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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft die simultane Synthese von PHA (Poly(3-Hydroxyalkanoate))
und kompatiblen Soluten in einem Fermentationsverfahren unter Verwendung
halophiler Bakterien.
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Technologischer Hintergrund und Stand
der Technik
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Viele
halophile oder halotolerante Bakterien parieren niedrige extrazelluläre Wasseraktivitäten durch
die Synthese von kleinen organischen Molekülen als osmotisches Gegengewicht
(Brown AD, 1976. Microbial Water Stress. Bacteriol. Rev. 40: 803–846.; Galinski
EA, 1995. Osmoadaptation in Bacteria. Adv. Microbial Physiol. 37:
273–328.).
Diese Protektormoleküle
beeinflussen die Zellfunktion nicht negativ und werden deshalb auch „compatible
solutes” oder
kompatible Solute genannt. Es wurde gefunden, dass neben ihrer Funktion
zur Erhaltung des Zellinnendruckes, kompatible Solute Biomoleküle oder
ganze Zellen gegen Inaktivierung durch Hitze, Gefrieren, niedrige
Wasseraktivitäten
oder sogar durch toxische Chemikalien zu schützen vermögen. Erste Versuche, diese
generellen Schutzeigenschaften in technische Maßnahmen zu überführen, waren erfolgreich. So sind
die Anwendungen von kompatiblen Soluten zur Geschmackskonservierung
gefriergetrockneter Lebensmittel, zur Stabilisierung von Enzymen
(Knapp S et al., 1999. Extrinsic protein stabilization by the naturally
occurring osmolytes_-hydroxyectoine and betaine. Extremophiles 3:
191–198.)
in der Biotechnologie (Knapp et al., 1999; Lamosa P et al., 2000.
Thermostabilization of proteins by diglycerol Phosphate, a new compatible
solute from hyperthermophile Archeoglobus fulgidus. Appl Environ
Microbiol 66: 1974–1979.)
oder speziell in der PCR, sowie zum Schutz der gesunden Zellen während einer
Chemotherapie bereits beschrieben (Margesin R, Schinner F, 2001.
Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology.
Extremophiles 5: 73–83.).
Weitere Anwendungen, vor allem in der Umwelttechnik sowie im prozessintegrierten
Umweltschutz in der Biotechnologie, lassen sich aufmachen, wenn
es gelingt, kompatible Solute und besonders ihren wirksamsten Vertreter,
das Ectoin und seine Derivate, preiswerter herzustellen.
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Die
Art der kompatiblen Solute und deren Zusammensetzung hängen vom
betrachteten Organismus, der Kohlenstoffquelle und der Art der Energiebereitstellung
ab. Zu den kompatiblen Soluten gehören unterschiedlichste Substanzklassen
und Substanzen, siehe z. B.
DE
42 44 580 A1 , darunter Disaccharide, Tetrahydropyrimidincarbonsäuren, Betaine,
Glycerol, Diglycerolphosphat, Glucosylglycerol, Dimethylsulfoniopropionat,
Prolin, Nδ-Acetylornithin, Nε-Acetyllysin,
Nα-Carbamoylglutaminamide, Nα-Acetylglutaminylglutaminamid.
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Wirtschaftliche
Verfahren zur biotechnologischen Synthese einiger kompatibler Solute
sind bekannt. Die wirtschaftliche Synthese kompatibler Solute ist
häufig
an die enzymatischen Leistungen lebender Mikroorganismen gebunden.
Im Prinzip existieren für
diese Substanzen zwei Syntheseverfahren. Das erste benutzt gentechnisch
veränderte
Organismen (GVO), welche kompatible Solute überproduzieren und in das Medium
bis zu Konzentrationen von 0.1 M ausschütten (Grammann K, Volke A,
Kunte HJ, 2001. Identification and characterization of the osmoregulated
ectoine transport system TeaABC in Halomonas elongata DSM 2581T. In: Halophiles 2001, Sevilla, Spain, 23.–27.09.2001,
p L42.; Schubert T et al. (2007) Continuous Synthesis and Excretion
of the Compatible Solute Ectoine by a Transgenic Non-Halophilic
Bacterium. Applied and Environmental Microbiology 73 (10), 3343–3347).
