KR20050109950A - 락토나아제의 제조 방법 및 그 이용 - Google Patents

Abstract

광학 활성인 판토락톤 등의 γ-락톤 유도체는 의약품 등의 유용 물질의 합성 중간체로서 그 대량 또한 저렴한 생산이 요구되고 있다. 이 목적으로는 효소적 비대칭 가수분해를 행하는 효소 락토나아제를 이용하는 기술이 우수하지만, 그 효소의 조제나 상기 효소 생산 미생물의 이용에는 여전히 문제점이 있다. 재조합 기술에 의한 경우도, 충분한 또한 안정된 효소 활성을 얻는 것이 곤란하다. 라세미판토락톤 등의 γ-락톤 유도체를 선택적으로 비대칭 가수분해하는 락토나아제를 재조합 기술로 생산함에 있어서, 성숙 락토나아제 DNA와 시그날 펩티드 영역 DNA의 양방을 숙주에 도입함으로써 천연의 락토나아제에 뒤떨어지지 않는 안정성있는 활성을 얻을 수 있고, 높은 효소 활성을 갖고 또한 그것을 안정적으로 유지하는 형질 전환을 얻을 수 있으며, 효율적 또한 공업상 유리한 γ-락톤 유도체의 비대칭 합성이 가능해진다.

Description

락토나아제의 제조 방법 및 그 이용{PROCESS FOR PRODUCING LACTONASE AND UTILIZATION THEREOF}

본 발명은 D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제의 미생물에서의 발현 및 분비 생산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소 및 상기 효소를 생산하는 시스템을 이용한 광학 활성 γ-락톤 및 그 관련 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

D-판토락톤은 D-판토텐산, D-판테놀, 판테틴의 제조에서의 중간체로서 알려져 있다. 이들은 의학상 또는 생리학상 중요한 비타민으로서 의약품의 외에, 식품 첨가물, 사료 첨가물의 외에, 화장품 원료로서도 유용하다. 종래, D-판토락톤은 화학적으로 합성된 D,L-판토락톤을 광학 분할함으로써 제조되고 있다. 그러나, 이 방법은, 퀴닌, 브루신 등의 비싼 분할제를 필요로 하는 것이고, D-판토락톤의 회수도 용이하지 않다는 등의 결점을 갖고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 본 발명자들은 D,L-판토락톤의 효소적 비대칭 가수분해에 의한 광학 분할법을 일본 특허 공개 공보 평3-65198호 및 일본 특허 공개 공보 평4-144681호 각 공보에 제시하였다.

즉, 푸사륨(Fusarium)속, 실린드로카르폰(Cylintrocarpon)속, 제베렐라(Gibberella)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 볼테라(Volutell)속, 글리오크라듐(Gliocladium)속, 유로튬(Eurotium)속, 넥토리아(Nectoria)속, 시조피람(Schizophyllum)속, 미로세슘(Myrothecium)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 아크레모늄(Acremonium)속, 튜벨크리너(Tuberculina)속, 아브시디아(Absidia)속, 스포로스릭스(Sporothrix)속, 바티실륨(Verticillium)속 또는 아르스로다마(Arthroderma)속에 속하는 미생물에서 선택된 락톤 가수분해능을 갖는 미생물을 이용하여 D,L-판토락톤 중의 D-체를 선택적으로 비대칭 가수분해시킴으로써 D-판토인산을 생성시키고, 그 D-판토인산을 분리하여 D-판토락톤으로 변환하는 것을 특징으로 하는 D-판토락톤의 제조법 및 상기한 속에 속하는 미생물에 의한 D-판토락톤 가수분해 효소의 제조법이다.

그러나, 이들의 개시되어 있는 미생물의 대부분이 즉시 공업적으로 이용 가능한 정도의 가수분해 활성을 가지고 있다고는 반드시 말할 수 없고, 그 미생물이 가지는 효소 활성을 공업 가능한 레벨까지 상승시키기 위해서는, 배양 조건이나 활성 유도 조건 등에 대해서 장시간을 요하는 번잡하고 어려운 검토가 필요해진다. 또한 이들의 그 미생물은 진균이기 때문에, 균체가 여러 가지 형태를 갖는 균사형상을 나타내고, 단일 형태를 갖는 세균 등에 비교하여 공업적 생산에 유리한 고정화 균체의 조제가 상당히 어렵다는 문제가 있다. 또한 효소를 균체로부터 정제할 때에도 D-판토락톤 가수분해 효소에 관해서는 상당히 회수율이 나쁘다는 등의 문제가 있다.

이들의 문제점을 해결하고, 또한, D-판토락톤 가수분해 효소 그 자체의 개변에 의해 효소 활성의 비약적인 상승을 가능하게 하는 것을 목표로 하여, 천연의 D-판토락톤 가수분해 효소, 예컨대, 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 유래의 천연의 D-판토락톤 가수분해 효소 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 밝히고, 상기 단백질을 암호화하는 염기 서열을 함유하는 DNA로 형질 전환시킨 숙주 세포가 제작되었지만, 상기 형질 전환 숙주 세포로 얻어지는 효소 활성도 그것을 즉시 공업적으로 이용 가능하게 하기 위해서는 더욱 효율적인 방법이 요구되고 있었다.

특허문헌 1: 특허공개 평3-65198호

특허문헌 2: 특허공개 평4-144681호

특허문헌 3: 국제 공개 팜플렛 WO, A, 97/10341

도 1은 아스페르길루스 오리제에서의 외래 락토나아제 유전자의 발현에 관해서 조사한 결과의 전기 영동 사진을 도시한다.

A는, 전기 영동으로 분리 처리한 단백을 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색한 겔을 도시한다. 레인 1은 분자량 마커(Daiichi Chemicals, Tokyo, Japan): 포스포릴라아제b(97kDa), 소혈청 알부민(66kDa), 알돌라아제(42kDa), 그리고 카르보닉안하이드라아제(30kDa). 레인 2는 pNAN-PC로 형질 전환된 아스페르길루스 오리제의 셀프리 추출액, 레인 3은 pNAN-XG로 형질 전환된 아스페르길루스 오리제의 셀프리 추출액. 각 레인에는 25㎍를 적용. 레인 4는 푸사륨 옥시스포룸에서 얻은 정제 락토나아제. 0.5㎍를 적용.

B는 웨스턴 블롯의 결과를 나타내는 것으로, 야생형 락토나아제에 특이적인 항체에 의해 면역 염색한 것으로, A와 동일한 겔에 관한 것이다. 레인 1은 분자량 마커(prestained SDS PAGE standards low range, Bio-Rad, Hercules, USA); 포스포릴라아제b(97kDa), 소혈청 알부민(66kDa), 난백 알부민(45kDa), 카르보닉안하이드라아제(31kDa), 트립신인히비터(22kDa).

도 2는 푸사륨 옥시스포룸과 재조합체 아스페르길루스 오리제를 이용한 라세미 판토락톤의 비대칭 가수분해의 결과를 도시한다. A는 습윤 세포를 사용하여 결과를, B는 고정화 세포를 사용한 결과를 도시한다. 흰 원 도장은 pNAN-PC로 형질 전환된 아스페르길루스 오리제, 검은 원 도장은 pNAN-XG로 형질 전환된 아스페르길루스 오리제, 흰 사각 도장은 푸사륨 옥시스포룸이다.

도 3은 락토나아제의 분비 발현용 플러스미드의 구조를 도시한다. 융합 유전자는, PCR을 조합시켜 행하여 구축하고, SalI 및 XbaI에서 절단하여 pBluescript II SK+ 중에 서브 클로닝하였다.

도 4는 아크레모늄 크리소게눔 형질 전환체에 의해 분비된 락토나아제의 전기 영동(SDS-PAGE) 사진을 도시한다. 10% 폴리아크릴아미드겔 사용. 레인 1은 푸사륨 옥시스포룸에서 얻은 정제 야생형 락토나아제(0.5㎍)를, 레인 2는 pAlpS로 형질 전환된 아크레모늄 크리소게눔(3㎍의 단백 함유)을, 레인 3은 pLacS로 형질 전환된 아크레모늄 크리소게눔(3㎍의 단백 함유)를 도시한다. 레인 4는 분자량 마커: 포스포릴라아제b(97kDa), 소혈청 알부민(66kDa), 알돌라아제(42kDa), 그리고 카르보닉안히드라아제(3OkDa).

도 5는 당쇄 절단 처리된 락토나아제의 전기 영동(SDS-PAGE) 사진을 도시한다. 야생형 락토나아제(레인 2-5) 및 pAlpS로 형질 전환된 아크레모늄 크리소게눔에서 얻은 정제 재조합형 락토나아제(레인 8-11)는 EndoH_f로 처리된 것으로, 10% 폴리아크릴아미드겔 상에서 전기 영동 처리된 것이다(각 레인 당 0.8㎍). 레인 2 및 레인 8은 1분간의 당쇄 절단 처리, 레인 3 및 레인 9는 5분간의 당쇄 절단 처리, 레인 4 및 레인 10은 15분간의 당쇄 절단 처리, 레인 5 및 레인11은 60분간의 당쇄 절단 처리. 당쇄 절단 처리로 하고 있지 않은 야생형 락토나아제 및 재조합형 락토나아제는, 레인 1 및 레인 7에 도시한다. 레인 6은 분자량 마커로 상세한 것은 도 4와 같은 것이다.

도 6은 고정화 효소에 의한 라세미 판토락톤의 비대칭 가수분해의 결과를 도시한다. D-및 L-판토산의 비율은 nPLC로 측정하였다. 검은 원 도장은 D-판토산을, 흰 원 도장은 L-판토산을, 흰 사각 도장은, DL-판토락톤(라세미 판토락톤)을 도시한다.

도 7은 푸사륨속 실형상균 유래 락토나아제를 암호화하는 염색체 DNA(게놈·유전자)의 염기 서열을 도시한다. NH₂-말단의 20개의 아미노산 잔기의 서열(1∼60의 염기 서열)이 시그날 펩티드 영역에서 그림자를 붙여 표시하고 있다. 또한, 5개의 인트론은 소문자(lowercase letter)로 표기되어 있고, 예측되는 N-글리코실화 아스파라긴 잔기는 다이어 도장이 붙어 있으며, 관련 스톱 코돈은 별표를 붙여 도시하고 있다.

종래, 대장균 등을 사용하여 얻어진 형질 전환체가 생산하는 효소는 당쇄(sugar chain)의 부가가 없고, 천연형(야생형)보다도 분자량이 작으며, 안정성이 부족하다는 문제가 있어 이것을 해결하는 것이 요구되고 있었다.

본 발명은, 천연의 락토나아제 유전자를 이용하여, 효율적이고 또한 생산성이 우수한 상기 효소를 생산하는 시스템을 제작하는 것에 있다. 또한, 본 발명은, 다시 상기 효소 및 상기 효소를 생산하는 시스템을 이용하여, 효율적이고 또한 보다 생산성이 우수한 광학 활성 γ-락톤 생산 시스템의 구축에 있다.

D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 D-판토락톤 가수분해 효소(이하, 「락토나아제」라고 함), 특히 푸사륨 옥시스포룸에서 클로닝되어 동정(同定)된 락토나아제는, 그 유전자의 해석의 결과, 5개의 인트론을 포함하는 1453 염기쌍으로 이루어지는 염색체 유전자에 의해서 암호화되어 있고, 상기 효소는 20개의 아미노산 잔기로 이루어지는 NH₂ 말단 시그날 펩티드를 갖는 것으로, 그 염색체 유전자로부터 전사된 mRNA에 상보적인 cDNA에 의해 암호화되는 성숙 효소는 380개의 아미노산으로 이루어지는 단백질이다.

그리고 야생형인 것은 당쇄가 부가하고 있는 것이다.

상기 과제를 감안하여 본 발명자들은 재조합형 효소에 있어서도 당쇄 부가가 이루어지는 시스템을 개발하도록 예의 연구를 진행시킨 결과, 상기 락토나아제 유전자를 시그날 펩티드를 암호화하는 유전자 서열과 함께 숙주 세포에 도입하고, 발현시킴으로써 천연형의 당쇄가 부가된 상기 효소의 대량 발현에 성공하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명은,

〔1〕D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔2〕락토나아제가 푸사륨속 유래인 것을 특징으로 하는 상기〔1〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔3〕서열목록의 서열 번호: 9의 제1∼380번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 락토나아제를 암호화하는 DNA 혹은 그 일부 서열과 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA로 이루어지는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔4〕시그날 펩티드 영역이 서열목록의 서열 번호: 9의 제-20∼-1번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열 또는 그 일부 서열, 혹은 Alp 시그날 펩티드 영역인 것을 특징으로 하는 상기〔3〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔5〕상기〔1〕∼〔4〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체를 배양하여 재조합 락토나아제를 생산시키고, 얻어진 재조합 락토나아제를 얻는 것을 특징으로 하는 D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 재조합 락토나아제의 제조 방법; 및

〔6〕일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그 염을, 상기〔1〕∼〔4〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 일반식 (II) 또는 일반식 (IV)로 표시되는 광학 활성인 γ-락톤 유도체 또는 그의 염의 제조방법을 제공한다.

