DE102004030385B4 - Verfahren zur Herstellung von Poly(3D-Hydroxybuttersäure-co-4-Hydroxybuttersäure) (P3HB/4HB) definierter molarer Zusammensetzung mit Delftia acidovorans P4A - Google Patents

Abstract

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly(D-3Hydroxybuttersäure-co-4-Hydroxybuttersäure) (P(3HB/4HB), dadurch gekennzeichnet, daß durch spezielle kontinuierliche ein- und zweistufige Kultivierungen sowie durch fed-batch-Kultivierungsverfahren mit mineralischen Medien und den Kohlenstoffsubstraten Essigsäure und Gamma-Butyrolacton (GBL) oder Essigsäure und 1,4-Butandiol unter Verwendung des Stammes Delftia acidovorans P4A (DSM 10474) definierte 4HB-Gehalte im Polymer gezielt erzeugt werden können.

Description

• Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von P(3HB/4HB) mit Delftia acidovorans P4a (DSM 10474). Durch eine spezielle Kultivierung können definierte 4HB-Gehalte im Polymer gezielt und reproduzierbar erzeugt werden.
• Polyhydroxyalkanoate (PHA) sind natürliche, thermoplastische Polyester, die mit der traditionellen Polymertechnik verarbeitet werden können. Ein wesentlicher Unterschied zu petrochemisch erzeugten Polymeren besteht in der biologischen Abbaubarkeit. Der bekannteste und verbreitetste Vertreter dieser Polymergruppe ist Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) (PHB). Dieses intrazelluläre Speicherpolymer kann von einer Vielzahl von Bakterien unterschiedlicher Gattungen synthetisiert werden, wenn eine geeignete Kohlenstoffquelle vorhanden ist und die Zellvermehrung durch Limitation von Ammonium-Stickstoff oder Phosphat gehemmt ist (JA Anderson, EA Dawes, 1990, Microbiol. Rev. 54: 450-472). Von Nachteil für eine Reihe von Anwendungen ist die geringe Elastizität.
• Ein wesentliche Verbesserung der mechanischen Eigenschaften kann durch die Synthese von Copolymeren erreicht werden. Von besonderem Interesse sind Copolymere aus (D)-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und 4-Hydroxybuttersäure (4HB). Schon bei einem 4HB-Gehalt von 3% kann die Reißdehnung von 5% auf 45% erhöht werden (Y Saito, et al., 1996, Polymer Int. 39: 169-174.).
• Aufgrund der Biokompatibilität sind PHA besonders als Werkstoffe für medizinische Anwendungen interessant ( WO 9932 536 ). In vivo wird das Polymer durch hydrolytische überwiegend nichtenzymatische Spaltung der Esterbindung abgebaut. Die Abbauzeiten sowohl von reinem PHB als auch von Copolymeren aus PHB/PHV sind sehr lang und können mehr als ein Jahr betragen (O. Duvernoy et al, 1995, Thorac. Cardiovasc. Surgeon 43: 271-274). Für eine Reihe medizinischer Anwendungen sind diese langen Degradationszeiten nicht erwünscht. P3HB/4HB zeichnet sich in Abhängigkeit vom 4HB-Anteil im Polymer durch wesentlich kürzerer Abbauzeiten aus, da die 4HB-Einheiten enzymatisch von Lipasen hydrolysiert werden können (Y Doi, 1990, Microbial polyesters. New York: VCH). Die Abbauprodukte 3-Hydroxybuttersäure (3HB) und 4-Hydroxybuttersäure (4HB) sind Bestandteil des humanen Stoffwechsels und können weiter metabolisiert werden.
• Es sind nur wenige Bakterienstämme bekannt, die ein Copolymer aus P(3HB/4HB) synthetisieren. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind 5 Wildtyp-Bakterienspecies identifiziert worden, die zur Synthese eines derartigen Copolymers befähigt sind: Ralstonia eutropha ( JP 0633 6523 ), Alcaligenes latus ( JP 06181784 ), Hydrogenophaga pseudoflava (MH Choi et al., 1999, Appl. Envir. Microbiol. 65: 1570-1576), Comamonas testosteronii (G Renner et al., 1996, Food Technol. Biotechnol. 34: 91-95) und Comamonas acidovorans ( JP 0919 1893 ). Die Synthese des Copolymers erfolgt nach Zusatz eines zweiten Kohlenstoffsubstrates (4- Hydroxybuttersäure, 1,4-Butandiol oder γ-Butyrolacton (GBL) während der Produktbildungsphase.