Das zweite Verfahren (Sauer T, Galinski EA, 1998. Bacterial milking:
A novel bioprocess for production of compatible solutes. Biotechnol.
Bioeng. 57: 306–13.),
basiert auf der Fähigkeit
halophiler Bakterien, Verdünnungsstress durch
das schnelle Ausscheiden kompatibler Solute zu bewältigen,
um so das Platzen der Zellen zu verhindern („Bacterial Milking”).
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Das
zweite betrachtete Produkt sind PHA. PHA sind natürliche,
thermoplastische Polyester, die mit der traditionellen Polymertechnik
verarbeitet werden können.
Ein wesentlicher Unterschied zu petrochemisch erzeugten Polymeren
besteht in der biologischen Abbaubarkeit (Jendrossek D, 2002. Extracellular
polyhydroxyalkanoate depolymerases: the key enzymes of PHA degradation.
in: Biopolymers 3b (Polyesters II), WILEY-VCH, Weinheim), 41–83.). Der bekannteste
und verbreitetste Vertreter dieser Polymergruppe ist Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) (PHB). Viele
seiner Eigenschaften ähneln
dem synthetischen Kunststoff Polypropylen. Aufgrund der Biokompatibilität sind PHA
besonders als Werkstoffe für medizinische
Anwendungen interessant, siehe z. B.
WO
00/56376 . Der Markt dieser Polymere für bulk-Anwendungen wird gegenwärtig nur
durch die Kosten limitiert. Insbesondere ist für Polypropylen-Anwendungen
bis hin zu einfachen Verpackungsanwendungen ein Substitutionspotential
von weltweit ca. 100 Mio. t pro Jahr für die Stoffgruppe der PHA erkennbar.
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Auslöser der
PHA-Synthese ist in der Regel eine Limitation der Zellvermehrung
durch Nährsalze wie
z. B. Phosphat oder Ammonium (Anderson AJ, Dawes, E A, 1990. Occurrence,
metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates.
Microbiol. Rev. 54: 450–472).
In Abhängigkeit
vom Bakterienstamm, dem verwendeten Kohlenstoffsubstrat und den
Fermentationsbedingungen können
PHA-Gehalte bis
zu 80% der Bakterientrockenmasse erreicht werden (Lee SY, Park SJ,
2002. Fermentative production of SCL-PHAs, in: Biopolymers 3a (Polyesters
I), WILEY-VCH, Weinheim, 263–290).
Die Synthese kann in Abhängigkeit
vom Bakterienstoffwechsel aus unterschiedlichen Kohlenstoffsubstraten
erfolgen. Aus Kostengründen
und Gründen
der Nachhaltigkeit ist die Erzeugung dieser Polymere aus nachwachsenden
Rohstoffen und landwirtschaftlichen Abfallprodukten von großem Interesse
(Koller M et al., 2006. Production of polyhydroxyalkanoates from
agricultural waste and surplus materials, Biomacromol. 6: 561–565.; Quillaguaman J
et al., 2007. Optimizing conditions for poly(β-hydroxybutyrate) production
by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon
source. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 981–986.; Van-Thuoc D et al.,
2008. Utilization of agricultural residues for poly(3-hydroxybutyrate)
production by Halomonas boliviensis LC1. J. Appl. Microbiol. 104:
420–428.).
Bei der Verwendung ungereinigter Substrate kann es jedoch auf Grund
von Anreicherungen der Verunreinigungen, insbesondere von Salzen
zu verringerten Ausbeuten und Gehalten an PHA kommen (Mothes G et
al., 2007. Production of PHB from crude glycerol. Eng. Life Sci.
7: 1–6.).
Wirtschaftlich hochinteressant ist es, die Monomere der PHA zu gewinnen,
da diese häufig
enantiomerenrein sind (Tokiwa Y. Ugwu CU, 2007. Biotechnological
production of (R)-3-hydroxybutyric acid monomer. J. Biotechnol.