(R은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내고, R¹및 R²는 각각 동일 또는 상이하며, 상호 독립적으로 수소 또는 저급 알킬기를 나타냄)

(R, R¹및 R²는 각각 상기와 동일함),

(R, R¹ 및 R²는 각각 상기와 동일함),

별도의 형태로는, 본 발명은,

〔7〕 D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 또는 그것을 삽입한 벡터를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔8〕 벡터가 실형상균 인핸서(filamentous fungal enhancer) 염기 서열의 1개 또는 복수개를 갖는 것을 특징으로 하는 상기〔7〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔9〕 벡터가 실형상균의 인핸서 염기 서열을 1개 또는 복수개, 실형상균으로 기능하는 프로모터 영역에 도입한 것을 특징으로 하는 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕및〔8〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔10〕벡터가 아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae)의 α-글루코시다아제 유전자(agdA), 프로모터 상의 인핸서 서열의 1개 또는 복수개를 실형상균으로 기능하는 프로모터 영역에 도입한 것을 특징으로 하는 상기〔1〕∼〔4〕및〔7〕∼〔9〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔11〕프로모터 영역이 실형상균 유래의 가수분해 효소 유전자, 또는, 해당(解糖)계 효소 유전자의 프로모터 영역인 것을 특징으로 하는 상기〔9〕또는〔10〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔12〕프로모터 영역이 아스페르길루스 오리제 유래의α-글루코시다아제 유전자의 프로모터 영역, 혹은, 그 부분 서열을 포함하는 프로모터 영역인 것을 특징으로 하는 상기〔9〕∼〔11〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔13〕벡터가 숙주 실형상균의 형질 전환체의 선택에 적합한 마커 유전자를 가지고, 터미네이터를 가지며, 대장균으로 복제 가능한 DNA 영역을 가지고 또한 실형상균에서의 폴리펩티드 발현용 플러스미드인 것을 특징으로 하는 상기〔7〕∼〔12〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔14〕마커 유전자가 실형상균 유래의 질산 환원 효소 유전자, 오르니틴 카르바모일 트랜스페라아제 유전자, 트립토판신타아제 유전자, 또는 아세트아미다아제 유전자인 것을 특징으로 하는 상기〔13〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔15〕마커 유전자가 아스페르길루스속 유래의 질산 환원 효소 유전자인 것을 특징으로 하는 상기〔13〕또는〔14〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔16〕터미네이터가 아스페르길루스 오리제 유래의 α-글루코시다아제 유전자의 터미네이터, 혹은, 그 부분 서열을 포함하는 터미네이터인 것을 특징으로 하는 상기〔13〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔17〕벡터가 푸사륨속 실형상균을 생산하는 알칼리프로테아제(Alp)의 발현에 따른 프로모터 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 상기〔7〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔18〕시그날 펩티드 영역이 상기 Alp의 분비에 따른 시그날 서열 영역 또는 상기 락토나아제의 시그날 서열 영역인 것을 특징으로 하는 상기〔1〕또는〔7〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔19〕(a) D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 DNA 서열 및 (b) 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔20〕(a) (i) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 cDNA 서열 또는 (ii) 염색체 유전자 DNA 서열, 및 (b) 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 상기〔19〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔21〕(a) D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 DNA 서열 및 (b) 푸사륨속 실형상균을 생산하는 Alp 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔22〕(a) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 cDNA 서열 (i) 또는 염색체 유전자 DNA 서열 (ii) 및 (b) 상기 Alp 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 상기〔21〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔23〕서열목록의 서열 번호: 8의 제61∼1453번째의 염기 서열을 암호화하는 DNA와 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA로 이루어지는 DNA를 도입한 것을 특징으로 하는 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔24〕시그날 펩티드 영역이 서열목록의 서열 번호: 9의 제-20∼-1번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열 혹은 푸사륨속 실형상균 Alp 시그날 펩티드 영역인 것을 특징으로 하는 상기〔23〕기재의 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔25〕일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을, 상기〔1〕∼〔4〕및〔7〕∼〔24〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 그 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시키고, 미반응인 일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 반응계에서 분리함에 따른 (S)-γ-락톤 유도체 또는 그의 염의 제조 방법;

(R은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내고, R¹ 및 R²는 각각 동일하거나 또는 상이하며, 상호 독립적으로 수소 또는 저급 알킬기를 나타냄).

(R, R₁ 및 R₂는 각각 상기와 동일함).

〔26〕일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을, 상기〔1〕∼〔4〕및〔7〕∼〔24〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 그 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시키고, 일반식 (III)의 화합물 또는 그의 염을 얻으며, 이것을 일반식 (IV)의 화합물 또는 그의 염으로 변환함에 따른, (R)-γ-락톤 유도체 또는 그의 염의 제조 방법;

(R은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내고, R¹ 및 R²는 각각 동일하거나 또는 상이하며, 상호 독립적으로 수소 또는 저급 알킬기를 나타냄)

(R, R¹ 및 R²는 각각 상기와 동일함)

(R, R¹ 및 R²는 각각 상기와 동일함)

〔27〕락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA;

〔28〕(a) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 DNA 서열 및 (b) 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA; 및

〔29〕(a) (i) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 cDNA 서열 또는 (ii) 염색체 유전자 DNA 서열 및 (b)상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA를 제공한다.

또 다른 형태로는, 본 발명은,

〔30〕숙주 미생물로서 아스페르길루스속, 아크레모늄속, 푸사륨속에 속하는 미생물에 도입하는 것을 특징으로 하는 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕및〔18〕∼〔24〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔31〕숙주 미생물로서, 아스페르길루스 오리제, 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum), 푸사륨 옥시스포룸에 속하는 미생물에 도입하는 것을 특징으로 하는 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕및〔18〕∼〔24〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체;

〔32〕일반식 (II) 또는 (IV)의 광학 활성인 γ-락톤 유도체의 제조법에 있어서, 락토나아제 생산 형질 변환체, 그 배양물, 그 세포, 그 세포 처리물, 및 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제를 고정화하여 반복 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

〔33〕일반식 (I)에서 R이 히드록실기이며, R¹및 R²가 함께 메틸기인 광학 활성인 판토락톤 또는 그의 염의 제조 방법;

〔34〕일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을, 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕∼〔24〕,〔30〕및〔31〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 그 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시켜 얻어진 D-판토락톤을 이용하는 것을 특징으로 하는 판토텐산 또는 그의 염, 판테놀, 혹은 판테틴의 제조 방법;

〔35〕상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕∼〔24〕,〔30〕및〔31〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 고정화 균체; 및

〔36〕상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕∼〔24〕,〔30〕및〔31〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체에서 얻어진 재조합 락토나아제가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 고정화 재조합 락토나아제를 제공한다.

또 다른 형태로는, 본 발명은

〔37〕상기 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을, 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕∼〔24〕,〔30〕,〔31〕,〔35〕및〔36〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 그 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시키고, 상기 일반식 (III)으로 표시되는 광학 활성인 화합물 또는 그의 염을 제조하며, 다음에 상기 광학 활성인 일반식 (III)으로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 출발 물질로서 사용하여 공지의 방법 혹은 그것과 균등한 방법 또는 그 개변 방법을 적용하여, 일반식 (IV)으로 표시되는 화합물, 판토텐산, 판토텐산칼슘, 판테놀, 판테테인, 코엔자임A(CoA), 판토테닐에틸에테르, 판테틴 등의 D-판토락톤 유도체 또는 그의 염을 제조하는 것을 특징으로 하는 D-판토락톤 유도체 또는 그의 염의 제조 방법;

〔38〕(a) D-판토락톤을 β-알라닌의 Ca염 또는 에스테르를 축합시켜 D-판토텐산 칼슘을 제조하는 것,

(b) D-판토락톤을 β-알라닌 또는 그 에스테르와 축합시켜 D-판토텐산으로 한 후, 칼슘 화합물을 반응시켜 D-판토텐산 칼슘을 제조하는 것,

(c) D-판토락톤과 β-알라닌을 제2급 또는 제3급 아민의 존재 하에서 반응시키고, 얻어진 반응 혼합물에 산화칼슘을 더하여 D-판토텐산칼슘을 제조하는 것,

(d) D-판토락톤과 3-아미노프로판올을 축합시켜 D-판테놀을 제조하는 것,

(e) D-판토락톤과 γ-아미노프로피오니트릴과 반응시켜 D-판토테노니트릴로 하고, 또한 시스테아민을 반응시켜 2-(2-D-판토아미드에틸)-2-티아졸린으로 한 후, 가수분해하여 D-판테테인을 제조하는 것, 또는

(f) 상기 (e)공정에서 얻어진 D-판테테인을 과산화수소의 존재 하 축합시켜 판테틴을 제조하는 것을 특징으로 하는 상기〔37〕기재의 제조 방법;

〔39〕일반식 (III)으로 표시되는 화합물, 일반식 (I)로 표시되는 화합물, 판토텐산산, 판토텐산칼슘, 판테놀, 판테테인, 코엔자임A(CoA), 판토테닐에틸에테르, 판테틴 등의 D-판토락톤 유도체 또는 그의 염을 제조함에 있어서, 상기〔1〕∼〔4〕,〔7〕∼〔24〕,〔30〕,〔31〕,〔35〕및〔36〕중 어느 하나에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 그 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것, 혹은 상기〔27〕∼〔29〕중 어느 하나에 기재된 DNA를 사용하는 것이 제공된다.

본 발명은, 천연의 락토나아제 유전자를 이용하여, 효율적이고 또한 생산성이 우수한 상기 효소를 생산하는 시스템을 제작하는 기술을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 효소 및 상기 효소를 생산하는 시스템을 이용하여, 효율적이고 또한 보다 생산성이 우수한 광학 활성 γ-락톤 생산 시스템의 구축을 가능하게 한다.

본 발명에 의해, 비싼 분할제를 필요로 하지 않고, 또한 간단한 조작으로 공업적 생산에 알맞으며, 환경 상에도 문제가 적고, 그리고 효율이 좋은 방법으로 의약품 중간체로서 유용한, 또한 아미노산이나 판토텐산의 출발 원료인 광학 활성 γ-락톤 유도체를 제조할 수 있다. 광학 활성인 γ-락톤 유도체를 간편하게 또한 공업적으로 제조하는 방법이 제공된다. 또한, D-판토락톤 및 그 유도체, 예컨대, 판토텐산, 판토텐산칼슘, 판테놀, 판테테인, 코엔자임A(CoA), 판토테닐에틸에테르, 판테틴 또는 그의 염의 효율적 또한 경제적으로 우수한 제조가 가능해진다.

본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 그것이 갖는 관점은, 이하의 기재에서 당업자에 있어서는 명백할 것이다. 그러나, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본건 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 형태를 도시하는 것이고, 설명을 위해서만 도시되어 있는 것을 이해받고자 한다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위 내에서 여러 가지 변화 및/또는 개변(혹은 수식)을 이루는 것은, 이하의 기재 및 본 명세서의 그 밖의 부분으로부터의 지식에 의해, 당업자에는 용이하게 분명할 것이다. 본 명세서에서 인용되고 있는 모든 특허문헌 및 참고 문헌은, 설명의 목적으로 인용되어 있는 것으로, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 여기에 포함시키고 해석되어야 하는 것이다.

본 발명에서는 천연의 D-판토락톤 가수분해능을 갖는 락토나아제 효소, 예컨대, 푸사륨 옥시스포룸 유래의 야생형(천연형) 락토나아제(D-판토락톤 가수분해 효소) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 재조합 발현 기술 및 그 이용 기술을 제공한다. 상기 락토나아제를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 DNA를 이용하여 형질 전환시킨 숙주 세포의 작성 및 배양·증식, 상기 숙주 세포를 이용하는 상기 단백질의 제조, 나아가서 이들 단백질 및 숙주 세포의 용도 등이 제공된다. 또한 본 발명에서는 상기 락토나아제를 암호화하는 유전자를 이용하는 유용한 각종 수단이 제공되고, 또한 이렇게 해서 디자인된 발현 벡터 등을 이용하여 효율적으로 또한 보다 생산성이 우수한 D-판토락톤 생산 시스템이 제공된다.

