培養時間とすればよく、特に限定はされないが、上述のように微好気培養に変更した後に、培養液中に放出されるハロモナス属に属する好塩菌の溶菌に伴う核酸、タンパク質、等を除去する精製工程を簡便にすること、すなわち、培養液中のＤＮＡ濃度や、当該培養液中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の濃度等に鑑みて、適宜決定すればよい。
工程３について
　本発明に係る３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程３は、上記工程２にて得られた培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは工程２によって得られる培養液中に３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在している時に上述の工程２の培養を停止し、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む培養液と、上記好塩菌体を分離することである。
　具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離方法を用いて培養液と上記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
　培養液中に３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれたまま培養をし続けていると、好気的な条件の場合には特に、培養液中に分泌された３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用されるために、結果として培養液中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が減少し、ひいては培養液から消失してしまうためにてしまうために、培養液中に３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在しているときに、上記培養を停止する必要がある。
　培養液中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、キャピラリー電気泳動等の分析方法を使用して、培養を行いながら培養を停止する時間を決定することもできる。
　また、３－ヒドロキシ酪酸は酸性を示す化合物であることから、培養の際の培地のｐＨの低下を基準にして、３－ヒドロキシ酪酸の存在を確認してもよい。
　なお回収される３－ヒドロキシ酪酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に基づく、ナトリウムやカルシウム等のアルカリ金属、アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３－ヒドロキシ酪酸を製造するには、回収した培養液を蒸留等の常法に供すればよい。また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。さらに、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。
　本発明に係る製造方法によって、培地中に菌体由来の溶解物を含むことなく得られる３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の量は、培地１Ｌに対して通常は３ｇ程度以上であり、好ましくは１０ｇ以上、より好ましくは１５．３ｇ以上、さらに好ましくは１７．２ｇ程度以上、最も好ましくは２０ｇ程度以上である。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
＜３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定＞
　培養液にて生産される３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を測定するため、非特許文献５に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用し、以下の実験を行った。
　下記の方法で培養して得られた培養液を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱し、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩をすべて３－ヒドロキシ酪酸メチルに変換した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．５０ｍｌ、蒸留水０．２５ｍｌを加えて、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、３－ヒドロキシ酪酸を分析した。３－ヒドロキシ酪酸の標品を上清乾燥物と同様に処理、分析し、これを基準として培地あたりの３－ヒドロキシ酪酸蓄積率（３－ヒドロキシ酪酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。また、「F-キット D-3-ヒドロキシ酪酸」(株式会社J.K.インターナショナル)のキットでは、D体のみが検出される。このキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分泌された３－ヒドロキシ酪酸は、ほぼD体であることが確認された。
＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
　菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量を測定するため、非特許文献２に記載の手法を用い以下の実験を行った。
　上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１～３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で３時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．５０ｍｌ、蒸留水０．２５ｍｌを加え、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、ＰＨＡｓを分析した。ＰＨＢの標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。
　本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造する方法について詳述する。
　表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ３を５倍に、リン源のＫ２ＨＰＯ４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。
　培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源として、それぞれ培地中での終濃度が１０％若しくは１５％となるグリセリン、又は１０％となるグルコースを使用した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養＞
　ハロモナス属に属する好塩菌（ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス〔ＡＴＣＣ　７００２７３〕及びハロモナス・カンピサリス〔ＡＴＣＣ　７００５９７〕）を、プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地（この場合、炭素源として１ｗ／ｖ％グルコース等を含むものを用いた）を加え、３７℃で１晩振盪培養した。