132: 264–272.). An
diesen Monomeren – den
D-3-Hydroxyalkanoaten – gibt
es einen ständig
wachsenden Bedarf, da diese Verbindungen als Synthone für die Herstellung
von pharmazeutischen Wirkstoffen, Vitaminen, Duftstoffen, Antibiotika
und Pheromonen (Ohashi T, Hasegawa J, 1992. New preparative methods
for optically active beta-hydrocarboxylic acids. In: Sheldrake GN, Collins
AN, Crosby J, eds. Chirality in industry. New York: John Wiley & Sons, pp 249–268.) eingesetzt werden
können.
Die Gewinnung der Monomeren kann durch Hydrolyse der extrahierten
PHA (De Roo G. et al., 2002. Production of chiral R-3-hydroxyalkanoic acids
and R-3-hydroxyalkanoic acid methylesters via hydrolytic degradation
of polyhydroxyalkanoates synthesized by Pseudomonads. Biotechnol.
Bioeng. 77: 717–722.)
oder durch die Autokatalyse der PHA-Granula (Saito T et al., 1992.
Intracellular degradation of poly(3-hydroxybutyrate) granules of
Zoogloea ramigera I-16-M. FEMS Microbiol. Rev. 103: 333–338.) erfolgen.
Ein eleganter Weg ist die genetische Manipulation von PHA-Bildnern (z. B. Überexpression
der Depolymerase; Knock-out der 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase), um das Monomer in einem
Fermentationsschritt zu gewinnen (Gao HJ et al., 2002. Enhanced
production of D-(–)-3-hydroxybutyric
acid by recombinant Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 213:
59–65.;
Shiraki M et al., 2006. Fermentative production of (R)-(–)-3-hydroxybutyrate using
3-hydroxybutyrate dehydrogenase null mutant of Ralstonia eutropha
and recombinant Escherichia coli. J Biosci. Bioeng. 102: 529–534.).
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Es
besteht daher ein Bedarf an einem Verfahren, welches die simultane
Produktion von PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten und kompatiblen Soluten
in wirtschaftlichem Massstab erlaubt.
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PHA
können
von Bakterien unterschiedlicher Gattungen synthetisiert werden,
so auch von halophilen Bakterien (Hezayen FF et al., 2000. Polymer
production by two newly isolated extremely halophilic archaea: application
of a novel corrosion-resistant bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol.
54: 319–325.; Koller
M et al., 2007. Potential of various archae- and eubacterial strains
as industrial polyhydroxyalkanoate producers from whey. Macromol.
Biosci. 7: 218–226.;
Ramsay B. A. et al., 1990. Production of poly(3-D-hydroxybutyric-co-3-D-hydroxyvaleric) acids.
Appl. Envir. Microbiol., 56: 2093–2098.). Doronina et al. beschreibt
die Isolierung und Charakterisierung neuer halophiler Organismen,
aus denen sowohl Ectoin als kompatibles Solut, als auch PHB in nenneswerten
Mengen gewonnen werden kann (siehe Doronina et al., 2000. Methylarcula
marina gen. nov., sp. nov. and Methylarcula terricola sp. nov.:novel
aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria
from coastal saline environments. Int. J. Syst Evol. Microbiology.
50, 1849–1859).
Allerdings legen bisherige Untersuchungen nahe, dass sich halophile
Bakterien nicht für die
simultane Bildung von PHA und kompatiblen Soluten in wirtschaftlich
interessanten Massstäben
eignen (Strazzullo G et al., 2008. Chemical-physical characterization
of polyhydroxyalkanoates recovered by means of a simplified method
from cultures of Halomonas campaniensis. World J. Microbiol. Biotechnol.
DOI 10.1007/s11274-007-9637-7). Strazzullo et al. zeigt auf, dass
aus dem halophilen Bakterium Halomonas campaniensis entweder PHA
oder kompatible Solute in nennenswerten Mengen gewonnen werden können, allerdings
nicht beide Stoffe simultan aus einem Reaktionsansatz. Allgemein
geht man in der Literatur davon aus, dass die Synthese von kompatiblen
Soluten viel Energie kostet (Oren A, 1999. Bioenergetic aspects
of halophilism. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 63: 334–348), so
dass es eine strenge Konkurrenz zwischen der Synthese von kompatiblen Soluten
und PHA gibt und dass deshalb die simultane Gewinnung der beiden
Stoffe praktisch nicht möglich
und wirtschaftlich sinnvoll sei (Strazzullo et al., 2008).