본 발명은, D,L-판토락톤 중의 D-체를 선택적으로 비대칭 가수분해시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토나아제에 관한 것이고, NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 포함하고 있는 상기 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 유전자를 사용하여 형질 전환시키면, 얻어진 형질 전환체는 야생형 효소와 거의 동등한 분자량의 재조합 효소를 발현 생산할 뿐만 아니라, 얻어지는 효소 활성에 관해서도 그 안정성에 있어서 만족할 수 있는 것이라는 지견을 이용하는 기술이며, 그 락토나아제에 관해서 재조합 기술에 의해서도, 보다 높은 촉매능과 안정적인 효소 활성을 유지하는 형질 전환된 세포를 취득하여, 그것을 이용하는 기술에 관한 것이다.

본 발명은 D-판토락톤 가수분해 효소로서의 활성을 갖는 락토나아제의 미생물에서의 발현 및 분비 생산의 기술을 제공한다. 대표적으로는, 상기 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 유전자를, N 말단 시그날 펩티드 영역을 포함하는 형태로서, 실형상균, 예컨대 아스페르길루스속이나 아크레모늄속 등의 균에 도입하면, 얻어진 형질 전환체는 야생형 효소와 일치하는 분자량의 당쇄가 부가된 재조합 효소를 생산하고, 상기 효소는 DL-판토락톤 등의 γ-락톤류의 가수분해반응에 있어서, 당쇄 부가를 받지 않는 효소에 비교하여 효소 안정성이 우수하고, 또한 상기 형질 전환체 아스페르길루스 오리제 균주는 푸사륨 옥시스포룸에 비교하여 가수분해율도 향상되었다. 또한 아크레모늄 크리소게눔의 경우, 락토나아제를 균체 외 대량 분비 가능해지고, 효소 레벨(조효소, 정제 효소 또는 고정화 효소)에서의 DL-판토락톤 가수분해 반응이 가능해지는 등 우수한 것이었다.

본 발명에서 이용되는 유전자 재조합 기술은, 예컨대 T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.T.(1989); 일본생화학회편, 「속 생화학 실험 강좌 1, 유전자 연구법 II」, 동경화학동인(1986); 일본생화학회편, 「신생 화학 실험 강좌 2, 핵산 III(재조합 DNA 기술)」, 동경화학동인(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol.68, Academic Press, New York(1980); R. Wu et al. .ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 & 101, Academic Press, New York(1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 & 155, Academic Press, New York(1987) 등에 기재된 방법 혹은 거기에 인용된 문헌 기재의 방법 혹은 이들과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있다. 이들의 수법은 본 발명의 목적에 맞추어 공지의 수법에 독자의 개변 개량을 가한 것일 수도 있다.

본 명세서 중, 「폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)」또는「PCR」이란, 일반적으로, 미국 특허 제4,683,195호 명세서 등에 기재된 바와 같은 방법을 나타내고, 예컨대, 원하는 뉴클레오티드 서열을 인비트로로 효소적으로 증폭시키기 위한 방법을 나타내고 있다. 일반적으로, PCR법은, 주형 핵산과 우선적으로 하이브리드화할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 프라이머 신장 합성을 행하는 사이클을 반복 행하는 것을 포함하는 것이다. 전형적으로는, PCR법으로 이용되는 프라이머는, 주형 내부의 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 프라이머를 사용할 수 있고, 예컨대, 상기 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열과 그 양단에 있어서 상보적이거나, 혹은 상기 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열에 인접하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 5'단측의 프라이머로서는, 적어도 개시 코돈을 함유하거나, 혹은 상기 개시 코돈을 포함하여 증폭할 수 있도록 선택하고, 또한 3'단측의 프라이머로서는, 적어도 스톱 코돈을 함유하거나, 혹은 상기 스톱 코돈을 포함하여 증폭할 수 있도록 선택하는 것이 바람직하다. 프라이머는 바람직하게는 5개 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18∼25개의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

PCR 반응은 그 분야에서 공지의 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있지만, 예컨대 R. Saiki, et al., Science, 230:1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239:487, 1988; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed.,"DNA Cloning", 2nd ed., Vol.1,(The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York(1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford(1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988) 등에 기재된 방법 혹은 그것을 수식하거나 개변한 방법에 따라서 행할 수 있다. 또한, PCR 법은 그것에 알맞은 시판의 키트를 이용하여 행할 수 있고, 키트 제조 업자 혹은 키트 판매 업자에 의해 밝혀져 있는 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.

본 명세서 중, 「올리고뉴클레오티드」란, 비교적 짧은 단일쇄 또는 이중쇄의 폴리뉴클레오티드로, 바람직하게는 폴리데옥시뉴클레오티드를 들 수 있고, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734(1989)에 기재되어 있는 바와 같은 기지의 방법, 예컨대, 포스포트리에스테르법, 포스포디에스테르법, 포스파이트법, 포스포아미다이트법, 포스포네이트법 등의 방법에 의해 화학 합성될 수 있다. 통상 합성은, 수식된 고체 지지체 상에서 합성을 편리하게 행할 수 있는 것이 알려지고 있고, 예컨대, 자동화된 합성 장치를 이용하여 행할 수 있으며, 상기 장치는 시판되고 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 1개 또는 그 이상의 수식된 염기를 함유하고 있어 좋고, 예컨대, 이노신 등의 천연에 있어서는 보통이 아닌 염기 혹은 트리틸화된 염기 등을 함유하고 있어서 좋으며, 경우에 따라서는 마커가 첨부된 염기를 함유하고 있어서 좋다.

소정의 핵산을 동정하거나 하기 위해서는, 하이브리드화 기술을 이용할 수 있다. 상기 하이브리드화는, 상기「유전자 재조합 기술」을 개시하는 문헌 기재의 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, 하이브리드화는, DNA 등의 핵산을 함유하고 있는 샘플을 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체에 전사시키고, 필요에 따라 변성 처리, 고정화 처리, 세정 처리 등을 실시한 후, 그 담체(예컨대, 막 등)에 전사시킨 것을 필요에 따라 변성시킨 표식 프로브 DNA 단편과, 하이브리드화용 완충액 중에서 반응시켜 행해진다.

하이브리드화 처리는, 보통 약 35∼약 80℃, 보다 적합하게는 약 50∼약 65℃에서, 약 15분간∼약 36시간, 보다 적합하게는 약1∼약24시간 행해지지만, 적절하게 최적의 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대, 하이브리드화 처리는, 약 55℃에서 약 18시간 행해진다. 하이브리드화용 완충액으로서는, 그 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있고, 예컨대, 래피드 하이브리드화 완충액(Rapid hybridization buffer, Amersham사) 등을 이용할 수 있다. 전사한 담체(예컨대, 막 등)의 변성 처리로서는, 알칼리 변성액을 사용하는 방법을 들 수 있고, 그 처리후 중화액이나 완충액으로 처리하는 것이 바람직하다. 또한 담체(예컨대, 막 등)의 고정화 처리로서는, 보통 약 40∼약 100℃, 보다 적합하게는 약 70∼약 90℃에서 약 15분간∼약 24시간, 보다 적합하게는 약 1∼약 4시간 베이킹함으로써 행해지지만, 적절하게 바람직한 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대, 필터 등의 담체를 약 80℃에서 약 2시간 베이킹함으로써 고정화가 행해진다. 전사한 담체(예컨대, 막 등)의 세정 처리로서는, 그 분야에서 보통 사용되는 세정액, 예컨대 1M NaCl, 1mM EDTA 및 0.1% 소디엄 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 함유 50Mm Tris-HCl 완충액, pH8.0 등으로 세정함으로써 행할 수 있다. 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체로서는, 상기 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있다.

상기 알칼리 변성액, 중화액, 완충액으로서는, 그 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있고, 알칼리 변성액으로서는, 예컨대, 0.5M NaOH 및 1.5M NaCl을 함유하는 액 등을 예를 들 수 있고, 중화액으로서는, 예컨대, 1.5M NaCl 함유 0.5M Tris-HCl 완충액, pH8.0 등을 예를 들 수 있으며, 완충액으로서는 예컨대, 2×SSPE(0.36M NaCl, 20mM NaH₂PO₄ 및 2mM EDTA) 등을 예로 들 수 있다. 또한 하이브리드화 처리에 앞서서, 비특이적인 하이브리드화 반응을 막기 위해서, 필요에 따라서 전사한 담체(예컨대, 막 등)는 프리하이브리드화 처리하는 것이 바람직하다. 이 프리하이브리드화 처리는, 예컨대, 프리하이브리드화 용액[50% 포름아미드, 5×Denhardt's 용액 (0.2% 소혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐 피롤리돈), 5×SSPE, 0.1% SDS, 100㎍/m1 열변성 연어 정자 DNA] 등에 침지하여 약 35∼약 50℃, 바람직하게는 약 42℃에서, 약 4∼약 24시간, 바람직하게는 약 6∼약 8시간 반응시킴으로써 행할 수 있지만, 이러한 조건은 당업자라면 적절하게 실험을 반복하여, 보다 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 하이브리드화에 이용하는 표식 프로브 DNA 단편의 변성은, 예컨대, 약 70∼약 100℃, 바람직하게는 약 100℃에서 행하고, 약 1∼약 60분간, 바람직하게는 약 5분간 가열하는 등 하여 행할 수 있다. 한편, 하이브리드화는 그 자체 공지의 방법 혹은 그것에 준하는 방법으로 행할 수 있지만, 본 명세서에서 엄중한 조건이란, 예컨대 나트륨 농도에 관하여 약 15∼약 50mM, 바람직하게는 약 19∼약 40mM, 보다 바람직하게는 약 19∼약 20mM이고, 온도에 관해서는 약 35∼약 85℃, 바람직하게는 약 50∼약 70℃, 보다 바람직하게는 약 60∼약 65℃의 조건을 나타낸다.

하이브리드화 완료 후, 필터 등의 담체를 충분히 세정 처리하여, 특이적인 하이브리드화 반응을 한 표식 프로브 DNA 단편 이외의 표식 프로브를 제거하는 등 한 후에 검출 처리를 할 수 있다. 필터 등의 담체의 세정 처리는, 그 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용하여 행할 수 있고, 예컨대, 0.1% SDS 함유 0.5×SSC(0.15M NaCl, 15mM 시트르산) 용액 등으로 세정함으로써 실시할 수 있다.

하이브리드화된 핵산은, 대표적으로는 오토라디오그래피에 의해 검출할 수 있지만, 그 분야에서 이용되는 방법 중에서 적절하게 선택하여 검출에 이용할 수도 있다. 검출한 시그날에 해당하는 핵산 밴드를, 적절한 완충액, 예컨대, SM 용액(100mM NaCl 및 10mM MgSO₄ 함유 50mM Tris-HCl 완충액, pH7.5) 등에 현탁하고, 이어서 이 현탁액을 적절히 희석하여 소정의 핵산을 단리·정제, 그리고 더욱 증폭 처리에 가할 수 있다.

하이브리드화 처리에 의해 유전자 라이브러리나 cDNA 라이브러리 등을 포함한 핵산 샘플로부터 목적 핵산을 스크리닝하는 처리는, 반복하여 행할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 상기 락토나아제는, 예컨대, 푸사륨속, 실린드로카르폰속, 제베렐라속, 아스페르길루스속, 페니실리움속, 리조푸스속, 볼테라속, 글리오크라듐속, 유로튬속, 넥토리아속, 시조피람속, 미로세슘속, 뉴로스포라속, 아크레모늄속, 튜벨크리너속, 아브시디아속, 스포로스릭스속, 바티실륨속 또는 아르스로다마속에 속하는 미생물 등에서 얻을 수 있다. 대표적인 것으로서는, 예컨대 푸사륨 옥시스포룸 IF0 5942, 푸사륨 세미테크탐 IF0 30200, 실린드로카르폰 톤키넨스 IF0 30561, 제베렐라 푸지쿠로이 IF0 6349, 아스페르길루스 오리제 ATCC 91002, 아스페르길루스 오리제 IF0 5240, 아스페르길루스 아와모리 IF0 4033, 페니실리움 크리소게눔 IF0 4626, 리조푸스 오리자에 IF0 4706, 볼테라 부쿠시 IF0 6003, 글리오크라듐 카테누라탐 IF0 6121, 유로튬 시에바리에리 IF0 4334, 넥토리아 엘레강스 IF0 7187, 시조피람 콤네 IF0 4928, 미로세슘 로리담 IF0 9531, 뉴로스포라 쿠라쯔사 IF0 6067, 아크레모늄 프시디오이데스 IF0 6813, 튜벨크리너 펠시시나 IF0 6464, 아브시디아 리히세이미 IF0 4009, 스포로스릭스 시엔키 IF0 5983, 바티실륨 말토우세이 IF0 6624, 또는 아르스로다마 운시나트움 IF0 7865 등을 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 그 락토나아제를 암호화하는 유전자는, W0, A, 97/10341; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1 2787-92, 1998에 준하여 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 예컨대, 배양한 푸사륨 옥시스포룸의 균체를 파쇄하고, 통상법에 의해 염색체 DNA를 원심 분리 후, RNA를 분해 제거하여, 단백 제거 조작을 행하여 DNA 성분을 정제한다. 이들의 조작에 대해서는 「식물 바이오 테크놀로지 실험 매뉴얼: 농촌문화사, 252페이지」를 참조하여 행할 수 있다. 마찬가지로, 파쇄한 균체로부터, AGPC법에 따라서 전체 RNA를 추출하고, 여기에서 적당한 방법, 예컨대 올리고 dT 셀룰로오스 칼럼을 이용하여 mRNA를 정제하고, 이어서 얻어진 mRNA를 주형으로 하여 역전사 효소(리버스 트랜스크립타아제) 등을 이용하여 cDNA를 합성해도 좋다. 또한, 이미 구축된 유전자 라이브러리를 사용하고, 적당한 프라이머를 사용하여 PCR법, 역전사 PCR(polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR)법으로 얻을 수 있다. 이미 얻어져 있는 락토나아제 유전자를 프로브로서 이용하여 얻을 수도 있다. 프로브 등을 방사성 동위체 등에 의해서 표식하기 위해서는, 시판의 표식 키트 , 예컨대 랜덤 프라임 DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim사) 등을 사용하여 행할 수 있다. 예컨대, 랜덤-프라이밍 키트(Pharmacia LKB사, Uppsala) 등을 사용하여, 프로브용 DNA를 [α^-3P]dCTP(Amersham사) 등으로 표식하여 방사 활성을 갖는 프로브를 얻을 수 있다.

