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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Estern der D(-)-3-Hydroxybuttersäure, dadurch gekennzeichnet, dass man einen D(-)-3-Hydroxybuttersäure produzierenden Bakterienstamm in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40"C und einem pH-Wert von 6 bis 8 züchtet, die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe isoliert und mit einem gegebenenfalls substituierten niederen Alkanol verestert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterienstamm die D(-)-3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381.76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383.76; von Bacillus megatherium ATCC 32, z. B. die Mutante CBS 382.76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384.76; von Clostridium butyricum ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380.76; und ferner Mycoplana rubra CBS 385.76 und seine entsprechenden Mutanten verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle 2 bis 25 % Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse oder Molke berechnet als reines Kohlehydrat, 1 bis 10% Methanol oder Äthanol, oder 1 bis 10% Ablauge der Caprolactamsynthese berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren, beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt wird, je nachdem, ob es sich bei dem verwendeten Bakterienstamm um einen Aerobier oder Anaerobier, z. B. die Gattung Clostridium, handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Veresterung einen Alkanol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung durch Behandlung der D(-)3-Hydroxybuttersäure in einem Überschuss des Alkanols in Gegenwart einer starken Minaralsäure durchgeführt wird.
7. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten Ester als Riechstoffe und Aromastoffe in dem Lebensmittelgebiet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Estern der D(-)-3-Hydroxy- buttersäure und die Verwendung derselben.
Da in der Literatur sich widersprechende Angaben über die Bezeichnung optisch aktiver 3-Hydroxybuttersäuren vorliegen, gelten für die vorliegende Erfindung die nachfolgenden Definitionen.
Die in der Natur vorkommende bzw. physiologische 3 -Hydroxybuttersäure oder D(-)-3-Hydroxybuttersäure (oder auch D(-)-beta-Hydroxybuttersäure) hat bei einer Konzentration von 5 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung [a]25 von -24,5o, während die in der Natur nicht vorkommende 3-Hydroxybuttersäure oder L( + )-3-Hydroxybuttersäure bei einer Konzentration von 2,226 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung [a]' von +24,30 aufweist.
Im folgenden handelt es sich ausschliesslich um die bei der Natrium D-Linie negativ drehende 3-Hydroxybuttersäure, welche der Einfachheit halber hinfort mit der Abkürzung ss-HB bezeichnet wird.
Bekanntlich bestehen in Früchten und Pflanzen vorkommende Riech- und Aromastoffe zum Teil aus niederen Alkylestern der D(-)-3-Hydroxybuttersäure. Ihre synthetische Herstellung jedoch ist bisher an der Unmöglichkeit gescheitert, die D(-)-3-Hydroxybuttersäure in reinem Zustand nach einem technisch durchführbaren und wirtschaftlich tragbaren Verfahren herzustellen. Insbesondere waren bisher keine Mikroorganismen bekannt, welche die gewünschte Carbonsäure ausscheiden.
Es wurde nun ein mikrobiologisches Verfahren gefunden, durch welches reine D(-)-3-Hydroxybuttersäure aus äusserst billigen Kohlenstoffquellen in hoher Ausbeute hergestellt werden kann, und dadurch auch die Möglichkeit der Synthese besagter optisch aktiver Ester geschaffen.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man einen D(-)-3-Hydroxybuttersäure produzierenden Bakterienstamm in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, z. B. Melasse und Molke, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 C und einem pH Wert von 6 bis 8 züchtet, die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe isoliert und mit einem gegebenenfalls substituierten niederen Alkanol verestert.
Im folgenden wird die Erfindung ausführlich beschrieben.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass unter den Mikroorganismen, welche zur Klasse der Schizomycetes von Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit.
R. R. Breed et al., 7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1957) gehören, können solche gewonnen werden, welche ausgehend von äusserst billigen Kohlenstoffquellen hohe Konzentrationen von D(-)-3-Hydroxybuttersäure ausscheiden und sich bezüglich dieser Fähigkeit stets verbessern lassen. Die Mikroorganismen können von irgendeiner Kulturensammlung bezogen, oder aber aus natürlichem Material, wie Boden, Wasser, Luft, Jauche, nach bekannten Methoden leicht isoliert werden. Besonders geeignet sind Mikroorganismen, welche imstande sind, selbst Buttersäure oder Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) zu synthetisieren, wie z. B.
Angehörige der Familien Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae und Enterobacteraceae.
Bekannte Poly-(D-3-Hydroxybuttersäure) aufspeichernde Bakterienstämme, wie z. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium ATCC 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 und ein bisher unbekannter, aus Luft isolierter Methanolverwerter, welcher als Stamm von Mycoplana rubra CBS 385.76 erkannt wurde, werden auf Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle submers angezüchtet. Nach Entfernung der Kohlenstoffquelle werden die Mikroorganismen in ein Medium gebracht, welches als einzige Kohlenstoffquelle racemische 3 -Hydroxybuttersäure, sowie ein die aktiven bzw. wachsenden Zellen abtötendes Antibiotikum enthält.
Die ruhenden bzw. nicht wachsenden, überlebenden Zellen, die das Enzym 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase (= EC 1.1.1.30) nicht bilden und folglich (3-HB nicht assimilieren können, werden isoliert und auf ihre Fähigkeit zur Bildung von p-HB geprüft. Zu diesem Zwecke wird in aliquoten Teilen der Kulturflüssigkeit gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie G.m.b.H., Weinheim und Academic Press, Inc., New York 1974, Seite 1883) die Konzentration an ss-HB quantitativ bestimmt. Die so gewonnenen ss-HB-ausscheidenden Bakterienstämme werden mit bekannten mutagenen Agenzien behandelt, um Mutanten zu erzeugen, unter welchen diejenigen ausgesucht werden, welche pro Volu
meneinheit der Kulturflüssigkeit noch höhere Konzentrationen an f3-HB als ihr Ausgangsstamm erzeugen.
Andererseits werden von Mikroorganismen, welche keine
Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichern, sondern Butter säure bilden, wie die Clostridiumarten, z. B. von Clostridium butyricum ATCC 19398, in analoger Weise jene Abkömmlinge gesucht, welche keine 3-Hydroxybuttersäurehydrogenase bilden und folglich ss-HB nicht assimilieren können. Solche Stämme werden auf Agarplatten als Streukolonien angezüchtet. Nach erfolgtem Wachstum werden die Agaroberflächen mit einem
Gemisch von 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase, Nicotin adenin-dinucleotid in der oxydierten Form (NAD) und einem aus Methylenblau oder Triphenyltetrazoliumchlorid bestehen den Redoxindikator überschichtet und nach Kolonien gesucht, welche eine Verfärbung des Rdoxindikators bewirken.