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war es einen oder mehrere der geschilderten
Nachteile des Standes der Technik zu mindern oder zu überwinden.
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Erfindungsgemäße Lösung
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch Bereitstellung eines Verfahrens zur simultanen Produktion
von PHA (Poly(3-Hydroxyalkanoate)) oder D-3-Hydroxyalkanoaten und
kompatiblen Soluten, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) halophile
Bakterien zum Einsatz kommen,
- b) die Bakterien aus Schritt a) kultiviert werden
- – in
einem Nährmedium
mit einer Kohlenstoffquelle,
- – unter
einer erhöhten
Salzkonzentration von > 1 M,
- – bei
einem Sauerstoffpartialdruck von ≥ 10%
der maximalen Sauerstofflöslichkeit
im Nährmedium und
- – unter
Bedingungen, die Auslöser
für die PHA-Synthese
sind,
- c) und dass aus einem Reaktionsansatz sowohl PHA oder D-3-Hydroxyalkanoate
als auch kompatible Solute gewonnen werden,
wobei für PHA oder
D-3-Hydroxyalkanoate eine Ausbeute von ≥ 20% w/w bezogen auf die Gesamttrockenmasse
und für
kompatible Solute eine Ausbeute von ≥ 50 mg/g Restbiomasse (Gesamttrockenmasse minus
PHA oder D-3-Hydroxyalkanoate) erreicht wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt es erstmals in einem einzigen Reaktionsansatz sowohl PHA
oder D-3-Hydroxyalkanoate und kompatible Solute in wirtschaftlich
interessanten Mengen herzustellen.
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Ein
weiterer Vorteil des Einsatzes von halophilen Bakterien ist es,
dass eine möglicherweise vorhandene
Salzlast im Nährmedium
nicht zu einer störenden
Inhibierung der PHA-Synthese führt.
Solche Salzlasten inhibieren das Wachstum der konventionellen PHA
Produzentenstämme
(z. B. Cupriavidus necator, Alkaligenes latus; Pseudomonas oleovorans).
Die Ursachen der Salzlasten können
im verwendeten Edukt liegen (beispielsweise agrarische Rückstände, Reststoffe
der Biodieselherstellung wie Glyerinwasser) oder während der
Fermentation selbst entstehen. Beispiele für den zweiten Fall sind die
Fermentation organischer Salze oder Säuren sowie die Bildung alkalischer
oder saurer Nebenprodukte. In diesem Fall rührt die Salzlast aus der Neutralisationsreaktion,
um den pH-Wert währen
der Reaktion konstant zu halten.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass in halophilen Bakterien durch das erfindungsgemäße Verfahren
eine hohe Ausbeute an kompatiblen Soluten und an PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten
in den Zellen erreicht wird. Dabei werden wirtschaftlich interessante
Ausbeuten für
PHA oder D-3-Hydroxyalkanoate von ≥ 20%
w/w bezogen auf die Gesamttrockenmasse und für kompatible Solute eine Ausbeute von ≥ 50 mg/g Restbiomasse
(Gesamttrockenmasse minus PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten) erreicht. Bevorzugt
werden Ausbeuten für
PHA oder D-3-Hydroxyalkanoate von ≥ 25%
w/w bezogen auf die Gesamttrockenmasse und für kompatible Solute eine Ausbeute
von ≥ 70
mg/g Restbiomasse (Gesamttrockenmasse minus PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten)
erreicht.
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Besonders
bevorzugt werden Ausbeuten für PHA
oder D-3-Hydroxyalkanoate von ≥ 40%
w/w bezogen auf die Gesamttrockenmasse und für kompatible Solute eine Ausbeute
von ≥ 80
mg/g Restbiomasse (Gesamttrockenmasse minus PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten)
erreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist der Auslöser
für die
PHA-Synthese eine Limitation an mindestens einem verwertbaren Salz
im Nährmedium.