소정의 핵산을 보유하는 퍼지 입자, 재조합 플러스미드, 재조합 벡터 등은, 그 분야에서 보통으로 사용되는 방법으로 그것을 정제 분리할 수 있고, 예를 들어, 글리세롤 글라디언트 초원심 분리법(Molecular Cloning, alaboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989), 전기 영동법 등에 의해 정제할 수 있다. 퍼지 입자 등으로부터는, 그 분야에서 보통으로 사용되는 방법으로 DNA를 정제 분리할 수 있고, 예컨대, 얻어진 퍼지 등을 TM 용액(10mM MgSO₄ 함유 50mM Tris-HCl 환충액, pH7.8) 등에 현탁하고, DNase I 및 RNase A 등으로 처리 후, 20mM EDTA, 50㎍/ml 프로티나아제 K 및 0.5% SDS 혼합액 등을 가하여, 약 65℃, 약 1시간 보온한 후, 이것을 페놀 추출 디에틸에테르 추출 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시키고, 다음에 얻어진 DNA를 70% 에탄올로 세정후 건조하고, TE 용액(10mM EDTA 함유 10mAl Tris-HCl 완충액, pH8.0)에 용해하는 등 하여 얻어진다. 또한, 목적으로 하고 있는 DNA는, 서브 클로닝 등에 의해 대량으로 얻는 것도 가능하고, 예컨대 서브 클로닝은, 숙주로서 대장균을 이용하여 플러스미드 벡터 등을 이용하여 행할 수 있다. 이러한 서브 클로닝에 의해 얻어진 DNA도, 상기와 동일하게 하여 원심 분리, 페놀 추출, 에탄올 침전 등의 방법에 의해 정제 분리할 수 있다. 염기 서열의 결정은, 다이데옥시법, 예컨대 M13 다이데옥시법 등, Maxam-Gilbert법 등을 이용하여 행할 수 있지만, 시판의 시퀀싱 키트 예컨대, Taq 다이프라이머 사이클 시퀀싱 키트 등을 이용하거나, 자동 염기 서열 결정 장치, 예컨대 형광 DNA 시퀀서 장치 등을 이용하여 행할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 핵산(또는 폴리뉴클레오티드)은 단일쇄 DNA, 이중쇄 DNA, RNA, DNA: RNA 하이브리드, 합성 DNA 등의 핵산이며, 또한 게놈 DNA(염색체 유전자 DNA), 게놈 DNA 라이브러리, cDNA, 합성 DNA 중 어느 하나라도 좋다. 핵산의 염기 서열은, 수식(예컨대, 부가, 제거, 치환 등)되는 것도 가능하고, 그러한 수식된 것도 포함되어 좋다. 핵산은 본 발명에서 기재하는 펩티드 혹은 그 일부를 암호화하는 것으로 좋고, 바람직한 것으로서는 DNA를 들 수 있다. 핵산은 화학 합성에 의해서 얻는 것도 가능하다. 그 경우 단편을 화학 합성하고, 이들을 효소에 의해 결합함에 의해도 좋다.

본 명세서에 있어서, 얻어진 PCR 산물 등의 핵산(DNA를 포함함)은 통상 1∼2% 아가로스겔 전기 영동에 가하고, 특이한 밴드로서 겔로부터 추출하며, 예컨대, gene clean kit(Bio 101) 등의 시판의 추출 키트를 이용하여 추출한다. 추출된 DNA는 적당한 제한 효소로 절단하여, 필요에 따라 정제 처리하거나, 나아가서 필요에 따라 5' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 등에 의해 인산화한 후, pUC18 등의 pUC계 벡터로 한 적당한 플러스미드 벡터에 라이게이션하여, 적당한 컨피던트 세포를 형질 전환한다. 클로닝된 PCR 산물은 그 염기 서열을 해석해서 좋다. PCR 산물의 클로닝에는, 예컨대, p-Direct(Clontech사), pCR-Script^TM SK(+)(Stratagene사), pGEM-T(Promega사), pAmp^TM(Gibco-BRL사) 등의 시판의 플러스미드 벡터를 이용할 수 있다. 숙주 세포의 형질 전환을 하기 위해서는, 예컨대 퍼지 벡터를 사용하거나, 칼슘법, 루비듐/칼슘법, 칼슘/망간법, TFB 고효율법, FSB 동결 컨피던트 세포법, 신속 콜로니법, 일렉트로포레이션 등 그 분야에서 알려진 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있다(D. Hanahan, J. Mol. Bio1., 166:557, 1983 등).

그 플러스미드의 서열 내에는, 예컨대 선택한 숙주 세포로 발현되기에 적합한 코돈을 도입하는 것이나, 제한 효소 부위를 설치하는 것도 가능하다. 또한, 목적으로 하는 유전자의 발현을 쉽게 하기 위한 제어 서열, 촉진 서열 등, 목적으로 하는 유전자를 결합하기에 도움이 되는 링커, 어댑터 등, 나아가서는 항생 물질 내성 등을 제어하거나 대사를 제어하거나 하여, 선별 등에 유용한 서열 등을 포함시키는 것이 가능하다.

대장균을 숙주로 하는 플러스미드로서는, 예컨대 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KS^TM(Stratagene) 등을 들 수 있다. 대장균에서의 발현에 적합한 플러스미드 벡터로서는, pAS, pKK223(Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30 등도 들 수 있다.

숙주 세포로서는, 대장균의 경우, 예컨대 대장균 K12주에 유래하는 것을 들 수 있고, 예컨대 NM533XL1-Blue, C600, DH1, HB101, JM109 등을 들 수 있다. 본 발명의 유전자 공학적 수법에 있어서는 상기 분야에서 알려진 혹은 범용되어 있는 제한 효소, 역전사 효소, DNA 단편을 클론화하기에 적합한 구조로 수식하거나 혹은 변환하기 위한 효소인 DNA 수식·분해 효소, DNA 폴리멜라아제, 말단 뉴클레오티드트랜스페라아제, DNA 리가아제 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 락토나아제는 융합 단백질로서 발현시키고, 생체 내 혹은 생체 외에서 야생형 효소와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것으로 변환·가공해도 좋다. 또한, 유전자 공학적으로 상용되는 융합 생산법을 이용할 수 있지만, 이러한 융합 단백질은 그 융합부를 이용하여 어피니티 크로마토그래피 등으로 정제하는 것도 가능하다. 단백질의 구조의 수식·개변 등은, 예컨대 합성 올리고 뉴클레오티드 등을 이용하는 위치 지정 변이 도입법(부위 특이적 변이 도입법) 혹은 PCR을 사용하는 등 그 분야에서 널리 알려진 방법으로 행할 수 있다.

본 발명에서는 그 락토나아제를 발현하는 형질 전환체를 제작하기 위해, 상기 락토나아제 및 시그날 펩티드를 암호화하는 DNA가 구축되어 적합하게 이용된다. 상기 락토나아제를 암호화하는 DNA는, 푸사륨속 실형상균 유래의 것을 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 재조합 락토나아제 발현용 염기 서열은, 예컨대 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 DNA 서열 및 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 것. 또한, 상기 재조합 락토나아제 발현용 염기 서열은, (a)푸사륨속 실형상균 유래 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 cDNA 서열 또는 염색체 유전자 DNA 서열과 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 것일 수 있다.

바람직한 예로서는, 상기 푸사륨속 실형상균 유래 락토나아제와 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 서열을 갖는 서열은, 적절한 발현용 벡터 내에 삽입할 수 있다. 상기 발현용 벡터로서는, 실형상균의 인핸서 염기 서열의 1개 또는 복수개를 갖는 것, 푸사륨(Fusarium)속 실형상균이 생산하는 알칼리프로테아제(Alp)의 발현에 따흔 프로모터 영역을 갖는 것, 실형상균의 인핸서 염기 서열의 1개 또는 복수개를 실형상균으로 기능하는 프로모터 영역에 도입한 것, 시그날 펩티드 영역이 상기 Alp의 분비에 따른 시그날 서열 영역 또는 상기 락토나아제의 시그날 서열 영역이도록 구성할 수 있는 것 등을 들 수 있다.

실형상균에서의 발현에 적합한 발현용 벡터로서는, 아스페르길루스 오리제의 α-글루코시다아제 유전자(agdA) 프로모터 상의 인핸서 서열과 프로모터 영역을 갖는 것을 들 수 있다. 상기 인핸서 서열을 도입하는 프로모터로서는, 실형상균에 있어서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 α-아밀라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 셀로비오하이드라아제, 아세트아미다아제 등의 가수분해 효소 유전자, 3-포스포글리세레이트키나아제, 글리셀알데히드-3-포스페이트데히드로게나아제, 알코올데히드로게나아제, 에놀라아제 등의 해당계 효소 유전자의 프로모터를 들 수 있다.

적합한 프로모터는, 아스페르길루스속의 α-아밀라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제가 유전자로부터 단리할 수 있다. 보다 적합하게는 아스페르길루스 오리제의 α-글루코시다아제 유전자의 프로모터를 들 수 있다. 그 프로모터는, 부분 서열이라도 실형상균에서의 프로모터로서의 기능을 갖는 한 포함된다. 또한, 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 발현 플러스미드는, 상술과 같이 개량된 실형상균으로 기능하는 프로모터와, 터미네이터를 가지고, 숙주의 형질 전환체의 선택에 적합한 마커 유전자를 가지며, 대장균으로 복제 가능한 DNA 영역을 갖는 것이다. 그 인핸서 서열의 프로모터로의 도입 부위는, 프로모터 영역이면 특별히 제한되는 것이 아니다. 터미네이터는 실형상균에 있어서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 아스페르길루스 오리제의 α-글루코시다아제 유전자의 터미네이터, 혹은, 그 부분 서열을 포함하는 터미네이터가 보다 적합하게 이용된다. 바람직한 선택 마커로서는, 질산 환원 효소(niaD), 오르니틴카르바모일 트랜스페라제(argB), 트립토판신타아제(trpC), 아세트아미다아제(amdS)의 유전자를 들 수 있다. 보다 적합한 선택 마커 유전자는, 질산 환원 효소 유전자(niaD)이다. 이들의 플러스미드는 프로모터와 터미네이터 사이에 설치된 제한 효소 인식 사이트를 이용하여, 본 발명의 발현시킬 목적의 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 삽입한다.