Solche wurden isoliert und auf die Fähigkeit ss-HB zu produzieren untersucht. ss-HB-erzeugende Stämme werden dem erwähnten
Mutationsverfahren unterworfen, um Abkömmlinge mit gestei gerter Produktivität für (3-HB zu erhalten.
Bakterienstämme, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(-)
3-Hydroxybuttersäure umsetzen, werden also im Prinzip da durch gewonnen, dass man einen Buttersäure oder D(-)
3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder einen Poly-(D
3-Hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der
Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(-)-3 Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Verwendung der nachstehend erwähnten Kohlenstoffquellen und Züchtungsbedingungen mehr D(-)-3-Hydroxybuttersäure als der der Mutation unter worfene Ausgangsstamm produzieren.
Auf diese Weise sind als besonders ergiebige Quellen die D(-)-3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381.76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383.76; von Bacillus megatherium ATCC 32, z. B. die Mutante CBS 382.76; von Zoogloea ramigera ATCC
19623, z. B. die Mutante CBS 384.76; von Clostridium butyricum ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380.76; und ferner Mycoplana rubra CBS 385.76 und seine entsprechenden Mutanten gewonnen worden. Selbstverständlich lassen sich die erwähnten Bakterienstämme durch Anwendung der oben beschriebenen Methode in ihrer Produktivität weiterhin verbessern.
Die genannten Stämme sind deponiert bei American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland, USA), und Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), München (BRD), die mit CBS angeführten Mutantenstämme sind am 4. 8. 1976 bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (Niederlande) deponiert worden.
Die ss-HB-erzeugenden Bakterienstämme werden in der Folge nach bekannten Methoden daran gewöhnt, in hohen Konzentrationen von spezifischen Kohlenstoffquellen, nämlich Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse, Molke, Methanol, Äthanol und der Ablauge von der Caprolactamsynthese, zu wachsen und ss-HB zu produzieren, wobei NH4-Ionen oder Harnstoff als Stickstoffquelle dienen und die üblichen Spurenelemente beigegeben werden. Die Abkömmlinge von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 könne nebst organischen Kohlenstoffquellen wie die oben erwähnten auch Kohlendioxyd assimilieren, wenn die Atmosphäre gleichzeitig molekularen Wasserstoff und Sauerstoff enthält, um ss-HB zu produzieren.
Der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle beträgt mit Vorteil ca. 2 bis 25% Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse oder Molke - berechnet als reines Kohlehydrat, ca.
1 bis 10% Methanol oder Äthanol, oder ca. 1 bis 10%Ablauge der Caprolactamsynthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren.
Obwohl all die erhaltenen Bakterienstämme ss-HB auf festen
Nährmedien produzieren, sind flüssige Medien für die Pro duktion vorzuziehen. Dafür werden in bekannter Weise wässe rige Nährlösungen von der erwähnten Konzentration an Koh lenstoffquelle und mit einer assimilierbaren Stickstoffquelle sowie den notwendigen Spurenelementen bereitet. Die sterilen
Nährmedien werden mit 0,1-10 Volumen-% einer Vorkultur beimpft und bei ca. 25-400C in stehender Kultur oder unter Luftausschluss - für die anaeroben Mikroorganismen, z. B.
die Clostridiumarten, bzw. unter Rühren oder Schütteln und gegebenenfalls unter Zufuhr von Luft oder einem Gemisch von
Kohlendioxyd, Wasserstoff und Sauerstoff (oder Luft) - für die aeroben Mikroorganismen, während 8 bis 72 Stunden inku biert. Um eine möglichst hohe Ausbeute an der gewünschten Carbonsäure zu erhalten, wird der pH-Wert der beimpften Lösung durch Zugabe steriler Alkalilösung bei 6-8 gehalten.
Während des Wachstums der Biomasse kann laufend frische Kohlenstoffquelle beigefügt werden, um davon eine konstante Konzentration aufrecht zu erhalten und eine maximale Produk tion von t3-HB zu erreichen.
Nach Abschluss des Fermentationsansatzes, d. h. wenn die maximale ss-HB-Konzentration erreicht ist, kann die ss-HB gegebenenfalls nach Abtrennung der Biomasse aus der Gärlösung mittels Ionenaustauschern, oder nach Ansäuerung der Gärlösung auf ca. pH 1,5-2,5 mittels mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Äther, Chloroform oder anderen chlorierten Kohlenwasserstoffen, Äthylacetat oder anderen Estern, Isopropanol, Butanol und anderen Alkoholen, extrahiert werden. Aus den organischen Lösungsmitteln kann $-HB als Salz mit metallischen Kationen, wie z. B. Lithium, Kalium, Natrium, Calcium und Barium oder Nickel, gefällt, in dieser Form getrocknet und daraus in reinem Zustand erhalten werden.
Die auf diese Weise hergestellte D(-)-3-Hydroxybuttersäure wird dann mit einem gegebenenfalls substituierten niederen Alkanol nach an sich bekannten Methoden verestert. Beispielsweise kann die Veresterung durch Behandlung der Carbonsäure in einem Überschuss des Alkanols in Gegenwart einer starken Mineralsäure, z. B. Schwefelsäure, durchgeführt werden. Als Alkanole werden insbesondere solche mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen verwendet.
Die erhaltenen Ester weisen die gleiche Konfiguration wie die in Früchten und Pflanzen vorkommenden, entsprechenden Riech- und Aromastoffe auf. Gegenüber den bisher mit der racemischen DL-3-Hydroxybuttersäure hergestellten Fruchtaromastoffen haben die Ester der D(-)-3-Hydroxybuttersäure den Vorteil ihrer natürlichen Konfiguration, welche mit toxikologischer Unbedenklichkeit und - auf Gewichtsbasis bedeutender Steigerung der olfaktischen und organoleptischen Eingenschaften einhergeht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
Es wird zuerst eine Nährlösung bereitet, welche 0,9% Na2HPO4 - 12 H2O, 0,15% KH2PO4, 0,1% NH4Cl, 0,04% MgSO4 7 H2O, 0,0195% Eisen(II)-NH4-citrat 6 H20, 0,00133 % Ca12, sowie pro Liter Lösung 1 ml einer Spuren elementlösung mit 0,01% ZnS04 7 H20,0,003 % MnCl2 4 H2O, 0,03% Borsäure, 0,02% CoCl2 6 H2O, 0,001% CuCk 2 H2O, 0,002% NiCh 6 H20,0,003 NazMoO 2 H20 enthält.