• Mit den bekannten Kultivierungsverfahren ist es kaum möglich, maßgeschneiderte Polymeren mit definierten Eigenschaften reproduzierbar zu erzeugen. Schon geringe Änderungen des 4HB-Anteils haben einen großen Einfluß auf die Polymereigenschaften. Die erzielten PHA-Gehalte sind häufig nicht ausreichend, um eine wirtschaftliche Gewinnung der Polymere zu erlauben. Von Nachteil sind zum Teil auch zu niedrige 4HB-Anteile, um signifikante Veränderungen der Material- und Degradationseigenschaften zu erzielen. Die beschriebenen fed-batch Verfahren mit Comamonas acidovorans nutzen komplexe Nährmedien für die Wachstumsphase (Fleischextrakt, Hefeextrakt, Polypepton), die zum Einleiten der Produktsynthese abgetrennt und durch Stickstoff-freie Medien ersetzt werden.
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Fermentationsverfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von P3HB/4HB mit gezielt einstellbarem 4-HB-Anteil zu entwickeln. Die Arbeiten konzentrierten sich auf den Einsatz von Wildstämmen. Im Gegensatz zur Herstellung von PHB-co-4HB mit gentechnisch veränderten Escherichia coli-Stämmen ( WO 9836078 , WO 9914313 , WO 9932536 , WO 2002008428 ) kann bei der Verwendung von Wildstämmen auf den Einsatz von Antibiotika im Fermentationsmedium verzichtet werden. Außerdem sind Prozeß- und Anlagenkosten aufgrund der geringeren Sicherheitsbestimmungen deutlich verringert. Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Entwicklung von speziellen kontinuierlichen ein- und zweistufigen Kultivierungsverfahren zur Synthese von P(3HB/4HB) aus Essigsäure und Gammabutyrolacton unter Verwendung des Stammes Delftia acidovorans P4a (DSM 10474) gelöst. Delftia acidovorans P4a ist aus Herbizid belastetem Mauerwerk isoliert worden (D. Hoffmann et al., 1996, Acta Biotechnol. 16: 121-131.) und zur mikrobiellen Dekontamination von mit Phenoxyessigsäure-Herbiziden belasteten Materialien eingesetzt worden (R. Müller, W. Babel, D. Hoffmann, DE 19608 19 , EP 0881923 ). Es wurde gefunden, daß der Stamm Copolymere mit hohem Gehalt an 4HB aus Essigsäure und GBL synthetisieren kann. Für die Zellvermehrung wird Essigsäure als Kohlenstoffsubstrat genutzt; es werden keine zusätzlichen komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen (Malzextrakt und Polypepton) benötigt. Die Einleitung der PHA-Synthese ist somit einfach, durch Auszehren des Ammonium-Stickstoff oder Phosphat zu vollziehen. Dadurch, sowie durch preiswertere Kohlenstoffsubstrate können Prozeßkosten gespart werden. Es können deutlich höhere PHA-Gehalte mit einem hohen Anteil an 4HB erreicht werden. Überraschenderweise wurde gefunden, daß nur der Stamm Delftia acidovorans P4a zu dieser Copolymersynthese befähigt ist; in anderen Isolaten der Gattung Delftia (z. B Delftia acidovorans MC1 (Müller et al., 1999, J. Microbiol. Res.154: 241-246)) konnten keine Copolymere aus 3HB und 4HB nachgewiesen werden.
• In der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Produktion von P(3HB/4HB) aus Essigsäure und GBL mit gezielt einstellbarem 4HB-Gehalt beschrieben. Zur Zuführung der in höheren Konzentrationen toxischen Kohlenstoffsubstrate in das Fermentationsmedium wurden spezielle Fermentationsstrategien entwickelt. Mit diesen Fermentationsstrategien werden konstante Verbrauchsraten der als Mischung zugeführten Kohlenstoffsubstrate erreicht und somit definierte Copolymeranteile erzeugt.
