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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(- > 3-Hydroxybuttersäure umzusetzen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Buttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(- > 3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Züchtung in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Menthol und Äthanol,
oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8, mehr D(- > 3-Hydroxybuttersäure als der der Mutation unterworfene Ausgangsstamm produzieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Buttersäure ausscheidenden Bakterienstamm einen solchen von Clostridium butyricum ATCC 19398 und als Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm einen solchen von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azoobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 oder Mycoplana rubra CBS 38576 einsetzt.
3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 gewonnen Bakterienstämme zur Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure, dadurch gekennzeichnet, dass man einen besagten Bakterienstamm in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8 züchtet und die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe isoliert.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterienstamm die D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381 76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383 76; von Bacillus megatherium DSM 32, z. B. die Mutante CBS 382 76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384 76; von Clostridium butyricum ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380 76; und ferner Mycoplana rubra CBS 38576 und seine entsprechenden Mutanten verwendet.
5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle 2 bis 25 Gew.-% Glucose, Saccarose, Lactose, Melasse oder Molke berechnet als reines Kohlehydrat, 1 bis 10 Gew.-% Methanol oder Äthanol, oder 1 bis 10 Gew.-% Ablauge der Caprolactam- synthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren, beträgt.
6. Verwendung nach Anspruch 3,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt wird, je nachdem ob es sich bei dem verwendeten Bakterienstamm um einen Aerobier oder Anaerobier, z. B. die Gattung Clostridium, handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche D(- > 3-Hydroxy- buttersäure produzieren, und die Verwendung derart gewonnener Bakterienstämme zur Herstellung der erwähnten Säure.
Da in der Literatur sich widersprechende Angaben über die Bezeichnung optisch aktiver 3-Hydroxybuttersäuren vorliegen, gelten für die vorliegende Erfindung die nachfolgenden Definitionen.
Die in der Natur vorkommende bzw. physiologische 3-Hydroxybuttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure (oder auch D(- > beta-Hydroxybuttersäure) hat bei einer Konzentration von 5 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung La]25 von -24,5 , während die in der Natur nicht vorkommende 3-Hydroxybuttersäure oder L(+ > 3-Hydroxybuttersäure bei einer Konzentration von 2,226 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung []d von +24,3 aufweist.
Im folgenden handelt es sich ausschliesslich um die bei der Natrium-D-Linie negativ drehende 3-Hydroxybuttersäure, welche der Einfachheit halber hinfort mit der Abkürzung HB bezeichnet wird.
Zur Herstellung der racemischen DL-3-Hydroxybuttersäure bestehend verschiedenen Verfahren; siehe unter anderem Deutsche Offenlegungsschrift 441 003 und Wislicenus, Ann. 149 (1869), 207. Ferner gelang es McKenzie und Harden, aus DL-3 Hydroxybuttersäure mittels Aspergillus niger die optisch aktive reine L(+ > 3-HydroxybuUersäure herzustellen [J. Chem.
Soc.83 (1903),430}.
In Mensch, Tier und Pflanzen kommt ausschliesslich die D(- > 3-hydroxybuttersäure, nämlich als unentbehrlicher Stoff im Fetthaushalt, vor [Edström et al., Acta Obstet. Gynecol.
Scand. 54(1975), 347; Moore et al., Am. J. Physiol. (1976), 619]. Eben zufolge dieses natürlichen Vorkommens und dieser physiologischen Funktion dürfte der Verbindung grosse Bedeutung unter anderem bei der parenteralen Ernährung und als Ausgangsstoff zur Herstellung für den menschlichen Organismus gut verträglichen chemischen Verbindungen zukommen.
Es ist dem um so erstaunlicher, dass es bis heute - im Gegensatz zu geschilderten Verhältnissen in bezug auf die racemische und die rechtsdrehende, nicht natürliche 3-Hydroxybuttersäure - noch kein Verfahren gibt, welches eine technisch durchführbare Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure ermöglicht, Insbesondere waren bisher keine Mikroorganismen bekannt, welche die gewünschte Carbonsäure ausscheiden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass unter den Mikroorganismen, welche zur Klasse der Schizomycetes von Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit. R. S. Breed et al., 7. Auflage, The Williams and Wilkins
Company, Baltimore 1957) gehören, solche gewonnen werden können, welche ausgehend von äusserst billigen Kohlenstoffquellen hohe Konzentrationen von D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheiden und sich bezüglich dieser Fähigkeit stets verbessern lassen. Die Mikroorganismen können von irgendeiner Kulturensammlung bezogen, oder aber aus natürlichem Material, wie Boden, Wasser, Luft, Jauche, nach bekannten Methoden leicht isoliert werden. Besonders geeignet sind Mikroorganismen, welche imstande sind, selbst Buttersäure oder Poly < D-3- hydroxybuttersäure) zu synthetisieren, wie z. B.
Angehörige der Familien Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae und Enterobacteraceae.
Bekannte Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) aufspeichernde Bakterienstämme, wie z. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 und ein bisher unbekannter, aus Luft isolierter Methanolverwerter, der als
Mycoplana rubra-Stamm erkannt wurde, werden auf Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle submers angezüchtet. Nach Entfernung der Kohlenstoffquelle werden die Mikroorganismen in ein Medium gebracht, welches als einzige Kohlenstoffquelle racemische 3-Hydroxybuttersäure, sowie ein die aktiven bzw.
wachsenden Zellen abtötendes Antibiotikum enthält. Die ruhende bzw. nicht wachsenden, überlebenden Zellen, die das Enzym 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase (= EC 1.1.1.30) nicht bilden und folglich ss-HB nicht assimilieren können, werden isoliert und auf ihre Fähigkeit zur Bildung von ss-HB geprüft. Zu diesem Zwecke wird in aliquoten Teilen der Kulturflüssigkeit gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim und Academic Press, Inc., New York 1974, Seite 1883), die Konzentration an HB quantitativ bestimmt.
Die so gewonnenen ss-HB-ausscheidenden Bakterienstämme werden mit bekannten mutagenen Agenzien behandelt, um Mutanten zu erzeugen, unter welchen diejenigen ausgesucht werden, welche pro Volumeneinheit der Kulturflüssigkeit noch höhere Konzentrationen an frHB als ihr Ausgangsstamm erzeugen.