In 250 ml Erlenmeyerflaschen werden mit je 30 ml der Nährlösung Schüttel- bzw. Standkulturen bei 30"C während 1624 Stunden angezüchtet. Der bei 121 0C während 20 Minuten sterilisierten Lösung werden pro 980 ml 20 ml steril filtrierte Fruktoselösung, enthaltend 10 g dieses Kohlehydrats, beigegeben. Die Beimpfung erfolgt mittels einer Oese ab 24-stündiger Schrägagarkultur.
Die Schüttelkultur wird auf einer Zentrifuge sedimentiert und die Biomasse mit Wasser gewaschen und in ca. 4 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Nach ca. 1 Stunde werden 4 ml 0,6-n Natriumacetat-Puffer von pH 4,6 und 4 ml einer 0,05-n Natriumnitritlösung zur Mutationserzeugung beigegeben und für wenige Minuten inkubiert. Nach Waschen wird die Biomasse eines jeden Mikroorganismus (siehe nachstehende Tabelle) auf ca. 10 Erlenmeyerflaschen zu 250 ml verteilt, welche mit obigem Medium beschickt sind und statt der Fruktose 2% DL-3-Hydroxybuttersäure enthalten.
Nachdem die Trübung in den Kolben sichtlich zunehmend ist, wird je nach Organismus pro Kolben je 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mg/ml K-Penicillin G, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 30 mg/ml Bacitracin, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mg/ml Colistin-Sulfat beigegeben oder je 0,5 ml von zwei verschiedenen Antibiotikalösungen zugefügt. Nach verschiedener Inkubationsdauer, d. h. nach 1-16 Stunden, werden die Antibiotika ausgewaschen oder mit Penicillinase zerstört. Die überlebenden Mikroorganismen werden mit Wasser gewaschen und auf das Fruktosemedium verimpft. Nach 1636 Stunden werden von jedem Kolben Verdünnungsreihen hergestellt und von jenen Verdünnungen, welche pro ml ca. 50-1000 Keime enthalten, werden 0,1 ml auf Agarplatten ausgestrichen, um einzelstehende Streukolonien zu erhalten.
Dieser Agar enthält als Kohlenstoffquelle 2% DL-3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz, sowie 0,008% Fruktose. Nach ca. 48 Stunden haben sich viele sehr kleine, unterschiedlich aussehende Kolonien von ca.
1/4-1 mm Durchmesser, sowie Kolonien von normaler Grösse gebildet. Von allen kleinen Kolonienvarianten werden nun mittels sterilen Zahnstochern aus Holz Inokula übertragen, erstens auf einen bestimmten Platz einer Agarplatte mit DL-3 Hydroxybuttersäure-Natriumsalz als einziger Kohlenstoffquelle und zweitens sofort danach auf den entsprechenden Platz einer Agarplatte mit Fructose als einziger Kohlenstoffquelle. Etwa 10 bis 30% der so geprüften Kolonien vermögen auf DL-3 Hydroxybuttersäure nicht zu wachsen. Diese werden auf das bekannte Fruktosemedium ausgebreitet, welchem 3 % fein disperses CaCOs (trocken sterilisiert) beigemengt worden sind, so dass die Platten milchig trüb aussehen.
Von allen Kolonien, welche den Kalk zu lösen vermögen, kann angenommen werden, dass sie eine Säure produzieren. Von diesen werden Schüttelkulturen im Fruktosemedium gemacht, um deren Fähigkeit zur Produktion von ,8-HB gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (siehe oben) zu prüfen.
Bei den Arbeiten mit Clostridium butyricum wird unter strikten Anaerobie-Verhältnissen gemäss Schocher [ Ein Beitrag zur Kenntnis der Wachstums- und Gärungsphysiologie der saccharolytischen Clostridien , Dissertation, Laboratorium voor Microbiologie, Technische Hochschule Delft (Nieder lande), 1959] gearbeitet. Die folgende Tabelle illustriert den Erfolg der angewendeten Technik.
Erzeugung von ss-HB-produzierenden Mikrobenstämmen
Pro Art wurden ca. 100 000-1 000 000 Stämme auf Säurebildungsfähigkeit untersucht Bakterienstamm Antibiotika- Anzahl säure- Anzahl ,5-HB-produzierender Stämme Stämme mit maximaler behandlung mit produzierender p-HB-Produktion
Kolonien bis bis bis in Bezeicnung des lmg/L lOmgiL 95 mg/L mglL besten Stammes Alcaligenes eutrophus ATCC 23 440 - ca. 10000 0 0 0 - - und Mutanten davon Colistin/ ca 10000 ca. 800 6 1 74 GA-3
Bacitracin (CBS 381.76) Bacillus megatherium ATCC 32 ca.
8000 0 0 0 - - und Mutanten davon Penicillin ca. 9 000 ca. 600 15 2 95 GB-1 (CBS 382.76) Azotobacter chroococ cum DSM 281 ca. 7000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 6 000 ca. 700 7 3 86 GC-7 (CBS 383.76) Zoogloea ramigera ATCC 19 623 ca. 11 000 0 0 0 - und Mutanten davon Colistin ca. 12000 ca. 500 17 1 51 GZ-1 (CBS 384.76) Clostridium butyricum ATCC 19 398 ca. 16000 0 0 0 - - und Mutanten davon Bacitracin/ ca. 16 000 ca. 1100 3 1 76 GC1-2
Penicillin (CBS 380.76) Mycoplana rubra CBS 385.76 - ca. 5000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 7 000 ca.