• Üblicherweise werden Prozesse zur Synthese von PHB bei einem Überangebot an Kohlenstoffsubstrat durchgeführt. Die Produktbildung wird ausgelöst, wenn die Zellvermehrung durch Limitation eines Nährstoffes (bevorzugt Ammonium oder Phosphat) begrenzt wird. Die Synthese von Copolymeren erfolgt durch Zuführen eines zweiten Kohlenstoffsubstrates, welches als Precursor für den zweiten Monomerbestandteil dient. In dem hier beschriebenen Verfahren werden die Kohlenstoffsubstrate in kleinen Konzentrationen kontinuierlich dosiert, um das Auftreten von inhibierenden Konzentrationen zu vermeiden. Für die PHA-Synthese wird ein Gemisch aus Essigsäure und Gamma-Butyrolacton im Verhältnis 100:7 (v/v)) als Kohlenstoffsubstrat verwendet, welches semi-kontinuierlich in gleichbleibenden niedrigen Konzentrationen durch Kopplung an die pH-Regulation dosiert wird. Aufgrund der unterschiedlichen Verbrauchsraten der beiden Kohlenstoffsubstrate können mit diesem System lediglich Copolymere mit einem molaren Anteil an 4HB von 10-13% reproduzierbar erzeugt werden. In der vorgeschalteten Wachstumsphase wird das Kohlenstoffsubstrat in Form einer Mischung aus Essigsäure und Natriumacetat als Vorlage für die pH-Regulation verwendet und auf diese Weise semi-kontinuierlich in nicht-toxischen Konzentrationen nachgeführt. Zum Erzielen hoher Bakterienkonzentrationen in der Fermentationsbrühe werden Spurensalze, und Ammonium oder Phosphat stufenweise oder kontinuierlich (durch Zusatz zum Kohlenstoffsubstratgemisch) nachgeführt.
• In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die PHA- Synthese in zweistufiger kontinuierlicher Prozeßführung. Derartige Verfahren, bei denen die Zellvermehrung und die Produktsynthese in getrennten Kulturgefäßen stattfinden, sind besonders geeignet, bei niedrigen Konzentrationen potentiell toxischer Kohlenstoffsubstrate eine gleichbleibende Zellvermehrung und eine hohe Produktanreicherung über einen beliebigen Zeitraum zu gestatten ( DE 199 10 143 C2 ). Überraschend wurde gefunden, daß durch Zufuhr von Kohlenstoffsubstratmischungen aus Essigsäure und GBL im Produktsynthesefermenter ein breites Spektrum von maßgeschneiderten Polymeren mit definierten und reproduzierbaren 4HB-Anteilen erzeugt werden kann.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die kontinuierliche Synthese von P(3HB/4HB) mit Delftia acidovorans P4a unter Belüftung und Rührung bei einem pH-Wert von 7-9,5. Im ersten Fermenter erfolgt bei einer Verweilzeit von 2 bis 8 Stunden die Zellvermehrung unter C-Limitation bei Verwendung von Essigsäure und Natriumacetat. Die Medienzusammensetzung ist derart berechnet, daß kleine Restsubstratkonzentrationen von N von 0,04 bis 0,1 g/l in der Fermentationsbrühe vorhanden sind. Die Fermentationsbrühe wird kontinuierlich steril in ein zweites Fermentergefäß überführt, in dem die Produktsynthese unter N-Limitation stattfindet. Im diesem Fermenter werden Verweilzeiten von 8 bis 30 Stunden eingestellt. Als Kohlenstoffsubstrat werden Mischungen von Essigsäure und GBL, bzw. Essigsäure und 1,4-Butandiol kontinuierlich zugeführt. Der Substratfluss wird so berechnet, daß nur sehr kleine Restsubstratkonzentrationen im Medium auftreten. Der PHA-Gehalt der Zellen liegt zwischen 40 und 70% der Trockenmasse. In Abhängigkeit von der Kohlenstoffsubstrat-Zusammensetzung im Medium können 4HB-Anteile zwischen 2 und 20 mol% gezielt eingestellt werden. Die räumliche Trennung von Zellvermehrung und Produktsynthese erlaubt eine direkte Einflußnahme hinsichtlich des zu erzeugenden 4HB-Gehaltes im Polymer.
• In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Synthese von P3HB/4HB in einstufiger kontinuierlicher Fermentation im Chemostaten unter N- oder P-Limitation. Das Kohlenstoffsubstrat wird als Mischung aus Essigsäure und Gamma-Butyrolacton im Verhältnis 100:3 bis 100:40 entweder mit dem Medium oder getrennt kontinuierlich zugeführt. Die Konzentration wird derart berechnet, daß hohe PHA-Gehalte erreicht werden (40-70%) und Restkonzentrationen von maximal 0,5 g/l im Kulturmedium auftreten. Auch mit dieser Kultivierungsmethode sind Polymere mit definierten Copolymergehalt an 4HB zu erzeugen, wenngleich die Ausbeutewerte der aus GBL erzeugten 4HB-Anteile geringer sind.