Andererseits werden von Mikroorganismen, welche keine Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichern, sondern Buttersäure bilden, wie die Clostridiumarten, z. B. das bekannte Clostridium butyricum ATCC 19398, in analoger Weise jene Abkömmlinge gesucht, welche keine 3-Hydroxybuttersäurehydrogenase bilden und folglich HB nicht mehr assimilieren können. Solche Stämme werden auf Agarplatten als Streukolonien angezüchtet. Nach erfolgtem Wachstum werden die Agaroberflächen mit einem Gemisch von 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase, Nicotin-adenin-dinucleotid in der oxydierten Form (NAD) und einem aus Methylenblau oder Triphenyltetrazoliumchlorid bestehenden Redoxindikator überschichtet und nach Kolonien gesucht, welche eine Verfärbung des Redoxindi kators bewirken.
Solche wurden isoliert und auf die Fähigkeit ss-HB zu produzieren untersucht. ss-HB-erzeugende Stämme werden dem erwähnten Mutationsverfahren unterworfen, um Abkömmlinge mit gesteigerter Produktivität für ss-HB zu erhalten.
Bakterienstämme, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(- > 3- Hydroxybuttersäure umsetzen, werden also erfindungsgemäss dadurch gewonnen, dass man einen Buttersäure oder D(- > 3- Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder eine Poly4D-3- Hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(- > 3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Verwendung der nachstehend erwähnten Koh- lenstoffquellen und Züchtungsbedingungen mehr D(- > 3 Hydroxybuttersäure als der der Mutation unterworfene Ausgangsstamm produzieren.
Auf diese Weise sind als besonders ergiebige Quellen die D(- > 3-Hydrnxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381 76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383 76; von Bacillus megatherium DSM 32, z. B.
die Mutante CBS 382 76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384 76; von Clostridium butyrium ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380 76; und ferner Mycoplana rubra, CBS 38576 und seine entsprechenden Mutanten gewonnen worden. Selbstverständlich lassen sich die erwähnten Bakterienstämme durch Anwendung der oben beschriebenen Methode in ihrer Produktivität weiterhin verbessern. Die genannten Stämme sind deponiert bei American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland, USA), und Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), München (BRD); die mit CBS angeführten Mutantenstämme sind am 4.8. 1976 bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (Niederlande), deponiert worden.
Kreuzreferenz der Stammnummern für ATCC/NCIB/DSM:
DSM ATCC NCIB Bacillus megatherium 32 14581 9376 Alcaligenes eutrophus 10442 23440 428 Zoogloea ramigera 10340 19623 287 Clostridium butyricum - 19398 552
Die ss-HB-erzeugenden Bakterienstämme werden in der Folge nach bekannten Methoden daran gewöhnt, in hohen Konzentrationen von spezifischen Kohlenstoffqellen, nämlich Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse, Molke, Methanol, Äthanol und der Ablauge von der Caprolactamsynthese, zu wachsen und HB zu produzieren, wobei NH4-lonen oder Harnstoff als Stickstoffquelle dienen und die üblichen Spurenelemente beigegeben werden.
Die Abkömmlinge von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 können nebst organischen Kohlenstoffquellen wie die oben erwähnten auch Kohlendioxyd assimilieren, wenn die Atmosphäre gleichzeitig molekularen Wasserstoff und Sauerstoff enthält, um a-HB zu produzieren.
Der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle beträgt mit Vorteil etwa 2 bis 25% Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse oder Molke - berechnet als reines Kohlehydrat, etwa 1 bis 10% Methanol oder Äthanol, oder etwa 1 bis 10% Ablauge der Caprolactamsynthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren.
Obwohl all die erhaltenen Bakterienstämme p-HB auf festen Nährmedien produzieren, sind flüssige Medien für die Produktion vorzuziehen. Dafür werden in bekannter Weise wässerige Nährlösungen von der erwähnten Konzentration an Kohlenstoffquellen und mit einer assimilierbaren Stickstoffquelle sowie den notwendigen Spurenelementen bereitet. Die sterilen Nährmedien werden mit 0,1-10 Volumen-% einer Vorkultur beimpft und bei etwa 25-40 "C in stehender Kultur oder unter Luftausschluss - für die anaeroben Mikroorganismen, z. B. die Clostridiumarten, bzw. unter Rühren oder Schütteln und gegebenenfalls unter Zufuhr von Luft oder einem Gemisch von Kohlendioxyd, Wasserstoff und Sauerstoff (oder Luft) - für die aeroben Mikroorganismen, während 8 bis 72 Stunden inkubiert.
Um eine möglichst hohe Ausbeute an der gewünschten Carbonsäure zu erhalten, wird der pH-Wert der beimpften Lösung durch Zugabe steriler Alkalilösung bei 6 bis 8 gehalten.
Während des Wachstums der Biomasse kann laufend frische Kohlenstoffquelle beigefügt werden, um davon eine konstante Konzentration aufrecht zu erhalten und eine maximale Produktion von HB zu erreichen.
Die erfindungsgemässe Verwendung besteht also darin, dass man einen verfahrensgemäss gewonnenen D(- > 3-Hydroxybuttersäure produzierenden Bakterienstamm in einem wässerigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse und Molke, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einen pH-Wert von 6 bis 8 züchtet und die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe nach bekannten Methoden isoliert.
Nach Abschluss des Fermentationsansatzes, d. h. wenn die maximale ss-HB-Konzentration erreicht ist, kann die HB gegebenenfalls nach Abtrennung der Biomasse aus der Gärlösung mittels lonenaustauschern, oder nach Ansäuerung der Gärlösung auf etwa pH 1,5 bis 2,5 mittels mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Äther, Chloroform oder anderen chlorierten Kohlenwasserstoffen, Äthylacetat oder anderen Estern, Isopropanol, Butanol und anderen Alkoholen, extrahiert werden. Aus den organischen Lösungsmitteln kann HB als Salz mit metallischen Kationen, wie z. B. Lithium, Kalium, Natrium, Calcium und Barium oder Nickel, gefällt oder in konzentrierte wässerige Lösungen übergeführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
Es wird zuerst eine Nährlösung bereitet, welche 0,9% NaHPO' 12 H2O, 0,15% KH2PO4, 0,1% NH4Cl, 0,04% MgSO- 7 H20, 0,0195% Eisen(II)-NH-citrat 6 H20, 0,00133% CaC12, sowie pro Liter Lösung 1 ml einer Spurenelementlösung mit 0,01% ZnSO4- 7 H2O, 0,003% MnCk-4 zu4 H2O,0,03% Borsäure, 0,02% CoClz.6 zu6 H2Q. 0,0001 CuCk- H2Q,'0,002 NiG .6 6 H2O, 0,003% Na2MoO4- 2 H20 enthält.