Bevorzugt werden die halophilen Bakterien in Schritt b) unter N-, P-,
K- und/oder S-Mangelbedingungen
kultiviert. N-, P-, K- und/oder S-Mangelbedingungen im Sinne der Erfindung
liegen dann vor, wenn das stoichiometrische Gleichgewicht im Nährmedium
zwischen Kohlenstoffangebot und N-, P-, K- und/oder S-Angebot zuungunsten
von N-, P-, K- und/oder S- verschoben ist. Wann dies erreicht ist,
hängt von
der Kohlenstoffquelle und dem verwendeten Organismus, sowie von der
N-, P-, K- und/oder S-Quelle
ab. Dem Fachmann ist dieser Zusammenhang bekannt und er hat keine Schwierigkeiten
geeignete Mangelbedingungen für eine
gegebene halophile Bakterienart ohne großen Aufwand zu bestimmen. Geeignete
Techniken sind dem Fachmann bekannt und im Stand der Technik beschrieben.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann insbesondere mit einem Nährmedium
betrieben werden, welches eine erhöhte Salzkonzentration aufweist.
Unter einer erhöhten
Salzkonzentration wird eine Salzkonzentration größer als 1 mol/L, im Fall des
NaCl > 58,443 g/L,
verstanden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird bei einem Sauerstoffpartialdruck von ≥ 10% der maximalen Sauerstofflöslichkeit
im Nährmedium
durchgeführt.
Ein solcher Sauerstoffpartialdruck ist notwendig, um die gewünschten
Ausbeuten zu erzielen. Insbesondere wird das Verfahren bei einem
Sauerstoffpartialdruck von ≥ 20%,
der maximalen Sauerstofflöslichkeit
im Nährmedium
durchgeführt.
Bevorzugt wird das Verfahren in einem Fermenter durchgeführt, der
die Regulation des Sauerstoffpartialdrucks erlaubt. Solche Fermenter
sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kommen
halophile Bakterien zum Einsatz. Insbesondere werden halophile Bakterien
verwendet, die nicht Halomonas campaniensis sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens kommen solche halophile Bakterien zum Einsatz, die
eine Wachstumsrate in einem Nährmedium
mit Methanol als Kohlenstoffquelle von ≥ 0,07 h–1 aufweisen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die halophilen Bakterien ausgewählt aus der Gattung Halomonas,
bevorzugt aus Halomonas elongata, H. halodenitrificans, H. eurihalina
und/oder H. salina.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann dazu verwendet werden anstatt PHA die entsprechenden D-3-Hydroxyalkanoat-Monomere
zu produzieren. Dies kann z. B. dadurch geschehen, dass nach Gewinnung
von PHA das PHA in einem weiteren Schritt in seine D-3-Hydroxyalkanoat-Monomere
zerlegt wird, z. B. durch Hydrolyse. Daneben ist es aber auch möglich durch
Einsatz von geeigneten halophilen Bakterien mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
direkt D-3-Hydroxyalkanoate zu produzieren. Dazu werden bevorzugt
halophile Bakterien eingesetzt, die mehr D-3-Hydroxyalkanoate als
PHA bilden. Solche Bakterien können
z. B. eine Überaktivität einer
geeigneten Depolymerase oder eine eingeschränkte 3-Hydroxyalkanoat-Dehydrogenaseaktivität, bevorzugt eine
eingeschränkte
3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenaseaktivität, aufweisen.
Besonders bevorzugt kann die vermehrte Produktion von D-3-Hydroxyalkanoaten
in halophilen Bakterien erfolgen, die gentechnisch verändert worden
sind.
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Das
Nährmedium
des erfindungsgemäßen Verfahrens
enthält
eine Kohlenstoffquelle. Eine besonders geeignete Kohlenstoffquelle
im Sinne der Erfindung ist jede Kohlenstoffquelle aus der die verwendeten
halophilen Bakterien kompatible Solute und PHA synthetisieren können und
auf der die halophilen Bakterien eine positive Wachstumsrate aufweisen.