300 21 4 67 GM-1 (CBS 385.76)
Beispiel 2
Die ss-HB-Produzenten GA-3, GB-1, GC-7, GZ-1, GCl-2 und GM-1 werden dem im Beispiel 1 beschriebenen Mutationserzeugungsverfahren unterworfen und analog auf Agarplatten ausgestrichen. Nach beendetem Wachstum werden die Kolonien mittels Samtstempeln auf frische Agarplatten gebracht, welche solche Mengen von sterilem Bromkresolgrün oder Bromkresolpurpur als pH-Indikator enthalten, dass der Agar blau, bzw. purpur angefärbt ist, Nach kurzen Inkubationszeiten, d. h. schon nach 5-6 Stunden, können z. T. schon Verfärbungen des pH-Indikators festgestellt werden, wodurch Kolonien lokalisiert werden, welche schnell wachsen und viel Säure bilden. Solche werden ausgewählt und submers gezüchtet, um ihre ss-HB-Produktivität zu erfassen.
Weitaus die meisten Abkömmlinge der eingesetzten ss-HB-Produzenten produzieren weniger oder z. T. gar keine ss-HB. Doch werden unter Tausenden von mutativ erhaltenen Abkömmlingen ab und zu einer oder wenige wahrgenommen, welche mehr t3-HB produzieren als der Ausgangsstamm. Solche werden einem erneuten Mutations-/Selektionszyklus unterworfen, um erneut die Stämme zu erfassen, welche noch höhere Konzentrationen von ss-HB produzieren können.
Aus den erhaltenen Gärlösungen wird die Biomasse abzentrifugiert und der pH-Wert vor oder nach dem Zentrifugieren mit verdünnter Säure auf ca. 1,5 bis 2,5 eingestellt. Die Lösung wird mit Äthyläther mehrmals extrahiert, das Lösungsmittel mit Säure gewaschen und im Vakuum bei ca. 30"C abgedampft.
Dem konzentrierten Extrakt wird Petroläther oder Cyclohexan beigemischt, wodurch ss-HB ausfällt und abfiltriert werden kann. Die Extraktion kann auch mit Chloroform durchgeführt werden.
Auf diese Weise wurde vom Stamm GA-3 die Mutante GA-113 abgeleitet, welche innert 48 Stunden 1375 mg ss-HB/Liter; vom Stamm GZ-1 die Mutante GZ-317, welche 1980 mg ss-HB/Liter; vom Stamm GCl-2 die Mutante GCl-138, welche 1670 mg P-HB/Liter, sowie von Stamm GM-1 die Mutante GM-97, welche 1475 mg ss-HB/Liter produzierte, abgeleitet.
1 g der erhaltenen D(-)-3-Hydroxybuttersäure wird in 100 ml Äthanol gelöst und der Lösung wird ca. 1 ml konz.
H2SO4 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 3 Stun den mit Magnetrührer bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 1 Volumen Wasser verdünnt und mit soviel Diäthyl äther versetzt, dass ein zweiphasiges Gemisch entsteht. Die organische Phase wird mit Wasser gründlich gewaschen und danach der Äther in Vakuum abdestilliert. Der Rückstand enthält den himbeerartig duftenden D(-)-3-Hydroxybuttersäure äthylester; Sdp. 184-1850C/755 mm, [aj25 = -10,5 (optisch nicht ganz rein). Auf Gewichtsbasis weist der Ester bedeutend stärkere Aromaeigenschaften auf als der käuflich erhältliche Äthylester der DL-3 -Hydroxybuttersäure.
Beispiel 3
500 ml Erlenmeyerkolben, welche 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1 enthalten, wobei jedoch an Stelle von Fruktose 6% neutralisierte, sterile Ablauge der Caprolactamsynthese (welche ein Gemisch von Mono- und Dicarbonsäuren enthält) verwendet wird und die NH4Cl-Menge um 50% herabgesetzt ist, werden mit einer Kultur des Azobacter chroococcum DSM 281, Abkömmling GC-183 CAL, beimpft und in Gegenwart von Luft bei 30-32 C exzentrisch geschüttelt.
Analog zu Beispiel 2 wird ss-HB mit Äthylacetat extrahiert und aus dem nativen Extrakt durch Beigabe von konzentrierten Lösungen von NaOH, Ca(OH)2 bzw. KOH ausgefällt und durch Abfiltrieren als Na-, Ca- bzw. K-Salz gewonnen. An Stelle des Äthylacetats kann auch n-Butanol oder Isopropanol verwendet werden. Nach 46 Stunden enthält die Gärlösung ca.
1600 mg ss-HB pro Liter.
Der Extrakt der Gärlösung wird mit dem gleichen Volumen Äthanol und ca. 25 g Na2SO4 und 3 ml konz. H2SO4 versetzt und während 5 Stunden gerührt. Danach wird das Reaktions gemisch mit viel Wasser gewaschen und die zurückgebliebene organische Phase im Vakuum eingeengt. Man erhält denselben Äthylester mit den gleichen Eigenschaften, wie in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Beispiel 4
Analog zum Beispiel 3 wird mit dem Abkömmling GC-157 MEL von Azotobacter chroococcum DSM 281 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Ablauge der Caprolactamsynthese
12 Gew.- % Rübenzuckermelasse verwendet werden. Nach 36 Stunden erreicht die Gärlösung eine ss-HB-Konzentration von
1780 mg/L.
Es wird analog zu Beispiel 2 verfahren, jedoch wird anstelle von Äthanol Methylalkohol eingesetzt. Aus dem Eindampfrückstand erhält man den D(-)-3-Hydroxybuttersäuremethylester, welcher nach Fruchtaromen duftet, Sdp.
67-68,5 C, [ot]n25 = -20,90 (ohne Lösungsmittel).
Beispiel 5
Unter anaeroben Bedingungen wird die Mutante GCl-1 12 von Clostridium butyricum ATCC 19398 in einem Medium von 4% Saccharose, 0,3 % NH4-Acetat, 0,178%NaHPO 2 H2O, 0,136% KH2PO4, 0,042% Mg S04 7 H20, 0,00025% FeSO4 7 H2O, 0,00013% MnQ2 4 4 H20, sowie 1 ug (+)- Biotin pro 1000 ml während 48 Stunden inkubiert, wonach das Gärmedium eine Konzentration von 1710 mg ss-HB/Liter aufweist.
Es wird analog zu Beispiel 2 verfahren, jedoch mit dem Unterschied, dass anstelle des Äthylalkohols Propylalkohol eingesetzt wird. Das Ergebnis ist analog zu Beispiel 4.