In 250 ml Erlenmeyerflaschen werden mit je 30 ml der Nährlösung Schüttel- bzw. Standkulturen bei 30 C während 16 bis 24 Stunden angezüchtet. Der bei 121 C während 20 Minuten sterilisierten Lösung werden pro 980 ml 20 ml sterilfiltrierte Fruktoselösung, enthaltend 10 g dieses Kohlehydrats, beigegeben. Die Beimpfung erfolgt mittels einer Öse ab 24-stündiger Schrägagarkultur.
Die Schüttelkultur wird auf einer Zentrifuge sedimentiert und die Biomasse mit Wasser gewaschen und in etwa 4 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Nach etwa 1 Stunde werden 4 ml 0,6-n Natriumacetat-Puffer von pH 4,6 und 4 ml einer 0,05-n Natriumnitritlösung zur Mutationserzeugung beigegeben und für wenige Minuten inkubiert. Nach Waschen wird die Biomasse eines jeden Mikroorganismus (siehe nachstehende Tabelle) auf etwa 10 Erlenmeyerflaschen zu 250 ml verteilt, welche mit obigem Medium beschickt sind und statt der Fruktose 2% DL-3-Hydroxybuttersäure enthalten.
Nachdem die Trübung in den Kolben sichtlich zunehmend ist, wird je nach Organismus pro Kolben je 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mg/ml K-Penicillin G, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 30 mg/ml Bacitracin, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mglml Colostin-Sulfat beigegeben oder je 0,5 ml von zwei verschiedenen Antibiotikalösungen zugefügt. Nach verschiedener Inkubationsdauer, d. h. nach 1 bis 16 Stunden, werden die Antibiotika ausgewaschen oder mit Penicillinase zerstört. Die überlebenden Mikroorganismen werden mit Wasser gewaschen und auf das Fruktosemedium verimpft.
Nach 16 bis 36 Stunden werden von jedem Kolben Verdünnungsreihen hergestellt und von jenen Verdünnungen, welche pro ml etwa 50 bis 1000 Keime enthalten, werden 0,1 ml auf Agarplatten ausgestrichen, um einzelstehende Streukolonien zu erhalten. Dieser Agar enthält als Kohlenstoffquelle 2% DL3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz sowie 0,008% Fruktose.
Nach etwa 48 Stunden haben sich viele sehr kleine, unterschiedlich aussehende Kolonien von etwa · bis 1 mm Durchmesser, sowie Kolonien von normaler Grösse gebildet. Von allen kleinen Kolonievarianten werden nun mittels sterilen Zahnstochern aus Holz Inokula übertragen, erstens auf einen bestimmten Platz einer Agarplatte mit DL-3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz als einziger Kohlenstoffquelle und zweitens sofort danach auf den entsprechenden Platz einer Agarplatte mit Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle. Etwa 10 bis 30% der so geprüften Kolonien vermögen auf DL-3-Hydroxybuttersäure nicht zu wachsen. Diese werden auf das bekannte Fruktosemedium ausgebreitet, welchem 3% fein disperses CaCO3 (trocken sterilisiert) beigemengt worden sind, so dass die Platten milchig trüb aussehen.
Von allen Kolonien, welche den Kalk zu lösen vermögen, kann angenommen werden, dass sie eine Säure produzieren. Von diesen werden Schüttelkulturen im Fruktosemedium gemacht, um deren Fähigkeit zur Produktion von HB gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (siehe oben) zu prüfen.
Bei den Arbeiten mit Clostridium butyricum wird unter strikten Anaerobie-Verhältnissen gemäss Schocher [ Ein Betrag zur Kenntnis der Wachstums- und Gärungsphysiologie der saccharolytischen Clostridien , Dissertation, Laboratorium voor Microbiologie, Technische Hochschule Delft (Nieder lande), 1959] gearbeitet. Die folgende Tabelle illustriert den Erfolg der angewendeten Technik.
Erzeugung von p-HB-produzierenden Mikrobenstämmen
Pro Art wurden etwa 100 000-1 000 000 Stämme auf Säurebildungsfähigkeit untersucht.
Bakterienstamm Antibiotika- Anzahl säure- Anzahl ss-HB-produzie- Stämme mit maximaler
Behandlung produziern- render Stämme ss-HB-Produktion mit der Kolonien bis bis bis in Bezeichnung des I mg/L 10 mg/L 95 mg/L mg/L besten Stammes Alcaligenes eutrophus ATCC23440 - ca. 10000 0 0 0 - und Mutanten davon Colistin/ ca. 10000 ca. 800 6 1 74 GA-3
Bacitracin (CBS 381 76) Bacillus megatherium DSM 32 - ca.8000 0 0 0 - und Mutanten davon Penicillin ca. 000 ca. 600 15 2 95 GB-1 (CBS38276) Azotobacter chroococ cum DSM 281 - ca.7000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 000 ca.
700 7 3 86 GC-7 (CBS 383 76) Zoogloea ramigera ATCC 19623 - ca.11 000 0 0 0 - und Mutanten davon Colistin ca. 12000 ca. 500 17 1 51 GZ-1 (CBS 384 76) Bakterienstamm Antibiotika- Anzahl säure- Anzahl ss-HB-produzie- Stämme mit maximaler
Behandlung produziern- render Stämme (1-1 B-Produktion mit der Kolonien bis bis bis in Bezeichnung des I mg/L 10 mg/L 95 mglL mg/L besten Stammes
Clostridium butyricumATCC19398 - ca. 16000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin/ ca.