사용하기에 적합한 발현용 벡터로서는, 예컨대 일본 특허 공개 공보 평09-9968호, 일본 특허 공개 공보 평5-268972호 등에 개시된 것, 혹은 그로부터 공지된 기술로 유도된 것을 들 수 있다. 예컨대, 플러스미드 pNLH2, pNAN8142 등을 적합하게 사용할 수 있다. 유전자를 연결하는 경우, 유전자 사이에 아답터 DNA로서 합성 DNA를 이용할 수도 있다. 상기 합성 DNA로서는, 양 유전자의 프레임이 일치하여, 목적으로 하는 유전자의 활성이 잃어지지 않는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예컨대, AP 아제 유전자 프로모터와, 번역 개시 부위 및/또는 분비 시그날을 이용한 목적 유전자의 발현은, 상기 AP 아제 유전자 유래 부위와 목적으로 하는 유전자의 프레임이 일치하도록 융합 유전자를 제작함으로써 행해진다. AP 아제의 분비 시그날을 번역 개시 코돈의 하류에 프레임을 합쳐서 연결함으로써 목적 물질을 균체 외에 분비 생산시킬 수 있다. 프로모터의 기능이 잃어지지 않는 한은, 일부의 DNA 단편을 결실시켜도 지장이 없다. 또한, 프로모터 및 번역 개시 부위의 기능을 변화시키도록, 예컨대, 발현력이 증가하도록 프로모터 및 번역 개시 부위를 포함하는 영역의 DNA 염기 서열을 개변한 것이라도 바람직하게 이용할 수 있고, 프로모터 및 번역 개시 부위의 기능에 관계하지 않는 영역의 DNA 염기 서열을 개변시켜 이용하는 것도 가능하다.

이상과 같이 하여 구축된 목적 유전자를 도입하기 위한 숙주로서는, 그 유전자가 작동, 발현되는 생물이면 어떠한 것이라도 좋다. 대표적인 숙주로서는, 예컨대, 효모, 실형상균, 식물 등의 진핵 생물에서 적절하게 선택되어 좋다. 예컨대, 푸사륨속, 실린드로카르폰속, 제베렐라속, 아스페르길루스속, 페니실리움속, 리조푸스속, 볼테라속, 글리오크라듐속, 유로튬속, 넥토리아속, 시조피람속, 미로세슘속, 뉴로스포라속, 아크레모늄속, 튜벨크리너속, 아브시디아속, 스포로스릭스속, 바티실륨속 또는 아르스로다마속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

대표적인 것으로서는, 예컨대 푸사륨 옥시스포룸 IF0 5942, 푸사륨 세미테크탐 IF0 30200, 실린드로카르폰 톤키넨스 IF0 30561, 제베렐라 푸지쿠로이 IF0 6349, 아스페르길루스 오리제 ATCC 91002, 아스페르길루스 오리제 IF0 5240, 아스페르길루스 아와모리 IF0 4033, 페니실리움 크리소게눔 IF0 4626, 리조푸스 오리자에 IF0 4706, 볼테라 부쿠시 IF0 6003, 글리오크라듐 카테누라탐 IF0 6121, 유로튬 시에바리에리 IF0 4334, 넥토리아 엘레강스 IF0 7187, 시조피람 콤네 IF0 4928, 미로세슘 로리담 IF0 9531, 뉴로스포라 쿠라쯔사 IF0 6067, 아크레모늄 프시디오이데스 IF0 6813, 튜벨크리너 펠시시나 IF0 6464, 아브시디아 리히세이미 IF0 4009, 스포로스릭스 시엔키 IF0 5983, 바티실륨 말토우세이 IF0 6624, 또는 아르스로다마 운시나트움 IF0 7865 등을 들 수 있다.

또한, AP 아제 유전자의 프로모터를 가지고 있고, 또한 번역 개시 부위 및/또는 분비 시그날을 암호화하는 영역의 하류에 연결한 목적 락토나아제 유전자를 갖는 벡터를 도입하기 위한 숙주로서는, 그 유전자가 작동, 발현되는 생물이면 어떠한 것이라도 좋다. 바람직하게는, 예컨대 효모, 실형상균 등의 진핵 미생물에서 적절하게 선택된다. 구체적으로는, 효모균으로서, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 피치아(Pichia)속균 등이다. 보다 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 등을 예를 들 수 있다. 또한 실형상균으로서는, 아크레모늄(Acremonium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 푸사륨(Fusarium)속, 페니실리움(Penicillium)속, 뮤코(Mucor)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 트리코에르마(Trichoderma)속균 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사륨 세미테크탐(Fusarium semitectum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 뮤코 자바니커스(Mucor javanicus), 뉴로스포라 쿠라쯔사(Neurospora crassa), 트리코에르마 비리데(Trichoderma viridae) 등을 예를 들 수 있다. 이들 중에서 특히 아크레모늄 크리소게눔이 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시아 AH22R-, 아크레모늄 크리소게눔 ATCC11550주, ATCC14553주, 아스페르길루스 오리제 IFO5240, 아스페르길루스 아와모리 IF04033, 푸사륨 옥시스포룸 IF05942, 푸사륨 세미테크탐 IF030200, 뮤코 자바니커스 IF04570, 트리코에르마 비리데 IF031137 등을 예를 들 수 있다. 이들 중에서 특히 아크레모늄 크리소게눔 ATCC11550주 등을 예로 들 수 있다.

이들 숙주에 유전자를 도입하는 형질 전환법으로서는, 예컨대 프로토플라스트(protoplast) 형질 전환법 등을 들 수 있다. 예컨대, 적당한 세포벽 용해 효소를 이용하여 조제한 프로토플라스트화한 세포에, 염화칼슘, 폴리에틸렌글리콜 등의 존재 하에 DNA를 접촉시키는 등의 방법으로 형질 전환을 할 수 있다. 또한, 형질 전환법으로서는, 일렉트로포레이션법(예컨대, E. Neumanne et al.,"EMBO J", Vol.1, pp.841(1982) 등), 마이크로 인젝션법, 유전자총에 의해 주입하는 방법 등을 들 수 있다.

형질 전환된 세포를 효율적으로 분리하기 위해서는, 숙주 내에서 기능하는 적절한 선택 마커 유전자를 갖는 플러스미드에 상기 융합 유전자를 삽입한 후, 상기 플러스미드로 숙주를 형질 전환해도 좋다. 상기 선택 마커 유전자로서는, 형질 전환된 세포를 선택적으로 분리할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용 가능하다. 대표적인 것으로서는, 예컨대 하이글로마이신B 내성 유전자 등을 예를 들 수 있다. 보통, 숙주는 선정된 선택 마커에 관한 기능적 유전자를 가지고 있지 않은 주를 이용해야 한다.

본 발명에서 얻어지는 형질 전환된 세포를 배양하는 경우의 각종 조건은, 사용하는 균주 등 세포의 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로는 배지에 관해서는 상기 형질 전환 세포가 동화되거나, 자화하는 것이 가능한 탄소원이나 질소원 등을 함유하는 배지를 사용한다. 탄소원으로서는, 상기 형질 전환 세포가 동화하거나, 자화할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 예컨대, 글루코오스, 수크로오스, 전분, 가용성 전분, 덱스트린 등의 당류, 파라핀류 등을 들 수 있고, 또한 아세트산, 시트르산, 부티르산, 푸마르산, 안식향산 등의 유기산류, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 글리세린 등의 알코올류, 올레인산, 스테아르산 등의 지방산 및 그 에스테르류, 대두유, 채종유, 라드유 등의 유지류 등을 들 수 있고, 이들은 단독 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 질소원으로서는, 자화할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 예컨대, 황산암모늄, 질산암모늄 등의 암모늄 염류, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염류, 요소, 펩톤, 카사미노산, 콘스테이-프리카, 콘글루텐밀, 밀기울, 효모엑기스, 건조효모, 대두가루, 면실가루, 고기 엑기스, 그 밖의 유기 또는 무기의 질소 함유물 등을 들 수 있고, 이들은 단독 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 배지에는, 무기 염류, 미네랄, 비타민, 미량 금속염 등의 영양소를 임의로 적절하게 가할 수도 있다. 무기 염류로서는, 황산마그네슘, 염화나트륨, 탄산칼슘, 인산 일수소칼륨, 인산 이수소칼륨 등의 인산염류, 망간염류 등을 들 수 있고, 다른 영양원으로서 맥아 엑기스 등도 들 수 있다. 그 밖에, 상기 분야에서 일반적으로 사용되는 것을 적절하게 선택하여 이용할 수 있다.

배양은 호기 조건 하에서 심부 배양하는 것이 일반적으로 유리하고, 호기적으로 행하는 경우, 통상, 배양 시간 1∼20일 정도이며, 바람직하게는 3∼14일 정도이며, 더욱 바람직하게는 3∼10일 정도로, 배지의 pH3∼9, 배양 온도, 10∼50℃에서 행한다.

본 발명에서 얻어지는 형질 전환된 세포에 의해 생산되는 효소는, 각종 원료, 예컨대 세포 배양액, 세포 배양 파쇄물 등을 포함한, 형질 전환체 세포 등의 효소 생산 재료로부터, 종래 공지의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 예컨대, 배지 중에 축적된 경우에는, 원심 분리 또는 여과에 의해서 목적 물질을 포함하는 상청액을 얻는다. 한편, 목적 물질이 균체 등 세포 중에 축적되는 경우에는, 배양 후, 원심 분리 또는 여과 등의 공지의 방법으로 균체 등을 모아, 균체를 염산 구아니딘 등의 단백질 변성제를 포함하는 완충액에 현탁하고, 찬 곳에서 교반한 후 원심 분리 등에 의해 목적 물질의 단백질을 포함하는 상청액을 얻거나, 균체를 완충액에 현탁한 후, 글래스 비드에 의한 분쇄, 프렌치 프레스, 초음파 처리 혹은 효소 처리 등으로 세포를 파쇄한 후 원심 분리 등에 의해 상청액을 얻는 등의 방법이 적절하게 이용된다.

상기 상청액으로부터 목적 단백질을 분리·정제하기 위해서는, 자체 공지의 분리·정제조 방법을 적절히 조합하여 행할 수 있고, 예컨대 황산암모늄 침전법 등의 염석, 에탄올을 사용하는 등의 용매 침전법, 세파덱스 등에 의한 겔여과법, 예컨대 디에틸아미노에틸기 혹은 카르복시메틸기 등의 염기성기 혹은 산성기를 갖는 담체 등을 이용한 이온 교환 크로마토그래피법, 예컨대 부틸기, 옥틸기, 페닐기 등 소수성기를 갖는 담체 등을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 색소 겔크로마토그래피법, 전기 영동법, 투석, 한외 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 고속액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제하여 얻을 수 있다. 또한 봉입체로서 얻어진 경우에는, 가용화 처리, 예컨대, 염산 구아니딘, 요소라는 변성제, 나아가서는 필요에 따라 2-머캅토 에탄올, 디티오슬레이톨 등의 환원제 존재 하에서 처리하여 활성형 효소로 할 수도 있다.

효소로서는 효소 생산 세포를 그대로 이용할 수 있다. 고정화 효소로서는, 그 분야에서 알려진 방법으로 효소 또는 효소 생산 세포 등을 고정화한 것을 들 수 있고, 공유 결합법이나 흡착법이라는 담체 결합법, 가교법, 포괄법 등에 의해 고정화할 수 있다. 또한, 미생물 균체의 알긴산겔로의 고정화도 적합하게 이용할 수 있다. 예컨대 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소시아네이트 등의 축합제를 필요에 따라서 사용하여 고정화할 수 있다. 또한 모노머를 중합 반응으로 겔화시켜 행하는 모노머법, 통상의 모노머보다도 큰 분자를 중합시키는 프리폴리머법, 폴리머를 겔화시켜 행하는 폴리머법 등을 들 수 있고, 폴리아크릴아미드를 이용한 고정화, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴, 한천, κ-칼라기난 등의 천연 고분자를 이용한 고정화, 광경화성수지, 우레탄폴리머 등의 합성 고분자를 이용한 고정화 등을 들 수 있다. 효소나 미생물 균체의 고정화 기술 및 그 이용은, 예컨대 센타 이치로 편「고정화 효소」, p75, 코단샤 사이언티픽(,1975년); 센타 이치로 편「고정화 생체 촉매」, p67, 코단샤 사이언티픽(1986년); 스즈키 토모오 감수「미생물 공학 기술 핸드북」,아사쿠라 쇼텐(1990년 5월); 이마나카 다카유키 편「Maruzen Advanced Technology <생물공학 편> 미생물 공학」, p180∼194, 마루젠 주식회사(1993년 9월30일), 일본생화학회 편「신생 화학 실험 강좌 13 생물 공학」, p50∼54, 동경화학동인(ISBN: 4-8079-1079-5) 등에 기재된 방법 혹은 거기에 인용된 문헌 기재의 방법 혹은 이들과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있다. 이들의 수법은, 본 발명의 목적에 맞추어 공지의 수법으로 독자의 개변 개량을 가한 것일 수도 있다. 미생물의 배양, 효소를 이용한 D-판토락톤 가수분해를 비롯한 락톤 가수분해 효소 이용의 효소적 비대칭 가수분해에 의한 락톤계 화합물의 광학 분할 반응 및 생성물의 처리는 일본 특허 공개 공보 평3-65198호 및 일본 특허 공개 공보 평4-144681호에 기재와 같이 하여 행할 수 있다.