Beispiel 6
Um Methanol verwertende Mikroorganismen zu finden, wird ein 500 ml Becherglas mit ca. 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1, welche jedoch als einzige Kohlenstoffquelle 1% Methylalkohol enthält, im Laboratorium offen aufgestellt. Nach einigen Tagen ist die Lösung trüb und es können daraus nach entsprechenden Verdünnungen mit Wasser auf Agarplatten mit dem Medium von Beispiel 1 einzelstehende Streukolonien erzeugt werden. Mit ausgewählten Kolonien werden im erwähnten Methylalkoholmedium Schüttelkulturen gezüchtet, welche gemäss Law & Slepecky [J. Bact., 82, (1961), 33] auf die Produktion von Polybetahydroxybuttersäure untersucht werden.
Auf diese Weise wird ein stäbchenförmiger Mikroorganismus erhalten, welcher bis zu 50 Gew.-% seiner Zellmasse Polybetahydroxybuttersäure bildet und als Mycoplana rubra-Stamm (CBS 385.76) versehen identifiziert wurde.
Mit dem Abkömmling GM-37 dieses Mikroorganismus wird analog zu Beispiel 3 verfahren, jedoch die Ablauge der Caprolactamsynthese durch 2,5 % Methylalkohol ersetzt. Nach 48-stündiger Inkubationszeit bei 310 C enthält die Gärlösung 536 mg 2-HB/Liter.
Es wird analog zu Beispiel 2 verfahren, jedoch mit dem Unterschied, dass anstelle des Äthylalkohols Butylalkohol eingesetzt wird. Das Resultat ist analog zu Beispiel 4.
Beispiel 7
Mit dem Stamm GA-113, der von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 gewonnen wurde, wird unter Bedingungen und im Medium gemäss Volker Oeding (Gesellschaft für Strahlenforschung, Bericht M 109, Göttingen 1972) in rein mineralischer Nährlösung und in Gegenwart einer aus Wasserstoff, Kohlendioxyd und Sauerstoff bestehenden Atmosphäre bei 30"C während 48 Stunden angezüchtet.
Das Überstehende der Gärlösung wird mit einem Anionen austauscher in der OH--Form behandelt. Durch Eluierung des Austauschers mit verdünnter Natronlauge wird das Natriumsalz der 2-HB erhalten. Ausbeute: 1250 n mg ss-HB/Liter.
Es wird analog zu Beispiel 2 verfahren, jedoch mit dem Unterschied, dass anstelle des Äthylalkohols Amylalkohol eingesetzt wird. Das Resultat ist analog zu Beispiel 4.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of optically active esters of D (-) - 3-hydroxybutyric acid, characterized in that a bacterial strain producing D (-) - 3-hydroxybutyric acid in an aqueous nutrient medium, which as the carbon source is an assimilable carbohydrate from the group glucose , Sucrose and lactose, an assimilable alcohol from the group consisting of methanol and ethanol, or the waste liquor from the caprolactam synthesis together with an assimilable nitrogen source and trace elements, at a temperature of 25 to 40 ° C. and a pH of 6 to 8, the grown optically active carboxylic acid isolated from the culture broth and esterified with an optionally substituted lower alkanol.
2. The method according to claim 1, characterized in that the D (-) - 3-hydroxybutyric acid secreting mutants of Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. the mutant CBS 381.76; from Azotobacter chroococcum DSM 281, e.g. B. the mutant CBS 383.76; from Bacillus megatherium ATCC 32, e.g. B. the mutant CBS 382.76; from Zoogloea ramigera ATCC 19623, e.g. B. the mutant CBS 384.76; from Clostridium butyricum ATCC 19398, e.g. B. the mutant CBS 380.76; and further used Mycoplana rubra CBS 385.76 and its corresponding mutants.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the content of the nutrient solution of carbon source 2 to 25% glucose, sucrose, lactose, molasses or whey calculated as pure carbohydrate, 1 to 10% methanol or ethanol, or 1 to 10% Waste liquor from the caprolactam synthesis, calculated as the total carboxylic acids contained therein, is.
4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cultivation is carried out under aerobic or anaerobic conditions, depending on whether the bacterial strain used is an aerobic or anaerobic, for. B. the genus Clostridium.
5. The method according to claim 1, characterized in that an alkanol having 1 to 5 carbon atoms is used for the esterification.
6. The method according to claim 1 or 5, characterized in that the esterification is carried out by treating the D (-) 3-hydroxybutyric acid in an excess of the alkanol in the presence of a strong mineral acid.
7. Use of the esters produced by the process according to claim 1 as fragrances and flavorings in the food area.
The present invention relates to a process for the preparation of optically active esters of D (-) - 3-hydroxybutyric acid and the use thereof.
Since there are contradicting information in the literature on the designation of optically active 3-hydroxybutyric acids, the following definitions apply to the present invention.
The naturally occurring or physiological 3-hydroxybutyric acid or D (-) - 3-hydroxybutyric acid (or also D (-) - beta-hydroxybutyric acid) has a specific rotation at a concentration of 5 g per 100 ml water [a] 25 of -24.5o, while the naturally occurring 3-hydroxybutyric acid or L (+) -3-hydroxybutyric acid has a specific rotation [a] 'of +24.30 at a concentration of 2.226 g per 100 ml of water.
In the following, it is exclusively the 3-hydroxybutyric acid which rotates negatively in the sodium D line, which for the sake of simplicity will be referred to as ss-HB.
It is known that fragrances and aromas found in fruits and plants partly consist of lower alkyl esters of D (-) - 3-hydroxybutyric acid. However, their synthetic production has so far failed due to the impossibility of producing the D (-) - 3-hydroxybutyric acid in its pure state using a technically feasible and economically viable method. In particular, no microorganisms which secrete the desired carboxylic acid were previously known.
A microbiological process has now been found by means of which pure D (-) - 3-hydroxybutyric acid can be prepared in high yield from extremely cheap carbon sources, and this also creates the possibility of synthesizing said optically active esters.
The inventive method consists in that a D (-) - 3-hydroxybutyric acid producing bacterial strain in an aqueous nutrient medium, which as an carbon source is an assimilable carbohydrate from the group of glucose, sucrose and lactose, e.g. B. molasses and whey, an assimilable alcohol from the group consisting of methanol and ethanol, or the waste liquor from the caprolactam synthesis together with an assimilable nitrogen source and trace elements, at a temperature of 25 to 40 C and a pH of 6 to 8, the grown optically active carboxylic acid isolated from the culture broth and esterified with an optionally substituted lower alkanol.