16000 ca. 100 3 1 76 GC1-2
Penicillin (CBS 380 76)
Mycoplana rubra
CBS 38576 ca.5000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 000 ca. 300 21 4 67 GM-1 (CBD 385 76)
Beispiel 2 Die ss-HB-Produzenten GA-3, GB-1, GC-7, GZ-1, GCl-1,GC-2und GM-1 werden dem im Beispiel 1 beschriebenen Mutationserzeugungsverfahren unterworfen und analog auf Agarplatten ausgestrichen. Nach beendetem Wachstum werden die Kolo nien mittels Samtstempeln auf frische Agarplatten gebracht, welche solche Mengen von sterilem Bromkresolgrün oder Bromkresolpurpur als pH-Indikator enthalten, dass der Agar blau bzw. purpur angefärbt ist.
Nach kurzen Inkubationszeiten, d. h. schon nach 5 bis 6 Stunden, können zum Teil schon Verfärbungen des pH-Indikators festgestellt werden, wodurch Kolonien lokalisiert werden, welche schnell wachsen und viel Säure bilden. Solche werden ausgewählt und submers gezüchtet, um ihre ss-HB-Produktivität zu erfassen. Weitaus die meisten Abkömmlinge der eingesetzten p-HB-Produzenten produzieren weniger oder zum Teil gar keine B-HB. Doch werden unter Tausenden von mutativ erhaltenen Abkömmlingen ab und zu einer oder wenige wahrgenommen, welche mehr ss-HB produzieren als der Ausgangsstamm.
Solche werden einem erneuten Mutations-/Selektionszyklus unterworfen, um erneut die Stämme zu erfassen, welche noch höhere Konzentrationen von frHB produzieren können.
Aus den erhaltenen Gärlösungen wird die Biomasse abzentrifugiert und der pH-Wert vor oder nach dem Zentrifugieren mit verdünnter Säure auf etwa 1,5 bis 2,5 eingestellt. Die
Lösung wird mit Äthyläther mehrmals extrahiert, das Lösungsmittel mit Säure gewaschen und im Vakuum bei etwa 30 "C abgedampft. Dem konzentrierten Extrakt wird Petroläther oder Cyclohexan beigemischt, wodurch ss-HB ausfällt und abfiltriert werden kann. Die Extraktion kann auch mit Chloroform durchgeführt werden.
Auf diese Weise wurde vom Stamm GA-3 die Mutante GA-113 abgeleitet, welche innert 48 Stunden 1375 mg ss-HB/ Liter; vom Stamm GZ-l die Mutante GZ-317, welche 1980 mg p-HB/Liter; vom Stamm GC1-2 die Mutante GCI-138, welche
1670 mg ss-HB/Liter, sowie von Stamm GM-1 die Mutante GM-97, welche 1475 mg ss-HB/Liter produzierte, abgeleitet.
Durch weitere Mutationen/Selektionen können die p-HB- Ausbeuten noch weiter erhöht werden.
Beispiel 3
500 ml Erlenmeyerkolben, welche 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1 enthalten, wobei jedoch an Stelle von Fruktose 6% neutralisierte, sterile Ablauge der Caprolactamsynthese (welche ein Gemisch von Mono- und Dicarbonsäuren enthält) verwendet wird und die NH4Cl-Menge um 50% herabgesetzt ist, werden mit einer Kultur des Azotobacter chroococcum DSM 281, Abkömmling GC-183 CAL, beimpft und in Gegenwart von Luft bei 30 bis 32 "C exzentrisch geschüttelt.
Analog zu Beispiel 2 wird p-HB mit Äthylacetat extrahiert und aus dem nativen Extrakt durch Beigabe von konzentrierten
Lösungen von NaOH, Ca(OH)2 bzw. KOH ausgefällt und durch
Abfiltrieren als Na-, Ca- bzw. K-Salz gewonnen. An Stelle des Äthlacetats kann auch n-Butanol oder Isopropanol verwendet werden. Nach 46 Stunden enthält die Gärlösung etwa 1600 mg ss-HB pro Liter.
Beispiel 4
Analog zum Beispiel 3 wird mit dem Abkömmling GC-157 MEL von Azotobacter chroococcum DSM 281 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Ablauge der Caprolactamsynthese
12 Gew.-% Rübenzuckermelasse verwendet werden. Nach 36
Stunden erreicht die Gärlösung eine ss-HB-Konzentration von
1780 mg/L.
Beispiel 5
In Analogie zu Beispiel 3 wird mit dem Stamm GB-257 CAL, welcher ein Abkömmling von Bacillus megatherium
DSM 32 ist, verfahren, und innert 36 Stunden 2100 mg ss-HB/
Liter erhalten.
Beispiel 6
Analog zu Beispiel 4 wird mit dem Stamm GB-312 MEL, einem anderen Abkömmling von Bacillus megatherium DSM 32, verfahren und in 48 Stunden 2670 mg ss-HB pro Liter erhalten.
Beispiel 7
Analog zum Beispiel 3 produziert GZ-253 Cal, eine Mutante von Zoogloea ramigera ATCC 19623, 1400 mg ss-HB pro Liter.
Beispiel 8
Analog zu Beispiel 4 synthetisiert GZ-301 MEL, eine andere Mutante von Zoogloea ramigera ATCC 19623,2030 mg ss-HB/ Liter.
Beispiel 9
Unter anaeroben Bedingungen wird die Mutante GCI-112 von Clostridium butyrium ATCC 19398 in einem Medium von 4% Saccharose, 0,3% NH4-Acetat, 0,178% Na2HPO4 2H2O, 0,136% KH2PO4, 0,042% Mg SO4.7 zu7 HzO, 0,00025% FeSO- 7 H2O, 0,00013% MnClz. 4 H2O, sowie 1 ,ug (+ > Biotin pro 1000 ml während 48 Stunden inkubiert, wonach das Gärmedium eine Konzentration von 1710 mg ss-HB/Liter aufweist.
Beispiel 10
Um Methanol verwertende Mikroorganismen zu finden, wird ein 500 ml Becherglas mit etwa 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1, welche jedoch als einzige Kohlenstoffquelle 1 % Methylalkohol enthält, im Laboratorium offen aufgestellt.