• Die Erfindung soll an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel 1
• Es wird der Stamm Delftia acidovorans P4a verwendet. Der Stamm wird in einem 5 Liter fassenden Fermenter bei pH 7-9,5 (vorzugsweise pH 8,0) und 30°C vermehrt. das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung, 0.94 g/l (NH₄)₂SO₄, 5.47 mg/l CaCl₂ × 6 H₂O, 310 mg/l P (aus äquimolaren Konzentrationen an KH₂PO₄ und K₂HPO₄) und Spurensalze: MgSO₄ × 7 H₂O (71.20 mg/l), CuSO₄ × 5 H₂O (0.78 mg/l), ZnCl₂ × 7 H₂O (0.44 mg/l), MnSO₄ × 4 H₂O (0.81 mg/l), Na₂MoO₄ × 2 H₂O (0.25 mg/l), FeSO₄ × 7 H₂O (10.0 mg/l). Das Volumen der Nährlösung beträgt 3,5 Liter; dieses wird mit 50 ml einer Vorkultur des Stammes beimpft. Die Kohlenstoffquelle wird in Form von Natriumacetat × 3 H₂O (1,1 g/l) zugesetzt und als Säurevorlage für die pH-Regulation, bestehend aus einem Gemisch von Natriumacetat × 3 H₂O (360 g/l) und Essigsäure (104 g/l), kontinuierlich nachgeführt. Nach Verbrauch des Ammonium-Stickstoffes wird Essigsäure-Mischung gegen eine Mischung folgender Zusammensetzung ausgetauscht: 340 ml/l Essigsäure, 11,9 ml/l Gamma-Butyrolacton, 511 ml/l 2N Schwefelsäure. Nach einer Gesamtkultivierungszeit von 45 Stunden ist ein PHA-Gehalt von 54% der Trockenmasse erreicht. Der 4HB-Anteil beträgt 13% (w/w) vom Gesamtpolymergehalt.
• Beispiel 2
• Der Stamm Delftia acidovorans P4a wird sowohl in einem 2-Liter als auch in einem 5 Liter fassenden Fermenter angezüchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Volumen der Nährlösung beträgt 0,8 bzw. 3,0 Liter. Die Bakterien werden zunächst mit einer Mischung aus Essigsäure und Natriumacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Bei Eintritt der Wachstumslimitation durch Ammonium ist eine Bakterientrockenmasse von 1,0 g/l erreicht.
• Das Volumen im ersten Fermenter beträgt 0,8 Liter, das Volumen des zweiten Fermenter 3,0 Liter. Nach Erreichen der Stickstofflimitation werden im ersten Fermenter 1N Schwefelsäure und 1N Natronlauge als Vorlage für die pH-Korrektur eingesetzt. Dann werden kontinuierlich 152 ml/h Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 unter Zusatz von 33 g/l Essigsäure und 0,3 ml/l Silikon-Antischaumemulsion zugeführt. Das überzählige Kulturvolumen wird periodisch abgepumpt. Der zweite Fermenter wird nach N-Limitation bis zum Erreichen einer PHA-Konzentration von 30-40% (berechnet aus einer Eichkurve der Zunahme der optischen Dichte bei 700 nm) weiter als fed-batch betrieben. Als Kohlenstoffsubstrat wird die Essigsäure-Natriumacetat-Mischung gegen Essigsäure (200 g/l) ausgetauscht, für die pH-Korrektur genutzt und somit kontinuierlich dosiert. Nach Erreichen des obengenannten PHB-Gehaltes werden 1N Schwefelsäure und 2N Natronlauge zur pH-Korrektur verwendet. Die beiden Fermentoren werden verbunden, so daß die Zellen aus dem ersten Fermenter kontinuierlich steril in den zweiten Fermenter überführt werden. Der Füllstand der Fermenter wird konstant gehalten. Als Regelgröße dient die Fermentermasse. Das überzählige Kulturvolumen wird abgepumpt. Nach Erreichen des Gleichgewichtes hat das Kulturmedium des ersten Fermenter eine Biomassekonzentration von 1,1 g/l (Trockenmasse) uns einen PHB-Gehalt von 0-1% (w/w). Das Kohlenstoffsubstrat wird als Mischung aus Essigsäure und Gamma-Butyrolacton kontinuierlich dem zweiten Fermenter zugeführt. Mit einer Mischung aus 91 g/l Essigsäure und 11 g/l Gamma-Butyrolacton, die mit einer Geschwindigkeit von 8,4 ml/Stunde zugepumpt wird, wird nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes eine Biotrockenmassekonzentration von 2,6 g/l mit einem PHA-Gehalt von 65% erreicht. Der 4HB-Anteil im Polymer beträgt 6,8% (w/w). Die Verweilzeit der Zellen im zweiten Fermenter beträgt 20 Stunden.