In the following the invention is described in detail.
It has now surprisingly been found that among the microorganisms belonging to the class of Schizomycetes by Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit.
RR Breed et al., 7th edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1957), those can be obtained which, starting from extremely cheap carbon sources, excrete high concentrations of D (-) - 3-hydroxybutyric acid and always differ with regard to this ability let it improve. The microorganisms can be obtained from any culture collection, or can be easily isolated from natural material, such as soil, water, air, liquid manure, by known methods. Particularly suitable are microorganisms which are able to synthesize butyric acid or poly (D-3-hydroxybutyric acid) themselves, such as, for. B.
Members of the Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae, and Enterobacteraceae families.
Known poly (D-3-hydroxybutyric acid) storing bacterial strains, such as. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium ATCC 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 and a previously unknown, isolated from air methanol processor, which was recognized as a strain of Mycoplana rubra CBS 385.76, are the only carbon source on fructose . After the carbon source has been removed, the microorganisms are placed in a medium which is the only carbon source and contains racemic 3-hydroxybutyric acid and an antibiotic which kills the active or growing cells.
The resting or non-growing, surviving cells which do not form the enzyme 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (= EC 1.1.1.30) and consequently (cannot assimilate 3-HB) are isolated and tested for their ability to form p-HB For this purpose, the concentration of ss-HB is quantitatively determined in aliquots of the culture fluid according to the enzymatic method of Williamson and Mellanby (Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim and Academic Press, Inc., New York 1974, page 1883). The ss-HB-secreting bacterial strains obtained in this way are treated with known mutagenic agents in order to generate mutants, among which those are selected which are per volume
unit of culture fluid produce even higher concentrations of f3-HB than their parent strain.
On the other hand, microorganisms that do not
Save poly (D-3-hydroxybutyric acid), but form butter acid, like the Clostridiumarten, z. B. from Clostridium butyricum ATCC 19398, searched in an analogous manner those derivatives which do not form 3-hydroxybutyric acid hydrogenase and consequently cannot assimilate ss-HB. Such strains are grown on agar plates as scattered colonies. After growth, the agar surfaces are covered with a
A mixture of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, nicotine adenine dinucleotide in the oxidized form (NAD) and a layer of methylene blue or triphenyltetrazolium chloride consist of the redox indicator and searched for colonies that cause discoloration of the Rdox indicator.
These were isolated and examined for their ability to produce ss-HB. ss-HB producing strains are mentioned
Subject to mutation procedures to obtain offspring with increased productivity for (3-HB.
Bacterial strains which, in the shortest possible time, contain a maximum proportion of the carbon source in D (-)
Implement 3-hydroxybutyric acid, in principle, are obtained by using a butyric acid or D (-)
Eliminating 3-hydroxybutyric acid or a poly (D
3-hydroxybutyric acid) storing bacterial strain of
Exposure to mutagenic agents subjects the mutants selected to those which D (-) - 3 hydroxybutyric acid is unable to assimilate and, in turn, selects those which - if necessary after renewed mutation - use more of the carbon sources and breeding conditions mentioned below to use more D ( -) - Produce 3-hydroxybutyric acid as the parent strain subject to the mutation.
In this way, the mutants of D (-) - 3-hydroxybutyric acid which secrete D (-) - 3-hydroxybutyric acid and are particularly productive sources are Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, e.g. B. the mutant CBS 381.76; from Azotobacter chroococcum DSM 281, e.g. B. the mutant CBS 383.76; from Bacillus megatherium ATCC 32, e.g. B. the mutant CBS 382.76; from Zoogloea ramigera ATCC
19623, e.g. B. the mutant CBS 384.76; from Clostridium butyricum ATCC 19398, e.g. B. the mutant CBS 380.76; and also Mycoplana rubra CBS 385.76 and its corresponding mutants. Of course, the bacterial strains mentioned can be further improved in their productivity by using the method described above.
The strains mentioned are deposited at American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland, USA), and Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Munich (FRG), the mutant strains listed with CBS are on August 4. In 1976 it was deposited at Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (Netherlands).
The ss-HB-producing bacterial strains are subsequently used according to known methods to grow in high concentrations of specific carbon sources, namely glucose, sucrose, lactose, molasses, whey, methanol, ethanol and the waste liquor from the caprolactam synthesis, and ss- HB produce, using NH4 ions or urea as a nitrogen source and the usual trace elements are added. In addition to organic carbon sources such as those mentioned above, the descendants of Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 can also assimilate carbon dioxide if the atmosphere contains both molecular hydrogen and oxygen to produce ss-HB.
The carbon source content of the nutrient solution is advantageously approx. 2 to 25% glucose, sucrose, lactose, molasses or whey - calculated as pure carbohydrate, approx.
1 to 10% methanol or ethanol, or approx. 1 to 10% waste liquor from caprolactam synthesis - calculated as the total carboxylic acids contained therein.
Although all the bacterial strains obtained ss-HB on solid
Producing culture media, liquid media are preferable to production. For this, aqueous nutrient solutions are prepared in a known manner from the concentration of carbon source mentioned and with an assimilable nitrogen source and the necessary trace elements. The sterile
Culture media are inoculated with 0.1-10% by volume of a pre-culture and at approx. 25-400C in a standing culture or in the absence of air - for the anaerobic microorganisms, e.g. B.
the Clostridiumarten, or with stirring or shaking and optionally with the addition of air or a mixture of
Carbon dioxide, hydrogen and oxygen (or air) - for the aerobic microorganisms, incubated for 8 to 72 hours. In order to obtain the highest possible yield of the desired carboxylic acid, the pH of the inoculated solution is kept at 6-8 by adding sterile alkali solution.
As the biomass grows, fresh carbon sources can be added continuously to maintain a constant concentration and to achieve maximum t3-HB production.
After completion of the fermentation approach, d. H. when the maximum ss-HB concentration is reached, the ss-HB can, if necessary after separating the biomass from the fermentation solution by means of ion exchangers, or after acidifying the fermentation solution to approx. pH 1.5-2.5 with water-immiscible solvents, such as B. ether, chloroform or other chlorinated hydrocarbons, ethyl acetate or other esters, isopropanol, butanol and other alcohols. From the organic solvents, $ -HB can be used as a salt with metallic cations, such as. As lithium, potassium, sodium, calcium and barium or nickel, precipitated, dried in this form and obtained from it in a pure state.