Nach einigen Tagen ist die Lösung trüb, und es können daraus nach entsprechenden Verdünnungen mit Wasser auf Agarplatten mit dem Medium von Beispiel 1 einzelstehende Streukolonien erzeugt werden. Mit ausgewählten Kolonien werden im erwähnten Methylalkoholmedium Schüttelkulturen gezüchtet, welche gemäss Law & Slepecky [J. Bact. 82(1961), 33] auf die Produktion von Polybetahydroxybuttersäure untersucht werden. Auf diese Weise wird ein stäbchenförmiger Mikroorganismus erhalten, welcher bis zu 50 Gew.-% seiner Zellmasse Polybetahydroxybuttersäure bildet und als Mycoplana rubra Stamm erkannt wurde.
Beispiel 11
Mit dem Abkömmling GM-37 des aus Luft neu isolierten Methanol-verwertenden, stäbchenförmigen Mikroorganismus Mycoplana rubra (CBS 385 76) wird analog zu Beispiel 3 verfahren, jedoch wird die Ablauge der Caprolactamsynthese durch 2,5% Methylalkohol ersetzt. Nach 48stündiger Inkuba tionszeit bei 31 "C enthält die Gärlösung 536 mg 2-HB/Liter.
Beispiel 12
Mit GA-97 CAL, einer Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 abgeleiteten Mutante, wird analog zu Beispiel 3 verfahren, und 1050 mg ss-HB/Liter erhalten.
Beispiel 13
Mit dem Stamm GA-113, der von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 gewonnen wurde, wird unter Bedingungen und im Medium gemäss Volker Öding (Gesellschaft für Strahlenforschung, Bericht M 109, Göttingen 1972) in rein mineralischer Nährlösung und in Gegenwart einer aus Wasserstoff, Kohlendioxyd und Sauerstoff bestehenden Atmosphäre bei 30 "C während 48 Stunden angezüchtet.
Das Überstehende der Gärlösung wird mit einem Anionenaustauscher in der OH-Form behandelt. Durch Eluierung des Austauschers mit verdünnter Natronlauge wird das Natriumsalz der 2-HB erhalten. Ausbeute: 1250 mg ss-HB/Liter.
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PATENT CLAIMS
1. A process for obtaining bacterial strains which are able to convert a maximum proportion of the carbon source present into D (-> 3-hydroxybutyric acid in the shortest possible time, characterized in that a butyric acid or D (-> 3-hydroxybutyric acid is eliminated or poly4D-3 -hydroxybutyric acid) subjecting bacterial strain to the action of mutagenic agents, selects from the mutants that are selected which D (-> 3-hydroxybutyric acid cannot assimilate) and in turn selects those which - if necessary after renewed mutation - are grown in an aqueous medium Nutrient medium, which as a carbon source is an assimilable carbohydrate from the group of glucose, sucrose and lactose, an assimilable alcohol from the group of menthol and ethanol,
or the waste liquor from the caprolactam synthesis, together with an assimilable nitrogen source and trace elements, at a temperature of 25 to 40 ° C. and a pH of 6 to 8, produce more D (-> 3-hydroxybutyric acid than the parent strain subjected to the mutation.
2. The method according to claim 1, characterized in that the bacterial strain excreting butyric acid is one of Clostridium butyricum ATCC 19398 and the poly4D-3-hydroxybutyric acid) storing bacterial strain is one of Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azoobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM , Zoogloea ramigera ATCC 19623 or Mycoplana rubra CBS 38576.
3. Use of the bacterial strains obtained by the process according to claim 1 for the production of D (-> 3-hydroxybutyric acid, characterized in that said bacterial strain in an aqueous nutrient medium which is an assimilable carbohydrate from the group of glucose, sucrose and lactose as a carbon source , an assimilable alcohol from the group consisting of methanol and ethanol, or the waste liquor from the caprolactam synthesis together with an assimilable nitrogen source and trace elements, is grown at a temperature of 25 to 40 ° C. and a pH of 6 to 8 and the optically active carboxylic acid formed the culture broth isolated.
4. Use according to claim 3, characterized in that the D (-> 3-hydroxybutyric acid-excreting mutants of Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, for example the mutant CBS 381 76; of Azotobacter chroococcum DSM 281, for example. the mutant CBS 383 76; from Bacillus megatherium DSM 32, e.g. the mutant CBS 382 76; from Zoogloea ramigera ATCC 19623, e.g. the mutant CBS 384 76; from Clostridium butyricum ATCC 19398, e.g. the mutant CBS 380 76; and also Mycoplana rubra CBS 38576 and its corresponding mutants.
5. Use according to claim 3, characterized in that the content of the nutrient solution of carbon source 2 to 25 wt .-% glucose, saccarose, lactose, molasses or whey calculated as pure carbohydrate, 1 to 10 wt .-% methanol or ethanol, or 1 to 10% by weight of waste liquor from the caprolactam synthesis - calculated as the total carboxylic acids contained therein.
6. Use according to claim 3, 4 or 5, characterized in that the cultivation is carried out under aerobic or anaerobic conditions, depending on whether the bacterial strain used is an aerobic or anaerobic, e.g. B. the genus Clostridium.
The present invention relates to a method for obtaining bacterial strains which produce D (-> 3-hydroxybutyric acid) and the use of bacterial strains obtained in this way for the production of the acid mentioned.
Since there are contradicting information in the literature on the designation of optically active 3-hydroxybutyric acids, the following definitions apply to the present invention.
The naturally occurring or physiological 3-hydroxybutyric acid or D (-> 3-hydroxybutyric acid (or also D (-> beta-hydroxybutyric acid) has a specific rotation La] 25 of -24 at a concentration of 5 g per 100 ml water , 5, while the naturally occurring 3-hydroxybutyric acid or L (+> 3-hydroxybutyric acid has a specific rotation [] d of +24.3 at a concentration of 2.226 g per 100 ml water.
In the following, it is exclusively the 3-hydroxybutyric acid which rotates negatively in the sodium D line, which for the sake of simplicity will be referred to with the abbreviation HB.
Various processes for the preparation of the racemic DL-3-hydroxybutyric acid; see, inter alia, German Offenlegungsschrift 441 003 and Wislicenus, Ann. 149 (1869), 207. McKenzie and Harden also succeeded in producing the optically active pure L (+> 3-hydroxybueric acid from DL-3 hydroxybutyric acid using Aspergillus niger [J. Chem.
Soc. 83 (1903), 430}.
D (-> 3-hydroxybutyric acid) occurs exclusively in humans, animals and plants, namely as an indispensable substance in the fat balance [Edström et al., Acta Obstet. Gynecol.