Solche geeigneten Kohlenstoffquellen sind dem Fachmann bekannt und
im Stand der Technik beschrieben. Als Kohlenstoffquelle kommen insbesondere
organische Kohlenstoffverbindungen in Frage, wie z. B. Zucker, Polyole,
Alkohole, verzweigte und unverzweigte Kohlenwasserstoffe, organische
Säuren,
aromatische Verbindungen und/oder Gemische davon. In einer bevorzugten
Ausführungsform stammt
die Kohlenstoffquelle des Nährmediums
aus einer nachwachsenden Rohstoffquelle, aus technischen organischen
Produkten, oder aus landwirtschaftlichen Produkten. Besonders geeignete
Kohlenstoffquellen umfassen C1- und C2-Körper, verzweigte und unverzweigte
C1- bis C40-Kohlenwasserstoffe,
Benzoate und/oder Phenole, bevorzugt Methanol, Glukose und Glycerin.
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Erfindungsgemäß fallen
kompatible Solute und PHA simultan an. Da beide Produkte (PHA und kompatible
Solute) intrazelluläre
Produkte sind, ist die Aufarbeitung besonders wirtschaftlich, weil
sie in einem gemeinsamen Verfahren erfolgen kann. Dadurch können die
Produktionskosten für
beide Produkte gesenkt werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann in einem kontinuierlichen oder einem diskontinuierlichen Prozessregime
erfolgen. Dabei kommen erfindungsgemäß z. B. batch-, fedbatch- oder
kontinuierliche Kultivierungsverfahren halophiler Bakterien zur
Synthese von Ectoin + PHA in einer oder mehreren Prozessstufen zum
Einsatz.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Verfahrens kann die Vermehrung der halophilen Bakterien, die
Auslösung
der PHA Synthese und die Spaltung des PHA in die entsprechenden
D-3-Hydroxyalkanoat-Monomere entweder in einem Reaktionsansatz erfolgen
oder in unterschiedlichen Prozessstufen erfolgen.
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Bevorzugt
wird das erfindungsgemäße Verfahren
in einem Temperaturbereich zwischen 10 und 90°C durchgeführt. Der bevorzugte pH-Wert
liegt zwischen 3 und 11. Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter aeroben,
mikroaeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das erfindungsgemäße Verfahren
mit halophilen Bakterien der Gattung Halomonas mit Gycerinwasser
als Kohlenstoffquelle, welches z. B. als Reststoff bei der Biodieselherstellung
angefallen ist, unter Stickstoff- und/oder Phosphorlimitierenden
Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 6 und 11 und bei einer Temperatur
von 25°C
durchgeführt.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird das erfindungsgemäße Verfahren
mit einem halophilen Bakterienisolat, bei einem pH-Wert zwischen
8 und 11, auf Methanol als Kohlenstoffquelle, sowohl unter Stickstoff-
als auch unter Phosphorlimitierenden Bedingungen durchgeführt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das erfindungsgemäße Verfahren
mit einem alkaliphilen Bakterienisolat auf Ethanol als Kohlenstoffquelle,
sowohl unter Stickstoff- als
auch unter Phosphorlimitierenden Bedingungen, bei einem pH-Wert
von 8 bis 11 und einer Temperatur von 20°C durchgeführt.
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In
einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung
halophiler Bakterien zur simultanen Produktion von PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten
und kompatiblen Soluten, wobei aus einem Reaktionsansatz sowohl
eine Ausbeute an PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten von ≥ 20% w/w bezogen
auf die Gesamttrockenmasse, als auch eine Ausbeute an kompatiblen
Soluten von ≥ 50
mg/g Restbiomasse (Gesamttrockenmasse minus PHA oder D-3-Hydroxyalkanoaten)
erreicht wird.
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Bei
der erfindungsgemäßen Verwendung kommen
halophile Bakterien zum Einsatz, insbesondere werden halophile Bakterien
eingesetzt, die nicht Halomonas campaniensis sind. Bevorzugt kommen halophile
Bakterien zum Einsatz, die eine Wachstumsrate in einem Nährmedium
mit Methanol als Kohlenstoffquelle von ≥ 0,07 h–1 aufweisen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verwendung
kommen halophile Bakterien zum Einsatz, die ausgewählt sind aus
der Gattung Halomonas, bevorzugt aus Halomonas elongata, H. halodenitrificans,
H. eurihalina und/oder H. salina.
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Die
erfindungsgemäße Verwendung
umfasst die Produktion von D-3-Hydroxyalkanoaten anstatt von PHA.