The D (-) - 3-hydroxybutyric acid produced in this way is then esterified with an optionally substituted lower alkanol by methods known per se. For example, the esterification can be carried out by treating the carboxylic acid in an excess of the alkanol in the presence of a strong mineral acid, e.g. B. sulfuric acid. In particular, those having 1 to 5 carbon atoms are used as alkanols.
The esters obtained have the same configuration as the corresponding odoriferous and aromatic substances found in fruits and plants. Compared to the fruit flavorings previously produced with the racemic DL-3-hydroxybutyric acid, the esters of D (-) - 3-hydroxybutyric acid have the advantage of their natural configuration, which is associated with toxicological safety and - on a weight basis - a significant increase in olfactory and organoleptic properties.
The following examples are intended to further illustrate the invention.
example 1
A nutrient solution is first prepared which contains 0.9% Na2HPO4-12 H2O, 0.15% KH2PO4, 0.1% NH4Cl, 0.04% MgSO4 7 H2O, 0.0195% iron (II) -NH4-citrate 6 H20, 0.00133% Ca12, as well as 1 ml of a trace element solution with 0.01% ZnS04 7 H20.0.003% MnCl2 4 H2O, 0.03% boric acid, 0.02% CoCl2 6 H2O, 0.001% CuCk 2 per liter solution Contains H2O, 0.002% NiCh 6 H20, 0.003 NazMoO 2 H20.
In 250 ml Erlenmeyer bottles, 30 ml of the nutrient solution are used to cultivate shake or stand cultures at 30 ° C. for 1624 hours. The solution, sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, contains 20 ml of sterile-filtered fructose solution containing 9 g of this carbohydrate per 980 ml. The inoculation is carried out using an eyelet from a 24-hour slant agar culture.
The shake culture is sedimented on a centrifuge and the biomass is washed with water and taken up in approx. 4 ml of physiological saline. After about 1 hour, 4 ml of 0.6-n sodium acetate buffer of pH 4.6 and 4 ml of a 0.05-n sodium nitrite solution are added to generate the mutation and incubated for a few minutes. After washing, the biomass of each microorganism (see table below) is divided into about 10 250 ml Erlenmeyer bottles, which are loaded with the above medium and contain 2% DL-3-hydroxybutyric acid instead of fructose.
After the turbidity in the flask is visibly increasing, depending on the organism, 1 ml of a sterile-filtered solution of 2 mg / ml K-penicillin G or 1 ml of a sterile-filtered solution of 30 mg / ml bacitracin or 1 ml is used per flask added to a sterile-filtered solution of 2 mg / ml colistin sulfate or 0.5 ml of two different antibiotic solutions. After various incubation periods, i.e. H. after 1-16 hours, the antibiotics are washed out or destroyed with penicillinase. The surviving microorganisms are washed with water and inoculated onto the fructose medium. After 1636 hours, dilution series are made from each flask and 0.1 ml of those dilutions containing about 50-1000 germs per ml are spread on agar plates in order to obtain single scattering colonies.
As a carbon source, this agar contains 2% DL-3-hydroxybutyric acid sodium salt and 0.008% fructose. After approx. 48 hours, many very small, different-looking colonies of approx.
1 / 4-1 mm in diameter, as well as colonies of normal size. From all small colonies, inocula are now transferred using sterile wooden toothpicks, first to a specific place on an agar plate with DL-3 hydroxybutyric acid sodium salt as the only carbon source and secondly immediately to the corresponding place on an agar plate with fructose as the only carbon source. About 10 to 30% of the colonies tested in this way are unable to grow on DL-3 hydroxybutyric acid. These are spread on the well-known fructose medium, to which 3% finely dispersed CaCOs (dry sterilized) have been added, so that the plates look milky cloudy.
All colonies that can dissolve the lime can be assumed to produce an acid. Shake cultures of these are made in the fructose medium in order to test their ability to produce, 8-HB according to the enzymatic method of Williamson and Mellanby (see above).
The work with Clostridium butyricum is carried out under strict anaerobia conditions according to Schocher [A contribution to the knowledge of the growth and fermentation physiology of saccharolytic clostridia, dissertation, laboratory for microbiology, Technical University Delft (Netherlands), 1959]. The following table illustrates the success of the technology used.
Generation of ss-HB producing microbial strains
Approx. 100,000-1,000,000 strains per species were examined for their ability to form acids. Bacterial strain Antibiotic number, acid number, 5-HB-producing strains Strains with maximum treatment with producing p-HB production
Colonies up to and including the lmg / L lOmgiL 95 mg / L mglL best strain Alcaligenes eutrophus ATCC 23 440 - approx. 10000 0 0 0 - - and mutants thereof colistin / approx. 10000 approx. 800 6 1 74 GA-3
Bacitracin (CBS 381.76) Bacillus megatherium ATCC 32 approx.
8,000 0 0 0 - - and mutants thereof penicillin approx. 9,000 approx. 600 15 2 95 GB-1 (CBS 382.76) Azotobacter chroococ cum DSM 281 approx. 7000 0 0 0 - and mutants thereof bacitracin approx. 6,000 approx. 700 7 3 86 GC-7 (CBS 383.76) Zoogloea ramigera ATCC 19 623 approx. 11 000 0 0 0 - and mutants thereof colistin approx. 12000 approx. 500 17 1 51 GZ-1 (CBS 384.76) Clostridium butyricum ATCC 19 398 approx. 16,000 0 0 0 - - and mutants thereof bacitracin / approx. 16,000 approx. 1100 3 1 76 GC1-2
Penicillin (CBS 380.76) Mycoplana rubra CBS 385.76 - approx. 5000 0 0 0 - and mutants thereof bacitracin approx. 7 000 approx.
300 21 4 67 GM-1 (CBS 385.76)
Example 2
The ss-HB producers GA-3, GB-1, GC-7, GZ-1, GCl-2 and GM-1 are subjected to the mutation generation process described in Example 1 and spread out analogously on agar plates. After growth has ended, the colonies are brought onto fresh agar plates by means of velvet stamps, which contain such quantities of sterile bromocresol green or bromocresol purple as pH indicator that the agar is colored blue or purple, after short incubation times, ie. H. after only 5-6 hours, z. T. discoloration of the pH indicator can already be detected, which localizes colonies that grow quickly and produce a lot of acid. Such are selected and grown submerged to assess their ss-HB productivity.