Scand. 54: 347 (1975); Moore et al., Am. J. Physiol. (1976), 619]. It is precisely because of this natural occurrence and this physiological function that the compound is of great importance in parenteral nutrition and as a starting material for the production of chemical compounds which are well tolerated by the human organism.
It is all the more astonishing that - in contrast to the conditions described with regard to the racemic and the right-handed, non-natural 3-hydroxybutyric acid - there is still no process which can produce D (-> 3-hydroxybutyric acid) on an industrial scale In particular, no microorganisms which secrete the desired carboxylic acid were previously known.
It has now surprisingly been found that among the microorganisms belonging to the class of Schizomycetes by Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit. R. S. Breed et al., 7th edition, The Williams and Wilkins
Company, Baltimore 1957), those can be obtained which, starting from extremely cheap carbon sources, excrete high concentrations of D (-> 3-hydroxybutyric acid and can always be improved with regard to this ability. The microorganisms can be obtained from any culture collection or from natural sources Material, such as soil, water, air, liquid manure, can be easily isolated by known methods, and microorganisms which are able to synthesize butyric acid or poly <D-3-hydroxybutyric acid), such as, for example, are particularly suitable. B.
Members of the Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae, and Enterobacteraceae families.
Known poly (D-3-hydroxybutyric acid) storing bacterial strains, such as. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 and a previously unknown, isolated from air methanol recycler, which as
Mycoplana rubra strain has been grown on fructose as the only carbon source submersed. After the carbon source has been removed, the microorganisms are placed in a medium which is the only carbon source and contains racemic 3-hydroxybutyric acid and the active or
contains growing antibiotic killing cells. The resting or non-growing, surviving cells, which do not form the enzyme 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (= EC 1.1.1.30) and consequently cannot assimilate ss-HB, are isolated and tested for their ability to form ss-HB. For this purpose, the concentration of HB is quantitatively determined in aliquots of the culture liquid according to the enzymatic method of Williamson and Mellanby (Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim and Academic Press, Inc., New York 1974, page 1883).
The ss-HB-secreting bacterial strains obtained in this way are treated with known mutagenic agents in order to produce mutants, among which those are selected which produce even higher concentrations of frHB per volume unit of the culture liquid than their starting strain.
On the other hand, microorganisms which do not store poly4D-3-hydroxybutyric acid) but form butyric acid, such as the Clostridium species, e.g. B. the well-known Clostridium butyricum ATCC 19398, searched in an analogous manner those derivatives which do not form 3-hydroxybutyric acid hydrogenase and consequently can no longer assimilate HB. Such strains are grown on agar plates as scattered colonies. After successful growth, the agar surfaces are covered with a mixture of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, nicotine adenine dinucleotide in the oxidized form (NAD) and a redox indicator consisting of methylene blue or triphenyltetrazolium chloride, and colonies are found which cause discoloration of the redox indicator.
These were isolated and examined for their ability to produce ss-HB. Strains producing ss-HB are subjected to the mutation process mentioned in order to obtain offspring with increased productivity for ss-HB.
Bacterial strains which convert a maximum proportion of the carbon source present into D (-> 3-hydroxybutyric acid as quickly as possible) are thus obtained according to the invention by eliminating a butyric acid or D (-> 3-hydroxybutyric acid or a poly4D-3-hydroxybutyric acid) storing bacterial strain is subjected to the action of mutagenic agents, selects from the mutants that are created which D (-> 3-hydroxybutyric acid cannot assimilate) and in turn selects those which - if necessary after renewed mutation - when using the carbon sources mentioned below and breeding conditions produce more D (-> 3 hydroxybutyric acid than the mutant parent strain.
In this way, the particularly efficient sources are the mutants which secrete D (-> 3-hydroxybutyric acid) from Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, for example the mutant CBS 381 76; from Azotobacter chroococcum DSM 281, for example the mutant CBS 383 76; from Bacillus megatherium DSM 32, e.g.
the mutant CBS 382 76; from Zoogloea ramigera ATCC 19623, e.g. B. the mutant CBS 384 76; from Clostridium butyrium ATCC 19398, e.g. B. the mutant CBS 380 76; and also Mycoplana rubra, CBS 38576 and its corresponding mutants. Of course, the bacterial strains mentioned can be further improved in their productivity by using the method described above. The strains mentioned are deposited at American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland, USA), and German Collection for Microorganisms (DSM), Munich (FRG); the mutant strains listed with CBS were on 4.8. In 1976 it was deposited at Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (Netherlands).
Cross reference of the master numbers for ATCC / NCIB / DSM:
DSM ATCC NCIB Bacillus megatherium 32 14581 9376 Alcaligenes eutrophus 10442 23440 428 Zoogloea ramigera 10340 19623 287 Clostridium butyricum - 19398 552
The ss-HB-producing bacterial strains are subsequently used according to known methods to grow in high concentrations of specific carbon sources, namely glucose, sucrose, lactose, molasses, whey, methanol, ethanol and the waste liquor from the caprolactam synthesis, and to HB produce, using NH4 ions or urea as a nitrogen source and the usual trace elements are added.
In addition to organic carbon sources such as those mentioned above, the descendants of Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 can also assimilate carbon dioxide if the atmosphere contains both molecular hydrogen and oxygen to produce a-HB.
The carbon source content of the nutrient solution is advantageously about 2 to 25% glucose, sucrose, lactose, molasses or whey - calculated as pure carbohydrate, about 1 to 10% methanol or ethanol, or about 1 to 10% leachate of the caprolactam synthesis - calculated as the total carboxylic acids contained therein.
Although all the bacterial strains obtained produce p-HB on solid nutrient media, liquid media are preferred for production. For this purpose, aqueous nutrient solutions of the aforementioned concentration of carbon sources and with an assimilable nitrogen source and the necessary trace elements are prepared in a known manner. The sterile culture media are inoculated with 0.1-10% by volume of a preculture and at about 25-40 "C in a standing culture or in the absence of air - for the anaerobic microorganisms, eg the Clostridium species, or with stirring or shaking and optionally with the addition of air or a mixture of carbon dioxide, hydrogen and oxygen (or air) - for the aerobic microorganisms, incubated for 8 to 72 hours.
In order to obtain the highest possible yield of the desired carboxylic acid, the pH of the inoculated solution is kept at 6 to 8 by adding sterile alkali solution.