• Beispiel 3
• Der Stamm Delftia acidovorans P4a wird in einem 2-Liter fassenden Fermenter angezüchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Nährmedium hat die 3-fache Konzentration an Ammoniumsulfat, Spurensalzen und Kalziumchlorid, sowie 310 mg/l P (aus äquimolaren Konzentrationen von KH₂PO₄ und K₂HPO₄). Das Volumen der Nährlösung beträgt 1,3 Liter. Die Bakterien werden zunächst mit einer Mischung aus Essigsäure und Natriumacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. bei Eintritt der Wachstumslimitation durch Ammonium ist eine Bakterientrockenmasse von 5,3 g/l erreicht. Die Produktsynthese wird mit einer Mischung von 340 ml/l Essigsäure, 11,9 ml/l GBL, 511 ml/l 2N Schwefelsäure bis zum Erreichen eines PHA-Gehaltes von 30% der Trockenmasse unter fed-batch Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der PHA-Gehalt wird anhand einer vorher ermittelten Eichkurve aus der Extinktion bei 700 nm errechnet. Dann wird die Fermentation als Chemostat weitergeführt. Es werden kontinuierlich 56 ml/h Medium, bestehend aus der dreifachen Konzentration an Ammoniumsulfat, Spurensalzen und Kalziumchlorid, 310 mg/l P, 75 g/l Essigsäure, 2 g/l GBL und 0,5 ml/l Silikon-Antischaumemulsion zugepumpt. Das Kulturvolumen wird auf 1,31 eingestellt und die überzählige Fermenterbrühe periodisch abgepumpt. Für die pH-Regelung werden 1N Schwefelsäure und 1N Natronlauge als Korrekturmittel eingesetzt. Die Verweilzeit im Fermenter beträgt 23 Stunden. Im Gleichgewichtszustand wird eine Bakterientrockenmasse von 7,2 g/l mit einem PHA-Gehalt von 38% erreicht. Der Anteil an 4HB beträgt 10,7% vom Gesamtpolymer.

Claims (14)

1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly(D-3Hydroxybuttersäure-co-4-Hydroxybuttersäure) (P(3HB/4HB), dadurch gekennzeichnet, daß durch spezielle kontinuierliche ein- und zweistufige Kultivierungen sowie durch fed-batch-Kultivierungsverfahren mit mineralischen Medien und den Kohlenstoffsubstraten Essigsäure und Gamma-Butyrolacton (GBL) oder Essigsäure und 1,4-Butandiol unter Verwendung des Stammes Delftia acidovorans P4A (DSM 10474) definierte 4HB-Gehalte im Polymer gezielt erzeugt werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellvermehrung in mineralischem Medium, mit Essigsäure als Kohlenstoffsubstrat erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung unter Belüftung und Rührung bei 25-35°C und pH 7-9,5 erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß für die Produktsynthese ein Gemisch aus Essigsäure und Gamma-Butyrolacton oder Essigsäure und 1,4-Butandiol verwendet wird, dessen Zusammensetzung den Comononeranteil an 4HB bestimmt.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellvermehrung und Produktsynthese unter fed-batch-Bedingungen erfolgen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffsubstrate semikontinuierlich, durch Kopplung an die pH-Regelung in kleinen Konzentrationen dosiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß Wachstum und Produktsynthese im Chemostat erfolgen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung unter N- oder P-Limitation erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 7-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Medien- und Kohlenstoffsubstrate so berechnet sind, daß kleine Restsubstratkonzentrationen (< 0,5 g/l) an Kohlenstoffsubstrat in der Kulturflüssigkeit auftreten.
10. Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß Wachstum und Produktsynthese räumlich getrennt in zwei Fermentoren erfolgen.
11. Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Fermenter bei Verweilzeiten von 2-8 Stunden die Zellvermehrung unter C-Limitation mit Acetat erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellvermehrung im ersten Fermenter unter N- oder P-Limitation, jedoch bei kleinen Restsubstratkonzentrationen an Acetat erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Fermenter niedrige Restsubstratkonzentrationen an N oder P auftreten.
14. Verfahren nach Anspruch 1-4 und 7-12, dadurch gekennzeichnet daß die Produktsynthese im zweiten Fermenter unter N- oder P-Limitation bei niedrigen Restsubstratkonzentrationen an Kohlenstoffsubstrat erfolgt.