예컨대, 액체 배지로 진탕 배양한 형질 전환균을 집균하고, 얻어진 균체에 D, L-판토락톤 수용액(2∼60% 농도)을 가하여 pH를 6∼8로 조정하면서 온도 10∼40℃에서 수시간 내지 1일 반응시킨다. 반응 종료 후, 균체를 분리하여 반응액 중 미반응 L-판토락톤을 유기 용매(아세트산에틸과 같은 에스테르류, 벤젠과 같은 방향족탄화수소류, 클로로포름과 같은 할로겐화탄화수소 등이 바람직함)를 이용하여 추출 분리한다. 수층에 잔존하고 있는 D-판토인산을 염산 산성 하, 가열함으로써 락톤화를 행하고, 상기한 유기 용매로 추출함으로써 생성한 D-판토락톤을 얻을 수 있다.

이리하여, 본 발명에서는 일반식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 푸사륨속 실형상균 유래 락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 또는 그것을 삽입한 벡터를 도입한 락토나아제 생산 형질 전환체의 배양물, 그 세포 또는 세포 처리물 및 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 등에 접촉시키고, 일반식 (II)로 표시되는 S체의 미가수분해물 또는 그 염을 반응계에서 분리함으로써, 또한 얻어진 일반식 (III)으로 표시되는 가수분해물 또는 그 염은 다음에 락톤화를 행함으로써 일반식 (IV) 또는 그 염으로 변환함으로써, 효율적인 광학 활성인 γ-락톤 유도체 또는 그 염의 제조법이 제공되는 것이다.

본 발명에 있어서는, 상기과 같이 하여 얻어진 형질 전환체, 특히 형질 전환된 미생물이, 바람직하게 일반식 (I)의 화합물을 R체 선택적으로 비대칭 가수분해하기에 사용되고, 공업적으로 일반식 (II)의 화합물 또는 일반식 (III)의 화합물을 거쳐 일반식 (IV)의 화합물을 제조하기 위해 사용된다. 예를 들면, 이하의 반응식으로 나타낼 수 있다.

(*은 광학 활성 탄소를 나타내고, R은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내며, R¹ 및 R²는 각각 동일 또는 상이하고, 서로 독립되어 수소 또는 저급 알킬기를 나타냄)

R¹ 및 R²의 저급 알킬기로서는, 직쇄형 혹은 분지형상의 탄소수 1∼5개의 알킬기를 들 수 있고, 예컨대 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, t-부틸기 등을 들 수 있다. 대표적으로는, R이 히드록실기이고, R¹ 및 R²이 모두 메틸기인 것으로, 그 경우 일반식 (I)의 라세미 판토락톤 또는 그 염에서 광학 활성한 판토락톤 또는 그 염, 예컨대 일반식 (IV)의 D-판토락톤 또는 그 염, 혹은 일반식 (II)의 L-판토락톤 또는 그 염을 제조할 수 있다.

본 제조법에 있어서, 사용하는 형질 전환체, 특히 형질 전환된 미생물은, 액체 배지에 균체를 배양하여 얻어진 배양물, 배양액에서 분리된 균체, 혹은 균체 또는 배양물을 처리하여 얻어지는 건조 균체, 혹은 고정화 균체 등 모든 형태의 것도 사용할 수 있고, 또한 상기 형질 전환체에서 단리된 효소는 그것을 조제한 것도, 정제한 것도, 또한 고정화된 것의 모든 형태의 것도 이용할 수 있다.

조작의 회분식, 반회분식, 또는 연속식의 모두를 행할 수 있다. 사용하는 γ-락톤의 농도는 통상 100∼500g/L이다. 반응 온도는 통상, 10∼50℃이지만, 보다 바람직하게는 20∼30℃이다. 반응 시간은 회분식의 경우, 통상 수시간에서 1일 동안이다. 반응계의 pH는 통상, 3∼9 정도이지만 보다 바람직하게는 6∼8이다.

형질 전환체 미생물에 의한 일반식 (I)의 선택적 비대칭 가수분해의 결과, 일반식 (III)의 화합물이 생성되고, 반응액의 pH가 저하됨과 동시에, 반응 속도도 저하된다. 반응 속도를 크게 하기 위해서, 반응액의 pH를 각 미생물의 락톤 가수분해 효소의 최적 pH로 유지하는 것이 바람직하다. 그 때, pH를 유지하기 위한 무기염으로서, 알칼리 금속 또는 알칼리토류 금속의 수산화물 또는 탄산염 외에, 암모니아수 등이 이용된다.

반응 종료 후, 가수분해를 받고 있지 않은 반응액 중 일반식 (II)의 화합물을 유기 용매에 의한 추출 등의 조작에 의해 분리한다. 유기 용매로서는, 염화에틸렌, 클로로포름, 토리클로로에탄과 같은 할로겐계 탄화수소, 벤젠, 톨루엔과 같은 방향족계 탄화수소, 디에틸에테르, t-부틸메틸에테르와 같은 에테르류 외에, 아세트산에틸 등이 이용되고, 보다 바람직하게는 아세트산에틸이다.

또한 추출 이외의 분리 방법으로서는, 컬럼 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 역상 컬럼을 이용하여 용리액으로서는, 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올류, 또는 이들의 혼합물로 일반식 (II)의 화합물과 일반식 (III)의 화합물을 분리하는 것도 가능하다.

반응액 중에 잔존하고 있는 일반식 (III)의 화합물은, 그대로 산성으로 함으로써 일반식 (IV)의 화합물로 변환할 수 있다. 산으로서는, 염산, 황산 등이 이용되고, 보다 바람직하게는 황산이다. pH나 반응 온도, 반응 시간은 일반식 (III)의 화합물이 폐환하고, 일반식 (IV)의 화합물로 변환할 수 있는 조건으로 좋지만, 보다 바람직하게는 pH는 1 이상의 강산성, 반응 온도는 80∼130℃, 반응 시간은 1∼6시간이다.

생성한 일반식 (IV)의 화합물은 유기 용매를 이용하여 추출함으로써 회수한다. 여기서 이용되는 유기 용매는, 먼저 일반식 (II)의 화합물의 추출에 이용한 용매와 동일하게, 염화에틸렌, 클로로포름, 트리클로로에탄과 같은 할로겐계 탄화수소, 벤젠, 톨루엔과 같은 방향족계 탄화수소, 디에틸에테르, t-부틸메틸에테르와 같은 에테르류 외에, 아세트산에틸 등이 이용되고, 보다 바람직하게는 아세트산에틸이다. 또한, 컬럼 크로마토그래피에서의 회수도 가능하다.

한편, 반응액 중에 잔존하고 있는 일반식 (III)의 화합물은, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염 등으로 처리 후, 반응액을 감압 증류 제거하고, 건고물를 용매로 재결정함으로써 카르복실산의 알칼리 금속염으로 하여 단리할 수도 있다. 이용되는 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염으로서는, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등이 있고, 바람직하게는 수산화나트륨이다. 또한, 재결정 용매로서는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 클로로포름 등이 이용되고, 바람직하게는 메탄올이다.

특히, 본 발명에 있어서는 높은 광학 순도의 D-판토락톤을 고수율로 얻을 수 있다. D-판토락톤으로부터는, β-알라닌의 Ca염 또는 에스테르와 알코올계 용매 중축합시켜 D-판토텐산칼슘을 얻을 수 있고, 예컨대, D-판토락톤을 알코올 등의 유기 용매 중, β-알라닌 또는 그 에스테르와 축합시켜 D-판토텐산으로 한 후, 탄산칼슘 등의 칼슘 화합물을 반응시키는 방법(E. Stiller, et al., J. Am. Chem. Soc., 62, 1785 (1940)), D-판토락톤과 β-알라닌을 제2급 또는 제3급 아민의 존재로 가열하고, 그 반응액에 산화칼슘을 가하여 D-판토텐산칼슘을 제조하는 방법(E. H. Wilson, et al., J. Am. Chem. Soc., 76, 5177 (1954)) 등에 의해 제조할 수 있다. 또한, 3-아미노프로판올을 알코올계 용매 중축합시켜 D-판테놀을 얻을 수 있다(USP No. 2,413,077; Brit. Patent No.568,355). 또한, D-판토락톤을 알코올 등의 유기 용매 중, γ-아미노프로피오니트릴과 반응시켜 D-판토테노니트릴로 하고, 다시 시스테아민을 가하여 반응시켜 2-(2-D판토아미드에틸)-2-티아졸린으로 한 후, 가수분해하여 D-판테테인으로 한 후, 과산화수소의 존재 하 축합시켜 판테틴을 제조할 수 있다(M. Shimizu, et al., Chem. Pharm. Bull., 13, 180 (1965)). 본 발명에서 얻어지는 D-판토락톤을 사용함으로써, D-판토텐산 및 또는 그의 염, 혹은 D-판테놀을 효율적으로 얻을 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 의약품 중간체나 아미노산 유도체로서 유용한 광학 활성인 γ-락톤 유도체가 간편하고 효율적인 제조 방법을 제공하는 것이다.

명세서 및 도면에 있어서, 용어는, IUPAC-IUB Commissionon Biochemical Nomenclature에 의하거나, 혹은 그 분야에서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것이다. 대표적인 용어의 의미를 이하에 나타낸다.

A: 알라닌(Ala) M: 메티오닌(Met)

C: 시스테인(Cys) N: 아스파라긴(Asn)

D: 아스파라긴산(Asp) P: 프롤린(Pro)

E: 글루타민산(Glu) Q: 글루타민(Gln)

F: 페닐알라닌(Phe) R: 아르기닌(Arg)

G: 글리신(Gly) S: 세린(Ser)

H: 히스티딘(His) T: 트레오닌(Thr)

I: 이소로이신(Ile) V: 바린(Val)

K: 리신(Lys) W: 트리푸토판(Trp)

L: 류신(Leu) Y: 티로신(Tyr)

뉴클레오티드 서열에 관해서는:

A: 아데닌 G: 구아닌

C: 시토신 L: 티민

(1) 후술의 실시예 1에 기재된 pNAN-XG로 형질 전환된 아스페르길루스 오리제: 아스페르길루스 오리제/pNAN-XG는 2003년 2월 4일부터 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1초메 1반지 추오 제6(AIST Tsukuba Central 6, 1」, Higashil-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan, 구 주소 표기: 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1초메 3호)(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary: IPOD)(구 명칭: 경제산업성 산업기술 종합연구소 생명 공학 공업 기술 연구소(NIBH))에 기탁되어 보관되어 있고(수탁 번호 FERMP-19199), 2004년 2월 2일에 원기탁에서 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로의 이관 청구가 이루어지고, 수탁 번호 FERMBP-08608로서 IPOD에 보관되어 있다. 또한, 후술의 실시예 2에 기재된 pAlpS로 형질 전환된 아크레모늄 크리소게눔: 아크레모늄 크리소게눔/pAlpS는 2003년 2월 4일부터 IPOD에 기탁되어 보관되어 있고(수탁 번호 FERMP-19200), 2004년 2월 2일에 원기탁에서 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로의 이관 청구가 이루어지고, 수탁 번호 FER BP-08609로서 IPOD에 보관되어 있다.

(2) 또한, 후술의 실시예 1에서 사용된 락토나아제의 유전자를 도입한 벡터(pFLC40E)를 보유하는 대장균 JM109(EJM-ESE-1)은, 1995년 8월 30일(원기탁일)부터 IPOD에 기탁되어 있고(수탁 번호 FERMP-15141), 1996년 8월 28일에 원기탁에서 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로의 이관 청구가 이루어지고, 수탁 번호 FERMBP-5638로서 IPOD에 보관되어 있다.

이하에 실시예를 들어, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 본 발명의 설명을 위해, 그 구체적인 형태의 참고를 위해 제공되고 있는 것이다. 이들의 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 형태를 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나, 혹은 제한하는 것을 나타내는 것은 아니다. 본 발명에서는 본 명세서의 사상에 기초하는 여러 가지 실시형태가 가능한 것은 이해되어야 한다.

모든 실시예는, 그 밖에 상세히 기재하는 것 이외에는 표준 기술을 이용하여 실시한 것, 또는 실시할 수 있는 것으로, 이것은 당업자에 있어서 주지이고 관용적인 것이다. 이하의 실시예에서의 통상 관용되는 분자 생물학적 기술로서는, 표준 실험메뉴얼, 예컨대 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis(ed.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al.(ed.),"DNA Cloning", 2nd ed., Vol.1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); H. A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover, et al.(ed.), "DNA Cloning", 2nd ed., Vol.1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al.(ed.), "PCR Protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, New York(1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford(1991) 등에 기재된 방법에 준하여 행하고 있고, 또한 시판의 시약 혹은 키트를 이용하고 있는 경우에는 이들에 첨부의 지시서(protocols)나 첨부의 약품 등을 사용하고 있다.