As the biomass grows, fresh carbon sources can be added continuously in order to maintain a constant concentration and to achieve maximum HB production.
The use according to the invention therefore consists in that a bacterial strain which produces D (-> 3-hydroxybutyric acid) is obtained in an aqueous nutrient medium, which as the carbon source is an assimilable carbohydrate from the group of glucose, sucrose, lactose, molasses and whey, an assimilable alcohol from the Group contains methanol and ethanol, or the waste liquor from the caprolactam synthesis, together with an assimilable nitrogen source and trace elements, is grown at a temperature of 25 to 40 ° C. and a pH of 6 to 8, and the optically active carboxylic acid formed is isolated from the culture broth by known methods .
After completion of the fermentation approach, d. H. when the maximum ss-HB concentration has been reached, the HB can, if appropriate after separating the biomass from the fermentation solution by means of ion exchangers, or after acidifying the fermentation solution to about pH 1.5 to 2.5 by means of water-immiscible solvents, such as, for. B. ether, chloroform or other chlorinated hydrocarbons, ethyl acetate or other esters, isopropanol, butanol and other alcohols. From the organic solvents, HB can be used as a salt with metallic cations, e.g. As lithium, potassium, sodium, calcium and barium or nickel, precipitated or converted into concentrated aqueous solutions.
The following examples are intended to further illustrate the invention.
example 1
A nutrient solution is first prepared which contains 0.9% NaHPO '12 H2O, 0.15% KH2PO4, 0.1% NH4Cl, 0.04% MgSO- 7 H20, 0.0195% iron (II) -NH-citrate 6 H20, 0.00133% CaC12, as well as 1 ml of a trace element solution with 0.01% ZnSO4-7 H2O, 0.003% MnCk-4 zu4 H2O, 0.03% boric acid, 0.02% CoClz.6 zu6 H2Q per liter solution . 0.0001 CuCk- H2Q, '0.002 NiG .6 6 H2O, 0.003% Na2MoO4- 2 H20 contains.
In 250 ml Erlenmeyer bottles, 30 ml of the nutrient solution are used to grow shake or stand cultures at 30 C for 16 to 24 hours. 20 ml of sterile-filtered fructose solution containing 10 g of this carbohydrate are added to the solution sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. The inoculation is carried out using an eyelet from a 24-hour slant agar culture.
The shake culture is sedimented on a centrifuge and the biomass washed with water and taken up in about 4 ml of physiological saline. After about 1 hour, 4 ml of 0.6-n sodium acetate buffer of pH 4.6 and 4 ml of a 0.05-n sodium nitrite solution are added to generate the mutation and incubated for a few minutes. After washing, the biomass of each microorganism (see table below) is distributed into about 10 250 ml Erlenmeyer bottles, which are loaded with the above medium and contain 2% DL-3-hydroxybutyric acid instead of the fructose.
After the turbidity in the flask is visibly increasing, depending on the organism, 1 ml of a sterile-filtered solution of 2 mg / ml K-penicillin G or 1 ml of a sterile-filtered solution of 30 mg / ml bacitracin or 1 ml is used per flask added to a sterile-filtered solution of 2 mg / ml Colostin sulfate or 0.5 ml of two different antibiotic solutions. After various incubation periods, i.e. H. after 1 to 16 hours, the antibiotics are washed out or destroyed with penicillinase. The surviving microorganisms are washed with water and inoculated onto the fructose medium.
After 16 to 36 hours, dilution series are made from each flask and 0.1 ml of those dilutions containing about 50 to 1000 germs per ml are streaked on agar plates to obtain single scattered colonies. This agar contains 2% DL3-hydroxybutyric acid sodium salt and 0.008% fructose as a carbon source.
After about 48 hours, many very small, different-looking colonies of approximately 1 to 1 mm in diameter, as well as colonies of normal size, have formed. Of all small colony variants, inocula are now transferred using sterile wooden toothpicks, first to a specific place on an agar plate with DL-3-hydroxybutyric acid sodium salt as the only carbon source and secondly immediately to the corresponding place on an agar plate with fructose as the only carbon source. About 10 to 30% of the colonies tested in this way are unable to grow on DL-3-hydroxybutyric acid. These are spread on the known fructose medium, to which 3% finely dispersed CaCO3 (dry sterilized) has been added, so that the plates look milky cloudy.
All colonies that can dissolve the lime can be assumed to produce an acid. Shake cultures of these are made in the fructose medium in order to test their ability to produce HB according to the enzymatic method of Williamson and Mellanby (see above).
The work with Clostridium butyricum is carried out under strict anaerobia conditions according to Schocher [An amount to know the growth and fermentation physiology of saccharolytic clostridia, dissertation, laboratory for microbiology, Delft University of Applied Sciences (Netherlands), 1959]. The following table illustrates the success of the technology used.
Generation of p-HB-producing microbial strains
About 100,000-1,000,000 strains per species were examined for their ability to form acids.
Bacterial strain Antibiotic- number of acid- number of ss-HB-produzie- strains with maximum
Treatment of producing strains ss-HB production with the colonies up to and including the name of the I mg / L 10 mg / L 95 mg / L mg / L best strain Alcaligenes eutrophus ATCC23440 - approx. 10000 0 0 0 - and mutants thereof Colistin / approx. 10000 approx. 800 6 1 74 GA-3
Bacitracin (CBS 381 76) Bacillus megatherium DSM 32 - approx. 8000 0 0 0 - and mutants thereof penicillin approx. 000 approx. 600 15 2 95 GB-1 (CBS38276) Azotobacter chroococ cum DSM 281 - approx. 7000 0 0 0 - and mutants thereof bacitracin approx. 000 approx.
700 7 3 86 GC-7 (CBS 383 76) Zoogloea ramigera ATCC 19623 - approx. 11 000 0 0 0 - and mutants thereof colistin approx. 12000 approx. 500 17 1 51 GZ-1 (CBS 384 76) bacterial strain antibiotic number acid number of ss HB produzie strains with maximum
Treatment of producing strains (1-1 B production with the colonies up to the name of the I mg / L 10 mg / L 95 mg / L mg / L best strain
Clostridium butyricumATCC19398 - approx. 16000 0 0 0 - and mutants thereof bacitracin / approx.