Dies kann z. B. dadurch geschehen, dass nach Gewinnung von PHA das
PHA in einem weiteren Schritt in seine D-3-Hydroxyalkanoat-Monomere zerlegt
wird, z. B. durch Hydrolyse. Daneben ist es aber auch möglich durch
Einsatz von geeigneten halophilen Bakterien direkt D-3-Hydroxyalkanoate
zu produzieren. Dazu werden bevorzugt halophile Bakterien verwendet,
die mehr D-3-Hydroxyalkanoate als PHA bilden. Solche Bakterien können z.
B. eine Überaktivität einer
geeigneten Depolymerase oder eine eingeschränkte 3-Hydroxyalkanoat-Dehydrogenaseaktivität, bevorzugt
eine eingeschränkte
3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenaseaktivität, aufweisen. Besonders
bevorzugt kann die vermehrte Produktion von D-3-Hydroxyalkanoaten
in halophilen Bakterien erfolgen, die gentechnisch verändert worden
sind.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1:
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Es
wird der Stamm Halomonas elongata verwendet. Der Stamm wird in einem
2,5 Liter fassenden Fermenter bei pH 5,5–8 (vorzugsweise pH 7,0) und 25–35°C (vorzugsweise
30°C) vermehrt.
Der Sauerstoffpartialdruck wird on-line überwacht und über die Rührdrehzahl
als Stellglied so geregelt, das er stets größer als 20% bezogen auf den
Sättigungsdruck
ist. Das Nährmedium
hat folgende Zusammensetzung: 100 g/l NaCl, 2,82 g/l (NH4)2SO4,
2,1 g/l MgSO4 × 7H2O,
1 g/l K2SO4, 15
mg/l FeSO4 × 7H2O,
5.5 mg/l CaCl2 × 6H2O.
Das Volumen der Nährlösung beträgt 1,0 Liter;
dieses wird mit 50 ml einer Vorkultur des Stammes mit einer optischen
Dichte von 2,7 (bei 700 nm) beimpft. Das Nährmedium der Vorkultur enthält zusätzlich 0,15
g/l KH2PO4. Die
resultierende Konzentration an Kaliumphospat im Fermenter beträgt 153 mg/l
und die Anfangskonzentration der Bakterientrockenmasse 0,1 g/l.
Als Kohlenstoffsubstrat dient Glukose, welches in Konzentrationen
zu 10 g/l zugesetzt wird. Als Korrekturmittel zur pH-Regulation
wird 12,5% NH4OH verwendet, als Entschäumer dient eine
10%ige Lösung
einer Silikon-Antischaum-Emulsion (Roth, Karlsruhe). Nach einer
Gesamtkultivierungszeit von 60 Stunden ist ein PHA-Gehalt von 42%
der Trockenmasse erreicht. Die PHA-Synthese erfolgt, nach Eintritt
einer P-Limitation. Der Ectoingehalt der Zelle beträgt 118 mg/g
Restbiomasse (Trockenmasse-PHA).
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Beispiel 2:
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Der
Stamm Halomonas elongata wird kultiviert wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Als Kohlenstoffsubstrat wird jedoch Glycerin verwendet. Der Ectoingehalt
nach 70 h Kultivierung beträgt
200 mg/g Restbiomasse bei einer Biomassekonzentration von 9 g/l
und einem PHA-Gehalt
von 40%.
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Beispiel 3:
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Der
Stamm Halomonas elongata wird kultiviert wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Die Konzentration an KH2PO4 in
der Nährlösung beträgt jedoch 1,58
g/l, die Konzentration an (NH4)2SO4 ist auf 0,95 g/l reduziert. Die PHA-Synthese
erfolgt nach Limitation der Zellteilung durch Ammonium. Nach 80
h Kultivierung beträgt
der Ectoingehalt der Zellen 133 mg/g Restbiotrockenmasse bei einem
PHA-Gehalt von 49%.