실시예 1

〔푸사륨 옥시스포룸 유래 락토나아제의 아스페르길루스 오리제에서의 발현〕

(1) 플러스미드의 구축

푸사륨 옥시스포룸 유래 성숙 락토나아제 cDNA(N말의 시그날 펩티드 및 인트론 불포함)를 삽입한 플러스미드 pFLC40E를 제한 효소 EcoRI, XbaI로 처리하고, 락토나아제 cDNA를 포함하는 단편을 단리하였다. 이것을 블런트 처리한 후, 발현용 플러스미드 pNAN8142(일본 특허 공개 공보 평09-9968호, Biosci. Biotechnol. Biochem., 60: 383-389, 1996)의 p-No8142 프로모터 하류의 PmaCI 사이트에 삽입하여 pNAN-PC를 얻었다.

pNAN-XC는 락토나아제 유전자의 cDNA와 시그날 펩티드의 서열을 도입하고 있고, 이하와 같이 구축되었다.

푸사륨 옥시스포룸에서 전체 RNA를 AGPC법(페놀과 티오시안산 구아니딘을 이용한 방법)으로 추출하였다(키트명: ISOGEN, nippongene). 이 전체 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR(PCR을 사용하여 RNA에서 DNA를 증폭하는 방법)법[Access RT-PCR System; Promega사 제조]를 이용하여, 1.3kb의 DNA 단편을 증폭하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드, FusLac1(하선부에 Xhol 절단 서열을 포함함)으로 FusLac2(하선부에 Xbal 절단 서열을 포함함)를 프라이머로서 사용하였다.

FusLac1; 5'-AACTCGAGATGCCTTCTTCCATTTCTGTA-3' 〔서열 번호 1〕

FusLac2; 5'-AATCTAGACTAATCATAGAGCTTGGGAC-3' 〔서열 번호 2〕

PCR 증폭 조건은 상기 키트의 지시 매뉴얼에 따랐다. PCR 산물은 저융점 아가로스겔로 정제하고, 제한 효소 Xho1과 Xba1로 절단한 후에 플러스미드: pNAN8142의 동일한 절단 부위에 삽입하였다.

게놈 상의 완전 길이 락토나아제 유전자를, FusLac1과 FusLac2를 프라이머로 하여 PCR을 이용하여 푸사륨 옥시스포룸의 전체 DNA에서 증폭하였다. 증폭한 DNA 단편은, 제한 효소 Xho1과 Xba1로 절단한 후에 플러스미드: pNAN8142의 동일한 절단 부위에 삽입하고, 이것을 pNAN-XG로 하였다.

(2) 아스페르길루스 오리제에서의 락토나아제 유전자의 발현

상기 플러스미드를 개별로 아스페르길루스 오리제(ATCC91002)를, Unkles SE 등(Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989)의 방법에 의해 조제한 아스페르길루스 오리제 niaD 돌연변이체(AON-2)로 형질 전환하고, 락토나아제 활성을 측정하였다. 락토나아제 활성 측정 방법은 하기와 같다.

습균체 50㎎, 0.5M 트리스 염산 완충액(pH7.4) 및 0.61mM(80㎎) D-판토락톤 을 포함하는 반응액 2mL를 30℃, 15분간, 300rpm에서 진탕하였다. 원심에 의해 균체를 제거하고, 그 상청 중의 판토락톤 및 판토산을 HPLC에 의해 해석하였다. 효소 1U는 1분간으로 1μmol D-판토락톤의 가수분해를 촉매하는 효소량으로 하였다.

pNAN-XG의 형질 전환체가 가장 높은 락토나아제 활성(푸사륨 옥시스포룸의 약 7.4배)을 나타내고, pNAN-XC도 또한 동등한 활성을 나타내었다. PNAN-PC의 형질 전환체에 있어서는 pNAN-XG의 활성의 4분의 1의 활성이었다(표 1).

벡터	조사된 형질전환체의 수	락토나아제 활성(mU/mg (습윤 중량) 세포)
		평균	최대
pNAN-PC	4	57.0	69.2
pNAN-XC	7	195	255
pNAN-XG	6	211	388

(3) 재조합 효소의 비교

pNAN-XG 및 pNAN-XC의 형질 전환체의 조추출액을 SDS-PAGE에 제공한 바, 푸사륨 옥시스포룸 유래 생성 락토나아제의 분자량에 해당하는 60kDa의 위치에 발현 단백질이 발견되었다(도 1A). 한편, pNAN-PC의 경우는 51kDa에 발현 단백질이 발견되었다. 락토나아제 항혈청을 이용한 웨스턴 블로팅을 행한 바, pNAN-XG는 60kDa에, pNAN-PC는 51kDa에 양성 밴드가 검출되었다(도 1B). 마찬가지로, pNAN-XC에서도 60kDa의 양성 밴드가 검출되었다.

PNAN-XG 및 pNAN-PC 형질 전환체로부터의 각 재조합 효소의 N말을 해석한 바, 양쪽 모두 천연형과 동일한 아미노산 서열(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser)을 나타내고, 정확하게 프로세싱을 받고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 재조합 효소 사이의 분자량의 차이는 당쇄 부가의 유무에 의한 것이라고 생각되었다.

시그날 펩티드 영역을 부가하지 않은 pNAN-PC의 형질 전환체만이 탈당쇄형의 효소를 생산하였기 때문에, 시그날 펩티드는 번역 후의 폴리펩티드가 당쇄 부가가 발생하는 장소, 즉 소포체에 수송되기 위해서 필요한 것이라고 생각되었다.

(4) 라세미 판토락톤의 비대칭 가수분해

푸사륨 옥시스포룸 및 아스페르길루스 오리제 전환체(pNAN-PC 및 pNAN-XG)를 35% DL-판토락톤 용액과 pH를 6.8∼7.5로 컨트롤하면서 반응을 행하였다.

pNAN-PC 형질 전환체로는, 반응 초속은 높지만 효소의 안정성이 나쁘고, 2시간 후에는 거의 반응이 진행하지 않게 되었다. 24시간 후에는 DL-판토락톤의 가수분해율은 8.52%이고, 푸사륨 옥시스포룸의 14.6%에 비교해서 낮았다(도 2A). pNAN-XG 전환체의 효소는 pNAN-PC 형질 전환체의 효소보다도 안정성이 좋고 가수분해율은 19.8%였다.

또한 가수분해율 50%를 목표로 하여, 효소의 안정성을 높이기 위해서, 습균체 5g을 115mL의 1% 알긴산나트륨에 현탁하고, 2% 염화칼슘 용액에 적하하여 형질 전환체의 고정화를 행하였다. 고정화 균체를 이용한 반응에 있어서 pNAN-XG 및 pNAN-PC 형질 전환체의 효소 모두 안정성이 좋아지고, DL-판토락톤의 가수분해율은 각별히 향상되었다. 반응 24시간 후의 가수분해율은 pNAN-XG 및 pNAN-PC 형질 전환체에 있어서 각각 49.1% 및 21%에 달하였다(도 2B). 광학 순도는 95% e.e. 이상이었다.

실시예 2

〔푸사륨 옥시스포룸 유래 락토나아제의 아크레모늄 크리소게눔에 의한 분비 생산〕

(1) 플러스미드의 구축

Combined PCR을 이용하여, 푸사륨 알카라인 프로테아제(Fusarium alkaline protease, Alp) 프로모터, 그 시그날 서열, 락토나아제 유전자의 융합 유전자를 구축하였다(도 3).

Alp 프로모터와 그것에 계속되는 Alp 시그날 펩티드, 프로펩티드를 플러스미드·pNLH2(일본 특허 공개 공보 평5-268972호)를 주형 PCR로 증폭하였다. 사용한 프라이머는 이하와 같다.

센스 프라이머 AlpPS(하선 부분은 합성한 Sall 절단 서열임)

안티센스 프라이머 AlpPA(하선부는 LacS 프라이머의 일부와 어닐링함).

AlpPS: 5'-TTGTCGACGGATCCGAAAGATGAGACCGCT3' 〔서열 번호 3〕

AlpPA; 5-GAAGCTTAGCCATGTTGATGCTGATGATGGCATCC-3' 〔서열 번호 4〕

LacS; 5'-CATCAGCATCAACATGGCTAAGCTAAGCTTCCTTCTACGGCTC-3'〔서열 번호 5〕

N말단의 시그날 펩티드를 없앤 락토나아제 유전자는 pNAN-XG을 주형 센스 프라이머 LacS(하선부는 AlpPA 프라이머의 일부분과 어닐링함)과, 안티센스 프라이머 FusLac2(서열 번호 2)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 각각의 PCR 산물을 혼합하여 AlpPS와 FusLac2를 프라이머로 하여 세컨드 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 단편(2.3kb)을 Sal1, Xba1로 절단하여 pBluescript에 도입하여 pAlpS를 구축하였다.

또 하나의 발현 플러스미드 pLacS는 락토나아제 자신의 시그날 펩티드를 Alp 프로모터의 제어 하에 두는 것으로, 역시 Combined PCR을 이용하여 구축하였다. A1p 프로모터는 프라이머 AlpPS와 AlpPA2(하선부는 LacS2 프라이머의 일부분과 어닐링함)를 이용하여 PCR로 증폭하고, 락토나아제 자신의 시그날 펩티드를 갖는 전체 길이 유전자는 프라이머 LacS2; (하선부는 AlpAP2 프라이머의 일부분과 어닐링할 수 있음)과 프라이머 FusLac2를 이용하여 PCR로 증폭하였다.

AlpPA2: 5'-TGGAAGAAGGCATCTTGTCAGGGAGTATGAAGGTTG-3' 〔서열 번호 6〕

LacS2: 5'-TACTCCCTGACAAGATGCCTTCTTCCTTTCTGTA-3' 〔서열 번호 7〕

양방의 PCR 산물을 혼합하여 프라이머 AlpPS와 프라이머 FusLac2를 이용하여 세컨드 PCR을 행하고, 증폭 산물을 Sal1, Xba1로 절단하여 pBluescript에 서브 클로닝하였다. 아크레모늄 크리소게눔의 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로제나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GDPH) 프로모터와 하이글로마이신 B 탈인산화 효소를 가지는 3.0kb의 단편이 Morita, S 등에 의해 개발된 pNLH2(J. Biotechenol. 42, 1-8, 1995)에서 HindIII로 추출할 수 있다. 이 HindIII 절단 단편을 pBluescript에 도입하여 pHm^R로 하였다.

(2) 아크레모늄 크리소게눔에서의 락토나아제 유전자의 발현

상기 플러스미드를 개별로 아크레모늄 크리소게눔(ATCC11550)로 형질 전환하였다. 락토나아제 유전자가 형질 전환체의 염색체 DNA에 삽입되어 있는 것을 확인하기 위해서, 형질 전환체의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 락토나아제 유전자 3' 및 5'말단 영역의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR 해석을 행하였다. PCR 산물을 아가로스겔 전기 영동에 제공한 바, 시험한 80의 형질 전환체의 약 80%에 락토나아제 유전자에 해당하는 1.2kb의 밴드가 검출되었다.

각 형질 전환체를 1L 당 30g 수크로오스, 5g DL-메티오닌, 32g 대두 분말, 1.5g 탄산칼슘(pH6.8)을 포함하는 배지에서 28℃, 3일간 전배양하고, 다시 500mL의 배지에서 28℃, 5일간, 120 strokes/min로 본 배양하였다. 그 배양 상청의 락토나아제 활성을 측정하였다.

락토나아제 활성은, 0.5M 트리스 염산 완충액(pH7.4), 0.61mM(80㎎) D-판토락톤 및 적당량의 효소를 포함하는 반응액 0.5mL을 30℃, 15분간 반응 후, 반응액 중 판토락톤 및 판토산을 HPLC에 의해 해석하였다. 그 결과, pAlpS 및 pLacS의 형질 전환체의 배양 상청으로 대량의 락토나아제가 발견되었다(표 2).

벡터	조사된 형질전환체의 수	락토나아제 활성(mU/mg (습윤 중량) 세포)
		평균	최대
pAlpS	10	57.9	190
pLacS	10	43.3	88.8

(3) 분비 효소의 성질

pAlpS 및 pLacS의 형질 전환체의 배양 상청을 SDS-PAGE에 제공한 바, 60kDa의 위치에 메이저인 밴드가 발견되었다(도 4). 이 분자량은 천연의 효소에 해당한다. 이들의 밴드를 PVDF 멤브레인에 찍고, N 말단의 아미노산 서열을 해석한 바, 양쪽 모두 천연형과 동일한 아미노산 서열(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser-Thr-Ala-)을 나타내었다.