＜ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等＞
　プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌずつ回収して、ＯＤ６００、乾燥菌体重量、ＰＨＢ含有量、及び上清中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の量を測定した。
　有機炭素源としてグルコース又はグリセロールを計１０％用いる場合は、それぞれ生育初期に５％分を培地に含有させ、培養後２４時間には５％の炭素源を追加供給し、計１５％用いる場合は、生育初期に５％分を培地に含有させ、培養後２４時間及び３６時間後にそれぞれ５％分の有機炭素源を追加供給した。
　培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、３６時間目に撹拌速度を５０ｒｐｍと、微好気条件に変更した。培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。
　図１、２では、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を３３℃において、グルコース又はグリセロールを炭素源に培養した生育の状況が示している。図３、４では、同条件で培養した際のＰＨＢの生産量について示している。図５では、同条件でハロモナス・エスピーＫＭ－１株を培養した際の培養液上清中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産量について示している。
　有機炭素源としてグルコース又はグリセロールを初期の濃度が５％で含む培地を用い２４時間目及び／又は３６時間目に５％分の有機炭素源を追加しても、特段の炭素源による生育阻害は見られなかった。また、一般に、グルコースの方が、グリセロールより生育速度は早く、ＰＨＢの蓄積量も多い。好気条件から、微好気条件へと供気条件を変更する３６時間目において、１５％のグルコースの場合は３２．５ｇ／Ｌ、１０％及び１５％のグリセロールの場合２１．５ｇ／ＬのそれぞれＰＨＢの蓄積が認められた。
　有機炭素源が１５％のグルコースの場合、８１％のＰＨＢが分解され、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が２０ｇ培地中に分泌された。
　有機炭素源がグリセロールの場合、１０％並びに１５％ともに、ほぼ１００％のＰＨＢが分解され、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が、それぞれ１５．３ｇ並びに１７．２ｇ培地中に分泌された。
　上記結果から、グルコース、グリセロール等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株は、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を収量として培地１Ｌ当り１５．３ｇ以上を産生することができることが明らかとなり、ＰＨＢの蓄積量を増やせば、特にグリセロールの場合、そのほとんどが分解され、多くが３－ヒドロキシ酪酸又はその塩として培地中に分泌させることも可能であることを示した。
　図６、７では、３３℃において、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ　７００２７３）及びハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ　７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときの生育の状況が示している。図８、９では、同条件で培養した際のＰＨＢの生産量について示している。図１０では、同条件で培養した際の培養液の上清中の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産量について示している。
　炭素源としてグリセロール１０％を炭素源とした場合、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス及びハロモナス・カンピサリスのそれぞれによって生育状況は異なる。好気条件から微好気条件へと供気条件を変更する４８時間目において、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、及びハロモナス・カンピサリスは、それぞれ、１６．０ｇ／Ｌ、５．８ｇ／Ｌ、７．３ｇ／ＬのＰＨＢの蓄積が認められた。また、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ－１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、及びハロモナス・カンピサリスは、それぞれ、９８％、４６％、４１％のＰＨＢが分解され、３－ヒドロキシ酪酸が、それぞれ、１６ｇ、２．６ｇ、３．０ｇ培地中にて生産された。
　上記結果から、グルコース、グリセロール等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株は、３－ヒドロキシ酪酸を収量として培地１Ｌ当り１４ｇ以上を産生することができることが明らかとなり、ＰＨＢの蓄積量を増やせば、特にグリセロールの場合、そのほとんどが分解され、多くが３－ヒドロキシ酪酸として培養液中にて生産されることも可能であることを示した。
　また、培養時の窒素源については、ある程度の濃度範囲であればＰＨＢの蓄積に差がないことは、特許文献３，５に示すとおりである。
　さらに、別のハロモナス属に属する好塩菌においても同様の傾向を示すことは、図６，７，８，９，１０に示すとおりである。
　なお、培地中の溶存酸素量についてもＨＯＲＩＢＡ　Ｄ－５５溶存酸素計で測定した。２００ｒｐｍの場合０．２～０．４ｍｇ／ｍｌ、５０ｒｐｍの場合０．１１～０．２１ｍｇ／ｍｌの溶存酸素量を示した。
　また、微好気条件でハロモナス・エスピーＫＭ－１株を７２時間培養した際の培地中のＤＮＡ量は、２．３１ｍｇ／Ｌであり、好気条件にて培養した際の０．２５ｍｇ／Ｌよりも多いものの、嫌気条件にて培養した際の３８４ｍｇ／Ｌと比較して約０．６％にまで抑えることが明らかとなった。
　なお、微好気条件にて７２時間培養した際の、培養液中のＤＮＡ量は、上述の２．３１ｍｇ／Ｌを越えることはなかった。

Claims (4)

  1. 　下記の工程（１）～（３）を含む、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
    （１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
    （２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する工程２、
    （３）工程２で得られる培養液から、３－ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
  2. 工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、３ｇ以上の３－ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 有機炭素源がグリセロールまたは廃グリセロールである請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＫＭ－１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９９５）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
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