By far most of the descendants of the ss-HB producers used produce less or z. Sometimes no ss-HB. However, one or a few are perceived among thousands of mutatively obtained descendants, which produce more t3-HB than the parent strain. Such are subjected to a renewed mutation / selection cycle in order to again detect the strains which can produce even higher concentrations of ss-HB.
The biomass is centrifuged off from the fermentation solutions obtained and the pH is adjusted to about 1.5 to 2.5 before or after centrifuging with dilute acid. The solution is extracted several times with ethyl ether, the solvent washed with acid and evaporated in vacuo at about 30 ° C.
Petroleum ether or cyclohexane is added to the concentrated extract, causing ss-HB to precipitate out and be filtered off. The extraction can also be carried out with chloroform.
In this way, the mutant GA-113 was derived from the GA-3 strain, which within 13 hours 1375 mg ss-HB / liter; from strain GZ-1 the mutant GZ-317, which contains 1980 mg ss-HB / liter; from the strain GCl-2 the mutant GCl-138, which 1670 mg P-HB / liter, and from the strain GM-1, the mutant GM-97, which produced 1475 mg ss-HB / liter.
1 g of the D (-) - 3-hydroxybutyric acid obtained is dissolved in 100 ml of ethanol and the solution is about 1 ml of conc.
H2SO4 added. The reaction mixture is stirred for 3 hours with a magnetic stirrer at room temperature and then diluted with 1 volume of water and mixed with enough diethyl ether to form a two-phase mixture. The organic phase is washed thoroughly with water and then the ether is distilled off in vacuo. The residue contains the raspberry-scented D (-) - 3-hydroxybutyric acid ethyl ester; Sdp. 184-1850C / 755 mm, [aj25 = -10.5 (optically not completely pure). On a weight basis, the ester has significantly stronger aroma properties than the commercially available ethyl ester of DL-3-hydroxybutyric acid.
Example 3
500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the nutrient solution from Example 1, but instead of fructose 6% neutralized, sterile waste liquor from caprolactam synthesis (which contains a mixture of mono- and dicarboxylic acids) is used and the amount of NH4Cl is reduced by 50% is inoculated with a culture of Azobacter chroococcum DSM 281, derivative GC-183 CAL, and shaken eccentrically in the presence of air at 30-32 ° C.
Analogously to Example 2, ss-HB is extracted with ethyl acetate and precipitated from the native extract by adding concentrated solutions of NaOH, Ca (OH) 2 or KOH and obtained by filtration as Na, Ca or K salt. Instead of the ethyl acetate, n-butanol or isopropanol can also be used. After 46 hours the fermentation solution contains approx.
1600 mg ss-HB per liter.
The extract of the fermentation solution is concentrated with the same volume of ethanol and approx. 25 g Na2SO4 and 3 ml. H2SO4 added and stirred for 5 hours. The reaction mixture is then washed with plenty of water and the remaining organic phase is concentrated in vacuo. The same ethyl ester with the same properties as described in Example 2 is obtained.
Example 4
Analogously to Example 3, the derivative GC-157 MEL from Azotobacter chroococcum DSM 281 is used, but instead of leaching the caprolactam synthesis
12% by weight beet sugar molasses can be used. After 36 hours the fermentation solution reaches an ss-HB concentration of
1780 mg / L.
The procedure is analogous to Example 2, but methyl alcohol is used instead of ethanol. The evaporation residue gives the D (-) - 3-hydroxybutyric acid methyl ester, which smells of fruit flavors, Sdp.
67-68.5 C, [ot] n25 = -20.90 (without solvent).
Example 5
Under anaerobic conditions, the mutant GCl-1 12 from Clostridium butyricum ATCC 19398 is grown in a medium of 4% sucrose, 0.3% NH4 acetate, 0.178% NaHPO 2 H2O, 0.136% KH2PO4, 0.042% Mg S04 7 H20, 0, 00025% FeSO4 7 H2O, 0.00013% MnQ2 4 4 H20, and 1 µg (+) - biotin per 1000 ml for 48 hours, after which the fermentation medium has a concentration of 1710 mg ss-HB / liter.
The procedure is analogous to Example 2, but with the difference that propyl alcohol is used instead of the ethyl alcohol. The result is analogous to example 4.
Example 6
In order to find microorganisms utilizing methanol, a 500 ml beaker with approx. 100 ml of the nutrient solution from Example 1, which, however, contains 1% methyl alcohol as the only carbon source, is placed open in the laboratory. After a few days the solution is cloudy and, after appropriate dilutions with water on agar plates with the medium from Example 1, single scattering colonies can be produced therefrom. With selected colonies, shake cultures are grown in the methyl alcohol medium mentioned, which according to Law & Slepecky [J. Bact., 82, (1961), 33] for the production of polybetahydroxybutyric acid.
In this way, a rod-shaped microorganism is obtained which forms up to 50% by weight of its cell mass polybetahydroxybutyric acid and has been identified as Mycoplana rubra strain (CBS 385.76).
With the derivative GM-37 of this microorganism, the procedure is analogous to Example 3, but the waste liquor from the caprolactam synthesis is replaced by 2.5% methyl alcohol. After an incubation period of 48 hours at 310 C, the fermentation solution contains 536 mg 2-HB / liter.
The procedure is analogous to Example 2, but with the difference that butyl alcohol is used instead of the ethyl alcohol. The result is analogous to example 4.
Example 7
The GA-113 strain, which was obtained from Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, is used under conditions and in the medium according to Volker Oeding (Society for Radiation Research, Report M 109, Göttingen 1972) in a purely mineral nutrient solution and in the presence of one of hydrogen, carbon dioxide and Oxygen existing atmosphere grown at 30 "C for 48 hours.
The excess of the fermentation solution is treated with an anion exchanger in the OH form. The sodium salt of 2-HB is obtained by eluting the exchanger with dilute sodium hydroxide solution. Yield: 1250 n mg ss-HB / liter.
The procedure is analogous to Example 2, but with the difference that amyl alcohol is used instead of the ethyl alcohol. The result is analogous to example 4.