효소에 부가되어 있는 당쇄의 해석을 행하기 위해서, N-연결된(N-linked) 당단백질 유래의 고말레노스타입 및 하이브리드올리고사카라이드를 절단하는 엔드글리코시다아제를 푸사륨 옥시스포룸 및 pAlpS의 형질 전환체로부터 각각 정제한 효소와 1, 5, 15, 60분간 반응시켜 SDS-PAGE를 행하였다. 60, 56, 51kDa의 상이한 3종의 분자량의 밴드가 검출된(도 5) 것에서 적어도 2개의 N-연결된 당쇄를 갖는 것이 나타났다.

(4) 고정화 효소의 조제

pAlpS의 형질 전환체의 배양액 500mL를 20mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)에 투석하고, Amicon YM-10 멤브레인을 이용하여 100mL에 농축하여 효소 용액으로 하였다. 한편, 지지체로서 Deolite A-568을 0.1M NaOH로 세정하고, pH가 8.2가 될 때까지 정제수로 세정하였다. 효소 용액 100mL에 건조 중량 15g의 세정 Deolite A-568을 가하고, 4℃, 24시간 교반을 행하였다. 효소 흡착 후, 정제수로 세정하여 2% 글루타르알데히드를 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH7.4) 100mL에서 4℃, 24시간 가교하였다.

약 13.6%의 단백질이 배양액 중에 남고 고정화되지 않았다. 고정화된 효소의 D-락토나아제 활성은 60.4U/g 습윤 수지로 예상되고, 활성 수율은 14.8%이었다(표 3).

투입 활성(U/g-수지(건조중량))	투입 단백질(mg/g-수지(건조중량))	흡수된 활성(U/g)	활성 수율(%)	흡수된 단백질(mg/g)	단백질 수율(%)
858	9.07	127	14.8	7.83	86.4

(5) 고정화 효소에 의한 라세미 판토락톤의 비대칭 가수분해

효소가 고정화된 resin 습중량 15g과 35%(w/v) DL-판토락톤 75mL를 30℃에서 pH를 6.8∼7.5로 유지하고, 천천히 교반하면서 반응시켰다. 비대칭 가수분해는 효율적으로 진행하여 부생물인 L-판토산은 검출되지 않았다(도 6). 반응 9시간 후, 가수분해율이 40%, 즉 D체의 가수분해율이 80%까지 진행하고, 24시간 후에는 45% 까지 달하였다.

본 발명에 의해, 천연의 락토나아제 유전자를 이용하여, 효율적으로 또한 생산성이 우수한 상기 효소를 생산하는 시스템을 제작할 수 있는 기술이 개발 가능해지고, 또한, 상기 효소 및 상기 효소를 생산하는 시스템을 이용하여 효율적으로 또한 보다 생산성이 우수한 광학 활성 γ-락톤 생산 시스템의 구축이 가능해진다. 또한, 의학 상 또는 생리학 상 중요한 비타민인 D-판토텐산, D-판테놀, 판테틴 등을 제조하는 뛰어난 시스템을 구축할 수 있고, 의약품 외에 식품 첨가물, 사료 첨가물, 화장품의 생산에 있어서 유용하다.

본 발명은, 상술한 설명 및 실시예에 특별히 기재한 것 이외에도 실행할 수 있는 것은 분명하다. 상술의 교시를 감안하여, 본 발명의 많은 개변 및 변형이 가능하고, 따라서 이들도 본건 첨부의 청구의 범위의 범위 내인 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI FINE CHEMICAL CO., LTD. <120> Production of Lactonase and Use Thereof <130> FC-101PCT <150> JP 2003-55233 <151> 2003-03-03 <150> JP 2003-371750 <151> 2003-10-31 <160> 9 <170> Microsoft Windows XP Notepad <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a p rimer for PCR <400> 1 aactcgagat gccttcttcc atttctgta 29 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a p rimer for PCR <400> 2 aatctagact aatcatagag cttgggac 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a p rimer for PCR <400> 3 ttgtcgacgg atccgaaaga tgagaccgct 30 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a p rimer for PCR <400> 4 gaagcttagc catgttgatg ctgatgatgg catcc 35 <210> 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gtatgtcact gcagcctcgt tgctgattgt tactaataat tatgagtag 202 Asp Ser Leu 30 gtg ttc act tgg cct ggt gta act gag gag tct ctt gtt gag aag cct 250 Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val Glu Lys Pro 35 40 45 ttc cat gtc tac gat gaa gag ttt tac gat gta att gga aaa gac ccc 298 Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly Lys Asp Pro 50 55 60 tct ttg acc ctc atc gca aca tcg gac acc gac cca atc ttc cat gag 346 Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile Phe His Glu 65 70 75 gct gtc gta tgg tat cct cct act gaa gag gtg ttc ttt gtg cag aat 394 Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe Val Gln Asn 80 85 90 95 gct ggc gct cct gcc gca ggc act ggc ttg aac aag tct tcc atc att 442 Ala Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser Ser Ile Ile 100 105 110 cag aag att tcc ctc aag gag gcc gat gct gtt cgc aag ggc aag cag 490 Gln Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys Gly Lys Gln 115 120 125 gat gag gtc aag gtc aca gtt gtt gac tcg aac cct cag gtt atc aac 538 Asp Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln Val Ile Asn 130 135 140 cca aat g gtatgtttaa cgggtgatat gacttaaacg agcctaacct tttgatctca 595 Pro Asn 145 g gt ggt act tac tac aag ggc aac atc atc ttc gct ggt gag ggc caa 643 Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe Ala Gly Glu Gly Gln 150 155 160 ggc gac gat gtt ccc tct gcg ctg tac ctc atg aac cct ctc cct cct 691 Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met Asn Pro Leu Pro Pro 165 170 175 tac aac acc acc a gtaagtcaca agaatcccta agagcacaat tctttgagct 744 Tyr Asn Thr Thr 180 aaccttaacc ag cc ctt ctc aac aac tac ttc ggt cgc cag ttc aac tcc 794 Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Phe Gly Arg Gln Phe Asn Ser 185 190 ctc aac gac gtc ggt atc aac ccc agg aac ggt gac ctg tac ttc acc 842 Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Asp Leu Tyr Phe Thr 195 200 205 210 gat acc ctc tac gga tat ctc caa gac ttc cgt cct gtt cct ggt ctg 890 Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe Arg Pro Val Pro Gly Leu 215 220 225 cga aac cag gtc tat cgt tac aac ttt gac act ggc gct gtc act gtt 938 Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Ala Val Thr Val 230 235 240 gtc gct gat gac ttt acc ctt ccc aac g gtatgtcttt tattgaatgg 986 Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn 245 250 taaagtacaa gcaactcata ttgatcag gt att ggc ttt ggc ccc gac ggc 1037 Gly Ile Gly Phe Gly Pro Asp Gly 255 aag aag gtt tat gtc acc gac act ggc atc gct ctc ggt ttc tac ggt 1085 Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly Ile Ala Leu Gly Phe Tyr Gly 260 265 270 275 cgc aac ctc tct tct ccc gct tct gtt tac tct ttc gac gtg aac cag 1133 Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val Tyr Ser Phe Asp Val Asn Gln 280 285 290 gac ggt act ctt cag aac cgc aag acc ttt gct tat gtt gcc tca ttc 1181 Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr Phe Ala Tyr Val Ala Ser Phe 295 300 305 atc ccc gat g gtaagtcctg tatgttgtgc ctctgtcgtg ttatatactg 1231 Ile Pro Asp 310 acctctccag gt gtc cac act gac tcc aag ggt cgt gtt tat gct ggc 1279 Gly Val His Thr Asp Ser Lys Gly Arg Val Tyr Ala Gly 315 320 tgc ggt gat ggt gtc cat gtc tgg aac ccc tct ggc aag ctc atc ggc 1327 Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn Pro Ser Gly Lys Leu Ile Gly 325 330 335 aag atc tac acc gga acg gtt gct gct aac ttc cag ttt gct ggt aag 1375 Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys 340 345 350 355 gga agg atg ata att act gga cag acg aag ttg ttc tat gtc act cta 1423 Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr Lys Leu Phe Tyr Val Thr Leu 360 365 370 ggg gct tcg ggt ccc aag ctc tat gat tag 1453 Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp 375 380 <210> 9 <211> 400 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 9 Met Pro Ser Ser Ile Ser Val Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Val Leu -20 -15 -10 -5 Gly Ala Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln -1 1 5 10 Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn 15 20 25 Asp Ser Leu Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val 30 35 40 Glu Lys Pro Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly 45 50 55 60 Lys Asp Pro Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile 65 70 75 Phe His Glu Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe 80 85 90 Val Gln Asn Ala Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser 95 100 105 Ser Ile Ile Gln Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys 110 115 120 Gly Lys Gln Asp Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln 125 130 135 140 Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe 145 150 155 Ala Gly Glu Gly Gln Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met 160 165 170 Asn Pro Leu Pro Pro Tyr Asn Thr Thr Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Phe 175 180 185 Gly Arg Gln Phe Asn Ser Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn 190 195 200 Gly Asp Leu Tyr Phe Thr Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe 205 210 215 220 Arg Pro Val Pro Gly Leu Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp 225 230 235 Thr Gly Ala Val Thr Val Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn Gly 240 245 250 Ile Gly Phe Gly Pro Asp Gly Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly 255 260 265 Ile Ala Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val 270 275 280 Tyr Ser Phe Asp Val Asn Gln Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr 285 290 295 300 Phe Ala Tyr Val Ala Ser Phe Ile Pro Asp Gly Val His Thr Asp Ser 305 310 315 Lys Gly Arg Val Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn 320 325 330 Pro Ser Gly Lys Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala 335 340 345 Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr 350 355 360 Lys Leu Phe Tyr Val Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp 365 370 375 380

Claims (8)

1. D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA를 도입한 락토나아제 생산 형질 변환체.
2. 제1항에 있어서, 락토나아제가 푸사륨(Fusarium)속 유래인 것인 락토나아제 생산 형질 변환체.
3. 서열목록의 서열 번호: 9의 제1 내지 380번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 락토나아제를 암호화하는 DNA, 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA로 이루어지는 DNA를 도입한 락토나아제 생산 형질 변환체.
4. 제3항에 있어서, 시그날 펩티드 영역이 서열목록의 서열 번호: 9의 제-20 내지 -1번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열 또는 Alp 시그날 펩티드 영역인 것인 락토나아제 생산 형질 변환체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체를 배양하여 재조합 락토나아제를 생산시키는 단계, 및 배양물로부터 재조합 락토나아제를 얻는 단계를 포함하는, D-판토락톤 가수분해 효소 활성을 갖는 재조합 락토나아제의 제조 방법.
6. 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시키는 것을 포함하는, 일반식 (II) 또는 일반식 (IV)로 표시되는 광학 활성인 γ-락톤 유도체 또는 그의 염의 제조 방법.

   (R은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내고, R¹ 및 R²는 각각 동일하거나 또는 상이하며, 상호 독립적으로 수소 또는 저급알킬기를 나타냄)
7. 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것에 접촉시켜, 상기 일반식 (IV)로 표시되는 광학 활성인 화합물 또는 그의 염을 제조하는 단계, 및 그 다음에 상기 광학 활성인 일반식 (IV)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 사용하여 공지의 방법 또는 그것과 균등하거나 개변된 방법을 적용하여, 판토텐산, 판토텐산 칼슘, 판테놀, 판테테인, 판토테닐에틸에테르, 판테틴 등의 D-판토락톤 유도체 또는 그의 염을 제조하는 단계를 포함하는, D-판토락톤 유도체 또는 그의 염의 제조 방법.
8. 일반식 (IV)로 표시되는 화합물, 및 판토텐산, 판토텐산칼슘, 판테놀, 판테테인, 판토테닐에틸에테르, 판테틴 등의 D-판토락톤 유도체 또는 그의 염을 제조함에 있어서,

   제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 락토나아제 생산 형질 변환체의 배양물, 세포, 세포 처리물, 또는 고정화 균체, 상기 형질 전환체에서 얻어진 재조합 락토나아제 및 고정화 재조합 락토나아제로 이루어지는 군에서 선택된 것, 또는

   (1) 락토나아제 및 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA; (2) (a) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 DNA 서열, 및 (b) 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA; 및 (3) (a) (i) 락토나아제 전체 길이를 암호화하는 cDNA 서열 또는 (ii) 염색체 유전자 DNA 서열, 및 (b) 상기 락토나아제의 NH₂ 말단 시그날 펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA의 용도.