16000 approx. 100 3 1 76 GC1-2
Penicillin (CBS 380 76)
Mycoplana rubra
CBS 38576 approx. 5000 0 0 0 - and mutants thereof bacitracin approx. 000 approx. 300 21 4 67 GM-1 (CBD 385 76)
Example 2 The ss-HB producers GA-3, GB-1, GC-7, GZ-1, GCl-1, GC-2 and GM-1 are subjected to the mutation generation process described in Example 1 and spread out analogously on agar plates. After growth has ended, the colonies are brought onto fresh agar plates by means of velvet stamps, which contain such quantities of sterile bromocresol green or bromocresol purple as a pH indicator that the agar is colored blue or purple.
After short incubation times, i.e. H. after 5 to 6 hours, discoloration of the pH indicator can already be detected, which helps to locate colonies that grow quickly and generate a lot of acid. Such are selected and grown submerged to assess their ss-HB productivity. By far most of the descendants of the p-HB producers used produce less or some of the B-HB. But now and then, among thousands of mutually obtained descendants, one or a few are perceived that produce more ss-HB than the parent strain.
These are subjected to a renewed mutation / selection cycle in order to again detect the strains which can produce even higher concentrations of frHB.
The biomass is centrifuged off from the fermentation solutions obtained and the pH is adjusted to about 1.5 to 2.5 before or after centrifuging with dilute acid. The
The solution is extracted several times with ethyl ether, the solvent washed with acid and evaporated in vacuo at about 30 ° C. Petroleum ether or cyclohexane is added to the concentrated extract, which precipitates ss-HB and can be filtered off. The extraction can also be carried out with chloroform.
In this way, the mutant GA-113 was derived from the GA-3 strain, which within 13 hours 1375 mg ss-HB / liter; from strain GZ-1 the mutant GZ-317, which 1980 mg p-HB / liter; from the GC1-2 strain the mutant GCI-138, which
1670 mg ss-HB / liter, and the mutant GM-97, which produced 1475 mg ss-HB / liter, was derived from strain GM-1.
The p-HB yields can be increased even further by further mutations / selections.
Example 3
500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the nutrient solution from Example 1, but instead of fructose 6% neutralized, sterile waste liquor from the caprolactam synthesis (which contains a mixture of mono- and dicarboxylic acids) is used and the amount of NH4Cl is reduced by 50% is inoculated with a culture of Azotobacter chroococcum DSM 281, derivative GC-183 CAL, and shaken eccentrically in the presence of air at 30 to 32 "C.
Analogously to Example 2, p-HB is extracted with ethyl acetate and from the native extract by adding concentrated
Solutions of NaOH, Ca (OH) 2 or KOH precipitated out and through
Filter off as Na, Ca or K salt. Instead of the ethyl acetate, n-butanol or isopropanol can also be used. After 46 hours the fermentation solution contains about 1600 mg ss-HB per liter.
Example 4
Analogously to Example 3, the derivative GC-157 MEL from Azotobacter chroococcum DSM 281 is used, but instead of leaching the caprolactam synthesis
12% by weight beet sugar molasses can be used. After 36
Hours, the fermentation solution reaches an ss-HB concentration of
1780 mg / L.
Example 5
In analogy to Example 3, the GB-257 CAL strain, which is a derivative of Bacillus megatherium
DSM 32 is, procedure, and within 36 hours 2100 mg ss-HB /
Get liters.
Example 6
The procedure of Example 4 is repeated with the GB-312 MEL strain, another derivative of Bacillus megatherium DSM 32, and 2670 mg of ss-HB per liter are obtained in 48 hours.
Example 7
Analogously to example 3, GZ-253 Cal, a mutant of Zoogloea ramigera ATCC 19623, produces 1400 mg ss-HB per liter.
Example 8
Analogously to Example 4, GZ-301 synthesizes MEL, another mutant of Zoogloea ramigera ATCC 19623.2030 mg ss-HB / liter.
Example 9
Under anaerobic conditions, the mutant GCI-112 from Clostridium butyrium ATCC 19398 is grown in a medium of 4% sucrose, 0.3% NH4 acetate, 0.178% Na2HPO4 2H2O, 0.136% KH2PO4, 0.042% Mg SO4.7 at7 HzO, 0, 00025% FeSO-7 H2O, 0.00013% MnClz. 4 H2O, and 1, ug (+> biotin per 1000 ml for 48 hours, after which the fermentation medium has a concentration of 1710 mg ss-HB / liter.
Example 10
In order to find microorganisms utilizing methanol, a 500 ml beaker with approximately 100 ml of the nutrient solution from Example 1, which, however, contains 1% methyl alcohol as the only carbon source, is placed open in the laboratory.
After a few days, the solution is cloudy and, after appropriate dilutions with water on agar plates with the medium of Example 1, single scattering colonies can be produced therefrom. With selected colonies, shake cultures are grown in the methyl alcohol medium mentioned, which according to Law & Slepecky [J. Bact. 82 (1961), 33] for the production of polybetahydroxybutyric acid. In this way, a rod-shaped microorganism is obtained which forms up to 50% by weight of its cell mass of polybetahydroxybutyric acid and has been recognized as a Mycoplana rubra strain.
Example 11
The progeny GM-37 of the rod-shaped microorganism Mycoplana rubra (CBS 385 76), which is newly isolated from air and uses methanol, is carried out analogously to Example 3, but the waste liquor from the caprolactam synthesis is replaced by 2.5% methyl alcohol. After 48 hours of incubation at 31 "C, the fermentation solution contains 536 mg 2-HB / liter.
Example 12
With GA-97 CAL, an Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 derived mutant, the procedure is analogous to Example 3, and 1050 mg ss-HB / liter is obtained.
Example 13
The GA-113 strain, which was obtained from Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, is used under conditions and in the medium according to Volker Öding (Society for Radiation Research, Report M 109, Göttingen 1972) in a purely mineral nutrient solution and in the presence of one of hydrogen, carbon dioxide and Oxygen existing atmosphere grown at 30 "C for 48 hours.
The excess of the fermentation solution is treated with an anion exchanger in the OH form. The sodium salt of 2-HB is obtained by eluting the exchanger with dilute sodium hydroxide solution. Yield: 1250 mg ss-HB / liter.